CN1204265C - 从生物样品中浓缩并回收病毒酶活性的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了一种从存在于生物样品中的有包膜病毒中浓缩并回收酶活性的方法。所述方法包括以下步骤：将所述生物样品在第一缓冲液中与病毒结合基质如阴离子交换基质接触，以将存在于样品中的病毒颗粒结合到所述基质上，用第二缓冲液洗涤载有所述病毒颗粒的所述基质，以除去干扰病毒酶活性的组分，在第三缓冲液中裂解固定化的病毒粒子并从第三缓冲液中回收所浓缩的病毒酶活性。另外，公开了一种商业成套试剂，所述成套试剂包含用于从存在于生物样品中的有包膜病毒中浓缩并回收的酶活性的实验步骤中的书面说明和/或资料载体说明，以及至少一种测定所必需的成分。

Description

从生物样品中浓缩并回收病毒酶活性的方法
本发明涉及从生物样品中浓缩并回收病毒保持活性的酶的方法。更准确地说，本发明涉及从存在于生物样品的有包膜病毒中浓缩并回收保持活性的酶的方法。本发明也涉及可用于实施本发明的方法的商业成套试剂(package)。
发明背景
在病毒体(病毒粒子)中，蛋白壳体覆盖着病毒核酸，在一些更为复杂动物病毒中，壳体本身被包含膜脂和糖蛋白的包膜包围着。在这些有包膜病毒中，现在最受关注的是各种反转录病毒，尤其是HIV(人免疫缺陷病毒)。反转录病毒这个名字来自这些病毒遗传信息传递的方向，即从细胞的RNA到DNA。发现一些反转录病毒毒株在一种物种中是共生的，而在另一种物种中是致病的。这些发现显示了异种移植(移植动物器官给人类)潜在的严重问题。内生反转录病毒和外生反转录病毒都可以造成在种内和种间垂直和水平转移遗传物质，并提供新病原体进化的机理。
在前十年期间，对诊断和监控反转录病毒感染的方法以及研究新反转录病毒发病机理的的需求不断增长。当前用于控制HIV感染的方法最好地说明了现有技术。在实验室中通过以下步骤检测和监控HIV感染：a)针对HIV抗原的抗体，b)循环HIV抗原，c)病毒分离，d)循环中的HIV RNA、和e)整合到细胞中的原病毒。选择的方法取决于试验的目的和病期。
当前可接受的临床环境中病毒负载的标记是测量血浆中HIVRNA的拷贝数。可以通过PCR、NASBA或者通过分支DNA技术(Revets等人，1996)完成。当前使用的测定的检出限是20 RNA拷贝/ml血浆(Perrin等人，1998)。由于所有检测病毒核酸的技术都基于序列特异引物的结合，所以存在所述引物不与样品中的新毒株或序列变异体杂交的显著危险性。
当推断体内情况的结果时，出现涉及体外检测感染参数的另一个重要方面。几个实验室技术包括一个扩增阶段，期间发生选择步骤。在最坏的情况下，所扩增的主要病毒变异体是与所用引物最佳匹配的那些变异体，而不是在体内处境中最丰富的变异体。
因此，对量化病毒复制和研究抗病毒物质的作用来说，直接检测来自患者血液样品中的病毒酶应该是细胞培养或基于核酸的方法的诱人的替代方法。所要克服的阻碍是测定的灵敏度和从宿主特异性酶和活性抑制物质中可再现地分离所述病毒酶。
本发明通过浓缩并回收保持活性的酶而不用分离病毒体，使得能够检测来自存在于生物样品中的有包膜病毒的保持活性的酶。
为浓缩和纯化不同病毒而设计的现有技术方法是或者基于病毒蛋白抗原性质的特异性方法，或者基于病毒的基本化学特性或物理特性的通用方法。仅后一种类型的方法可被认为与纯化抗原性高度易变的反转录病毒如HIV相关。
传统上通过不同类型的离心，或者仅仅沉淀病毒或结合使用例如聚乙二醇的沉淀剂(US5661022)，部分纯化了病毒。密度梯度离心的结果是获得更纯的病毒制剂(US4729955)。
另一种方法是将病毒与不同类型的吸附剂结合。Porath和Jansson(US3925152)使用不溶性有机大孔聚合物，所述大孔聚合物选自琼脂、琼脂糖、葡聚糖和包含由含氮碱性基团和羧酸酯基或磺酸酯基组成的两性取代基的纤维素。可以在它们的体系中用连续不同离子强度的溶液洗脱被吸附的病毒，以达到病毒变异体的分离。在过去二十年间，他们的初创方法已经被沿用于基于病毒与包含阴离子交换残基或阳离子交换残基的凝胶之间的相互作用的许多相关的纯化技术中(US3655509)。例如已经采用阳离子交换(US5447859，US4138287)或阴离子交换(US5837520，US5661023)纯化了反转录病毒和相关的乙型肝炎病毒。上面所举的方法都基于在低离子强度下结合病毒而在高离子强度下洗脱。
再一种纯化病毒和病毒核酸的方法基于将病毒与水不溶性交联聚羟基羧酸聚合物结合(US5658779)。病毒在pH6.0-pH8.0可能通过疏水作用与所述聚合物结合，并可以在pH8.0-pH11.0被解吸。这种技术的一个有趣的应用涉及病毒核酸的分离。在一个这样的实例中，来自细菌溶菌产物的噬菌体在第一步中吸附到所述聚合物上。然后洗涤所述聚合物，并采用螯合剂如EDTA或者变性剂如SDS使结合的病毒破裂。于是病毒蛋白吸附于聚合物上，而获得大体上不含相互作用蛋白的病毒核酸。提出了应用相似方法纯化病毒蛋白，但是所描述的技术将病毒蛋白与所有其他吸附于聚合物的细胞成分和病毒成分一起释放。
本发明人已经广泛研究了病毒酶反转录酶(RT)活性的检测。先前已经直接测定血清或血浆中的RT活性(Awad，R.J.K.等人1997，Ekstrand等人1996)。在这些早期研究中遇到的一个问题是在初次感染后马上诱导出高效价的RT活性抑制性抗体。另一个问题是HIV阴性对照样品中偶然出现RT抑制剂。
发明的描述
本发明提供了解决上面提到的现有技术问题的方法。而且，它可以用于从大体积液体即含很少量病毒的细胞培养上清液中浓缩病毒保持活性的酶。另一种应用是将病毒酶从高度抑制性样品例如组织或培养细胞的提取物中转移到适合酶测定条件的环境中。
因此，本发明提供了从粗制生物样品例如血液、血浆、血清、细胞培养液和细胞提取物中，浓缩并回收病毒保持活性的酶(尤其从有包膜病毒中)的方法。它是基于病毒体被捕获于固体基质上的分离步骤的。通过洗涤步骤除去酶抑制性抗体和其他抑制剂，并通过裂解固定化的病毒体释放酶。结合步骤和裂解步骤都是重要的。结合步骤必须有能力优先几乎定量地固定化来自具有很高蛋白浓度的生物液体例如血清或血浆中的少量病毒体，而不结合免疫球蛋白(Ig)或者其他潜在的抑制物。裂解步骤应该近乎定量地释放病毒酶于如下环境中：该环境防止酶与分离基质结合，稳定天然酶并适宜于最佳测定条件。
具体而言，本发明涉及从存在于生物样品中的有包膜病毒中浓缩并回收保持活性的酶的方法，所述方法包括以下步骤：
在缓冲物浓度范围为100-500mM、pH4.0-8.5、并任选包含离子强度高至2M的离液离子的第一缓冲溶液中，将所述生物样品与病毒结合基质接触，以使存在于样品中的病毒粒子附着在基质上，
用缓冲物浓度为1-100mM且包含浓度为0.1-1M的阳离子、pH为4-9的第二缓冲液，洗涤载有所述病毒粒子的基质，以除去干扰病毒酶活性的成分，
在缓冲物浓度为10-500mM并含有非变性去污剂、pH6-9的第三缓冲液中，裂解固定化的病毒粒子，
并从第三缓冲液中回收所浓缩的保持活性的病毒酶。
在本发明的一个实施方案中，所述病毒结合基质是阴离子交换基质，例如包含叔胺和/或季铵基团的阴离子交换基质，如在150mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)pH6.0中平衡的Fractogel EMD DMAE和Fractogel EMD TMAE。
在另一实施方案中，第一缓冲液选自：150mM MES pH6.0和200mM碘化钾(KI)，第二缓冲液选自：10mM MES pH6.0和500mM醋酸钾(KAc)，而第三缓冲液选自：包含一种去污剂如1％Triton X 100和一种缓冲物如100mM(N-(2-羟基乙基哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(Hepes)pH7.6的适合于酶测定的缓冲液。
在一个特别优选的实施方案中，所述经浓缩并回收的病毒酶活性是反转录酶(RT)活性。
所述生物样品优选选自血清样品和血浆样品。
本发明也涉及可用于实施本发明方法的商业成套试剂。所述成套试剂包含用于从存在于生物样品中的有包膜病毒中浓缩并回收保持活性的酶的实验步骤的书面说明和/或资料载体说明，以及至少一种以下成分：
一种病毒结合基质；
第一缓冲溶液，其缓冲物浓度范围为100-500mM、pH4.0-8.5且包含离子强度高至2M的离液离子；
第二缓冲液，其缓冲物浓度为1-100mM且包含浓度为0.1-1M的阳离子、pH为4-9；
第三缓冲液，其缓冲物浓度为10-500mM且包含非变性去污剂、pH为4-9；
微型柱；和
塑料管。
在商业成套试剂的一个优选实施方案中，所述病毒结合基质是阴离子交换基质，
所述第一缓冲液选自：150mM MES pH6.0和200mM碘化钾(KI)；
所述第二缓冲液选自：10mM MES pH6.0和500mM醋酸钾(KAc)；且
所述第三缓冲液选自：包含一种去污剂如1％Triton X 100和一种缓冲物如100mM(N-(2-羟基乙基哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(Hepes)pH7.6的适合RT测定的缓冲液。
在一个特别优选在实施方案中，所述阴离子交换基质是包含叔胺和/或季铵基团的阴离子交换基质，在150mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)pH6.0中平衡的Fractogel EMD DMAE和Fractogel EMDTMAE。
关于选择缓冲液的考虑
A)结合缓冲液(第一缓冲液)
结合缓冲液用于调节样品的pH和离子强度至合适值，以最大化病毒粒子的结合，同时最小化宿主成分、例如血浆/血清蛋白、尤其是抗体以及其他潜在的抑制物的结合。
I)pH
我们发现，在系统pH7.5-5.0的缓冲液中，阴离子交换剂和FIV病毒结合，而不结合血浆成分。就应该不结合的血浆成分的等电点(Ip)而论，应该使用尽可能低的pH。新鲜EDTA血浆样品的pH大约为8.5。根据处理(如储存)，该样品的pH可以降至约为8.0。
在将不同血浆的pH标准化以将pH限于3.0-7.5范围的能力方面，研究了许多缓冲液。
当pH值低于6.0时，遇到两个问题。
a)pH值低于5.0，不可能获得浓度达到0.5M的缓冲液。
b)当采用1∶1的血浆和缓冲液混合物时，pH值低于6.0时发生沉淀。离心实验证明，pH值低于6.0时血浆中的病毒粒子也开始沉淀。
因此优选pH范围的选择值为4.0-8.5，并认为pH6.0最佳。
所选择的缓冲液浓度应该在100-500mM范围内，并认为150mM为最佳。
研究了两种在pH范围大约为6.0时起作用的缓冲液，即(二(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)甲烷；2-二(2-羟乙基)-氨基-2(羟甲基)-1，3-丙二醇)(Bis-Tris)和MES。
Bis-Tris为碱性，需要用大量酸调节pH。因此在不同pH值，获得具有pH作用和离子强度的混合物。MES为酸性，为达到所需的pH，需要较少的调节。结合实验显示MES缓冲液作用稍微好些，选择这种缓冲液用于离子强度重要性的研究。
II)离子强度
由于确定了pH范围，我们研究了在何种离子强度下以及存在何种阴离子时病毒粒子仍然结合。主要使用硫酸盐、醋酸盐、氯化物和碘化物。
在较宽的浓度范围内研究了醋酸(Ac)和碘化物这两种在离液序列中离得很远的离子。作用是正如所预期的：与醋酸相比，碘化物在较低浓度下开始影响病毒的结合。
500mM碘化物使结合减弱50％，而需要2M的Ac才能达到这样的效果。
在结合并用缓冲液中Ac和碘化物的不同组合洗涤血浆中的FIV后，研究可以从凝胶洗脱下来的结合Ig的量。/
裂解后，如果在结合时没有盐，则导致Ig的残留量更高(尽管已经用盐洗涤凝胶)。碘化物比Ac更有效，后者引起Ig残留量大约高出1.5倍。在这两个步骤中结合不同的盐，表明在结合中使用碘化物而在洗涤中使用Ac与在整个过程中使用碘化物同样有效。
有用的阴离子可以是弱洗脱液如Ac至强洗脱液如碘化物，以及在离液系列中就特性而言处在这些洗脱剂之间的那些离子，优选Ac、Cl和碘化物，尤其是碘化物。
离子强度的选择值可以不同，可以高至2M，优选0.1-1M，特别是对于碘化物为200mM，而对于Ac为1M。
B)洗涤缓冲液(第二缓冲液)
1)该缓冲液应该尽可能有效地除去凝胶中干扰病毒酶的检测/回收的因子。尤其重要的是除去抗体。
2)该缓冲液不能从凝胶中除去病毒体或裂解病毒体。
3)因为该缓冲液的成分经过一定稀释(大约5-9倍)后，将存在于酶测定中，所以所述成分不可以严重抑制所述酶。
洗涤缓冲液的重要因素是pH和离子强度。
I)pH
蛋白质在高于其等电点的pH下与阴离子交换剂结合并保持结合。不同免疫球蛋白的Ip不同，但平均处于pH8.9。
我们的FIV病毒体实验表明，在包含0.1M KCl的缓冲液中，在pH5.8-7.6范围内，病毒的确很好地与几种不同的阴离子交换剂结合。在用缓冲液于相同pH下洗涤之后，在整个pH范围内，裂解回收率高。这样，FIV的Ip＜5.8。
所选择的洗涤缓冲液pH范围是4-9(尽管可能使用可能更低的pH值)。
优选pH范围是5.5-8(可能高于8.0时对Ig的洗涤作用弱)，尤其是6-7.5。缓冲物应该以足以保持pH稳定的相对低浓度存在，但不需要太高浓度的缓冲物而不能在裂解阶段改变pH。
所选择的缓冲物浓度范围是1-100mM。优选5-50mM，最佳是10mM。
II)离子强度
洗涤时太高的阳离子浓度可以释放病毒，太低的浓度导致在裂解物中残留Ig和其他抑制剂。
实际使用的离液阳离子影响浓度极限。原则上是使用尽可能高而不释放病毒的浓度。
稀释(大约5-9倍)后，所述浓度也受所述酶(如RT)测定中的离子作用的限制，参见实施例4。
根据基质的性质，在给定盐浓度下，不同阴离子交换剂可能导致残留或多或少的Ig。
例如，当Fractogel TMAE在pH6.0下洗涤时适用以下方法：
1)用高至0.5M的Ac洗涤没有病毒损失。1M时回收率大约50％。高至0.25M时仍有大约0.2％的残留Ig。0.5M和更高时有少于0.02％的残留Ig。
2)用高至0.25M的氯化物(Cl-)洗涤时没有病毒损失，0.5M时大约有50％损失，1M时损失所有病毒。在0.25M和更高的Cl-下残留的Ig少于0.02％。
3)在没有血清蛋白的情况下，高浓度碘好象不可逆地影响病毒，以致我们不能回收任何酶(RT)的活性。因此碘适用于结合阶段，但不应该用于洗涤缓冲液中。
所选择的洗涤缓冲液阳离子浓度范围是0.1-1M，优选0.2-0.6M，特别是Ac-和Cl-以0.2-0.6M使用。
C)裂解缓冲液(第三缓冲液)
裂解步骤应该接近定量地将病毒酶释放到防止酶与分离基质结合、稳定天然酶并合适于最佳测定条件的环境中。
I)去污剂
去污剂对于裂解病毒是必不可少的。有大量的去污剂，在本文中，所述去污剂应该是“非变性去污剂”如聚氧乙烷脱水山梨醇(Tween)或叔辛基苯氧基聚乙氧乙醇(Triton X-100)。不同的去污剂裂解病毒体的作用或强或弱，它们在高浓度下在酶(RT)测定中的干扰相当小。因此不需要浓度的具体范围。可以提到Triton X-100在0.1％无效，而在5％开始引起问题。
II)pH
pH必须适合所选择酶测定的pH。而且，所述pH不应该允许病毒酶与离子交换剂结合。我们已经发现，在pH5.5-8.5下没有FIV或HIV结合，而HIV RT的Ip接近9.1。因此pH对酶测定的影响是非常重要的。
所选择的pH范围是4-9，优选7-8，最佳是7.6。
应该以足够的高浓度添加缓冲物以调节pH为6.0-7.6。当然，所需浓度随着洗涤缓冲液中的浓度而变。太高的浓度可能干扰酶测定。所选择缓冲物浓度的范围为10-500mM，优选50-200mM，最佳是100mM。
当然，所述缓冲液可以包含有利于所选酶测定的其它成分。
现在将通过以下的实施方案描述，特别是用于提供可以通过我们(Cavidi Tech)市售的比色RT测定(如我们的瑞典专利申请9902410-1所描述)准确分析RT活性的RT样品的方法，说明本发明。这些实施方案和实施例没有限制要求保护的本发明的范围的意图。
实施本发明方法的概述
描述本发明的两个稍微不同的实施方案。
I)分批分离血浆的方法
1)标记所需数目的15ml塑料离心管，以识别要分析的样品。
2)小心地将分离胶悬浮为1∶1的凝胶浆，并转移400μl凝胶浆于每个标记的离心管中。离心所述胶并除去缓冲液。
3)将要分析的每种血浆500μl和等体积的结合缓冲液(A)混合。转移每种血浆-缓冲液混合物至对应含凝胶的标记的离心管中。塞上塞子，摇动所述离心管以悬浮所述凝胶于样品中，并于室温下在定轨摇床上温育1小时。
4)制备洗涤缓冲液(B)，需要30ml缓冲液/样品。
5)让凝胶沉降并除去上清液。加入10ml洗涤缓冲液(B)。塞上塞子，经摇动重悬浮所述凝胶于洗涤缓冲液中。让凝胶沉降大约10分钟。打开塞子，小心吸出洗涤液，避免吸出凝胶。
6)按照步骤6重复洗涤。
7)按照步骤6重复洗涤。
8)将离心管以大约500g离心5-10分钟。吸出凝胶表面上的所有洗涤缓冲液(B)。
9)每管加入180μl裂解缓冲液(C)，塞上塞子，室温下在定轨摇床中温育30分钟。
10)将离心管以大约500g离心5-10分钟。
可以用灵敏的RT活性测定，例如，基于Ekstrand等人1996年描述的方法的CavidiHS-kits，定量测定步骤10的上清液中回收的RT活性。
II)在微型柱上分离血浆的方法
1)标记所需数量的15ml塑料微型柱，以识别要分析的样品。
2)制备洗涤缓冲液(B)，需要20ml缓冲液/样品。
3)小心地将分离胶悬浮为1∶1的凝胶浆，并转移1000μl凝胶浆于每个柱中。
4)将要分析的血浆在结合缓冲液(A)中以1∶1稀释。分析500μl血浆时该系统最优化。
5)打开柱的两端，让每个柱中的缓冲液流出。轻轻地向每个柱的顶端加入最多1000μl按照4)的样品。在柱流干之前，封闭柱，并在开始洗涤步骤之前，让样品吸附60min。
6)用2×10ml洗涤缓冲液(B)洗涤每个柱。
7)当所有洗涤缓冲液都流过柱时，向每个柱加入200μl裂解缓冲液(C)，让柱流干，并在室温下温育30min。
8)把柱转移到具有样品收集管的架子上，并向每个柱另外加入300μl裂解缓冲液(C)。收集含有来自存在于原始样品中的病毒体的RT的洗出液。
可以用灵敏的RT活性测定，例如，基于Ekstrand等人1996年描述的方法的CavidiHS-kits，定量测定步骤8的洗脱液中回收的RT活性。
用于优选实施方案的原料
分离胶：例如平衡于150mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)pH6.0的Fractogel EMD TMAE，或Fractogel EMD DMAE。微型柱如BioradPoly-Prep(7311553)。
塑料管
A)结合缓冲液：300mM MES pH6.0，400mM碘化钾(KI)
B)洗涤缓冲液：10mM MES pH6.0，500mM醋酸钾(KAc)
C)裂解缓冲液：适合于RT分析的缓冲液，包含去污剂如1％TritonX-100和缓冲物如100mM(N-(2-羟基乙基哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(Hepes)pH7.6。
附图简述
图1显示A和B两个图表，它们显示了在标准测定条件下向RT反应混合物中加入不同阳离子的作用。
记号：Ac-(◆)、Cl-(■)、Br-(▲)、I-(○)、SCN-(◇)。
图2显示了按照本发明回收的HIV RT的量和用HIV 1 RNA PCR检测的病毒RNA的量之间的关系。
记号：来自100个健康供血者的混合血浆◆，来自HIV感染个体的血浆●。
图3显示了通过从大体积细胞培养液中浓缩RT活性检测微小量的反转录病毒。
记号：1％血清(空心柱)，10％血清(实心柱)。
实施例
实施例1.各种层析介质固定化反转录病毒的能力的筛选(表1)。将500μl用结合缓冲液以1∶1稀释的掺入FIV的人血浆和100μl所指明的凝胶混合。1小时后，从每个样中取出450μl上清液，并用450μl裂解缓冲液替换。然后再温育所述样品30分钟，检测每种上清液以及裂解部分中RT活性的量，并计算占加入于原始样品中的RT活性的百分比。在所测试的介质中，病毒结合能力有相当程度的不同。最高结合能力发现于具有叔铵或季铵阴离子交换介质中。采用具有良好结合能力的介质回收裂解部分中的RT酶的回收率范围为53-100％，这表明在病毒裂解时，没有发生所释放的RT与阴离子交换剂的结合。我们选择分离介质的主要标准是良好的病毒结合能力和高的FIV RT回收率。
实施例2.从加入人血浆中的不同反转录病毒中回收RT活性(表2)。将四种不同的反转录病毒中的每一种掺入四种人血浆样品中。用样品缓冲液以1∶1稀释所述样品，并按照“在微型柱上分离血浆的方法”，采用500μl Fractogel TMAE highcap凝胶进行加工。将每种RT回收于300μl裂解缓冲液中，并检测裂解产物中RT和Ig的量，换算成原始样品中对应量的百分比。在300μl裂解产物部分中回收了存在于原始病毒制剂中39-74％的RT活性。对不同样品，Ig浓度降低2000-12000倍。
实施例3.向RT反应混合物中加入不同阳离子的作用(图1)。将给出所示终浓度的离液阳离子加入到Cavidi HS kit Lenti RT反应液中。评价五种不同阳离子对两种RT活性的作用：A)FIV病毒体，相当于0.4μU RT活性，B)重组HIV 1 RT，相当于0.6μU RT活性。将每种阳离子浓度下的RT活性换算成在标准条件下检测的对照的百分数。不同阳离子的抑制作用与所述离子的离液作用有关。离液序列最高的阳离子-SCN-和I-在所有测试的浓度下都是抑制性的。中等的离子-Br-和Cl-在低于100mM的浓度下刺激反转录病毒RT，但在较高的浓度下抑制作用增强。从图1可以推断，在反应混合物中可以包含浓度高至70mM的Cl-离子或Br-离子以及浓度高至200mM的Ac-离子，而不引起副作用。
实施例4.按照本发明回收的HIV RT的量和用HIV 1 RNAPCR测定的病毒RNA的量之间的关系(图2)。将来自HIV感染个体的200μl EDTA血浆样品以及来自从100位健康供血者中获得的混合样品的200μl EDTA血浆样品，按照“分批分离血浆的方法”进行加工。采用Cavidi HS kit Lenti RT，在过夜RT测定中测定从每种样品中回收的RT活性的量。按照内部标准曲线，将所获得的RT活性换算成pg HIV 1 RT。通过标准HIV 1 RNA PCR(Roche，Cobas Amplicor HIV1.5型控制器)测定每个样品中HIV 1 RNA的量。小于50 RNA拷贝/ml的值绘制为等于25(图2)。发现按照本发明回收的血浆RT的量和用PCR测定的HIV RNA的量之间密切相关(r＝0.85，p＜0.001，Spearman等级相关(Spearman correlation by ranks))。
实施例5.通过从大体积细胞培养物中浓缩RT活性测定微量反转录病毒(图3)。
制备包含或者1％(空心柱)或者10％(实心柱)的新生小牛血清(Gibco)的eagles基本必需培养基(MEM)。将相当于0.6mU RT活性的少量FIV病毒体加入到来自每种MEM/血清混合物的1ml、5ml以及25ml的样品中。每个样品都通过1ml DEAE A25 Sephadex微型柱，然后用20ml洗涤缓冲液洗涤，最后按照“在微型柱上分离血浆的方法”将RT活性洗脱于300μl洗脱缓冲液中。只要所述血清浓度不超过1％，则通过这个方法我们从25ml培养基中回收了超过70％的病毒并相关RT。对应的图在10％血清下大约为50％(图3)。
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Shabram P W，Huyghe B G，Liu X，Shepard H M.纯化病毒载体的方法。US5837520：
表1.各种层析介质固定化反转录病毒的能力的筛选
商标                       相互作用      活性基团                            基质          *上清液中  *从凝胶回收 *回收的总
                           类型                                                              的RT活性    的RT活性     RT活性
                                                                                             (％)        (％)         (％)
Fraktogel，DEAE            阴离子，弱    R-CH2N(C2H5)2                 甲基丙烯酸酯      6          68           74
DEAE-Si500                 阴离子，弱    R-CH2N(C2H5)2                 硅石              9          96           105
Fraktogel，DEAE            阴离子，弱    R-CH2N(CH3)2                   甲基丙烯酸酯      9           73           83
Fraktogel，TEAE            阴离子，强    R-CH2N+(CH3)3                  甲基丙烯酸酯      11          73           85
Fraktogel，TEAE high cap   阴离子，强    R-CH2N+(CH3)3                  甲基丙烯酸酯      12          100          112
DEAE Ceramics Hyper DF     阴离子，弱    R-CH2N(C2H5)2                 陶瓷              19          98           117
Macro prep High Q          阴离子，强    R-CH2N+(CH3)3                  甲基丙烯酸酯      21          72           93
Macro prep DEAE support    阴离子，弱    R-CH2N(C2H5)2                 甲基丙烯酸酯      38          47           85
Toyopearl DEAE 650M        阴离子，弱    R-CH2N(C2H5)2                 甲基丙烯酸酯      40          64           104
AG4-X4                     阴离子，弱    R-CH2N(CH3)2                   丙烯酸类聚合      40          64           104
                                                                            物
QAE Sephadex A25           阴离子，强    R-CH2N+(C2H3OHCH3)(C2H5)2 琼脂糖            42          53           96
DEAE Sephadex A25          阴离子，弱    R-CH2N(C2H5)2                 葡聚糖            46          56           102
Express ion exchange       阴离子，弱    R-CH2N(C2H5)2                 纤维素            50          57           107
Sephadex G25               对照          无                                 葡聚糖            81          38           118
*占加入到原始样品中的RT活性的百分率。
表2.从加入人血清中的不同反转录病毒中回收RT活性。
                 加入到血浆
                 样中的RT
病毒             (mU RT活性)      RT回收率(％)       Ig回收率(％)
FIVa            0.24             66                 0.023
BLVb            0.68             41                 0.014
JSRBc           0.10             74                 0.047
MuLVd           0.35             39                 0.007
a猫免疫缺陷病毒
b牛白血病病毒
c肺腺瘤病绵羊反转录病毒
d鼠类白血病病毒

Claims (12)

1.一种从存在于生物样品中的有包膜病毒中浓缩并回收保持活性的酶的方法，所述方法包括以下步骤：
在缓冲物浓度范围为100-500mM、pH5.0-7.5、并任选包含离子强度高至2M的离液离子的第一缓冲溶液中，将所述生物样品与病毒结合阴离子交换基质接触，以使存在于所述样品中的病毒粒子结合在所述基质上，
用缓冲物浓度为1-100mM且包含浓度为0.1-1M的阳离子、pH为4-9的第二缓冲液，洗涤载有所述病毒粒子的所述基质，以除去干扰病毒酶活性的成分，
在缓冲物浓度为10-500mM并含有非变性去污剂、pH4-9的第三缓冲液中，裂解所述固定化的病毒粒子，
并从所述第三缓冲液中回收所述经浓缩的保持活性的病毒酶。
2.权利要求1的方法，其中所述阴离子交换基质包含叔胺和/或季铵基团。
3.权利要求1的方法，其中所述阴离子交换基质选自：在150mM MES pH6.0中平衡的FractogelEMD DMAE和FractogelEMD TMAE。
4.权利要求1-3中任何一项的方法，其中所述第一缓冲液选自：150mM MES pH6.0、200mM碘化钾(KI)。
5.权利要求1-3中任何一项的方法，其中所述第二缓冲液选自：10mM MES pH6.0、500mM醋酸钾(KAc)。
6.权利要求1-3中任何一项的方法，其中所述第三缓冲液选自：包含一种去污剂如1％Triton X 100和一种缓冲物如100mM(N-(2-羟基乙基哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(Hepes)pH7.6的适合于酶测定的缓冲液。
7.权利要求1-3中任何一项的方法，其中所述经浓缩并回收的病毒酶活性是反转录酶(RT)活性。
8.权利要求1-3中任何一项的方法，其中所述生物样品选自血清样品和血浆样品。
9.一种商业成套试剂，所述成套试剂包含用于从存在于生物样品中的有包膜病毒中浓缩并回收保持活性的酶的实验步骤的书面说明和/或资料载体说明，以及
以下成分：
一种病毒结合阴离子交换基质；
第一缓冲溶液，其缓冲物浓度范围为100-500mM、pH4.0-8.5且包含离子强度高至2M的离液离子；
第二缓冲液，其缓冲物浓度为1-100mM且包含浓度为0.1-1M的阳离子、pH为4-9；
第三缓冲液，其缓冲物浓度为10-500mM且包含非变性去污剂、pH为4-9；以及任选的
微型柱；和
塑料管。
10.权利要求9的商业成套试剂，其中
所述第一缓冲液选自：150mM MES pH6.0、200mM碘化钾(KI)，
所述第二缓冲液选自：10mM MES pH6.0、500mM醋酸钾(KAc)，
所述第三缓冲液选自：包含一种去污剂如1％ Triton X 100和一种缓冲物如100mM(N-(2-羟基乙基哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(Hepes)pH7.6的适合于酶测定的缓冲液。
11.权利要求10的商业成套试剂，其中所述阴离子交换基质包含叔胺和/或季铵基团。
12.权利要求11的商业成套试剂，其中所述阴离子交换基质选自：在15mM MES pH6.0中平衡的FractogelEMD DMAE和FractogelEMD TMAE。
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