JP2023511271A - 核酸搭載細胞外小胞 - Google Patents

Abstract

核酸カーゴが搭載された赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）；搭載された小胞を調製するための方法；及びその小胞の治療的使用が開示される。核酸カーゴは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、及び線状または環状であり得る。【選択図】図４

Description

本出願は、２０２０年１月１３日に出願されたＵＳ６２／９６０，５６９及び２０２０年２月２６日に出願されたＵＳ６２／９８１，８８０の優先権を主張し、その内容及び要素は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、細胞外小胞及び特に、限定的ではないが、赤血球に由来する細胞外小胞に関する。

細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞間の生体分子の移行を媒介する細胞由来脂質膜結合小胞である。２つのクラスのＥＶ、すなわち、１）エンドソーム膜の内方に出芽し、最終的に細胞膜と融合し、エクソソームを細胞外空間に放出する多胞体における管腔内小胞を形成することから生成されるエクソソーム；及び２）細胞膜からの直接的出芽によって形成される微小胞が存在することが広く受け入れられている。典型的には、エクソソームは、直径が３０～１００ｎｍである一方で、微小胞は、１００ｎｍよりも大きい。

細胞膜を介して大きなマクロ分子を輸送するそれらの天然の能力により、ＥＶは、小分子、タンパク質及び核酸（アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のような短いＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のような長いＲＮＡ、またはさらに二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む）の輸送のための薬物送達ビヒクルとして提案されている。核酸のＥＶ媒介送達は、これらのマクロ分子が多様な疾患を処置する潜在性を有する有望な薬物候補であるために非常に模索されているが、それらが細胞膜を透過できないこと、免疫原性及び全身循環におけるヌクレアーゼに対する脆弱性を含むいくつかの理由により、薬物としての核酸の開発は妨げられている。いくつかの他のタイプの送達ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子及び陽イオン性ポリマーが核酸送達のために使用されているが、それらの適用は、肝臓毒性及び限られた肝外生体内分布のため、限られている。

ＥＶは、生体適合性であり、独自の指向性を有し、それらの細胞起源に応じて、それらは、毒性または免疫原性の恐れがほとんどないため、ＥＶにおける核酸の搭載は、これらの課題のほとんどを克服するであろう。ＥＶは、細胞源におけるペイロードのトランスフェクションまたは過剰発現とそれに続くこれらの細胞によって生成されるＥＶの精製を介して内因的に、または機械的手段（すなわち、エレクトロポレーション、超音波処理、凍結解凍、細胞押出）または化学的手段（すなわち、リポフェクションまたは塩化カルシウム処置）を使用する単離されたＥＶの直接搭載を介して外因的に搭載され得る。文献に基づけば、核酸を搭載するためのほとんどの試みは、短いＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びＡＳＯを伴い、これらのペイロードは、外因的手段、通常はエレクトロポレーションを介して搭載される。

細胞外小胞に１０００塩基対を超える核酸を搭載する試みは、課題に直面し、極めて不十分である（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１５ Ｏｃｔｏｂｅｒ ５；１２（１０）：３６５０－３６５７）。ペイロードのサイズは、精製されたＥＶの外因的搭載に対する通常の制限要因である（ＰＮＡＳ Ｍａｒｃｈ ２４，２０１５ １１２（１２）Ｅ１４３３－Ｅ１４４２）（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１５ Ｏｃｔｏｂｅｒ ５；１２（１０）：３６５０－３６５７）。また、小胞凝集、収率または機能の損失を引き起こすことなく、大きな核酸をＥＶに成功裏に搭載することは可能となっていない（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１５ Ｏｃｔｏｂｅｒ ５；１２（１０）：３６５０－３６５７）。結果として、典型的にはサイズが１０００塩基対を超えるＤＮＡ遺伝子発現ベクターは、ＥＶにとって課題のあるカーゴとみなされている。

Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（安全なｈｔｔｐサイトｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１９－０４８５－１で利用可能なＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）は、外因性核酸、特に大きなメッセンジャーＲＮＡを細胞分泌エクソソーム内に挿入することは、低い収率に繋がることを説明している。この問題に対処するために、彼らは、源細胞をプラスミドＤＮＡでトランスフェクションし、その後限局性及び一過性電気的刺激物で刺激して、転写されたｍＲＮＡ及び標的化ペプチドを有するエクソソームの放出を促進する細胞性ナノポレーション法を開発した。バルクエレクトロポレーション及び他のエクソソーム生成ストラテジーと比較して、彼らは、低い基礎レベルのエクソソーム分泌を有する細胞からであっても、最大で５０倍多いエクソソーム及びエクソソームのｍＲＮＡ転写産物の１０３倍超の増加を報告した。

ＷＯ２０１０／１１９２５６は、環状及び線状化ｐＥＧＦＰ－ＮＡＤを有するエクソソームのエレクトロポレーションを記載している。エレクトロポレーションは、環状ＤＮＡプラスミドをＤＮａｓｅ Ｉ分解から保護するが、線状ＤＮＡは保護しないようであった。それらは、一貫性のない結果及びしばしば分解からの保護の低いレベルを達成した。

低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ）のみが細胞外小胞に成功裏に搭載されたことに着目し、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ ｉｎｔｏ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｖｉａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｓ Ｓｉｚｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１５ Ｏｃｔｏｂｅｒ ５；１２（１０）：３６５０－３６５７）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞及びヒト間葉幹細胞に由来する細胞外小胞へのＤＮＡの搭載を検討した。彼らは、細胞外小胞における搭載効率及び容量がＤＮＡサイズに依存し、長さが１０００ｂｐ未満の線状ＤＮＡ分子は、より大きな線状ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡと比較して細胞外小胞により効率的に関連付けられることを決定し、特に「７５０～１０００ｂｐの範囲のサイズ制限カットオフ」に着目した。

Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９，２３５９（２０１８）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０４７９１－８）は、ＲＮＡの送達のための赤血球由来細胞外小胞の大規模な量を生成するためのストラテジーを記載している。

本発明は、上記考察の観点から考案された。

本発明者は、カーゴを細胞外小胞に搭載するための方法を開発した。特に、方法は、ＤＮＡなどの核酸カーゴを細胞外小胞、例えば、赤血球由来細胞外小胞またはエクソソームに搭載することを可能にする。得られる搭載された細胞外小胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで標的細胞にカーゴを送達するために、療法及び研究において有用である。

本開示の一態様では、カーゴが搭載された細胞外小胞またはそのような細胞外小胞の集団が提供される。カーゴは、好ましくは核酸である。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドであり得る。核酸は、最も好ましくはＤＮＡである。核酸は、環状であり、もしくは環状化され、または線状であり得る。核酸は、二本鎖または一本鎖、好ましくは二本鎖であり得る。いくつかの態様では、核酸は、環状化ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡミニサークル、プラスミドまたはナノプラスミド（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）である。

核酸カーゴが一本鎖である場合、それは、少なくとも２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００または３００００塩基のうちの１つの長さを有し得る。任意に、核酸カーゴが一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である場合、それは、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００または３００００塩基のうちの１つの最大長さを有し得る。好ましい実施形態では、一本鎖核酸カーゴは、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００塩基または１００００塩基超のうちの１つの最小長さを有し得る。

核酸カーゴが一本鎖である場合、それは、２５０～７５０、５００～１０００，１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、９０００～１００００、１００００～１１０００、２５０～１０００、１０００～３０００、１０００～４０００、１０００～５０００、１０００～６０００、１０００～７０００、１０００～８０００、１０００～９０００、１０００～１００００、１０００～１１０００、２０００～４０００、２０００～５０００、２０００～６０００、２０００～７０００、２０００～８０００、２０００～９０００、２０００～１００００、２０００～１１０００、３０００～５０００、３０００～６０００、３０００～７０００、３０００～８０００、３０００～９０００、３０００～１００００、３０００～１１０００、４０００～６０００、４０００～７０００、４０００～８０００、４０００～９０００、４０００～１００００、４０００～１１０００、５０００～７０００、５０００～８０００、５０００～９０００、５０００～１００００、５０００～１１０００、６０００～８０００、６０００～９０００、６０００～１００００、６０００～１１０００、７０００～９０００、７０００～１００００、または７０００～１１０００塩基のうちの１つの長さを有し得る。

いくつかの実施形態では、核酸カーゴが一本鎖である場合、それは、最大で２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、４００００、４１０００、４２０００、４３０００、４４０００、４５０００、４６０００、４７０００、４８０００、４９０００または５００００塩基のうちの１つの長さを有し得る。一本鎖核酸カーゴは、５０００～１００００、５０００～１５０００、５０００～２００００、５０００～２５０００、５０００～３００００、５０００～３５０００、５０００～４００００、１００００～１５０００、１００００～２００００、１００００～２５０００、１００００～３００００、１００００～３５０００、１００００～４００００、１５０００～２００００、１５０００～２５０００、１５０００～３００００、１５０００～３５０００、１５０００～４００００、２００００～２５０００、２００００～３００００、２００００～３５０００、２００００～４００００、２５０００～３００００、２５０００～３５０００、２５０００～４００００、３００００～３５０００、３００００～４００００、３５０００～４００００、３５０００～４５０００、３５０００～５００００、４００００～５００００または４００００～４５０００塩基のうちの１つの長さを有し得る。

核酸カーゴが二本鎖である場合、それは、少なくとも２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００または２００００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。任意に、核酸カーゴが二本鎖である場合、それは、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０，１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００または２００００塩基対のうちの１つの最大長さを有し得る。好ましい実施形態では、二本鎖核酸カーゴは、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００塩基対または１００００塩基対超のうちの１つの最小長さを有し得る。

核酸カーゴが二本鎖である場合、それは、２５０～７５０、５００～１０００，１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、９０００～１００００、１００００～１１０００、２５０～１０００、１０００～３０００、１０００～４０００、１０００～５０００、１０００～６０００、１０００～７０００、１０００～８０００、１０００～９０００、１０００～１００００、１０００～１１０００、２０００～４０００、２０００～５０００、２０００～６０００、２０００～７０００、２０００～８０００、２０００～９０００、２０００～１００００、２０００～１１０００、３０００～５０００、３０００～６０００、３０００～７０００、３０００～８０００、３０００～９０００、３０００～１００００、３０００～１１０００、４０００～６０００、４０００～７０００、４０００～８０００、４０００～９０００、４０００～１００００、４０００～１１０００、５０００～７０００、５０００～８０００、５０００～９０００、５０００～１００００、５０００～１１０００、６０００～８０００、６０００～９０００、６０００～１００００、６０００～１１０００、７０００～９０００、７０００～１００００、７０００～１１０００、８０００～１２０００、８０００～１３０００、８０００～１４０００、８０００～１５０００、９０００～１３０００、９０００～１４０００、９０００～１５０００、９０００～１６０００、９０００～１７０００、１００００～１４０００、１００００～１５０００、１００００～１６０００、１００００～１７０００または１００００～１８０００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。

いくつかの実施形態では、核酸カーゴが二本鎖である場合、それは、最大で２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、または４００００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。二本鎖核酸カーゴは、５０００～１００００、５０００～１５０００、５０００～２００００、５０００～２５０００、５０００～３００００、５０００～３５０００、５０００～４００００、１００００～１５０００、１００００～２００００、１００００～２５０００、１００００～３００００、１００００～３５０００、１００００～４００００、１５０００～２００００、１５０００～２５０００、１５０００～３００００、１５０００～３５０００、１５０００～４００００、２００００～２５０００、２００００～３００００、２００００～３５０００、２００００～４００００、２５０００～３００００、２５０００～３５０００、２５０００～４００００、３００００～３５０００、３００００～４００００、または３５０００～４００００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。

カーゴは好ましくは、細胞外小胞の内腔に搭載され得る（すなわち、内腔搭載）。いくつかの場合では、カーゴの一部は、細胞外小胞上（例えば、細胞外小胞の膜の外部表面上）に搭載される。細胞外小胞の膜の外部表面上に搭載されたカーゴ分子は、小胞をヌクレアーゼ、例え ば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅと接触させることによって除去され得る。

細胞外小胞は、微小胞またはエクソソームであり得る。細胞外小胞は、任意の好適な細胞に由来し得るが、赤血球（ＲＢＣ）に由来する細胞外小胞が特に好ましい。

本開示による細胞外小胞は、単離された形態で提供され得る。

本開示はさらに、核酸カーゴが搭載された細胞外小胞を含む組成物を提供する。そのような組成物において、細胞外小胞は、小胞当たり平均で少なくとも１．０、２．０、３．０、４．０またはそれ以上の核酸分子を含み得る。

本開示の別の態様では、ＤＮＡカーゴが搭載された赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）が提供される。

一実施形態では、ＲＢＣＥＶの内腔に少なくとも１つのＤＮＡカーゴを含有する単離された赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）が提供される。

ＤＮＡカーゴは、一本鎖または二本鎖であり得る。

ＤＮＡカーゴが一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である場合、それは、少なくとも２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００または３００００塩基のうちの１つの長さを有し得る。任意に、ＤＮＡカーゴが一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である場合、それは、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００または３００００塩基のうちの１つの最大長さを有し得る。好ましい実施形態では、一本鎖ＤＮＡカーゴは、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００塩基または１００００塩基超のうちの１つの最小長さを有し得る。

ＤＮＡカーゴが一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である場合、それは、２５０～７５０、５００～１０００，１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、９０００～１００００、１００００～１１０００、２５０～１０００、１０００～３０００、１０００～４０００、１０００～５０００、１０００～６０００、１０００～７０００、１０００～８０００、１０００～９０００、１０００～１００００、１０００～１１０００，２０００～４０００、２０００～５０００、２０００～６０００、２０００～７０００、２０００～８０００、２０００～９０００、２０００～１００００、２０００～１１０００、３０００～５０００、３０００～６０００、３０００～７０００、３０００～８０００、３０００～９０００、３０００～１００００、３０００～１１０００、４０００～６０００、４０００～７０００、４０００～８０００、４０００～９０００、４０００～１００００、４０００～１１０００、５０００～７０００、５０００～８０００、５０００～９０００、５０００～１００００、５０００～１１０００、６０００～８０００、６０００～９０００、６０００～１００００、６０００～１１０００、７０００～９０００、７０００～１００００、または７０００～１１０００塩基のうちの１つの長さを有し得る。

いくつかの実施形態では、核酸カーゴが一本鎖である場合、それは、最大で２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、４００００、４１０００、４２０００、４３０００、４４０００、４５０００、４６０００、４７０００、４８０００、４９０００または５００００塩基のうちの１つの長さを有し得る。一本鎖核酸カーゴは、５０００～１００００、５０００～１５０００、５０００～２００００、５０００～２５０００、５０００～３００００、５０００～３５０００、５０００～４００００、１００００～１５０００、１００００～２００００、１００００～２５０００、１００００～３００００、１００００～３５０００、１００００～４００００、１５０００～２００００、１５０００～２５０００、１５０００～３００００、１５０００～３５０００、１５０００～４００００、２００００～２５０００、２００００～３００００、２００００～３５０００、２００００～４００００、２５０００～３００００、２５０００～３５０００、２５０００～４００００、３００００～３５０００、３００００～４００００、３５０００～４００００、３５０００～４５０００、３５０００～５００００、４００００～５００００、または４００００～４５０００塩基のうちの１つの長さを有し得る。

ＤＮＡカーゴが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である場合、それは、少なくとも２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００または２００００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。任意に、ＤＮＡカーゴが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である場合、それは、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００または２００００塩基対のうちの１つの最大長さを有し得る。好ましい実施形態では、二本鎖ＤＮＡカーゴは、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００塩基対または１００００塩基対超のうちの１つの最小長さを有し得る。

ＤＮＡカーゴが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である場合、それは、２５０～７５０、５００～１０００，１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、９０００～１００００、１００００～１１０００、２５０～１０００、１０００～３０００、１０００～４０００、１０００～５０００、１０００～６０００、１０００～７０００、１０００～８０００、１０００～９０００、１０００～１００００、１０００～１１０００，２０００～４０００、２０００～５０００、２０００～６０００、２０００～７０００、２０００～８０００、２０００～９０００、２０００～１００００、２０００～１１０００、３０００～５０００、３０００～６０００、３０００～７０００、３０００～８０００、３０００～９０００、３０００～１００００、３０００～１１０００、４０００～６０００、４０００～７０００、４０００～８０００、４０００～９０００、４０００～１００００、４０００～１１０００、５０００～７０００、５０００～８０００、５０００～９０００、５０００～１００００、５０００～１１０００、６０００～８０００、６０００～９０００、６０００～１００００、６０００～１１０００、７０００～９０００、７０００～１００００、７０００～１１０００、８０００～１２０００、８０００～１３０００、８０００～１４０００、８０００～１５０００、９０００～１３０００、９０００～１４０００、９０００～１５０００、９０００～１６０００、９０００～１７０００、１００００～１４０００、１００００～１５０００、１００００～１６０００、１００００～１７０００または１００００～１８０００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。

いくつかの実施形態では、核酸カーゴが二本鎖である場合、それは、最大で２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、または４００００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。二本鎖核酸カーゴは、５０００～１００００、５０００～１５０００、５０００～２００００、５０００～２５０００、５０００～３００００、５０００～３５０００、５０００～４００００、１００００～１５０００、１００００～２００００、１００００～２５０００、１００００～３００００、１００００～３５０００、１００００～４００００、１５０００～２００００、１５０００～２５０００、１５０００～３００００、１５０００～３５０００、１５０００～４００００、２００００～２５０００、２００００～３００００、２００００～３５０００、２００００～４００００、２５０００～３００００、２５０００～３５０００、２５０００～４００００、３００００～３５０００、３００００～４００００、または３５０００～４００００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。

ＤＮＡカーゴは、タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターであり得る。

ＤＮＡカーゴは、環状（例えば、ミニサークルまたはプラスミド）または線状であり得る。ＤＮＡカーゴは、ＲＢＣＥＶの内腔にあり得る。ＲＢＣＥＶは好ましくは、ヒトまたは哺乳動物赤血球に由来し、またはそれから得られる。ＲＢＣＥＶは、単離され得る。

本開示の関連態様では、ＲＢＣＥＶの内腔に少なくとも１つの核酸（好ましくはＤＮＡ）カーゴ（本明細書に記載される）を含有する単離された赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）が提供される。

また、単離された赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）の集団であって、平均で、各ＲＢＣＥＶは、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９もしくは４．０またはそれ以上の核酸（好ましくはＤＮＡ）カーゴ（本明細書に記載されている）が搭載されている、集団が提供される。また、各ＲＢＣＥＶの内腔に、平均で、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９もしくは４．０またはそれ以上の核酸（好ましくはＤＮＡ）カーゴ（本明細書に記載されている）を含有する単離された赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）の集団が提供される。

本開示の関連する態様では、本明細書に記載される複数のＲＢＣＥＶまたはＲＢＣＥＶの集団を含む組成物が提供される。組成物において、平均で、各ＲＢＣＥＶは、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９もしくは４．０またはそれ以上のＤＮＡカーゴが搭載され得る。組成物において、平均で、各ＲＢＣＥＶは、１．０～４．０のＤＮＡカーゴ、または０．１～１．０、０．５～１．０、０．５～１．５、０．５～２．０、０．５～２．５、０．５～３．０、０．５～３．５、０．５～４．０、１．０～１．５、１．０～２．０、１．０～２．５、１．０～３．０、１．０～３．５、１．０～４．０、１．５～２．０、１．５～２．５、１．５～３．０、１．５～３．５、１．５～４．０、２．０～２．５、２．０～３．０、２．０～３．５、２．０～４．０、２．５～３．０、２．５～３．５、２．５～４．０、３．０～３．５、３．０～４．０、もしくは３．５～４．０またはそれ以上のカーゴのうちの１つが搭載され得る。平均は、ミーン平均（ｍｅａｎ ａｖｅｒａｇｅ）であり得る。

組成物は、薬学的組成物または薬品であり得、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤または安定化剤をさらに含み得る。

本明細書に記載の細胞外小胞は、標的細胞に核酸を送達してその標的細胞において遺伝子の発現を引き起こすための療法、特に遺伝子療法において有用であり得る。

本開示の別の態様では、処置を必要とする対象を処置する方法であって、方法は、治療的有効量の本明細書に記載される細胞外小胞、好ましくはＲＢＣＥＶ、または本明細書に記載される複数の細胞外小胞、好ましくはＲＢＣＥＶを含む組成物を対象に投与し、それにより対象を処置することを含む、方法が提供される。

本開示の別の態様では、対象における疾患を処置する方法において使用するための、本明細書に記載される細胞外小胞、好ましくはＲＢＣＥＶ、または複数の細胞外小胞、好ましくはＲＢＣＥＶを含む組成物が提供される。

本開示の別の態様では、対象における疾患を処置する方法において使用するための薬学的組成物または薬品の製造における、本明細書に記載される１つまたは複数の細胞外小胞、好ましくは本明細書に記載される１つまたは複数のＲＢＣＥＶの使用が提供される。

対象は、処置を必要とする対象であり得る。対象を処置する方法は、ＤＮＡカーゴの遺伝子配列からのタンパク質またはペプチドの発現による対象における疾患の処置を伴い得る。処置は、疾患の予防及び／または改善を含み得る。

本開示の別の態様では、細胞外小胞に核酸カーゴを搭載するための方法、及びそのような方法を使用して搭載された（または調製されたまたは得られた）細胞外小胞が提供される。

方法は、化学的トランスフェクション法である。そのような方法は、核酸をトランスフェクション試薬と接触させること、任意に核酸／トランスフェクション試薬複合体の形成を可能にすること；細胞外小胞に核酸が搭載されるのに十分な条件下で核酸及びトランスフェクション試薬を細胞外小胞と共にインキュベートすること；及び任意に搭載された細胞外小胞を洗浄することを伴い得る。所定の方法では、核酸及びトランスフェクション試薬は、細胞外小胞と共に複数回インキュベートされる（すなわち、核酸及びトランスフェクション試薬を細胞外小胞と共にインキュベートする工程は、少なくとも１回繰り返される）。

好ましい方法では、トランスフェクション試薬は、線状ポリエチレンイミン塩酸塩（例えば、ＭＷ２５０００ＤａまたはＭＷ４０，０００Ｄａのもの）である。

本明細書に記載の所定の方法は、細胞外小胞の内腔内に含まれない核酸カーゴを除去する工程を含む。細胞外小胞の内腔に含まれていない核酸カーゴを除去することは、搭載された細胞外小胞をヌクレアーゼ、例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅと接触させることを含み得る。搭載された細胞外小胞は、ヌクレアーゼとの接触の前にヘパリンと接触させられ得る。

本明細書に記載の細胞外小胞を搭載するための方法では、核酸カーゴは、本明細書に記載される核酸分子を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、搭載される細胞外小胞は、赤血球細胞外小胞である。他の実施形態では、細胞外小胞は、エクソソームである。

したがって、本開示の一態様では、細胞外小胞に核酸カーゴを搭載するための方法であって、方法は、
ａ．細胞外小胞に搭載される核酸を提供すること；
ｂ．細胞外小胞に核酸が搭載されるのに十分な条件下で、任意に好適な時間、トランスフェクション試薬の存在下で核酸を細胞外小胞と接触せることまたはインキュベートすること；及び
ｃ．任意に搭載された細胞外小胞を洗浄すること
を含む、方法が提供される。

好ましい実施形態では、細胞外小胞は、赤血球細胞外小胞、または赤血球細胞外小胞の集団である。

方法は、工程ｂを１、２、３回またはそれ以上繰り返すことを含み得る。工程ｂは、細胞外小胞に搭載するためにより多くの核酸を提供することによって工程ｃの前または後に繰り返され得る。発明者は、トランスフェクション試薬の存在下で核酸を細胞外小胞と接触させるまたはインキュベートする搭載工程が、細胞外小胞に搭載される核酸の量を改善することを見出した。

本開示の別の態様では、細胞外小胞に核酸カーゴを搭載するための方法であって、方法は、
ａ．細胞外小胞に搭載される核酸を提供すること；
ｂ．核酸をトランスフェクション試薬と接触させて、核酸／トランスフェクション試薬複合体の形成を可能とすること；及び
ｃ．細胞外小胞に核酸／トランスフェクション試薬複合体が搭載されるのに十分な条件下で、任意に好適な時間、核酸／トランスフェクション試薬複合体を細胞外小胞とインキュベートすることまたは接触させること；及び
ｄ．任意に搭載された細胞外小胞を洗浄すること
を含む、方法が提供される。

好ましい実施形態では、細胞外小胞は、赤血球細胞外小胞、または赤血球細胞外小胞の集団である。

方法は、工程ｂ～ｄを１、２、３またはそれ以上のサイクル繰り返すことを含み得る。これは、細胞外小胞に搭載するためにより多くの核酸を提供することを伴い得る。発明者は、トランスフェクション試薬の存在下で核酸を細胞外小胞と接触させるまたはインキュベートする搭載工程が、細胞外小胞に搭載される核酸の量を改善することを見出した。

本開示の関連する態様では、細胞外小胞に核酸カーゴを搭載するための方法であって、方法は、
ａ．細胞外小胞に搭載される核酸を提供すること；
ｂ．核酸をトランスフェクション試薬と接触させて、核酸／トランスフェクション試薬複合体の形成を可能とすること；及び
ｃ．細胞外小胞に核酸／トランスフェクション試薬複合体が搭載されるのに十分な条件下で、任意に好適な時間、核酸／トランスフェクション試薬複合体を細胞外小胞とインキュベートすることまたは接触させること；
ｄ．任意に搭載された細胞外小胞を洗浄すること；
ｅ．搭載された細胞外小胞をさらなる核酸／トランスフェクション試薬複合体と接触させること；及び
ｆ．さらなる核酸／トランスフェクション試薬複合体を搭載された細胞外小胞とインキュベートすることまたは接触させること
を含む、方法が提供される。

方法は、次の工程、例えば、工程ｅに進行する前に、工程ｂ～ｄを少なくとも１回繰り返すことを含み得る。

好ましい実施形態では、細胞外小胞は、赤血球細胞外小胞、または赤血球細胞外小胞の集団である。

上記方法のいずれかにおいて、トランスフェクション試薬は、線状ポリエチレンイミン塩酸塩（任意にＭＷ２５，０００ＤａまたはＭＷ４０，０００Ｄａのもの）であり得る。

方法は、細胞外小胞の内腔内に含まれない核酸カーゴを除去する工程をさらに含み得る。これは、搭載された細胞外小胞をヌクレアーゼ、例えば、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅと接触させることを含み得る。搭載された細胞外小胞は、ヌクレアーゼとの接触の前にヘパリンと接触させられ得る。

核酸カーゴは、核酸分子を含み得、各核酸分子は、一本鎖であり、少なくとも２５０塩基、または少なくとも２０００塩基、または２０００～１１０００塩基、またはそれ以上の長さを有する。

核酸カーゴは、核酸分子を含み得、各核酸分子は、二本鎖であり、少なくとも２５０塩基対、または少なくとも２０００塩基対、または２０００～１１０００塩基対、またはそれ以上の長さを有する。

核酸カーゴは、環状、例えば、ミニサークルまたはプラスミドであり得る。核酸カーゴは、線状であり得る。核酸カーゴは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。

細胞外小胞は、微小胞またはエクソソームであり得る。

本開示による方法によって調製されるまたは得られる、核酸カーゴが搭載された細胞外小胞も提供される。

本発明は、記載される態様及び好ましい特徴の組み合わせを含む（そのような組み合わせが明らかに許容できないまたは明示的に回避される場合を除く）。

これより本発明の原理を説明する実施形態及び実験を、添付の図面を参照して論述する。

エレクトロポレーションされたＲＢＣＥＶによる２９３Ｔ細胞内へのｍＲＮＡ対ＤＮＡの送達。非搭載ＲＢＣＥＶ、ＧＦＰ ｍＲＮＡと混合されたＲＢＣＥＶ（ＲＢＣＥＶ＋ｍＲＮＡ）、及びエレクトロポレーションによって搭載されたＧＦＰ ｍＲＮＡを有するＲＢＣＥＶ（ｍＲＮＡ－ｅＲＢＣＥＶ）を２９３Ｔ細胞に添加した。４８時間後、細胞を顕微鏡法によって画像化し、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーを使用して定量した。 エレクトロポレーションされたＲＢＣＥＶによる２９３Ｔ細胞内へのｍＲＮＡ対ＤＮＡの送達。非搭載ＲＢＣＥＶ、ＧＦＰミニサークルと混合されたＲＢＣＥＶ（ＲＢＣＥＶ＋ＭＣ）、及びエレクトロポレーションによって搭載されたＧＦＰミニサークルを有するＲＢＣＥＶ（ＭＣ－ｅＲＢＣＥＶ）を２９３Ｔ細胞に添加した。４８時間後、細胞を顕微鏡法によって画像化し、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーを使用して定量した。 化学的にトランスフェクションされたＲＢＣＥＶによる２９３Ｔ細胞内へのｍＲＮＡ対ＤＮＡの送達。ＲＢＣＥＶに、ＧＦＰをコードするミニサークルＤＮＡ（ＭＣ）またはｍＲＮＡを化学的に搭載し、２９３Ｔ細胞に処置した。４８時間後、細胞を顕微鏡法によって画像化し、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーを使用して定量した。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージが散布図に示されている。 ＲＢＣＥＶとＭＳＣ－ｅｘｏとの間のＤＮＡミニサークル送達の比較。ＲＢＣＥＶまたはＭＳＣ－ｅｘｏを、ＧＦＰをコードするミニサークルＤＮＡに化学的にトランスフェクションし、その後、２９３Ｔ細胞に処置した（ＭＣ－ＲＢＣＥＶ及びＭＣ－ＭＳＣ－ｅｘｏ）。ＥＶの非存在下でミニサークルＤＮＡを対照（ＭＣ対照）として使用した。４８時間後、細胞を顕微鏡法によって画像化し、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーを使用して定量した。 ＲＢＣＥＶとＭＳＣ－ｅｘｏとの間のＤＮＡミニサークル送達の比較。各群におけるＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ。ｎ＝３、＊ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ－検定） ＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶの注射後のマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現の評価。６週齢の雌のＮＳＧマウスに、非搭載ＲＢＣＥＶ（ｎ＝３）またはルシフェラーゼをコードするＭＣが搭載されたＲＢＣＥＶ（ｎ＝３）を尾静脈注射を介して０日目に投与した。ｘ軸によって示される時点で、ルシフェリン基質の注射後の全身生物発光画像化によってルシフェラーゼ活性を経時的に評価した。示された時点におけるマウスの代表的な腹側及び背側画像が右に示されている。 ２つの異なる最適化パラメータの比較。非搭載ＲＢＣＥＶをＧＦＰミニサークル及びトランスフェクション試薬と３０分間または１２０分間、１回または２回混合した。次いで５μｇ、１０μｇ、２０μｇまたは５０μｇのＲＢＣＥＶを２９３Ｔ細胞に添加した。４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーを使用して定量した。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージが散布図に示されている。 搭載されたＲＢＣＥＶにおけるＤＮＡの位置の評価。未処置のＤＮＡ搭載ＲＢＣＥＶを２０，０００ｘｇで遠心分離した。上清画分及びＴｒｉｔｏｎ－Ｘ溶解ペレット画分の電気泳動をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで実行し、ＤＮＡがペレット画分中に単離されたことを示しており、ＲＢＣＥＶにＤＮＡが搭載されたことを示している。ＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶをヘパリンで事前処置して、ＤＮＡをＰＥＩ－Ｍａｘから解離した場合、ＤＮＡは、上清及びペレット画分の両方で単離され、ＲＢＣＥＶの外部及び内腔の両方の搭載を示している。さらなるヘパリンでの溶解したペレット画分の処置は、内在化したＤＮＡが、ＰＥＩ－Ｍａｘと複合して存在していたことを示していた。 ＲＢＣＥＶのＤＮＡカーゴ制限を評価すること。増加するサイズのコンストラクト（レーン１－２．ｋｂ；２－６．６ｋｂ、３－９．６ｋｂ、４－１１．４ｋｂ；５－３４．２ｋｂ）を、単一の独自の切断部位の制限消化を介して線状化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。これらのコンストラクトはそれぞれ、ＣＭＶプロモーターによって誘導されるｃｏｐＧＦＰ導入遺伝子の単一のコピーを含有する。 ＲＢＣＥＶのＤＮＡカーゴ制限を評価すること。ＲＢＣＥＶにこれらのコンストラクトの各々を搭載し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加した。４８時間後、蛍光顕微鏡法を使用して導入遺伝子発現を検出した。 ＲＢＣＥＶのＤＮＡカーゴ制限を評価すること。導入遺伝子を発現する細胞をまた、フローサイトメトリーによって分析した。各ＤＮＡカーゴについての代表的なドットプロットが、ゲーティングされた領域で示されているＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージと共に示されている。平均蛍光強度が棒グラフにプロットされている（ｎ＝３）。 ＲＢＣＥＶに搭載されたＤＮＡの血清安定性。むき出しのＭＣ（ミニサークル）、トランスフェクション試薬と複合体化されたＭＣ、及びＲＢＣＥＶに搭載されたＭＣをマウス血清（Ｍ１～Ｍ４）またはＰＢＳ（Ｐ１～Ｐ４）で処置した。血清単独をバックグラウンド対照（Ｍ０）として使用した。ＤＮＡ質量－強度標準曲線に基づいてゲル密度測定によって回収されたＤＮＡのパーセンテージを定量した（Ｓ１～Ｓ５）。 ＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶの注射後のマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現の評価。０日目に６週齢の雌ＮＳＧマウスに非搭載ＲＢＣＥＶ（ｎ＝３）またはルシフェラーゼをコードするＭＣが搭載されたＲＢＣＥＶ（ｎ＝３）を尾静脈注射を介して投与した。線グラフは、ｘ軸によって示された時点での、ルシフェリン基質の注射後の全身生物発光画像化によって経時的に追跡されたルシフェラーゼ活性を示している。示された時点でのマウスの代表的な腹側及び背側画像が左に示されている。 ＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶの注射後のマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現の評価。最大で３４ｋｂのサイズのＤＮＡプラスミドのｉｎ ｖｉｖｏ送達。６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、非搭載ＲＢＣＥＶ（ｎ＝２）またはルシフェラーゼをコードする２ｋｂ、８ｋｂ及び３４ｋｂのＤＮＡカーゴが搭載されたＲＢＣＥＶ（ｎ＝２）を尾静脈注射を介して０日目に投与した。ルシフェリン基質の注射後の全身生物発光画像化によって４８時間後にルシフェラーゼ活性を評価した。マウスの全身発光画像が左に示されている。異なるサイズのＤＮＡカーゴで処置されたマウスの平均生物発光光子フラックスが右に示されている。

これより本発明の態様及び実施形態を、添付の図面を参照して論述する。さらなる態様及び実施形態は、当業者に明らかになる。この文書で挙げられるすべての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

細胞外小胞
用語「細胞外小胞」（ＥＶ）は、本明細書で使用される場合、細胞から細胞外環境に放出される小さな小胞様構造を指す。本明細書に開示される特に好ましい態様では、細胞外小胞は、赤血球に由来する（ＲＢＣＥＶ）。

細胞外小胞（ＥＶ）は、直径が５０～１０００ｎｍの間の細胞膜またはエンドソーム膜の実質的に球状の断片である。細胞外小胞は、病理学的条件及び生理的条件の両方の下で様々な細胞タイプから放出される。細胞外小胞は、膜を有する。膜は、二重層膜（すなわち、脂質二重層）であり得る。膜は、細胞膜を起源とし得る。したがって、細胞外小胞の膜は、その由来となる細胞と類似する組成を有し得る。本明細書に開示されるいくつかの態様では、細胞外小胞は、実質的に透明である。

細胞外小胞という用語は、エクソソーム、微小胞、膜マイクロパーティクル、エクトソーム、ブレブ及びアポトーシス小体を包含する。細胞外小胞は、外方への出芽及び分裂を介して生成され得る。生成は、天然プロセス、または化学的に誘導もしくは増強されたプロセスであり得る。本明細書に開示されるいくつかの態様では、細胞外小胞は、化学的誘導を介して生成される微小胞である。

細胞外小胞は、それらのサイズ及び形成の起源に基づいて、エクソソーム、微小胞またはアポトーシス小体として分類され得る。微小胞は、本明細書に開示される本発明による細胞外小胞の特に好ましいクラスである。好ましくは、本発明の細胞外小胞は、細胞膜からシェディングされたものであり、エンドソームシステムを起源としない。本明細書に記載の所定の態様では、細胞外小胞は、エクソソームではない。本明細書に記載の好ましい態様では、細胞外小胞は、細胞膜の外方への出芽及び分裂を介する赤血球の細胞膜に由来する赤血球由来細胞外小胞である。

本開示のいくつかの態様及び実施形態では、細胞外小胞は、エクソソームではない。本開示のいくつかの態様及び実施形態では、細胞外小胞は、エクトソームではない。本開示のいくつかの態様及び実施形態では、細胞外小胞は、ブレブではない。本開示のいくつかの態様及び実施形態では、細胞外小胞は、アポトーシス小体ではない。

本開示のいくつかの態様及び実施形態では、細胞外小胞は、微小胞または膜マイクロパーティクルである。

本明細書に開示される細胞外小胞は、様々な細胞、例えば、赤血球、白血球、がん細胞、幹細胞、樹状細胞、マクロファージなどに由来し得る。好ましい実施形態では、細胞外小胞は、赤血球に由来するが、白血病細胞及び細胞株などの任意の源からの細胞外小胞が使用され得る。本明細書に記載の好ましい態様では、細胞外小胞は、赤血球に由来する。

微小胞またはマイクロパーティクルは、細胞膜の直接的な外方への出芽及び分裂を介して生じる。微小胞は、典型的には、エクソソームよりも大きく、１００～５００ｎｍの範囲の直径を有する。いくつかの場合では、微小胞の組成物は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、または１００～２００ｎｍの範囲の直径を有する微小胞を含む。好ましくは、直径は、１００～３００ｎｍである。

微小胞の集団は、例えば、組成物、薬学的組成物、薬品または調製物に存在する場合、様々な異なる直径を有する微小胞を含み、微小胞サンプル内の微小胞のメジアン直径は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの範囲であり得る。好ましくは、メジアン直径は、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの範囲のうちの１つにある。ミーン平均直径は、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ（任意に±１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｎｍ）のうちの１つであり得る。

エクソソームの直径は、約３０～約１００ｎｍの範囲である。いくつかの場合では、エクソソームの集団は、組成物に存在し得る場合、１０～２００ｎｍ、１０～１５０ｎｍ、１０～１２０ｎｍ、１０～１００ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２５～１１０ｎｍ、２５～１００ｎｍ、または３０～１００ｎｍの範囲の直径を有するエクソソームを含む。好ましくは、直径は、３０～１００ｎｍである。エクソソームの集団は、例えば、組成物、薬学的組成物、薬品または調製物に存在する場合、様々な異なる直径を有するエクソソームを含み、サンプル内のエクソソームのメジアン直径は、１０～２００ｎｍ、１０～１５０ｎｍ、１０～１２０ｎｍ、１０～１００ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２５～１１０ｎｍ、２５～１００ｎｍ、または３０～１００ｎｍの範囲であり得る。好ましくは、メジアン直径は、３０～１００ｎｍの間である。ミーン平均直径は、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または１２０ｎｍ（任意に±１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｎｍ）のうちの１つであり得る。

細胞外小胞の集団は、（任意に担体１ｍｌ当たり）少なくとも１０、１００、１０００、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３または１０^１４個の細胞外小胞のうちの１つを含み得る。

エクソソームは、リンパ球、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、肥満細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、及び腸上皮細胞を含む多様な培養細胞において観察される。エクソソームは、細胞質における大きな嚢である多胞体内に位置するエンドソームネットワークを起源とする。これらの嚢は、細胞膜と融合してから、細胞外環境に放出される。

アポトーシス小体またはブレブは、最も大きな細胞外小胞であり、１～５μｍの範囲である。アポトーシスを受ける有核細胞は、核クロマチンの凝縮から始まり、膜ブレブ形成及びアポトーシス小体を含むＥＶの最終的な放出のいくつかの段階を経る。

好ましくは、細胞外小胞は、ヒト細胞、またはヒト起源の細胞に由来する。本発明の細胞外小胞は、小胞誘導剤と接触した細胞から誘導されたものであり得る。小胞誘導剤は、カルシウムイオノフォア、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、またはホルボール－１２－ミリスタット－１３－アセテート（ＰＭＡ）であり得る。好ましくは、小胞誘導剤は、カルシウムイオノフォアである。

本明細書に記載の多くの態様では、細胞は、改変されない。特に、細胞外小胞の由来となる細胞は、外因性核酸またはタンパク質を含まない。いくつかの場合では、細胞は、採血から得られるようなｅｘ ｖｉｖｏである。いくつかの場合では、細胞は、改変されておらず、例えば、形質導入、トランスフェクション、感染またはそうでなければ改変されていないが、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞と比較して実質的に未変化である。細胞が赤血球である場合、細胞は、ＤＮＡを含有しない場合があり、またはＤＮＡを実質的に含有しない場合がある。赤血球は、ＤＮＡを含まない場合がある。したがって、好ましい実施形態では、細胞外小胞は、細胞外小胞が形成され、単離された後に、それらの核酸カーゴが搭載される。好ましくは、細胞外小胞は、それらの由来となる細胞に存在した核酸、特にＤＮＡを含有しない。例えば、細胞外小胞は、ゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡを含有しないことが好ましい。

赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）
本明細書に開示される所定の態様では、細胞外小胞は、赤血球に由来する。赤血球は、多数の理由からＥＶの良好な源である。赤血球は除核されているので、ＲＢＣＥＶは、他の源からのＥＶよりも少ない核歳を含有する。ＲＢＣＥＶは、内因性ＤＮＡを含有しない。ＲＢＣＥＶは、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡを含有し得る。ＲＢＣＥＶは、発がん性ＤＮＡまたはＤＮＡ変異などの発がん性物質を含まない。赤血球は、細胞小器官（エンドソームを含む）を欠くので、ＲＢＣＥＶは、エンドソームに由来することができず、よって、エクソソームではない。代わりに、ＲＢＣＥＶは、赤血球の細胞膜の外方への出芽に由来する。このように、ＲＢＣＥＶの膜は、赤血球のものと極めて類似する組成を有し、例えば、赤血球の膜の研究で見られる曲げ係数と類似する約１５ｋ_ＢＴ、例えば、１４～１６ｋ_ＢＴ、１３～１７ｋ_ＢＴ、１２～１８ｋ_ＢＴの曲げ係数を有する。曲げ係数は、Ｄａａｎ Ｖｏｒｓｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９：４９６０に示されているように、小胞剛性、半径及びテザー力を使用して評価され得る。

ＲＢＣＥＶの単離及び特性化のための方法は、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９，２３５９（２０１８）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０４７９１－８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

ＲＢＣＥＶは、ヘモグロビン及び／またはストマチン及び／またはフロチリン－２を含み得る。それらは、色が赤であり得る。典型的には、ＲＢＣＥＶは、透過型電子顕微鏡下でドーム状（凹形）表面、または「カップ形状」を示す。ＲＢＣＥＶは、細胞表面ＣＤ２３５ａを有することを特徴とし得る。ＲＢＣＥＶは、ヘモグロビンαまたはストマチンなどの赤血球マーカーを含み得る。

本発明によるＲＢＣＥＶは、直径が約１００ｎｍ～約３００ｎｍであり得る。いくつかの場合では、ＲＢＣＥＶの組成物は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍまたは１００～１５０ｎｍの範囲の直径を有するＲＢＣＥＶを含む。好ましくは、直径は、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍである。

ＲＢＣＥＶの集団は、例えば、組成物に存在し得る場合、様々な異なる直径を有するＲＢＣＥＶを含み、ＲＢＣＥＶサンプル内のＲＢＣＥＶのメジアン直径は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍまたは１００～１５０ｎｍの範囲であり得る。好ましくは、メジアン直径は、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの間である。ミーン平均直径は、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ（任意に±１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｎｍ）のうちの１つであり得る。

好ましくは、ＲＢＣＥＶは、ヒトもしくは動物血液サンプルまたは初代細胞もしくは固定化赤血球株に由来する赤血球に由来する。血液細胞は、処置される患者に適合したタイプであり得、よって、血液細胞は、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型、Ｏ型またはＯｈ血液型であり得る。好ましくは血液は、Ｏ型である。血液は、アカゲザル陽性またはアカゲザル陰性であり得る。いくつかの場合では、血液は、Ｏ型及び／またはアカゲザル陰性、例えば、Ｏ－型である。血液は、疾患または障害がないこと、例えば、ＨＩＶ、鎌状赤血球貧血、マラリアがないことが決定されている場合がある。しかしながら、任意の血液タイプが使用され得る。いくつかの場合では、ＲＢＣＥＶは、自己のものであり、処置される患者から得られた血液サンプルに由来する。いくつかの場合では、ＲＢＣＥＶは、同種異系であり、処置される患者から得られた血液サンプルに由来しない。

ＲＢＣＥＶは、赤血球のサンプルから単離され得る。赤血球からＥＶを得るためのプロトコルは、当該技術分野、例えば、Ｄａｎｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ｊａｎ ３０；１２３（５）：６８７－６９６で知られている。ＥＶを得るのに有用な方法は、赤血球を含むサンプルを提供するまたは得る工程、細胞外小胞を生成するように赤血球を誘導する工程、及び細胞外小胞を単離する工程を含み得る。サンプルは、全血サンプルであり得る。好ましくは、赤血球以外の細胞は、サンプルの細胞成分が赤血球となるようにサンプルから除去されている。

サンプルにおける赤血球は、濃縮され、または白血球などの全血サンプルの他の成分から分画され得る。赤血球は、遠心分離によって濃縮され得る。サンプルは、白血球減少に供され得る。

赤血球を含むサンプルは、実質的に赤血球のみを含み得る。細胞外小胞は、赤血球を小胞誘導剤と接触させることによって赤血球から誘導され得る。小胞誘導剤は、カルシウムイオノフォア、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、またはホルボール－１２－ミリスタット－１３－アセテート（ＰＭＡ）であり得る。

ＲＢＣＥＶは、遠心分離（超遠心分離を伴うまたは伴わない）、沈殿、濾過プロセス、例えば、タンジェンシャルフロー濾過、またはサイズ排除クロマトグラフィー（例えば、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照されたい）によって単離され得る。このように、ＲＢＣＥＶは、混合物のＲＢＣ及び他の成分から分離され得る。

細胞外小胞は、赤血球のサンプルを得ること；赤血球を小胞誘導剤と接触させること；及び誘導された細胞外小胞を単離することを含む方法によって赤血球から得られ得る。

赤血球は、低速度遠心分離によって及び白血球枯渇フィルターを使用して白血球及び血漿を含有する全血サンプルから分離され得る。いくつかの場合では、赤血球サンプルは、白血球などの他の細胞タイプを含有しない。すなわち、赤血球サンプルは、実質的に赤血球からなる。赤血球は、小胞誘導剤と接触させる前に、ＰＢＳなどの緩衝液に希釈され得る。小胞誘導剤は、カルシウムイオノフォア、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、またはホルボール－１２－ミリスタット－１３－アセテート（ＰＭＡ）であり得る。小胞誘導剤は、約１０ｎＭのカルシウムイオノフォアであり得る。赤血球は、小胞誘導剤と一晩、または少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２時間もしくは１２時間超接触させられ得る。混合物は、ＲＢＣ、細胞デブリ、または他の非ＲＢＣＥＶ物質を除去するための低速度遠心分離、及び／または上清を約０．４５μｍシリンジフィルターに通過させることに供され得る。ＲＢＣＥＶは、約１００，０００ｘｇでの遠心分離などの超遠心分離によって濃縮され得る。ＲＢＣＥＶは、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５０分または少なくとも１時間の超遠心分離によって濃縮され得る。濃縮されたＲＢＣＥＶは、冷ＰＢＳに懸濁され得る。それらは、６０％スクロースクッション上に重ねられ得る。スクロースクッションは、凍結された６０％スクロースを含み得る。スクロースクッション上に重ねられたＲＢＣＥＶは、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間またはそれ以上、１００，０００ｇで超遠心分離に供され得る。好ましくは、スクロースクッション上に重ねられたＲＢＣＥＶは、約１６時間１００，０００ｇで超遠心分離に供され得る。次いでスクロースクッション上の赤色層を回収し、それによりＲＢＣＥＶを得る。得られたＲＢＣＥＶは、さらなる処理、例えば、洗浄、タグ付け、及び任意に搭載に供され得る。

表面タグ付け
組成物内の細胞外小胞は、好ましくは小胞膜に結合された、または小胞膜を介して挿入された、タグを含み得る。

細胞外小胞は、それらの表面に、タグを有し得る。タグは、好ましくはタンパク質またはペプチド配列である。タグは、ペプチドまたはタンパク質であり得る。それは、改変されたペプチドまたはタンパク質、例えば、グリコシル化またはビオチン化タンパク質またはペプチドであり得る。タグは、細胞外小胞に共有結合され得、例えば、細胞外小胞における膜タンパク質に共有結合され得る。タグは、細胞外小胞が形成した後に細胞外小胞に付加されている場合がある。タグは、タンパク質リガーゼ認識配列である、またはそれに由来する配列を含む、またはそれからなる配列によって細胞外小胞に連結され得る。例えば、タグは、タンパク質リガーゼ認識配列と１００％の配列同一性、またはタンパク質リガーゼ認識配列と約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％もしくは約４０％の配列同一性を含む配列によって細胞外小胞に連結され得る。アミノ酸配列は、ＬＰＸＴを含み得る。

タグは、小胞の外部表面上に提示され、よって、小胞外環境に曝露され得る。

タグは、外因性分子であり得る。すなわち、タグは、天然では小胞の外部表面上に存在しない分子である。いくつかの場合では、タグは、細胞外小胞の由来となる細胞または赤血球に存在しない外因性分子である。

タグは、細胞外小胞の循環における安定性、取り込み効率及び利用可能性を向上させ得る。

いくつかの場合では、タグは、身体における循環及び器官において細胞外小胞及びカーゴを含有する細胞外小胞を提示するように作用する。ペプチド及びタンパク質は、標的細胞機能の阻害／活性化またはワクチン接種のための抗原の提示など、治療用分子として作用し得る。それらはまた、毒素の診断などのバイオマーカー検出のためのプローブとして作用し得る。

タグは、機能性ドメイン及びタンパク質リガーゼ認識配列を含有し得る。機能性ドメインは、標的部位に結合することが可能であり、検出が可能であり、または治療効果を誘導することが可能であり得る。機能性ドメインは、標的分子に結合することが可能であり得る。そのような機能性ドメインを含むタグは、本明細書で結合分子と称され得る。結合分子は、標的分子と特異的に相互作用することが可能なものである。結合部位を含む細胞外小胞は、標的分子を有する細胞にカーゴまたは治療剤を送達するのに特に有用であり得る。好適な結合分子には、抗体及び抗原結合断片（時に抗体断片として知られている）、リガンド分子及び受容体分子が含まれる。結合分子は、対象となる標的に結合する。標的は、対象となる細胞に関連する、例えば、その表面上に発現した分子であり得る。リガンドは、受容体分子などの標的細胞上の生体分子と複合体を形成し得る。

好適な結合分子には、抗体及び抗原結合断片が含まれる。Ｆａｂ及びＦａｂ２断片などの断片は、遺伝子操作された抗体及び抗体断片として使用され得る。抗体の可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）ドメインは抗原認識に関与し、初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された事実である。さらなる確認は、げっ歯類抗体の「ヒト化」によって見出された。げっ歯類起源の可変ドメインは、得られる抗体がげっ歯類親抗体の抗原特異性を保持するようにヒト起源の定常ドメインに融合され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８１，６８５１－６８５５）。本明細書に開示される細胞外小胞において有用な抗体または抗原結合断片は、標的分子を認識し、及び／またはそれに結合する。

その抗原特異性は、可変ドメインによって付与され、定常ドメインとは無関係であり、抗体断片（すべてが１つ以上の可変ドメインを含有する）の細菌発現を伴う実験から既知である。これらの分子には、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０４１）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０３８）；ＶＨ及びＶＬパートナードメインがフレキシブルオリゴペプチドを介して連結されている一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８５，５８７９）及び単離されたＶドメインを含むシングルドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４）が含まれる。それらの特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関与する技術の一般的説明は、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９，２９３－ ２９９に記載されている。本明細書において有用な抗体及び断片は、ヒトもしくはヒト化、ネズミ、ラクダ、キメラであり、または任意の他の好適な源からのものであり得る。

「ＳｃＦｖ分子」は、ＶＨ及びＶＬパートナードメインが、例えば、直接的に、ペプチドによってまたはフレキシブルオリゴペプチドによって共有結合した分子を意味する。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ及びｓｄＡｂ抗体断片はすべて、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現及び分泌され得るため、前記断片の容易な大量生成が可能になる。

完全抗体、及びＦ（ａｂ’）２断片は、「二価」である。「二価」は、前記抗体及びＦ（ａｂ’）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ及びｓｄＡｂ断片は、一価であり、１つのみの抗原結合部位を有する。一価抗体断片は、それらの小さなサイズにより、タグとして特に有用である。

好ましい結合分子は、ｓｄＡｂであり得る。「ｓｄＡｂ」は、１つ、２つまたはそれ以上の単一の単量体可変抗体ドメインからなるシングルドメインを意味する。ｓｄＡｂ分子は、時にｄＡｂと称される。

いくつかの場合では、結合分子は、一本鎖抗体、またはｓｃＡｂである。ｓｃＡｂは、共有結合したＶＨ及びＶＬパートナードメイン（例えば、直接的に、ペプチドによって、またはフレキシブルオリゴペプチドによって）及び任意に軽鎖定常ドメインからなる。

他の好適な結合分子には、標的分子に対する親和性を有するリガンド及び受容体が含まれる。タグは、細胞表面受容体のリガンドであり得る。例には、ストレプトアビジン及びビオチン、アビジン及びビオチン、または他の受容体のリガンド、例えば、フィブロネクチン及びインテグリンが含まれる。ビオチンの小さなサイズは、結合分子の生物学的活性に対してほとんどまたは全く影響をもたらさない。ビオチン及びストレプトアビジン、ビオチン及びアビジン、ならびにフィブロネクチン及びインテグリンは、高い親和性及び特異性でそれらの対と結合するので、それらは、結合分子として極めて有用である。アビジン－ビオチン複合体は、タンパク質とリガンドとの間の最も強い既知の非共有結合性相互作用（Ｋｄ＝１０～１５Ｍ）である。結合形成は迅速であり、一度形成すると、極端なｐＨ、温度、有機溶媒及び他の変性因子によって影響を受けない。ストレプトアビジンに対するビオチンの結合もまた強く、形成が迅速であり、バイオテクノロジー用途において有用である。

機能性ドメインは、治療剤を含み、またはそれからなり得る。治療剤は、酵素であり得る。それは、アポトーシス誘導剤または阻害剤であり得る。

機能性ドメインは、抗原または抗体認識配列を含み得る。タグは、１つ以上の抗原ペプチドに由来する１つ以上の短いペプチドを含み得る。ペプチドは、抗原ペプチドの断片であり得る。好適な抗原ペプチドは、当業者に知られている。

機能性ドメインは、検出可能な部位を含み、またはそれからなり得る。検出可能な部位には、蛍光標識、比色分析標識、フォトクロミック化合物、磁性粒子または他の化学的標識が含まれる。検出可能な部位は、ビオチンまたはＨｉｓタグであり得る。

タグは、スペーサーまたはリンカー部位を含み得る。スペーサーまたはリンカーは、タグとタンパク質リガーゼ認識配列との間に配置され得る。スペーサーまたはリンカーは、タグのＮまたはＣ末端に連結され得る。スペーサーまたはリンカーは、タグによる標的結合活性などのタグの機能と干渉または阻害しないように配置され得る。スペーサーまたはリンカーは、ペプチド配列であり得る。いくつかの場合では、スペーサーまたはリンカーは、一連の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１１アミノ酸、少なくとも１２アミノ酸、少なくとも１３アミノ酸、少なくとも１４アミノ酸または少なくとも１５アミノ酸である。スペーサーまたはリンカーは、フレキシブルであり得る。スペーサーは、複数のグリシン及び／またはセリンアミノ酸を含み得る。

スペーサー及びリンカー配列は、当業者に知られており、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３）６５（１０）：１３５７－１３６９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、フレキシブルリンカー配列であり得る。フレキシブルリンカー配列は、リンカー配列によって連結されるアミノ酸配列の相対的移動を可能とする。フレキシブルリンカーは、当業者に知られており、いくつかは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３）６５（１０）：１３５７－１３６９で同定されている。フレキシブルリンカー配列はしばしば、高い割合のグリシン及び／またはセリン残基を含む。

いくつかの場合では、スペーサーまたはリンカー配列は、少なくとも１つのグリシン残基及び／または少なくとも１つのセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、グリシン及びセリン残基からなる。いくつかの場合では、スペーサーまたはリンカー配列は、１～２、１～３、１～４、１～５または１～１０アミノ酸の長さを有する。

スペーサーまたはリンカーの包含は、細胞外小胞とタグ部位との間のタンパク質リガーゼ反応の効率を改善し得る。用語「タグ」は、本明細書で使用される場合、タグ、スペーサー、及びタンパク質リガーゼ認識配列を含むペプチドを包含し得る。

好適なタンパク質リガーゼ認識配列は、当該技術分野で知られている。タンパク質リガーゼ認識配列は、細胞外小胞をタグ付けする方法において使用されるタンパク質リガーゼによって認識される。例えば、方法において使用されるタンパク質リガーゼがソルターゼである場、そのときはタンパク質リガーゼ認識配列は、ソルターゼ結合部位である。それらの場合、配列は、ＬＰＸＴＧ（Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸である）、好ましくはＬＰＥＴＧであり得る。代替的には、酵素がＡＥＰ１である場合、タンパク質リガーゼ認識配列は、ＮＧＬであり得る。タンパク質リガーゼ結合部位は、ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に配置され得る。

タグは、タグの精製もしくは処理において、タグ自体の生成中に、タグ付け法の間に、または後の精製のために補助する１つ以上のさらなる配列を追加的に含み得る。当該技術分野で知られている任意の好適な配列が使用され得る。例えば、配列は、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ（例えば、ポリＨｉｓタグ、または６ｘＨｉｓタグ）であり得る。

タグは、集団または組成物における細胞外小胞の実質的にすべてに連結され得る。本明細書に開示される組成物は、細胞外小胞の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、または少なくとも９７％がタグを含む細胞外小胞を含み得る。好ましくは、細胞外小胞の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％または少なくとも９７％は、タグを含む。いくつかの場合では、組成物中の異なる細胞外小胞は、異なるタグを含む。いくつかの場合では、細胞外小胞は、同じまたは実質的に同じタグを含む。

タグを組み込むための方法は、ＰＣＴ／ＳＧ２０１９／０５０４８１、ＷＯ２０１４／１８３０７１Ａ２、ＷＯ２０１４／８３０６６Ａ２及びＵＳ２０１４／００３０６９７Ａ１（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

カーゴ
本明細書に開示される細胞外小胞には、カーゴが搭載され、または含まれ得る。本開示は、特に、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）または化学的に改変されたＤＮＡもしくはＲＮＡを含み、またはそれからなる核酸カーゴに関する。好ましい実施形態では、カーゴは、ＤＮＡまたは化学的に改変されたＤＮＡを含み、またはそれからなる。用語「カーゴ」は、本明細書において「ロード」と互換的に使用される。

核酸カーゴは、細胞外小胞内にまたは上に搭載された核酸（例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）を指す。核酸カーゴは通常、オリゴヌクレオチド鎖（任意の形態、例えば、一本鎖、二本鎖、スーパーコイル状または非スーパーコイル状、染色体状または非染色体状であり得る）を指す。ＤＮＡは、他の分子、例えば、担体、安定化剤、ヒストン、脂溶性剤にコンジュゲートされ、またはそれと複合体化され得る。

本明細書に開示される方法は、任意の核酸カーゴのために使用され得るが、大きな核酸を搭載するのに、特にＤＮＡカーゴを搭載するのに特に有利である。核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る。好ましくは、核酸は、二本鎖である。核酸は、環状であり得る。

カーゴは、好ましくは外因性である。すなわち、核酸は、それらが新しく生成したときの細胞外小胞において及び／または細胞外小胞の由来となる細胞において存在しない。カーゴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計及び／または構築されている、合成であり得る。

カーゴは、治療用オリゴヌクレオチドまたは診断用オリゴヌクレオチドであり得る。核酸は、対象となる遺伝子をコードし得る。例えば、カーゴは、非存在遺伝子を置き換えるための、欠陥遺伝子を修復するための、または標的組織において治療効果を誘導するための機能性遺伝子をコードし得る。いくつかの場合では、カーゴは、レポーター遺伝子であり、または容易に検出可能な分子をコードする。

カーゴは、発現ベクターまたは発現カセット配列を含み得る。好適な発現ベクター及び発現カセットは、既知の技術である。本明細書に記載の方法において有用な発現ベクターは、標的細胞において１つ以上の核酸配列の発現を容易化する要素を含む。本開示において有用な発現ベクターは、導入遺伝子または他のＤＮＡ配列を含み得る。

発現ベクターは、細胞における／による発現のためにその細胞に外来遺伝物質を含む移行するためにビヒクルとして使用されるオリゴヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。そのようなベクターは、発現する遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されたプロモーター配列を含み得る。ベクターにはまた、終止コドン及び発現エンハンサーが含まれ得る。当該技術分野で知られている任意の好適なプロモーター、エンハンサー及び終止コドンが使用され得る。

本明細書において、用語「機能可能に連結された」には、選択されたヌクレオチド配列及び制御ヌクレオチド配列（例えば、プロモーター及び／またはエンハンサー）が、制御配列の影響または制御下でヌクレオチド配列の発現を設定する（それにより発現カセットを形成する）ような方法で共有結合された状況が含まれ得る。よって、制御配列がヌクレオチド配列の転写を行うことが可能である場合、制御配列は、選択されたヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。適切な場合、得られる転写産物は次いで、所望のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドに翻訳され得る。所望のタンパク質、ペプチド及びポリペプチドには、全長抗体及び抗体断片、ホルモン、サイトカイン、酵素、ペプチド抗生物質、タンパク質プロドラッグ、マーカータンパク質、膜タンパク質、トランスポータータンパク質、受容体タンパク質、成長因子、ヒストン、シャペロン、構造タンパク質、転写因子、シグナル伝達タンパク質、核酸結合タンパク質、脂質結合タンパク質、膜融合タンパク質、細胞接着タンパク質及び凝固因子が含まれる。

環状カーゴ分子の例には、ミニサークル及びプラスミドが含まれる。

核酸カーゴは、ミニサークルであり得る。ミニサークルは、小さな（約４ｋｂｐ）環状レプリコンである。ミニサークルは普通は、ＤＮＡ（通常は二本鎖）を含む。ミニサークルは、いくつかの真核細胞小器官ゲノムにおいて天然に存在するが、本明細書において好ましいミニサークルは、合成的に誘導される。いくつかの場合では、ミニサークルは、複製起点を含まず、よって、細胞内で複製しない。本明細書に開示されるミニサークルは、約１．５ｋｂｐ、約２ｋｂｐ、約２．５ｋｂｐ、約３ｋｂｐ、約３．５ｋｂｐ、約４ｋｂｐ、約４．５ｋｂｐ、約５ｋｂｐ、約５．５ｋｂｐ、約６ｋｂｐ、約６．５ｋｂｐまたは約７ｋｂｐであり得る。ミニサークルは、当業者に知られており、例えば、Ｇａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１５ Ｍａｒ；１５（３）：３５３－７９．ｄｏｉ：１０．１５１７／１４７１２５９８．２０１５．９９６５４４．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｄｅｃ ２４を参照されたい。

いくつかの場合では、核酸カーゴは、プラスミドである。プラスミドは通常、細胞において独立して複製することができる。プラスミドは通常、ＤＮＡ（通常は二本鎖）を含み、約１ｋｂｐ～数メガ塩基対（Ｍｂｐ）のサイズの範囲であり得る。プラスミドは、複製起点配列を含み得る。

いくつかの場合では、核酸は、ＤＮＡダンベルである。ＤＮＡダンベルは、一本鎖ループ構造を有する両末端で共有結合で封鎖された線状二本鎖ＤＮＡ発現カセットを含む最小ベクターである。ＤＮＡダンベルは、同時分子間ライゲーション及びミスライゲーションされた経路外生成物の消化を伴って、ヌクレアーゼによって補助される酵素ライゲーション（ＥＬＡＮ）によって合成され得る。代替的には、ＤＮＡダンベルは、２工程の方法で合成され得、その場合、発現カセットは、最初に、化学的に改変されたプライマーを使用してＰＣＲによって増幅されてライゲーションの準備がされたＤＮＡ構造が形成され、その後、非常に効率的な分子内ライゲーション反応に供される（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１５ Ｏｃｔ １５；４３（１８）：ｅ１２０．）。

いくつかの場合では、カーゴは、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、またはそれをコードする核酸である。そのようなカーゴは、遺伝子サイレンシングの方法において有用であり得る。ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯは、標的細胞において発現する配列に対応し得る。それは、対象となる特定の遺伝子またはタンパク質の発現を阻害または増強するように作用し得る。核酸は、標的細胞において発現するｍｉＲＮＡに対応するｓｉＲＮＡまたはＡＳＯをコードし得る。

カーゴは、ｍＲＮＡを含み、またはそれをコードし得る。ｍＲＮＡは、導入遺伝子をコードし得る。

いくつかの場合では、核酸は、小胞の表面上のタンパク質に結合する配列を含有するように改変されない。例えば、カーゴ核酸は、トランス活性化反応（ＴＡＲ）要素を含有しない。いくつかの場合では、細胞外小胞は、改変された表面タンパク質、例えば、外因性ＡＲＲＤＣ１タンパク質またはＡＲＲＤＣ１タンパク質に由来する配列を含有するように改変されない。

いくつかの場合では、核酸カーゴは、１つ以上の改変されたヌクレオチドまたは他の改変を含む。化学的改変には、例えば、改変ヌクレオチドの組み込み、キャッピング部位（例えば、３’キャッピング）の組み込み、高分子量非免疫原性化合物（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））へのコンジュゲーション、脂溶性化合物へのコンジュゲーション、リン酸骨格における置換を含む、核酸の糖位置、リン酸位置、及び／または塩基位置での化学的置換が含まれ得る。例えば、核酸は、１つ以上の２’－位置の糖改変、例えば、２’－アミノ（２’－ＮＨ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、及び２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）を含み得る。塩基改変には、５－位置のピリミジン改変、８－位置のプリン改変、環外アミンにおける改変、４－チオウリジンの置換、５－ブロモ－または５－ヨード－ウラシルの置換、骨格改変、メチル化、イソ塩基であるイソシチジン及びイソグアニジンなどの通常ではない塩基対形成の組み合わせが含まれ得る。改変にはまた、キャッピングなどの３’及び５’改変が含まれ得る。他の改変には、天然に存在するヌクレオチドの１つ以上のアナログでの置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）を用いるもの及び荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を用いるもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を用いるもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、及び改変結合（例えば、アルファアノマー核酸など）を用いるものなどが含まれ得る。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、ホスホネート基またはリン酸基によって置き換えられ；標準的な保護基によって保護され；または追加のヌクレオチドもしくは固体支持体に対する追加の結合を生成するために活性化され得る。５’及び３’末端ＯＨ基は、リン酸化され、またはアミン、約１～約２０個の炭素原子の有機キャッピング基部位、または約１～約２０ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーもしくは他の親水性もしくは疎水性生物学的または合成ポリマーの有機キャッピング基部位で置換され得る。核酸は、バリアントタイプ、例えば、ロック核酸（ＬＮＡ）、またはギャップマーのものであり得る。

本開示による細胞外小胞は、小胞当たり少なくとも０．１個の核酸分子を含み得る（例えば、搭載され得る）。細胞外小胞（複数可）は、小胞当たり０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０個またはそれ以上の核酸のコピーのうちの１つを含み得る（例えば、搭載され得る）。細胞外小胞（複数可）は、小胞当たり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０個の核酸のコピーのうちの１つを含み得る（例えば、搭載され得る）。細胞外小胞（複数可）は、小胞当たり少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも３．５、少なくとも４、少なくとも５個またはそれ以上のコピーを含み得る（例えば、搭載され得る）。細胞外小胞（複数可）は、小胞当たり約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれ以上の核酸のコピーを含み得る（例えば、搭載され得る）。細胞外小胞（複数可）は、小胞当たり０．１～１．０、０．１～２．０、０．１～３．０、０．１～４．０、０．１～５．０、０．１～６．０、０．１～７．０、０．１～８．０、０．１～９．０、０．１～１０、０．１～１５．０、０．１～２０．０、０．１～２５．０、０．１～３０．０、０．１～３５．０、０．１～４０．０、０．１～４５．０、０．１～５０、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、１～５０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、２～１５、２～２０、２～２５、２～３０、２～３５、２～４０、２～４５、２～５０、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～１５、３～２０、３～２５、３～３０、３～３５、３～４０、３～４５、３～５０、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、４～１５、４～２０、４～２５、４～３０、４～３５、４～４０、４～４５、４～５０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５、５～５０、６～７、６～８、６～９、６～１０、６～１５、６～２０、６～２５、６～３０、６～３５、６～４０、６～４５、６～５０、７～８、７～９、７～１０、７～１５、７～２０、７～２５、７～３０、７～３５、７～４０、７～４５、７～５０、８～９、８～１０、８～１５、８～２０、８～２５、８～３０、８～３５、８～４０、８～４５、８～５０、９～１０、９～１５、９～２０、９～２５、９～３０、９～３５、９～４０、９～４５、９～５０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１０～３５、１０～４０、１０～４５、１０～５０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、１５～３５、１５～４０、１５～４５、１５～５０、２０～２５、２０～３０、２０～３５、２０～４０、２０～４５、２０～５０、２５～３０、２５～３５、２５～４０、２５～４５、２５～５０、３０～３５、３０～４０、３０～４５、３０～５０、３５～４０、３５～４５、３５～５０、４０～４５、４０～５０、または４５～５０個の核酸のコピーのうちの１つを含み得る（例えば、搭載され得る）。

小胞当たりの核酸（複数可）の数は、例えば、組成物に存在するＥＶの集団にわたる平均数、好ましくはミーン平均であり得る。小胞当たりの核酸のコピーの数は、搭載された核酸カーゴのコピーの総数をＥＶの総数で除算することによって決定され得る。すなわち、ＥＶ当たりのコピー＝搭載された核酸のコピーの数／ＥＶ粒子の総数。核酸のコピーの数は、ｑＰＣＲによって決定され得る。ＥＶの数は、ナノ粒子追跡分析（ＮＰＡ、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＳＭＭｓ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８ ９－９６０に記載されている）によって決定され得る。ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）は、液体中で粒子を可視化及び分析するための方法である。その技術は、限外顕微鏡及びレーザー照射単位と併せて使用され、これらは、液体懸濁液中の小さな粒子をブラウン運動下で動いているのを可視化することを可能にする。粒子によって散乱した光は、ＣＣＤまたはＥＭＣＣＤカメラを使用して複数のフレームにわたって捉えられる。次いでコンピュータソフトウエアが使用されて、各粒子の動きがフレームごとに追跡される。

本明細書で使用される場合、別段示されない限り、用語「平均」は、数学的平均を指す。これは、サンプルにおいて決定された核酸の総量を、そのサンプルにおける小胞の総数で除算したものを指し得る。

カーゴは、組成物における細胞外小胞の実質的にすべてに搭載されることが所望であり得るが、本明細書に開示される組成物は、細胞外小胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうち１つがカーゴを含有する細胞外小胞を含み得る。好ましくは、細胞外小胞の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の少なくとも１つは、カーゴを含有する。いくつかの場合では、組成物内の異なる細胞外小胞は、異なるカーゴを含有する。いくつかの場合では、細胞外小胞は、同じ、または実質的に同じカーゴ分子を含有する。

核酸カーゴのサイズは、塩基（一本鎖核酸の場合）または塩基対（二本鎖核酸の場合）でその長さの観点から定義され得る。本明細書において、核酸カーゴの一本鎖または二本鎖特質が示されていない場合、塩基（例えば、ｋｂ（キロ塩基）で与えられる長さはまた、塩基対（例えば、ｋｂｐ）での同じ長さの開示である。このように、１ｋｂ（１０００塩基）の長さはまた、１ｋｂｐ（１０００塩基対）の開示である。

核酸カーゴが一本鎖である場合、それは、少なくとも２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０または１１０００塩基のうちの１つの長さを有し得る。任意に、核酸カーゴが一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である場合、それは、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０または１１０００塩基のうちの１つの最大長さを有し得る。好ましい実施形態では、一本鎖核酸カーゴは、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００塩基または５０００塩基超のうちの１つの最小長さを有し得る。

核酸カーゴが一本鎖である場合、それは、２５０～７５０、５００～１０００，１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、９０００～１００００、１００００～１１０００、２５０～１０００、１０００～３０００、１０００～４０００、１０００～５０００、１０００～６０００、１０００～７０００、１０００～８０００、１０００～９０００、１０００～１００００、１０００～１１０００、２０００～４０００、２０００～５０００、２０００～６０００、２０００～７０００、２０００～８０００、２０００～９０００、２０００～１００００、２０００～１１０００、３０００～５０００、３０００～６０００、３０００～７０００、３０００～８０００、３０００～９０００、３０００～１００００、３０００～１１０００、４０００～６０００、４０００～７０００、４０００～８０００、４０００～９０００、４０００～１００００、４０００～１１０００、５０００～７０００、５０００～８０００、５０００～９０００、５０００～１００００、５０００～１１０００、６０００～８０００、６０００～９０００、６０００～１００００、６０００～１１０００、７０００～９０００、７０００～１００００、または７０００～１１０００塩基のうちの１つの長さを有し得る。

いくつかの実施形態では、核酸カーゴが一本鎖である場合、それは、最大で２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、または４００００塩基のうちの１つの長さを有し得る。一本鎖核酸カーゴは、５０００～１００００、５０００～１５０００、５０００～２００００、５０００～２５０００、５０００～３００００、５０００～３５０００、５０００～４００００、１００００～１５０００、１００００～２００００、１００００～２５０００、１００００～３００００、１００００～３５０００、１００００～４００００、１５０００～２００００、１５０００～２５０００、１５０００～３００００、１５０００～３５０００、１５０００～４００００、２００００～２５０００、２００００～３００００、２００００～３５０００、２００００～４００００、２５０００～３００００、２５０００～３５０００、２５０００～４００００、３００００～３５０００、３００００～４００００、または３５０００～４００００塩基のうちの１つの長さを有し得る。

核酸カーゴが二本鎖である場合、それは、少なくとも２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０または１１０００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。任意に、核酸カーゴが二本鎖である場合、それは、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０または１１０００塩基対のうちの１つの最大長さを有し得る。好ましい実施形態では、二本鎖核酸カーゴは、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００塩基対または５０００塩基対超のうちの１つの最小長さを有し得る。

核酸カーゴが二本鎖である場合、それは、２５０～７５０、５００～１０００，１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、９０００～１００００、１００００～１１０００、２５０～１０００、１０００～３０００、１０００～４０００、１０００～５０００、１０００～６０００、１０００～７０００、１０００～８０００、１０００～９０００、１０００～１００００、１０００～１１０００、２０００～４０００、２０００～５０００、２０００～６０００、２０００～７０００、２０００～８０００、２０００～９０００、２０００～１００００、２０００～１１０００、３０００～５０００、３０００～６０００、３０００～７０００、３０００～８０００、３０００～９０００、３０００～１００００、３０００～１１０００、４０００～６０００、４０００～７０００、４０００～８０００、４０００～９０００、４０００～１００００、４０００～１１０００、５０００～７０００、５０００～８０００、５０００～９０００、５０００～１００００、５０００～１１０００、６０００～８０００、６０００～９０００、６０００～１００００、６０００～１１０００、７０００～９０００、７０００～１００００、または７０００～１１０００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。

いくつかの実施形態では、核酸カーゴが二本鎖である場合、それは、最大で２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、または４００００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。二本鎖核酸カーゴは、５０００～１００００、５０００～１５０００、５０００～２００００、５０００～２５０００、５０００～３００００、５０００～３５０００、５０００～４００００、１００００～１５０００、１００００～２００００、１００００～２５０００、１００００～３００００、１００００～３５０００、１００００～４００００、１５０００～２００００、１５０００～２５０００、１５０００～３００００、１５０００～３５０００、１５０００～４００００、２００００～２５０００、２００００～３００００、２００００～３５０００、２００００～４００００、２５０００～３００００、２５０００～３５０００、２５０００～４００００、３００００～３５０００、３００００～４００００、または３５０００～４００００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。

各核酸カーゴは、約０．５ｋｂ～約４ｋｂの間、約０．５ｋｂ～約３ｋｂの間、約０．５ｋｂ～約２．５ｋｂの間、約１ｋｂ～約３ｋｂの間、約１．５ｋｂ～約２．５ｋｂの間、または約２ｋｂであり得る。各核酸カーゴは、少なくとも０．５ｋｂ、少なくとも１．０ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２．０ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１１ｋｂ、少なくとも１２ｋｂ、少なくとも１３ｋｂ、少なくとも１４ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも１６ｋｂ、少なくとも１７ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ、少なくとも１９ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２１ｋｂ、少なくとも２２ｋｂ、少なくとも２３ｋｂ、少なくとも２４ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも２６ｋｂ、少なくとも２７ｋｂ、少なくとも２８ｋｂ、少なくとも２９ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３１ｋｂ、少なくとも３２ｋｂ、少なくとも３３ｋｂ、少なくとも３４ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも３６ｋｂ、少なくとも３７ｋｂ、少なくとも３８ｋｂ、少なくとも３９ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４１ｋｂ、少なくとも４２ｋｂ、少なくとも４３ｋｂ、少なくとも４４ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも４６ｋｂ、少なくとも４７ｋｂ、少なくとも４８ｋｂ、少なくとも４９ｋｂ、少なくとも５０ｋｂまたはそれ以上であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、各核酸カーゴは、少なくとも２ｋｂである。

いくつかの場合では、総核酸カーゴは、約０．５ｋｂ～約４ｋｂの間、約０．５ｋｂ～約３ｋｂの間、約０．５ｋｂ～約２．５ｋｂの間、約１ｋｂ～約３ｋｂの間、約１．５ｋｂ～約２．５ｋｂの間、または約２ｋｂであり得る。各核酸カーゴは、少なくとも０．５ｋｂ、少なくとも１．０ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２．０ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１１ｋｂ、少なくとも１２ｋｂまたはそれ以上であり得る。すなわち、カーゴは、複数の核酸を含み、各小胞におけるこれらの核酸の合計長さは、平均で、約０．５ｋｂ～約４ｋｂ、約０．５ｋｂ～約３ｋｂ、約０．５ｋｂ～約２．５ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２．５ｋｂ、または約２ｋｂである。各核酸カーゴは、少なくとも０．５ｋｂ、少なくとも１．０ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２．０ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１１ｋｂ、少なくとも１２ｋｂ、少なくとも１３ｋｂ、少なくとも１４ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも１６ｋｂ、少なくとも１７ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ、少なくとも１９ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２１ｋｂ、少なくとも２２ｋｂ、少なくとも２３ｋｂ、少なくとも２４ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも２６ｋｂ、少なくとも２７ｋｂ、少なくとも２８ｋｂ、少なくとも２９ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３１ｋｂ、少なくとも３２ｋｂ、少なくとも３３ｋｂ、少なくとも３４ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも３６ｋｂ、少なくとも３７ｋｂ、少なくとも３８ｋｂ、少なくとも３９ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４１ｋｂ、少なくとも４２ｋｂ、少なくとも４３ｋｂ、少なくとも４４ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも４６ｋｂ、少なくとも４７ｋｂ、少なくとも４８ｋｂ、少なくとも４９ｋｂ、少なくとも５０ｋｂまたはそれ以上であり得る。

いくつかの場合では、核酸カーゴは、均一である（すなわち、ＥＶの組成物における各核酸は、類似し、または実質的に同一である）。いくつかの場合では、核酸カーゴは、不均一である（すなわち、ＥＶの組成物における核酸は、互いに類似せず、または実質的に同一ではない）。

本明細書において、細胞外小胞へのカーゴの搭載は、細胞外小胞が、カーゴの担体として有用となるように、例えば、細胞へのその送達を可能とするように、安定なまたは準安定な形態で細胞外小胞及びカーゴを会合させることを指す。カーゴ分子は、少なくとも２つの方法で搭載され得る。１つは、カーゴが細胞外小胞の内腔に存在するためのものである（内腔搭載）。もう１つは、カーゴが細胞外小胞の外部表面、例えば、膜に付着され、接着され、それを介して挿入され、またはそれと複合体化されるためのものである（外部表面搭載）。細胞外小胞の外部表面上に搭載されるカーゴ分子は通常、小胞をヌクレアーゼ、例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅと接触させることによって除去され得る。

発明者は、細胞外小胞が、内腔及び外部表面搭載の組み合わせによって搭載され得ること、及びそのような細胞外小胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で標的細胞にカーゴ核酸を有効に送達し得ることを示した。

任意に、いくつかの実施形態では、搭載に対する言及は、内腔搭載に対するもののみであり得る。任意に、いくつかの他の実施形態では、搭載に対する言及は、外部表面搭載に対するもののみであり得る。

本明細書に記載されるように、細胞外小胞への核酸の搭載は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの核酸分解からの抵抗性を提供し得る。例えば、核酸搭載細胞外小胞は、細胞外小胞に搭載されていない核酸と比較して、血清分解に対する増加した抵抗性を有し得る。例えば、核酸搭載細胞外小胞は、血清分解に抵抗し得、よって、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、または５時間超の血清との接触の間、核酸、好ましくは機能性核酸を保持する。好ましくは、核酸は、核酸搭載細胞外小胞と血清との２時間の接触の後に依然として検出され得る。

細胞外小胞に搭載する方法
本明細書には、細胞外小胞に搭載するアプローチが開示される。そのアプローチは、細胞外小胞（複数可）、核酸及びトランスフェクション試薬が、好適な条件下で、搭載の発生を可能とするのに十分な時間、一緒にする化学的形質導入を使用する。

好ましくは、方法は、エレクトロポレーションを伴わない。好ましくは、方法は、ナノポレーションを伴わない。

本明細書に開示される方法は、搭載される核酸をトランスフェクション試薬と接触させる工程を伴う。好適なトランスフェクション試薬には、陽イオン性脂質試薬などの陽イオン性試薬が含まれる。いくつかのトランスフェクション試薬は、当該技術分野で知られており、リポフェクタミン（商標）３０００（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、リポフェクタミン（商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｅｘｏｆｅｃｔ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び線状ポリエチレンイミン塩酸塩（例えば、２５，０００Ｄａまたは４０，０００Ｄａの平均分子量を有する）、例えば、ＰＥＩＭａｘ（商標）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）及びｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）が含まれる。

本明細書に開示されるいくつかの方法は、搭載される核酸を調製する工程を伴う。調製工程において、細胞外小胞に搭載される核酸は、トランスフェクション試薬と核酸との間の複合体の形成に好適な条件下でトランスフェクション試薬と接触させられる。核酸及びトランスフェクション試薬は、複合体形成が生じるのに十分な時間、接触させられる。好ましくは、核酸及びトランスフェクション試薬は、ＤＮＡ：ＰＥＩＭａｘ複合体などの複合体を形成する。搭載のための核酸の調製は、さらなる工程、例えば、核酸の濃縮もしくは希釈、または緩衝液もしくは他の試薬もしくは培地、例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ還元血清培地（Ｇｉｂｃｏ）の添加を含み得る。核酸及びトランスフェクション試薬は、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分、少なくとも５分、少なくとも６分、少なくとも７分、少なくとも８分、少なくとも９分、少なくとも１０分、少なくとも１１分、少なくとも１２分、少なくとも１３分、少なくとも１４分、少なくとも１５分、少なくとも１６分、少なくとも１７分、少なくとも１８分、少なくとも１９分、少なくとも２０分または２０分超、接触させられ得る。

本明細書に開示される方法は、細胞外小胞に核酸：トランスフェクション試薬複合体を搭載する工程を伴い得る。調製された核酸：トランスフェクション試薬複合体は、搭載される細胞外小胞と接触させられる。好ましい方法では、細胞外小胞は、調製された核酸：トランスフェクション試薬複合体に添加される。すなわち、細胞外小胞との接触は、搭載される核酸カーゴをトランスフェクション試薬と接触させた後に実施される。通常、核酸：トランスフェクション試薬複合体は、複数の細胞外小胞を含む組成物と接触させられる。核酸：トランスフェクション試薬複合体及び細胞外小胞は、核酸：トランスフェクション試薬複合体の１つ以上が細胞外小胞に搭載されることを可能にするのに十分な時間及び適切な条件下でインキュベートされ得る。複合体は、細胞外小胞に内在化され、またはそうでなければ細胞外小胞上に、例えば、細胞外小胞の表面上に搭載され得る。好ましくは、複合体は、細胞外小胞に内在化される。

搭載工程の後、細胞外小胞は、単離、洗浄及び／または濃縮され得る。好ましい方法では、洗浄工程が搭載工程に続く。搭載工程の後、混合物は、ＰＢＳで洗浄され得る。好ましくは、洗浄は、混合物を遠心分離して細胞外小胞をペレット化し、ペレットを適切な緩衝液（ＰＢＳなど）に再懸濁することを含む。洗浄工程は、１、２、３、４、５、６回またはそれ以上繰り返され得る。

細胞外小胞に核酸：トランスフェクション試薬複合体を搭載する工程は、繰り返され得る。すなわち、細胞外小胞に核酸：トランスフェクション試薬複合体を搭載する工程に続いて、細胞外小胞は、任意に洗浄され、さらなる核酸：トランスフェクション試薬複合体と接触させられ得る。そのような方法において、核酸：トランスフェクション試薬複合体が搭載される細胞外小胞は、搭載された細胞外小胞であり得、よって、核酸カーゴをすでに含有し得る。代替的には、細胞外小胞は、搭載工程に供されたが、カーゴが搭載されておらず、または低レベルのカーゴが搭載された場合がある。第２のまたはさらなる搭載工程が必要とされる場合、細胞外小胞は、先行の搭載工程において使用されたものと同じまたは異なる条件下及び同じまたは異なる時間、さらなる核酸：トランスフェクション試薬複合体とインキュベートされ得る。第２のまたはさらなる搭載工程の後、さらなる洗浄工程が使用され得る。

好ましくは、方法は、細胞外小胞を核酸：トランスフェクション試薬複合体とインキュベートすることを伴い、細胞を核酸：トランスフェクション試薬複合体とインキュベートし、その後そのような細胞からの細胞外小胞の形成を誘導することを伴わない。

いくつかの態様では、カーゴは、細胞外小胞に搭載される。いくつかの態様では、カーゴは、細胞外小胞の内腔に搭載される。いくつかの態様では、カーゴは、細胞外小胞上に、例えば、小胞の膜上に、または小胞の膜のタンパク質上に搭載される。いくつかの態様では、カーゴの一部は、細胞外小胞の内腔に搭載され、カーゴの一部は、細胞外小胞上に、例えば、小胞の膜上に、または小胞の膜のタンパク質上に搭載される。

方法は、細胞外小胞の内腔内に含まれない核酸カーゴを除去することを伴い得る。そのような工程は、搭載された細胞外小胞をＤＮＡｓｅと接触させることを含み得る。搭載された細胞外小胞は、核酸または核酸：トランスフェクション試薬複合体を解離するために、ＤＮＡｓｅとの接触の前にヘパリンと接触させられ得る。

組成物
本明細書では、細胞外小胞を含む組成物が開示される。組成物は、細胞外小胞の集団を形成する、複数の細胞外小胞を含み得る。組成物の例には、薬学的組成物及び薬品が含まれる。

組成物は、１ｍｌ当たり１０^６～１０^１４個の粒子を含み得る。組成物は、１ｍｌ当たり少なくとも１０^５個の粒子、１ｍｌ当たり少なくとも１０^６個の粒子、１ｍｌ当たり少なくとも少なくとも１０^７個の粒子、１ｍｌ当たり少なくとも１０^８個の粒子、１ｍｌ当たり少なくとも１０^９個の粒子、１ｍｌ当たり少なくとも１０^１０個の粒子、１ｍｌ当たり少なくとも１０^１１個の粒子、１ｍｌ当たり少なくとも１０^１２個の粒子、１ｍｌ当たり少なくとも１０^１３個の粒子または１ｍｌ当たり少なくとも１０^１４個の粒子を含み得る。

組成物における細胞外小胞の集団は、サイズ特性、例えば、直径の範囲を有することが予期される。集団は、異なり得るメジアン及びミーン平均サイズを有するサイズ分布を示し得る。そのような特性は、上述されている。

集団における各小胞は、同じ量のカーゴを含有する可能性は低い。このように、細胞外小胞の集団は、上述したように、小胞当たりのカーゴ分子の平均数の観点から記載され得る。

組成物は、薬学的組成物であり得る。組成物は、１つ以上の細胞外小胞、及び任意に薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含み得る。薬学的組成物は、特定の投与経路による投与のために製剤化され得る。例えば、薬学的組成物は、静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮内、皮下、鼻腔内または他の投与経路のために製剤化され得る。

組成物は、緩衝溶液を含み得る。組成物は、防腐化合物を含み得る。組成物は、薬学的に許容可能な担体を含み得る。

本発明の核酸を含有する組成物は、無菌の生理的に許容可能な担体中で保存及び投与され得、その場合、核酸は、細胞へのＤＮＡの導入を補助する任意の薬剤と併せて分散される。

水、ＰＢＳ、エタノール、脂質などを含む様々な滅菌溶液が組成物の投与のために使用され得る。ＤＮＡの濃度は、治療用量を提供するのに十分であり、これは細胞への輸送の効率に依存する。

組成物は、凍結または凍結乾燥形態で提供され得る。

処置の方法及び細胞外小胞の使用
本明細書に記載される細胞外小胞及び細胞外小胞を含む組成物は、療法において、例えば、疾患または障害の処置、予防及び／または改善において使用され得る。特に、療法は、遺伝子療法または遺伝子サイレンシングの方法であり得る。

投与は、好ましくは「治療的有効量」のものであり、これは、個体に対する利益を示すのに十分である。投与される実際の量、ならびに投与の速度及び時間経過は、処置されている疾患の特質及び重症度に依存する。処置の処方、例えば、投薬量などに対する決定は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法及び開業医に知られている他の要因を考慮する。上記の技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓで見ることができる。

処置される対象は、任意の動物またはヒトであり得る。対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。対象は、非ヒト哺乳動物であり得るが、より好ましくはヒトである。対象は、男性または女性であり得る。対象は、患者であり得る。治療的使用は、ヒトまたは動物（獣医学的使用）におけるものであり得る。

本明細書に開示される細胞外小胞は、処置の方法において有用である。特に、方法は、標的遺伝子に関連する疾患または障害に罹患している対象を処置するのに有用である。標的遺伝子は、対象において異常に発現している場合がある。標的遺伝子は、健康な対象と比較して、対象において上方制御され、または過剰発現している場合がある。標的遺伝子は、健康な対象と比較して、対象において下方制御され、不十分に発現し、または発現していない場合がある。標的遺伝子の機能的欠陥バージョン、例えば、変異体形態（機能的な野生型と比較して）が、対象において発現している場合がある。方法は、有効量の搭載された細胞外小胞を前記対象に投与する工程を含み得、搭載された細胞外小胞は、治療用核酸カーゴ、例えば、標的細胞において標的遺伝子の発現を増加させ、減少させまたは調節するための核酸を含む。

本明細書で開示される細胞外小胞は、例えば、標的遺伝子の上方制御、過剰発現、下方制御、不十分な発現または発現の欠如（例えば、健康な対象と比較して）または健康な対象と比較して対象における標的遺伝子の機能的欠陥コピーまたはバージョンの発現によって引き起こされる遺伝子基礎を有する疾患または障害（遺伝性障害）の処置に特に有用である。

ＲＢＣＥＶは、ＣＮＳ、肺、肝臓、脾臓または骨髄の障害を処置するのに特に有用であり得る。いくつかの場合では、ＲＢＣＥＶは、膵臓または心臓の障害を処置するために有用であり得る。標的細胞／組織は、処置される障害に依存する。

カーゴは、標的遺伝子の発現を阻害または増強するように設計された核酸であり得、または特定の遺伝子の発現を抑制し、その配列を修正するための遺伝子編集を実施するように設計され得る。カーゴは、標的細胞において不十分に発現するまたは不正確に発現するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸であり得る。例えば、核酸は、発現しない、不十分に発現する、または不正確に発現する機能性ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードし得、それにより標的細胞において不正確なタンパク質機能を修復し、または補う。

本明細書に記載の搭載されたＥＶの投与は、患者において核酸カーゴによってコードされるタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの発現をもたらし得る。例えば、患者におけるＤＮＡ及び／または導入遺伝子の発現。本明細書に記載の搭載されたＥＶの投与は、患者の標的細胞においてタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの発現をもたらし得る。本明細書に記載の搭載されたＥＶの投与は、患者のＣＮＳ、肺、肝臓、脾臓、骨髄、膵臓または心臓細胞の細胞においてタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの発現をもたらし得る。

本明細書に記載の細胞外小胞及び組成物は、全身性、腫瘍内、腹腔内、非経口、静脈内、動脈内、皮内、皮下、筋肉内、硝子体内、網膜下、経口及び鼻腔を含むがこれらに限定されない多数の経路によって投与され、または投与のために製剤化され得る。薬品及び組成物は、流体または固体形態で製剤化され得る。流体製剤は、ヒトまたは動物の身体の選択された領域への注射による投与のために製剤化され得る。

細胞外小胞は、処置される細胞または組織の表面上の分子に結合するタグを含み得る。タグは、処置される細胞または組織に特異的に結合し得る。細胞外小胞は、治療用カーゴを含み得る。治療用カーゴは、標的細胞において標的遺伝子と相互作用するための非内因性物質であり得る。

細胞外小胞は、単独でまたは他の処置と組み合わせて、処置される状態に依存して同時にまたは順次に投与され得る。

本明細書に記載されるカーゴが搭載された細胞外小胞は、そのカーゴを標的細胞に送達するために使用され得る。いくつかの場合では、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法である。他の場合では、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ方法である。用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、実験室条件でまたは培養中の物質、生物学的物質、細胞及び／または組織を用いる実験を包含することが意図される一方で、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、インタクトな多細胞生物を用いた実験及び手順を包含することが意図される。「ｅｘ ｖｉｖｏ」は、生物の外、例えば、ヒトまたは動物身体の外で存在するまたは起こるものであって、生物から採取された組織（例えば、器官全体）または細胞におけるものであり得るものを指す。

キット
また、本明細書では、細胞外小胞を含むキットが開示される。キットは、１つ以上の細胞外小胞、核酸、例えば、発現ベクター、ＤＮＡミニサークル、プラスミドまたはＲＮＡから選択される１つ以上の成分、及びトランスフェクション試薬、例えば、ＰＥＩＭａｘを含み得る。キットは、本明細書に記載の方法において使用するのに好適な指示書及び／または緩衝液及び／または試薬をさらに含み得る。

前述の記載、または以下の特許請求の範囲、または添付の図面において開示される特徴は、それらの具体的な形態でまたは開示される機能を発揮するための手段もしくは開示される結果を得るための方法もしくはプロセスの観点から表されており、別々に、またはそのような特徴の任意の組み合わせで、その多様な形態で発明を実現するために利用され得る。

本発明は、上述した例示的な実施形態と併せて記載されているが、多くの同等の改変及び類型が、本開示が与えられた場合に当業者に明らかになる。したがって、上記の本発明の例示的な実施形態は、例示的であり、限定するものではないと考えられる。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、記載される実施形態に対する様々な変更がなされ得る。

いかなる疑義を回避するため、本明細書で提供される任意の理論的説明は、読者の理解を改善する目的で提供される。発明者は、これらの理論的説明のいずれかによって高速されることを望まない。

本明細書で使用される任意のセクションの見出しは、組織的な目的のためのもにすぎず、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

以下の特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、別段文脈が必要としていない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、ならびに変化形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、記述された整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の包含を暗示するが、任意の他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の除外を暗示しないことが理解される。

明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈が別段明らかに示さない限り、複数の指示物が含まれることが留意されなければならない。範囲は、「約」ある特定の値から、及び／または「約」別の特定の値までとして本明細書で表され得る。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、一方の特定の値から及び／または他方の特定の値までを含む。同様に、値が、先行する「約」の使用によって近似として表される場合、特定の値は別の実施形態を形成することが理解される。数値に関する用語「約」は、任意であり、例えば＋／－１０％を意味する。

実施例１
我々は、赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）などの細胞外小胞によるＤＮＡ及び他の核酸の効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ送達のための方法を記載する。我々は、ＧＦＰをコードするＤＮＡミニサークル（ＭＣ）が、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡと比較してサイズ及び分子量がはるかに大きいにもかかわらず、ＧＦＰ ｍＲＮＡと比較してより高い効率でＲＢＣＥＶに搭載され、より有効に細胞に送達され得ることを見出した。また、我々は、ＤＮＡ送達がＲＢＣＥＶの独自の特徴であり、エクソソームを使用して試みた場合に非常に不十分であることを見出した。

理論に縛られることなく、我々は、大きなＤＮＡカーゴを搭載するこの能力は、ＲＢＣＥＶの独自の膜特性に起因する可能性があると仮定する。ＲＢＣＥＶは、非常にフレキシブルなＲＢＣ膜と近い曲げ係数を示すことが報告されている（Ｖｏｒｓｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９，４９６０（２０１８））。他方で、エクソソームは、それらの膜上のコレステロール、ガングリオシド及びスフィンゴミエリンに富む脂質ラフトの高い濃度により、非常に硬い小胞である（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．，Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１８；８（１）：２３７－２５５）。この証拠は、ＲＢＣＥＶとエクソソーム膜との間の構造的相違の可能性を示唆しており、これは、ＤＮＡカーゴを搭載するそれらの異なる能力を説明し得る。我々はまた、ＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶの全身的に注射されたボーラスが、マウスにおける長期遺伝子発現をもたらすことを示し、ＲＢＣＥＶ／ＤＮＡ組成物が新規な非ウイルス性遺伝子療法実体として機能することを実証し、ＡＡＶなどの今日のほとんどの先発の遺伝子療法ベクターに関連する制約を潜在的に回避する。

以下に記載されるように、我々は、ミニサークルＤＮＡ（ＭＣ）が搭載されたＲＢＣＥＶが、ｍＲＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶよりも多くの細胞にトランスフェクションしたことを観察した。この効果は、使用される搭載方法にかかわらず、ＭＣは、エレクトロポレーションまたは化学的トランスフェクションのいずれかを搭載方法として使用した場合に、ｍＲＮＡよりも効率的にトランスフェクションした。我々のデータは、ＤＮＡミニサークルをｍＲＮＡよりも高い効率で搭載することができ、より有効に標的細胞に送達することができたことを示唆している。

我々はまた、化学的トランスフェクションを使用して搭載されたＲＢＣＥＶが、エレクトロポレーションを使用して搭載されたＲＢＣＥＶよりも細胞を形質導入するのに有効であったことを観察した。これは、核酸がｍＲＮＡであるか、ＤＮＡミニサークルであるかにかかわらず該当する。これらのデータは、我々の化学的トランスフェクション方法が、エレクトロポレーションよりも高いレベルのカーゴをもたらしたことを示唆している。興味深いことに、ＲＢＣＥＶにカーゴを２回搭載することにより、細胞は、１回のみ搭載されたＲＢＣＥＶよりもはるかに効率的にトランスフェクションした。

興味深いことに、核酸、特にｓｉＲＮＡを標的細胞に送達するためにエクソソームを使用する潜在性に関する多くの文献が存在するが、我々のデータは、ＭＣが搭載されたＲＢＣＥＶが、ＭＣが搭載されたエクソソームよりも多くの細胞をトランスフェクションすることを示唆している。これらのデータは、ＲＢＣＥＶがドナー血液から多量に精製され得るので、核酸送達ビヒクルとしてのＲＢＣＥＶの臨床的使用は、通常はＥＶにとって不可能であると以前に考えられた多量の大きなサイズの核酸（ＤＮＡ発現ベクター及びｍＲＮＡ）が容易に搭載され得、非免疫原性であることを支持する。

方法
物質及び試薬
ＧＦＰ ｍＲＮＡをＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、ＭＣ－Ｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＧＦＰ及びルシフェラーゼミニサークルＤＮＡ（ＭＣ）を生成した。ヒト骨髄由来間葉幹細胞エクソソーム（ＭＳＣ－ｅｘｏ）をＳｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ）から購入した。２９３Ｔ細胞をＡＴＣＣから購入し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターにおいて、１０％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。

ヒトＲＢＣ及びＭＳＣからのＥＶの精製及び定量
インフォームドコンセントをした健康ドナーからＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃを介して全血サンプルを得た。遠心分離及び白血球枯渇フィルター（Ｔｅｒｕｍｏ Ｊａｐａｎ）を使用することによってＲＢＣを血漿及び白血球から分離した。単離されたＲＢＣをＰＢＳに希釈し、１０ｍＭカルシウムイオノフォア（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で一晩処置した。ＥＶを精製するために、ＲＢＣ及び細胞デブリを６００ｇで２０分間、１６００ｇで１５分間、３７００ｇで１５分間、及び１０，０００ｇで３０分間４℃で遠心分離によって除去した。上清を０．４５μｍのフィルターに通過させた。ＥＶを４ダイア体積（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）のＰＢＳで洗浄し、タンジェンシャルフロー濾過（Ｐａｌｌ Ｍｉｎｉｍａｔｅ）によって濃縮し、続いて１００ｋＤ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してさらに濃縮した。精製されたＲＢＣＥＶを－８０℃で保存した。Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を使用してそれらのヘモグロビン含有量を評価することによってＥＶを定量した。

ＲＢＣＥＶの核酸搭載
ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ）、０．４ｃｍのキュベットを用いて１５０μＦの固定キャパシタンスで指数関数的プログラムを使用してＲＢＣＥＶのエレクトロポレーションを実施した。７５μｇのＲＢＣＥＶを４％トレハロースを含有するＯｐｔｉＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に希釈し、１．５μｇのＧＦＰ ＭＣまたはＧＦＰ ｍＲＮＡと混合して２００μｌの総体積とした。１００μｌのＥＶ混合物のアリコートを各キュベットに添加し、氷上で１０分間インキュベートした。エレクトロポレーションを４００Ｖで実施した。

いくつかの実験において、１μｇのｍＲＮＡまたはＤＮＡをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中の５～７μｌの化学ベースのトランスフェクション試薬（ＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、線状ポリエチレンイミン塩酸塩（ＭＷ４０，０００））に添加し、室温で１０分間インキュベートして複合体形成を促進した。混合物を５０μｇの洗浄されたＲＢＣＥＶに添加し、穏やかに混合した。反応を回転させながら３７℃で３０分間インキュベートし、続いて１０分間氷冷した。その後、搭載されたＲＢＣＥＶを２１，０００×ｇでペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄した。ＭＳＣ－ｅｘｏでの比較を伴う実験のため、ＭＳＣ－ｅｘｏに上述したものと同じ手法でＤＮＡを搭載し、搭載されたＲＢＣＥＶ及びＭＳＣ－ｅｘｏの両方の一貫性のため、製造業者の指示書に従ってＥｘｏＱｕｉｃｋ－ＴＣ（ＳＢＩ）で精製した。

ＲＢＣＥＶにおける搭載された核酸のコピー数の評価
ｑＲＴ－ＰＣＲ及びｑＰＣＲを既知の量のｍＲＮＡ及びＤＮＡに対してそれぞれ実施し、Ｃｔ値をコピー数に対してプロットして標準曲線を生成した。Ｔｒｉｚｏｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してｍＲＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶから総ＲＮＡを抽出し、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して製造業者のプロトコルに従ってｃＤＮＡに変換した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ ＭＣが搭載されたＲＢＣＥＶから総ＤＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ／ＤＮＡサンプルに対してｑＰＣＲを実施してコピー数を決定した。ナノ粒子追跡分析の原理に基づいてＺｅｔａＶｉｅｗ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｔｒｉｘ）によってＲＢＣＥＶを定量した。

フローサイトメトリー分析
ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ）中の細胞のフローサイトメトリーを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して実施し、Ｆｌｏｗｊｏ Ｖ１０（Ｆｌｏｗｊｏ，ＵＳＡ）を使用して分析した。２９３Ｔ細胞を、始めにＦＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ａに基づいてゲーティングしてデブリ及び死細胞（低ＦＳＣ－Ａ）を除外した。細胞をＦＳＣ幅対ＦＳＣ高さに基づいてさらにゲーティングして、ダブレット及び凝集体を排除した。その後、ＧＦＰ陽性細胞を、未処置の細胞を対照として使用してＦＩＴＣチャネルでゲーティングし、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ及び平均蛍光強度を評価した。

ＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶの血清安定性
記載されるトランスフェクション試薬を使用してＲＢＣＥＶにＭＣを搭載した。心穿刺を介して６週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスから１～１．２ｍＬの全血を採取した。血清を３，０００ｇで１０分間の凝固した全血の遠心分離によって単離した。１００μＬの血清またはＰＢＳを８０μｇのＭＣ、または当量のトランスフェクション試薬複合体化ＭＣ、または搭載されたＲＢＣＥＶと共に３７℃で撹拌しながら２時間インキュベートすることによって血清または対照（ＰＢＳ）処置を行った。インキュベート後、搭載されたＲＢＣＥＶを２１，０００ｇで３０分間遠心分離して、ペレット及び上清を収集した。ＥＤＴＡをすべての血清処置サンプルに添加して５ｍＭの最終濃度とした。ＥＤＴＡを有するサンプルを７５℃で５分間加熱してＤＮＡｓｅを不活性化した。サンプル及びＤＮＡ標準をＤＮＡ搭載色素と混合し、電気泳動のための１％アガロースゲルに搭載した。

ＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶの全身ｉｎ ｖｉｖｏ投与
すべての動物実験は、Ａ＊ＳＴＡＲ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ，ＳｉｎｇａｐｏｒｅにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された実験プロトコルに従って実施した。６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃまたはＮＳＧマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＭＥ，ＵＳ）から購入した。ＲＢＣＥＶに、化学的トランスフェクションによってルシフェラーゼがコードされたプラスミドを搭載した。ＲＢＣＥＶに搭載されたＤＮＡの量をゲル密度測定によって定量した。非搭載対照及びＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶを、尾静脈注射によって単回２００μｌボーラスで全身的に投与した。ルシフェラーゼの発現を検出するために、全身生物発光画像を、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の腹腔内注射から１５分後にＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して示された時点で捕捉した。視覚的出力は、疑似カラー画像（最大は赤色であり、最小は暗青色である）として１秒当たりの放出された光子の総数を表す。

結果
ＲＢＣＥＶによるＤＮＡ送達は、ｍＲＮＡと比較してより効率的であった。

我々は、２つの主要なクラスの核酸である環状二本鎖ＤＮＡ（ミニサークル、ＭＣ）及び線状一本鎖ｍＲＮＡがＲＢＣＥＶに搭載される能力を評価した。ＧＦＰ ＭＣ（２０００ｂｐ）及びＧＦＰ ｍＲＮＡ（１０００塩基）を、エレクトロポレーションによるＲＢＣＥＶにおけるそれらの搭載効率について評価した。この比較において、ＭＣ（ｄｓＤＮＡ）は、ｍＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）と比較して分子量が約４倍大きい。そのため、原理的には、より大きなＭＣペイロードをＲＢＣＥＶに搭載することはより困難であるはずである。ＧＦＰ ＭＣ及びＧＦＰ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションによってＲＢＣＥＶに搭載した。我々は、ｍＲＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶで処置された細胞において、ＧＦＰ発現レベルは、フローサイトメトリーによって検出するのに十分に高くはなかったことを観察した（図１ａ）。しかしながら、ＤＮＡ ＭＣが搭載されたＲＢＣＥＶで処置された細胞において、細胞の約３％がＧＦＰについて陽性であった（図１ｂ）。

我々はまた、ＲＢＣＥＶをＤＮＡ及びｍＲＮＡで化学的にトランスフェクションしてから、それらをｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に処置した。図２ａに示されるように、このカーゴ搭載方法を使用して、我々は、ｍＲＮＡと比較して、より多くのＤＮＡのコピーをＲＢＣＥＶに何とか搭載することができた。ナノ粒子追跡分析によって測定されたＥＶ粒子の総数を、ｑＰＣＲによって測定されたｃＤＮＡのコピーの総数で除算することによって、我々は、１．１６コピーのＧＦＰ ｍＲＮＡが各小胞に搭載されたことを計算し、これは、小胞当たり搭載された３．７４コピーのＧＦＰ ＤＮＡ ＭＣと比較して有意に低い（データは示されていない）。これらの搭載された小胞で２９３Ｔ細胞を処置した場合、我々は、ｍＲＮＡカーゴと比較して、ＤＮＡ ＭＣカーゴで細胞を処置した場合に４８時間で緑色の蛍光について陽性となる細胞のより高いパーセンテージを観察した（９９．５％対７３．５％、図２）。

ＲＢＣＥＶは、ＭＳＣＥＶと比較して、ＤＮＡカーゴのためのより良好なビヒクルである。

ＭＳＣは、エクソソームの豊富なプロデューサーであり、当該技術分野において、ＭＳＣによって生成されたエクソソームは、細胞の免疫調節特性を保持し、そのため、これらのエクソソームは、同種異系的に患者に投与され得ることが報告されている。これらの理由から、ＭＳＣ－ｅｘｏは、多様な治療用ペイロードのための新規な薬物送達ビヒクルとして積極的に探求されている。しかしながら、ＥＶの治療用ヒト用量を得るための大規模な細胞培養などの、いくつかの課題がＭＳＣ－ｅｘｏの臨床的使用に付随し、今日まで、一般的にＥＶに大きな核酸ペイロード（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ発現ベクター）を搭載することがほとんど成功しておらず、遺伝子送達におけるそれらの用途を制限している。我々は、化学的トランスフェクションの上記方法を使用してＭＳＣ－ｅｘｏに対してＲＢＣＥＶのＤＮＡ搭載容量を比較することを試みた。等量のＲＢＣＥＶ及びＭＳＣ－ｅｘｏに同じ量のＧＦＰをコードするＤＮＡ ＭＣを搭載し、一貫性のために両方のタイプの小胞をＥｘｏＱｕｉｃｋを使用して精製した。我々は、ＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶで処置された２９３Ｔ細胞が、ＤＮＡが搭載されたＭＳＣ－ｅｘｏについての２６．１％の陽性と比較して、ＧＦＰについて５９．３％の陽性であったことを見出した（図３、ａ及びｂ）。このことは、ＲＢＣＥＶが、それらの安全性及び生体適合性、血液の一単位から得ることが可能な高い収率、ならびに大きな核酸が搭載されるそれらの容易性を考慮すると、理想的な非ウイルス性遺伝子療法ビヒクルであることを示唆している。

ＲＢＣＥＶは、多様なサイズのＤＮＡカーゴを送達することができる。

遺伝子療法は主に、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法の最前線でＡＡＶを用いてウイルスベクターによって媒介される。しかしながら、免疫原性及び製造上の課題の他に、ウイルスベクターを使用する他の制約の１つは、ペイロード容量である。ＡＡＶゲノムの容量は４．７ｋｂであり、これは、挿入され得る導入遺伝子のサイズを大きく制限する。我々は、ＲＢＣＥＶによって送達され得るＤＮＡカーゴのサイズ制約を同定しようとした。ＣＭＶプロモーターによって誘導されるｃｏｐＧＦＰ導入遺伝子の単一のコピーをそれぞれ含有する様々なサイズ（２．４、６．６、９．６、１１．４及び３４．２ｋｂ－図７ａを参照されたい）の等質量のＤＮＡカーゴを、ＲＢＣＥＶに化学的に搭載し、等量の搭載及び洗浄されたＲＢＣＥＶを培養中の２９３Ｔ 細胞に添加した。４８時間後、細胞を蛍光顕微鏡法によって画像化し、続いてフローサイトメーターを使用して分析した。図７ｂに示されているように、成功裏にトランスフェクションされた蛍光細胞をすべてのＤＮＡカーゴについて観察した。興味深いことに、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージならびに平均蛍光強度は、カーゴのサイズの増加とともに減少し（２．４ｋｂカーゴの場合は９９．７％の陽性細胞であり、３４．２ｋｂカーゴの場合は５９．２％の陽性細胞に減少する）、これは、そのサイズに応じて異なるコピー数のペイロードを含有する等質量のＤＮＡを送達した結果である可能性が高い。それにもかかわらず、結果は、ＲＢＣＥＶが、多様なサイズのＤＮＡカーゴを送達することができることを示唆している。

ＲＢＣＥＶは、搭載されたＤＮＡを血清分解から保護する
ＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶの全身投与を伴う用途のため、搭載されたＤＮＡカーゴは、循環においてヌクレアーゼの活性に対して安定であることを確保することが重要である。よって、我々は、ＭＣ、トランスフェクション試薬と複合体化されたＭＣ、及びＭＣが搭載されたＲＢＣＥＶをＢａｌｂ／Ｃマウスからの血清で処置することによって、搭載されたＤＮＡの安定性を評価し、ゲル電気泳動を使用して残存ＤＮＡを分析した（図５）。レーンＭ０で観察されるように、使用された血清サンプルからの混入ＤＮＡは存在しない。血清におけるＤＮＡｓｅは、むき出しのＤＮＡ（レーンＭ４）だけでなく、トランスフェクション試薬と複合体化されたＤＮＡ（レーンＭ３）も分解することが可能であった。むき出しのＤＮＡもトランスフェクション試薬と複合体化されたＤＮＡも、ＰＢＳで処置された対照において観察されなかった（それぞれレーンＰ４及びＰ３）。しかしながら、血清インキュベート後であっても、搭載されたＲＢＣＥＶは、ＰＢＳで処置された対照と比較した場合、インタクトなＤＮＡペイロードの９３％を保持した（レーンＭ２対Ｐ２）。このことは、ＲＢＣＥＶが、ＤＮＡペイロードを血清ヌクレアーゼ分解から保護することができ、血清安定性に対するいかなる懸念を伴わずに、全身的に投与され得ることを示唆している。

マウスにおける長期遺伝子発現のためのＤＮＡカーゴのｉｎ ｖｉｖｏ送達
遺伝子療法ビヒクルのための重要な特徴の１つは、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子を送達し、標的組織において持続した長期遺伝子発現を付与する能力である。これを実証するために、我々は、ルシフェラーゼがコードされたＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶをＮＳＧマウスの尾静脈に２ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ用量で注射した。全身ルシフェラーゼ発現の動態を、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ生物発光画像化機を使用してモニターした。ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞へのＲＢＣＥＶ媒介送達は、マウスの胴体部領域における持続した長期ルシフェラーゼ活性をもたらした。生物発光シグナルをいかなる観察可能な減少も伴わずに３０ｄｐｉにわたって（これまでのところ４５ｄｐｉ）（図４）及び最小限の減少を伴って２７９日にわたって（図９ａ）モニターした。

ｉｎ ｖｉｖｏで大きなＤＮＡカーゴを送達する潜在性を実証するために、３ｋｂ、８ｋｂ、及び３４ｋｂのルシフェラーゼがコードされたＤＮＡカーゴが搭載されたＲＢＣＥＶを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に２．５ｍｇ／ｋｇの同等ＤＮＡ用量で全身的に投与した。ＤＮＡカーゴのサイズにかかわらず、ＤＮＡが搭載されたＲＢＣＥＶが注射されたマウスのすべてが、４８時間の時点で発光を示した（図９ｂ）。しかしながら、我々は、ＤＮＡカーゴのサイズが増加するとともに導入遺伝子の発現が減少したことを観察し、この場合もまた、その分子量に応じた異なるコピー数のペイロードに起因している。まとめると、我々は、大きなＤＮＡカーゴを送達し、マウスにおける長期導入遺伝子発現を引き起こすＲＢＣＥＶの能力を実証し、新規な非ウイルス遺伝子療法ベクターとなるその潜在性を強調する。

参考文献
本発明及び本発明が属する技術の状況をより十分に説明し、開示するために、多数の刊行物が上記で引用されている。これらの参考文献の完全が引用が以下に提供される。これらの参考文献の各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

標準的な分子生物学技術については、Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ ｅｄ．２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
１．Ｋａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．ＰＮＡＳ Ｍａｒｃｈ ２４，２０１５ １１２（１２）Ｅ１４３３－Ｅ１４４２；ｆｉｒｓｔ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２３，２０１５
２．Ｙａｎｇ，Ｚ．，Ｓｈｉ，Ｊ．，Ｘｉｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍＲＮＡ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｖｉａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎａｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ（２０１９）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１９－０４８５－１
３．ＷＯ２０１０／１１９２５６
４．Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ ｉｎｔｏ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｖｉａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｓ Ｓｉｚｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１５ Ｏｃｔｏｂｅｒ ５；１２（１０）：３６５０－３６５７．
５．Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９，２３５９（２０１８）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０４７９１－８．
６．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＳＭＭｓ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓを参照されたい。Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８ ９－９６０．

Claims (42)

1. ＤＮＡカーゴが搭載された赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）。
2. 前記ＤＮＡカーゴは、一本鎖であり、少なくとも２５０塩基の長さを有する、請求項１に記載のＲＢＣＥＶ。
3. 前記ＤＮＡカーゴは、一本鎖であり、少なくとも２０００塩基または２０００～３００００塩基またはそれ以上の長さを有する、請求項１または２に記載のＲＢＣＥＶ。
4. 前記ＤＮＡカーゴは、二本鎖であり、少なくとも２５０塩基対の長さを有する、請求項１に記載のＲＢＣＥＶ。
5. 前記ＤＮＡカーゴは、二本鎖であり、少なくとも２０００塩基対または２０００～１７０００塩基対またはそれ以上の長さを有する、請求項１または４に記載のＲＢＣＥＶ。
6. 前記ＤＮＡカーゴは、タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターである、任意の先行請求項に記載のＲＢＣＥＶ。
7. 前記ＤＮＡカーゴは、環状である、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＢＣＥＶ。
8. 前記ＤＮＡカーゴは、ミニサークルまたはプラスミドである、請求項１～７のいずれか１項に記載のＲＢＣＥＶ。
9. 前記ＤＮＡカーゴは、線状である、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＢＣＥＶ。
10. 前記ＤＮＡカーゴは、前記ＲＢＣＥＶの内腔にある、任意の先行請求項に記載のＲＢＣＥＶ。
11. 前記ＲＢＣＥＶは、ヒトまたは哺乳動物赤血球に由来し、またはそれから得られる、任意の先行請求項に記載のＲＢＣＥＶ。
12. 前記ＲＢＣＥＶは、単離されている、任意の先行請求項に記載のＲＢＣＥＶ。
13. ＲＢＣＥＶの内腔に少なくとも１つのＤＮＡカーゴを含有する単離された赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）。
14. 先行請求項のいずれか１項に記載の複数のＲＢＣＥＶを含む組成物。
15. 平均で前記組成物における各ＲＢＣＥＶは、少なくとも１．０のＤＮＡカーゴが搭載されている、請求項１４に記載の組成物。
16. 平均で前記組成物における各ＲＢＣＥＶは、少なくとも２．０または３．０のＤＮＡカーゴが搭載されている、請求項１４または１５に記載の組成物。
17. 平均で前記組成物における各ＲＢＣＥＶは、少なくとも１．０～４．０のＤＮＡカーゴが搭載されている、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物。
18. 前記組成物は、薬学的組成物または薬品である、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の組成物。
19. 前記組成物または薬品は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤または安定化剤をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
20. 処置を必要とする対象を処置する方法であって、前記方法は、治療的有効量の請求項１～１３のいずれか１項に記載のＲＢＣＥＶまたは請求項１４～１９のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与し、それにより前記対象を処置することを含む、前記方法。
21. 前記方法は、前記ＤＮＡカーゴの遺伝子配列からのタンパク質またはペプチドの発現による前記対象における疾患の処置を伴う、請求項２０に記載の方法。
22. 前記処置は、前記疾患の予防及び／または改善を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 細胞外小胞に核酸カーゴを搭載するための方法であって、前記方法は、
    ａ．細胞外小胞に搭載される核酸を提供すること；
    ｂ．前記細胞外小胞に前記核酸が搭載されるのに十分な条件下でトランスフェクション試薬の存在下で前記核酸を前記細胞外小胞と接触させること；及び
    ｃ．任意に前記搭載された細胞外小胞を洗浄すること
    を含む、前記方法。
24. 前記細胞外小胞は、赤血球細胞外小胞である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記方法は、工程ｂを繰り返すことを含む、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 細胞外小胞に核酸カーゴを搭載するための方法であって、前記方法は、
    ａ．細胞外小胞に搭載される核酸を提供すること；
    ｂ．前記核酸をトランスフェクション試薬と接触させて、核酸／トランスフェクション試薬複合体の形成を可能とすること；
    ｃ．前記細胞外小胞に前記核酸／トランスフェクション試薬複合体が搭載されるのに十分な条件下で前記核酸／トランスフェクション試薬複合体を前記細胞外小胞とインキュベートすることまたは接触させること；及び
    ｄ．任意に前記搭載された細胞外小胞を洗浄すること
    を含む、前記方法。
27. 細胞外小胞に核酸カーゴを搭載するための方法であって、前記方法は、
    ａ．細胞外小胞に搭載される核酸を提供すること；
    ｂ．前記核酸をトランスフェクション試薬と接触させて、核酸／トランスフェクション試薬複合体の形成を可能とすること；
    ｃ．前記細胞外小胞に前記核酸／トランスフェクション試薬複合体が搭載されるのに十分な条件下で前記核酸／トランスフェクション試薬複合体を前記細胞外小胞とインキュベートすることまたは接触させること；
    ｄ．任意に前記搭載された細胞外小胞を洗浄すること；
    ｅ．前記搭載された細胞外小胞をさらなる核酸／トランスフェクション試薬複合体と接触させること；及び
    ｆ．前記さらなる核酸／トランスフェクション試薬複合体を前記搭載された細胞外小胞とインキュベートすることまたは接触させること
    を含む、前記方法。
28. 前記細胞外小胞は、赤血球細胞外小胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
29. 前記方法は、工程ｂ～ｄを繰り返すことをさらに含む、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記トランスフェクション試薬は、任意にＭＷ２５，０００ＤａまたはＭＷ４０，０００Ｄａの、線状ポリエチレンイミン塩酸塩である、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記方法は、前記細胞外小胞の内腔内に含まれない核酸カーゴを除去する工程をさらに含む、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記細胞外小胞の内腔内に含まれない核酸カーゴを除去することは、前記搭載された細胞外小胞をヌクレアーゼ、好ましくはＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅと接触させることを含む、請求項３１に記載の方法。
33. 前記搭載された細胞外小胞は、ヌクレアーゼとの接触の前にヘパリンと接触させられる、請求項３２に記載の方法。
34. 前記核酸カーゴは、核酸分子を含み、各核酸分子は、一本鎖であり、少なくとも２５０塩基、または少なくとも２０００塩基、または２０００～３００００塩基またはそれ以上の長さを有する、請求項２３～３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記核酸カーゴは、核酸分子を含み、各核酸分子は、二本鎖であり、少なくとも２５０塩基対、または少なくとも２０００塩基対、または２０００～１７０００塩基対またはそれ以上の長さを有する、請求項２３～３３のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記核酸カーゴは、環状である、請求項２３～３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記核酸カーゴは、ミニサークルまたはプラスミドである、請求項３６に記載の方法。
38. 前記核酸カーゴは、線状である、請求項２３～３５のいずれか１項に記載の方法。
39. 前記核酸カーゴは、ＤＮＡである、請求項２３～３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記細胞外小胞は、微小胞である、請求項２３～３９のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記細胞外小胞は、エクソソームである、請求項２３～３９のいずれか１項に記載の方法。
42. 請求項２３～４１のいずれか１項に記載の方法によって調製されるまたは得られる、核酸カーゴが搭載された細胞外小胞。

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