CN115197895A - 基于TiO2的外泌体组学串联提取技术及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于TiO2的外泌体组学串联提取技术及其应用。本发明通过TiO2捕获外泌体,加入高比例的有机溶剂使蛋白质大量聚集、沉降,进而非特异性的吸附在TiO2表面,分离出外泌体中的代谢物,并进一步提取外泌体中的蛋白质。本发明技术方案能够同时获取外泌体的蛋白质组及代谢组信息,步骤简单易操作,具有良好的稳定性和重复性,在筛选疾病的诊断标志物方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及基于TiO2的外泌体组学串联提取技术及其应用。
背景技术
外泌体是一种由不同类型细胞分泌的球状囊泡,直径在30nm-150nm之间,包含蛋白质、脂质、核酸等生物活性分子,能够在血液、尿液、脑脊液,乳液等多种体液环境中检测到,是细胞间信号交流的重要介质。研究表明,外泌体与多种疾病发生相关,通过检测外泌体的形态、数量以及内含物的异常表达,对疾病的早期诊断、药物研发、预后监测等具有重要意义。
血液是临床检验最常用的液体活检样本,由于其成分复杂,在分离外泌体时往往将高丰度血浆蛋白一并分离,对实验结果造成严重干扰。超速离心法被称为外泌体分离的“金标准”,但分离得到的外泌体纯度低,耗时至少3个小时,且需要昂贵的超速离心机。尺寸排阻法操作简单,得到的外泌体纯度较高,能有效去除大多数高丰度血浆蛋白,但提取产率低,不能同时处理多个样本使得临床应用受限。TiO2方法能够快速的从血浆中捕获外泌体,提取过程仅需5分钟,操作步骤简单,但同时非特异性吸附了大量的血浆脂蛋白,外泌体提取纯度低。其它常见的外泌体分离方法有超滤法、沉淀法、免疫捕获法等,这些方法都存在外泌体提取效率和纯度低的问题,且只能获取外泌体单组学信息,对于复杂疾病的研究不能提供多维度的结果。
质谱技术的发展逐渐趋向于微量样本分析,高效的样本前处理方法非常关键,对样本分析的稳定性,重复性和高效性有很大影响。目前常用的蛋白质组样本前处理方法有过滤辅助样本制备(filter-aided sample preparation,FASP),单管固相样本制备(single-pot,solid-phase-enhanced sample preparation,SP3)和in-StageTip(iST)。FASP方法通过不同孔径大小的滤膜收集蛋白产物,通过离心去除洗涤剂等与质谱不兼容的试剂,该方法具有良好的稳定性,但操作繁杂,样本回收率低。iST是一种简单快速的样本制备方法,能够在单管内实现蛋白质的变性,酶解和脱盐,最大限度的减少了样本转移损失,但该方法的稳定性较差,与蛋白裂解剂和清洁剂不兼容。
因此,实现外泌体组学的高效快速提取是亟待解决的问题。
发明内容
为弥补现有技术的不足,本发明提供了基于TiO2的外泌体组学串联提取技术及其应用,灵敏度高,能够同时获取外泌体的蛋白质组及代谢组信息。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面提供了一种提取外泌体组学的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)自样本中提取外泌体;
(2)提取外泌体中的代谢物;
(3)提取外泌体中的蛋白质。
进一步,步骤(1)使用TiO2提取外泌体。
进一步,所述样本为血浆样本。
进一步,TiO2与血浆样本的重量体积比为3:10-5:1(mg:μL)。
进一步,TiO2与血浆样本的重量体积比为3:10-1:2(mg:μL)。
进一步,TiO2与血浆样本的重量体积比为1:2(mg:μL)。
进一步,所述血浆样本为1-100μL。
进一步,所述血浆样本为1μL。
进一步,所述TiO2的质量为0.3-5mg。
进一步,所述TiO2的质量为0.3-0.5mg。
进一步,所述TiO2的质量为0.5mg。
进一步,步骤(2)通过加入有机溶剂提取外泌体中的代谢物。
进一步,所述有机溶剂为乙腈。
进一步,步骤(2)还包括破碎外泌体提取外泌体中的代谢物。
进一步,采用超声的方式破碎外泌体。
进一步,步骤(3)包括加入变性剂使吸附于TiO2上的蛋白质变性。
进一步,所述变性剂包括TCEP、CAA、SDC和/或TEAB。
进一步,步骤(3)还包括通过加入蛋白酶将蛋白酶解为肽段。
进一步,所述蛋白酶包括胰酶和/或赖氨酸蛋白酶。
进一步,所述赖氨酸蛋白酶为Lys-c。
进一步,所述胰酶与蛋白质量比为1:50。
进一步,所述Lys-c与蛋白质量比为1:100。
进一步,将蛋白酶解为肽段还包括加入碳酸氢铵。
进一步,步骤(3)还包括终止酶解反应。
进一步,步骤(3)还包括沉淀SDC。
进一步,通过加入甲酸沉淀SDC及终止酶解反应。
进一步,步骤(3)还包括脱盐。
进一步,通过脱盐柱进行脱盐。
进一步,所述脱盐柱为C18脱盐柱。
进一步,步骤(3)还包括去除非特异性吸附的血浆脂蛋白。
进一步,通过加入乙腈和/或乙醇去除非特异性吸附的血浆脂蛋白。
进一步,所述方法包括:
(1)取血浆样本,加入TiO2,孵育,获得外泌体样本;
(2)加入乙腈,超声破碎,释放外泌体中的代谢物和蛋白质,孵育,使蛋白质聚集并吸附在TiO2表面;
(3)离心,获得含有外泌体代谢物的上清;
(4)剩余沉淀中分别加入乙腈和乙醇清洗,离心去除上清,加入变性剂孵育,加入碳酸氢铵,加入胰酶和Lys-c,孵育,将蛋白酶解为肽段,加入甲酸,去除SDC并终止酶解反应,离心去除TiO2并收集肽段;
(5)使用C18脱盐柱进行脱盐。
本发明的第二方面提供了一种检测外泌体不同组学的方法,所述外泌体组学通过本发明第一方面所述的方法提取。
进一步,所述检测外泌体组学的方法为质谱检测。
进一步,加入甲酸和/或冰甲醇用于质谱检测。
进一步,在外泌体蛋白质中加入甲酸用于质谱检测;在外泌体代谢物中加入冰甲醇用于质谱检测。
进一步,所述甲酸纯度为1%。
进一步,所述冰甲醇纯度为80%。
本发明的第三方面提供了一种提取外泌体组学的设备,所述设备包括:
(1)取样装置;
(2)外泌体组学获取装置。
进一步,所述外泌体组学获取装置包括执行本发明第一方面所述的方法中所使用的装置。
本发明的第四方面提供了一种检测外泌体组学的设备,所述设备包括检测装置和本发明第三方面所述的设备。
进一步,所述检测装置包括执行本发明第二方面所述的方法中所使用的装置。
本发明的第五方面提供了本发明第一方面所述的方法、本发明第二方面所述的方法、本发明第三方面所述的设备或本发明第四方面所述的设备在筛选诊断疾病标志物中的应用。
进一步,所述疾病为外泌体相关疾病。
进一步,所述外泌体相关疾病包括自身免疫疾病、免疫相关疾病、肿瘤或障碍疾病。
进一步,所述外泌体相关疾病为肿瘤。
进一步,所述肿瘤为乳腺癌。
本发明的第六方面提供了代谢物标志物在制备诊断乳腺癌的产品中的应用,所述代谢物标志物包括(+)-15,16-Dihydroxyoctadecanoic acid、N-Desmethylselegiline或Rotundine A。
进一步,所述产品包括检测代谢物标志物含量的试剂。
进一步,所述试剂包括通过色谱、光谱或质谱仪/光谱法进行检测代谢物标志物含量的试剂。
进一步,所述色谱包括GC,CE,LC,HPLC 5和UHPLC;光谱包括UV/Vis,IR,NIR和NMR;质谱仪/光谱法包括ESI、四极质谱仪、离子阱质谱仪、TOF(飞行时间)质谱仪、Orbitrap质谱仪、扇形磁场质谱仪、扇形静电场质谱仪、离子回旋共振(ICR)以及它们的组合,包括单级四极杆(Q)和三级四极杆((QqQ),QqTOF,TOF-TOF,Q-Orbitrap,APCI-QqQ,APCI-QqTOF,MALDI-QqQ,MALDI-QqTOF和MALDI-TOF-TOF。
本发明的优点和有益效果:
本发明的技术方案具有较高的灵敏度,可以同时获取外泌体的蛋白质组及代谢组信息,可用于筛选疾病蛋白质组和代谢组潜在的生物标志物。步骤简单易操作,具有良好的稳定性和重复性。
附图说明
图1是技术流程图;
图2是外泌体表征图,其中,2A是外泌体透射电镜图,2B是外泌体粒径分析图;
图3是技术方案稳定性及重复性评估图,其中,3A是外泌体蛋白质组三次重复样本间的相关性分析图,3B是三次技术重复外泌体蛋白质组定性结果图,3C是三次技术重复外泌体代谢组样本间相关性分析图,3D是外泌体代谢组样本定量结果变异系数分布图;
图4是不同外泌体提取方法的Western blot实验图;
图5是超速离心法与TiMMEP方法的银染图;
图6是不同TiO2质量提取外泌体的蛋白质组质谱结果图;
图7是不同外泌体蛋白质组样本前处理方法所鉴定蛋白质对比图;
图8是乳腺癌患者和健康人血浆外泌体蛋白质组分析图,其中,8A是主成分分析图,8B是外泌体蛋白质组火山图,8C是差异表达外泌体蛋白质组热图,8D是差异表达蛋白质基因本体分析图;
图9是乳腺癌患者和健康人血浆中提取的外泌体代谢组分析图,其中,9A是偏最小二乘判别分析法图,9B是外泌体代谢组火山图;
图10是蛋白质ROC曲线图;
图11是代谢物ROC曲线图;
图12是三种差异代谢物相对定量图。
具体实施方式
术语“样本”包括但不限于,组织样本(例如肿瘤组织样本),原代或培养的细胞或细胞系,细胞上清,细胞裂解物,血小板,血清,血浆,玻璃体液,淋巴液,滑液,滤泡液(follicular fluid),精液,羊水,乳,全血,血液衍生的细胞,尿液,脑脊髓液,唾液,痰,泪,汗液,粘液,肿瘤裂解物,和组织培养液(tissue culture medium),组织提取物如匀浆化的组织,肿瘤组织,细胞提取物,及其组合。
在本发明的具体实施方案中,样本选自血浆。
术语“血浆”是血液和淋巴液的液体部分,占血液体积的约一半。血浆没有细胞,并且与血清不同,血浆没有凝结。血浆含有抗体和其它蛋白质。
术语“外泌体”是由不同细胞类型在体内分泌的直径30-150nm的质膜囊泡。是由所有细胞分泌并与细胞间相互作用、癌转移等多样生物学机制相关的物质。由于细胞的内吞作用而在细胞内部形成多泡小体后,它们借助于胞吐作用而排出,从而生成。外泌体包含多种细胞内蛋白、DNA、RNA、microRNA或抗原。
术语“代谢物”是指代谢的中间体或终产物,包括细胞、生物体、组织的,或存在于体液中和从上面提到的来源获得的提取物中的内源有机化合物,其具有典型低于1500道尔顿的分子量。“代谢物”具有包括对酶的能源,结构,信号传导,刺激,和抑制影响的功能。代谢物还可以自身具有催化活性。代谢物可以是底物-酶反应的终产物,代谢物的典型实例是糖类、脂类、磷脂、鞘脂类和鞘磷脂、氨基酸、胆甾醇、甾类激素和氧化甾醇,以及其他化合物例如收集在人类代谢物数据库[WishartDS等,HMDB:人类代谢组数据库(HMDB:theHumanMetabolomeDatabase),NucleicAcidsRes.2007Jan;35(数据库版):D521-6(参见http://www.hmdb.ca/)]和其他数据库和文献中的化合物。这包括通过代谢或通过代谢过程产生的任何物质和参与代谢的任何物质。
术语“蛋白质”广义上指代具有两个或多个氨基酸亚基、氨基酸类似物或者拟肽的化合物。所述亚基可以由肽键相连。蛋白质必须包含至少两个氨基酸并且氨基酸最大数目不限,其可以包含蛋白质的序列。氨基酸指代天然和/或非天然或合成的氨基酸,包括甘氨酸以及D和L光学异构体二者、氨基酸类似物和拟肽。
术语“酶解”是由酶催化的分解作用。术语“蛋白酶解”是指蛋白质降解为较小的多肽或氨基酸的过程。
术语“组学”主要包括基因组学(Genomics),蛋白组学(Proteomics),代谢组学(Metabolomics),转录组学(transcriptomics),脂类组学(lipidomics),免疫组学(Immunomics),糖组学(glycomics),RNA组学(RNomics)学,影像组学(Radiomics),超声组学(Ultrasomics),其检测方法包括但不限于质谱术,液相色谱、气相色谱和其他分离方法与质谱术或核磁共振(NMR)的偶联。
在本发明的具体实施方案中,组学包括蛋白组学和代谢组学,检测组学的方法为质谱检测。
术语“设备”通常指可供人们在生产中长期使用,并在反复使用中基本保持原有实物形态和功能的生产资料和物质资料的总称。
在本发明的实施方案中,提取外泌体组学的设备包括取样装置和外泌体组学获取装置,其中,外泌体组学获取装置包括上样装置、混样装置、分离装置、洗涤装置和/或孵育装置。
在本发明的实施方案中,外泌体组学检测设备包括检测装置,所述检测装置包括上样装置、混样装置、质谱仪,所述质谱仪包括但不限于同位素质谱仪、无机质谱仪、有机质谱仪。
术语“标志物”是在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因、蛋白或代谢物。
在本发明的具体实施方案中,所述标志物是蛋白或代谢物。
术语“疾病”包括外泌体相关疾病。
外泌体相关疾病包括但不限于自身免疫疾病、免疫相关疾病、肿瘤或障碍疾病。
自身免疫疾病或免疫相关疾病类型包括但不限于炎症、抗磷脂综合征、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、自身免疫性血管炎、乳糜泻、自身免疫性甲状腺炎、输血后免疫、母体胎儿不相容(maternal-fetal incompatibility)、输血反应、免疫缺陷诸如IgA缺陷、常见变异型免疫缺陷、药物诱导性狼疮、糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、幼年型糖尿病、幼年型类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、多发性硬化、免疫缺陷、过敏、哮喘、银屑病、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、慢性皮肤病、肌萎缩侧索硬化、化疗所致损伤、移植物抗宿主病(graft-vs-host diseases)、骨髓移植排斥、强直性脊柱炎、特应性湿疹、天疱疮、白塞病、慢性疲劳综合症纤维肌痛、化疗所致损伤、重症肌无力、肾小球肾炎、过敏性视网膜炎、系统性硬化、亚急性皮肤型红斑狼疮、包括冻疮样红斑狼疮的皮肤型红斑狼疮、干燥综合征、自身免疫性肾炎、自身免疫性血管炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性心脏炎、自身免疫性脑炎、自身免疫介导的血液病、lc-SSc(局限性皮肤型硬皮病)、dc-SSc(弥漫性皮肤型硬皮病)、自身免疫性甲状腺炎(AT)、格雷夫斯病(GD)、重症肌无力、多发性硬化(MS)、强直性脊柱炎、移植排斥、免疫衰老、风湿性/自身免疫性疾病、混合型结缔组织病、脊柱关节病、银屑病、银屑病性关节炎、肌炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性血管炎、混合型结缔组织病、特发性血小板减少性紫癜、克罗恩病、人类佐剂病、骨性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊柱关节病、特发性炎性肌病、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、免疫介导的肾病、中枢或外周神经系统脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆疾病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、谷蛋白敏感性肠病、惠普尔病、自身免疫性或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形性红斑、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏、荨麻疹、肺部免疫性疾病、嗜酸性肺炎、特发性肺纤维化、过敏性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病、银屑病性关节炎、银屑病、皮炎、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、系统性硬皮病和硬化、与炎性肠病相关的应答、克罗恩病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、成人型呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、肾小球肾炎、过敏性状况、湿疹、哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的状况、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞黏附缺陷症、过敏性脑脊髓炎、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性过敏相关的免疫应答、结核病、结节病、包括韦格纳肉芽肿病的肉芽肿病、粒细胞缺乏症、血管炎(包括ANCA)、再生障碍性贫血、Diamond Blackfan贫血、包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的免疫性溶血性贫血、恶性贫血、纯红细胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺乏症、血友病A、自身免疫性中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病、中枢神经系统(CNS)炎性紊乱、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基膜病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、白塞病、Castleman综合征、Goodpasture综合征、兰伯特-伊顿肌无力综合征、雷诺综合征、干燥综合征、斯-约综合征、大疱性类天疱疮、天疱疮、自身免疫性多内分泌腺疾病、Reiter病、僵人综合征、巨细胞性动脉炎、免疫复合物性肾炎、IgA肾病、IgM多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎的睾丸和卵巢自身免疫性疾病、原发性甲状腺功能减退症、包括自身免疫性甲状腺炎的自身免疫性内分泌疾病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能减退症、爱迪生氏病、格雷夫斯病、自身免疫性多内分泌腺综合征(或多腺性内分泌病综合征)、席汉氏综合征、自身免疫性肝炎、淋巴细胞性间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)对NSIP、格林-巴利综合征、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞性(高安)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、强直性脊柱炎、Berger病(IgA肾病)、快速进行肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、口炎性腹泻(Celiac sprue)(谷蛋白肠病)、冷球蛋白血症、和肌萎缩侧索硬化(ALS)。
肿瘤类型包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人急性髓性白血病、成人原发部位不明癌、成人恶性间皮瘤、艾滋病相关癌症、艾滋病相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、儿童小脑或大脑癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑癌、脑干胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性不明的癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、儿童急性髓性白血病、儿童原发部位不明的癌症、儿童癌症、儿童大脑星形细胞瘤、儿童间皮瘤、软骨肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性紊乱、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、室管膜瘤、上皮样血管内皮瘤(EHE)、食管癌、尤因肿瘤肉瘤家族、尤因肿瘤家族中的尤因肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑素瘤、胆囊癌、胃(gastric)(胃(stomach))癌、胃类癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠性滋养层细胞瘤、脑干胶质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视觉途径胶质瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、急性成淋巴细胞性白血病(也称为急性淋巴细胞白血病)、急性髓性白血病(也称为急性髓细胞性白血病)、慢性淋巴细胞性白血病(也称为慢性淋巴细胞白血病)、白血病(leukaemia)、慢性髓细胞性白血病(也称为慢性髓性白血病)、毛细胞白血病(leukemia)、唇及口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤(艾滋病相关)、淋巴瘤、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、原发灶隐匿转移性颈部鳞状癌、口癌、多发性内分泌肿瘤综合征、儿童多发性骨髓瘤(骨髓癌)、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性髓细胞性白血病、粘液瘤、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、少突神经胶质瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质肿瘤)、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、Sézary综合征、皮肤癌(黑素瘤)、皮肤癌(非黑素瘤)、梅克尔细胞皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、原发灶隐匿转移性颈部鳞状癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、输尿管和肾盂移行细胞癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉途径和下丘脑神经胶质瘤、儿童视觉途径和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、巨球蛋白血症和肾母细胞瘤(肾癌)。
障碍疾病的类型包括但不限于神经性障碍(例如偏头痛;癫痫症;阿尔茨海默病;帕金森病;脑损伤;中风;脑血管疾病(包括脑动脉硬化症、脑淀粉样蛋白血管病、遗传性脑出血和脑缺氧缺血);脊髓性肌萎缩;侧索硬化;多发性硬化;认知障碍(包括健忘症、老年性痴呆、HIV相关性痴呆、阿尔茨海默病相关性痴呆、亨廷顿病相关性痴呆、Lewy体痴呆、血管性痴呆、药物相关性痴呆、谵妄和轻度认知缺损);与帕金森病和抑郁症相关的认知功能障碍;心理缺陷(包括唐氏综合征和脆性X染色体综合征);精神病(包括精神分裂症,例如连续性或发作性、偏执型、青春型、紧张型、分化不良型和残留型精神分裂性障碍)、情感性分裂症、精神分裂症样精神病和妄想症。
在本发明的一些实施方案中,所述外泌体相关疾病为肿瘤。
在本发明的具体实施方案中,所述肿瘤为乳腺癌。
术语“代谢物标志物”或短的“代谢标志物”被定义为适合作为乳腺癌存在和状态的指标化合物,这种化合物是哺乳动物体内的代谢过程中出现的代谢物或代谢化合物。“代谢物标志物”或“代谢标志物”通常在本发明的上下文中同义使用,并且通常是指一种代谢物的量或两种或更多种代谢物的含量或比率。
术语“质谱仪”通常由三个部件组成:离子源、质量分析器和检测器。离子发生器将一部分样品转化为离子。如下所述,根据样品的相(固体、液体、气体)和未知物种的各种电离机制的效率,存在各种各样的电离技术。质谱仪通常还包括提取系统,该提取系统从样品中去除离子,然后将离子通过质量分析器并且到达检测器上。片段的质荷比(m/z)的差异允许质量分析器通过它们的质荷比对离子进行分类。最后,检测器测量指示物的量的值,从而提供用于计算存在的每种离子的丰度的数据。
在典型的质谱分析程序中,第一步包括样品的电离。在一个实施方案中,电离包括电子电离(E1),其包括用电子轰击样品。在另一个实施方案中,电离包括化学电离(CI),根据该化学电离,离子通过分析物与存在于离子源中的反应气体的离子的碰撞产生(合适的反应气体的实例包括甲烷、氨和异丁烷)。在另一个实施方案中,电离包括大气压化学电离(APCI)。在另一个实施方案中,电离包括大气压光子电离(APPI)。
当电离是电子电离时,这通常导致质量离子具有与母体分子相同的质量(M),但是带电荷(M+或M-)。当电离是化学电离时,这通常导致具有母体分子质量的质量离子和用于电离分子的化学物质,众所周知的实例包括[M+H]+、[M-H]-、5[M+NH4]+和[M+Na]+。这种分子离子在本说明书中也称为“假分子离子”。
在另一个实施方案中,电离包括电喷雾电离(ESI),其中含有目标分析物的液体通过电喷雾分散成细气溶胶。在另一个实施方案中,电离包括基质辅助激光解吸/电离(MALDI),其通常包括三步法,如下:(1)将样品混合在合适的基质材料中并将其施加到表面,通常是金属板;(2)通常用脉冲激光照射样品,从而触发样品和基质材料的烧蚀和解吸;(3)通过在烧蚀气体的热羽流中质子化或去质子化使分析物分子电离,使离子加速进入用于分析它们的质谱仪。这些电离技术是本领域技术人员公知的。电离,特别是电子电离,可能导致一些样品的分子碎裂成带电碎片。
在电离之后,根据质量分析器中的质荷比(m/z)分离第一步中产生的离子。这通常通过以下一种或多种质荷比分离技术进行:通过四极质谱仪中使用的四极电场,通过离子阱质谱仪使用的离子阱四极电场,通过飞行时间质谱仪使用的纵向离子传播时间,以及通过电和磁扇区质谱仪传统上使用的电场和/或磁场偏转。最后一种技术涉及加速离子并使它们经受电场或磁场,使得电场或磁场使离子偏转。具有相同质荷比的离子将经历相同的偏转量。
在分离后检测离子,检测器记录感应的电荷或当离子通过或撞击表面时产生的电流。在扫描仪器中,在扫描过程中在检测器中产生的信号与仪器在扫描中的位置将产生质谱,作为m/z的函数的离子的记录。
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是,在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示,并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下,本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例1外泌体的提取
取10例健康人血浆样本混合,2,000×g离心30min用于去除细胞碎片、凋亡小体等杂质,将上清液移至新管,分装为5μL每管并储存在-80℃备用。
1.1TiO2法提取血浆外泌体
取1μL上述血浆样本并加入100μL PBS稀释,加入1mg TiO2,4℃震荡孵育5min。20,000×g离心3min后去除上清即得到结合在TiO2上的外泌体。用PBS清洗3遍去除杂质,加入4%SDS(w/v)将外泌体从TiO2上裂解,可直接用于Western blot和银染实验;或加入氨水使其终浓度为10%,4℃震荡孵育10min,20,000×g离心3min,将上清液转移至30kDa超滤管中,离心之后用PBS清洗多次,超滤管上层溶液即为有完整结构的外泌体悬液。
使用透射电镜观察外泌体形态。将上述在碱性条件下洗脱下来的外泌体悬液滴加在铜网上沉淀1min,用滤纸吸走浮液。加入10μL醋酸双氧铀在铜网上,沉淀1min后用滤纸吸走浮液。常温干燥后用透射电镜(Hitachi-7700)在100kv下观察成像。获得的外泌体结构完整,呈典型的杯状结构(图2A)。
使用粒径分析仪(Nano FCM-N30E)对外泌体尺寸大小进行分析。将上述得到的外泌体悬液用PBS稀释至合适浓度,进行后续分析。所获得的外泌体直径分布在30-150nm之间(图2B)。
本实例证明了在1μL血浆样本中提取外泌体的可行性,可进行后续分析。
1.2超速离心法提取血浆外泌体
取1μL血浆样本加入PBS稀释,20,000×g离心15min去除杂质,取上清;100,000×g离心70min,将上清收集至新的离心管内。加PBS通过20,000×g离心70min,去除上清即得到外泌体囊泡。将第一次超速离心得到的上清液经本发明方案再次提取外泌体蛋白,用于评估超速离心法提取血浆外泌体的蛋白质损失。
1.3TiMMEP法提取血浆外泌体
取1μL血浆并加入100μL PBS稀释,加入1mg TiO2震荡孵育5min,20,000×g离心3min,弃上清,PBS清洗三次,加入100μL 70%乙腈(v/v),低温超声15min使外泌体充分破碎,震荡孵育18min用于外泌体蛋白质提取。20,000×g离心3min,收集含有外泌体代谢物的上清液,冻干后保存至-80℃备用或加入50μL 80%冰甲醇(v/v)直接进行质谱检测。在结合外泌体蛋白质的TiO2中加100μL 70%乙腈(v/v)和100μL 70%乙醇(v/v),去除非特异性吸附的血浆脂蛋白。加入20μL变性剂(含10mM TCEP,40mM CAA,1%SDC,50mM TEAB)95℃孵育10min。加入80μL 50mM碳酸氢铵,待样本温度降低后加入胰酶(与蛋白质的质量比为1:50)和Lys-c(与蛋白质的质量比为1:100),37℃孵育4小时。加入甲酸使其终浓度为1%(v/v),用于沉淀SDC并终止酶解反应。20,000×g离心15min后收集上清,将得到的肽段溶液经自制的C18脱盐柱除盐后热干,加入0.1%甲酸(v/v)复溶肽段,进而用于质谱检测,具体流程见图1。
通过三次技术重复评估该发明方案的稳定性及重复性。如图3所示,蛋白质组样本间的皮尔逊相关系数达到了0.98,至少两次鉴定到的蛋白质占72%,共鉴定到870个蛋白质组。同时,代谢组样本间的皮尔逊相关性系数达到了0.83,变异系数小于30%的离子占61%,共鉴定到491个注释代谢物。
证明本技术方案具有良好的稳定性和重复性。
1.4Western blot实验
将实施例1.1,实施例1.2和实施例1.3得到的外泌体蛋白样本进行Western blot实验,用于评估每种方法提取血浆外泌体的效率。将每种方法提取的外泌体蛋白样本全部加载到12%的琼脂糖凝胶中,同将未经任何处理的0.1μL血浆样本作为对照,将电泳后的琼脂糖凝胶通过转膜使蛋白质印迹到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,加入5%的胎牛血清封闭1h,加入外泌体特异性蛋白抗体CD63和TSG101,4℃下孵育过夜,TBST清洗三次后加入二抗,室温孵育2h后显影,通过ImageJ对不同泳道蛋白显影面积进行半定量分析。图4蛋白条带由左至右依次为0.1μL血浆、TiO2提取的血浆中的蛋白质、TIMMEP法提取的血浆中的蛋白质、高速离心法提取的血浆中的蛋白质、TIMMEP法提取的高速离心法所提取的上清中的蛋白质,由图4可看出,本发明方案所提取的外泌体蛋白质相对强度远高于超速离心法,同时高于TiO2直接提取法,与未处理的血浆相比无显著差别,说明本技术方案的样本损失量较低,具有较高的提取效率。
1.5银染实验
将实施例1.1,实施例1.2和实施例1.3得到的外泌体蛋白样本进行银染实验,将未经任何处理的0.1μL血浆样本作为对照。将上述样本加载到12%琼脂糖凝胶上,经电泳后按CWBIO试剂盒(CW20125,CWBIO,Jiangsu,China)说明进行后续步骤。图5由左至右条带依次为Marker、0.1μL血浆、TIMMEP血浆、孵化后的洗涤缓冲液、蛋白提取后的缓冲液、超速离心法血浆、超速离心法上清,如图5所示,与血浆对照相比,本发明方案能够有效去除血浆高丰度蛋白,且在富集完外泌体蛋白质的洗脱液中未见明显蛋白条带,证明与TiO2直接提取外泌体蛋白法相比并没有产生额外的外泌体蛋白质损失。超速离心法蛋白泳道可见少量蛋白条带,可能由于蛋白样本损失导致,且可推测出超速离心法获取的第一次洗涤液中仍存在大量外泌体蛋白。
证明了本方法提取血浆外泌体的效率及纯度均高于现有其他方法。
实施例2不同质量TiO2提取微量血浆外泌体的效率
为了根据TiO2使用体积来评估血浆外泌体分离效率,使用TiO2的质量为0.3mg,0.5mg,1mg,2mg,3mg,5mg。通过实施例1.3中所述的方法在1μL血浆中提取外泌体。如图6所示,在TiO2量为0.3-0.5mg时,提取效率显著上升;0.5mg-3mg时,提取效率无太大变化;当TiO2量增加到5mg时,提取效率有所下降,可能由于TiO2微粒大量聚集致使提取效率下降。后续使用0.5mg TiO2作为微量血浆外泌体提取的最优值。
实施例3不同蛋白质组样本前处理方法
取100μL,10μL,1μL血浆样本遵循实施例1.1方法提取的血浆外泌体,经Filter-aided sample preparation(FASP),Single-pot,solid-phase-enhanced sample-preparation(SP3),In-StageTip(iST)方法处理外泌体蛋白质组后经质谱检测,与本发明方法进行对比。
3.1 FASP方法处理外泌体蛋白质组样本
使用实施例1.1方法得到血浆外泌体超声裂解20min,离心后将上清液移至30kDa超滤管,12,000g×g离心10min,加入8M尿素清洗三遍去除裂解剂和杂质。加入10mM DTT和20mM碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)用于蛋白质还原烷基化。加入50mM碳酸氢铵至超滤管用于替换DTT和IAA,清洗三次后加入胰酶(酶:蛋白=1:50,w/w)酶切过夜。得到的肽段使用自制的C18脱盐柱脱盐后热干并保存在-80℃备用。
3.2 SP3
使用实施例1.1方法得到血浆外泌体超声裂解20min,离心后将上清液移至新的离心管,加入10mM DTT和20mM IAA使蛋白质变性。加入乙腈使其终浓度为70%,加入顺磁珠(Sera-Mag speedbeads),37℃震荡孵育18min,去除上清后加70%乙腈清洗两次。加入50μL50mM碳酸氢铵和胰蛋白酶在37℃下过夜酶切。得到的肽段使用自制的C18脱盐柱脱盐后热干并保存在-80℃备用。
3.3 iST
使用实施例1.1方法得到血浆外泌体超声裂解20min,离心后将上清液移至新的离心管,后续步骤按试剂盒(OSFP00018,PreOmics)说明执行。
如图7所示,由质谱结果可以看出,本发明方法在血浆体积降低的条件下蛋白质鉴定量并无显著变化,同时对比其它三种方法,本发明方案在1μL起始血浆体积条件下所鉴定的蛋白质高于其它方法。证明本方法具有较高的灵敏度。
实施例4乳腺癌患者血浆外泌体蛋白质组与代谢组质谱分析
将本发明应用于乳腺癌患者血浆(n=10)和健康人血浆(n=10)外泌体组学样本提取,并通过质谱检测外泌体蛋白质组样本和代谢组样本。
4.1蛋白质组分析
如图8所示,通过无监督模式的主成分分析(principal component analysis,PCA)可以看出乳腺癌患者与健康人的蛋白表达有明显区别。通过变量统计分析,将p value<0.01且fold change>2或<0.5的变量被认为有统计学意义。进一步通过火山图得出两组间具有显著表达的蛋白质。共有108个蛋白质与对照组有显著区别,其中47个蛋白质表达上调,61个蛋白质表达下调,其中PAI-1,HER2已被证明可作为乳腺癌的诊断生物标志物。选取差异表达的蛋白质通过热图分析可以看出有明显的区别。通过GO分析得出这些差异表达的蛋白质大多与外泌体成分及功能相关,并与抗原结合,过氧化物酶活性等重要的生物过程相关。
4.2代谢组样本分析
如图9所示,结合偏最小二乘判别分析法可以看出两组能够明显区分,通过火山图可以看出共有17个差异表达的代谢物,为乳腺癌诊断提供了更大的潜力。
4.3受试者操作特征曲线(Receiver operating characteristic,ROC)
为了评估潜在蛋白质组和代谢组的生物标志物的敏感性和特异性,绘制ROC曲线进行分析。如图10所示,通过ROC曲线可以看出PAI-1,ERdj6,
Cathepsin S三种候选蛋白标志物的曲线下面积(Area under the curve,AUC)均大于0.9,如图11所示,所选代谢组候选标志物(+)-15,16-Dihydroxyoctadecanoic acid,N-Desmethylselegiline和Rotundine A三种代谢物的AUC均大于0.7,具有一定的准确性,证明了该模型具有可预测性,其中N-Desmethylselegiline和Rotundine A与对照组相比表达上升(+)-15,16-Dihydroxyoctadecanoic acid与对照组相比表达量有所下降(图12)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种提取外泌体组学的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)自样本中提取外泌体;
(2)提取外泌体中的代谢物;
(3)提取外泌体中的蛋白质;
优选的,步骤(1)使用TiO2提取外泌体;
优选的,所述样本为血浆样本;
优选的,TiO2与血浆样本的重量体积比为3:10-5:1(mg:μL);
优选的,TiO2与血浆样本的重量体积比为3:10-1:2(mg:μL);
优选的,TiO2与血浆样本的重量体积比为1:2(mg:μL);
优选的,所述血浆样本为1-100μL;
优选的,所述血浆样本为1μL;
优选的,所述TiO2的质量为0.3-5mg;
优选的,所述TiO2的质量为0.3-0.5mg;
优选的,所述TiO2的质量为0.5mg。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)通过加入有机溶剂提取外泌体中的代谢物;
优选的,所述有机溶剂为乙腈;
优选的,步骤(2)还包括破碎外泌体提取外泌体中的代谢物;
优选的,采用超声的方式破碎外泌体。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)包括加入变性剂使吸附于TiO2上的蛋白质变性;
优选的,所述变性剂包括TCEP、CAA、SDC和/或TEAB;
优选的,步骤(3)还包括通过加入蛋白酶将蛋白酶解为肽段;
优选的,所述蛋白酶包括胰酶和/或赖氨酸蛋白酶;
优选的,所述赖氨酸蛋白酶为Lys-c;
优选的,所述胰酶与蛋白质量比为1:50;
优选的,所述Lys-c与蛋白质量比为1:100;
优选的,将蛋白酶解为肽段还包括加入碳酸氢铵;
优选的,步骤(3)还包括终止酶解反应;
优选的,步骤(3)还包括沉淀SDC;
优选的,通过加入甲酸沉淀SDC及终止酶解反应;
优选的,步骤(3)还包括脱盐;
优选的,通过脱盐柱进行脱盐;
优选的,所述脱盐柱为C18脱盐柱。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)还包括去除非特异性吸附的血浆脂蛋白;
优选的,通过加入乙腈和/或乙醇去除非特异性吸附的血浆脂蛋白。
5.根据权利要求1-4所述的方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)取血浆样本,加入TiO2,孵育,获得外泌体样本;
(2)加入乙腈,超声破碎,释放外泌体中的代谢物和蛋白质,孵育,使蛋白质聚集并吸附在TiO2表面;
(3)离心,获得含有外泌体代谢物的上清;
(4)剩余沉淀中分别加入乙腈和乙醇清洗,离心去除上清,加入变性剂孵育,加入碳酸氢铵,加入胰酶和Lys-c,孵育,将蛋白酶解为肽段,加入甲酸,去除SDC并终止酶解反应,离心去除TiO2并收集肽段;
(5)使用C18脱盐柱进行脱盐。
6.一种检测外泌体不同组学的方法,其特征在于,所述外泌体组学通过权利要求1-5任一项所述的方法提取;
优选的,所述检测外泌体组学的方法为质谱检测;
优选的,加入甲酸和/或冰甲醇用于质谱检测;
优选的,在外泌体蛋白质中加入甲酸用于质谱检测;在外泌体代谢物中加入冰甲醇用于质谱检测;
优选的,所述甲酸纯度为1%;
优选的,所述冰甲醇纯度为80%。
7.一种提取外泌体组学的设备,其特征在于,所述设备包括:
(1)取样装置;
(2)外泌体组学获取装置;
优选的,所述外泌体组学获取装置包括执行权利要求1-5任一项所述的方法中所使用的装置。
8.一种检测外泌体组学的设备,其特征在于,所述设备包括检测装置和权利要求7所述的设备;
优选的,所述检测装置包括执行权利要求6所述的方法中所使用的装置。
9.权利要求1-5任一项所述的方法、权利要求6所述的方法、权利要求7所述的设备或权利要求8所述的设备在筛选诊断疾病标志物中的应用;
优选的,所述疾病为外泌体相关疾病;
优选的,所述外泌体相关疾病包括自身免疫疾病、免疫相关疾病、肿瘤或障碍疾病;
优选的,所述外泌体相关疾病为肿瘤;
优选的,所述肿瘤为乳腺癌。
10.代谢物标志物在制备诊断乳腺癌的产品中的应用,其特征在于,所述代谢物标志物包括(+)-15,16-Dihydroxyoctadecanoic acid、N-Desmethylselegiline或Rotundine A;
优选的,所述产品包括检测代谢物标志物含量的试剂;
优选的,所述试剂包括通过色谱、光谱或质谱仪/光谱法进行检测代谢物标志物含量的试剂;
优选的,所述色谱包括GC,CE,LC,HPLC 5和UHPLC;光谱包括UV/Vis,IR,NIR和NMR;质谱仪/光谱法包括ESI、四极质谱仪、离子阱质谱仪、TOF(飞行时间)质谱仪、Orbitrap质谱仪、扇形磁场质谱仪、扇形静电场质谱仪、离子回旋共振(ICR)以及它们的组合,包括单级四极杆(Q)和三级四极杆((QqQ),QqTOF,TOF-TOF,Q-Orbitrap,APCI-QqQ,APCI-QqTOF,MALDI-QqQ,MALDI-QqTOF和MALDI-TOF-TOF。
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