JP7383162B2 - 臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体 - Google Patents

臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体 Download PDF

Info

Publication number
JP7383162B2
JP7383162B2 JP2022543156A JP2022543156A JP7383162B2 JP 7383162 B2 JP7383162 B2 JP 7383162B2 JP 2022543156 A JP2022543156 A JP 2022543156A JP 2022543156 A JP2022543156 A JP 2022543156A JP 7383162 B2 JP7383162 B2 JP 7383162B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
lectin
glycosylated
exosomes
magnetic carrier
derived
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2022543156A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2023503713A (ja
Inventor
チャンチン リン
ティアンシェン チェン
クン ハオ
ヘー ファン
チー ガオ
ヤンチャオ リー
ジーフイ シュー
シュアン チエ
グアンチェン チャオ
Original Assignee
ベイジン グリエクソ ジーン テクノロジー カンパニー リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ベイジン グリエクソ ジーン テクノロジー カンパニー リミテッド filed Critical ベイジン グリエクソ ジーン テクノロジー カンパニー リミテッド
Publication of JP2023503713A publication Critical patent/JP2023503713A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7383162B2 publication Critical patent/JP7383162B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28009—Magnetic properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28004—Sorbent size or size distribution, e.g. particle size
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
    • B01J20/28016—Particle form
    • B01J20/28019—Spherical, ellipsoidal or cylindrical
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/34—Regenerating or reactivating
    • B01J20/3425—Regenerating or reactivating of sorbents or filter aids comprising organic materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/34—Regenerating or reactivating
    • B01J20/345—Regenerating or reactivating using a particular desorbing compound or mixture
    • B01J20/3475—Regenerating or reactivating using a particular desorbing compound or mixture in the liquid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C07K14/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

関連出願の相互参照
本願発明では、中国国家知識産権局に提出された、出願番号が２０２０１００６００５５．７で、発明の名称が「臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体」である中国特許出願の優先権が主張され、当該出願が援用により全体として本明細書に組み込まれる。
本願発明は、バイオ医薬品及び生物分離に関連する技術分野に属し、臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体、及び分離方法に関する。
エクソソームは多胞体が原形質膜に融合する時に放出される生理活性を有する小胞であり、直径が約３０～１５０ｎｍで、細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターの１つである。生理学的に健常なヒトにおいて、エクソソームは細胞間でＤＮＡ、タンパク質、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのさまざまな生理活性物質を輸送し、細胞間コミュニケーション、細胞の移動、腫瘍細胞の成長などのさまざまな過程に関与して、細胞間の物質と情報の伝達を行うことができる。文献研究により、ほぼ全てのタイプの細胞がエクソソームを分泌し、血液、唾液、尿、脳脊髄液、貯留液、乳汁などの体液からエクソソームが抽出されることが判明した。
エクソソームは腫瘍、慢性感染性疾患、自己免疫疾患など多くの疾患に関係しており、生体に病変が生じると、細胞から分泌されるエクソソームの成分、含有量、特性などはいずれも変わる可能性がある。グリコシル化エクソソームは腫瘍を含めさまざまな疾患の発生、進行に重要な役割を果たし、エクソソーム検出の研究は疾患の発生と進行の効果的な監視につながると思われる。臨床サンプルでエクソソームの含有量が低いため、エクソソームの分離と濃縮はエクソソームの研究に特に重要なことである。
従来のエクソソーム分離方法はさまざまで、主に、超遠心分離や密度勾配遠心分離、免疫磁気ビーズ法などである。このうち、超遠心分離と密度勾配遠心分離はエクソソームと他の生物学的成分との密度のわずかな差により分離するもので、当該方法は特殊な装置を必要とし、大量のサンプルが必要であり、時間がかかるだけでなく、臨床サンプルによって特性が異なるため、当該方法の分離効果は安定性が悪く、さらに、超遠心分離で小胞が損傷しやすいため後の実験に影響がある。免疫磁気ビーズ法の原理は、エクソソームの表面の特異的タンパク質、例えば、ＣＤ９／ＣＤ６３／ＣＤ８１などが、対応する抗体をコーティングされた免疫磁気ビーズと結合して、磁気分離を行うことであるが、免疫磁気ビーズの体積が小さく、粒径はナノレベルでエクソソームの直径以下であるため、免疫磁気ビーズとエクソソームの結合は立体障害が大きく、エクソソームとの結合が不充分であるため、分離効率が芳しくない。また、免疫磁気ビーズ法で使用する溶離液は酸性溶離液であり、エクソソーム小胞の破裂、形態の不完全を起こしやすいため、グリコシル化エクソソームを正確に分離して、疾患の発生、進行などにおける検出、監視、診断にこれを使用することはできない。
そこで、臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを迅速に、正確に、かつ自動で効率的に分離及び濃縮できる組成物及び方法について研究し、これを確立する必要がある。
本願発明は従来技術の欠点に対し、臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体が提供され、さらに、当該レクチン－磁性担体カップリング複合体を含むグリコシル化エクソソーム分離組成物、並びに当該レクチン－磁性担体カップリング複合体を用いてグリコシル化エクソソームを分離する方法及び使用が提供される。本願発明に係るレクチン－磁性担体カップリング複合体は臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを正確に分離することができ、分離効率が高く、分離後のエクソソームは形態が完全で、破裂したもの又は断片化したものはないため、そのままグリコシル化エクソソームの液体の検出に用い、又はそのまま関連の免疫学的検出を行い、又はそのままエクソソームから関連の核酸を抽出して遺伝子測定分析を行うことができる。本願発明に係るグリコシル化エクソソーム分離方法で、エクソソームの外面の豊富な糖鎖がレクチンと結合できるという原理を利用して、効果的な洗浄と効果的な溶離でグリコシル化エクソソームを分離することができ、且つ非常に簡易かつ迅速であり、自動化が実現しやすく、再現性に優れ、分離後のエクソソームは形態が完全で、破裂したもの又は断片化したものはないため、疾患の発生、進行などにおける検出、監視、診断にこれを使用する。
本願発明では、磁性担体と、磁性担体の外側にカップリングしたレクチンとを含む臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体が提供され、
レクチンは、パラミツ由来レクチン、ピーナッツ由来レクチン、エンドウ由来レクチン（ＶＶＡ及び／又はＶＶＬ）、ナタマメ由来レクチン、レンズマメ由来レクチン、小麦胚芽レクチン、ダイズ由来レクチン、インゲンマメ由来レクチン、カタツムリ由来レクチン（ＨＡＡ及び／又はＨＰＡ）のいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含み、
磁性担体は、デキストラン磁気ビーズ、アガロース磁気ビーズ、樹脂又はエポキシ樹脂磁気ビーズ、ポリスチレン磁気ビーズのいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含む。
レクチン－磁性担体カップリング複合体のいくつかの実施形態において、磁性担体の粒径分布範囲は１～２００μｍであり、好ましくは１０～２００μｍであり、より好ましくは３０～１５０μｍである。
レクチン－磁性担体カップリング複合体のいくつかの実施形態において、レクチン－磁性担体カップリング複合体で、１ｍＬの磁性担体当たり１～２０ｍｇ、好ましくは５～１５ｍｇ、より好ましくは１０～１５ｍｇのレクチンが結合されている。磁性担体とレクチンがカップリングした後、エクソソームを含まないウシ血清アルブミン緩衝液を用いて反応させることにより、最終のレクチン－磁性担体カップリング複合体を得る。
レクチン－磁性担体カップリング複合体のいくつかの実施形態において、臨床サンプルは、血清、血漿、唾液、組織又は細胞培養上清、尿、脳脊髄液、リンパ液のいずれかの１つを含む。
レクチン－磁性担体カップリング複合体のいくつかの実施形態において、レクチンは、パラミツ由来レクチン、ピーナッツ由来レクチン、エンドウ由来レクチン（ＶＶＡ及び／又はＶＶＬ）、ナタマメ由来レクチン、レンズマメ由来レクチン、小麦胚芽レクチン、ダイズ由来レクチン、インゲンマメ由来レクチンのいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含む。
レクチン－磁性担体カップリング複合体のいくつかの実施形態において、グリコシル化エクソソームは、Ｎ－グリコシル化エクソソーム、Ｏ－グリコシル化エクソソーム、フコシル化エクソソームのいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含む。
レクチン－磁性担体カップリング複合体のいくつかの実施形態において、レクチン－磁性担体カップリング複合体が保存液に保存され、最終のレクチン－磁性担体カップリング複合体保存液におけるレクチン－磁性担体カップリング複合体の保存濃度（体積比）は１０～６０％であり、好ましくは当該比が３０～５０％であり、より好ましくは４０～５０％である。レクチン－磁性担体カップリング複合体保存液の体積とは、保存液に分散したレクチン－磁性担体カップリング複合体と、保存液との総体積を指す。
本願発明の別の態様では、さらに、グリコシル化エクソソーム分離組成物が提供され、グリコシル化エクソソーム分離組成物は、レクチン－磁性担体カップリング複合体を含み、分離過程で非特異的にカップリングした、グリコシル化していないエクソソーム及び他の不純物を洗浄し除去するための洗浄液、及び／又はレクチン－磁性担体カップリング複合体に特異的にカップリングしたグリコシル化エクソソームを溶離するための溶離液をさらに含む。ここで組成物とは混合してまとまったものではなく、個別に包装され且つ同時に１つの薬物キットに存在するものを意味する。
グリコシル化エクソソーム分離組成物のいくつかの実施形態において、洗浄液は金属塩イオン不含の洗浄緩衝液又は精製水であり、場合によって金属塩イオン不含の洗浄緩衝液であり、さらに、場合によって、分離過程で非特異的にカップリングしたグリコシル化していないエクソソーム及び他の不純物を洗浄し除去するためのｐＨ７．６±０．２の金属塩イオン不含の洗浄緩衝液である。
グリコシル化エクソソーム分離組成物のいくつかの実施形態において、溶離液は糖類を溶解したホウ酸塩緩衝液であり、任意選択で、マンノースを溶解したホウ酸塩緩衝液であり、即ちホウ酸塩－マンノース緩衝液であり、さらに、任意選択で、ｐＨ６．５±０．２のホウ酸塩－マンノース緩衝液であり、当該緩衝液は非常に生理的ｐＨに近く、レクチン－磁性担体カップリング複合体にカップリングしたグリコシル化エクソソームを溶離するために用いられ、溶離後のエクソソームは外観と形態が完全で、破裂したもの又は断片化したものはない。
本願発明の別の態様では、さらに、レクチン－磁性担体カップリング複合体を用いてグリコシル化エクソソームを分離する分離ステップを含むグリコシル化エクソソーム分離方法が提供され、分離ステップは、
臨床サンプルを前処理するステップと、
前処理後のサンプルをレクチン－磁性担体カップリング複合体と充分に均一に混合してインキュベートするステップと、
磁気分離により、グリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を分離し、洗浄液でグリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を洗浄するステップと、
溶離液で洗浄後のレクチン－磁性担体カップリング複合体を溶離するステップと、を含む。溶離上清は分離後のグリコシル化エクソソーム溶液であり、溶離後のエクソソームは外観と形態が完全で、破裂したもの又は断片化したものはない。
グリコシル化エクソソーム分離方法のいくつかの実施形態において、前処理後のサンプルとレクチン－磁性担体カップリング複合体の混合における体積比は０．５～５：１であり、好ましくは０．５～３：１であり、より好ましくは１～２：１である。
グリコシル化エクソソーム分離方法のいくつかの実施形態において、洗浄液でグリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を洗浄する時に、レクチン－磁性担体カップリング複合体の体積の１～３倍の洗浄液で１～３回洗浄する。
グリコシル化エクソソーム分離方法のいくつかの実施形態において、溶離液とレクチン－磁性担体カップリング複合体の体積比は０．５～２：１であり、好ましくは０．５～１：１である。
グリコシル化エクソソーム分離方法のいくつかの実施形態において、サンプルを前処理するための方法は、
血清、血漿、唾液、脳脊髄液又はリンパ液サンプルの場合は、サンプルを３０００ｇ以下の速度で１０～１５分遠心分離してサンプルから細胞破片、沈殿した不純物を除去し、遠心分離後の上清を得、使用に備えるステップと、
組織又は細胞培養上清、尿サンプルの場合は、サンプルを３０００ｇ以下の速度で１０～１５分遠心分離してサンプルから細胞破片、沈殿した不純物を除去し、次に、上清を限外濾過遠心管で１０～１０００倍濃縮し、使用に備えるステップと、を含む。
グリコシル化エクソソーム分離方法のいくつかの実施形態において、洗浄液は金属塩イオン不含の洗浄緩衝液又は精製水であり、場合によって金属塩イオン不含の洗浄緩衝液であり、さらに、場合によってｐＨ７．６±０．２の金属塩イオン不含の洗浄緩衝液である。
グリコシル化エクソソーム分離方法のいくつかの実施形態において、前記溶離液は糖類を溶解したホウ酸塩緩衝液であり、任意選択で、マンノースを溶解したホウ酸塩緩衝液であり、即ちホウ酸塩－マンノース緩衝液であり、さらに、任意選択でｐＨ６．５±０．２のホウ酸塩－マンノース緩衝液である。
いくつかの実施形態において、インキュベート条件は、室温下で１～３０分、好ましくは５～２０分、より好ましくは１０～１５分インキュベートすることである。
本願発明では、さらに、方法で分離したエクソソームの使用が提供され、使用は、グリコシル化エクソソームの液体の検出、エクソソームの免疫学的検出、エクソソームからの核酸抽出後のヌクレオチド断片の測定分析を含む。
１．本願発明のレクチン－磁性担体カップリング複合体で分離したエクソソームは全てグリコシル化エクソソームであり、形態が完全で、破裂したものがないため、そのままでグリコシル化エクソソームの液体の検出、エクソソームの免疫学的検出、又は核酸抽出後のヌクレオチド配列測定分析などに用いることができ、さらに、適切な装置と組み合わせて迅速に、正確に、かつ自動なグリコシル化エクソソームの分離を実現できる。
２．本願発明のレクチン－磁性担体カップリング複合体で使用する磁性担体の粒径は、一般に免疫磁気ビーズの粒径の１０～１０００倍であり、単一の磁気ビーズの表面積がより大きいため、レクチンの磁気ビーズに結合する時の立体障害が低減され、より多くのレクチンに結合することが可能となり、これに対し、同じ体積を有する従来の免疫磁気ビーズはより大きな比表面積を有するが、立体障害が大きいため、カップリングしたレクチンが少なく、本願発明のレクチン－磁性担体カップリング複合体で、１ｍＬの磁性担体当たり１～２０ｍｇのレクチンを結合でき、関連の研究では体積の小さい免疫磁気ビーズを使用する場合に、１ｍＬの免疫磁気ビーズ当たりカップリングしたレクチンの数量がｎｇレベルで、結合効率が低いことが判明した。また、当該粒径がエクソソーム自体の直径をはるかに超えているため、レクチンとグリコシル化エクソソームの結合の立体障害を低減することができ、レクチンとグリコシル化エクソソームの結合に役立ち、エクソソームの分離効率を大幅に向上させる。
３．本願発明のレクチン－磁性担体カップリング複合体は、エクソソーム含有量の少ない臨床サンプル、例えば、尿、組織又は細胞培養上清中のエクソソームにも優れた効果がある。エクソソーム含有量の多い臨床サンプル、例えば、血漿中のエクソソームを分離する場合、分離したグリコシル化エクソソームの濃度は１０１１～１４個／ｍＬに達している。
４．本願発明のレクチン－磁性担体カップリング複合体で使用するレクチンは、パラミツ由来レクチン、ピーナッツ由来レクチン、エンドウ由来レクチン（ＶＶＡ及び／又はＶＶＬ）、ナタマメ由来レクチン、レンズマメ由来レクチン、小麦胚芽レクチン、ダイズ由来レクチン、インゲンマメ由来レクチンなどの植物由来レクチンであることが好ましく、植物由来レクチンを大量に取得することが一層容易であり、原料がより豊富である。
５．本願発明のグリコシル化エクソソーム分離組成物で使用するのは金属塩イオン不含の洗浄緩衝液又は精製水であり、金属塩イオンはレクチンとグリコシル化エクソソームの親和性吸着に解離効果を有するため、レクチンとグリコシル化エクソソームの親和性吸着に影響があり、しかも金属塩イオンの濃度が高いほど、解離効果が強く、エクソソームの分離効果に影響を与え、エクソソームを分離できないこともある。金属塩イオン不含の洗浄緩衝液又は精製水は洗浄時に金属塩イオンがエクソソームと磁気ビーズの表面のレクチンとの結合に影響を与え、分離したエクソソームが減少され又はエクソソームを分離できないことを避けられる。
６．本願発明のグリコシル化エクソソーム分離組成物で使用する溶離液はホウ酸塩緩衝液であり、他の緩衝液に比べて、エクソソームに対してより優れた溶離効果を有し、溶離効率が高く、少ない溶離液だけで溶離が実現でき、溶離後のエクソソームは外観と形態が完全で、破裂したもの又は断片化したものはなく、また、使用量が少ないため、エクソソームの濃縮工程が同時に完了するも同然である。
７．本願発明のグリコシル化エクソソーム分離方法は、サンプルを前処理するための方法が実行しやすく、単に遠心分離及び／又は濃縮するだけで、本願発明に適するサンプルを効果的に得ることができ、サンプルの超高速遠心分離処理が不要で、しかも適切な装置と組み合わせて迅速に、正確に、かつ自動なグリコシル化エクソソームの分離を実現でき、サンプル中のグリコシル化エクソソームを最大限に保護することができる。
図１は、レクチン－磁性担体カップリング複合体によるグリコシル化エクソソームの分離の原理概略図である。 図２は、４つの異なるサンプル（細胞培養上清、血漿、尿、脳脊髄液）から分離したグリコシル化エクソソームの電子顕微鏡下観察画像である。 図３は、血漿サンプル分離後のグリコシル化エクソソームのＮＴＡ解析図である。 図４は、４つの異なるサンプル（細胞培養上清、血漿、尿、脳脊髄液）のエクソソーム特異的膜タンパク質ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果図である。 図５は、４つの異なるサンプル（細胞培養上清、血漿、尿、脳脊髄液）のエクソソーム特異的非膜タンパク質ＡＬＩＸ及びＴＳＧ１０１抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果図である。 図６は、４つの異なるサンプル（細胞培養上清、血漿、尿、脳脊髄液）のエクソソームカルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果図である。 図７は、５つの異なる洗浄緩衝液で、グリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を洗浄した後、溶離して分離したグリコシル化エクソソーム溶液のエクソソーム特異的膜タンパク質ＣＤ９／ＣＤ６３／ＣＤ８１抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果図である。 図８は、３つの異なる溶離液で分離したグリコシル化エクソソーム溶液の電子顕微鏡検出結果図である。
次に、本願発明の一層の説明のために、本願発明のさまざまな例示的な実施形態を詳細に説明し、当該詳細な説明は本願発明に対する限定ではなく、本願発明の特定の態様、特性及び実施形態についてのより詳細な説明と理解される。
本願発明の範囲又は趣旨を逸脱することなく、本願発明の明細書の特定の実施形態にさまざまな改善と変形を行うことができ、これらは当業者に自明なものである。本明細書と実施例は例示的なものに過ぎない。
本明細書で使用する「含む」、「有する」などは、全て開放的な用語で、「…を含むが、これらに限定されない」を意味する。特に指定がない限り、次で使用するさまざまな試薬は全て市販の試薬で、そのうち使用する化学試薬は分析用純度以上のものである。
実施例１：レクチン－磁性担体カップリング複合体の製造
レクチン－磁性担体カップリング複合体は、磁性担体と、磁性担体の外側にカップリングしたレクチンとを含み、レクチンと磁性担体が特定の条件下で結合して得られるものであり、主に、臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離するために用いられ、分離したグリコシル化エクソソームは形態が完全である。
レクチンは、主に、パラミツ由来レクチン（Ｊａｃａｌｉｎ）、ピーナッツ由来レクチン（ＰＮＡ）、エンドウ由来レクチン（ＶＶＡ及び／又はＶＶＬ）、ナタマメ由来レクチン（ＣｏｎＡ）、レンズマメ由来レクチン（ＬＣＡ）、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）、ダイズ由来レクチン（ＳＢＡ）、インゲンマメ由来レクチン（ＰＶＬ）、カタツムリ由来レクチン（ＨＡＡ及び／又はＨＰＡ）のいずれかの１つを選択し、又は２つ若しくはそれ以上のレクチンを組み合わせて使用し、主な理由は、異なるレクチンの組み合わせでさまざまなタイプのグリコシル化エクソソームの分離を実現できることであり、例えば、ＬＣＡ、ＡＡＬでフコシル化エクソソームを分離し、ＣｏｎＡ、ＰＶＬ、ＳＢＡ、ＷＧＡ、ＡＡＬなどのレクチンでＮ－グリコシル化エクソソームを分離し、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＶＶＡ、ＰＮＡ、ＪａｃａｌｉｎなどのレクチンでＯ－グリコシル化エクソソームを分離する。単一のレクチンは、主に、レクチンに対応する特定のグリコシル化エクソソームを分離するために用いられ、２つ又はそれ以上のレクチンを組み合わせて使用するのはさまざまなグリコシル化エクソソームを分離するために利用でき、又は２つ若しくはそれ以上のレクチンを組み合わせて使用するのは特定のグリコシル化エクソソームを相乗的に分離することができる。
本願発明の一層の説明として、以下の実施例では主にレンズマメ由来レクチン（ＬＣＡ）（米国ｓｉｇｍａ社より購入）を使用して本願発明を一層説明する。
磁性担体とは、主に、磁気分離効果を有し、表面に高分子材料がコーティングされた複合磁気ビーズを指し、主に、デキストラン磁気ビーズ、アガロース磁気ビーズ、樹脂又はエポキシ樹脂磁気ビーズ、ポリスチレン磁気ビーズなどの複合磁気ビーズのいずれかの１つ、又は２つ若しくはそれ以上の磁性担体混合物を含み、前記磁性担体粒径分布範囲は１～２００μｍであり、好ましくは１０～２００μｍであり、より好ましくは３０～１５０μｍである。磁性担体を生産する際は、同じロットで生産した磁性担体でも必ずしも粒径が均一であるとは限られないため、磁性担体の粒径は一般に平均粒径として説明され、本願発明のように粒径分布範囲としてもよく、粒径分布範囲で説明する場合はその具体的な分布が当該分布範囲内の正規分布に合致し又は実質的に合致すると見なしてもよい。本願発明の実施例のレクチン－磁性担体カップリング複合体で使用する磁性担体の粒径は、一般に免疫磁気ビーズの粒径の１０～１０００倍であり、単一の磁気ビーズの表面積がより大きいため、レクチンの磁気ビーズに結合する時の立体障害が低減され、より多くのレクチンに結合することが可能となり、これに対し、同じ総体積を有する従来の免疫磁気ビーズはより大きな比表面積を有するが、立体障害が大きいため、カップリングしたレクチンが少なく、本願発明のレクチン－磁性担体カップリング複合体で、１ｍＬの磁性担体当たり１～２０ｍｇのレクチンを結合でき、関連の研究では体積の小さい免疫磁気ビーズを使用する場合に、１ｍＬの免疫磁気ビーズ当たりカップリングしたレクチンの数量がｎｇレベルで、結合効率が低いことが判明した。また、当該粒径がエクソソーム自体の直径をはるかに超えているため、レクチンとグリコシル化エクソソームの結合の立体障害を低減することができ、レクチンとグリコシル化エクソソームの結合に役立ち、エクソソームの分離効率を大幅に向上させる。
前記磁性担体が表面にコーティングされた高分子材料によってレクチンに結合して、レクチン－磁性担体カップリング複合体が形成され、磁性担体によって浸漬、結合、洗浄、保存などのステップを調整することで、いずれもレクチンに結合する効果を得られるが、当然ながらレクチンによって最適な高分子材料が違う可能性がある。レクチン－磁性担体カップリング複合体の製造で磁性担体（ｍＬ）とレクチン（ｍｇ）の比は１：１～１：２０であり、好ましくは１：５～１：１５であり、より好ましくは１：１０～１：１５である。
製造したレクチン－磁性担体カップリング複合体を保存液に保存し、レクチン－磁性担体カップリング複合体保存液におけるレクチン－磁性担体カップリング複合体の保存濃度（体積比）は１０～６０％であり、好ましくは当該比が３０～５０％であり、より好ましくは４０～５０％である。
本願発明の一層の説明として、以下の実施例ではいずれも粒径分布範囲を３０～１５０μｍとするアガロース磁気ビーズで説明し、前記アガロース磁気ビーズは市販の的活性化ＮＨＳアガロース磁気ビーズ（Ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入）であり、購入した市販のアガロース磁気ビーズの濃度は１０％であった（体積比）。
レクチン－磁性担体カップリング複合体、即ちＬＣＡ－アガロース磁気ビーズカップリング複合体の製造プロセスは、詳しくは次のとおりである。
（１）市販のアガロース磁気ビーズを均一に混合し、５０ｍＬのアガロース磁気ビーズを２００ｍＬ容器に加え、磁気的に分離し上清を除去して、５ｍＬのアガロース磁気ビーズを得た。
（２）１００ｍＬの無水エタノールを加え、均一に混合し磁気的に分離して上清を除去し、当該ステップを１～３回繰り返して、アガロース磁気ビーズを洗浄するという目的を果たした。
（３）０．１～１ＭでｐＨ６～７のＭＥＳ緩衝液（０．１～０．５Ｍ ＮａＣｌを含む）５０ｍＬにレンズマメ由来レクチンと、ステップ（２）のアガロース磁気ビーズを加え、均一に混合して使用に備える。アガロース磁気ビーズの体積（ｍＬ）とレンズマメ由来レクチン（ＬＣＡ、ｍｇ）の比は１：１～１：２０である（即ち１ｍＬのアガロース磁気ビーズ当たり１～２０ｍｇのレンズマメ由来レクチンが加えられる）。本願発明の一層の説明として、本実施例のＭＥＳ緩衝液は濃度が０．１Ｍで、ｐＨが６．５であり、０．１Ｍ ＮａＣｌを含み、アガロース磁気ビーズ体積（ｍＬ）とレンズマメ由来レクチン（ＬＣＡ、ｍｇ）の比は１：１０で、即ち５０ｍＬの０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液に５ｍＬのアガロース磁気ビーズと５０ｍｇのＬＣＡが加えられる。
（４）ステップ（３）の溶液を室温下で振盪しながら０．５～５時間反応させ、磁気的に分離して上清を除去し、捨てた上清からは実質的にレクチンが検出できない。本願発明の一層の説明として、本実施例では室温下で３時間振盪した。
（５）エクソソームを含まないウシ血清アルブミン緩衝液を加えてブロッキングし、即ち、エクソソームを含まない２００ｍＬの０．１～１ＭでｐＨ６～７のＭＥＳ－Ｂ緩衝液（０．１～０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１～１％ＢＳＡ溶液を含む）を加え、室温下で振盪しながら０．５～５時間反応させ、磁気的に分離し上清を除去した。本願発明の一層の説明として、本実施例では２００ｍＬの０．５ＭでｐＨが６．５のＭＥＳ－Ｂ緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ溶液を含む）を加え、室温下で振盪しながら３時間反応させた。
（６）１０～２００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液を加えて、室温下で振盪しながら均一に混合させ、磁気的に分離して上清を除去し、当該ステップを１～５回繰り返した。本願発明の一層の説明として、本実施例では１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液を加えた。
（７）ステップ（６）で収集したＬＣＡ－アガロース磁気ビーズをＴｒｉｓ緩衝液に再懸濁して、１０～６０％のＬＣＡ－アガロース磁気ビーズ溶液を調製し、使用に備え、好ましくは３０～５０％のＬＣＡ－アガロース磁気ビーズ溶液を調製し、本実施例では５ｍＬのＴｒｉｓ緩衝液を加えて、体積比５０％のＬＣＡ－アガロース磁気ビーズ溶液を調製した。
実施例２：グリコシル化エクソソーム分離組成物の製造
本願発明では、レクチン－磁性担体カップリング複合体と、分離過程で非特異的にカップリングした、グリコシル化していないエクソソーム及び他の不純物を洗浄し除去するための洗浄液、及び／又はレクチン－磁性担体カップリング複合体に特異的にカップリングしたグリコシル化エクソソームを溶離するための溶離液とを含むグリコシル化エクソソーム分離組成物が提供され、それぞれが個別に包装され、同時に１つの薬物キット又は試薬キットに存在した。
本実施例では、前記レクチン－磁性担体カップリング複合体が実施例１の体積比５０％のＬＣＡ－アガロース磁気ビーズ溶液であった。
前記洗浄液は金属塩イオン不含の洗浄緩衝液又は精製水であり、場合によって金属塩イオン不含の洗浄緩衝液であり、例えば、主な成分は１０～２００ｍＭ金属塩イオン不含Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を含み、ｐＨは７．６±０．２であり、分離過程で非特異的にカップリングしたグリコシル化していないエクソソーム及び他の不純物を洗浄し除去するために用いられる。本実施例では、洗浄液が１００ｍＭ金属塩イオン不含Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で、ｐＨは７．６±０．２であった。
前記溶離液は糖類を溶解したホウ酸塩緩衝液であり、マンノースを溶解したホウ酸塩緩衝液であってもよく、例えば、主な成分は１０～２０ｍＭホウ酸塩緩衝液と、それに溶解した１００～５００ｍＭマンノースとを含み、ｐＨは６．５±０．２であり、レクチン－磁性担体カップリング複合体にカップリングしたグリコシル化エクソソームを溶離するために用いられ、溶離後のエクソソームは外観と形態が完全で、破裂したもの又は断片化したものはない。本実施例では、洗浄液は１５ｍＭホウ酸塩緩衝液とそれに溶解した３００ｍＭマンノースで、ｐＨは６．５±０．２であった。
実施例３：グリコシル化エクソソーム分離組成物の使用方法
本願発明では、さらに、グリコシル化エクソソーム分離方法が提供され、主に、実施例２のグリコシル化エクソソーム分離組成物を使用する主な実験ステップを含み、分離の原理概略図は、詳しくは図１「レクチン－磁性担体カップリング複合体によるグリコシル化エクソソームの分離の原理概略図である」を参照する。
本願発明の詳細な実験ステップは次を含む。
１．事前の準備
用具又は装置を用意した。磁気スタンドであり、グリコシル化エクソソームの手動分離に用いた。又は、当社若しくは子会社による自動アガロース磁気ビーズ分離装置を使用し、主に、人力節約の目的のために、グリコシル化エクソソームの自動分離に用いられた。アガロース磁気ビーズによるグリコシル化エクソソームの自動分離は手動方式の自動化を実現するもので、手動分離と同等な又はより優れた効果を得られ、本実施例では、磁気スタンドによる手動分離で一層の説明を行う。
２．実験手順
（１）臨床サンプルの前処理であった。臨床サンプルの特性に応じてサンプルを前処理するための方法を調整した。
前記血清、血漿、唾液、脳脊髄液、リンパ液サンプルの場合は、サンプルを３０００ｇで１０～１５分遠心分離してサンプルから細胞破片、沈殿物などの不純物を除去し、遠心分離後の上清を新しい磁気分離容器、例えば、遠心分離管に移し、使用に備えた。
前記組織又は細胞培養上清、尿サンプルの場合は、サンプルを３０００ｇで１０～１５分遠心分離してサンプルから細胞破片、沈殿物などの不純物を除去し、次に、上清を限外濾過遠心管で１０～１０００倍濃縮し、濃縮後の上清を新しい磁気分離容器、例えば、遠心分離管に移し、使用に備えた。
（２）ステップ（１）の前処理済みのサンプル５０～５００μＬ、任意選択で５０～３００μＬ、さらに、任意選択で１００～２００μＬ、さらに、任意選択で１００μＬを、１００μＬのレクチン－磁性担体カップリング複合体と充分に均一に混合してインキュベートし、前記前処理済みのサンプルとレクチン－磁性担体カップリング複合体保存液の体積は混合時の両者の比を表すもので、両者の体積が確定したというわけではなく、当然ながら当業者が均一混合時の体積を比例で増加又は減少することができ、なお、磁気分離容器に加える体積は磁気分離容器自体の体積に適合しなければならなかった。レクチン－磁性担体カップリング複合体保存液におけるレクチン－磁性担体カップリング複合体の保存濃度（体積比）は１０～６０％であり、好ましくは当該比が３０～５０％であり、より好ましくは４０～５０％である。インキュベート条件は、室温下で１～３０分、好ましくは５～２０分、より好ましくは１０～１５分インキュベートすることである。前記比と室温下インキュベート時間によって、分離効果に少し差があるが、実質的には同じ分離効果を得る。本願発明の一層の説明として、本実施例の主なステップは次のとおりである。２００μＬのＬＣＡ－アガロース磁気ビーズ保存液（１００μＬのＬＣＡ－アガロース磁気ビーズを含む）を１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、１００μＬの前処理済みのサンプルを吸引して前記遠心分離管に加え、充分に均一に混合させ、室温下で均一に振盪しながら１０～１５分インキュベートした。
（３）磁気スタンドを用いてエクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を分離し、分離過程で非特異的にカップリングしたグリコシル化していないエクソソーム及び他の不純物を洗浄し除去するために、レクチン－磁性担体カップリング複合体の体積の１～３倍のｐＨ７．６±０．２の金属塩イオン不含の洗浄緩衝液で１～３回洗浄した。本実施例の詳細なステップは次のとおりである。ステップ（２）の遠心分離管を磁気スタンドに置き、１分静置した後に上清を吸い取り、この時にグリコシル化エクソソームがＬＣＡ－アガロース磁気ビーズ複合体に吸着され、１００μＬのＬＣＡ－アガロース磁気ビーズには２００μＬのｐＨ７．６±０．２の金属塩イオン不含の洗浄緩衝液を加え、その主な成分は１００ｍＭ金属塩イオン不含Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を含み、充分に吸引して均一に混合させた後、磁気スタンドに置いて１分静置した後に上清を吸い取り、３回繰り返し洗浄した。
（４）ｐＨ６．５±０．２のホウ酸塩－マンノース緩衝液を溶離液として洗浄後のレクチン－磁性担体カップリング複合体を溶離し、その主な成分は１０～２０ｍＭホウ酸塩緩衝液と、それに溶解した１００～５００ｍＭマンノースとを含み、１００μＬのＬＣＡ－アガロース磁気ビーズに対し溶離液の体積は５０～２００μＬであり、好ましくは５０～１００μＬである。溶離上清は分離後のグリコシル化エクソソーム溶液であり、溶離後のエクソソームは外観と形態が完全で、破裂したもの又は断片化したものはなかった。本実施例の詳細なステップは次のとおりである。ステップ（３）で１００μＬのグリコシル化エクソソーム溶離液を加え、溶離液は１５ｍＭホウ酸塩緩衝液と、それに溶解した３００ｍＭマンノースとを含み、吹きかけて均一に混合させた後、磁気スタンドに置いて１分以上静置し、上清を吸引して新しい遠心分離管に入れ、そのままで検出に用い又は使用に備えて－８０±５℃で保存し、上清を吸引する時は磁気ビーズと不純物に触れないよう注意した。溶離分離後のグリコシル化エクソソームは形態が完全で、そのままでグリコシル化エクソソームの液体の検出、エクソソームの免疫学的検出、又は核酸抽出後の遺伝子測定分析などに用いることができる。
実施例４：
本実施例では、主に、グリコシル化エクソソーム分離サンプルを一層説明し、本願発明で利用可能な被分離サンプルは、主に、血清、血漿、唾液、組織又は細胞培養上清、尿、脳脊髄液、リンパ液のいずれかの１つである。通常の１．５ｍＬ遠心分離管の場合は、前記血清、血漿、唾液、脳脊髄液、リンパ液、組織又は細胞培養上清、尿の前処理済みのサンプルの体積は５０～５００μＬであり、好ましくは５０～３００μＬであり、より好ましくは１００～２００μＬであった。サンプルを前処理する過程で、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、リンパ液サンプルは遠心分離するだけであるため、５０～５００μＬ、任意選択で５０～３００μＬ、さらに、任意選択で１００～２００μＬのサンプルを前処理して所定の体積の前処理済みのサンプルを得られた。前記組織又は細胞培養上清、尿サンプルはサンプルを前処理する過程で、遠心分離ステップの他に、１０～１０００倍の濃縮が必要であり、十分な前処理済みのサンプルを得るためには、１～５０ｍＬ、任意選択で１０～５０ｍＬ、さらに、任意選択で３０～５０ｍＬの前記組織又は細胞培養上清、尿サンプルに前処理を行う必要があり、こうして所定の体積の前処理済みのサンプルを得た。
分離サンプルの体積によって分離効果に少し影響があるが、いずれもグリコシル化エクソソーム分離の効果を得られ、本願発明を一層説明するために、本実施例では、実施例３の分離ステップに基づいて、１００μＬの前処理済みの血清、血漿、唾液、脳脊髄液、リンパ液サンプルとして説明する。組織又は細胞培養上清、尿サンプルの分離体積はいずれも５０ｍＬとし、濃縮後の体積は好ましくは１００μＬとして説明する。
細胞培養上清、血清、血漿、脳脊髄液、尿、貯留液、乳汁、唾液、リンパ液などの被分離サンプルの特異性に基づいて、それぞれ細胞培養上清、血漿、尿、脳脊髄液などの４つのタイプのサンプルを選択して一層説明し、他のタイプのサンプルを置き換えても、同じ分離効果が得られた。実施例３のステップに基づいて、由来の異なる１００μＬの前処理済みの細胞培養上清、血漿、尿、脳脊髄液からそれぞれグリコシル化エクソソームを分離し、それぞれ４つの異なるサンプルに由来するグリコシル化エクソソーム分離溶液を得て使用に備えた。
実施例５：
本実施例は、主に、グリコシル化エクソソームの形態及び粒径サイズを観察するために、実施例４で分離したグリコシル化エクソソームを透過型電子顕微鏡で検出するもので、主なステップは次のとおりである。
実施例４で分離したグリコシル化エクソソームサンプルを約５μＬ吸引して、銅メッシュに滴下し、４～５分静置して、濾紙で銅メッシュの縁部から余分な液体を吸い取り、ネガティブ染色液（０．５％酢酸ウラニル水溶液、ｐＨ４．５）を滴加して、銅メッシュにおいて１分間反応させ、濾紙で乾燥させて、２回洗浄し、自然乾燥させた後、Ｔｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ（１２０ｋＶ ＴＥＭ）透過型電子顕微鏡で観察した。透過型電子顕微鏡で実施例４の４つの異なるサンプルから分離したグリコシル化エクソソームを観察したところ、エクソソームの形態が完全で、破裂したものはなく、粒径はいずれも３０～１５０ｎｍで、詳しくは図２の４つの異なるタイプのサンプルから分離したグリコシル化エクソソームの電子顕微鏡下観察画像を参照する。
実施例６：
本実施例は、主に、実施例４で分離したグリコシル化エクソソームに対しＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００システムを用いてエクソソームの粒度及び粒径についてナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を行うもので、ＮＴＡ解析は主に溶液状態下の測定（インサイチュ測定）で、高精度の粒度数分布測定により、約１：１．５倍の相対的粒径差の粒子を見分けることができ、エクソソーム粒子を本来に近い状態で測定することができ、測定データの信憑性と有効性が保証され、信頼性のあるエクソソーム濃度データを提供することで、エクソソームを電子顕微鏡で直接的に観察し測定する際は、一度に観察できる範囲が限られているため、得られた粒径分布データが代表的でないことが多いという従来の欠点を効果的に解消し、電子顕微鏡観察のための乾燥、固定、凍結などのさまざまな前処理でエクソソームが損傷したことを効果的に軽減することができる。
実施例５の４つの異なるタイプのサンプルのグリコシル化エクソソームの電子顕微鏡観察結果が一致することから、本実施例では血漿サンプルから分離したグリコシル化エクソソームを選択してＮＴＡ検出を行い、詳細なステップは次のとおりである。約１０μＬのサンプルを１ｍＬに希釈し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔシリンジポンプでロードし、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００システムで自動的に解析したところ、グリコシル化エクソソームは比較的均一で、平均粒径はいずれも３０～１５０ｎｍで、粒度はいずれも１０１１～１４個／ｍＬであった。詳しくは、血漿サンプル分離後のグリコシル化エクソソームのＮＴＡ解析図である図３を参照する。
実施例７：
本実施例は、主に、実施例４で分離したグリコシル化エクソソームに対しエクソソーム特異的膜タンパク質ＣＤ９／ＣＤ６３／ＣＤ８１抗体、エクソソーム特異的非膜タンパク質ＡＬＩＸ及びＴＳＧ１０１抗体、エクソソームカルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出及び同定を行うもので、主な検出ステップは次のとおりである。
（１）サンプル調製である。３０μＬのエクソソーム洗浄液に等体積の５×ＳＤＳ－ＰＡＧＥロード緩衝液を加え、１００℃下で１０分処理し、使用に備えた。
（２）ＳＤＳ電気泳動である。ゲル（１５％分離ゲル、５％濃縮ゲル）を調製し、１×電気泳動緩衝液を加え、１０μＬ／ウェルでサンプルを加え、電気泳動条件は６０Ｖ、１２０分と設定した。
（３）転写である。適切なサイズのＰＶＤＦ膜を転写緩衝液に入れて、１０分浸漬し、ゲルとＰＶＤＦ膜及びスポンジパッドを、気泡が出ないようにぴったりと貼り合わせ、セミドライ式転写装置でタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した（定電圧４０Ｖ、定電流２００ｍＡ、転写２０分）。
（４）ブロッキングである。５％脱脂粉乳ブロッキング溶液で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、毎回５分とした。
（５）インキュベートである。それぞれ一次抗体（抗ＣＤ９、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ６３、抗ＴＳＧ１０１、抗Ａｌｉｘ、抗カルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）モノクローナル抗体、濃度１ｍｇ／ｍＬ、１：４００希釈）を加えて１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、毎回５分とした。二次抗体（ヤギ抗マウスＨＲＰ １ｍｇ／ｍＬ、１：５０００希釈）を加えて１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、毎回５分とした。
（６）表示である。ＢｅｙｏＥＣＬ Ｍｏｏｎ（高感度ＥＣＬ化学発光試薬キット）で発色させた後、検出した。
実施例４で分離した４つのグリコシル化エクソソームのウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果はそれぞれ次のとおりである。
（１）エクソソーム特異的膜タンパク質ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出が全て陽性であることから、エクソソーム特異的膜タンパク質が検出され、溶離液がエクソソームを含んでいることが示される。詳しくは、エクソソーム特異的膜タンパク質ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果図である図４を参照する。
（２）エクソソーム特異的非膜タンパク質ＡＬＩＸ及びＴＳＧ１０１抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出が全て陽性であることから、エクソソーム特異的非膜タンパク質が検出され、溶離液がエクソソームを含んでいることが示される。詳しくは、エクソソーム特異的非膜タンパク質ＡＬＩＸ及びＴＳＧ１０１抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果図である図５を参照する。
（３）エクソソームサンプルのカルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出が全て陰性であることから、本方法で分離したエクソソームの純度が高いことが示される。カルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）タンパク質が細胞の小胞体に存在し、小胞体マーカータンパク質であり、エクソソームにないため、エクソソームの分離で細胞破片及び／又は細胞が存在するかどうかを効果的に区分するための特異的タンパク質であった。詳しくは、エクソソームサンプルのカルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果図である図６を参照する。本実施例でサンプルから分離したグリコシル化エクソソームのカルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出が全て陰性であることから、分離後のグリコシル化エクソソームサンプルに細胞破片がないことが示される。
実施例８：
本実施例は、主に、異なる洗浄液に対し、特に、金属塩イオンを含む一般的な洗浄液、金属塩イオンを含まない一般的な洗浄液、精製水に対して、グリコシル化エクソソーム分離プロセスの洗浄効果及び分離効果を一層比較及び検証することにより、本願発明で選択した洗浄液の適合性を決定するものであった。
実施例２、３のグリコシル化エクソソーム分離組成物で金属塩イオン不含緩衝液洗浄（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）を精製水、一般的な金属塩イオン含有洗浄液に置き換えた。一般的な金属塩イオン含有洗浄液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ緩衝液）、Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｔｏｎ－ＮａＣｌ緩衝液、ＴＢＳＴ緩衝液を含み、一般的な金属塩イオン含有洗浄液が殆ど界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００などを含み、界面活性剤がエクソソーム小胞の外膜造を損傷する可能性があるため、本実施例で一般的な金属塩イオン含有洗浄液を調製する際は界面活性剤成分を含めなかった。
本実施例で一般的な金属塩イオン含有洗浄液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ緩衝液）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００不含Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｔｏｎ－ＮａＣｌ緩衝液、Ｔｗｅｅｎ－２０不含ＴＢＳＴ緩衝液であった。
前記ＰＢＳ緩衝液の成分は、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）：０．２４ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）：１．４４ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）：８ｇ／Ｌ、塩化カリウム（ＫＣｌ）：０．２ｇ／Ｌで、ｐＨは７．４±０．２であった。
前記Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００不含Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｔｏｎ－ＮａＣｌ緩衝液の成分は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．６Ｍ ＮａＣｌで、ｐＨは７．６±０．２であった。
前記Ｔｗｅｅｎ－２０不含ＴＢＳＴ緩衝液の成分は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌで、ｐＨは７．６±０．２であった。
本実施例で５つの洗浄緩衝液はそれぞれＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、精製水、ＰＢＳ緩衝液、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００不含のＴｒｉｓ－Ｔｒｉｔｏｎ－ＮａＣｌ緩衝液、Ｔｗｅｅｎ－２０不含のＴＢＳＴ緩衝液で、順に１番洗浄液、２番洗浄液、３番洗浄液、４番洗浄液、５番洗浄液とマークした。本実施例の５つの洗浄緩衝液を用いてそれぞれ血漿サンプルからグリコシル化エクソソームを分離して、比較及び検証分析をし、洗浄液以外には、他の成分とステップが全て同じであり、詳細なプロセスは実施例１～４、及び実施例７のエクソソーム特異的膜タンパク質ＣＤ９／ＣＤ６３／ＣＤ８１抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出及び同定ステップを参照する。
本実施例では５つの異なる洗浄緩衝液で、グリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を洗浄した後、溶離して分離したグリコシル化エクソソーム溶液のエクソソーム特異的膜タンパク質ＣＤ９／ＣＤ６３／ＣＤ８１抗体のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果は、詳しくは図７を参照する。
本実施例の結果が示すように、金属塩イオン不含緩衝液（１番洗浄液、２番洗浄液）でグリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を洗浄した後、溶離して得た溶離液のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果は、エクソソーム特異的膜タンパク質ＣＤ９／ＣＤ６３／ＣＤ８１が全て陽性であることを示し、いずれも効果的にグリコシル化エクソソームを分離できることが示唆される。界面活性剤不含で一般的な金属塩イオン含有の一般的な洗浄緩衝液（３番、４番、５番洗浄液）でグリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を洗浄した後、溶離して得た溶離液のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）検出結果は、エクソソーム特異的膜タンパク質ＣＤ９／ＣＤ６３／ＣＤ８１が全て陰性であることを示し、溶液に存在する金属塩イオンがグリコシル化エクソソーム分離の効果に影響を与え、本願発明のグリコシル化エクソソームに明らかな解離効果があることが示される。
実施例９：
本実施例は、主に、グリコシル化エクソソームに対する異なる一般的なタンパク質溶離液及び本願発明のホウ酸塩－マンノース緩衝液の分離効果について一層比較及び検証することにより、本願発明で選択した溶離液の適合性を決定するものである。
実施例２、３のグリコシル化エクソソーム分離組成物でホウ酸塩－マンノース緩衝液を通常のタンパク質溶離液、糖タンパク質溶離液に置き換え、具体的にはタンパク質抗体溶離緩衝液ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、糖タンパク質溶離液Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｌｕｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（米国Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ社）であった。
前記ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒの成分は、６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ β－２－メルカプトエタノールで、ｐＨは６．８±０．２であった。
本実施例の３つの溶離液を用いてそれぞれ血漿サンプルからグリコシル化エクソソームを分離して、比較及び検証分析をし、溶離液以外には、他の成分とステップが全て同じであり、詳細なプロセスは実施例１～５を参照し、３つの溶離液でそれぞれ血漿サンプルから分離したグリコシル化エクソソームに対し電子顕微鏡下でエクソソームの形態と完全性を観察した。
本実施例において３つの異なる溶離液で分離したグリコシル化エクソソーム溶液のエクソソームの電子顕微鏡検出結果は、詳しくは図８を参照する。
本実施例の結果が示すように、本願発明の溶離液はサンプルからグリコシル化エクソソームを効果的に分離でき、しかもエクソソームの形態が完全で、破裂したものはなく、粒径がいずれも３０～１５０ｎｍであった。ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを溶離液としてエクソソームが観察されず、理由としては、ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを溶離液として溶離する過程でエクソソームの外膜が損傷されたため、完全なエクソソームが得られないことが考えられる。糖タンパク質溶離液Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｌｕｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎでは典型的なエクソソーム小胞が観察されず、擬似エクソソーム小胞だけが観察されたが、エクソソームの形態が不完全であることから、分離中にエクソソームが損傷されたため、後の測定分析には不利であるということが示される。
以上をまとめると、本願発明の内容を利用して異なるサンプルに由来するグリコシル化エクソソームを分離したところ、いずれも同じ効果が得られ、しかも分離したエクソソームが全てグリコシル化エクソソームであり、分離精製後のエクソソームの形態が完全で、破裂したものはなく、そのままでグリコシル化エクソソームの液体の検出、エクソソームの免疫学的検出、又は核酸抽出後の遺伝子測定分析などに用いることができる。さらに、後の精製ステップで純度のより高いエクソソーム溶液を得ることができる。
上記の記載で本願発明の好ましい実施例を示しそれを説明しているが、前述したとおり、本願発明は本明細書で開示される形態に限定されず、他の実施例を除外するのではなく、他のさまざまな組み合わせ、修正又は場合に適用でき、しかも本明細書に記載の構想を逸脱しない限り、上記の教示又は関連分野の技術若しくは知識によって変更できることが理解される。当業者が行う変更と変形が本願発明の趣旨と範囲から逸脱しなければ、本願発明に添付した特許請求の範囲による保護範囲に入る。
本願発明は、臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体に関し、前記レクチン－磁性担体カップリング複合体は、磁性担体と、磁性担体の外側にカップリングしたレクチンと、を含む。本願発明に係るレクチン－磁性担体カップリング複合体は、迅速に、正確に、かつ自動で臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することができ、分離効率が高く、分離後のエクソソームは形態が完全で、破裂したもの又は断片化したものはないため、そのままグリコシル化エクソソームの液体の検出に用い、又はそのまま関連の免疫学的検出を行い、又はそのままエクソソームから関連の核酸を抽出してヌクレオチド配列測定分析を行うことができる。

Claims (25)

  1. 磁性担体と、磁性担体の外側にカップリングしたレクチンと、を含み、
    前記レクチンは、パラミツ由来レクチン、ピーナッツ由来レクチン、エンドウ由来レクチンＶＶＡ及び／又はＶＶＬ、ナタマメ由来レクチン、レンズマメ由来レクチン、小麦胚芽レクチン、ダイズ由来レクチン、インゲンマメ由来レクチン、カタツムリ由来レクチンＨＡＡ及び／又はＨＰＡのいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含み、
    前記磁性担体は、デキストラン磁気ビーズ、アガロース磁気ビーズ、樹脂磁気ビーズ、ポリスチレン磁気ビーズのいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含み、前記磁性担体の粒径分布範囲は１～２００μｍである臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体を含み、
    分離過程で非特異的に結合した、グリコシル化されていないエクソソーム及び他の不純物を洗浄し除去するための洗浄液、及び／又はレクチン－磁性担体カップリング複合体に特異的に結合したグリコシル化エクソソームを溶離するための溶離液をさらに含み、
    前記洗浄液は金属塩イオン不含の洗浄緩衝液又は精製水であり、及び／又は、
    前記溶離液は糖類を溶解したホウ酸塩緩衝液であることを特徴とするグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  2. 樹脂がエポキシ樹脂であることを特徴とする請求項１に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  3. 前記磁性担体の粒径分布範囲は１０～２００μｍであることを特徴とする請求項１に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  4. 前記磁性担体の粒径分布範囲は３０～１５０μｍであることを特徴とする請求項１に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  5. 前記レクチン－磁性担体カップリング複合体において、１ｍＬの磁性担体当たり１～２０ｍｇのレクチンが結合されていることを特徴とする請求項１に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  6. 前記レクチン－磁性担体カップリング複合体において、１ｍＬの磁性担体当たり５～１５ｍｇのレクチンが結合されていることを特徴とする請求項１に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  7. 前記レクチン－磁性担体カップリング複合体において、１ｍＬの磁性担体当たり１０～１５ｍｇのレクチンが結合されていることを特徴とする請求項１に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  8. 前記臨床サンプルは、血清、血漿、唾液、組織又は細胞培養上清、尿、脳脊髄液、リンパ液のいずれかの１つを含むことを特徴とする請求項１に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  9. 前記レクチンは、パラミツ由来レクチン、ピーナッツ由来レクチン、エンドウ由来レクチンＶＶＡ及び／又はＶＶＬ、ナタマメ由来レクチン、レンズマメ由来レクチン、小麦胚芽レクチン、ダイズ由来レクチン、インゲンマメ由来レクチンのいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含むことを特徴とする請求項１に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  10. 前記グリコシル化エクソソームは、Ｎ－グリコシル化エクソソーム、Ｏ－グリコシル化エクソソーム、フコシル化エクソソームのいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含むことを特徴とする請求項１に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  11. 前記洗浄液は金属塩イオン不含の洗浄緩衝液であることを特徴とする請求項１に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  12. 前記溶離液はマンノースを溶解したホウ酸塩緩衝液であることを特徴とする請求項１に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。
  13. 磁性担体と、磁性担体の外側にカップリングしたレクチンと、を含み、
    前記レクチンは、パラミツ由来レクチン、ピーナッツ由来レクチン、エンドウ由来レクチンＶＶＡ及び／又はＶＶＬ、ナタマメ由来レクチン、レンズマメ由来レクチン、小麦胚芽レクチン、ダイズ由来レクチン、インゲンマメ由来レクチン、カタツムリ由来レクチンＨＡＡ及び／又はＨＰＡのいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含み、
    前記磁性担体は、デキストラン磁気ビーズ、アガロース磁気ビーズ、樹脂磁気ビーズ、ポリスチレン磁気ビーズのいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含み、前記磁性担体の粒径分布範囲は１～２００μｍであるレクチン－磁性担体カップリング複合体を用いてグリコシル化エクソソームを分離する分離ステップを含み、前記分離ステップは、
    臨床サンプルを前処理するステップと、
    前処理後のサンプルをレクチン－磁性担体カップリング複合体と充分に均一に混合してインキュベートするステップと、
    磁気分離により、グリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を分離し、金属塩イオン不含の洗浄緩衝液又は精製水である洗浄液でグリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を洗浄するステップと、
    溶離液で洗浄後のレクチン－磁性担体カップリング複合体を溶離するステップと、を含むことを特徴とするグリコシル化エクソソーム分離方法。
  14. 前処理後のサンプルとレクチン－磁性担体カップリング複合体の混合における体積比は０．５～５：１であり、
    及び／又は、洗浄液でグリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を洗浄する時に、レクチン－磁性担体カップリング複合体の体積の１～３倍の洗浄液で１～３回洗浄し、
    及び／又は、溶離液とレクチン－磁性担体カップリング複合体の体積比は０．５～２：１であることを特徴とする請求項１３に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。
  15. 前処理後のサンプルとレクチン－磁性担体カップリング複合体の混合における体積比は０．５～３：１であることを特徴とする請求項１３に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。
  16. 前処理後のサンプルとレクチン－磁性担体カップリング複合体の混合における体積比は１～２：１であることを特徴とする請求項１３に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。
  17. 溶離液とレクチン－磁性担体カップリング複合体の体積比は０．５～１：１であることを特徴とする請求項１３に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。
  18. 臨床サンプルを前処理するための方法は、
    血清、血漿、唾液、脳脊髄液又はリンパ液サンプルの場合は、サンプルを３０００ｇ以下の速度で１０～１５分遠心分離してサンプルから細胞破片、沈殿した不純物を除去し、遠心分離後の上清を得、使用に備えるステップと、
    組織又は細胞培養上清、尿サンプルの場合は、サンプルを３０００ｇ以下の速度で１０～１５分遠心分離してサンプルから細胞破片、沈殿した不純物を除去し、次に、上清を限外濾過遠心管で１０～１０００倍濃縮し、使用に備えるステップと、を含むことを特徴とする請求項１３に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。
  19. 磁性担体と、磁性担体の外側にカップリングしたレクチンと、を含み、
    前記レクチンは、パラミツ由来レクチン、ピーナッツ由来レクチン、エンドウ由来レクチンＶＶＡ及び／又はＶＶＬ、ナタマメ由来レクチン、レンズマメ由来レクチン、小麦胚芽レクチン、ダイズ由来レクチン、インゲンマメ由来レクチン、カタツムリ由来レクチンＨＡＡ及び／又はＨＰＡのいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含み、
    前記磁性担体は、デキストラン磁気ビーズ、アガロース磁気ビーズ、樹脂磁気ビーズ、ポリスチレン磁気ビーズのいずれかの１つ、２つ又はそれ以上を含み、前記磁性担体の粒径分布範囲は１～２００μｍであるレクチン－磁性担体カップリング複合体を用いてグリコシル化エクソソームを分離する分離ステップを含み、前記分離ステップは、
    臨床サンプルを前処理するステップと、
    前処理後のサンプルをレクチン－磁性担体カップリング複合体と充分に均一に混合してインキュベートするステップと、
    磁気分離により、グリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を分離し、金属塩イオン不含の洗浄緩衝液又は精製水である洗浄液でグリコシル化エクソソームをカップリングしたレクチン－磁性担体カップリング複合体を洗浄するステップと、
    糖類を溶解したホウ酸塩緩衝液である溶離液で洗浄後のレクチン－磁性担体カップリング複合体を溶離するステップと、を含むことを特徴とするグリコシル化エクソソーム分離方法。
  20. 前記インキュベート条件は、室温下で１～３０分インキュベートすることであることを特徴とする請求項１３に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。
  21. 前記洗浄液は金属塩イオン不含の洗浄緩衝液であることを特徴とする請求項１３に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。
  22. 前記溶離液はマンノースを溶解したホウ酸塩緩衝液であることを特徴とする請求項１３に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。
  23. 前記インキュベート条件は、室温下で５～２０分インキュベートすることであることを特徴とする請求項１３に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。
  24. 前記インキュベート条件は、室温下で１０～１５分インキュベートすることであることを特徴とする請求項１３に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。
  25. グリコシル化エクソソームの液体の検出、エクソソームの免疫学的検出、又はエクソソームからの核酸抽出後のヌクレオチド断片の測定分析を含むことを特徴とする請求項１３～２２のいずれか１項に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法で分離したエクソソームの使用。
JP2022543156A 2020-01-19 2021-01-05 臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体 Active JP7383162B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010060055.7A CN111253491B (zh) 2020-01-19 2020-01-19 一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物
CN202010060055.7 2020-01-19
PCT/CN2021/070288 WO2021143576A1 (zh) 2020-01-19 2021-01-05 一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023503713A JP2023503713A (ja) 2023-01-31
JP7383162B2 true JP7383162B2 (ja) 2023-11-17

Family

ID=70944091

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022543156A Active JP7383162B2 (ja) 2020-01-19 2021-01-05 臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220372173A1 (ja)
EP (1) EP4092052A4 (ja)
JP (1) JP7383162B2 (ja)
CN (2) CN114813264A (ja)
WO (1) WO2021143576A1 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114813264A (zh) * 2020-01-19 2022-07-29 北京尧景基因技术有限公司 凝集素-磁性载体偶联复合物用于分离糖基化外泌体的应用
CN112877274B (zh) * 2021-01-29 2024-02-09 南京大学 一种细胞外囊泡磁性印迹材料及其制备方法与应用
CN113671185A (zh) * 2021-08-23 2021-11-19 安龄(上海)生物科技有限公司 一种外泌体识别装置及方法
CN113652388A (zh) * 2021-09-02 2021-11-16 西安龙旂生物科技有限公司 一种高纯度外泌体提取试剂盒及其提取方法
CN114540491B (zh) * 2021-12-08 2024-01-30 北京尧景基因技术有限公司 一种基于岩藻糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNA的肝癌预测模型建立及应用
CN114354913A (zh) * 2021-12-31 2022-04-15 厦门大学 一种外泌体pd-l1糖基化检测方法
WO2023165529A1 (zh) * 2022-03-01 2023-09-07 南京羿检医学科技有限公司 检测迁移体的方法和系统
CN115786266A (zh) * 2023-01-31 2023-03-14 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种凝集素微阵列芯片的制备方法及捕获细胞外泌体的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120077263A1 (en) 2009-06-05 2012-03-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for isolating exosomes
US20130203061A1 (en) 2009-11-30 2013-08-08 Michael KLASS Methods and systems for isolating, storing, and analyzing vesicles
US20130323756A1 (en) 2010-07-07 2013-12-05 Aethlon Medical, Inc. Methods and compositions for quantifying exosomes
WO2018172384A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Biovesicle Inc Methods and kits for exosome isolation and quantification
JP2018191636A (ja) 2017-05-12 2018-12-06 国立大学法人広島大学 癌の診断デバイス

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5857321A (ja) * 1981-10-01 1983-04-05 Nippon Koutai Kenkyusho:Kk 抗癌剤
DK3110977T3 (en) * 2014-02-28 2018-07-23 Exosome Sciences Inc BRAIN SPECIFIC EXOSOME-BASED DIAGNOSTIC AND EXTRACORPORAL THERAPIES
CN104714026B (zh) * 2014-12-31 2018-08-21 北京热景生物技术股份有限公司 一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物、系统及其应用
WO2017087467A1 (en) * 2015-11-20 2017-05-26 Exosome Sciences, Inc. Exosomal tau as a biomarker for brain disorders
CN108761088B (zh) * 2018-06-28 2021-01-05 北京热景生物技术股份有限公司 用于糖链异常蛋白分离检测的组合物、试剂盒以及方法和用途
CN109266599A (zh) * 2018-10-16 2019-01-25 郑州大学 一种高效形貌无损的外泌体分离方法
CN111381043B (zh) * 2018-12-30 2021-06-18 北京舜景生物医药技术有限公司 一种适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用
CN109738625A (zh) * 2019-01-04 2019-05-10 湖南师范大学 一种捕获纳米磁珠、捕获外泌体的方法和应用
CN114813264A (zh) * 2020-01-19 2022-07-29 北京尧景基因技术有限公司 凝集素-磁性载体偶联复合物用于分离糖基化外泌体的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120077263A1 (en) 2009-06-05 2012-03-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for isolating exosomes
US20130203061A1 (en) 2009-11-30 2013-08-08 Michael KLASS Methods and systems for isolating, storing, and analyzing vesicles
US20130323756A1 (en) 2010-07-07 2013-12-05 Aethlon Medical, Inc. Methods and compositions for quantifying exosomes
WO2018172384A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Biovesicle Inc Methods and kits for exosome isolation and quantification
JP2018191636A (ja) 2017-05-12 2018-12-06 国立大学法人広島大学 癌の診断デバイス

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUBO, T. et al.，Effective separation of exosomes based on its surface sugar chains using a macroporous spongy monolith，ISEV2019 Abstract Book，2019年04月23日，p.307
SAMSONOV, R. et al.，Lectin-Induced Agglutination Method of Urinary Exosomes Isolation Followed by mi-RNA Analysis: Application for Prostate Cancer Diagnostic，The Prostate，2016年，Vol.76，pp.68-79
増川陽大 ほか，多発性骨髄腫の病態解明のためのエクソソーム糖鎖解析，電気泳動，2016年，Vol.60，pp.15-18

Also Published As

Publication number Publication date
US20220372173A1 (en) 2022-11-24
CN111253491B (zh) 2022-03-25
EP4092052A4 (en) 2023-07-12
EP4092052A1 (en) 2022-11-23
CN111253491A (zh) 2020-06-09
WO2021143576A1 (zh) 2021-07-22
JP2023503713A (ja) 2023-01-31
CN114813264A (zh) 2022-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7383162B2 (ja) 臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体
JP7493602B2 (ja) 臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－高分子担体カップリング複合体
JP7364240B2 (ja) 疎水性相互作用を利用した細胞外小胞体の分離方法
US9829483B2 (en) Methods of isolating extracellular vesicles
US11614388B2 (en) Method for recovering extracellular vesicles
EP3674704B1 (en) Method for isolating exosome and exosome isolation kit
CN110231207B (zh) 一种分离外泌体的方法
US20200132682A1 (en) Methods and kits for exosome isolation and quantification
CN112501112A (zh) 一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法
CN113774008A (zh) 一种外泌体的提取方法及其应用
JP2021101705A (ja) 赤血球タンパク質を生産するための方法
CN112852725A (zh) 利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法及应用
CN112430569B (zh) 蛋白sftpc作为肺癌诊断标志物的应用、试剂盒
CN111659158B (zh) 一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法
CN112980006A (zh) 蛋白交联纳米亲和微球及制备方法和应用
KR101711953B1 (ko) 고속 대용량 자동화 당사슬 시료 전처리 시스템
Sharma et al. Method for isolation of small extracellular vesicles from different biofluids and workflow for Mass Spectrometry based-shotgun proteomics and RNA isolation
CN118064424A (zh) 一种去除质粒dna中细菌内毒素的方法
Pauwels et al. Filter-aided extracellular vesicle enrichment (FAEVEr) for proteomics
CN115521894A (zh) 用于提取细胞外囊泡的试剂盒与方法
CN113249292A (zh) 一种细胞外囊泡的分离方法
KR101748588B1 (ko) N-당사슬 바이오마커를 이용하여 난소암을 탐지하는 방법
CN114574429A (zh) 一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂
CN111718977A (zh) 一种分离细胞外囊泡的方法和检测细胞外囊泡的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220826

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20220826

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221220

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230320

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20230530

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231002

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20231016

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20231031

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231107

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7383162

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150