CN114354913A - 一种外泌体pd-l1糖基化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外泌体PD‑L1糖基化检测方法，包括如下步骤：1)用PD‑L1适体即序列PDL1‑S‑T1，标记外泌体PD‑L1；2)通过修饰环炔基DBCO的DNA即序列DBCO‑S‑T2，与代谢标记的外泌体表面糖上叠氮的无铜环加成反应标记外泌体的糖；3)加入DNA连接臂，所述的连接臂分别具有和序列PDL1‑S‑T1的至少一段互补的序列以及和序列DBCO‑S‑T2的至少一段互补的序列；4)加入探针H1和H2，其中，所述的探针H1和探针H2互补，且其中一探针分别具有和序列PDL1‑S‑T1的至少一段互补的序列以及和序列DBCO‑S‑T2的至少一段互补的序列；5)扩增，检测扩增信号，得到外泌体PD‑L1糖基化信息。
Description
技术领域
本发明涉及一种外泌体PD-L1糖基化检测方法。
背景技术
外泌体上糖蛋白在跨膜信号传递、免疫抑制、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要的调节作用，外泌体特定蛋白的糖基化检测有助于理解其在生理病理过程中的作用。
目前外泌体蛋白糖基化的检测方法主要包括质谱(MS)、液相色谱(LC)和凝集素微阵列(LMA)等。但这些方法存在检测效率低，样品前处理过程复杂，无法研究完整外泌体等不足，因此难以实现生理状态下的外泌体蛋白糖基化水平灵敏分析。最近发展的代谢聚糖标记(MGL)策略通过在细胞培养基中加入非天然单糖和后续的化学偶联将功能性化学基团移植到细胞膜聚糖中，该方法保持细胞的完整性，不明显影响其生物学功能。然而MGL策略没有选择性，为了实现特定蛋白糖基化的选择性标记，需结合特定蛋白的识别手段，例如通过绿色荧光蛋白(GFP)或者靶标特异性适配体标记目标蛋白，结合MGL标记的特定功能化学基团，然后通过荧光共振能量转移(FRET)实现特定蛋白糖基化成像。然而FRET技术的检测灵敏度较低，不适用于低丰度的外泌体糖蛋白检测，及示踪糖基化的细微变化。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种外泌体PD-L1糖基化检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，包括如下步骤：
1)用PD-L1适体即序列PDL1-S-T1，标记外泌体PD-L1；
2)通过修饰环炔基DBCO的DNA即序列DBCO-S-T2，与代谢标记的外泌体表面糖上叠氮的无铜环加成反应标记外泌体的糖；
3)加入DNA连接臂，所述的连接臂分别具有和序列PDL1-S-T1的至少一段互补的序列以及和序列DBCO-S-T2的至少一段互补的序列；
4)加入探针H1和H2，其中，所述的探针H1和探针H2互补，且其中一探针分别具有和序列PDL1-S-T1的至少一段互补的序列以及和序列DBCO-S-T2的至少一段互补的序列；
5)扩增，检测扩增信号，得到外泌体PD-L1糖基化信息。
优选地，序列PDL1-S-T1上与探针H1或H2互补的序列，和序列PDL1-S-T1上与连接臂互补的序列不重叠；序列DBCO-S-T2上与探针H1或H2互补的序列，和序列DBCO-S-T2上与连接臂互补的序列不重叠。
优选地，步骤3)中，所述的连接臂长度优选为20个-80个碱基。
优选地，序列PDL1-S-T1上和连接臂互补的片段优选位于中间10-20个碱基。
优选地，序列DBCO-S-T2上和连接臂互补的片段优选位于中间10-20个碱基。
优选地，序列PDL1-S-T1上与探针H1或H2互补的序列位于序列PDL1-S-T1的末端10-20个碱基，序列DBCO-S-T2上与探针H1或H2互补的序列位于序列DBCO-S-T2的末端5-15个碱基。
优选地，探针H1分别具有和序列PDL1-S-T1的至少一段序列互补的第一序列、和序列DBCO-S-T2的至少一段序列互补的第二序列以及和H2的一段序列互补的第三序列；探针H2具有和探针H1第三序列互补的序列，以及和第一序列、第二序列互补的序列，
优选地，步骤5)所述的扩增为HCR扩增。
优选地，步骤5)的检测采用荧光检测。
优选地，所述的荧光检测为H1上带有Alexa Fluor 488或者FAM探针，序列T1或T2上无修饰基团。
本技术方案与背景技术相比，具有如下优点：
现有的糖基化检测方法包括质谱、色谱和凝集素阵列法需从外泌体中纯化糖蛋白，破坏了外泌体的完整性，很难实现生理状态下外泌体PD-L1糖基化的研究。而本发明方法采用糖代谢标记和特异性适配体识别的方法分别标记糖以及蛋白，通过HCR放大外泌体特定蛋白糖基化信号，该方法无需先分离释放糖蛋白，操作简单，保持了外泌体的生物学活性。同时HCR扩增提高了外泌体特定蛋白糖基化的检测灵敏度，并可表征外泌体特定蛋白糖基化水平的变化及其随后的生物学功能的变化，能够用于外泌体糖蛋白组学研究。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明的实验原理图。
图2为HCR在缓冲液体系中的组装，其中，A为琼脂糖凝胶图，B为荧光光谱图，C为荧光定量分析结果。
图3为PDL1-S-T1、DBCO-S-T2的识别性能表征。
图4为外泌体HCR扩增产物表征。
图5为流式细胞仪检测外泌体PD-L1糖基化。
图6为激光共聚焦原位成像外泌体PD-L1糖基化。
图7为外泌体PD-L1糖基化水平对与PD-1阳性细胞识别的影响
图8：(A)外泌体与PD-1阳性细胞的结合示意图；(B)流式验证外泌体HCR对PD-L1和PD-1相互作用的影响
图9：(A)CLSM成像HCR扩增/未HCR扩增的A375外泌体与Jurkat细胞(PD-1转染)的结合；(B)定量外泌体与PD-1阳性Jurket细胞的结合(n＝20)
具体实施方式
如图1所示，本发明的原理为：用PD-L1适体(PDL1-S-T1，GACCCTAAGCATACATCAGCCTAATCGCACTGACGCTAGGTTTTTTTTTTTTTTTTACAGGTTCTGGGGGGTGGGTGGGGAACCTGTT)标记外泌体PD-L1(exoPD-L1)，通过修饰环炔基DBCO的DNA(DBCO-S-T2，TTTTTTTTTTTTTTTCGACATCTAACCTGATTAGGCTGCGTC CTTCAT)与代谢标记的外泌体表面糖上叠氮的无铜环加成反应标记外泌体的糖。最后通过DNA连接臂(Connector)将PDL1-S-T1及DBCO-S-T2拉近，引入H1和H2发夹探针启动HCR组装对外泌体PD-L1的糖基化信号放大。
实施例1
外泌体的提取与分离。先用含Ac4ManNAz的培养基将A375(人黑色素瘤)细胞培养48-50h后收集培养基，使用差速离心法纯化糖代谢标记的外泌体。第一步，以3000g，20min离心去除细胞碎片，收集上清；第二步，以16500g，45min离心上一步收集的细胞培养上清，以除去大囊泡，再次收集上清；第三步：上清以100,000g，2h离心，用PBS收集底部沉淀；第四步：用PBS以100,000g，2h离心清洗上一步收集的沉淀，去除上清，用PBS收集底部外泌体。
验证DNA序列在缓冲液体系中的杂交链扩增反应(HCR)。将PDL1-S-T1(GACCCTAAGCATACATCAGCCTAATCGCACTGACGCTAGGTTTTTTTTTTTTTTTTACAGGTTCTGGGGGGTGGGTGGGGAACCTGTT)、DBCO-S-T2(TTTTTTTTTTTTTTTCGACATCTAACCTGATTAGGCTGCGTCCTTCAT)和Connector(CTTACAACACCTAGCGTCAGTGCGATCAGGTTAGATGTCG)以95℃加热5min变性后冷却至室温，H1(标记有FAM和荧光淬灭基团BHQ，ATGAAGGACGATGTATGCTTAGGGTCGACTTCCATAGACCCTAAGCATACAT)和H2(GACCCTAAGCATACATCGTCCTTCATATGTATGCTTAGGGTCTATGGAAGTC)以60℃加热10min变性后冷却至室温。接着将PDL1-S-T1、DBCO-S-T2、Connector、H1和H2以终浓度10μM溶解于dPBS(含12.5mM Mg(Ac)2)，冰上反应1.5h。使用琼脂糖胶和荧光光谱验证HCR反应在缓冲液体系中的可行性。琼脂糖凝胶结果表明，只有同时加入PDL1-S-T1、DBCO-S-T2、Connector、H1和H2的泳道产生HCR扩增产物(图2A)。荧光光谱使用488nm波长激发，检测L1-L6产物在500-600nm的荧光光谱，并以L4对照组作为背景扣除。荧光光谱结果表明，同时加入PDL1-S-T1、DBCO-S-T2、Connector、H1和H2的反应物的H1被猝灭的FAM的荧光信号恢复，其荧光信号的强度为背景信号的5.28倍(图2B，C)。上述结果证明HCR在缓冲液体系中组装成功(图2)。
验证PDL1-S-T1、DBCO-S-T2与代谢标记外泌体的结合情况。使用激光共聚焦显微镜，表征PD-L1适体延长链(PDL1-S-T1)、DBCO-DNA延长链(DBCO-S-T2)与代谢标记的A375(人黑色素瘤)外泌体的结合情况。将10μg外泌体和4μL乳胶醛珠于室温孵育1h，并用PBS缓冲液(含20％BSA牛血清白蛋白)封闭30min，封闭结束通过离心(6,000rpm,3min)去掉上清，并使用200μL PBS(含0.5％BSA)洗涤2次后重悬到50μL PBS(含0.5％BSA)，获得外泌体-乳胶醛珠复合物(exosome-beads)。exosome-beads与500nM DBCO-S-T2-Cy5在37℃下孵育30min，孵育完成后用200μL PBS(含0.5％BSA)洗涤3次，重悬到100μL BB(含5mM MgCl2，0.5％BSA)中再与500nM PDL1-S-T2-Cy3在室温下孵育30min，孵育完成后用200μL结合缓冲液BB(含5mM MgCl2，0.5％BSA)洗涤3次。对照组为外泌体-乳胶醛珠复合物分别与500nMDBCO-S-T2-Cy5或200nM PDL1-S-T1-Cy3孵育，通过激光扫描共聚焦显微镜CLSM(Leica,DMi8)拍摄Cy3，Cy5，FRET通道的图像。结果表明，只有同时加入两种序列的样品才能检测到FRET信号，因此，DBCO-S-T2-Cy5和PDL1-S-T1-Cy3可以同时结合到代谢标记的A375外泌体的同一PD-L1蛋白上(图3)。
验证外泌体表面HCR反应。
a.DLS验证外泌体HCR。代谢标记的A375外泌体与500nM DBCO-S-T2在37℃下孵育30min，再加入200nM PDL1-S-T1在室温下孵育30min，最后投入2.5μM Connector、100nM H1和100nM H2孵育1.5h，对照组为不加入H2，使用Zetasizer(Malvern Nano ZS,MalvernInstruments Ltd,England)进行对反应后外泌体的粒径和ζ电势分析。
b.TEM验证外泌体HCR。代谢标记的A375外泌体与500nM DBCO-S-T2在37℃下孵育30min，再加入200nM DBCO-S-T2在室温下孵育30min，最后投入2.5μM Connector、100nM H1和100nM H2室温孵育18h，产物取出10μL滴加在铜网上，然后用磷钨酸滴加在铜网上进行染色，干燥后通过JEM1400透射电子显微镜采集图片。
DLS粒径分析结果表明发生HCR后外泌体的粒径由约50nm增大至约250nm，而对照组未检测到明显的粒径增大(图4A)。同时HCR后，外泌体表面的ζ电势绝对值增大(图4B)，表明在外泌体的表面有DNA扩增产物生成。TEM结果显示，发生HCR后，外泌体的周围有一圈DNA产物生成(图4C)，这与文献报道的一致，进一步证明代谢标记的外泌体能够发生HCR扩增反应。
外泌体PD-L1蛋白糖基化信号检测
a.流式细胞仪考察外泌体的PD-L1蛋白糖基化水平。如上制备exosome-beads复合物，将5μL exosome-beads与500nM DBCO-S-T2，在37℃下孵育30min，再与500nM PDL1-S-T1在室温下孵育30min，接着加入2.5μM的Connector，100nM的H1-AF488和100nM的H2继续孵育1.5h，孵育完成后无需洗涤，对照组孵育条件一致(Control i：无PDL1-S-T1；Control ii：无DBCO-S-T2；Control iii：无PDL1-S-T1和DBCO-S-T2；Control iv：H2)，反应结束后使用流式细胞仪(BD FACS Verse)检测反应产物的荧光强度(记录104个events)。
b.激光共聚焦显微镜原位成像外泌体的PD-L1糖基化。样品处理方式与上述流式细胞仪检测方法一致。将孵育结束的exosome-beads用200μL BB(含5mM MgCl2，0.5％BSA)洗涤3次，重悬至20μL BB(含5mM MgCl2，0.5％BSA)后，使用激光共聚焦显微镜检测外泌体PD-L1蛋白糖基化。
c.外泌体PD-L1的糖基化水平对与PD-1阳性细胞识别的影响。用PNGase F(肽-N-糖苷酶F)调控外泌体PD-L1的糖基化水平，并通过外泌体PD-L1糖基化信号放大方法考察不同糖基化水平的外泌体PD-L1与PD-1阳性的Jurkat细胞的结合情况。先将15μg外泌体与5μLPNGaseF分别在37℃孵育1h和18h，孵育完成后将外泌体PD-L1糖基化进行HCR信号放大，接着将HCR标记后的外泌体与PD1阳性细胞Jurkat孵育，用PBS洗涤使用激光共聚焦显微镜对外泌体与细胞的结合进行成像。
流式细胞仪和激光共聚焦显微镜的结果表明，HCR组装后，外泌体的PD-L1糖基化信号得到了放大。激光共聚焦显微镜成像结果显示，与不加入H2的未HCR放大对照组相比，荧光信号增加了7.7倍(图5，6)。使用外泌体HCR可以成像不同外泌体PD-L1糖基化水平下外泌体与PD-1阳性细胞Jurkat的结合情况，随着PNGase F处理时间的延长，外泌体PD-L1糖基化水平降低，PD-1阳性Jurkat细胞表面的外泌体信号逐渐减弱(图7)。因此，该方法不仅能对外泌体特定蛋白糖基化的信号进行放大，还可原位观察外泌体特定糖基化水平的细微变化并指示其生物学功能的变化。
外泌体PD-L1与PD-1阳性Jurkat细胞的相互作用表征。
a.用流式细胞仪考察外泌体HCR对外泌体PD-L1与PD-1蛋白的影响。exosome-beads包被和HCR方法如前所述，完成HCR的exosome-beads与2μg/mL生物素化的PD-1蛋白室温孵育2h，洗涤后与SA-PE室温孵育30min，对照组为exosome-beads以及不HCR的exosome-beads(不加入H2)，处理方法一致，洗涤结束后通过流式细胞仪(FACSVerse)检测荧光强度(记录104个events)。
b.激光共聚焦显微镜考察外泌体与转染PD-1蛋白的Jurkat细胞的结合情况。25μg/mL的外泌体与500nM DBCO-S-T2，37℃下孵育30min，再与500nM PDL1-S-T1在室温下孵育30min，再加入2.5μM的Connector、100nM H1-AF488和100nM H2孵育1.5h，接着与Jurkat细胞(2×105)孵育2h，洗涤细胞三次后使用激光共聚焦显微镜考察外泌体与PD-1阳性Jurkat细胞的结合情况(对照组不加入H2)。
文献表明，外泌体PD-L1的糖基化是外泌体PD-L1/PD-1相互作用和抑制CD8+T细胞增殖的基础。因此，本方案HCR信号放大表征PD-L1与Jurkat细胞(PD-1转染)的结合。流式结果表明，HCR不会阻断外泌体PD-L1与PD-1阳性Jurkat的结合(图8)，因此该方法可用于表征外泌体PD-L1与Jurkat细胞的结合情况。共聚焦结果表明，HCR反应可灵敏地成像外泌体与PD-1阳性Jurkat细胞的结合(图9A)，与未HCR的对照组相比，HCR将外泌体与PD-1阳性Jurket细胞的结合信号放大4.8倍(图9B)。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种外泌体PD-L1糖基化检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaccctaagc atacatcagc ctaatcgcac tgacgctagg tttttttttt ttttttacag 60
gttctggggg gtgggtgggg aacctgtt 88
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttttttttt tttttcgaca tctaacctga ttaggctgcg tccttcat 48
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttacaacac ctagcgtcag tgcgatcagg ttagatgtcg 40
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaaggacg atgtatgctt agggtcgact tccatagacc ctaagcatac at 52
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaccctaagc atacatcgtc cttcatatgt atgcttaggg tctatggaag tc 52
Claims (10)
1.一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，包括如下步骤：
1)用PD-L1适体即序列PDL1-S-T1，标记外泌体PD-L1；
2)通过修饰环炔基DBCO的DNA即序列DBCO-S-T2，与代谢标记的外泌体表面糖上叠氮的无铜环加成反应标记外泌体的糖；
3)加入DNA连接臂，所述的连接臂分别具有和序列PDL1-S-T1的至少一段序列互补的序列以及和序列DBCO-S-T2的至少一段序列互补的序列；
4)加入探针H1和H2，其中，所述的探针H1和探针H2部分互补，且其中一探针分别具有和序列PDL1-S-T1的至少一段序列互补的序列以及和序列DBCO-S-T2的至少一段序列互补的序列；
5)扩增，检测扩增信号，得到外泌体PD-L1糖基化信息。
2.根据权利要求1所述的一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，其特征在于：序列PDL1-S-T1上与探针H1或H2互补的序列，和序列PDL1-S-T1上与连接臂互补的序列不重叠；序列DBCO-S-T2上与探针H1或H2互补的序列，和序列DBCO-S-T2上与连接臂互补的序列不重叠。
3.根据权利要求1所述的一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，其特征在于：步骤3)中，所述的连接臂长度为20个-80个碱基。
4.根据权利要求1所述的一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，其特征在于：序列PDL1-S-T1和连接臂互补的片段优选位于中间10-20个碱基。
5.根据权利要求1所述的一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，其特征在于：序列DBCO-S-T2和连接臂互补的片段优选位于中间10-20个碱基。
6.根据权利要求3所述的一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，其特征在于：序列PDL1-S-T1上与探针H1或H2互补的序列位于序列PDL1-S-T1的末端10-20个碱基,序列DBCO-S-T2上与探针H1或H2互补的序列位于序列DBCO-S-T2的末端5-15个碱基。
7.根据权利要求1所述的一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，其特征在于：步骤5)所述的扩增为HCR扩增。
8.根据权利要求1-7所述的一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，其特征在于：探针H1分别具有和序列PDL1-S-T1的至少一段序列互补的第一序列、和序列DBCO-S-T2的至少一段序列互补的第二序列以及和H2的一段序列互补的第三序列；探针H2具有和探针H1第三序列互补的序列，以及和第一序列、第二序列互补的序列。
9.根据权利要求1-7任一项所述的一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，其特征在于：步骤5)的检测采用荧光检测。
10.根据权利要求9所述的一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，其特征在于：所述的荧光检测为Alexa Fluor 488或者FAM探针，序列T1或T2上无修饰基团。
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