CN118064424A - 一种去除质粒dna中细菌内毒素的方法 - Google Patents

一种去除质粒dna中细菌内毒素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN118064424A
CN118064424A CN202410184829.5A CN202410184829A CN118064424A CN 118064424 A CN118064424 A CN 118064424A CN 202410184829 A CN202410184829 A CN 202410184829A CN 118064424 A CN118064424 A CN 118064424A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid dna
triton
sample
solution
endotoxin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410184829.5A
Other languages
English (en)
Inventor
冯冬歌
胡海
汤傲
董泰华
黄瑜云
韦金壮
汪毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huadao Shanghai Biopharma Co ltd
Original Assignee
Huadao Shanghai Biopharma Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huadao Shanghai Biopharma Co ltd filed Critical Huadao Shanghai Biopharma Co ltd
Priority to CN202410184829.5A priority Critical patent/CN118064424A/zh
Publication of CN118064424A publication Critical patent/CN118064424A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种降低化学杂质的去除质粒DNA中细菌内毒素的方法，为依次使用非离子表面活性剂和Lipid Removal Agent对待处理样品进行处理。本发明还提供上述去除质粒DNA中细菌内毒素的方法在制备去除化学杂质的质粒DNA中的应用以及一种去除化学杂质的质粒DNA。本发明的质粒DNA的细菌内毒素含量和化学杂质含量低于其他方法制备的质粒DNA，符合医药行业标准。

Description

一种去除质粒DNA中细菌内毒素的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种去除质粒DNA中细菌内毒素的方法。
背景技术
质粒是一类小的、双链环状DNA分子，携带染色体以外的遗传信息，由于具有自我复制功能，被广泛应用于生物制药领域。在细胞基因治疗产品中，质粒是构建病毒载体以及将目标基因转入宿主的关键传递载体。在治疗或预防性药物中，质粒又可以作为终产品注入人体内，进行目标蛋白的表达。早在2017年，全球范围内以“裸”质粒型基因治疗药物的临床方案(包含DNA疫苗)就达到了428起。随着临床试验药物申请的不断增多，以及药物在进入后期临床研究阶段上的急速消耗，行业对质粒DNA的需求量不断上升；相应的，对于质粒DNA的生产和质控也提出了更高的要求，以满足药品级规格标准。
内毒素，即脂多糖或LPS，是革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)细胞膜的组成部分。细菌外膜的外层脂质部分是完全由内毒素分子所构成的。单个大肠杆菌细胞约包含两百万个LPS分子，每个LPS分子由疏水的脂质A(lipid A)部分、复杂的糖类残基阵列部分及负电性的磷酸基团所组成。因此，每个内毒素分子都具有疏水域、亲水域和电荷域，这使它在与其他分子相互作用时具有其独特的自身性质。细菌在其活性生长期向其周围微环境中散布少量的内毒素，在死亡时则释放大量内毒素。人体对细菌内毒素极为敏感。极微量(1～5ng/kg体重)内毒素就能引起体温上升，发热反应持续约4小时后逐渐消退。自然感染时，因革兰氏阴性菌不断生长繁殖，同时伴有陆续死亡、释放出内毒素，故发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止。内毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞、中性粒细胞等，使之产生白细胞介素1、6和肿瘤坏死因子α等细胞因子，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升高发热。
根据《药典2020版》第三部总论的要求，对用于瞬时共转染生产过程的质粒DNA，需对其来源、特性、分离纯化方法以及核酸序列等进行描述，对质粒DNA的复制起始点、启动子以及编码选择性标记的基因等组成元件的来源和功能进行说明。质粒的生产应基于细菌种子批系统，并符合相关要求。质粒DNA产品必须满足GMP规格标准，应采用适宜的方法纯化质粒，并基于风险分析和产品特性对每批质粒的质量进行检测，通常包括鉴别、基因组完整性、质粒含量、质粒纯度、宿主细胞DNA残留量、质粒对细胞的转染效率或其他可反映转染效率的检测项目，如细菌内毒素检查和无菌检查等，以及对化学杂质含量的检测，检测结果符合要求后，质粒DNA才能作为应用于医药行业的质粒DNA产品，例如用于载体的生产。而现有的质粒DNA产品在生产过程中，常面临化学杂质超标的问题，导致获得的质粒DNA不能满足药品GMP规格标准而被淘汰，不能作为实际应用的质粒DNA产品。
发明内容
本申请在对质粒DNA产品的制备和生产中发现，质粒DNA易出现化学杂质超标的问题而难以生产得到合格的质粒DNA产品，经本申请研究确认，质粒DNA中超标的化学杂质的一个重要原因是由于质粒DNA去除内毒素的过程中试剂的引入，基于此新发现，本申请对现有的质粒DNA去除内毒素的技术进行改进。
本申请第一方面提供一种降低化学杂质的去除质粒DNA中细菌内毒素的方法，为依次使用非离子表面活性剂和Lipid Removal Agent对待处理样品进行处理。
本申请第二方面提供上述第一方面的降低化学杂质的去除质粒DNA中细菌内毒素的方法在降低质粒DNA化学杂质残留中的应用。
本申请第三方面提供一种降低质粒DNA化学杂质残留的方法，包括在制备质粒DNA溶液后，采用权利要求上述第一方面的方法对所述质粒DNA溶液进行处理。
本申请的有益效果在于：
1)本申请首次发现质粒DNA制备过程中化学杂质容易超标，且发现超标的化学杂质来源于质粒DNA制备过程中试剂的引入且难以去除，因此改进质粒DNA纯化技术，提供了一种降低化学杂质的去除质粒DNA中细菌内毒素的方法，在去除细菌内毒素的同时，可以确保质粒DNA中的化学杂质符合医药行业标准，获得合格的质粒DNA产品。
2)本申请不仅可以有效清除反复萃取后超螺旋质粒DNA溶液中依然存在的痕量内毒素，还能够吸附残留的化学杂质TritonTMX-114。在吸附完成后，可以通过简易离心配合精细过滤彻底去除Lipid Removal Agent，简便高效。
3)通过本申请的方法，可以去除超螺旋质粒DNA溶液中几乎所有的细菌内毒素，得到的超螺旋质粒DNA内毒素浓度检测低于1EU/mL，符合GMP药品规格的内毒素含量浓度标准，且质粒DNA中几乎检测不到化学杂质TritonTMX-114，其含量低于15.0μg/mL，低于其他方法制备的质粒DNA，符合GMP药品标准。
4)本申请的方法同时具备了传统非色谱和色谱方法的优势，具有简便快捷、易于放大以及成本效益等诸多特点；与此同时，在实际检测过程中，内毒素去除彻底、产品损失量小、且几乎不含有非离子表面活性剂、蛋白质、基因组、RNA等杂质。
5)本申请的方法在去除内毒素和化学杂质的同时，还能全方面的降低质粒DNA中的其他杂质，包括蛋白残留、基因组残留、RNA残留，用本申请的方法即可使质粒DNA的各指标都达到GMP药品标准，无需额外的更复杂的去除步骤，且获得的质粒DNA纯度更高，各类杂质残留更少，在使用过程中安全性更高。
附图说明
图1为大肠杆菌碱裂解澄清后超螺旋质粒DNA粗提液的电泳图。
图2为超螺旋质粒DNA粗提液经凝胶排阻(分子筛)纯化过程的峰图。
图3为超螺旋质粒DNA粗提液经凝胶排阻(分子筛)纯化后的电泳图。
图4为超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析纯化过程的峰图。
图5为超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析纯化后的电泳图。
图6为超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析后的内毒素浓度。
图7为实施例5超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取，LipidRemoval Agent吸附后的内毒素浓度。
图8为对比例1超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取后的内毒素浓度。
图9为实施例5的内毒素标准品的标准曲线。
图10为对比例1的内毒素标准品的标准曲线。
图11为实施例6的校准曲线样品的检测数值。
图12为实施例6的校准曲线样品的校准曲线。
图13为实施例6的质粒DNA待测样品的检测数值。
图14为实施例7的DNA定量标准品的标准曲线。
图15为实施例10的TritonTMX-114标准品的标准曲线。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公布的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本申请在质粒DNA产品的实际生产过程中，发现质粒DNA易出现化学杂质超标的问题，且发现质粒DNA中超标的化学杂质来源于质粒DNA制备过程中化学试剂的引入且难以去除。
基于此新发现，本申请第一方面提供一种降低化学杂质的去除质粒DNA中细菌内毒素的方法，为依次使用非离子表面活性剂和Lipid Removal Agent对待处理样品进行处理。所述化学杂质可以为Triton，具体可以为TritonTMX-114或TritonTMX-100，所述化学杂质不包括细菌内毒素。通过本申请的方法在去除质粒DNA的细菌内毒素的同时，还能去除引入的TritonTMX-114，在TritonTMX-114的加入量足够的情况下，能使TritonTMX-114的残留量符合标准，TritonTMX-114的残留量低于15.0μg/mL。
本申请还提供一种化学杂质残留量符合标准的去除质粒DNA中细菌内毒素的方法，为依次使用非离子表面活性剂和Lipid Removal Agent对待处理样品进行处理。所述化学杂质可以为Triton，具体可以为TritonTMX-114或TritonTMX-100，所述化学杂质不包括细菌内毒素。通过该方法在去除质粒DNA的细菌内毒素的同时，还能去除引入的TritonTMX-114，在TritonTMX-114的加入量足够的情况下，能使TritonTMX-114的残留量符合标准，TritonTMX-114的残留量低于15.0μg/mL。
所述非离子表面活性剂为Triton，本领域技术人员可知，Triton可以包括TritonTMX-114或TritonTMX-100等。TritonTMX-114，即曲拉通X-114，是一种非离子型表面活性剂，具有较低的临界胶束浓度，在4℃下能与水溶液互溶。其浊点为23℃，在低于该温度时，TritonTMX-114能与水互溶；当高于该温度时，则分离成水相和去污剂相，基于该特点，TritonTMX-114在生物化学实验中常用于水相蛋白和脂蛋白的分离，如膜蛋白的提取等。
TritonTMX-100，即曲拉通X-100，其化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子表面活性剂，结构类似于igepal、NP-40，在分子生物学及免疫学中用于促进脂质和蛋白质的溶解，可用于多种实验，如细胞裂解、蛋白提取、酶类储存液以及其他蛋白稳定液的配制、ICC/IHC等，作为常用的灭活剂和裂解剂，该试剂大量应用于生物制品，尤其是疫苗、基因-细胞治疗产品的生产中。
Lipid Removal Agent是指脂质去除剂，成分包括结晶硅酸钙水合物，LipidRemoval Agent可以是购买的商业产品，例如可以为MilliporeSigma公司的产品。
在本申请的具体实施方式中，所述方法采用TritonTMX-114。由于TritonTMX-114和TritonTMX-100具有相同或相似的结构、物理性质、化学性质，两者所起的作用也相同，因此两者可以互相替换。
由于TritonTMX-114本身具有一定毒性，因此需要在终成品中对其残留量进行检测。中国药典2020版三部对生物制品中TritonTMX-114和TritonTMX-100的残留量做了明确规定，要求小于15.0μg/mL。在本申请的具体实施方式中，所述方法包含以下步骤：
S1：采用TritonTMX-114工作液对待处理样品进行萃取，取水相获得初处理样品
S2：将步骤S1得到的初处理样品采用Lipid Removal Agent抛光处理，得到去除细菌内毒素的质粒DNA。
在本申请的具体实施例中，所述TritonTMX-114工作液为将TritonTMX-114溶于注射用水后制备得到的溶液，所述注射用水是指符合中国药典注射用水项下规定的水，所述TritonTMX-114工作液中TritonTMX-114的质量分数通常为10～40％；可选的，所述TritonTMX-114工作液中TritonTMX-114的质量分数可以为10～20％，可以为20～30％，也可以为30～40％，在本申请的某一实施例中，所述TritonTMX-114工作液中TritonTMX-114的质量分数为20～30％。
在本申请的具体实施例中，所述TritonTMX-114工作液的体积可以为待处理样品体积的1～10％；例如所述TritonTMX-114工作液的体积可以为待处理样品体积的1～4％，可以为待处理样品体积的4～6％，也可以为待处理样品体积的6～10％，在本申请的某一实施例中，所述TritonTMX-114工作液的体积为待处理样品体积的4～6％。
进一步的，所述萃取还包括将待处理样品和TritonTMX-114依次在冰浴和温浴中混匀；本领域技术人员可知，冰浴即为将样品放置于冰水混合物中，从而降低样品的温度，达到在低温下处理的目的，冰水混合物的温度通常为0℃，在本申请的具体实施方式中，所述冰浴的时间为10～50min；例如所述冰浴的时间可以为10～20min，可以为20～40min，也可以为40～50min，在本申请的某一实施例中，所述冰浴的时间为20～40min。
在实施例中所述温浴的温度可以为42～100℃，按照实际情况进行调整，所述温浴的温度可以为42～60℃，可以为60～80℃，也可以为80～100℃，在本申请的某一实施例中，所述温浴的温度为60℃。除了温浴的温度以外，温浴时间对于混匀和反应的充分程度也有重要作用，可以依据温浴的温度调整温浴的时间，当温浴温度提高时可以减少温浴的时间，所述温浴的时间为10～50min；进一步的，所述温浴的时间可以为10～20min，可以为20～40min，也可以为40～50min，在申请的某一实施例中，所述温浴的时间为20～40min。
本领域技术人员可知，混匀可以采用各种常规的手段或仪器进行混匀，例如可以采用各种类型的磁力搅拌器等。所采用的转速可以根据实际情况进行调整，使TritonTMX-114在超螺旋质粒DNA溶液中充分混匀并与超螺旋质粒DNA溶液中的细菌内毒素充分接触即可，在本申请的具体实施方式中，一般设置转速为100～200rpm，例如可以为100～130rpm，可以为130～160rpm，也可以为160～200rpm，在本申请的某一实施例中，转速为150rpm。
步骤S1中取水相可以采用本领域的常规操作，例如在本申请的具体实施方式中，可以采用高速离心，本领域技术人员可知，高速离心的转速为8000～30000rpm/min，可根据分离的实际情况进行调整，在本申请的某一实施例中，离心转速为12000rpm/min，该离心的时间可以选择10～20min，可选的，该离心的时间可以为10～14min，也可以为14～17min，也可以为17～20min，在本申请的某一实施例中，离心的时间为15min。
在本申请的具体实施方式中，步骤S1中采用TritonTMX-114工作液对待处理样品进行萃取的次数可以为多次，萃取的次数可以根据去除细菌内毒素的效果而定，可以为2～5次，例如可以为2～3次，3～4次，4～5次，在本申请的某一实施例中，所述萃取的次数为2～5次。
在本申请的具体实施方式中，所述抛光处理为加入Lipid Removal Agent后孵育。Lipid Removal Agent对TritonTMX-114处理后的产物进行抛光处理。所述抛光处理是指吸附TritonTMX-114处理后未除尽的细菌内毒素，和吸附TritonTMX-114处理后残余的TritonTMX-114。Lipid Removal Agent是一种人工合成的水合硅酸钙，为了解决本申请发现的化学杂质超标的问题，引入Lipid Removal Agent作为一种下游抛光净化工具，去除在质粒DNA纯化过程中引入的化学杂质。本申请中引入Lipid Removal Agent可以有效清除反复萃取后超螺旋质粒DNA溶液中依然存在的痕量内毒素，选择性亲和上层水相中残留的洗涤剂TritonTMX-114，从而去除了质粒DNA中的化学杂质。在吸附完成后，可以通过简易离心配合精细过滤彻底去除Lipid Removal Agent，检测的化学杂质TritonTMX-114残留量低于15.0μg/mL。
在本申请的具体实施方式中，可以采用以下方法对TritonTMX-114或TritonTMX-100残留量进行检测：参照《中国药典》三部(2010版)配制磷酸盐缓冲液(pH 7.2)；取10mL液体苯酚，溶于190mL灭菌蒸馏水中，得到5％(v/v)苯酚工作液；配置TritonTMX-114标准品浓度分别为0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％和0.01％(w/v)，取100μL PBS(pH 7.2)加至96孔板作为空白对照，然后向上述共11个孔中各加入50μL 5％的苯酚工作液，充分混匀后，室温静置15min，于340nm波长处测定不同浓度TritonTMX-114标准品的A340nm值，以A340nm值对TritonTMX-114标准品浓度进行线性回归，绘制标准曲线；取待测样品100μL加至96孔板，取100μL PBS(pH 7.2)加至96孔板作为空白对照，然后像上述各孔中各加入50μL 5％的苯酚工作液，充分混匀后，室温静置15min，于340nm波长处测定待测样品的A340nm值，再由所得A340nm值，根据TritonTMX-114标准曲线求得待测样品中残留TritonTMX-114浓度。
在本申请的具体实施方式中，所述Lipid Removal Agent在初处理样品中的终浓度为10g/L～70g/L，即将Lipid Removal Agent加入初处理样品中，以初处理样品为溶剂，Lipid Removal Agent在初处理样品中的浓度。例如在具体实施例中Lipid Removal Agent在初处理样品中的终浓度可以为10g/L～30g/L，可以为30g/L～50g/L，也可以为50g/L～70g/L，在本申请的某一实施方式中，Lipid Removal Agent在初处理样品中的终浓度为30g/L～50g/L。在实际操作中，可以一次加入Lipid Removal Agent使Lipid RemovalAgent在初处理样品中的终浓度为10g/L～70g/L，也可以分批多次加入使Lipid RemovalAgent在初处理样品中的终浓度为10g/L～70g/L，优选的，可以分批多次加入LipidRemoval Agent，使Lipid Removal Agent与样品充分混合起到吸附作用。
此外，在本申请的实施例中所述孵育的温度通常为室温，通常情况下，室温可以为20～25℃，因此所述孵育的温度可以为20～22℃，也可以为22～24℃，还可以为24～25℃，在本申请的某一实施方式中，所述孵育的温度为25℃。在本申请的实施例中所述孵育的时间通常为3～15min，例如所述孵育的时间可以为3～5min，可以为5～8min，也可以为8～10min，还可以为10～15min，在本申请的某一实施方式中，所述孵育的时间为3min。
在本申请的具体实施例中，待处理样品为质粒DNA溶液，优选的，所述质粒DNA溶液选自超螺旋质粒DNA溶液、线性质粒DNA溶液、开环质粒DNA溶液以及多聚体质粒DNA溶液；在本申请的某些实施例中，所述质粒DNA溶液为超螺旋质粒DNA溶液。
本领域技术人员可知，质粒DNA包括超螺旋质粒DNA、线性质粒DNA、开环质粒DNA以及多聚体质粒DNA等，无论质粒DNA大小如何(1Kbp～20Kbp)，均适用于本申请的方法进行细菌内毒素和化学杂质的去除。采用本申请的方法TritonTMX-114反复萃取并补加LipidRemoval Agent进行抛光处理来去除细菌内毒素和化学杂质，使得最终质粒DNA符合GMP药品规格，均在本专利的保护范围内。其中超螺旋质粒DNA被认为是一种能够最有效地提高转染效率和目的基因表达量的质粒形态，在基因治疗、DNA疫苗、制药上较为常用。
本申请第二方面提供上述第一方面的去除质粒DNA中细菌内毒素的方法在降低质粒DNA化学杂质残留中的应用。其中所述质粒DNA选自超螺旋质粒DNA、线性质粒DNA、开环质粒DNA以及多聚体质粒DNA等，所述化学杂质可以是在质粒DNA生产、处理等过程中引入的化学试剂，比如非离子表面活性剂等，更具体的，非离子表面活性剂可以包括TritonTMX-114或TritonTMX-100。所述化学杂质不包括细菌内毒素。
本申请第三方面提供一种降低质粒DNA化学杂质残留的方法，包括在制备质粒DNA溶液后，采用上述第一方面的方法对所述质粒DNA溶液进行处理。所述化学杂质包括TritonTMX-114或TritonTMX-100，所述TritonTMX-114或TritonTMX-100残余量小于15.0μg/mL，符合GMP药品规格的标准。
上述降低质粒DNA化学杂质残留指的是相比单独采用TritonTMX-114或TritonTMX-100或其他去除质粒DNA中细菌内毒素的方法，化学杂质残留更少。
所述质粒DNA由以下步骤制备：
S1)以发酵结束后的大肠杆菌为原料，依次通过重悬、裂解、澄清、凝胶排阻以及亲和层析得到待处理样品。
S2)待处理样品采用上述的去除质粒DNA中细菌内毒素的方法进行处理。
具体的，步骤S1)包括通过重悬发酵结束后的大肠杆菌菌泥制得菌体重悬液，随后进行碱裂解并澄清，得到超螺旋质粒DNA粗提液，通过凝胶排阻(分子筛)去除超螺旋质粒DNA粗提液中的RNA，通过亲和层析去除超螺旋质粒DNA粗提液中其它构型的质粒DNA，包括开环、线性以及多聚体等等，得到残留细菌内毒素的超螺旋质粒DNA溶液。所述碱裂解可以为加入0.2M NaOH，1％SDS溶液使菌体裂解；所述澄清即为将裂解后的液体过滤或离心，得到澄清的超螺旋质粒DNA粗提液；所述凝胶排阻即利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，从而将RNA分离出来；所述亲和层析是一种基于生物分子之间特异性相互作用的纯化技术，其工作原理是基于目标物质与某种配体(如抗体、金属离子、受体等)之间的高度选择性结合，通过这种特异性结合，目标物质可以被亲和柱上的配体捕获，而其他杂质则被洗脱，实现了目标物质的纯化。本申请可以利用亲和层析去除其它构型的质粒DNA，包括开环、线性以及多聚体等，只保留制药领域中最常用的超螺旋质粒DNA。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1超螺旋质粒DNA粗提液的制备
大肠杆菌的重悬、裂解以及澄清制备超螺旋质粒DNA粗提液，包括如下步骤：
样品准备：待发酵结束后，将发酵液转移到离心杯中，两两配平，4℃、12000×g离心10min收集菌体沉淀，弃上清；
重悬：取50g大肠杆菌菌体沉淀，按每克菌体用已校验的量具加入12.50mL P1溶液(50mmol/L葡糖糖，25mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，10mmol/L EDTA(pH 8.0))重悬；
裂解：检查P2(0.2mol/L NaOH，1％w/v SDS)是否有沉淀，如有沉淀，将P2放入水浴锅中40～60℃加热溶解。按每克菌体用已校验的量具加入12.50mL P2溶液至上一步骤的重悬菌液中，用玻璃棒缓慢搅动使其混匀2～5min；
中和：按每克菌体用已校验的量具加入12.50mL P3溶液(3mol/L乙酸钾，冰醋酸调节pH至5.5)至上一步骤的裂解液中，用玻璃棒缓慢搅动使其混匀，混匀后冰浴30min；
除杂：将中和后的溶液分装至离心杯中，并用天平两两配平后放到离心机中，以4℃、12000×g离心15min；离心后，收集上清，采用0.45μm的囊式过滤器过滤，将滤液收集至细口大瓶中；
浓缩：向过滤后的裂解液中加入0.7倍裂解液体积的异丙醇，混匀后分装至离心杯中，并用天平两两配平后放到离心机中，以4℃、12000×g离心15min。倒掉上清液，将沉淀转移到1～2个离心杯中；
洗涤：向每个装有沉淀的离心杯中加入50mL 70％乙醇，充分洗涤后以4℃、12000×g离心10min，缓慢倒掉上清液；重复上述步骤1次，并晾干沉淀；
复溶：待沉淀晾干后，在离心杯中加入少量注射用水，将离心杯中的沉淀转移到试剂瓶中，按照1g湿菌加入2mL注射用水的比例，用经校验的量具量取注射用水进行溶解，得到质粒粗提液，用天平称量质粒粗提液重量。
分析：大肠杆菌碱裂解澄清后超螺旋质粒DNA粗提液的电泳图如图1所示，从整个泳道中可以很明显的看到除了开环质粒DNA和超螺旋质粒DNA条带外，泳道下方存在明显的RNA条带，且含量较多；2个泳道内超螺旋质粒DNA占总质粒DNA的百分比分别为77.9％、69.9％。
实施例2通过凝胶排阻(分子筛)去除超螺旋质粒DNA粗提液中的RNA
准备：打开AKTA层析纯化系统，运行相应纯化程序；确认凝胶排阻(分子筛)层析柱柱效在“1”附近，通过柱高和底面积确定柱体积并确保载量不高于1g菌/10mL柱体积；将层析柱连接至AKTA层析纯化系统，设置整个系统流速为40mL/min并用平衡液(2.1mol/L(NH)2SO4，10mmol/L EDTA，100mmol/L Tris，pH 7.5)平衡层析柱，直到层析柱内的pH和电导率趋于稳定，其中pH内控标准：7.0-8.0，电导率内控标准：190-240mS/cm；
进样：以40mL/min的流速将上述大肠杆菌碱裂解澄清后超螺旋质粒DNA粗提液分二次全部泵入凝胶排阻(分子筛)纯化体系，并在层析柱出口设置紫外检测信号UV260参数；
洗脱收样：根据柱体积，采用3倍柱体积的平衡液进行样品洗脱，流速同样设置为40mL/min，收集目标为UV260第一个洗脱峰(第一个UV260洗脱峰为质粒DNA峰，第二个UV260洗脱峰为RNA峰)，当UV260初次升到20mAU时开始收集，等UV260下降到80mAU以下或再次升起时结束收集，收集得到的质粒洗脱液暂存于2～8℃或者立即进行下一步纯化操作；
分析：超螺旋质粒DNA粗提液经凝胶排阻(分子筛)纯化过程的峰图如图2所示，用平衡液平衡纯化柱，待系统检测的pH和电导率达到稳定后，再进样并洗脱，根据UV260的第一个峰来收集质粒DNA，此时认为RNA依然存在于纯化柱中，没有流出；超螺旋质粒DNA粗提液经凝胶排阻(分子筛)纯化前后的电泳图如图3所示，此时泳道中未见RNA，实验结果说明超螺旋质粒DNA粗提液经凝胶排阻(分子筛)纯化过程后，RNA被有效去除。
实施例3通过亲和层析去除超螺旋质粒DNA粗提液中其它构型的质粒DNA
通过亲和层析去除超螺旋质粒DNA粗提液中其它构型的质粒DNA，包括开环、线性以及多聚体等等，包括如下步骤：
准备：打开AKTA层析纯化系统，运行相应纯化程序；确认亲和层析柱柱效在“1”附近，通过柱高和底面积确定柱体积并确保载量不高于1g菌/5mL柱体积；将层析柱连接至AKTA层析纯化系统，设置整个系统流速为40mL/min并用平衡液(2.1mol/L(NH)2SO4，10mmol/LEDTA，100mmol/L Tris，pH 7.5)平衡层析柱，直到层析柱内的pH和电导率趋于稳定，其中pH内控标准：7.0-8.0，电导率内控标准：190-240mS/cm；
进样：以40mL/min的流速将经凝胶排阻(分子筛)纯化后的超螺旋质粒DNA粗提液全部泵入亲和层析纯化体系，并在层析柱出口设置紫外检测信号UV260参数；
洗涤除杂：根据柱体积，采用3倍柱体积的洗涤液(1.9mol/L(NH)2SO4，10mmol/LEDTA，100mmol/L Tris，pH 7.5)进行样品除杂，流速同样设置为40mL/min；
洗脱收样：根据柱体积，采用3倍柱体积的洗脱液(1.85mol/L(NH)2SO4，10mmol/LEDTA，100mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，pH 7.5)进行样品洗脱，流速同样设置为40mL/min，收集目标为UV260第一个洗脱峰，当UV260初次升到20mAU时开始收集，等UV260下降到80mAU以下或再次升起时结束收集，收集得到的质粒洗脱液暂存于2～8℃或者立即进行下一步纯化操作；
分析：超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析纯化过程的峰图如图4所示，亲和层析柱特异性结合超螺旋质粒DNA，因此在进样阶段时即存在一个小峰，认为此峰为开环质粒DNA，后续超螺旋质粒DNA采用洗脱液进行洗脱，依然根据UV260来进行收集超螺旋质粒DNA；超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析纯化前后的电泳图如图5所示，开环质粒DNA占总质粒DNA百分比明显减少，超螺旋质粒DNA占主导地位。
实施例4超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析后的内毒素浓度检测
超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析后的内毒素浓度检测，采用鲎试剂吸光度检测法，包括如下步骤：
缓冲液置换：超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析纯化后的缓冲液为亲和层析的洗脱液，在内毒素浓度检测中需要将其置换为灭菌注射用水；因此需要向其中加入0.7倍裂解液体积的异丙醇，混匀后分装至离心杯中，并用天平两两配平后放到离心机中，以4℃、12000×g离心15min；倒掉上清液，将沉淀转移到1～2个离心杯中；向每个装有沉淀的离心杯中加入50mL 70％乙醇，充分洗涤后以4℃、12000×g离心10min，缓慢倒掉上清液；重复上述步骤1次，并晾干沉淀；待沉淀晾干后，在离心杯中加入少量注射用水，将离心杯中的沉淀转移到试剂瓶中，按照1g湿菌加入2mL注射用水的比例，用经校验的量具量取注射用水进行溶解，从而达到置换洗脱液为灭菌注射用水的目的；
内毒素标准品配制：内毒素标准品参数为10EU/支，在配置内毒素标准品时，取一支标准品，加入细菌内毒素检查用水1.0mL，复溶后置旋涡混匀器上混匀15分钟，得到溶解即为10EU/mL的内毒素标准品溶液，如果需要其他浓度的内毒素溶液，可根据实验要求配制；
内毒素标准品稀释：方法如下(以1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125EU/mL为例)：
取上步配制的10EU/mL的内毒素溶液，稀释为1.0EU/mL的内毒素溶液，以1.0EU/mL的内毒素溶液为母液按下表1稀释成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125EU/mL的浓度梯度，配制好的内毒素标准溶液应在4小时内用完；
表1内毒素溶液稀释梯度
鲎试剂工作液配制：按照内置说明书要求，每管鲎试剂标准品在使用时，添加1.25mL细菌内毒素检查用水，充分溶解后，即得工作液；使用时，按照鲎试剂工作液体积与样品体积1：1来进行添加混匀，随后进行光度检测；
内毒素浓度检测：将样品稀释适当倍数后作为待测样品，连同内毒素稀释标准品依次安顺序加入到96孔板中，每孔100μL；随后迅速向每个孔中补加0.1mL的鲎试剂工作液，轻微振荡混匀后，进行吸光度的检测；每间隔10秒检测一次各孔在OD450nm处的吸光度，检测循环重复800次，最后导出excel数据，以上检测由全自动紫外分光光度计完成；
分析：超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析后的内毒素浓度如图6所示，其中A1/B1/C1/D1/E1/F1/G1对应的内毒素浓度依次为1/0.5/0.25/0.125/0.0625/0.03125/0EU/mL，样品稀释100倍后分成3组，分别为A2/B2/C2，经测量发现，内毒素浓度很明显超过了标准品所在的范围(内毒素浓度越大，吸光度随着时间增加的速率越快)，因此总体内毒素浓度将会＞100EU/mL，定性分析得到其不符合GMP药品规格的内毒素含量浓度标准。
实施例5超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取，LipidRemoval Agent吸附后的内毒素浓度检测
超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取，Lipid RemovalAgent吸附后的内毒素浓度检测，采用鲎试剂吸光度检测法，包括如下步骤：
萃取：用灭菌注射用水配制终浓度为20％的TritonTMX-114工作液，按照5％：95％的体积比，将终浓度为20％的TritonTMX-114工作液和经亲和层析纯化后并已经通过缓冲液置换的超螺旋质粒DNA粗提液充分混合，在150rpm的转速下置于冰水混合物上孵育30min，再置于60℃水浴锅中孵育30min，随后12000×g高速离心15min，留上层清液；再用终浓度为20％的TritonTMX-114工作液反复萃取，共计3次，弃去下层去垢相，此时上层水相中已去除大部分的细菌内毒素；
吸附：向TritonTMX-114反复萃取后的超螺旋质粒DNA溶液中加入终浓度为10g/L的Lipid Removal Agent，置于振荡摇床中25℃、160rpm孵育3min；随后取出继续补加LipidRemoval Agent至终浓度为20g/L，继续置于振荡摇床中25℃、160rpm孵育3min；重复以上操作，直至Lipid Removal Agent的终浓度为40g/L；
收样：待吸附结束后，将料液分装至离心杯中，并用天平两两配平后放到离心机中，以4℃、12000×g离心15min，留上清液，弃沉淀；
过滤：采用0.22μm一次性囊氏过滤器过滤上述所得上清液，彻底去除残留的LipidRemoval Agent颗粒以及其它杂质；
内毒素浓度检测：经过Lipid Removal Agent吸附后的样品内毒素浓度检测方法参照具体实施例4中的内毒素浓度检测方法，除样品不同外，其它均保持一致；
分析：超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取，Lipid RemovalAgent吸附后的内毒素浓度如图7所示，其中A1/B1/C1/D1/E1/F1/G1对应的内毒素浓度依次为1/0.5/0.25/0.125/0.0625/0.03125/0EU/mL，样品稀释100倍后分成3组，分别为A2/B2/C2，经测量发现，内毒素浓度介于标准品所在的范围以下(内毒素浓度越大，吸光度随着时间增加的速率越快)。如下表2和表3所示，取吸光度到达0.7时所用时间为统一标准，联合各孔板相应位置的内毒素浓度，将LOG10(C)与LOG10(T)一一对应起来并做出标准曲线，标准曲线如图9所示；再根据样品吸光度到达0.7时所用时间，结合标准曲线，逆推出样品中内毒素浓度：
表2A1/B1/C1/D1/E1/F1/G1对应的内毒素浓度及吸光度到达0.7时所用时间
96孔板位置 C浓度(EU/ML) LOG10(C) LOG10(T) T时间(s) 时间(min)
F1 0.03125 -1.505149978 3.511749711 3249 0:54:09
E1 0.0625 -1.204119983 3.40654018 2550 0:42:30
D1 0.1250 -0.903089987 3.29666519 1980 0:33:00
C1 0.2500 -0.602059991 3.193124598 1560 0:26:00
B1 0.5000 -0.301029996 3.08278537 1210 0:20:10
A1 1.0000 0 2.977723605 950 0:15:50
表3A2/B2/C2对应的内毒素浓度及吸光度到达0.7时所用时间
根据样品作用时间以及标准曲线逆推样品内毒素浓度，再乘以稀释倍数，得到样品最终内毒素浓度，均在1EU/mL以下(3次结果分别为0.68、0.48、0.25EU/mL)，内毒素含量至少为未经TritonTMX-114反复萃取和Lipid Removal Agent抛光处理的初提液的1/200，内毒素含量具有大幅度的降低，符合GMP药品规格的内毒素含量浓度标准。
对比例1超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取后的内毒素浓度检测
超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取后的内毒素浓度检测，采用鲎试剂吸光度检测法，包括如下步骤：
样品制备：需要经TritonTMX-114反复萃取的样品为具体实施例4中经亲和层析纯化后并已经通过缓冲液置换的超螺旋质粒DNA粗提液；
萃取：用灭菌注射用水配制终浓度为20％的TritonTMX-114工作液，按照5％：95％的体积比，将终浓度为20％的TritonTMX-114工作液和经亲和层析纯化后并已经通过缓冲液置换的超螺旋质粒DNA粗提液充分混合，在150rpm的转速下置于冰水混合物上孵育30min，再置于60℃水浴锅中孵育30min，随后12000×g高速离心15min，留上层清液；再用终浓度为20％的TritonTMX-114工作液反复萃取，共计3次，弃去下层去垢相，此时上层水相中已去除大部分的细菌内毒素；
内毒素浓度检测：经过终浓度为20％的TritonTMX-114工作液反复萃取后的样品内毒素浓度检测方法参照具体实施例4中的内毒素浓度检测方法，除待测样品不同外，其它均保持一致；
分析：超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取后的内毒素浓度如图8所示，其中A1/B1/C1/D1/E1/F1对应的内毒素浓度依次为1/0.5/0.25/0.125/0.0625/0.03125EU/mL，样品稀释100倍后分成4组，分别为A2/B2/C2/D2，经测量发现，内毒素浓度介于标准品所在的范围以内(内毒素浓度越大，吸光度随着时间增加的越快)，如下表4和表5所示，取吸光度到达0.7时所用时间为统一标准，联合各孔板相应位置的内毒素浓度，将LOG10(C)与LOG10(T)一一对应起来并做出标准曲线；标准曲线如图10所示，再根据样品吸光度到达0.7时所用时间，结合标准曲线，逆推出样品中内毒素浓度。
表4A1/B1/C1/D1/E1/F1对应的内毒素浓度及到达0.7时所用时间
96孔板位置 C浓度(EU/ML) LOG10(C) LOG10(T) T时间(s) 时间(min)
F1 0.03125 -1.505149978 3.474216264 2980 0:49:40
E1 0.0625 -1.204119983 3.36361198 2310 0:38:30
D1 0.1250 -0.903089987 3.278753601 1900 0:31:40
C1 0.2500 -0.602059991 3.190331698 1550 0:25:50
B1 0.5000 -0.301029996 3.086359831 1220 0:20:20
A1 1.0000 0 2.977723605 950 0:15:50
表5A2/B2/C2/D2对应的内毒素浓度及到达0.7时所用时间
根据样品作用时间以及标准曲线逆推样品内毒素浓度，再乘以稀释倍数，得到样品最终内毒素浓度，均在10EU/mL以下(4次结果分别为6.32、4.26、3.89、1.88EU/mL)，符合GMP药品规格的内毒素含量浓度标准，但平均值为实施例5经由Lipid Removal Agent抛光处理后的内毒素含量浓度的9倍左右，显著高于实施例5经由Lipid Removal Agent抛光处理后的内毒素含量浓度。因此对比例1与实施例5说明加入Lipid Removal Agent可以进一步除去内毒素，更适合工业上生产。
实施例6超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取，LipidRemoval Agent吸附后的宿主细胞蛋白残留检测
本实施例采用E.coli克隆菌碱裂HCP检测试剂盒(酶联免疫吸附法)检测实施例5的质粒样品中的宿主细胞(E.coli)蛋白残留
实验步骤：
1、将E.coli HCP-AC标准品、标准品复溶液、铝箔袋密封的E.coli HCP-AC预包被酶标板从试剂盒内取出，于室温平衡20min；
2、取出浓缩缓冲液(10×)，溶液如有结晶属于正常现象，于37℃温育直至完全溶解；
3、根据加样孔数，平衡后从铝箔袋中取出相应数量的预包被酶标版条，并将其余试剂在下步使用前20min取出于室温平衡；
4、根据E.coli HCP-AC标准品西林瓶标签上的含量标识，精确量取标准品复溶液500μL于西林瓶中，轻柔颠倒混匀，静置5min，复溶后的标准品HCP浓度即为标识浓度；
5、浓缩缓冲液(10×)用超纯水稀释10倍，例如取25mL浓缩缓冲液(10×)加入225mL超纯水混匀，即为1×缓冲液，用于稀释标准品、样品、生物素偶联E.coli HCP-AC抗体(20×)及链霉亲和素HRP复合物(100×)；
6、校准曲线配制：参照下表6对标准品进行梯度稀释：
表6标准品梯度稀释情况
/>
7、将待测供试品用1×稀释缓冲液稀释至标准曲线范围内，正常采用供试品原液、供试品2倍稀释液(供试品原液400μL+400μL 1×稀释缓冲液)和供试品4倍稀释液(供试品2倍稀释液400μL+400μL 1×稀释缓冲液)进行测定；
8、移取100μL标准品梯度稀释液、1×缓冲液(NCS)以及处理好的供试品溶液加入相应微孔板中，注意避免气泡，加好样后用封板膜密封微孔板，放置于微孔板恒温振荡器上，室温400rpm振荡孵育1h；
9、将生物素偶联E.coli HCP-AC抗体(20×)提前室温平衡20min，用1×缓冲液于离心管中将其稀释20倍待用；
10、待振荡孵育1h完成后，倒掉微孔板内的反应液，加入1×缓冲液洗板，340μL/孔，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干，重复以上操作2～3次；
11、取1×生物素偶联E.coli HCP-AC抗体溶液倒入加样槽中，用多通道移液器配合无菌吸头快速将抗体溶液100μL/孔加入上述微孔板孔底部，注意避免气泡，随后封板膜密封后，于室温避光反应45min；
12、用1×缓冲液将链霉亲和素HRP复合物(100×)稀释100倍，轻轻颠倒混匀，即为1×链霉亲和素HRP复合物溶液；
13、将上述微孔板用1×缓冲液洗板3次，于纸巾上拍干后，取1×链霉亲和素HRP复合物溶液倒入加样槽，用多通道移液器配合无菌吸头快速将溶液100μL/孔加入上述微孔板孔底部，避免气泡，随后封板膜密封后，于室温避光反应15min；
14、TMB显色液同样提前20min置于室温条件下平衡，将上述微孔板用1×缓冲液洗涤5次，于纸巾上拍干后，取合适体积的TMB显色液于加样槽中，用多通道移液器迅速将TMB显色液100μL/孔加入上述微孔板中，室温避光孵育15min，此步骤不需要用封板膜密封；
15、取合适体积的终止液于加样槽中，用多通道移液器迅速将终止液50μL/孔加入上述微孔板中，加入顺序需同显色液加入顺序一致，终止后的微孔板于室温放置5min；
16、设定酶标仪波长450nm和630nm，测定各孔OD值；各孔OD450nm数值需减去各自孔的OD630nm数值；各校准点和样品的OD值分别减去阴性对照的OD值后，将3个重复孔取均值，以校准点浓度值和OD值进行四参数拟合，获得校准曲线方程；将样品的平均OD值代入方程计算得到样品浓度，该浓度乘以系数倍数得到样品的实际浓度。
以上实验需满足的条件为：
1、标准曲线相关系数R2≥0.990
2、复孔之间OD值的CV值≤15％，换算浓度≤3ng/mL的OD值的CV值可不做要求。
实验结果：
校准曲线样品检测数值情况如图11所示，校准曲线如图12所示，所得校准曲线方程为：Y＝0.056+0.009X，R2＝0.993。待测样品检测数值如图13所示。由此可知，超螺旋质粒DNA样品稀释8倍后，所得平均值分别为2.862和2.567ng/mL，稀释倍数为8倍，因此原液超螺旋质粒DNA中宿主细胞(E.coli)蛋白残留值为22.900和20.538ng/mL，均＜150μg/mL，说明本申请的方法在去除内毒素的同时可有效且大幅度降低蛋白残留，符合GMP药品规格的标准。
实施例7超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取，LipidRemoval Agent吸附后的宿主细胞基因组残留检测
本实施例采用E.coli残留DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)检测实施例5的质粒样品中的宿主细胞(E.coli)基因组残留
实验方法：
供试品和标准品的稀释：
1、将试剂盒中的E.coli DNA稀释液置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，短时间快速离心10s；
2、用试剂盒中的DNA稀释液将供试品稀释至标准曲线范围内，如选择将供试品溶液进行100倍、1000倍、10000倍稀释后进行检测，稀释过程如下：
3、取4支洁净的1.5mL离心管，分别标记为10倍、100倍、1000倍、10000倍，每管加入90μL DNA稀释液；
4、用带滤芯的枪头取10μL供试品溶液加入含有90μL DNA稀释液的10倍管中，振荡混匀后短时间快速离心10s，此即为10倍稀释的供试品；
5、带滤芯的枪头取10μL 10倍稀释的供试品，加入含有90μL DNA稀释液的100倍管中，振荡混匀后短时间快速离心10s，此即为100倍稀释的供试品；
6、带滤芯的枪头取10μL 100倍稀释的供试品，加入含有90μL DNA稀释液的1000倍管中，振荡混匀后短时间快速离心10s，此即为1000倍稀释的供试品；
带滤芯的枪头取10μL 1000倍稀释的供试品，加入含有90μL DNA稀释液的10000倍管中，振荡混匀后短时间快速离心10s，此即为10000倍稀释的供试品；
7、检验过程中可选择供试品100倍、1000倍、10000倍稀释液进行测定，若选择的供试品稀释液测定值不在标准曲线范围内，则根据测定结果重新选择其它合适的稀释倍数进行测定；
8、将试剂盒中的E.coli DNA定量参考品置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，短时间快速离心10s；
9、用试剂盒中提供的DNA稀释液将DNA定量参考品原液(30ng/μL)依次进行10倍梯度稀释，稀释浓度依次为3ng/μL、300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL作为检测用标准品；
10、取6支灭过菌的1.5mL离心管，分别标记为ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，并且分别加入90μL DNA稀释液；
11、用带滤芯的枪头取10μL DNA定量参考品原液(30ng/μL)于含有90μL DNA稀释液的ST0管中，振荡混匀后短时间快速离心15s，接着更换枪头，从ST0管中吸取10μL加入ST1管中，重复以上操作直到ST5。
qPCR加样准备：
1、打开生物安全柜，打开紫外灯照射30min以上；
2、将qPCR需要的所有试剂、供试品以及标准品置于装满冰的冰盒内，并且之后的所有操作都在生物安全柜内于冰上进行；
3、向96孔板中每孔加入20μL E.coli qPCR MIX，并依次向每个孔内加入10μL 100倍、1000倍、10000倍稀释的待测供试品以及5个浓度梯度的E.coli DNA定量参考品，并在最后设置一组无模板空白对照孔(20μL E.coli qPCR MIX+10μL DNA稀释液)；
4、加样结束后，贴上封板膜，以上实验可以设置复孔；
qPCR上机检测
1、打开LightCycler 480qPCR仪，选择可追踪数据库，打开LightCycler 480SW软件；
2、将96孔板及其适配器一同放入qPCR仪，进行程序设定，具体参数如下表7所示：
表7qPCR程序设定具体参数
3、程序运行过程中选择检测类型“Abs Quant”，点击“Sample Editor”进行编辑，包括ST1、ST2、ST3、ST4、ST5及其浓度、无模板对照NTC及供试品；
4、程序运行完毕后，对结果进行分析并保存，导出TXT格式原始数据文件；
程序判定和结果计算
1、阈值循环数(Cycle threshold，Ct值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。在导入TXT格式原始数据后，将标准品孔对应的Ct值取平均数得到平均Ct值，以ST1，ST2，ST3，ST4，ST5浓度对数为横坐标，平均Ct值为纵坐标，绘制相应标准曲线；
2、将供试品孔对应的Ct值取平均数得到平均Ct值，将平均Ct值带入标准曲线中计算质粒DNA中宿主细胞(E.coli)DNA的残留；
3、将无模板对照NTC孔对应的Ct值也填入相应的记录中；
4、当无模板对照NTC中无扩增或者Ct值≥35、标准曲线相关系数R2≥0.98、标准曲线斜率介于-3.1～-3.8之间、E.coli DNA定量参考品Ct值以及供试品Ct值的的CV值同时满足≤15％才认为此次检测结果有效成立(CV值计算：CT值标准差与平均CT值的比值)；
5、如测得供试品的Ct值≥35或无Ct值显示，则判定供试品无宿主细胞(E.coli)DNA残留；
6、如不同稀释浓度的供试品测得的Ct值位于ST2～ST5(30pg/μL～30fg/μL)之间，则宿主细胞(E.coli)DNA残留测定结果取最低稀释度的样本稀释液的测定Ct值的平均值代入标准曲线方程，乘以稀释倍数，即为宿主细胞(E.coli)DNA残留；
7、若最低稀释倍数的样本稀释液超过标准范围，不同稀释度中，取最接近ST2(30pg/μL)的测定Ct值的平均值代入标准曲线方程，乘以稀释倍数，即为宿主细胞(E.coli)DNA残留。
实验结果：
标准品的处理数据如下表8所示，标准品处理数据所得标准曲线如图14所示。
表8标准品的处理数据
实施例5所得的质粒DNA样品的处理数据如下表9所示。
表9实施例5所得的质粒DNA样品的处理数据
由此可得，根据超螺旋质粒DNA质量内控放行标准，E.coli宿主细胞基因组残留≤150μg/mL即为符合要求，因此上述超螺旋质粒DNA样品中的E.coli宿主细胞基因组浓度7.61、7.88以及7.56μg/mL均符合GMP药品规格的标准，说明通过本申请的方法亦能高效去除宿主细胞的基因组残留，从而降低杂质的残留，提高质粒的纯度。
实施例8超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取，LipidRemoval Agent吸附后的宿主细胞RNA残留检测
本实施例采用QubitR RNA HS Assay Kit和QubitR 4.0荧光定量仪检测实施例5的质粒样品中的宿主细胞(E.coli)RNA残留
实验方法：
1、采用专门研制的荧光燃料与供试品的RNA特异性结合，发射荧光信号，对供试品质粒中RNA残留进行检测；
2、QubitR Working Solution配制：采用QubitR RNA HS Buffer对QubitR RNA HSReagent进行200倍稀释备用，例如取199μL QubitR RNA HS Buffer和1μL QubitR RNA HSReagent加入0.5mL PCR管中，室温混合均匀备用；
3、取190μL QubitR Working Solution加入0.5mL PCR管中，加入10μL QubitR RNAHS Standard#1(Component C)，混匀2～3秒，注意避免气泡，室温孵育2min；
4、取190μL QubitR Working Solution加入0.5mL PCR管中，加入10μL QubitR RNAHS Standard#2(Component D)，混匀2～3秒，注意避免气泡，室温孵育2min；
5、将供试品稀释100倍或以上再进行检测，例如将供试品稀释100倍和200倍：取90μL超纯水和10μL供试品原液，加入1.5mL EP管中混匀2～3s，此为供试品10倍稀释液；之后取90μL超纯水和10μL供试品10倍稀释液，加入1.5mL EP管中混匀2～3s，此为供试品100倍稀释液；取50μL超纯水和50μL供试品100倍稀释液，加入1.5mL EP管中混匀2～3s，此为供试品200倍稀释液；
6、取190μL QubitR Working Solution和10μL供试品100倍稀释液，加入到0.5mLPCR管中，混匀2～3s，注意避免气泡，室温孵育2min；
7、取190μL QubitR Working Solution和10μL供试品200倍稀释液，加入到0.5mLPCR管中，混匀2～3s，注意避免气泡，室温孵育2min；
8、打开QubitR 4.0荧光定量仪预热3min，打开样品检测盖，将准备好的Standard#1插入样品槽，点击主屏幕上的“RNA”，选择“RNA：High Sensitivity”，点击“ReadStandards”；Standard#2操作同上；
9、随后，将准备好的供试品插入样品槽，点击“Run Sample”；
10、屏幕界面选择样品体积：点击“+”或“-”，选择样品体积为10μL，体积范围为：1μL～20μL，在下拉菜单中选择浓度单位“ng/mL”；
11、如果供试品100倍稀释液、200倍稀释液两个样品的初始浓度在100～10000ng/mL范围内，则选择供试品最低稀释倍数的初始浓度值×稀释倍数作为RNA残留检测结果；如果供试品100倍稀释液、200倍稀释液两个样品的初始浓度均大于10000ng/mL，则继续稀释进行检测，直到初始浓度在100～10000ng/mL范围内，则该值对应的供试品初始浓度×稀释倍数作为RNA残留检测结果；如果供试品100倍稀释液、200倍稀释液两个样品的RNA仪器检测值均为“out of range”，则两个样品的初始浓度为小于检测限的值100ng/mL，则判定供试品原液RNA残留量低于“检测限×最低稀释倍数”作为RNA残留检测结果。
实验结果：
实施例5的质粒样品的检测数值情况如表10所示：
表10供试品检测数值情况
供试品稀释20倍之后的RNA残留浓度为：
(33.9+34.1+34.3+35.1+33.8+33.8)/6＝34.17ng/mL；
因此初始供试品中RNA残留浓度为：
34.17×20＝683.33ng/mL＝0.68333μg/mL；均＜100μg/mL，
说明本申请的方法在去除内毒素的同时也能高效的去除宿主细胞的RNA残留，符合GMP药品规格的标准。
实施例9超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取，LipidRemoval Agent吸附后的质粒纯度检测
根据GMP药品规格的标准，质粒纯度初步检测采用OD260nm/OD280nm以及OD260nm/OD230nm两个指标来进行要求，规定的参数范围是OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之间，OD260nm/OD230nm需要大于等于2.0；
DNA纯度判断根据：DNA纯度的判断根据OD260nm/OD280nm的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之间，低于此范围表明蛋白质含量或其他吸光度为280的化学杂质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA；OD230nm表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐(胍盐)或其他吸光度为230的化学杂质等，较纯净的DNA其OD260nm/OD230nm的比值大于2.0；
检测实施例5的质粒样品所得：OD260nm/OD280nm＝1.87；OD260nm/OD230nm＞2；其OD260nm/OD280nm值处于标准范围内，其OD260nm/OD230nm值处于标准范围内，说明本申请的方法得到的质粒具有良好的纯度更高，总杂质含量少，安全性高。
实施例10超螺旋质粒DNA粗提液经亲和层析，TritonTMX-114反复萃取，LipidRemoval Agent吸附后的TritonTMX-114残留检测，并与仅通过TritonTMX-114萃取的质粒DNA进行比较
基于实施例9中检测到的实施例5的质粒样品总杂质含量相对降低，进一步的，检测了实施例5中的质粒样品的TritonTMX-114残留。并与对比例1中的质粒样品的TritonTMX-114残留比较。
根据《中国药典》三部(2010版)所得到的方法，标准品的配置和标准曲线的绘制具体如下所示：
1、磷酸盐缓冲液(pH 7.2)：参照《中国药典》三部(2010版)配制；
2、苯酚工作液：取10mL液体苯酚，溶于190mL灭菌蒸馏水中，得到5％(v/v)苯酚工作液；
3、TritonTMX-114工作液：量取2mL TritonTMX-114，加入PBS(pH 7.2)，定容至100mL，充分溶解后即为2％的TritonTMX-114溶液；量取10mL 2％的TritonTMX-114溶液，加入PBS(pH 7.2)定容至100mL，充分溶解后即为0.2％(v/v)的TritonTMX-114工作液，4℃保存备用；
4、TritonTMX-114标准曲线的绘制：取0.2％(v/v)的TritonTMX-114工作液，10倍稀释后，取5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μL加至96孔板，用PBS(pH 7.2)定容至100μL，使得标准品浓度分别为0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％和0.01％(w/v)，取100μL PBS(pH 7.2)加至96孔板作为空白对照，然后像上述共11个孔中各加入50μL 5％的苯酚工作液，充分混匀后，室温静置15min，于340nm波长处测定不同浓度TritonTMX-114标准品的A340nm值，以A340nm值对TritonTMX-114标准品浓度进行线性回归，绘制标准曲线。
实验结果：标准品的A340nm如下表11所示，标准曲线如图15所示。
表11标准品的A340nm
其中：
0.001％标准品TritonTMX-114等价于10μg/mL TritonTMX-114；
0.002％标准品TritonTMX-114等价于20μg/mL TritonTMX-114；
0.003％标准品TritonTMX-114等价于30μg/mL TritonTMX-114；
0.004％标准品TritonTMX-114等价于40μg/mL TritonTMX-114；
0.005％标准品TritonTMX-114等价于50μg/mL TritonTMX-114；
0.006％标准品TritonTMX-114等价于60μg/mL TritonTMX-114；
0.007％标准品TritonTMX-114等价于70μg/mL TritonTMX-114；
0.008％标准品TritonTMX-114等价于80μg/mL TritonTMX-114；
0.009％标准品TritonTMX-114等价于90μg/mL TritonTMX-114；
0.01％标准品TritonTMX-114等价于100μg/mL TritonTMX-114。
将对比例1的质粒样品作为第1组待测样品；将实施例5的质粒样品作为第2组待测样品。
待测样品中残留TritonTMX-114浓度的测定：取待测样品100μL加至96孔板，取100μLPBS(pH 7.2)加至96孔板作为空白对照，然后像上述各孔中各加入50μL 5％的苯酚工作液，充分混匀后，室温静置15min，于340nm波长处测定待测样品的A340nm值，再由所得A340nm值，根据TritonTMX-114标准曲线求得待测样品中残留TritonTMX-114浓度。
实验结果：两组待测样品的检测情况如下表12和表13所示。
表12第1组待测样品检测情况
表13第2组待测样品检测情况
根据TritonTMX-114标准曲线并结合待测样品检测所得的A340nm值，推算出第1组待测样品的TritonTMX-114浓度为(0.170-0.1071)/0.0046×50＝683.6957μg/mL，不符合《中国药典》三部(2010版)规定的标准15.0μg/mL，因此经本实施例可知，质粒DNA化学杂质残留的超标的原因之一是制备过程中化学试剂的引入且难以去除；第2组待测样品的TritonTMX-114浓度为(0.143-0.1071)/0.0046＝7.8043μg/mL，低于《中国药典》三部(2010版)规定的标准15.0μg/mL，可得到符合标准的质粒DNA产品。
根据本申请的实施例9和实施例10，可知质粒DNA中超标的化学杂质的一个重要原因是由于质粒DNA去除内毒素的过程中试剂的引入且难以去除，而Lipid Removal Agent吸附能显著降低超螺旋质粒DNA中残留的TritonTMX-114，且含量低于《中国药典》三部(2010版)规定的标准15.0μg/mL，符合GMP药品规格的标准，本申请的方法制备的质粒DNA能够成为合格的质粒DNA产品用于实际的医药行业的应用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (11)

1.一种降低化学杂质的去除质粒DNA中细菌内毒素的方法，为依次使用非离子表面活性剂和Lipid Removal Agent对待处理样品进行处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂包括Triton；优选的，所述Triton包括TritonTMX-114或TritonTMX-100。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
S1：采用Triton工作液对待处理样品进行萃取，取水相获得初处理样品；
S2：将步骤S1得到的初处理样品采用Lipid Removal Agent抛光处理，得到去除细菌内毒素的质粒DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1)中，还包括以下一项或多项特征：
S11)所述萃取还包括将待处理样品和Triton工作液依次在冰浴和温浴中混匀；
S12)所述萃取的次数为2～5次。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤S2)中，还包括以下一项或多项特征：
S21)所述抛光处理为加入Lipid Removal Agent后孵育；
S22)步骤S2)后还包括通过离心和/或过滤除去Lipid Removal Agent。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下一项或多项特征：
a)所述Triton工作液中Triton的质量分数为10～40％；
b)所述Triton工作液的体积为处理样品体积的1～10％；
c)所述冰浴的时间为10～50min；
d)所述温浴的时间为10～50min，所述温浴的温度为42-100℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下一项或多项特征：
a)所述Lipid Removal Agent在初处理样品中的终浓度为10g/L～70g/L；
b)所述孵育的温度为室温；
c)所述孵育的时间为3～15min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待处理样品为质粒DNA溶液，优选的，所述质粒DNA溶液选自超螺旋质粒DNA溶液、线性质粒DNA溶液、开环质粒DNA溶液以及多聚体质粒DNA溶液；更优选的，所述质粒DNA溶液为超螺旋质粒DNA溶液；
和/或，所述质粒DNA溶液以发酵结束后的大肠杆菌为原料，依次通过重悬、裂解、澄清、凝胶排阻以及亲和层析获得。
9.权利要求1-8任一项所述的降低化学杂质的去除质粒DNA中细菌内毒素的方法在降低质粒DNA化学杂质残留中的应用。
10.一种降低质粒DNA化学杂质残留的方法，包括在制备质粒DNA溶液后，采用权利要求1-8任一项所述的方法对所述质粒DNA溶液进行处理。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述质粒DNA溶液以发酵结束后的大肠杆菌为原料，依次通过重悬、裂解、澄清、凝胶排阻以及亲和层析获得。
CN202410184829.5A 2024-02-19 2024-02-19 一种去除质粒dna中细菌内毒素的方法 Pending CN118064424A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410184829.5A CN118064424A (zh) 2024-02-19 2024-02-19 一种去除质粒dna中细菌内毒素的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410184829.5A CN118064424A (zh) 2024-02-19 2024-02-19 一种去除质粒dna中细菌内毒素的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118064424A true CN118064424A (zh) 2024-05-24

Family

ID=91101394

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410184829.5A Pending CN118064424A (zh) 2024-02-19 2024-02-19 一种去除质粒dna中细菌内毒素的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118064424A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5057426A (en) Method for separating long-chain nucleic acids
JP4334012B2 (ja) 核酸精製の方法および装置
JP7383162B2 (ja) 臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン－磁性担体カップリング複合体
JP2008263978A (ja) 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段
JP2000516091A (ja) アルカリプロテアーゼを用いる核酸の単離方法
CN110511902B (zh) 基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法
US11702648B2 (en) Process for concentrating cells from a sample and then isolating nucleic acids from said cells
JP2002543980A (ja) 混合床固相及び核酸の単離におけるその使用
US20110117628A1 (en) Method for concentrating and isolating biomolecules or viruses
JP2006311803A (ja) 核酸精製方法、及び核酸精製器具
CN110951669A (zh) 提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法
JP2002521029A (ja) 核酸の精製方法
KR20100001827A (ko) 핵산 추출 방법
EP1183514A1 (en) Sample processing device
CN102676503A (zh) 一种快速提取dna的方法
US8685742B2 (en) Apparatus and method for the more efficient isolation of nucleic acids
TWI314212B (en) Differential phage capture proteomics
CN111378646A (zh) 一种快速单反应管提取长片段基因组dna的方法和试剂盒
US9340828B2 (en) Purification of nucleic acid
JP2008220377A (ja) 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段
CN110088282A (zh) 用磁性颗粒分离高纯度核酸的方法
JP2008220377A6 (ja) 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段
CN110938624A (zh) 一种用于基因组dna提取的试剂盒及其应用
US10457931B2 (en) Purification of nucleic acid from a sample containing nucleic acid and endotoxin
CN118064424A (zh) 一种去除质粒dna中细菌内毒素的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination