KR20020019749A

KR20020019749A - 염기성 단백질로부터 엔도톡신을 제거하는 방법

Info

Publication number: KR20020019749A
Application number: KR1020000052914A
Authority: KR
Inventors: 표상현; 박흥복; 소진언; 김진현; 홍승서; 이현수
Original assignee: 김일웅; 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 2000-09-07
Filing date: 2000-09-07
Publication date: 2002-03-13
Also published as: US20020147315A1; KR100356738B1; US6713611B2; JP2002179697A

Abstract

본 발명은 염기성 단백질 용액에 함유되어 있는 엔도톡신을 제거하는 방법에 관한 것으로, 재조합 미생물로부터 얻은 염기성 단백질을 함유하는 용액에 계면활성제를 첨가하여 혼합하고, 상기 용액을 양이온 교환 수지에 로딩하고, 상기 양이온 교환 수지를 계면활성제를 함유하지 않는 용액으로 세척하고, 상기 양이온 교환 수지로부터 원하는 염기성 단백질을 용출시키는 것으로 이루어진다.

Description

염기성 단백질로부터 엔도톡신을 제거하는 방법{A method for removing endotoxin from the samples containing basic protein}

본 발명은 유용한 단백질 함유 용액으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법에 관한 것이다.

의약적 활성을 가지는 염기성 단백질을 대량으로 생산하기 위한 한 방법으로 재조합 미생물 발현 시스템을 이용하여 생산하는 방법이 이용된다. 이와 같이 재조합 미생물 발현 시스템을 이용하는 경우, 특히 그람음성균 등의 박테리아를 숙주세포로 사용하는 경우, 정제단계에서 숙주세포의 세포벽성분인 엔도톡신을 충분히 제거하는 것이 필수적이다.

엔도톡신은 E. coli와 같은 대부분의 그람음성균의 세포벽에 존재하는 당지질이다. 단백질에 엔도톡신이 존재하는 경우, 아주 미량의 엔도톡신이라도 발열, 엔도톡신 쇼크, 염증유발을 일으킬 수 있다.

엔도톡신을 제거하기 위하여 1) 이온교환 크로마토그래피, 2) 친화크로마토그래피 3) 울트라필트레이션 4) 계면활성제를 이용한 상전이 등이 제시되었다.

그러나 DNA 결합 단백질과 같은 염기성 단백질은 양전하를 띠는 자체 특성상음전하를 띠는 엔도톡신과 정전기적 인력에 의한 결합이 이루어질 수 있어 이온교환 및 친화 크로마토그래피에 의해 엔도톡신이 충분히 제거되지 않는다 (Journal of immunological Methods. 132(1990)191-195).

또한 울트라필트레이션의 경우 일반적으로는 10K 컷오프의 막을 사용하여 이보다 작은 원하는 분자는 막을 통과시키고 이보다 큰 분자량을 갖는 엔도톡신은 잔류시킴에 의해 엔도톡신을 제거할 수 있다. 그러나 원하는 물질이 단백질 등과 같은 거대분자의 경우, 컷오프 값이 100K 이상인 막을 사용하여 울트라필트레이션을 여러 번 반복해야 하므로 단백질 손실이 있을 수 있고 제거효율이 떨어진다.

계면활성제 상전이에 의한 제거는 단백질 용액에 계면활성제를 첨가하여 혼합한 후 원심분리에 의해 상전이를 유도한 후 엔도톡신 함유층을 제거하는 것으로, 엔도톡신의 제거 효율은 우수하나 제거공정상 계면활성제가 잔류하고 있어 계면활성제의 제거공정이 추가로 필요하며, 여러 번 반복처리를 해야 하므로 이에 따른 단백질 정제수율 감소와 공정특성상 약 35℃ 이상으로 용액온도를 높여 주어야 하므로 온도에 민감한 단백질인 경우 사용하기 어렵다.

미국특허 5,747,663에는 세포용해물에 트리톤 X-114를 처리하여 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 기질 용액으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법이 기재되어 있으나 여전히 10~12I.U/mg 정도의 엔도톡신이 잔류한다.

본 발명은 재조합 미생물로부터 염기성 단백질을 분리 정제할 때 효과적으로 엔도톡신을 극미량까지 제거할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명은 염기성 단백질 함유 용액으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은

(a) 재조합 미생물로부터 얻은 염기성 단백질을 함유하는 용액에 계면활성제를 첨가하여 혼합하고,

(b) 상기 용액을 양이온 교환 수지에 로딩하고,

(c) 상기 양이온 교환 수지를 계면활성제를 함유하지 않는 용액으로 세척하고,

(d) 상기 양이온 교환 수지로부터 원하는 염기성 단백질을 용출시키는 것으로 이루어진다.

본 발명의 방법에 의해, 염기성 단백질을 의약적으로 사용이 가능하도록 엔도톡신을 충분히 제거할 수 있다.

본 발명의 방법은 부분적으로 또는 완전히 정제된 염기성 펩타이드 또는 염기성 단백질에 적용할 수 있으며, 따라서 필요에 따라 정제 과정 중 또는 정제 과정의 마지막 단계로 적용할 수 있다.

본 명세서에서 염기성 단백질은 등전점이 7.0보다 큰 단백질 또는 펩타이드를 의미한다. 예를 들어 히스톤과 같이 DNA에 결합하는 단백질, 부포린이나 머게이닌과 같이 항균활성을 갖는 염기성 펩타이드, 염기성 섬유아세포 성장인자 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 계면활성제는 트리톤 X-114, 트리톤 X-110, 트윈 80, 트윈 20 등의 비이온성(non-ionic) 계면활성제가 바람직하다. 계면활성제의 농도는 0.01~10%(v/v)가 바람직하며, 0.1~2%(v/v)가 더욱 바람직하다. 계면활성제의 농도가 낮으면 엔도톡신 제거 효율이 떨어지고, 농도가 높으면 계면활성제를 제거하기 위하여 시간이 많이 소요된다.

본 발명에서 사용할 수 있는 양이온 교환 수지에는 특별한 한정이 없으며, 분리하고자 하는 염기성 단백질의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어 스트림라인 SP, CM-세파로오스 FF, SP-세파로오즈 FF, 포러스 20 HR 등을 사용할 수 있다.

필요한 경우, 염기성 단백질로부터 엔도톡신의 분리를 촉진하기 위하여, 본 발명에서 염기성 단백질을 포함하는 용액에 계면활성제를 혼합한 후 일정시킨 방치시킬 수 있다. 방치 온도 및 시간은 사용하는 계면활성제의 종류, 사용량, 대상 단백질의 특성에 따라 달라질 수 있다. 또한 방치 온도는 염기성 단백질 용액이 동결되지 않으며 또한 단백질의 활성이 유지되는 범위를 고려하여 결정한다. 예를 들어 히스톤의 경우 0~40℃에 방치할 수 있다.

양이온 교환 수지에 단백질 용액을 로딩한 후 먼저 계면활성제를 함유하지 않는 완충용액으로 양이온 교환 수지를 세척함으로써 양이온 교환 수지로부터 단백질 용액에 함유되어 있던 계면활성제와 엔도톡신을 제거할 수 있다. 이때 사용되는 완충용액은 염기성 단백질을 포함하는 용액과 같거나 다른 용액일 수 있다.

양이온 교환 수지로부터 원하는 염기성 단백질을 용출시키기 위하여, 양이온교환 수지의 세척에 사용된 것과 다른 완충용액을 사용한다.

본 발명에서 사용되는 배지조성은 다음과 같다.

RP 배지(pH6.8) : 인산이수소 칼륨 3g/L, 인산수소 칼륨 3g/L, 황산암모늄 4g/L, 트리소디움 시트레이트 2.3g/L, 황산 마그네슘 0.22g/L, 미량 금속액 10ml/L, 가나마이신 0.1g/L

미량금속액 : 시트르산 철(III) 7.3g/L, 염화코발트 0.534g/L, 염화망간 3.2g/L, 염화구리 0.302g/L, 붕산 0.666g/L, 몰리브산 나트륨 0.534g/L, 아세트산 아연 1.687g/L, 티아민 0.534g/L, 염화 칼슘 11.5g/L, 트리소디움 시트레이트 20g/L

RS 배지 : RP 배지, 카사미노 액시드 2g/L

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다.

실시예 1

히스톤 H1.5를 암호화하는 유전자를 얻기 위해 인간의 태반조직 200mg을 얻어 액체질소에 급냉시킨 후 막자사발에서 분쇄하였다. 1.2ml의 다이제스쳔 완충액(150mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH8.0), 25mM EDTA, 0.5% SDS, 프로테이테이즈 K 0.1mg/ml)을 첨가하고 50℃에서 12시간 반응시킨 후 Short protocols in molecular biology(1992)에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. 얻은 게놈 DNA에 다음의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시한 후 0.7 kb의 산물을 얻고 BamHI과XhoI으로 절단하였다. 플라즈미드 pET32a(Novagen)를 같은 제한효소로 자른후 중합효소연쇄반응 산물을 연결하여 pET32a-HH14을 제조하였다.

프라이머

5'-GGTGCCAAGGATCCATGTCGGAAACCGCTCCTGCCGA-3'

5'-GGTGCCACTCGAGTTACTTCTTTTTGGCAGCCGC-3'

pET32a-HH14에 대해 다음의 프라이머로 중합효소연쇄반응을 실시한 후 NdeI과 BamHI으로 절단하고, 한국특허출원 2000-36803의 실시예 1을 참고하여 제조한 pGNX4F4M을 같은 제한효소로 절단한 후 두 DNA을 연결하여 pGNX4-HH14를 제조하였다. 이 플라즈미드를 E.coli TG1에 형질전환시켜 양성 콜로니를 얻은 후 RS배지 접종하여 30℃에서 12시간 전배양하였다. 전배양액을 RS 배지 1.5L가 담긴 5L 발효조(한국발효기)에 접종하고 30℃, 1000rpm, 1.0vvm에서 Abs660 60이 될 때까지 배양 후 락토오즈를 30g/L로 첨가하고 배양온도를 37℃로 올려 12시간 동안 배양하였다.

프라이머

5'-GGGCATATGATGTCGGAAACCGCTCCTGCCGA-3'

5'-GGGGGATCCTTACTTCTTTTTGGCAGCCGC-3'

실시예 2

배양액 10L를 5000xg의 속도로 20분간 원심분리하여 세포펠렛을 회수한 후 0.1M 염화나트륨이 함유된 인산칼륨 완충액(pH 8.0) 50mM 첨가하여 10L가 되도록 현탁시켰다. 이 현탁액을 마이크로플루다이저(microfluidizer, Microfluidics사)를이용하여 1000bar, 400mL/min의 속도로 3번 통과시켜 세포를 파쇄하였다. 10L 파쇄용액의 Abs₆₆₀가 50이 되도록, 0.1M 염화나트륨이 함유된 인산칼륨 완충액(pH 8.0)으로 약 2.5배 희석하였다. 스트림라인 SP(Streamline SP, Amersham Pharmacia Biotech) 900ml을 컬럼 (100 X 600mm)에 충진하고 용액 A (200mM 염화나트륨 + 50mM 인산칼륨완충액(pH8.0)) 2.5L로 평형화시킨 후 파쇄액을 로딩한 후 250mL/분의 속도로 용액 A를 UV값이 0이 될 때까지 약 3L를 흘려주어 컬럼내 불순물을 제거하였다. 완충액을 용액 B (500mM 염화나트륨 + 50mM 인산칼륨완충액 (pH8.0))로 바꾸어 UV값이 0으로 떨어질 때까지 약 2L를 흘려주었다. 용액 C(900mM 염화나트륨 + 50mM 인산칼륨완충액(pH8.0)) 2L를 흘려주어 용출시켜 1차 정제된 단백질 용액을 얻고 SDS-PAGE를 하여 22,449Da 크기의 H1.5 단백질 띠를 확인하였다.

용출액을 울트라필트레이션(컷 오프 10K, Millipore)하여 500mL까지 농축한 후 인산칼륨완충액(pH6.8) 50mM 2L를 가하고 다시 500mL까지 농축하면서 염을 부분제거하였다.

XK50컬럼 (50 X 300mm, Amersham Pharmacia Biotech)에 하이드록시아파타이트 타입 I (Hydroxyapatite, Bio-Rad) 300mL을 충진하고 인산칼륨 완충액(pH6.8) 200mM 0.5L로 평형화시켰다. 여기에 1차 정제된 농축액 500mL을 로딩한 후 인산칼륨 완충액(pH6.8) 200mM 약 0.5L을 50mL/분 속도로 흘려주면서 컬럼내 불순물을 제거하였다. 용출액의 UV값이 0으로 떨어지면 인산칼륨 완충액(pH6.8) 400mM 약 0.5L를 컬럼에 같은 속도로 흘려주면서 결합되어 있는 불순물을 용출시켰다. 인산칼륨완충액(pH6.8) 600mM 0.5L를 흘려주어 히스톤H1.5를 함유하는 분획물을 모아 2차 정제된 용액 500ml을 얻었다. 이 용액을 울트라필트레이션(컷 오프 10K, Millipore)하여 100mL까지 농축 후 50mM 인산칼륨 완충액 (pH8.0) 0.5L를 가하여 다시 100mL까지 농축하고 염을 부분제거하였다.

XK50컬럼 (50 X 300mm, Amersham Pharmacia Biotech)에 포러스 20 HS (Poros 20 HS, PerSeptive Biosystems) 200ml을 충진하고 용액 D(200mM 염화나트륨 + 50mM 인산칼륨 완충액(pH8.0)) 0.5L로 평형화시켰다. 2차 정제된 용액 100mL 용액을 로딩하고 용액 D 0.5L를 50mL/분의 속도로 UV값이 0이 될 때가지 흘려주면서 컬럼내 불순물을 제거하였다. 용액 E(500mM 염화나트륨 + 50mM 인산칼륨 완충액(pH8.0)) 0.5L를 다시 흘려주어 컬럼에 결합되어 있는 불순물을 용출시킨 후, 용액 E와 용액 F(1000mM 염화나트륨 + 50mM 인산칼륨 완충액(pH8.0)) 각 2.5L를 선형구배하여 50ml/분의 속도로 용출시키면서 50ml씩 분획하였다. 각 분획물은 Mono S HR 5/5 컬럼(Amerxham Pharmacia Biotech)으로 용액 E와 용액 F로 분석하여 순도가 95% 이상인 분획물만 모아 3차 정제된 용액을 얻었다. 울트라필트레이션(컷 오프 10K, Millipore)하여 100mL까지 농축 후 50mM 인산칼륨 완충액(pH8.0) 500mL를 가하고 다시 200mL까지 농축 및 부분탈염을 실시한 후 이 농축액을 3차 정제액이라 하였다.

실시예 3

3차 정제액에 잔존하는 엔도톡신을 극미량까지 제거하기 위한 방법은 다음과 같다.

3차 정제액 20mL(50mg 단백질)에 50% 트리톤 X-114 0.2mL(0.5% v/v)을 가하고 30분간 10℃에서 교반하였다. SP-세파로오스 FF(SP-Sepharose FF, Amersham Pharmacia Biotech) 50ml을 XK26컬럼 (26X200mm, Amersham Pharmacia Biotech)에 충진하고 용액 G(200mM 염화나트륨 + 50mM 인산칼롬 완충액 (pH8.0) + 0.5% Triton X-114) 100mL로 평형화 시켰다. 트리톤 처리를 한 3차 정제액을 5mL/분의 속도로 로딩한 후 용액 G 100ml을 컬럼내에 흘려주었다. 용액 H(200mM 염화나트륨 + 50mM 인산칼륨 완충액(pH8.0)) 500ml을 흘려주어 컬럼내의 트리톤 X-114를 제거한 후 용액 I(900mM 염화나트륨 + 50mM 인산칼륨 완충액(pH8.0)) 100ml을 흘려주어 히스톤 H1.5용액 100ml을 얻었다. 이 용출액을 투석막(컷오프 10K, Spectrum)에 넣고 증류수에 대해 투석하여 염을 제거하였다. 염이 제거된 용액 100mL을 동결건조하여 정제된 히스톤 분말을 얻었다. 히스톤 분말의 순도는 95%이고 정제수율은 35%이였다.

엔도톡신 양은 제조사(Endosafe사)의 지시에 따라 투구게의 발색반응(LAL 반응)으로 측정하였다. 정제된 히스톤의 엔도톡신 함량은 0.05EU/mg히스톤 이하였다.

비교예 1

실시예 2에서 얻은 3차 정제액 20mL을 투석하여 염을 제거한 후 동결건조하여 엔도톡신 함량을 측정하였다. 그 함량은 7.89 EU/mg히스톤이었다.

비교예 2

실시예 2의 3차 정제액 20mL을 트리톤 X-114를 처리하지 않는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일 조건으로 SP-세파로오즈 FF에 로딩한 후 용출하고 투석으로 탈염, 그리고 동결건조하여 히스톤 분말을 얻었다. 엔도톡신 함량을 측정한 결과 엔도톡신의 함량은 7.48 EU/mg히스톤이었다.

비교예 3

엔도톡신 제거에 사용되는 Aff-Prep Polymyxin Support (Bio-Rad) 25ml을 XK26컬럼 (26X200mm, Amersham Pharmacia Biotech)에 충진하고 용액 J(100mM 염화나트륨 + 50mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.5))로 평형화한 후 실시예 2에서 얻은 3차 정제액 20ml을 5ml/분의 속도로 로딩하였다. 같은 완충액 75ml로 불순물을 용출시켜 제거하고 용액 K(200mM 염화나트륨 + 50mM 인산칼륨완충액 (pH7.5)) 50ml로 용출하고 단백질 용액을 모아 투석을 통한 탈염 및 동결건조한 후 엔도톡신의 함량을 측정한 결과 5.31 EU/mg히스톤이었다.

비교예 4

DEAE-Sepharose FF(Amersham Pharmacia Biotech) 50ml을 XK26컬럼 (26X200mm, Amersham Pharmacia Biotech)에 충진하여 트리스 완충액(pH7.5) 50mM로 평형화시켰다. 실시예 2에서 얻은 3차 정제액 20mL을 로딩한 후 그대로 용출되는 용액을 모아 투석하고 동결건조하였다. 이 때의 엔도톡신 함량은 7.33 EU/mg히스톤이었다.

비교예 5

실시예 2의 3차 정제액 20mL을 울트라필트레이션(컷 오프 100K, Millipore)하여 막을 통과하는 용액을 모아 투석하여 염을 제거하고 동결건조한 후에 측정한 엔도톡신 함량은 0.28 EU/mg히스톤이었다. 단백질 중 일부가 변성되었음이 관찰되었다.

비교예 6

실시예 2의 3차 정제액 20mL을 50% 트리톤 X-114 400ul(1.0%v/v)과 혼합한 후 4℃에서 30분간 교반하여 균일한 용액을 얻은 후 37℃ 수조로 옮겨 10분간 반응시켰다. 이 용액을 25℃에서 10분간 20,000g의 속도로 원심분리하여 상층액을 취하고 다시 같은 양의 트리톤 X-114를 첨가하여 위 과정을 2회 더 반복한 후 상층액을 모아 엔도톡신 함량을 측정하였고 그 양은 0.05EU/mg히스톤 이하였다. 이 경우 1회 실시마다 약 5%의 단백질이 손실되었다.

본발명에 의해 재조합 미생물에 의해 생산되는 염기성 단백질로부터 기타 오염물질 특히 엔도톡신을 검출이 안되는 수준까지 제거할 수 있고, 엔도톡신이 제거된 고순도의 염기성 단백질은 엔도톡신에 의한 부작용이 없는 의약품으로 사용할 수 있다.

Claims

(a) 재조합 미생물로부터 얻은 염기성 단백질을 함유하는 용액에 계면활성제를 첨가하여 혼합하고,

(b) 상기 용액을 양이온 교환 수지에 로딩하고,

(c) 상기 양이온 교환 수지를 계면활성제를 함유하지 않는 용액으로 세척하고,

(d) 상기 양이온 교환 수지로부터 원하는 염기성 단백질을 용출시키는 것으로 이루어지는, 염기성 단백질로부터 엔도톡신을 제거하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질이 DNA 결합 단백질, 염기성 항균 펩타이드 및 염기성 섬유 아세포 인자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질이 히스톤인 방법.
제1항에 있어서, 상기 계면활성제가 비이온성 계면활성제인 방법.
제1항에 있어서, 상기 계면활성제의 농도가 0.01~10%(v/v)인 방법.