CN111394433A - 一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术 - Google Patents

一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术 Download PDF

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CN111394433A CN202010277171.4A CN202010277171A CN111394433A CN 111394433 A CN111394433 A CN 111394433A CN 202010277171 A CN202010277171 A CN 202010277171A CN 111394433 A CN111394433 A CN 111394433A
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李智洋
黄蓉蓉
何农跃
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Abstract

本发明公开了一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术，首先以细胞外囊泡表面蛋白为靶标设计适配体发卡，以及相应的挂锁探针、连接序列和第二引物，通过挂锁探针和连接序列杂交制备环状模板，适配体发卡与细胞外囊泡孵育后，发卡结构打开，从而与环状模板结合，在加入第二引物的情况下触发超分支滚环扩增，形成大量长度梯度的双链核酸，与核酸染料SYBR GreenⅠ结合能够产生强烈的荧光信号，而且荧光信号强弱与细胞外囊泡浓度呈正相关，从而可根据荧光强度定量检测出目标细胞外囊泡，游离的适配体发卡由于无法触发扩增，无需清洗。本发明提供的细胞外囊泡检测技术方法简单，特异性高，且细胞外囊泡免洗，灵敏度高。

Description

一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测 技术
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术。
背景技术
细胞外囊泡(Extracelluar Vesicles,EVs)是细胞释放的膜衍生囊泡，根据起源机制和大小主要分为外泌体(30-200nm)、微囊泡(200-1000nm)和凋亡小体(50-5000nm)3种亚群。细胞外囊泡携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，与包括肿瘤发生、侵袭和转移在内的多种疾病进程密切相关。以细胞外囊泡作为液体活检的靶标，具有非侵入性、含量丰富、稳定存在、实时检测、信息全面等优势。
滚环扩增是一种等温扩增技术，包括线性扩增和指数扩增(即超分支滚环扩增)，其中超分支滚环扩增效率更高，产物为长度梯度的双链核酸。超分支滚环扩增具有设备简单、灵敏度和特异性高、可以实现多重检测，以及反应温和，不会破坏生物分子结构和功能等优点，在生物传感器中有着广阔的应用前景。
目前报道的细胞外囊泡检测技术在简便性和样本处理上存在一定问题，例如，检测步骤需要反复清洗，导致EVs损失，检测灵敏度低、重复性差，无法满足临床检测的需求。
通过适配体发卡触发滚环扩增的方式，可以免除反复清洗去除多余适配体发卡的步骤，简化操作步骤，缩短检测时间，提高方法重复性，目前已被实验室用于miRNA的检测，但尚无用于细胞外囊泡检测的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术。
为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以目标细胞外囊泡表面蛋白为靶标设计适配体发卡以及相应的挂锁探针、连接序列和第二引物，其中，适配体发卡的3’端和5’端部分序列碱基互补，挂锁探针的3’端和5’端部分序列与连接序列碱基互补，第二引物与挂锁探针部分序列相同；
(2)挂锁探针和连接序列杂交制备环状模板：挂锁探针、连接序列、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA连接酶混合孵育；
(3)适配体发卡与细胞外囊泡混合孵育：将PBS缓冲液稀释后的细胞外囊泡与0.2μM 适配体发卡室温摇床孵育1h，转速为100rpm；
(4)适配体发卡触发超分支滚环扩增：步骤(3)混合孵育后的适配体发卡与细胞外囊泡混合液中加入环状模板、第二引物和相关扩增试剂，组成超分支滚环扩增体系，混合孵育一段时间后，终止反应，获得超分支滚环扩增产物；
(5)超分支滚环扩增产物的验证：分别利用凝胶电泳成像和酶标仪验证超分支滚环扩增产物，凝胶电泳检测有明亮条带且酶标仪检测具有较高荧光值的为目的细胞外囊泡。
进一步地，步骤(3)中，适配体发卡存在能够特异性识别目标细胞外囊泡表面蛋白的序列，在适配体发卡与细胞外囊泡孵育后，适配体发卡和目标细胞外囊泡表面蛋白序列结合，适配体发卡结构打开。
进一步地，步骤(4)中，向步骤(3)孵育后的细胞外囊泡和适配体发卡混合液中加入环状模板、第二引物、聚合酶缓冲液、聚合酶、dNTPs、SYBR GreenⅠ染料和超纯水，组成超分支滚环扩增体系，该扩增反应体系在37℃下反应2h后，65℃加热处理使聚合酶失活，以终止反应。
进一步地，步骤(4)中，适配体发卡结构打开后与环状模板结合，触发超分支滚环扩增，形成不同长度梯度的双链核酸，SYBR GreenⅠ嵌合双链结构后产生强烈的荧光信号，荧光信号强弱与细胞外囊泡浓度呈正相关，游离的适配体发卡由于无法触发超分支滚环扩增，无需清洗。
本发明还提供了细胞外囊泡检测技术在定量检测目标细胞外囊泡中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明利用适配体发卡与目标细胞外囊泡结合后发卡结构打开，在加入第二引物的情况下触发超分支滚环扩增，形成大量长度梯度的双链核酸，该双链核酸与核酸染料SYBR GreenⅠ结合能够产生强烈的荧光信号，荧光信号强弱与细胞外囊泡浓度呈正相关，从而可根据荧光强度定量检测出目标细胞外囊泡，操作简单，而游离的适配体发卡由于无法触发超分支滚环扩增，无需清洗，可避免检测过程中细胞外囊泡损失、提高检测灵敏度和方法重复性，满足临床检测的需求。
附图说明
图1是本发明基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术流程图；
图2是本发明实施例1的超分支滚环扩增产物凝胶电泳成像图，其中，M为DL10000DNA Marker的电泳条带，1为PBS缓冲液组的电泳条带，2为GES-1细胞外囊泡检测组的电泳条带，3为SGC-7901细胞外囊泡检测组的电泳条带；
图3是本发明实施例1的超分支滚环扩增产物荧光检测结果，其中，PBS为PBS缓冲液组的荧光检测结果，GES-1为GES-1细胞外囊泡检测组的荧光检测结果，SGC-7901为 SGC-7901细胞外囊泡检测组的荧光检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明提供了基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术，检测流程如图1所示，具体步骤如下：
(1)以目标细胞外囊泡表面蛋白为靶标设计适配体发卡以及相应的挂锁探针、连接序列和第二引物，其中，适配体发卡的3’端和5’端部分序列碱基互补，挂锁探针的3’端和5’端部分序列与连接序列碱基互补，第二引物与挂锁探针部分序列相同；
(2)挂锁探针和连接序列杂交制备环状模板：取0.6μL挂锁探针(100mM)与1.8μL连接序列(100mM)混合均匀，85℃下孵育5min，随后缓慢冷却至室温，在上述溶液中加入5μL10×T4 DNA连接酶缓冲液、3.5μL T4 DNA连接酶(30U/μL)和牛血清蛋白(BSA，0.1mg/mL)，最后加入超纯水补足50μL，涡旋震荡混匀，随后在16℃下孵育过夜；取20μL孵育后产物加入1μL核酸外切酶I(20U/μL)和0.25μL核酸外切酶Ⅲ(200U/μL)，37℃孵育1h，85℃加热10min使T4 DNA连接酶热失活以终止反应；
(3)适配体发卡与细胞外囊泡混合孵育：将PBS缓冲液稀释后的细胞外囊泡与0.2μM 适配体发卡室温摇床孵育1h，转速为100rpm；
(4)适配体发卡触发超分支滚环扩增：向步骤(3)孵育后的细胞外囊泡和适配体发卡混合液中加入环状模板、第二引物、聚合酶缓冲液、聚合酶、dNTPs、SYBR GreenⅠ染料和超纯水，组成超分支滚环扩增体系，该扩增反应体系在37℃下反应2h，最后65℃加热处理使聚合酶失活，以终止反应。
(5)超分支滚环扩增产物的验证：分别利用凝胶电泳成像和酶标仪验证超分支滚环扩增产物，凝胶电泳检测有明亮条带且酶标仪检测具有较高荧光值的为目的细胞外囊泡。
进一步地，步骤(3)中，适配体发卡存在能够特异性识别目标细胞外囊泡表面蛋白的序列，在适配体发卡与细胞外囊泡孵育后，适配体发卡和目标细胞外囊泡表面蛋白序列结合，适配体发卡结构打开并与环状模板结合，在加入第二引物的情况下触发超分支滚环扩增，形成大量不同长度梯度的双链核酸，SYBR GreenⅠ嵌合双链结构后产生强烈的荧光信号，荧光信号强弱与细胞外囊泡浓度呈正相关，游离的适配体发卡由于无法触发超分支滚环扩增，无需清洗。
本发明还提供了细胞外囊泡检测技术在定量检测目标细胞外囊泡中的应用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术检测人胃癌细胞外囊泡。
一、实验材料：人胃癌细胞株SGC-7901购自南京科佰生物科技有限公司，货号CBP60500，胃黏膜上皮细胞株GES-1购自南京科佰生物科技有限公司，货号CBP60512。
二、试验方案
具体检测步骤如下：
步骤1、设计适配体发卡，以及相应的挂锁探针、连接序列和第二引物：申请人此前报道了SGC-7901细胞株来源的细胞外囊泡表面过表达粘蛋白1，并鉴定了该蛋白对应的适配体 (Huang,Rongrong；He,Lei；Xia,Yanyan；Xu,Hongpan；Liu,Chang；Xie,Hui；Wang,Su；Peng, Lijun；Liu,Yufeng；Liu,Yuan；He,Nongyue*；Li,Zhiyang*；ASensitive AptasensorBased on a Hemin/G-Quadruplex-Assisted Signal Amplification Strategy forElectrochemical Detection of Gastric Cancer Exosomes,Small,2019,15(19):1900735)，在此适配体两端添加互补的碱基对，形成适配体发卡结构，以SGC-7901人胃癌细胞外囊泡表面粘蛋白1为靶标，设计适配体发卡，以及相应的挂锁探针、连接序列和第二引物，序列信息如下：
适配体发卡：5’-ATGTACTGCATGCACACCACTTCAACTATGCAGTACAT-3’(SEQ ID NO.1)，其中直线下划线部分为MUC1适配体序列；
挂锁探针：5’-ACTACGCGACTCtactagttctatcattctcata
Figure RE-GDA0002498089500000041
CTCGTTTGGTGGAC CTGAATCATGT-3’(SEQ ID NO.2)；
连接序列：5’-GTCGCGTAGTACATGATTCA-3’(SEQ ID NO.3)；
第二引物：5’-TACTAGTTCTATCATTCTCATA-3’(SEQ ID NO.4)；
其中，挂锁探针序列中波浪下划线部分与连接序列(SEQ ID NO.3)互补，挂锁探针序列中小写字母部分(tactagttctatcattctcata)与第二引物序列(SEQ ID NO.4)相同，挂锁探针序列中双直线下划线部分(TGTACTGCAT)与适配体发卡序列(SEQ ID NO.1)的5’端部分序列相同；
步骤2、环状模板的制备：挂锁探针和连接序列杂交制得环状模板，具体步骤如下：
2.1)取0.6μL挂锁探针(100mM)与1.8μL连接序列(100mM)混合，85℃下孵育5min，随后缓慢冷却至室温；
2.2)在上述溶液中加入5μL 10×T4 DNA连接酶缓冲液、3.5μL T4 DNA连接酶(30U/μL) (Thermo Fisher Scientific，T4 DNA Ligase HC，货号EL0013，含缓冲液)和牛血清白蛋白 (0.1mg/mL)(沪试，牛白蛋白，货号69003433)，最后加入超纯水补足50μL，涡旋震荡混匀，随后在16℃下孵育过夜；
2.3)取20μL过夜孵育后产物加入1μL核酸外切酶I(20U/μL)(生工生物工程(上海)股份有限公司，Exonuclease I，货号C610019)和0.25μL核酸外切酶Ⅲ(200U/μL)(NEB，核酸外切酶III(E.coli)，货号M0206S)，37℃孵育1h，85℃加热10min使酶热失活；
步骤3、适配体发卡与细胞外囊泡孵育：用PBS缓冲液稀释以1：1的体积比分别稀释人胃癌细胞株SGC-7901和胃黏膜上皮细胞株GES-1来源的细胞外囊泡(采用文献(Zhiyang,Li, Chaoyue,et al.Establishment and Evaluation of a Simple Size-SelectiveMethod for Exosome Enrichment and Purification.[J].Journal of BiomedicalNanotechnology,2019.)中所述粒径选择法从两种细胞株中提取出细胞外囊泡)，以获得SGC-7901细胞外囊泡重悬液和GES-1细胞外囊泡重悬液，然后SGC-7901细胞外囊泡重悬液和GES-1细胞外囊泡重悬液分别与0.2μM适配体发卡室温(25℃)摇床孵育1h，转速为100rpm；
步骤4、适配体发卡触发超分支滚环扩增：取1μL步骤3孵育后的溶液，加入1μL环状模板、1μL第二引物(2μL)、2μL 10×Phi 29DNA聚合酶缓冲液、1μL Phi 29DNA聚合酶(10U/μL) (Thermo Fisher Scientific，phi29 DNA Polymerase，货号EP0092)、1μL dNTP(含dATP、dGTP、dCTP、dDTP各10mM)(生工生物工程(上海)股份有限公司，dNTP Mixture，10mM溶液，货号B500056)，加入超纯水(来自MILLIPORE纯水仪)补足20μL，组成20μL的超分支滚环扩增体系，涡旋震荡混匀后置于37℃(水浴锅或恒温箱)反应2h，最后通过65℃加热使 Phi29DNA聚合酶失活以终止反应，获得超分支滚环扩增产物；
将超分支滚环扩增产物为PBS缓冲液组、GES-1细胞外囊泡检测组和SGC-7901细胞外囊泡检测组，其中，PBS缓冲液组为PBS缓冲液与适配体发卡孵育后的溶液(作为步骤3孵育后的溶液)经超分支滚环扩增后的产物，GES-1细胞外囊泡检测组为GES-1细胞外囊泡重悬液与适配体发卡孵育后的溶液(作为步骤3孵育后的溶液)经超分支滚环扩增后的产物，SGC-7901细胞外囊泡检测组为SGC-7901细胞外囊泡重悬液与适配体发卡孵育后的溶液(作为步骤3孵育后的溶液)经超分支滚环扩增后的产物；
步骤5、超分支滚环扩增产物验证：分别利用凝胶电泳成像和酶标仪对超分支滚环扩增产物进行验证，具体为：
5.1)凝胶电泳检测：配置浓度为1.5％的琼脂糖凝胶，用于滚环扩增产物电泳，保持电泳电压为120V，电流在40mA以上，电泳过程大约持续45min，电泳结束后用凝胶成像系统观察拍照；
如图2所示的凝胶电泳结果，其中M为DL10000bp的Marker电泳条带，1为PBS缓冲液组的电泳条带；2为GES-1细胞外囊泡检测组的电泳条带，3为SGC-7901细胞外囊泡检测组的电泳条带，与PBS缓冲液组(条带1)和GES-1细胞外囊泡检测组(条带2)相比，SGC-7901 细胞外囊泡检测组(条带3)的SGC-7901来源细胞外囊泡能结合适配体发卡，触发超分支滚环扩增，与核酸染料SYBR GreenⅠ结合产生强烈的荧光信号，且超分支滚环扩增产物长度大于10Kbp，PBS缓冲液组(条带1)和GES-1细胞外囊泡检测组的电泳条带(条带2)存在的极少量大片段扩增产物为非特异性扩增导致，属于背景值；
5.2)酶标仪检测：酶标板中每孔加入步骤4获得的超分支滚环扩增产物5μL，SYBRGreen Ⅰ终浓度1×(生工生物工程(上海)股份有限公司，核苷酸胶体染料，货号A502040)，超纯水补足150μL，室温(25℃)静置孵育5min后读取荧光值，酶标仪(Synergy HT，美国伯腾仪器有限公司)参数设置为激发波长485nm，发射波长530nm，实验全程避光，其中，适配体发卡与细胞外囊泡孵育后，发卡结构打开，在加入第二引物的情况下触发超分支滚环扩增，形成大量长度梯度的双链核酸，该双链核酸与核酸染料SYBR GreenⅠ结合能够产生强烈的荧光信号，而游离的适配体发卡由于无法触发扩增，无需清洗；
如图3所示的荧光检测结果，其中纵坐标为荧光值，横坐标为检测的组别，从图中可知， SGC-7901细胞外囊泡检测组(SGC-7901)的扩增产物荧光值远远高于PBS缓冲液组(PBS) 和GES-1细胞外囊泡检测组(GES-1)，这是由于胃癌细胞外囊泡与适配体发卡结合后能够有效触发超分支滚环扩增，故产生的荧光信号远高于非特异性扩增导致的背景信号。
本实施例所用适配体发卡是以SGC-7901人胃癌细胞外囊泡表面粘蛋白1为靶标设计的，故该适配体发卡能够特异性识别SGC-7901人胃癌细胞外囊泡表面粘蛋白1序列，两者结合后发卡结构打开，在加入第二引物的情况下，打开后的发卡结构与环状模板结合，触发超分支滚环扩增，形成不同长度梯度的双链核酸，SYBR GreenⅠ嵌合双链结构后产生强烈的荧光信号，信号强弱与细胞外囊泡浓度呈正相关，如图3所示的酶标仪检测结果可见，SGC-7901细胞外囊泡检测组的荧光值最高，表明该组细胞外囊泡来源于SGC-7901，与实际来源一致；
综合上述凝胶电泳检测结果和酶标仪检测结果可见，本发明提供的基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术可特异性检测出目的细胞外囊泡(凝胶电泳检测有明亮条带，且最长的条带大于10Kbp，酶标仪检测荧光值不低于10000)，而游离的适配体发卡由于无法触发超分支滚环扩增，无需清洗，可避免检测过程中细胞外囊泡损失、提高检测灵敏度，故本基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术可高效检测出目的细胞外囊泡，操作简单且灵敏度高，满足临床检测的需求。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京鼓楼医院
<120> 一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtactgca tgcacaccac ttcaactatg cagtacat 38
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actacgcgac tctactagtt ctatcattct catatgtact gcatctcgtt tggtggacct 60
gaatcatgt 69
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgcgtagt acatgattca 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tactagttct atcattctca ta 22

Claims (9)

1.一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以目标细胞外囊泡表面蛋白为靶标设计适配体发卡以及相应的挂锁探针、连接序列和第二引物；
(2)挂锁探针和连接序列杂交制备环状模板；
(3)适配体发卡与细胞外囊泡混合孵育；
(4)适配体发卡触发超分支滚环扩增：步骤(3)混合孵育后的适配体发卡与细胞外囊泡混合液中加入环状模板、第二引物和相关扩增试剂，组成超分支滚环扩增体系，混合孵育一段时间后，终止反应，获得超分支滚环扩增产物；
(5)验证超分支滚环扩增产物，以检测出目标细胞外囊泡。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡检测技术，其特征在于：步骤(1)中，适配体发卡的3’端和5’端部分序列碱基互补，挂锁探针的3’端和5’端部分序列与连接序列碱基互补，第二引物与挂锁探针部分序列相同。
3.根据权利要求2所述的细胞外囊泡检测技术，其特征在于：步骤(2)中，挂锁探针、连接序列、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA连接酶混合孵育，制备环状模板。
4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡检测技术，其特征在于：步骤(3)中，将PBS缓冲液稀释后的细胞外囊泡与0.2μM适配体发卡室温摇床孵育1h，转速为100rpm。
5.根据权利要求4所述的细胞外囊泡检测技术，其特征在于：步骤(3)中，适配体发卡存在能够特异性识别目标细胞外囊泡表面蛋白的序列，在适配体发卡与细胞外囊泡孵育后，适配体发卡和目标细胞外囊泡表面蛋白序列结合，适配体发卡结构打开。
6.根据权利要求5所述的细胞外囊泡检测技术，其特征在于：步骤(4)中，向步骤(3)孵育后的细胞外囊泡和适配体发卡混合液中加入环状模板、第二引物、聚合酶缓冲液、聚合酶、dNTPs、SYBR GreenⅠ染料和超纯水，组成超分支滚环扩增体系，该扩增反应体系在37℃下反应2h后，65℃加热处理使聚合酶失活，以终止反应。
7.根据权利要求6所述的细胞外囊泡检测技术，其特征在于：步骤(4)中，适配体发卡结构打开后与环状模板结合，触发超分支滚环扩增，形成不同长度梯度的双链核酸，SYBRGreenⅠ嵌合双链结构后产生强烈的荧光信号，荧光信号强弱与细胞外囊泡浓度呈正相关。
8.根据权利要求7所述的细胞外囊泡检测技术，其特征在于：步骤(5)中，分别利用凝胶电泳成像和酶标仪对超分支滚环扩增产物进行验证，凝胶电泳检测有明亮条带且酶标仪检测具有较高荧光值的为目的细胞外囊泡。
9.权利要求1-8任一项所述的细胞外囊泡检测技术在定量检测目标细胞外囊泡中的应用。
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