JPH01305036A - 血漿蛋白成分の加熱処理方法および血漿蛋白成分製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、血漿蛋白成分の加熱処理方法および血漿蛋白
成分製剤に関する。

（従来技術〕 血漿蛋白成分を血漿分画から得る場合には、肝炎ウィル
ス等の夾雑ウィルスの混在を否定することができない。

従って、血漿蛋白成分製剤は血液製剤化技術において、
夾雑ウィルスの不活化方法として広く知られている６０
℃１１０時間の液状加熱処理を施されていることが極め
て重要である。

〔発明が解決しようとする課題〕

ところで本発明者らは、上記の６０゛Ｃで１０時間の条
件下での加熱処理によってはウィルスの種類によっては
充分に不活化できないのではないかという危惧を持って
いる。

そこで、本発明者らは血漿蛋白成分を殆ど不活化させる
ことなく、夾雑ウィルスを実質的に不活化させることを
目的として液状加熱処理条件について検討を重て来たと
ころ、５０〜７０℃で１５〜３０時間という従来より過
酷な加熱処理条件でも所期の目的が達成できることを見
出した。

また、その際、少なくとも垢の存在下に加熱処理を行う
ことが、効果の発現に大いに寄与することを見出した。

本発明は以上の新知見に基づいて完成されたものである
。

〔課題を解決するための手段］ 即ち、本発明は下記（１）〜（３）に関するものである
。

（１）血漿蛋白成分含有水溶液を５０〜７０℃で１５〜
３０時間加熱処理することを特徴とする血漿蛋白成分の
加熱処理方法。

（２）少なくとも糖の存在下に加熱処理を行う請求項（
１）記載の加熱処理方法。

（３）血漿蛋白成分含有水溶液の状態において５０〜７
０℃で１５〜３０時間加熱処理してなることを特徴と１
−る血漿蛋白成分製剤。

本発明・′）血漿蛋白成分はヒト血漿に由来するもので
あれば特に限定されない、具体的には、血液凝固因子（
例えば、第■因子、第■因子、第■因子複合体、第ＸＩ
［［因子など）、フィブロネクチン、プラスミノゲン、
アンチトロンビン■、アルブミン、ハプトグロビン、コ
ロニー形成刺激因子などが挙げられる。

この血漿蛋白成分は未精製、部分精製、高度精製のいず
れの段階にあってもよい。

また、水溶液中における血漿蛋白成分の含量としては、
０．１〜３０　ｗ／ｖ％、好ましくは１〜１０ｗ　／　
ｖ％程度が例示される。当該水溶液のｐＨは一般に４〜
１０であり、好ましくは適当な緩衝液によってｐ１１６
〜８程度に調製される。

血漿蛋白成分含有水溶液を加熱処理する際には、従来公
知の安定化剤を加えることが好ましい。安定化剤として
は塘（単＃Ｍ類、二Ｉ！類、糖アルコールなど）、アミ
ノ酸、有機酸塩、無機塩、界面活性剤、アルブミンなど
が挙げられ、これらは２種以上を併用してもよい。特に
好ましい安定化剤は糖である。

単糖類としてはグルコース、マンノース、ガラクトース
、果糖などが、二ｔＪ！［としてはシｇ糖、麦芽糖、乳
糖などが、糖アルコールとしてはマンニント、ツルピン
ト、キシリットなどが好適なものとして例示されるが、
これらに限定されるものではない。糖類の添加量は、血
漿蛋白成分含有水溶液１００ｄ当たり１０〜２００ｇで
ある。

中性塩としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カ
ルシウム、塩化マグネシウムなどのアルカリ金属または
アルカリ土類金属のハロゲン酸塩などが例示され、その
添加量は、血漿蛋白成分含有水溶液ｌｏｏｍ当たり０．
１〜１０ｇである。

アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイ
シン、イソロイシン、リジン、アルギニンなどが例示さ
れ、その添加量は血漿蛋白成分台を水溶液１００ａ＋！
当たり１〜３０ｇである。

有機酸としては、有機カルボン酸（炭化水素残基にカル
ボキシル基が置換したもの）であることが好ましく、炭
化水素残基は飽和されていても不飽和であってもよ（、
また鎖状（直鎖状または分枝状）、環状のいずれでもよ
い、当該炭化水素残基としてはアルキル基、アリール基
（たとえばフェニル基）などが例示される。当該有機酸
におけるカルボキシル基は複数個であってもよいが、１
または２個が好ましい、また当該有機酸は、水酸基で置
換されていてもよい、有機酸塩における塩としては、生
理的に許容されるものであれば特に制限はなく、好まし
いものとしては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリ
ウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩など
）、特に好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げ
られる。

かかる有機酸の好ましい炭素数は、３〜１５程度である
。

有機酸塩の具体例としては、プロパン酸、ブタン酸、ペ
ンタン酸、カプリン酸、カプロン酸、マロン酸、コハク
酸、グルタル酸、アジピン酸、クエン酸、マンデル酸な
どの生理的に許容される塩、特にアルカリ金属塩（ナト
リウム塩、カリウム塩）が挙げられる。

有機カルボン酸塩の添加量は、血漿蛋白成分含有水溶液
１００−当たり１〜３０ｇである。

界面活性剤としては、アルキルフェニルポリオキシエチ
レン〔たとえば、トリトン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ　”　）、
ノニデント（Ｎｏｎｉｄｅｔ＠）　）のような非イオン
性剤、胆汁酸塩（例えばナトリウムタウロコラート）の
ようなアニオン性剤、またヘンズアルコニウムクロライ
ドのようなカチオン性剤、プロピレンオキシドの高分子
量共重合体のような界面活性を持つ多価アルコール〔プ
ルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ”）　　Ｆ６８］などが
例示され、その添加量は、当該水溶液１００ｄ当たり０
．００２〜０．０５　ｇ程度が好ましい、アルブミンは
ヒト血清由来または遺伝子組喚えによって得られたもの
が好ましい。添加量としては当該水溶液１０Ｃ１ｄＩ′
、ｌ：＝’・ｌ′ＩＱ、Ｉ−Ｌｏｇ程度が好ましい。

加熱処理は、５０’Ｃへ一１０゛Ｃ好ましくは約６０℃
にて１５〜３０時間、好まし±す０時間行われる。

かくして得られた製剤は溶液状であり、高度精製血漿蛋
白成分を出発材料とした場合はそのまま、粗製品を用い
た場合は公知の精製法に準じて処理を行った後、必要な
らば、透析、除菌濾過を行った後、包装単位に従って分
注されて。その貯蔵方法は、高温を避ければ特に限定さ
れるものではないが、３０℃以下に保存することが好ま
しい。また、当該血漿蛋白成分製剤は所望により凍結乾
燥製剤としてもよい。

当該処理を経た血漿蛋白成分は、そのまま、または自体
公知の製剤化処理を行って、たとえば注射用蒸留水で溶
解または希釈して投与される。投与量は各々の血漿蛋白
成分が通常用いられる量である。

〔効果〕

本発明によれば、血漿蛋白成分の生理活性をあまり損失
することなく、各種ウィルスを実質的に完全に不活性化
できる。

従って、本発明により得られた血漿蛍白成分製剤は、医
療上極めて安全性が高く、また有効性にも優れたものと
言える。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げて説明
するが、本発明はこれらによって何ら限定されるもので
はない。

実施例１（血液凝固筒■因子） 部分精製した第■因子溶液ｌａ１にシボ＃ａ２．０ｇを
加え、３７℃に加温して溶解させる。この溶液をｐＨ１
，０に調製したのち、６０℃の温浴中で２０時間加熱す
る。次に限外濾過装置を用いてシボ゛・−を除去し、第
■因子を濃縮する。第■因子の活之残存率は５６％であ
った６ 実施例２（血液凝固筒■因子） クリオプレシビテイトの抽出液ｌｌ１１にソルビトール
２．０ｇを加え、３７℃の温浴中で加温して溶解させる
。この溶液をｐＨ７，０に調製したのち、６０℃の温浴
中で２０時間加熱する。次に限外濾過装置を用いてソル
ビトールを除去し、第■因子を濃縮する。第■因子の活
性残存率は５８％であった。

実施例３（血液凝固第■因子複合体） 正常人血漿からコーンの冷エタノール分画法により得ら
れた第１画分を用いて、ＤＥＡＥセルロース　カラム　
クロマトグラフィー法〔ダイク。

ジー、ダブル、アールら、ブリティッシュ　ジャーナル
　オブ　ヘマトロジー（Ｄｉｋｅ、　Ｇ、Ｗ、Ｒ，、ｅ
ｔａｌ、、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、第２２巻、第４６９頁（１
９７２）３により第■因子含有粉末品（１■蛋白当たり
の第■囚子活性１ｓｔＪ位）を調製した。この第■因子
含有製剤１００ｇを６．５　Ｉ！、の水で溶解した後、
シａ　糖（１ｇ　／ｍｌ）、グリシン（２，２Ｍ）およ
び塩化カルシウム（０，５Ｍ）を添加した。この第■因
子含有製剤溶液のｐＨを７．６に調整後、５０ｄ容バイ
アル瓶に２０戚ずつ小分は分注した後、６０℃で２０時
間加熱処理した。

実施例４（血液凝固筒χ■因子） １））１７．０の０．０５　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液に溶解
した活性１００単位／ｄの第Ｘ１ｌｌ因子を含有する水
溶液１１にマンニトール１５０ｇ、カプリル酸ナトリウ
ム１５０ｇを添加した。これをよく攪拌した後、６０℃
で２０時間加熱する。冷却後、沈澱を回収し、再びｐＨ
１，０の０．０５　Ｍリン酸緩衝液に熔解した。この溶
解液をｐＨ７，２の０．００５Ｍ　　ＥＤＴＡ含有０．
０５　Ｍリン酸緩衝液に対して透析して澄明な液を得る
。この液に上記と同様の緩衝液であらかじめ平衡とした
ＱＡＥ・セファデックスを湿重量で５００ｇ加えて第Ｘ
Ｉ［ｌ因子を吸着させ、これから０．５　Ｍの塩化ナト
リウムで溶出されてくる両分を集めて、２．２５％グリ
シンを加えた０、５％塩化ナトリウム溶液に対して透析
し、除閉濾過、分注後凍結乾燥する（加熱処理時の活性
残存率は９０％）。

実施例５（フィブロネクチン） プールした正常成人血漿よりコーンのエタノール分画に
よって得られる第１両分を０．０５５　Ｍクエン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ６，０に溶解し、これに０．０１Ｍ
のイプシロンアミノカプロン酸およびアプロチニン１０
単位／ｌＩｒ１を加え、更にリジン−セファロースによ
りプラスミンおよびプラスミノゲンを除去したのち、ヘ
パリン１０単位／−を加えて０〜２℃に４８時間静置し
て沈澱を集める。

沈澱は０．０５　Ｍリン酸緩衝液、ｐｎｓ、ｏと１Ｍグ
リシンおよび６．５％エタノールを含む０．０５５　Ｍ
クエン酸緩衝液とでそれぞれ洗浄したのち、０．０５５
Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６，３５を加えて室温にもたら
し、沈澱を溶解させる。これを０〜２℃に放置後沈澱を
分けとりＣＩＧ（フィブロネクチン）を含有する両分タ
ライオフィブリノゲンを得る。

タライオフィブリノゲン（沈ｉ＃）を、０．０５　Ｍト
リス−リン酸緩衝液、ｐＨ７，０に溶解し、これを同一
緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスに吸着さ
せ、同一緩衝液および０．０９　Ｍ　）リス−リン酸緩
衝液、ｐＨ７，０で洗浄したのち、０．２Ｍトリス−リ
ン酸緩衝液、ｐＨ７，０でＣＩＧの溶出を行う。

０、０５　Ｍ　）リス−リン酸緩衝液、ＰＨ８，０に溶
解した３０■／ｄのＣＩＧを含存する水溶？１ｉｌＮに
ンヨｖ！１　ｋｇを添加した。これをよく攪拌した後、
６０℃で２０時間加熱した。冷却後、０．９％塩化ナト
リウム溶液に対して透析し、遠心分離して澄明な液を得
た。

このようにして得られたＣＩＧにつき一元免疫拡散法で
ＣＩＧを定量したところ、ＣＩＧの回収率は７９％であ
った。

実施例６（プラスミノーゲン） コーンの冷エタノール分画法で得られた両分■＋■をｌ
　ｗ　／　ｖ％塩化ナトリウム、ｌ　ｗ　／　ｖ％グリ
シン溶液に懸濁し、攪拌後、遠心分離により上澄を分離
した。この上澄をＤｅｕｔｓｃｈ、　Ｄ、　Ｇ、　　ら
〔５ｃｉｅｎｃｅ、　」刊、　１０９５．　（１９７０
））の方法に準じ、リジン−セファロースカラムに注入
し、プラスミノーゲンを吸着させ、次いで生理食塩溶液
で洗浄した後、０．２５　Ｍリジンと０．９％グリシン
とを含む溶媒（ｐＨ７，２）を用いて吸着したプラスミ
ノーゲンを？容出せしめた。

この精製プラスミノーゲン液１ｄにシｇ塘１ｇおよびア
プロチニン５０ＫＩＵを加え、６０℃ｌ２Ｏ時間加熱処
理を行い、残存プラスミノーゲンの力価を求めた。

プラスミノーゲンの力価は、Ｆｒｉｂｅｒｇｅｒらの方
法（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｊｖｉｎｇｓｔｏｎ、　１
２８＋　１９７９）に準じ発色合成基質Ｓ−２２５１を
用いて測定した。その結果、９２％の残存率を示した。

実施例７（アンチトロンビン−■） コーンの冷アルコール分画法で得られた画分■−１のペ
ースト１０ｋｇを生理食塩水１００Ｎに懸濁し、硫酸バ
リウムを５　ｗ　／　ｖ％になるように加え、室温で３
０分間攪拌した。この上清液をＰＨ６，５に調整し、ポ
リエチレングリコール＃４０００を１３ｗ／Ｖ％になる
ように加え、生じた沈澱を遠心分離して除き、さらにポ
リエチレングリコール＃　４０００を３０ｗ／ｖ％にな
るように加え、生じた沈澱を遠心分離して回収した。こ
の沈澱を冷生理食塩水約２０１に溶解し、予め生理食塩
水で調製されたヘパリンセファロースのカラムへ注入し
、アンチトロンビン−■をカラムに吸着させた。このカ
ラムを０．４Ｍの塩化ナトリウム溶液で洗浄したのち、
２．０Ｍの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出部
分を回収した。

このアンチトロンビン−■の水溶液にシｓｔＪ！ｉ（溶
液１ｍ当たりＩｇ）およびグリシン（７容液１ｌｔ１当
たり０．３　ｇ　）を加え、ＰＨ７，８に調整した後６
０℃で２０時間の加熱処理を施し、続いて０．９％塩化
ナトリウム溶液に対し１夜透析を行いつつ濃縮してアン
チトロンビン−■の１ｗ／ｖ％水溶液を得、必要に応じ
て濾過または遠心分離を行って澄明な液とした。

このアンチトロンビン−■の１ｗ／ｖ％水？容ン夜にマ
ンニトール２Ｗ／ｖ％とクエン酸ナトリウム０．２Ｗ／
Ｖ％を加え、塩化ナトリウムが０．５％になるように少
量の冷蒸留水希釈し、ＩＮの水酸化ナトリウムでｐＨ７
，６に調整した後、滅菌したミリポアフィルタ−で除菌
濾過し、５００単位づつ分注し、凍結乾燥を行って乾燥
製剤とした。

実施例８（アルブミン） 正常人血漿からコーンの冷エタノール分画法により得ら
れた第Ｖ画分を精製して純度９６％以上のアルブミン画
分を得た。これをアルブミン濃度５　ｗ　／　ｖ％温溶
液調製した後、６０℃で２０時間加熱処理した。

実施例９（ハプトグロビン） 大血漿よりコーンの低温エタノール分画法で得た両分Ｉ
Ｖ３０ｋｇにＰＨ８，２の０．０５モル酢酸アンモニウ
ム緩衝液１４５２を加え懸濁した。これに１％リバノー
ル水溶液１２０２を加え３時間かきまぜ、２時間静置後
、沈澱を分離し、得られた上清液に８ｋｇの酸性白土を
加えて２時間攪拌後濾過して澄明な濾液を得た。濾液に
ＩＮ酢酸を加えてｐＨを７，０とした後、硫酸アンモニ
ウムを３０％飽和となるまで加え、生じた沈澱を除去後
、硫酸アンモニウムを追加して４０％飽和とじて、生じ
た沈澱を採取した。得られた沈澱を０．０５　Ｍ酢酸ナ
トリウム溶液１０ｉ！、に溶解しくハプトグロビンとし
て４％）これに２０％（Ｗ／Ｖ）となるようにマンニト
ールを加え、温浴中６０℃で２０時間の加熱処理を施し
た。加熱処理した液は０．０５モルの酢酸緩衝液（ｐＨ
５，０）に対し、透析した後２００ｇのＱＡＥ−セファ
デックスＡ−５０をあらかじめ同−液で平衡化したもの
と混じ、ハプトグロビンを吸着させた。ハプトグロビン
を吸着した上記ＱＡＥ−セファデックスＡ−５０をイオ
ン強度０．０５の緩衝液（組成：０．０５Ｍ酢酸、０．
０５　Ｍ酢酸ナトリウム３水和物）で洗った後、イオン
強度０．３の緩衝液（組成：　０．３　Ｍ酢酸＋０．３
　Ｍ塩化ナトリウム）で洗い、ハプトグロビンを溶離し
た。ｌ離液に硫酸アンモニウムを加えて５０％飽和とし
て生じた沈澱を濾取し、得られた沈澱を生理食塩水１．
５２に溶解し透析後０．２μのミリポアフィルタ−で除
菌濾過してハプトグロビン水溶液を得た。

加熱処理前後でハプトグロビンの機能を示すヘモグロビ
ン結合能を測定したところ、残存率は８５％であった。

実験例１　（安定化効果） （１）血液凝固筒■因子の場合 実施例２に準じて６０゛Ｃ１３０時間の液状加熱処理を
行い、加熱前の第■因子活性（■：Ｃ）を１００とした
時の加熱後残存活性率（％）を経時的に求めた。第■因
子活性は活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ
）により測定した。結果を第１表に示す。

第１表 （２）血液凝固筒■因子（複合体）の場合実施例３に準
じて６０℃１２５時間の液状加熱処理を行い、加熱前の
第■因子活性を１００とした時の加熱後残存活性率（％
）を経時的に求めた。第■因子活性は一段法による凝血
測定法（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ。

Ｍｅｄ、、　２６７　１２５−１３０　（１９６２））
により測定した。結果を第２表に示す。

第２表 実験例２（ウィルス不活化効果） （１）血液凝固筒■因子の場合 実施例２に準じて調製した第■因子含存水溶液に第３表
に記載のウィルスを懸濁させた５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７）を添加した。

６０℃で２０時間液状加熱処理を行い、経時的に残存す
る各ウィルスの感染性をプラーク形成法により測定した
。結果を第３表に示す。

〔以下余白〕

（２）血液凝固第■因子の場合 実施例３に準じて調製した第■因子含有水溶液に第４表
に記載のウィルスを！Ｑ′／ＩＡさせた５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７）を添加した。

６０℃で２０時間液状加熱処理を行い、経時的に残存す
る各ウィルスの感染性をプラーク形成法により測定した
。結果を第４表に示す。

〔以下余白〕

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）血漿蛋白成分含有水溶液を５０〜７０℃で１５〜
   ３０時間加熱処理することを特徴とする血漿蛋白成分の
   加熱処理方法。
2. （２）少なくとも糖の存在下に加熱処理を行う請求項（
   １）記載の加熱処理方法。
3. （３）血漿蛋白成分含有水溶液の状態において５０〜７
   ０℃で１５〜３０時間加熱処理してなることを特徴とす
   る血漿蛋白成分製剤。