KR20220127851A - 핵산 로딩된 적혈구 세포외 소포 - Google Patents

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텐진 고차
하비 로디시
와카스 무함마드 우스만
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카민 테라퓨틱스 피티이. 엘티디.
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Abstract

핵산 운반물이 로딩된 적혈구 세포외 소포(RBCEV); 로딩된 소포를 제조하는 방법; 및 이들 소포의 치료 용도가 개시된다. 핵산 운반물은 DNA 또는 RNA. 단일 가닥 또는 이중 가닥, 뿐만 아니라 선형 또는 원형일 수 있다.

Description

핵산 로딩된 적혈구 세포외 소포
본 출원은 2020년 1월 13일 출원된 US 62/960,569 및 2020년 2월 26일 출원된 US 62/981,880의 우선권을 주장하며, 이의 내용 및 요소는 모든 목적을 위해 참조로 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 세포외 소포 및 특히, 배타적이지는 않지만, 적혈구로부터 유래된 세포외 소포에 관한 것이다.
세포외 소포(EV)는 세포 사이에 생물분자의 전달을 매개하는 세포-유래 지질 막-결합된 소포이다. EV의 2 가지 부류, 즉 1) 엔도좀 막의 내부 출아로부터 생성되어, 결국 원형질 막과 융합하고 엑소좀을 세포외 공간 내로 방출하는 다소포체에서 내강 소포를 형성하는 엑소좀; 및 2) 원형질 막으로부터 직접 출아함으로써 형성되는 미세소포가 있음이 널리 받아들여지고 있다. 전형적으로, 엑소좀은 30-100 nm 직경인 반면, 미세소포는 100 nm보다 더 크다.
세포 막을 가로질러 큰 거대분자를 수송하는 선천적 능력으로 인해, EV는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 짧은 간섭 RNA(siRNA) 및 microRNA(miRNA)와 같은 짧은 RNA, 메신저 RNA(mRNA)와 같은 긴 RNA, 또는 심지어 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 포함하는 소분자, 단백질 및 핵산의 수송을 위한 약물 전달 소포로서 제안되었다. 이들 거대분자는 다수의 질환을 치료할 가능성이 있는 유망한 약물 후보이기 때문에 핵산의 EV-매개 전달에 대한 수요가 많지만, 약물로서 핵산의 개발은 세포 막을 투과할 수 없는 능력, 면역원성 및 전신 순환 시 뉴클레아제에 대한 취약성을 포함하는 여러 이유로 인해 지연되었다. 지질 나노입자 및 양이온성 중합체와 같은 여러 다른 유형의 전달 소포가 핵산 전달에 사용되었지만, 이들의 적용은 간 독성 및 제한된 간외 생체분포로 인해 제한된다.
EV에 핵산의 로딩은 EV가 생체적합성이고, 고유한 향성을 가지며, 세포 기원에 따라 독성 또는 면역원성 위협이 거의 없기 때문에 이러한 문제의 대부분을 극복할 것이다. EV는 세포 공급원의 페이로드(payload)를 형질감염시키거나 또는 과발현한 후 이러한 세포에 의해 생산된 EV를 정제하는 것을 통해 내인성으로, 또는 기계적 수단(즉 전기천공, 초음파 처리, 동결-해동, 세포 압출) 또는 화학적 수단(즉 리포펙션 또는 염화칼슘 처리)을 사용하여 단리된 EV의 직접 로딩을 통해 외인성으로 로딩될 수 있다. 문헌에 기반하여, 핵산을 로딩하려는 대부분의 시도는 siRNA, miRNA 및 ASO와 같은 짧은 RNA를 수반하고, 이들 페이로드는 외인성 수단, 일반적으로 전기천공을 통해 로딩된다.
1000 개 염기쌍보다 더 큰 핵산을 세포외 소포 내에 로딩하려는 시도는 문제에 봉착하였으며 매우 비효율적이다(Mol Pharm. 2015 October 5; 12(10): 3650-3657). 페이로드의 크기는 정제된 EV의 외인성 로딩에 대한 일반적인 제한 인자이다(PNAS March 24, 2015 112 (12) E1433-E1442)(Mol Pharm. 2015 October 5; 12(10): 3650-3657). 또한, 소포 응집, 수율 또는 기능 상실을 야기하지 않고 큰 핵산을 EV 내에 성공적으로 로딩하는 것은 가능하지 않았다(Mol Pharm. 2015 October 5; 12(10): 3650-3657). 결과적으로, 전형적으로 크기가 1000 개 염기쌍보다 더 큰 DNA 유전자 발현 벡터는 EV에 대한 문제적 운반물(cargo)로 간주된다.
Yang 등(Nature Biomedical Engineering, 보안 http 사이트 doi.org/10.1038/s41551-019-0485-1에서 이용가능)은 외인성 핵산, 특히 큰 메신저 RNA를 세포-분비된 엑소좀 내에 삽입하는 것이 낮은 수율을 야기한다는 것을 설명한다. 이 문제를 해결하기 위해, 그들은 공급원 세포를 플라스미드 DNA로 형질감염시키고 후속적으로 국소적 및 일시적 전기 자극으로 자극하여 전사된 mRNA를 운반하고 펩티드를 표적하는 엑소좀의 방출을 촉진하는 세포-나노천공 방법을 개발하였다. 벌크 전기천공 및 다른 엑소좀-생산 전략과 비교하여, 그들은 엑소좀 분비의 기저 수준이 낮은 세포에서조차 최대 50-배 더 많은 엑소좀 및 엑소좀 mRNA 전사체에서 103-배 초과 증가를 보고하였다.
WO2010/119256은 원형 및 선형화된 pEGFP-NAD를 사용한 엑소좀의 전기천공을 기재한다. 전기천공은 원형 DNA 플라스미드를 DNase I 분해로부터 보호하지만, 선형 DNA는 보호하지 않는 것으로 나타났다. 그들은 일관되지 않은 결과 및 종종 분해로부터 낮은 보호 수준을 달성하였다.
작은 RNA(siRNA 및 miRNA)만이 세포외 소포 내에 성공적으로 로딩되었다는 점에 주목하면, Lamichhane 등(Exogenous DNA Loading into Extracellular Vesicles via Electroporation is Size-Dependent and Enables Limited Gene Delivery. Mol Pharm. 2015 October 5; 12(10): 3650-3657)은 HEK293T 세포, HUVEC 세포 및 인간 중간엽 줄기 세포의 세포외 소포 내에 DNA의 로딩을 조사하였다. 그들은 세포외 소포에서의 로딩 효율 및 용량이 DNA 크기에 따르며, 1000bp 미만 길이의 선형 DNA 분자가 더 큰 선형 DNA 및 플라스미드 DNA와 비교하여 세포외 소포와 더 효율적으로 연관되어 있다는 것을 결정하였으며, 특히 "750-1000bp 범위의 크기 제한 컷오프"에 주목하였다.
Usman 등(Efficient RNA drug delivery using red blood cell extracellular vesicles. Nature Communications Nat Commun　9,　2359 (2018) doi:10.1038/s41467-018-04791-8)은 RNA의 전달을 위한 대규모 양의 적혈구-유래 세포외 소포를 생성하는 전략을 기재한다.
본 발명은 상기 고려사항에 비추어 고안되었다.
본 발명자들은 운반물을 세포외 소포 내에 로딩하는 방법을 개발하였다. 특히, 방법은 DNA와 같은 핵산 운반물을 적혈구-유래 세포외 소포 또는 엑소좀과 같은 세포외 소포 내에 로딩시켰다. 생성된 로딩된 세포외 소포는 운반물을 시험관내 및 생체내에서 표적 세포에 전달하기 위한 요법 및 연구에 유용하다.
본 개시내용의 일 측면에서, 운반물 또는 이러한 세포외 소포 집단이 로딩된 세포외 소포가 제공된다. 운반물은 바람직하게는 핵산이다. 핵산은 DNA, RNA, 또는 다른 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 핵산은 가장 바람직하게는 DNA이다. 핵산은 원형 또는 원형화, 또는 선형일 수 있다. 핵산은 이중 또는 단일 가닥, 바람직하게는 이중 가닥일 수 있다. 일부 측면에서, 핵산은 DNA 미니서클, 플라스미드 또는 나노플라스미드(Aldevron)와 같은 원형화 DNA이다.
핵산 운반물이 단일 가닥인 경우 적어도 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 21000, 22000, 23000, 24000, 25000, 26000, 27000, 28000, 29000 또는 30000 개 염기 중 하나의 길이를 가질 수 있다. 임의적으로, 핵산 운반물이 단일 가닥 DNA(ssDNA)인 경우 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 21000, 22000, 23000, 24000, 25000, 26000, 27000, 28000, 29000 또는 30000 개 염기 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서 단일 가닥 핵산 운반물은 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 개 또는 10000 개 초과의 염기 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있다.
핵산 운반물이 단일 가닥인 경우 250-750, 500-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000, 4000-5000, 5000-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000, 9000-10000, 10000-11000, 250-1000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-5000, 1000-6000, 1000-7000, 1000-8000, 1000-9000, 1000-10000, 1000-11000, 2000-4000, 2000-5000, 2000-6000, 2000-7000, 2000-8000, 2000-9000, 2000-10000, 2000-11000, 3000-5000, 3000-6000, 3000-7000, 3000-8000, 3000-9000, 3000-10000, 3000-11000, 4000-6000, 4000-7000, 4000-8000, 4000-9000, 4000-10000, 4000-11000, 5000-7000, 5000-8000, 5000-9000, 5000-10000, 5000-11000, 6000-8000, 6000-9000, 6000-10000, 6000-11000, 7000-9000, 7000-10000, 또는 7000-11000 개 염기 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서 핵산 운반물이 단일 가닥인 경우 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 21000, 22000, 23000, 24000, 25000, 26000, 27000, 28000, 29000, 30000, 31000, 32000, 33000, 34000, 35000, 36000, 37000, 38000, 39000, 40000, 41000, 42000, 43000, 44000, 45000, 46000, 47000, 48000, 49000 또는 50000 개 염기 중 최대 하나의 길이를 가질 수 있다. 단일 가닥 핵산 운반물은 5000-10000, 5000-15000, 5000-20000, 5000-25000, 5000-30000, 5000-35000, 5000-40000, 10000-15000, 10000-20000, 10000-25000, 10000-30000, 10000-35000, 10000-40000, 15000-20000, 15000-25000, 15000-30000, 15000-35000, 15000-40000, 20000-25000, 20000-30000, 20000-35000, 20000-40000, 25000-30000, 25000-35000, 25000-40000, 30000-35000, 30000-40000, 35000-40000, 35000-45000, 35000-50000, 40000-50000 또는 40000-45000 개 염기 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
핵산 운반물이 이중 가닥인 경우 적어도 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000 또는 20000 개 염기쌍 중 하나의 길이를 가질 수 있다. 임의적으로, 핵산 운반물이 이중 가닥인 경우 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750,11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000 또는 20000 개 염기쌍 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서 이중 가닥 핵산 운반물은 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 개 또는 10000 개 초과의 염기쌍 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있다.
핵산 운반물이 이중 가닥인 경우 250-750, 500-1000,1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000, 4000-5000, 5000-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000, 9000-10000, 10000-11000, 250-1000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-5000, 1000-6000, 1000-7000, 1000-8000, 1000-9000, 1000-10000, 1000-11000, 2000-4000, 2000-5000, 2000-6000, 2000-7000, 2000-8000, 2000-9000, 2000-10000, 2000-11000, 3000-5000, 3000-6000, 3000-7000, 3000-8000, 3000-9000, 3000-10000, 3000-11000, 4000-6000, 4000-7000, 4000-8000, 4000-9000, 4000-10000, 4000-11000, 5000-7000, 5000-8000, 5000-9000, 5000-10000, 5000-11000, 6000-8000, 6000-9000, 6000-10000, 6000-11000, 7000-9000, 7000-10000, 7000-11000, 8000-12000, 8000-13000, 8000-14000, 8000-15000, 9000-13000, 9000-14000, 9000-15000, 9000-16000, 9000-17000, 10000-14000, 10000-15000, 10000-16000, 10000-17000 또는 10000-18000 개 염기쌍 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서 핵산 운반물이 이중 가닥인 경우 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 21000, 22000, 23000, 24000, 25000, 26000, 27000, 28000, 29000, 30000, 31000, 32000, 33000, 34000, 35000, 36000, 37000, 38000, 39000, 또는 40000 개 염기쌍 중 최대 하나의 길이를 가질 수 있다. 이중 가닥 핵산 운반물은 5000-10000, 5000-15000, 5000-20000, 5000-25000, 5000-30000, 5000-35000, 5000-40000, 10000-15000, 10000-20000, 10000-25000, 10000-30000, 10000-35000, 10000-40000, 15000-20000, 15000-25000, 15000-30000, 15000-35000, 15000-40000, 20000-25000, 20000-30000, 20000-35000, 20000-40000, 25000-30000, 25000-35000, 25000-40000, 30000-35000, 30000-40000, 또는 35000-40000 개 염기쌍 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
운반물은 바람직하게는 세포외 소포의 내강 내에 로딩될 수 있다(즉 내강 로딩). 일부 경우에, 운반물의 일부가 세포외 소포 위(예를 들어 세포외 소포 막의 외부 표면 위)에 로딩된다. 세포외 소포 막의 외부 표면 위에 로딩된 운반물 분자는 소포를 뉴클레아제, 예를 들어 DNase 또는 RNase와 접촉시킴으로써 제거될 수 있다.
세포외 소포는 미세소포 또는 엑소좀일 수 있다. 세포외 소포는 임의의 적합한 세포로부터 유래될 수 있지만, 적혈구(RBC)로부터 유래된 세포외 소포가 특히 바람직하다.
본 개시내용에 따른 세포외 소포는 단리된 형태로 제공될 수 있다.
본 개시내용은 핵산 운반물이 로딩된 세포외 소포를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 이러한 조성물에서, 세포외 소포는 소포 당 평균 적어도 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 개 또는 그 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서 DNA 운반물이 로딩된 적혈구 세포외 소포(RBCEV)가 제공된다.
일 구현예에서 적혈구 세포외 소포(RBCEV)의 내강에 적어도 하나의 DNA 운반물을 함유하는 단리된 RBCEV가 제공된다.
DNA 운반물은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
DNA 운반물이 단일 가닥 DNA(ssDNA)인 경우 적어도 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 21000, 22000, 23000, 24000, 25000, 26000, 27000, 28000, 29000 또는 30000 개 염기 중 하나의 길이를 가질 수 있다. 임의적으로, DNA 운반물이 단일 가닥 DNA(ssDNA)인 경우 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 21000, 22000, 23000, 24000, 25000, 26000, 27000, 28000, 29000 또는 30000 개 염기 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서 단일 가닥 DNA 운반물은 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 개 또는 10000 개 초과 염기 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있다.
DNA 운반물이 단일 가닥 DNA(ssDNA)인 경우 하나의 250-750, 500-1000,1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000, 4000-5000, 5000-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000, 9000-10000, 10000-11000, 250-1000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-5000, 1000-6000, 1000-7000, 1000-8000, 1000-9000, 1000-10000, 1000-11000, 2000-4000, 2000-5000, 2000-6000, 2000-7000, 2000-8000, 2000-9000, 2000-10000, 2000-11000, 3000-5000, 3000-6000, 3000-7000, 3000-8000, 3000-9000, 3000-10000, 3000-11000, 4000-6000, 4000-7000, 4000-8000, 4000-9000, 4000-10000, 4000-11000, 5000-7000, 5000-8000, 5000-9000, 5000-10000, 5000-11000, 6000-8000, 6000-9000, 6000-10000, 6000-11000, 7000-9000, 7000-10000, 또는 7000-11000 개 염기의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서 핵산 운반물이 단일 가닥인 경우 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 21000, 22000, 23000, 24000, 25000, 26000, 27000, 28000, 29000, 30000, 31000, 32000, 33000, 34000, 35000, 36000, 37000, 38000, 39000, 40000, 41000, 42000, 43000, 44000, 45000, 46000, 47000, 48000, 49000 또는 50000 개 염기 중 최대 하나의 길이를 가질 수 있다. 단일 가닥 핵산 운반물은 5000-10000, 5000-15000, 5000-20000, 5000-25000, 5000-30000, 5000-35000, 5000-40000, 10000-15000, 10000-20000, 10000-25000, 10000-30000, 10000-35000, 10000-40000, 15000-20000, 15000-25000, 15000-30000, 15000-35000, 15000-40000, 20000-25000, 20000-30000, 20000-35000, 20000-40000, 25000-30000, 25000-35000, 25000-40000, 30000-35000, 30000-40000, 35000-40000, 35000-45000, 35000-50000, 40000-50000, 또는 40000-45000 개 염기 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
DNA 운반물이 이중 가닥 DNA(dsDNA)인 경우 적어도 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750,11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000 또는 20000 개 염기쌍 중 하나의 길이를 가질 수 있다. 임의적으로, DNA 운반물이 이중 가닥 DNA(dsDNA)인 경우 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000 또는 20000 개 염기 쌍 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서 이중 가닥 DNA 운반물은 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 개 또는 10000 개 초과 염기쌍 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있다.
DNA 운반물이 이중 가닥 DNA(dsDNA)인 경우 250-750, 500-1000,1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000, 4000-5000, 5000-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000, 9000-10000, 10000-11000, 250-1000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-5000, 1000-6000, 1000-7000, 1000-8000, 1000-9000, 1000-10000, 1000-11000,2000-4000, 2000-5000, 2000-6000, 2000-7000, 2000-8000, 2000-9000, 2000-10000, 2000-11000, 3000-5000, 3000-6000, 3000-7000, 3000-8000, 3000-9000, 3000-10000, 3000-11000, 4000-6000, 4000-7000, 4000-8000, 4000-9000, 4000-10000, 4000-11000, 5000-7000, 5000-8000, 5000-9000, 5000-10000, 5000-11000, 6000-8000, 6000-9000, 6000-10000, 6000-11000, 7000-9000, 7000-10000, 7000-11000, 8000-12000, 8000-13000, 8000-14000, 8000-15000, 9000-13000, 9000-14000, 9000-15000, 9000-16000, 9000-17000, 10000-14000, 10000-15000, 10000-16000, 10000-17000 또는 10000-18000 개 염기쌍 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서 핵산 운반물이 이중 가닥인 경우 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 21000, 22000, 23000, 24000, 25000, 26000, 27000, 28000, 29000, 30000, 31000, 32000, 33000, 34000, 35000, 36000, 37000, 38000, 39000, 또는 40000 개 염기쌍 중 최대 하나의 길이를 가질 수 있다. 이중 가닥 핵산 운반물은 5000-10000, 5000-15000, 5000-20000, 5000-25000, 5000-30000, 5000-35000, 5000-40000, 10000-15000, 10000-20000, 10000-25000, 10000-30000, 10000-35000, 10000-40000, 15000-20000, 15000-25000, 15000-30000, 15000-35000, 15000-40000, 20000-25000, 20000-30000, 20000-35000, 20000-40000, 25000-30000, 25000-35000, 25000-40000, 30000-35000, 30000-40000, 또는 35000-40000 개 염기쌍 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
DNA 운반물은 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터일 수 있다.
DNA 운반물은 원형(예를 들어 미니서클 또는 플라스미드) 또는 선형일 수 있다. DNA 운반물은 RBCEV의 내강에 있을 수 있다. RBCEV는 바람직하게는 인간 또는 포유동물 적혈구로부터 유래되거나 또는 수득된다. RBCEV는 단리될 수 있다.
본 개시내용의 관련 측면에서 적혈구 세포외 소포(RBCEV)의 내강에 적어도 하나의 핵산(바람직하게는 DNA) 운반물(본원에 기재된 바와 같음)을 함유하는 단리된 RBCEV가 제공된다.
또한 평균적으로, 각 RBCEV에 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 4.0 개 또는 그 이상의 핵산(바람직하게는 DNA) 운반물(본원에 기재된 바와 같음)이 로딩된 단리된 적혈구 세포외 소포(RBCEV) 집단이 제공된다. 또한 각 RBCEV의 내강에 평균적으로, 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 4.0 개 또는 그 이상의 핵산(바람직하게는 DNA) 운반물(본원에 기재된 바와 같음)을 함유하는 단리된 적혈구 세포외 소포(RBCEV) 집단이 제공된다.
본 개시내용의 관련 측면에서 본원에 기재된 바와 같은 복수의 RBCEV 또는 RBCEV 집단을 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물에서, 평균적으로, 각 RBCEV에 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 4.0 개 또는 그 이상의 DNA 운반물이 로딩될 수 있다. 조성물에서, 평균적으로 각 RBCEV에 1.0 내지 4.0 개의 DNA 운반물, 또는 0.1 내지 1.0, 0.5 내지 1.0, 0.5 내지 1.5, 0.5 내지 2.0, 0.5 내지 2.5, 0.5 내지 3.0, 0.5 내지 3.5, 0.5 내지 4.0, 1.0 내지 1.5, 1.0 내지 2.0, 1.0 내지 2.5, 1.0 내지 3.0, 1.0 내지 3.5, 1.0 내지 4.0, 1.5 내지 2.0, 1.5 내지 2.5, 1.5 내지 3.0, 1.5 내지 3.5, 1.5 내지 4.0, 2.0 내지 2.5, 2.0 내지 3.0, 2.0 내지 3.5, 2.0 내지 4.0, 2.5 내지 3.0, 2.5 내지 3.5, 2.5 내지 4.0, 3.0 내지 3.5, 3.0 내지 4.0, 또는 3.5 내지 4.0 개 또는 그 이상의 운반물 중 하나가 로딩될 수 있다. 평균은 산술 평균일 수 있다.
조성물은 약제학적 조성물 또는 약제일 수 있고, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 세포외 소포는 해당 표적 세포에서 유전자의 발현을 야기하기 위해 표적 세포에 핵산을 전달하기 위한 요법, 특히 유전자 요법에 유용할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 세포외 소포, 바람직하게는 RBCEV, 또는 본원에 기재된 바와 같은 복수의 세포외 소포, 바람직하게는 RBCEV를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하여, 대상체를 치료하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서 본원에 기재된 바와 같은 세포외 소포, 바람직하게는 RBCEV, 또는 복수의 세포외 소포, 바람직하게는 RBCEV를 포함하는 조성물은 대상체의 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위해 제공된다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서 대상체의 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물 또는 약제의 제조에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 또는 복수의 세포외 소포, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 하나 또는 복수의 RBCEV의 용도가 제공된다.
대상체는 치료를 필요로 하는 대상체일 수 있다. 대상체를 치료하는 방법은 DNA 운반물의 유전자 서열로부터 단백질 또는 펩티드의 발현에 의해 대상체의 질환 치료를 수반할 수 있다. 치료는 질환의 예방 및/또는 개선을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서 세포외 소포에 핵산 운반물을 로딩하는 방법, 및 이러한 방법을 사용하여 로딩된(또는 이에 의해 제조되거나 또는 수득된) 세포외 소포가 제공된다.
방법은 화학적 형질감염 방법이다. 이러한 방법은 핵산을 형질감염 시약과 접촉시켜, 임의적으로 핵산/형질감염 시약 복합체의 형성을 허용하는 단계; 세포외 소포에 핵산이 로딩되기에 충분한 조건 하에 핵산 및 형질감염 시약을 세포외 소포와 인큐베이션하는 단계; 및 임의적으로 상기 로딩된 세포외 소포를 세척하는 단계를 수반할 수 있다. 특정 방법에서, 핵산 및 형질감염 시약은 세포외 소포와 1 회 초과 인큐베이션된다(즉 핵산 및 형질감염 시약을 세포외 소포와 인큐베이션하는 단계는 적어도 1 회 반복된다).
바람직한 방법에서, 형질감염 시약은 선형 폴리에틸렌이민 하이드로클로라이드(예를 들어 MW 25000 Da 또는 MW 40,000 Da)이다.
본원에 기재된 특정 방법은 세포외 소포의 내강 내에 함유되지 않은 핵산 운반물을 제거하는 단계를 포함한다. 세포외 소포의 내강 내에 함유되지 않은 핵산 운반물을 제거하는 것은 로딩된 세포외 소포를 뉴클레아제, 예를 들어 DNase 또는 RNase와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 로딩된 세포외 소포는 뉴클레아제와의 접촉 전에 헤파린과 접촉될 수 있다.
본원에 기재된 세포외 소포를 로딩하는 방법에서, 핵산 운반물은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 로딩될 세포외 소포는 적혈구 세포외 소포이다. 다른 구현예에서, 세포외 소포는 엑소좀이다.
따라서, 본 개시내용의 일 측면에서 다음을 포함하는, 세포외 소포에 핵산 운반물을 로딩하는 방법이 제공된다:
a. 세포외 소포 내에 로딩될 핵산을 제공하는 단계;
b. 세포외 소포에 핵산이 로딩되기에 충분한 조건 하에, 및 임의적으로 적합한 양의 시간 동안 형질감염 시약의 존재 하에 핵산을 세포외 소포와 접촉시키거나 또는 인큐베이션하는 단계; 및
c. 임의적으로 상기 로딩된 세포외 소포를 세척하는 단계.
바람직한 구현예에서 세포외 소포는 적혈구 세포외 소포, 또는 적혈구 세포외 소포 집단이다.
방법은 단계 b를 1, 2, 3 회 또는 그 이상 반복하는 것을 포함할 수 있다. 단계 b는 세포외 소포 내에 로딩하기 위한 더 많은 핵산을 제공함으로써 단계 c 전에 또는 후에 반복될 수 있다. 본 발명자들은 형질감염 시약의 존재 하에 핵산을 세포외 소포와 접촉시키거나 또는 인큐베이션하는 로딩 단계를 반복하는 것이 세포외 소포에 로딩된 핵산을 양을 개선시킨다는 것을 발견하였다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서 다음을 포함하는, 세포외 소포에 핵산 운반물을 로딩하는 방법이 제공된다:
a. 세포외 소포 내에 로딩될 핵산을 제공하는 단계;
b. 핵산을 형질감염 시약과 접촉시켜 핵산/형질감염 시약 복합체의 형성을 허용하는 단계; 및
c. 세포외 소포에 핵산/형질감염 시약 복합체가 로딩되기에 충분한 조건 하에, 및 임의적으로 적합한 양의 시간 동안 핵산/형질감염 시약 복합체를 세포외 소포와 인큐베이션하거나 또는 접촉시키는 단계; 및
d. 임의적으로 상기 로딩된 세포외 소포를 세척하는 단계.
바람직한 구현예에서 세포외 소포는 적혈구 세포외 소포, 또는 적혈구 세포외 소포 집단이다.
방법은 단계 b-d를 1, 2, 3 회 또는 그 이상의 주기를 통해 반복하는 것을 포함할 수 있다. 이는 세포외 소포 내에 로딩하기 위한 더 많은 핵산을 제공하는 것을 수반할 수 있다. 본 발명자들은 형질감염 시약의 존재 하에 핵산을 세포외 소포와 접촉시키거나 또는 인큐베이션하는 로딩 단계를 반복하는 것이 세포외 소포에 로딩된 핵산의 양을 개선시킨다는 것을 발견하였다.
본 개시내용의 관련 측면에서 다음을 포함하는, 세포외 소포에 핵산 운반물을 로딩하는 방법이 제공된다:
a. 세포외 소포 내에 로딩될 핵산을 제공하는 단계;
b. 핵산을 형질감염 시약과 접촉시켜 핵산/형질감염 시약 복합체의 형성을 허용하는 단계; 및
c. 세포외 소포에 핵산/형질감염 시약 복합체가 로딩되기에 충분한 조건 하에, 및 임의적으로 적합한 양의 시간 동안 핵산/형질감염 시약 복합체를 세포외 소포와 인큐베이션하거나 또는 접촉시키는 단계;
d. 임의적으로 상기 로딩된 세포외 소포를 세척하는 단계;
e. 로딩된 세포외 소포를 추가의 핵산/형질감염 시약 복합체와 접촉시키는 단계; 및
f. 추가의 핵산/형질감염 시약 복합체를 로딩된 세포외 소포와 인큐베이션하거나 또는 접촉시키는 단계.
방법은 다음 단계, 예를 들어 단계 e를 진행하기 전에 단계 b-d를 적어도 1 회 반복하는 것을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서 세포외 소포는 적혈구 세포외 소포, 또는 적혈구 세포외 소포 집단이다.
임의의 상기 방법에서, 형질감염 시약은 임의적으로 MW 25,000Da 또는 MW 40,000Da의 선형 폴리에틸렌이민 하이드로클로라이드일 수 있다.
방법은 세포외 소포의 내강 내에 함유되지 않은 핵산 운반물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이는 로딩된 세포외 소포를 뉴클레아제, 예를 들어 RNase 또는 DNase와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 로딩된 세포외 소포는 뉴클레아제와의 접촉 전에 헤파린과 접촉될 수 있다.
핵산 운반물은 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 여기서 각 핵산 분자는 단일 가닥이고 적어도 250 개 염기, 또는 적어도 2000 개 염기, 또는 2000-11000 개 염기, 또는 그 이상의 길이를 갖는다.
핵산 운반물은 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 여기서 각 핵산 분자는 이중 가닥이고 적어도 250 개 염기쌍, 또는 적어도 2000 개 염기쌍, 또는 2000-11000 개 염기쌍, 또는 그 이상의 길이를 갖는다.
핵산 운반물은 원형, 예를 들어 미니서클 또는 플라스미드일 수 있다. 핵산 운반물은 선형일 수 있다. 핵산 운반물은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
세포외 소포는 미세소포 또는 엑소좀일 수 있다.
본 개시내용에 따른 방법에 의해 제조되거나 또는 수득된, 핵산 운반물이 로딩된 세포외 소포가 또한 제공된다.
본 발명은 조합이 명백하게 허용되지 않거나 또는 명시적으로 회피되는 경우를 제외하고 기재된 측면 및 바람직한 특징의 이러한 조합을 포함한다.
본 발명의 원리를 예시하는 구현예 및 실험이 이제 첨부 도면을 참조하여 논의될 것이다:
도 1. 전기천공된 RBCEV에 의한 293T 세포 내로 mRNA 대 DNA의 전달. (a) 로딩되지 않은 RBCEV, GFP mRNA와 혼합된 RBCEV(RBCEV + mRNA), 및 전기천공에 의해 로딩된 GFP mRNA가 있는 RBCEV(mRNA-eRBCEV)를 293T 세포에 첨가하였다. 48 시간 후, 세포를 현미경으로 이미지화하였고 GFP-양성 세포를 유세포 분석법을 사용하여 정량화하였다. (b) 로딩되지 않은 RBCEV, GFP 미니서클과 혼합된 RBCEV(RBCEV + MC), 및 전기천공에 의해 로딩된 GFP 미니서클이 있는 RBCEV(MC-eRBCEV)를 293T 세포에 첨가하였다. 48 시간 후, 세포를 현미경으로 이미지화하였고 GFP-양성 세포를 유세포 분석법을 사용하여 정량화하였다.
도 2. 화학적으로 형질감염된 RBCEV에 의한 293T 세포 내에 mRNA vs DNA의 전달. RBCEV에 GFP를 암호화하는 미니서클 DNA(MC) 또는 mRNA를 화학적으로 로딩하고 293T 세포에 처리하였다. 48 시간 후, 세포를 현미경으로 이미지화하였고 GFP-양성 세포 유세포 분석법을 사용하여 정량화하였다. GFP-양성 세포의 백분율은 산점도로 표시된다.
도 3. RBCEV와 MSC-exo 사이의 DNA 미니서클 전달 비교. (a) RBCEV 또는 MSC-exo를 GFP를 암호화하는 미니서클 DNA로 화학적으로 형질감염시키고 이후에 293T 세포에 처리하였다(MC-RBCEV 및 MC-MSC-exo). EV의 부재 하에 미니서클 DNA를 대조군(MC 대조군)으로 사용하였다. 48 시간 후, 세포를 현미경으로 이미지화하였고 GFP-양성 세포를 유세포 분석법을 사용하여 정량화하였다. (b) 각 그룹에서 GFP-양성 세포의 백분율. n = 3, * p < 0.001 (스튜던트 t-검정)
도 4. DNA-로딩된 RBCEV의 주사 후 마우스에서 생체내 유전자 발현 평가. 6 주령 암컷 NSG 마우스에 0 일에 꼬리 정맥 주사를 통해 로딩되지 않은 RBCEV(n=3) 또는 루시퍼라제-암호화 MC-로딩된 RBCEV(n=3)를 투여하였다. 루시퍼라제 활성을 x-축으로 표시된 시점에서 루시페린 기질의 주사 후 전신 생물발광 이미지화에 의해 시간 경과에 따라 평가하였다. 표시된 시점에서 마우스의 대표적인 복부 및 등 이미지가 오른쪽에 제시된다.
도 5. 2 개의 상이한 최적화 매개변수 비교.　 로딩되지 않은 RBCEV를 GFP 미니서클 및 형질감염 시약과 30 분 또는 120 분 동안, 1 회 또는 2 회 혼합하였다.　 그런 다음 5 μg, 10 μg, 20 μg 또는 50 μg의 RBCEV를 293T 세포에 첨가하였다.　 48 시간 후, GFP 양성 세포를 유세포 분석법을 사용하여 정량화하였다.　 GFP-양성 세포의 백분율은 산점도로 표시된다.
도 6. 로딩된 RBCEV에서 DNA의 위치 평가.　 처리되지 않은 DNA-로딩된 RBCEV를 20,000x g로 원심분리하였다.　 상청액 분획 및 Triton-X 용해된 펠릿 분획의 전기영동을 SDS-PAGE 겔 상에서 실행하여 DNA가 펠릿 분획에서 단리되었음을 나타내었으며, 이는 RBCEV에 DNA가 로딩되었음을 나타낸다.　 DNA-로딩된 RBCEV가 PEI-Max로부터 DNA를 해리하기 위해 헤파린으로 전처리되었을 때, DNA는 상청액 및 펠릿 분획 둘 다에서 단리되었으며, 이는 RBCEV의 외부 및 내강 로딩을 둘 다 나타낸다.　 용해된 펠릿 분획을 추가 헤파린으로 처리하는 것은 내재화된 DNA가 PEI-Max와의 복합체에 존재함을 나타내었다.
도 7. RBCEV의 DNA 운반물 제한 평가. (a) 크기가 증가하는 DNA 작제물(레인 1- 2.kb; 2 - 6.6kb, 3 - 9.6 kb, 4 - 11.4kb; 5 - 34.2 kb)을 단일 고유 절단 부위의 제한 소화를 통해 선형화하고 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 이들 작제물은 각각 CMV 프로모터에 의해 구동된 copGFP 이식유전자의 단일 카피를 함유한다. (b) RBCEV에 이들 작제물 각각을 로딩하고 HEK293T 세포에 첨가하였다. 48 시간 후 이식유전자 발현을 형광 현미경을 사용하여 검출하였다. (c) 이식유전자 발현 세포를 또한 유세포 분석법으로 분석하였다. 각 DNA 운반물에 대한 대표적인 점 플롯은 게이팅된 영역에 표시된 GFP-양성 세포의 백분율로 묘사된다. 평균 형광 강도는 막대 차트로 플롯팅한다(n=3).
도 8. RBCEV에 로딩된 DNA의 혈청 안정성. 네이키드 MC(미니서클), 형질감염 시약과 복합체화된 MC, 및 RBCEV에 로딩된 MC를 마우스 혈청(M1 내지 M4) 또는 PBS(P1 내지 P4)로 처리하였다. 혈청 단독은 배경 대조군(M0)으로 사용하였다. 회수된 DNA의 백분율은 DNA 질량-강도 표준 곡선에 기반한 겔 밀도계에 의해 정량화하였다(S1 내지 S5).
도 9. DNA-로딩된 RBCEV의 주사 후 마우스에서 생체내 유전자 발현 평가. (a) 6 주령 암컷 NSG 마우스에 0 일에 꼬리 정맥 주사를 통해 로딩되지 않은 RBCEV(n=3) 또는 루시퍼라제-암호화 MC-로딩된 RBCEV(n=3)를 투여하였다. 선 그래프는 x-축으로 표시된 시점에서 루시페린 기질의 주사 후 전신 생물발광 이미지화에 의해 시간 경과에 따라 추적된 루시퍼라제 활성을 묘사한다. 표시된 시점에서 마우스의 대표적인 복부 및 등 이미지는 왼쪽에 제시된다. (b) 최대 34 kb 크기의 DNA 플라스미드의 생체내 전달. 6 주령 암컷 BALB/c 마우스에 0 일에 꼬리 정맥 주사를 통해 로딩되지 않은 RBCEV(n=2) 또는 루시퍼라제-암호화 2 kb, 8 kb 및 34 kb DNA 운반물이 로딩된 RBCEV(n=2)를 투여하였다. 루시퍼라제 활성을 루시페린 기질의 주사 후 전신 생물발광 이미지화에 의해 48 시간 후 평가하였다. 마우스의 전신 발광 이미지는 왼쪽에 제시된다. 상이한 크기의 DNA 운반물로 처리된 마우스의 평균 생물발광 광자 플럭스는 오른쪽에 제시된다.
본 발명의 측면 및 구현예가 이제 첨부 도면을 참조하여 논의될 것이다. 추가의 측면 및 구현예는 당업자에게 명백할 것이다. 이 텍스트에 언급된 모든 문서는 참조로 본원에 포함된다.
세포외 소포
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포외 소포"(EV)는 세포로부터 세포외 환경 내로 방출되는 작은 소포-유사 구조를 지칭한다. 본원에 개시된 특히 바람직한 측면에서, 세포외 소포는 적혈구로부터 유래된다(RBCEV).
세포외 소포(EV)는 실질적으로 50 내지 1000nm 직경의 원형질 막 또는 엔도좀 막의 구체 단편이다. 세포외 소포는 병리학적 및 생리학적 조건 둘 다에서 다양한 세포 유형으로부터 방출된다. 세포외 소포는 막을 갖는다. 막은 이중 층 막(즉 지질 이중층)일 수 있다. 막은 원형질 막으로부터 기원할 수 있다. 따라서, 세포외 소포의 막은 유래되는 세포와 유사한 조성을 가질 수 있다. 본원에 개시된 일부 측면에서, 세포외 소포는 실질적으로 투명하다.
용어 세포외 소포는 엑소좀, 미세소포, 막 미세입자, 엑토좀, 수포 및 세포자멸사체를 포함한다. 세포외 소포는 외향 출아 및 분열을 통해 생산될 수 있다. 생산은 자연적인 과정, 또는 화학적으로 유도되거나 또는 향상된 과정일 수 있다. 본원에 개시된 일부 측면에서, 세포외 소포는 화학적 유도를 통해 생산된 미세소포이다.
세포외 소포는 크기 및 형성 기원에 기반하여 엑소좀, 미세소포 또는 세포자멸사체로 분류될 수 있다. 미세소포는 본원에 개시된 본 발명에 따른 세포외 소포의 특히 바람직한 부류이다. 바람직하게는, 본 발명의 세포외 소포는 원형질 막으로부터 떨어졌고, 엔도좀계로부터 기원하지 않는다. 본원에 기재된 특정 측면에서, 세포외 소포는 엑소좀이 아니다. 본원에 기재된 바람직한 측면에서, 세포외 소포는 원형질 막의 외향 출아 및 분열을 통해 적혈구의 원형질 막으로부터 유래된 적혈구 유래된 세포외 소포이다.
본 개시내용의 일부 측면 및 구현예에서 세포외 소포는 엑소좀이 아니다. 본 개시내용의 일부 측면 및 구현예에서 세포외 소포는 엑토좀이 아니다. 본 개시내용의 일부 측면 및 구현예에서 세포외 소포는 수포가 아니다. 본 개시내용의 일부 측면 및 구현예에서 세포외 소포는 세포자멸사체가 아니다.
본 개시내용의 일부 측면 및 구현예에서 세포외 소포는 미세소포 또는 막 미세입자이다.
본원에 개시된 세포외 소포는 적혈구, 백혈구, 암 세포, 줄기 세포, 수지상 세포, 대식세포 등과 같은 다양한 세포로부터 유래될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 백혈병 세포 및 세포주로부터와 같은 임의의 공급원으로부터의 세포외 소포가 사용될 수 있지만, 세포외 소포는 적혈구로부터 유래된다. 본원에 기재된 바람직한 측면에서, 세포외 소포는 적혈구로부터 유래된다.
미세소포 또는 미세입자는 원형질 막의 직접 외향 출아 및 분열을 통해 발생한다. 미세소포는 전형적으로 엑소좀보다 더 크며, 100-500nm 범위의 직경을 갖는다. 일부 경우에, 미세소포의 조성물은 50-1000nm, 50-750nm, 50-500nm, 50-300nm, 50-200nm, 50-150nm, 101-1000nm, 101-750nm, 101-500nm, 101-300nm, 100-300nm, 또는 100-200nm 범위의 직경을 갖는 미세소포를 포함한다. 바람직하게는, 직경은 100-300nm이다.
예를 들어, 조성물, 약제학적 조성물, 약제 또는 제제에 존재하는 바와 같은 미세소포 집단은 상이한 직경 범위를 갖는 미세소포를 포함할 것이며, 미세소포 샘플 내 미세소포의 중앙 직경은 50-1000nm, 50-750nm, 50-500nm, 50-300nm, 50-200nm, 50-150nm, 101-1000nm, 101-750nm, 101-500nm, 101-300nm, 100-300nm, 100-200nm, 또는 100-150nm 범위일 수 있다. 바람직하게는, 중앙 직경은 50-300nm, 50-200nm, 50-150nm, 100-300nm, 100-200nm, 또는 100-150nm 범위 중 하나이다. 산술 평균 직경은 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 110nm, 120nm, 130nm, 140nm, 150nm, 160nm, 170nm, 180nm, 190nm, 200nm, 임의적으로 ± 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10nm 중 하나일 수 있다.
엑소좀의 직경은 약 30 내지 약 100nm 범위이다. 일부 경우에, 조성물에 존재할 수 있는 바와 같은 엑소좀 집단은 10-200nm, 10-150nm, 10-120nm, 10-100nm, 20-150nm, 20-120nm, 25-110nm, 25-100nm, 또는 30-100nm 범위의 직경을 갖는 엑소좀을 포함한다. 바람직하게는, 직경은 30-100nm이다. 예를 들어 조성물, 약제학적 조성물, 약제 또는 제제에 존재하는 바와 같은 엑소좀 집단은 상이한 직경 범위를 갖는 엑소좀을 포함할 것이며, 샘플 내 엑소좀의 중앙 직경은 10-200nm, 10-150nm, 10-120nm, 10-100nm, 20-150nm, 20-120nm, 25-110nm, 25-100nm, 또는 30-100nm 범위일 수 있다. 바람직하게는, 중앙 직경은 30-100nm이다. 산술 평균 직경은 10nm, 20nm, 30nm, 40nm, 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 110nm, 또는 120nm, 임의적으로 ± 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10nm 중 하나일 수 있다.
세포외 소포 집단은 적어도 10, 100, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 또는 1014 개의 세포외 소포(임의적으로 담체 ml 당) 중 하나를 포함할 수 있다.
엑소좀은 림프구, 수지상 세포, 세포독성 T 세포, 비만 세포, 뉴런, 희소돌기아교세포, 슈완 세포, 및 장 상피 세포를 포함하는 다양한 배양된 세포에서 관찰된다. 엑소좀은 세포질의 거대 낭인 다소포체 내에 위치한 엔도좀 네트워크로부터 기원한다. 이러한 낭은 세포외 환경 내로 방출되기 전에 원형질 막에 융합한다.
세포자멸사체 또는 수포는 1-5μm 범위의 가장 큰 세포외 소포이다. 세포자멸사를 겪는 유핵 세포는 핵 염색질의 응축으로 시작하여, 막 수포형성 및 최종적으로 세포자멸사체를 포함한 EV의 최종 방출의 여러 단계를 거친다.
바람직하게는, 세포외 소포는 인간 세포, 또는 인간 기원의 세포로부터 유래된다. 본 발명의 세포외 소포는 소포 유도제와 접촉된 세포로부터 유도될 수 있었다. 소포 유도제는 칼슘 이온운반체, 리소포스파티드산(LPA), 또는 포르볼-12-미리스타트-13-아세테이트(PMA)일 수 있다. 바람직하게는, 소포 유도제는 칼슘 이온운반체이다.
본원에 기재된 많은 측면에서, 세포는 변형되지 않는다. 특히, 세포외 소포가 유래된 세포는 외인성 핵산 또는 단백질을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 세포는 채혈로 인한 것과 같이 생체외이다. 일부 경우에, 세포는 형질도입, 형질감염, 감염, 또는 달리 변형된 것과 같이 변형되지 않았지만, 생체내 세포와 비교하여 실질적으로 변하지 않았다. 세포가 적혈구인 경우, 세포는 DNA를 함유하지 않을 수 있거나, 또는 실질적으로 DNA를 함유하지 않을 수 있다. 적혈구는 DNA가 없을 수 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서 세포외 소포가 형성되고 단리된 후에 세포외 소포에 핵산 운반물이 로딩된다. 바람직하게는, 세포외 소포는 유래된 세포에 존재하는 핵산, 특히 DNA를 함유하지 않는다. 예를 들어, 세포외 소포가 게놈 또는 미노콘드리아 DNA를 함유하지 않는 것이 바람직하다.
적혈구 세포외 소포(RBCEV)
본원에 개시된 특정 측면에서, 세포외 소포는 적혈구(적혈구)로부터 유래된다. 적혈구는 다수의 이유로 인해 EV의 우수한 공급원이다. 적혈구는 적출되기 때문에, RBCEV는 다른 공급원으로부터의 EV보다 핵산을 덜 함유한다. RBCEV는 내인성 DNA를 함유하지 않는다. RBCEV는 miRNA 또는 다른 RNA를 함유할 수 있다. RBCEV는 종양원성 DNA와 같은 종양원성 물질 또는 DNA 돌연변이가 없다. 적혈구는 세포 소기관(엔도좀 포함)이 결여되어 있기 때문에, RBCEV는 엔도좀으로부터 유래되지 않을 수 있고, 따라서 엑소좀이 아니다. 대신에, RBCEV는 적혈구의 원형질 막의 외향 출아로부터 유래된다. 이와 같이, RBCEV의 막은 적혈구 막의 연구에서 발견된 굽힘 계수와 유사한 약 15 k B T, 예컨대 14 내지 16 k B T, 13 내지 17 k B T, 12 내지 18 k B T의 굽힘 계수를 갖는 것과 같이, 적혈구의 것과 매우 유사한 조성을 갖는다. 굽힘 계수는 Daan Vorselen et al., (2018) Nature Communications 9: 4960에 설정된 바와 같은 소포 강성, 반경 및 구속력을 사용하여 평가될 수 있다.
RBCEV의 단리 및 특성화를 위한 방법은 Usman 등(Efficient RNA drug delivery using red blood cell extracellular vesicles. Nature Communications 9,　2359 (2018) doi:10.1038/s41467-018-04791-8)에 기재되어 있으며, 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
RBCEV는 헤모글로빈 및/또는 스토마틴 및/또는 플로틸린-2를 포함할 수 있다. 그들은 적색일 수 있다. 전형적으로 RBCEV는 돔형(오목한) 표면, 또는 투과 전자 현미경에서 "컵 모양"을 나타낸다. RBCEV는 세포 표면 CD235a를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. RBCEV는 헤모글로빈 α 또는 스토마틴과 같은 적혈구 마커를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 RBCEV는 약 100nm 내지 약 300nm 직경일 수 있다. 일부 경우에, RBCEV의 조성물은 50-1000nm, 50-750nm, 50-500nm, 50-300nm, 50-200nm, 50-150nm, 101-1000nm, 101-750nm, 101-500nm, 101-300nm, 100-300nm, 100-200nm 또는 100-150nm 범위의 직경을 갖는 RBCEV를 포함한다. 바람직하게는, 직경은 50-300nm, 50-200nm, 50-150nm, 100-300nm, 100-200nm, 또는 100-150nm이다.
예를 들어 조성물에 존재할 수 있는 바와 같은 RBCEV 집단은 상이한 직경 범위를 갖는 RBCEV를 포함할 것이며, RBCEV 샘플 내 RBCEV의 중앙 직경은 50-1000nm, 50-750nm, 50-500nm, 50-300nm, 50-200nm, 50-150nm, 101-1000nm, 101-750nm, 101-500nm, 101-300nm, 100-300nm, 100-200nm 또는 100-150nm 범위일 수 있다. 바람직하게는, 중앙 직경은 50-300nm, 50-200nm, 50-150nm, 100-300nm, 100-200nm, 또는 100-150nm이다. 산술 평균 직경은 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 110nm, 120nm, 130nm, 140nm, 150nm, 160nm, 170nm, 180nm, 190nm, 200nm, 임의적으로 ± 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10nm 중 하나일 수 있다.
바람직하게는, RBCEV는 인간 또는 동물 혈액 샘플 또는 1차 세포 또는 고정화된 적혈구 세포주로부터 유래된 적혈구로부터 유래된다. 혈액 세포는 치료될 환자에게 일치된 유형일 수 있고, 따라서 혈액 세포는 A형, B형, AB형, O형 또는 Oh 형액형일 수 있다. 바람직하게는 혈액은 O형이다. 혈액은 레서스 양성 또는 레서스 음성일 수 있다. 일부 경우에, 혈액은 O형 및/또는 레서스 음성, 예컨대 O-형이다. 혈액은 HIV, 겸상 적혈구 빈혈, 말라리아가 없는 것과 같이 질환 또는 장애가 없는 것으로 결정될 수 있었다. 그러나, 임의의 혈액형이 사용될 수 있다. 일부 경우에, RBCEV는 자가조직이며 치료될 환자로부터 수득된 혈액 샘플로부터 유래된다. 일부 경우에, RBCEV는 동종이형이며 치료될 환자로부터 수득된 혈액 샘플로부터 유래되지 않는다.
RBCEV는 적혈구의 샘플로부터 단리될 수 있다. 적혈구로부터 EV를 수득하기 위한 프로토콜은 당업계, 예를 들어 Danesh et al. (2014) Blood. 2014 Jan 30; 123(5): 687-696에 알려져 있다. EV를 수득하는 데 유용한 방법은 적혈구를 포함하는 샘플을 제공하거나 또는 수득하는 단계, 적혈구를 유도하여 세포외 소포를 생산하는 단계, 및 세포외 소포를 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플은 전혈 샘플일 수 있다. 바람직하게는, 샘플의 세포 구성요소가 적혈구가 되도록 적혈구 이외의 세포가 샘플로부터 제거되었다.
샘플의 적혈구는 농축되거나, 또는 백혈구와 같은 전혈 샘플의 다른 구성요소로부터 분할될 수 있다. 적혈구는 원심분리에 의해 농축될 수 있다. 샘플은 백혈구 감소를 겪을 수 있다.
적혈구를 포함하는 샘플은 실질적으로 적혈구만 포함할 수 있다. 세포외 소포는 적혈구를 소포 유도제와 접촉시킴으로써 적혈구로부터 유도될 수 있다. 소포 유도제는 칼슘 이온운반체, 리소포스파티드산(LPA), 또는 포르볼-12-미리스타트-13-아세테이트(PMA)일 수 있다.
RBCEV는 원심분리(초원심분리가 있거나 없음), 침전, 여과 과정 예컨대 접선 유동 여과, 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다(예를 들어 상기 Usman 등 참조). 이 방식으로, RBCEV는 RBC 및 혼합물의 다른 구성요소로부터 분리될 수 있다.
세포외 소포는 다음을 포함하는 방법에 의해 적혈구로부터 수득될 수 있다: 적혈구의 샘플을 수득하는 단계; 적혈구를 소포 유도제와 접촉시키는 단계; 및 유도된 세포외 소포를 단리하는 단계.
적혈구는 백혈구 및 혈장을 함유하는 전혈 샘플로부터 저속 원심분리에 의해 백혈구 제거 필터를 사용하여 분리될 수 있다. 일부 경우에, 적혈구 샘플은 백혈구와 같은 다른 세포 유형을 함유하지 않는다. 다시 말해서, 적혈구 샘플은 실질적으로 적혈구로 이루어진다. 적혈구는 소포 유도제와 접촉하기 전에 PBS와 같은 완충액에 희석될 수 있다. 소포 유도제는 칼슘 이온운반체, 리소포스파티드산(LPA) 또는 포르볼-12-미리스타트-13-아세테이트(PMA)일 수 있다. 소포 유도제는 약 10nM 칼슘 이온운반체일 수 있다. 적혈구는 소포 유도제와 밤새, 또는 적어도 1 시간, 적어도 2 시간, 적어도 3 시간, 적어도 4 시간, 적어도 5 시간, 적어도 6 시간, 적어도 7 시간, 적어도 8 시간, 적어도 9 시간, 적어도 10 시간, 적어도 11 시간, 적어도 12 시간 또는 12 시간 초과 동안 접촉될 수 있다. 혼합물은 RBC, 세포 파편, 또는 다른 비-RBCEV 물질을 제거하고/하거나, 상청액을 약 0.45μm 주사기 필터를 통해 통과시키기 위해 저속 원심분리에 적용될 수 있다. RBCEV는 약 100,000 x g에서 원심분리와 같은 초원심분리에 의해 농축될 수 있다. RBCEV는 적어도 10 분, 적어도 20 분, 적어도 30 분, 적어도 40 분, 적어도 50 분 또는 적어도 1 시간 동안 초원심분리에 의해 농축될 수 있다. 농축된 RBCEV는 차가운 PBS에 현탁될 수 있다. 이들은 60% 수크로스 쿠션 상에 적층될 수 있다. 수크로스 쿠션은 동결된 60% 수크로스를 포함할 수 있다. 수크로스 쿠션 상에 적층된 RBCEV는 100,000g에서 적어도 1 시간, 적어도 2 시간, 적어도 3 시간, 적어도 4 시간, 적어도 5 시간, 적어도 6 시간, 적어도 7 시간, 적어도 8 시간, 적어도 9 시간, 적어도 10 시간, 적어도 11 시간, 적어도 12 시간, 적어도 13 시간, 적어도 14 시간, 적어도 15 시간, 적어도 16 시간, 적어도 17 시간, 적어도 18 시간 또는 그 이상 동안 초원심분리에 적용될 수 있다. 바람직하게는, 수크로스 쿠션 상에 적층된 RBCEV는 100,000g에서 약 16 시간 동안 초원심분리에 적용될 수 있다. 그런 다음 수크로스 쿠션 위의 적색 층을 수집하여, RBCEV를 수득한다. 수득된 RBCEV는 세척, 태깅, 및 임의적으로 로딩과 같은 추가 처리에 적용될 수 있다.
표면 태깅
조성물 내 세포외 소포는 바람직하게는 소포 막에 부착되거나, 또는 이를 통해 삽입되는 태그를 포함할 수 있다.
세포외 소포는 표면에 태그를 가질 수 있다. 태그는 바람직하게는 단백질 또는 펩티드 서열이다. 태그는 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 글리코실화 또는 비오티닐화 단백질 또는 펩티드와 같은 변형된 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 태그는 세포외 소포의 막 단백질에 공유적으로 연결된 것과 같이 세포외 소포에 공유적으로 연결될 수 있다. 태그는 세포외 소포가 형성된 후 세포외 소포에 첨가되었을 수 있다. 태그는 단백질 리가제 인식 서열이거나, 또는 이로부터 유래된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 서열에 의해 세포외 소포에 연결될 수 있다. 예를 들어, 태그는 단백질 리가제 인식 서열에 대해 100% 서열 동일성, 또는 단백질 리가제 인식 서열에 대해 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50% 또는 약 40% 서열 동일성을 포함하는 서열에 의해 세포외 소포에 연결될 수 있다. 아미노산 서열은 LPXT를 포함할 수 있다.
태그는 소포의 외부 표면 상에 제시될 수 있으며, 따라서 소포외 환경에 노출된다.
태그는 외인성 분자일 수 있다. 다시 말해서, 태그는 자연에서 소포의 외부 표면 상에 존재하지 않는 분자이다. 일부 경우에, 태그는 세포외 소포가 유래된 세포 또는 적혈구에 존재하지 않는 외인성 분자이다.
태그는 세포외 소포의 순환 시 안정성, 흡수 효율 및 이용가능성을 증가시킬 수 있다.
일부 경우에, 태그는 세포외 소포 및 순환 시 운반물 및 신체의 기관을 함유하는 세포외 소포를 제시하기 위한 역할을 한다. 펩티드 및 단백질은 표적 세포 기능을 차단/활성화하거나 백신접종을 위한 항원을 제시하는 것과 같이 치료 분자로서 역할을 할 수 있다. 또한 독소의 진단과 같은 바이오마커 검출을 위한 프로브로서 역할을 할 수 있다.
태그는 기능적 도메인 및 단백질 리가제 인식 서열을 함유할 수 있다. 기능적 도메인은 표적 모이어티에 결합할 수 있거나, 겸출할 수 있거나, 또는 치료 효과를 유도할 수 있다. 기능적 도메인은 표적 분자에 결합할 수 있다. 이러한 기능적 도메인을 포함하는 태그는 결합 분자로서 본원에서 지칭될 수 있다. 결합 분자는 표적 분자와 특이적으로 상호작용할 수 있는 것이다. 결합 모이어티를 포함하는 세포외 소포는 운반물 또는 치료제를 표적 분자를 갖는 세포에 전달하는 데 특히 유용할 수 있다. 적합한 결합 분자는 항체 및 항원 결합 단편(때때로 항체 단편으로 알려짐), 리간드 분자 및 수용체 분자를 포함한다. 결합 분자는 관심 표적에 결합할 것이다. 표적은 관심 세포의 표면상에서 발현되는 것과 같이 관심 세포와 연관된 분자일 수 있다. 리간드는 수용체 분자와 같은 표적 세포 상의 생체분자와 복합체를 형성할 수 있다.
적합한 결합 분자는 항체 및 항원 결합 단편을 포함한다. Fab 및 Fab2 단편과 같은 단편은 유전적으로 조작될 수 있는 항체 및 항체 단편과 같이 사용될 수 있다. 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인은 항원 인식에 수반되며, 초기 프로테아제 소화 실험에 의해 처음으로 인식된 사실이다. 설치류 항체의 "인간화"에 의해 추가 확인을 발견하였다. 설치류 기원의 가변 도메인은 생성된 항체가 설치류 모 항체의 항원 특이성을 유지하도록 인간 기원의 불변 도메인에 융합될 수 있다(Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81, 6851-6855). 본원에 개시된 세포외 소포에서 유용한 항체 또는 항원 결합 단편은 표적 분자를 인식하고/하거나 이에 결합할 것이다.
해당 항원 특이성은 가변 도메인에 의해 부여되고 불변 도메인과 무관함이 하나 이상의 가변 도메인을 모두 함유하는 항체 단편의 박테리아 발현을 수반하는 실험으로부터 알려져 있다. 이들 분자는 Fab-유사 분자(Better et al. (1988) Science 240, 1041); Fv 분자(Skerra et al. (1988) Science 240, 1038); VH 및 VL 파트너 도메인이 가요성 올리고펩티드를 통해 연결된 단일 쇄 Fv(ScFv) 분자(Bird et al. (1988) Science 242, 423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85, 5879) 및 단리된 V 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체(dAb)(Ward et al. (1989) Nature 341, 544)를 포함한다. 특이적 결합 부위를 유지하는 항체 단편의 합성에 수반되는 기술의 일반적인 검토는 Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293- 299에서 찾을 수 있다. 본원에서 유용한 항체 및 단편은 인간 또는 인간화, 뮤린, 낙타과, 키메라, 또는 임의의 다른 적합한 공급원으로부터의 것일 수 있다.
"ScFv 분자"란 VH 및 VL 파트너 도메인이 예를 들어 펩티드 또는 가요성 올리고펩티드에 의해 직접 공유적으로 연결되어 있는 분자를 의미한다. Fab, Fv, ScFv 및 sdAb 항체 단편은 모두 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되고 분비될 수 있으며, 따라서 다량의 상기 단편을 용이하게 생산할 수 있다.
전체 항체, 및 F(ab')2 단편은 "2가"이다. "2가"란 상기 항체 및 F(ab')2 단편이 2 개의 항원 조합 부위를 갖는다는 것을 의미한다. 대조적으로, Fab, Fv, ScFv 및 sdAb 단편은 1가이며, 하나의 항원 조합 부위만을 갖는다. 1가 항체 단편은 작은 크기로 인해 태그로서 특히 유용하다.
바람직한 결합 분자는 sdAb일 수 있다. "sdAb"란 1, 2개 또는 그 이상의 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체를 의미한다. sdAb 분자는 때때로 dAb로서 지칭된다.
일부 경우에, 결합 분자는 단일 쇄 항체, 또는 scAb이다. scAb는 공유적으로 연결된 VH 및 VL 파트너 도메인(예를 들어 펩티드, 또는 가요성 올리고펩티드에 의해 직접) 및 임의적으로 경쇄 불변 도메인으로 이루어진다.
다른 적합한 결합 분자는 표적 분자에 대한 친화성을 갖는 리간드 및 수용체를 포함한다. 태그는 세포 표면 수용체의 리간드일 수 있다. 예는 스트렙타비딘 및 비오틴, 아비딘 및 비오틴, 또는 피브로넥틴 및 인테그린과 같은 다른 수용체의 리간드를 포함한다. 작은 크기의 비오틴은 결합된 분자의 생물학적 활성에 거의 내지 전혀 영향을 미치지 않는다. 비오틴 및 스트렙타비딘, 비오틴 및 아비딘, 및 피브로넥틴 및 인테그린은 높은 친화성 및 특이성으로 그들의 쌍에 결합하기 때문에, 결합 분자로서 매우 유용하다. 아비딘-비오틴 복합체는 단백질과 리간드 사이의 가장 강력한 알려진 비공유 상호작용(Kd = 10-15M)이다. 결합 형성은 신속하고, 일단 형성되면, 극한의 pH, 온도, 유기 용매 및 다른 변성제에 의해 영향을 받지 않는다. 스트렙타비딘에 대한 비오틴의 결합은 또한 강력하고, 신속하게 형성되며 생명공학 적용에 유용하다.
기능적 도메인은 치료제를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 치료제는 효소일 수 있다. 이는 세포자멸사 유도제 또는 억제제일 수 있다.
기능적 도메인은 항원 또는 항체 인식 서열을 포함할 수 있다. 태그는 하나 이상의 항원성 펩티드로부터 유래된 하나 이상의 짧은 펩티드를 포함할 수 있다. 펩티드는 항원성 펩티드의 단편일 수 있다. 적합한 항원성 펩티드는 당업자에게 알려져 있다.
기능적 도메인은 검출가능한 모이어티를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 검출가능한 모이어티는 형광 표지, 비색 표지, 광색성 화합물, 자기 입자 또는 다른 화학적 표지를 포함한다. 검출가능한 모이어티는 비오틴 또는 His 태그일 수 있다.
태그는 스페이서 또는 링커 모이어티를 포함할 수 있다. 스페이서 또는 링커는 태그와 단백질 리가제 인식 서열 사이에 배열될 수 있다. 스페이서 또는 링커는 태그의 N 또는 C 말단에 연결될 수 있다. 스페이서 또는 링커는 태그에 의한 표적 결합 활성과 같은 태그의 기능을 방해하거나 또는 지연시키지 않도록 배열될 수 있다. 스페이서 또는 링커는 펩티드 서열일 수 있다. 일부 경우에, 스페이서 또는 링커는 일련의 적어도 1 개, 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 6 개, 적어도 7 개, 적어도 8 개, 적어도 9 개, 적어도 10 개 아미노산, 적어도 11 개 아미노산, 적어도 12 개 아미노산, 적어도 13 개 아미노산, 적어도 14 개 아미노산 또는 적어도 15 개 아미노산이다. 스페이서 또는 링커는 가요성일 수 있다. 스페이서는 복수의 글리신 및/또는 세린 아미노산을 포함할 수 있다.
스페이서 및 링커 서열은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369에 기재되어 있으며, 그 전문이 참조로 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 가요성 링커 서열일 수 있다. 가요성 링커 서열은 링커 서열에 의해 연결된 아미노산 서열의 상대적 이동을 허용한다. 가요성 링커는 당업자에게 알려져 있고, 몇몇은 Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369에서 식별된다. 가요성 링커 서열은 종종 높은 비율의 글리신 및/또는 세린 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 스페이서 또는 링커 서열은 적어도 하나의 글리신 잔기 및/또는 적어도 하나의 세린 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서 링커 서열은 글리신 및 세린 잔기로 이루어진다. 일부 경우에, 스페이서 또는 링커 서열은 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 또는 1-10 개 아미노산의 길이를 갖는다.
스페이서 또는 링커의 포함은 세포외 소포와 태그 모이어티 사이의 단백질 리가제 반응의 효율을 개선시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "태그"는 태그, 스페이서, 및 단백질 리가제 인식 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다.
적합한 단백질 리가제 인식 서열은 당업계에 알려져 있다. 단백질 리가제 인식 서열은 세포외 소포를 태깅하는 방법에 사용되는 단백질 리가제에 의해 인식된다. 예를 들어, 방법에 사용되는 단백질 리가제가 소르타제이면, 단백질 리가제 인식 서열은 소르타제 결합 부위이다. 그러한 경우에, 서열은 LPXTG(여기서 X는 임의의 자연 발생 아미노산임), 바람직하게는 LPETG일 수 있다. 대안적으로, 효소가 AEP1인 경우, 단백질 리가제 인식 서열은 NGL일 수 있다. 단백질 리가제 결합 부위는 펩티드 또는 단백질의 C 말단에 배열될 수 있다.
태그는 태그 자체의 생산 동안, 태깅 방법 동안, 또는 후속 정제를 위해 태그의 정제 또는 처리를 돕기 위해 하나 이상의 추가 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 서열이 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열은 HA 태그, FLAG 태그, Myc 태그, His 태그(예컨대 폴리 His 태그, 또는 6xHis 태그)일 수 있다.
태그는 집단 또는 조성물에서 실질적으로 모든 세포외 소포에 연결될 수 있다. 본원에 개시된 조성물은 세포외 소포의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 또는 적어도 97%가 태그를 포함하는 세포외 소포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세포외 소포의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96% 또는 적어도 97%가 태그를 포함한다. 일부 경우에, 조성물 내의 상이한 세포외 소포는 상이한 태그를 포함한다. 일부 경우에, 세포외 소포는 동일하거나, 또는 실질적으로 동일한 태그를 포함한다.
태그를 혼입하는 방법은 PCT/SG2019/050481, WO 2014/183071 A2, WO 2014/83066 A2 및 US 2014/0030697 A1에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
운반물
본원에 개시된 세포외 소포에는 운반물이 로딩되거나, 또는 함유할 수 있다. 본 개시내용은 특히 DNA(데옥시리보핵산), RNA(리보핵산) 또는 화학적으로 변형된 DNA 또는 RNA를 포함하거나, 또는 이로 이루어진 핵산 운반물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서 운반물은 DNA 또는 화학적으로 변형된 DNA를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 용어 "운반물"은 본원에서 "로드"와 상호교환가능하게 사용된다.
핵산 운반물은 세포외 소포 내에 또는 위에 로딩된 핵산(예를 들어 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드)을 지칭한다. 핵산 운반물은 정상적으로 올리고뉴클레오티드 가닥(이는 임의의 형태, 예를 들어 단일 가닥, 이중 가닥, 초나선형 또는 비-초나선형, 염색체 또는 비-염색체일 수 있음)을 지칭한다. DNA는 다른 분자, 예를 들어 담체, 안정화제, 히스톤, 친유성 제제에 접합되거나, 또는 이와 복합체화될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 임의의 핵산 운반물에 대해 사용될 수 지만, 큰 핵산을 로딩하는 데, 특히 DNA 운반물을 로딩하는 데 특히 유리하다. 핵산은 이중 또는 단일 가닥일 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 이중 가닥이다. 핵산은 원형일 수 있다.
운반물은 바람직하게는 외인성이다. 다시 말해서, 핵산은 새롭게 생성될 때 세포외 소포에, 및/또는 세포외 소포가 유래된 세포에 존재하지 않는다. 운반물은 합성일 수 있으며, 시험관내 또는 가상 환경에서 설계 및/또는 구축되었다.
운반물은 치료용 올리고뉴클레오티드 또는 진단용 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 핵산은 관심 유전자를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 운반물은 부재 유전자를 대체하거나, 결함이 있는 유전자를 복구하거나, 또는 표적 조직에서 치료 효과를 유도하는 기능적 유전자를 암호화할 수 있다. 일부 경우에, 운반물은 리포터 유전자이거나 또는 용이하게 검출가능한 분자를 암호화한다.
운반물은 발현 벡터 또는 발현 카세트 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 벡터 및 발현 카세트는 당업계에 알려져 있다. 본원에 기재된 방법에 유용한 발현 벡터는 표적 세포에서 하나 이상의 핵산 서열의 발현을 용이하게 하는 요소를 포함한다. 본 개시내용에 유용한 발현 벡터는 이식유전자 또는 다른 DNA 서열을 포함할 수 있다.
발현 벡터는 해당 세포에서/이에 의한 발현을 위해 세포 내에 외래 유전 물질을 전달하기 위한 비히클로서 사용되는 올리고뉴클레오티드 분자(예를 들어 DNA 또는 RNA)를 지칭한다. 이러한 벡터는 발현될 유전자 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 종결 코돈 및 발현 인핸서를 포함할 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "작동가능하게 연결된"은 선택된 뉴클레오티드 서열 및 조절 뉴클레오티드 서열(예를 들어 프로모터 및/또는 인핸서)이 조절 서열의 영향 또는 제어 하에뉴클레오티드 서열의 발현을 배치하는 이러한 방식(이에 의해 발현 카세트 형성)으로 공유적으로 연결되는 상황을 포함할 수 있다. 따라서 조절 서열이 뉴클레오티드 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우 조절 서열은 선택된 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 적절한 경우, 이어서 생성된 전사체는 원하는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있다. 원하는 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드는 전장 항체 및 항체 단편, 호르몬, 사이토카인, 효소, 펩티드 항생제, 단백질 전구약물, 마커 단백질, 막 단백질, 수송체 단백질, 리포터 단백질, 성장 인자, 히스톤, 샤페론, 구조적 단백질, 전사 인자, 신호전달 단백질, 핵산-결합 단백질, 지질-결합 단백질, 막 융합 단백질, 세포 접착 단백질 및 응고 인자를 포함한다.
원형 운반물 분자의 예는 미니서클 및 플라스미드를 포함한다.
핵산 운반물은 미니서클일 수 있다. 미니서클은 작은(약 4kbp) 원형 레플리콘이다. 미니서클은 일반적으로 DNA, 정상적으로 이중 가닥을 포함한다. 미니서클은 일부 진핵생물 세포 소기관 게놈에서 자연적으로 발생하지만, 본원에서 바람직한 미니서클은 합성적으로 유래된다. 일부 경우에, 미니서클은 복제 기점을 포함하지 않고, 따라서 세포 내에서 복제되지 않는다. 본원에 개시된 미니서클은 약 1.5kbp, 약 2kbp, 약 2.5kbp, 약 3kbp, 약 3.5kbp, 약 4 kbp, 약 4.5kbp, 약 5kbp, 약 5.5kbp, 약 6kbp, 약 6.5kbp 또는 약 7kbp일 수 있다. 미니서클은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 Gaspar et al., Minicircle DNA vectors for gene therapy: advances and applications. Expert Opin Biol Ther_2015 Mar;15(3):353-79. doi: 10.1517/14712598.2015.996544. Epub 2014 Dec 24를 참조한다.
일부 경우에, 핵산 운반물은 플라스미드이다. 플라스미드는 정상적으로 세포에서 독립적으로 복제될 수 있다. 플라스미드는 일반적으로 DNA, 정상적으로 이중 가닥을 포함하고, 약 1kbp 내지 수 메가염기쌍(Mbp)의 크기 범위일 수 있다. 플라스미드는 복제 서열 기점을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 핵산은 DNA 덤벨이다. DNA 덤벨은 양쪽 끝에 단일 가닥 루프 구조로 공유적으로 폐쇄된 선형 이중 가닥 DNA 발현 카세트를 포함하는 최소 벡터이다. DNA 덤벨은 뉴클레아제에 의해 보조된 효소적 결찰(ELAN)에 의해 합성될 수 있으며, 잘못 결찰된 경로외 생성물의 분자간 결찰 및 소화를 동시에 수반한다. 대안적으로, DNA 덤벨은 발현 카세트를 먼저 화학적으로 변형된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켜 결찰할 준비가 된 DNA 구조를 형성하고, 후속적으로 매우 효율적인 분자내 결찰 반응에 적용하는 2-단계 방법으로 합성될 수 있다(예를 들어 Yu et al., Nucleic Acids Res. 2015 Oct 15; 43(18): e120.).
일부 경우에, 운반물은 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이거나, 또는 이를 암호화하는 핵산이다. 이러한 운반물은 유전자 침묵 방법에 유용할 수 있다. siRNA 또는 ASO는 표적 세포에서 발현된 서열에 상응할 수 있다. 이는 관심 특정 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하거나 또는 향상시키는 데 역할을 할 수 있다. 핵산은 표적 세포에서 발현된 miRNA에 상응하는 siRNA 또는 ASO를 암호화할 수 있다.
운반물은 mRNA를 포함하거나 또는 암호화할 수 있다. mRNA는 이식유전자를 암호화할 수 있다.
일부 경우에 핵산은 소포의 표면 상의 단백질에 결합하는 서열을 함유하도록 변형되지 않는다. 예를 들어, 운반물 핵산은 트랜스 활성화 반응(TAR) 요소를 함유하지 않는다. 일부 경우에, 세포외 소포는 외인성 ARRDC1 단백질 또는 ARRDC1 단백질로부터 유래된 서열과 같은, 변형된 표면 단백질을 함유하도록 변형되지 않는다.
일부 경우에, 핵산 운반물은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 또는 다른 변형을 포함한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드의 혼입, 캡핑 모이어티(예를 들어 3' 캡핑)의 혼입, 고분자량, 비-면역원성 화합물(예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG))에 대한 접합, 친유성 화합물에 대한 접합, 포스페이트 백본에서 치환을 포함하는 화학적 변형은 핵산의 당 위치, 포스페이트 위치, 및/또는 염기 위치에서 화학적 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 하나 이상의 2'-위치 당 변형, 예컨대 2'-아미노(2'-NH), 2'-플루오로(2'-F), 및 2'-O-메틸(2'-OMe)을 포함할 수 있다. 염기 변형은 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 퓨린 변형, 외환식 아민에서 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모- 또는 5-요오도-우라실의 치환, 백본 변형, 메틸화, 비정상적 염기-쌍형성 조합 예컨대 이소염기 이소시티딘 및 이소구아니딘을 포함할 수 있다. 변형은 또한 3' 및 5' 변형, 예컨대 캡핑을 포함할 수 있다. 다른 변형은 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상의 유사체로의 치환, 예를 들어, 비하전된 연결을 갖는 것들(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결을 갖는 것들(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 인터칼레이터가 있는 것들(예를 들어, 아크리딘, 솔라렌 등), 킬레이터를 함유하는 것들(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등), 알킬레이터를 함유하는 것들, 및 변형된 연결을 갖는 것들(예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)과 같은 뉴클레오티드간 변형을 포함할 수 있다. 또한, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 하이드록실 기는 포스포네이트 기 또는 포스페이트 기에 의해 대체되거나; 표준 보호기에 의해 보호되거나; 또는 추가적인 뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 대한 추가적인 연결을 제조하기 위해 활성화될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH 기는 인산화되거나 또는 아민, 약 1 내지 약 20 개 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티, 또는 약 1 내지 약 20 개 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체 또는 다른 친수성 또는 소수성 생물학적 또는 합성 중합체로부터의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 핵산은 잠금 핵산(LNA), 또는 갭머(gapmer)와 같은 변이체 유형의 것일 수 있다.
본 개시내용에 따른 세포외 소포는 소포 당 적어도 0.1 개의 핵산 분자를 포함할 수 있다(예를 들어 로딩될 수 있다). 세포외 소포(들)는 소포 당 핵산의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 개 또는 그 이상의 카피 중 하나를 포함할 수 있다(예를 들어 로딩될 수 있다). 세포외 소포(들)는 소포 당 핵산의 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 개 카피 중 하나를 포함할 수 있다(예를 들어 로딩될 수 있다). 세포외 소포(들)는 소포 당 적어도 0.5 개, 적어도 1 개, 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 3.5 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개 또는 그 이상의 카피를 포함할 수 있다(예를 들어, 로딩될 수 있다). 세포외 소포(들)는 소포 당 핵산의 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 또는 그 이상의 카피를 포함할 수 있다(예를 들어, 로딩될 수 있다). 세포외 소포(들)는 소포 당 핵산의 0.1-1.0, 0.1-2.0, 0.1-3.0, 0.1-4.0, 0.1-5.0, 0.1-6.0, 0.1-7.0, 0.1-8.0, 0.1-9.0, 0.1-10, 0.1-15.0, 0.1-20.0, 0.1-25.0, 0.1-30.0, 0.1-35.0, 0.1-40.0, 0.1-45.0, 0.1-50, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 2-40, 2-45, 2-50, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45, 3-50, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 4-45, 4-50, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-35, 6-40, 6-45, 6-50, 7-8, 7-9, 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-35, 7-40, 7-45, 7-50, 8-9, 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-35, 8-40, 8-45, 8-50, 9-10, 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-35, 9-40, 9-45, 9-50, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 15-20, 15-25, 15-30, 15-35, 15-40, 15-45, 15-50, 20-25, 20-30, 20-35, 20-40, 20-45, 20-50, 25-30, 25-35, 25-40, 25-45, 25-50, 30-35, 30-40, 30-45, 30-50, 35-40, 35-45, 35-50, 40-45, 40-50, 또는 45-50 개 카피 중 하나를 포함할 수 있다(예를 들어 로딩될 수 있다).
소포 당 핵산(들)의 수는 예를 들어, 조성물에 존재하는 바와 같은 EV 집단에 걸쳐 평균 수, 바람직하게는 산술 평균일 수 있다. 소포 당 핵산의 카피 수는 로딩된 핵산 운반물의 총 카피 수를 EV의 총 수로 나누어 결정될 수 있다. 다시 말해서, EV 당 카피 = 핵산의 로딩된 카피 수 / EV 입자의 총 수. 핵산의 카피 수는 qPCR에 의해 결정될 수 있다. EV의 수는 나노입자 추적 분석(예를 들어 Wang et al., ASMMs as a versatile platform for intracellular delivery of macromolecules. Nature Communications 2018 9-960에 기재된 바와 같은 NPA)에 의해 결정될 수 있다. 나노입자 추적 분석(NTA)은 지질의 입자를 시작화하고 분석하는 방법이다. 기술은 초현미경 및 레이저 조명 장치와 함께 사용되어 함께 액체 현탁액의 작은 입자가 브라운(Brownian) 운동 하에 움직이는 것을 시각화하게 한다. 입자에 의해 산란된 빛은 CCD 또는 EMCCD 카메라를 사용하여 다중 프레임으로 캡쳐된다. 그런 다음 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 프레임에서 프레임으로 각 입자의 움직임을 추적한다.
본원에 사용된 바와 같고 달리 나타내지 않는 한, 용어 "평균"은 수학적 평균을 지칭한다. 이는 샘플에서 결정된 핵산의 총량을 해당 샘플의 소포의 총 수로 나눈 것을 지칭할 수 있다
운반물이 조성물의 실질적으로 모든 세포외 소포 내에 로딩되는 것이 바람직할 수 있지만, 본원에 개시된 조성물은 세포외 소포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나가 운반물을 함유하는 세포외 소포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세포외 소포의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 적어도 하나가 운반물을 함유한다. 일부 경우에, 조성물 내 상이한 세포외 소포는 상이한 운반물을 함유한다. 일부 경우에, 세포외 소포는 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 운반물 분자를 함유한다.
핵산 운반물의 크기는 염기(단일 가닥 핵산의 경우) 또는 염기쌍(이중 가닥 핵산의 경우)의 길이 면에서 정의될 수 있다. 이 명세서에서, 핵산 운반물의 단일 또는 이중 가닥 속성이 염기로 주어진 길이(예를 들어 kb(킬로염기)를 나타내지 않은 경우 또한 염기쌍의 동일한 길이(예를 들어 kbp)를 개시한다. 이와 같이 1kb(1000 개 염기)의 길이는 또한 1kbp(1000 개 염기쌍)를 개시한다.
핵산 운반물이 단일 가닥인 경우 적어도 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750 또는 11000 개 염기 중 하나의 길이를 가질 수 있다. 임의적으로, 핵산 운반물이 단일 가닥 DNA(ssDNA)인 경우 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750 또는 11000 개 염기 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서 단일 가닥 핵산 운반물은 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000 개 또는 5000 개 초과 염기 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있다.
핵산 운반물이 단일 가닥인 경우 250-750, 500-1000,1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000, 4000-5000, 5000-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000, 9000-10000, 10000-11000, 250-1000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-5000, 1000-6000, 1000-7000, 1000-8000, 1000-9000, 1000-10000, 1000-11000, 2000-4000, 2000-5000, 2000-6000, 2000-7000, 2000-8000, 2000-9000, 2000-10000, 2000-11000, 3000-5000, 3000-6000, 3000-7000, 3000-8000, 3000-9000, 3000-10000, 3000-11000, 4000-6000, 4000-7000, 4000-8000, 4000-9000, 4000-10000, 4000-11000, 5000-7000, 5000-8000, 5000-9000, 5000-10000, 5000-11000, 6000-8000, 6000-9000, 6000-10000, 6000-11000, 7000-9000, 7000-10000, 또는 7000-11000 개 염기 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서 핵산 운반물이 단일 가닥인 경우 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 21000, 22000, 23000, 24000, 25000, 26000, 27000, 28000, 29000, 30000, 31000, 32000, 33000, 34000, 35000, 36000, 37000, 38000, 39000, 또는 40000 개 염기 중 최대 하나의 길이를 가질 수 있다. 단일 가닥 핵산 운반물은 5000-10000, 5000-15000, 5000-20000, 5000-25000, 5000-30000, 5000-35000, 5000-40000, 10000-15000, 10000-20000, 10000-25000, 10000-30000, 10000-35000, 10000-40000, 15000-20000, 15000-25000, 15000-30000, 15000-35000, 15000-40000, 20000-25000, 20000-30000, 20000-35000, 20000-40000, 25000-30000, 25000-35000, 25000-40000, 30000-35000, 30000-40000, 또는 35000-40000 개 염기 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
핵산 운반물이 이중 가닥인 경우 적어도 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750 또는 11000 개 염기쌍 중 하나의 길이를 가질 수 있다. 임의적으로, 핵산 운반물이 이중 가닥인 경우 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 6250, 6500, 6750, 7000, 7250, 7500, 7750, 8000, 8250, 8500, 8750, 9000, 9250, 9500, 9750, 10000, 10250, 10500, 10750 또는 11000 개 염기쌍 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서 이중 가닥 핵산 운반물은 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000 개 또는 5000 개 초과 염기쌍 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있다.
핵산 운반물이 이중 가닥인 경우 250-750, 500-1000,1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000, 4000-5000, 5000-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000, 9000-10000, 10000-11000, 250-1000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-5000, 1000-6000, 1000-7000, 1000-8000, 1000-9000, 1000-10000, 1000-11000, 2000-4000, 2000-5000, 2000-6000, 2000-7000, 2000-8000, 2000-9000, 2000-10000, 2000-11000, 3000-5000, 3000-6000, 3000-7000, 3000-8000, 3000-9000, 3000-10000, 3000-11000, 4000-6000, 4000-7000, 4000-8000, 4000-9000, 4000-10000, 4000-11000, 5000-7000, 5000-8000, 5000-9000, 5000-10000, 5000-11000, 6000-8000, 6000-9000, 6000-10000, 6000-11000, 7000-9000, 7000-10000, 또는 7000-11000 개 염기쌍 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서 핵산 운반물이 이중 가닥인 경우 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 21000, 22000, 23000, 24000, 25000, 26000, 27000, 28000, 29000, 30000, 31000, 32000, 33000, 34000, 35000, 36000, 37000, 38000, 39000, 또는 40000 개 염기쌍 중 최대 하나의 길이를 가질 수 있다. 이중 가닥 핵산 운반물은 5000-10000, 5000-15000, 5000-20000, 5000-25000, 5000-30000, 5000-35000, 5000-40000, 10000-15000, 10000-20000, 10000-25000, 10000-30000, 10000-35000, 10000-40000, 15000-20000, 15000-25000, 15000-30000, 15000-35000, 15000-40000, 20000-25000, 20000-30000, 20000-35000, 20000-40000, 25000-30000, 25000-35000, 25000-40000, 30000-35000, 30000-40000, 또는 35000-40000 개 염기쌍 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
각 핵산 운반물은 약 0.5kb 내지 약 4kb, 약 0.5kb 내지 약 3kb, 약 0.5kb 내지 약 2.5kb, 약 1kb 내지 약 3kb, 약 1.5kb 내지 약 2.5kb, 또는 약 2kb일 수 있다. 각 핵산 운반물은 적어도 0.5kb, 적어도 1.0kb, 적어도 1.5kb, 적어도 2.0kb, 적어도 2.5kb, 적어도 3kb, 적어도 4kb, 적어도 5kb, 적어도 6kb, 적어도 7kb, 적어도 8kb, 적어도 9kb, 적어도 10kb, 적어도 11kb, 적어도 12kb, 적어도 13kb, 적어도 14kb, 적어도 15kb, 적어도 16kb, 적어도 17kb, 적어도 18kb, 적어도 19kb, 적어도 20kb, 적어도 21kb, 적어도 22kb, 적어도 23kb, 적어도 24kb, 적어도 25kb, 적어도 26kb, 적어도 27kb, 적어도 28kb, 적어도 29kb, 적어도 30kb, 적어도 31kb, 적어도 32kb, 적어도 33kb, 적어도 34kb, 적어도 35kb, 적어도 36kb, 적어도 37kb, 적어도 38kb, 적어도 39kb, 적어도 40kb, 적어도 41kb, 적어도 42kb, 적어도 43kb, 적어도 44kb, 적어도 45kb, 적어도 46kb, 적어도 47kb, 적어도 48kb, 적어도 49kb, 적어도 50kb 또는 그 이상일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서 각 핵산 운반물은 적어도 2kb이다.
일부 경우에, 총 핵산 운반물은 약 0.5kb 내지 약 4kb, 약 0.5kb 내지 약 3kb, 약 0.5kb 내지 약 2.5kb, 약 1kb 내지 약 3kb, 약 1.5kb 내지 약 2.5kb, 또는 약 2kb일 수 일 수 있다. 각 핵산 운반물은 적어도 0.5kb, 적어도 1.0kb, 적어도 1.5kb, 적어도 2.0kb, 적어도 2.5kb, 적어도 3kb, 적어도 4kb, 적어도 5kb, 적어도 6kb, 적어도 7kb, 적어도 8kb, 적어도 9kb, 적어도 10kb, 적어도 11kb, 적어도 12kb 또는 그 이상일 수 있다. 다시 말해서, 해당 운반물은 다중 핵산을 포함하고, 각 소포에서 이들 핵산의 조합된 길이는 평균적으로, 약 0.5kb 내지 약 4kb, 약 0.5kb 내지 약 3kb, 약 0.5kb 내지 약 2.5kb, 약 1kb 내지 약 3kb, 약 1.5kb 내지 약 2.5kb, 또는 약 2kb이다. 각 핵산 운반물은 적어도 0.5kb, 적어도 1.0kb, 적어도 1.5kb, 적어도 2.0kb, 적어도 2.5kb, 적어도 3kb, 적어도 4kb, 적어도 5kb, 적어도 6kb, 적어도 7kb, 적어도 8kb, 적어도 9kb, 적어도 10kb, 적어도 11kb, 적어도 12kb, 적어도 13kb, 적어도 14kb, 적어도 15kb, 적어도 16kb, 적어도 17kb, 적어도 18kb, 적어도 19kb, 적어도 20kb, 적어도 21kb, 적어도 22kb, 적어도 23kb, 적어도 24kb, 적어도 25kb, 적어도 26kb, 적어도 27kb, 적어도 28kb, 적어도 29kb, 적어도 30kb, 적어도 31kb, 적어도 32kb, 적어도 33kb, 적어도 34kb, 적어도 35kb, 적어도 36kb, 적어도 37kb, 적어도 38kb, 적어도 39kb, 적어도 40kb, 적어도 41kb, 적어도 42kb, 적어도 43kb, 적어도 44kb, 적어도 45kb, 적어도 46kb, 적어도 47kb, 적어도 48kb, 적어도 49kb, 적어도 50kb 또는 그 이상일 수 있다.
일부 경우에, 핵산 운반물은 동질적이다(즉 EV의 조성물 중 각 핵산은 유사하거나 또는 실질적으로 동일하다). 일부 경우에, 핵산 운반물은 이질적이다(즉 EV의 조성물 중 핵산은 서로 유사하지 않거나 또는 실질적으로 동일하지 않다).
본 명세서에서, 세포외 소포에 운반물의 로딩은 세포외 소포가 운반물의 담체로서, 예를 들어 세포로의 전달에 유용하도록 세포외 소포 및 운반물을 안정하거나 또는 반-안정한 형태로 회합하는 것을 지칭한다. 운반물 분자는 적어도 2 가지 방식으로 로딩될 수 있다. 한 가지는 운반물이 세포외 소포의 내강에 존재하는 것이다(내강 로딩). 또 다른 것은 운반물이 세포외 소포의 외부 표면, 예를 들어 막에 부착되거나, 접착되거나, 이를 통해 삽입되거나, 또는 이와 복합체화되는 것이다(외부 표면 로딩). 세포외 소포의 외부 표면 위에 로딩된 운반물 분자는 일반적으로 소포를 뉴클레아제, 예를 들어 DNase 또는 RNase와 접촉시킴으로써 제거될 수 있다.
본 발명자들은 내강 및 외부 표면 로딩의 조합에 의해 세포외 소포에 로딩될 수 있고, 이러한 세포외 소포가 시험관내 및 생체내 모두에서 운반물 핵산을 표적 세포에 효율적으로 전달할 수 있음을 나타내었다.
임의적으로, 일부 구현예에서, 로딩에 대한 언급은 단지 내강 로딩일 수 있다. 임의적으로, 일부 다른 구현예에서, 로딩에 대한 언급은 단지 외부 표면 로딩일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 세포외 소포 내에 핵산의 로딩은 생체내 또는 시험관내에서 핵산 분해로부터 내성 부여를 제공할 수 있다. 예를 들어, 핵산 로딩된 세포외 소포는 세포외 소포 내에 로딩되지 않은 핵산과 비교하여 혈청 분해에 대한 증가된 내성을 가질 수 있다. 예를 들어, 핵산 로딩된 세포외 소포는 혈청 분해를 견딜 수 있고, 따라서 핵산, 바람직하게는 기능적 핵산을 혈청과의 접촉의 적어도 30 분, 적어도 1 시간, 적어도 2 시간, 적어도 3 시간, 적어도 4 시간, 적어도 5 시간, 또는 5 시간 초과 동안 유지할 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 핵산 로딩된 세포외 소포와 혈청의 접촉 2 시간 후에도 여전히 검출될 수 있다.
세포외 소포의 로딩 방법
본원에는 세포외 소포를 로딩하는 접근법이 개시된다. 접근법은 세포외 소포(들), 핵산 및 형질감염 시약이 로딩이 발생하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 함께 제공하는 화학적 형질도입을 사용한다.
바람직하게는, 방법은 전기천공을 수반하지 않는다. 바람직하게는, 방법은 나노천공을 수반하지 않는다.
본원에 개시된 방법은 로딩될 핵산을 형질감염 시약과 접촉시키는 단계를 수반한다. 적합한 형질감염 시약은 양이온성 지질 시약과 같은 양이온성 시약을 포함한다. LipofectamineTM 3000TM(ThermoFisher), TurbofectTM(ThermoFisher), LipofectamineTM MessengerMAXTM(ThermoFisher), ExofectTM(System Biosciences), 및 PEIMaxTM(Polysciences, Inc.) 및 jetPEI®(Polyplus transfection)과 같은 예를 들어 25,000 Da 또는 40,000Da의 평균 분자량을 갖는 선형 폴리에틸렌이민 하이드로클로라이드를 포함한 여러 형질감염 시약이 당업계에 알려져 있다.
본원에 개시된 일부 방법은 로딩될 핵산을 제조하는 단계를 수반한다. 제조 단계에서, 세포외 소포 내에 로딩될 핵산은 형질감염 시약과 핵산 사이의 복합체 형성에 적합한 조건 하에 형질감염 시약과 접촉된다. 핵산 및 형질감염 시약은 복합체 형성이 발생하기에 충분한 시간 동안 접촉된다. 바람직하게는, 핵산 및 형질감염 시약은 DNA:PEIMax 복합체와 같은 복합체를 형성한다. 로딩하기 위한 핵산의 제조는 핵산의 농도 또는 희석, 또는 완충제 또는 다른 시약 또는 Opti-MEM 환원 혈청 배지(Gibco)와 같은 배지의 첨가와 같은 추가 단계를 포함할 수 있다. 핵산 및 형질감염 시약은 적어도 1 분, 적어도 2 분, 적어도 3 분, 적어도 4 분, 적어도 5 분, 적어도 6 분, 적어도 7 분, 적어도 8 분, 적어도 9 분, 적어도 10 분, 적어도 11 분, 적어도 12 분, 적어도 13 분, 적어도 14 분, 적어도 15 분, 적어도 16 분, 적어도 17 분, 적어도 18 분, 적어도 19 분, 적어도 20 분 또는 20 분 초과 동안 접촉될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 세포외 소포에 핵산:형질감염 시약 복합체를 로딩하는 단계를 수반할 수 있다. 제조된 핵산:형질감염 시약 복합체는 로딩될 세포외 소포와 접촉된다. 바람직한 방법에서, 세포외 소포는 제조된 핵산:형질감염 시약 복합체에 첨가된다. 다시 말해서, 세포외 소포와의 접촉은 후속적으로 로딩될 핵산 운반물을 형질감염 시약과 접촉시키는 것을 수행한다. 정상적으로, 핵산:형질감염 시약 복합체는 복수의 세포외 소포를 포함하는 조성물과 접촉된다. 핵산:형질감염 시약 복합체 및 세포외 소포는 세포외 소포에 핵산:형질감염 시약 복합체 중 하나 이상이 로딩되게 하기에 충분한 시간 및 적절한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다. 복합체는 세포외 소포 내로 내재화되거나, 또는 달리 세포외 소포의 표면 위와 같은 세포외 소포 위에 로딩될 수 있다. 바람직하게는, 복합체는 세포외 소포 내로 내재화된다.
로딩 단계 후, 세포외 소포는 단리되고/되거나, 세척되고/되거나 농축될 수 있다. 바람직한 방법에서, 세척 단계는 로딩 단계 후 이어진다. 로딩 단계 후, 혼합물은 PBS로 세척될 수 있다. 바람직하게는, 세척은 혼합물을 원심분리하여 세포외 소포를 펠릿화하고, 펠릿을 적절한 완충액(예컨대 PBS)에 재현탁하는 것을 포함한다. 세척 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6 회 또는 그 이상 반복될 수 있다.
세포외 소포에 핵산:형질감염 시약 복합체를 로딩하는 단계는 반복될 수 있다. 다시 말해서, 세포외 소포에 핵산:형질감염 시약 복합체를 로딩하는 단계 후, 세포외 소포를 임의적으로 세척하고 추가의 핵산:형질감염 시약 복합체와 접촉시킬 수 있다. 이러한 방법에서, 핵산:형질감염 시약 복합체가 로딩될 세포외 소포는 로딩된 세포외 소포일 수 있고, 따라서 이미 핵산 운반물을 함유할 수 있다. 대안적으로, 세포외 소포는 로딩 단계에 적용되었지만, 운반물이 로딩되지 않았거나, 또는 낮은 수준의 운반물이 로딩되었을 수 있다. 제2 또는 추가 로딩 단계가 필요한 경우, 세포외 소포는 선행 로딩 단계에서 사용된 바와 같이 동일하거나 또는 상이한 조건 하에 동일하거나 또는 상이한 시간 동안 추가 핵산:형질감염 시약 복합체와 함께 인큐베이션될 수 있다. 제2 또는 추가 로딩 단계 후, 추가 세척 단계가 사용될 수 있다.
바람직하게는, 방법은 세포외 소포를 핵산:형질감염 시약 복합체와 함께 인큐베이션하는 것을 수반하고, 세포를 핵산:형질감염 시약 복합체와 함께 인큐베이션하고 후속적으로 이러한 세포로부터 세포외 소포의 형성을 유도하는 것을 수반하지 않는다.
일부 측면에서, 운반물은 세포외 소포에 로딩된다. 일부 측면에서, 운반물은 세포외 소포의 내강 내에 로딩된다. 일부 측면에서, 운반물은 소포의 막 위, 또는 소포 막의 단백질 위와 같은 세포외 소포 위에 로딩된다. 일부 측면에서, 운반물의 일부는 세포외 소포의 내강 내에 로딩되고 운반물의 일부는 소포의 막 위, 또는 소포 막의 단백질 위와 같은 세포외 소포 위에 로딩된다.
방법은 세포외 소포의 내강 내에 함유되지 않은 핵산 운반물을 제거하는 단계를 수반할 수 있다. 이러한 단계는 로딩된 세포외 소포를 DNAse와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 로딩된 세포외 소포는 핵산 또는 핵산:형질감염 시약 복합체를 해리하기 위해 DNAse와의 접촉 전에 헤파린과 접촉될 수 있다.
조성물
본원에는 세포외 소포를 포함하는 조성물이 개시된다. 조성물은 세포외 소포 집단을 형성하는 복수의 세포외 소포를 포함할 수 있다. 조성물의 예는 약제학적 조성물 및 약제를 포함한다.
조성물은 ml 당 106 내지 1014 개 입자를 포함할 수 있다. 조성물은 ml 당 적어도 105 개 입자, ml 당 적어도 106 개 입자, ml 당 적어도 107 개 입자, ml 당 적어도 108 개 입자, ml 당 적어도 109 개 입자, ml 당 적어도 1010 개 입자, ml 당 적어도 1011 개 입자, ml 당 적어도 1012 개 입자, ml 당 적어도 1013 개 입자 또는 ml 당 적어도 1014 개 입자를 포함할 수 있다.
조성물의 세포외 소포 집단은 직경과 같은 다양한 크기 특성을 가질 것으로 예상될 것이다. 집단은 상이할 수 있는 중간 및 산술 평균 크기를 갖는 크기 분포를 나타낼 수 있다. 이러한 특성은 상기 기재되어 있다.
집단의 모든 소포는 동일한 양의 운반물을 함유할 가능성이 없다. 이와 같이, 세포외 소포 집단은 상기 기재된 바와 같이 소포 당 운반물 분자의 평균 수 면에서 기재될 수 있다.
조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 조성물은 하나 이상의 세포외 소포, 및 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 특정 투여 경로에 의해 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 정맥내, 종양내, 복강내, 피내, 피하, 비강내 또는 다른 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다.
조성물은 완충 용액을 포함할 수 있다. 조성물은 방부제 화합물을 포함할 수 있다. 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산-함유 조성물은 멸균 생리학적으로 허용되는 담체에 저장 및 투여될 수 있으며, 여기서 핵산은 DNA를 세포 내에 도입하는 데 도움이 되는 임의의 제제와 함께 분산된다.
물, PBS, 에탄올, 지질 등을 포함한 다양한 멸균 용액이 조성물의 투여에 사용될 수 있다. DNA의 농도는 치료 용량을 제공하기에 충분할 것이며, 이는 세포로의 수송 효율에 따를 것이다.
조성물은 동결 또는 동결건조된 형태로 제공될 수 있다.
세포외 소포의 치료 방법 및 용도
본원에 기재된 바와 같은 세포외 소포 및 세포외 소포를 포함하는 조성물은 요법, 예를 들어 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용될 수 있다. 특히, 요법은 유전자 요법 또는 유전자 침묵 방법일 수 있다.
투여는 바람직하게는 "치료 유효량"이며, 이는 개체에게 이익을 나타내기에 충분하다. 투여되는 실제 양, 및 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 질환의 속성 및 중증도에 따를 것이다. 치료 처방, 예를 들어 투여량 결정 등은 일반의 및 다른 의사의 책임 내에 있고, 전형적으로 치료될 장애, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 다른 인자를 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins에서 찾을 수 있다.
치료될 대상체는 임의의 동물 또는 인간일 수 있다. 대상체는 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 비인간 포유동물일 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있다. 치료 용도는 인간 또는 동물(수의학적 용도)에 있을 수 있다.
본원에 개시된 세포외 소포는 치료 방법에 유용하다. 특히, 방법은 표적 유전자와 연관된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 표적 유전자는 대상체에서 비정상적으로 발현될 수 있다. 표적 유전자는 건강한 대상체와 비교하여 대상체에서 상향조절 또는 과발현될 수 있다. 표적 유전자는 건강한 대상체와 비교하여 대상체에서 하향조절되거나, 과소발현되거나 또는 발현되지 않을 수 있다. 표적 유전자의 기능적으로 결함이 있는 버전은 대상체, 예를 들어 돌연변이체 형태에서 발현될 수 있다(기능적 야생형에 비해). 방법은 유효량의 로딩된 세포외 소포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 로딩된 세포외 소포는 표적 세포에서 표적 유전자의 발현을 증가, 감소 또는 조절하기 위한 핵산과 같은 치료용 핵산 운반물을 포함한다.
본원에 개시된 세포외 소포는 표적 유전자 발현의 상향조절, 과발현, 하향조절, 과소발현, 또는 결핍(예를 들어 건강한 대상체에 비해) 또는 건강한 대상체에 비교하여 대상체에서 표적 유전자의 기능적으로 결함이 있는 카피 또는 버전의 발현에 의해 야기되는 것과 같은 유전적 기반이 있는 질환 또는 장애(유전 장애)의 치료에 특히 유용하다.
RBCEV는 CNS, 폐, 간, 비장 또는 골수의 장애를 치료하는 데 특히 유용할 수 있다. 일부 경우에, RBCEV는 췌장 또는 심장의 장애를 치료하는 데 유용할 수 있다. 표적 세포 / 조직은 치료될 장애에 따른다.
운반물은 표적 유전자의 발현을 억제 또는 향상시키도록 설계된 핵산일 수 있거나, 또는 특정 유전자의 발현을 침묵시키거나, 또는 이의 서열을 교정하기 위해 유전자 편집을 수행하도록 설계될 수 있다. 운반물은 표적 세포에서 과소발현되거나 또는 잘못 발현된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 핵산은 발현되지 않거나, 과소발현되거나, 또는 잘못 발현되어, 이에 의해 표적 세포에서 잘못된 단백질 기능을 복구하거나 또는 보상하는 기능적 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있다.
본원에 기재된 로딩된 EV의 투여는 환자에서 핵산 운반물에 의해 암호화된 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드의 발현을 초래할 수 있다. 예를 들어, 환자에서 DNA 및/또는 이식유전자의 발현. 본원에 기재된 로딩된 EV의 투여는 환자의 표적 세포에서 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드의 발현을 초래할 수 있다. 본원에 기재된 로딩된 EV의 투여는 환자의 CNS, 폐, 간, 비장, 골수, 췌장 또는 심장 세포의 세포에서 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드의 발현을 초래할 수 있다.
본원에 기재된 세포외 소포 및 조성물은 전신, 종양내, 복강내, 비경구, 정맥내, 동맥내, 피내, 피하, 근육내, 유리체내, 망막하, 경구 및 비강을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 경로에 의해 투여되거나, 또는 투여를 위해 제형화될 수 있다. 약제 및 조성물은 유체 또는 고체 형태로 제형화될 수 있다. 유체 제형은 인간 또는 동물 신체의 선택된 영역에 주사에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다.
세포외 소포는 치료될 세포 또는 조직의 표면 상의 분자에 결합하는 태그를 포함할 수 있다. 태그는 치료될 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있다. 세포외 소포는 치료용 운반물을 포함할 수 있다. 치료용 운반물은 표적 세포에서 효적 유전자와 상호작용하기 위한 비내인성 물질일 수 있다.
세포외 소포는 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여 치료될 병태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 운반물이 로딩된 세포외 소포는 해당 운반물을 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다. 다른 경우에 방법은 생체내 방법이다. 용어 "시험관내"는 실험실 조건 또는 배양물에서 재료, 생물학적 물질, 세포 및/또는 조직을 사용한 실험을 포함하도록 의도되는 반면 용어 "생체내"는 온전한 다세포 유기체를 사용한 실험 및 절차를 포함하도록 의도된다. "생체외"는 유기체의 외부, 예를 들어 유기체로부터 취한 조직(예를 들어 전체 기관) 또는 세포 상에 있을 수 있는 인간 또는 동물 신체의 외부에 존재하거나 또는 발생하는 것을 지칭한다.
키트
또한 본원에는 세포외 소포를 포함하는 키트가 개시된다. 키트는 하나 이상의 세포외 소포, 발현 벡터, DNA 미니서클, 플라스미드 또는 RNA와 같은 핵산, 및 PEIMax와 같은 형질감염 시약으로부터 선택된 하나 이상의 구성요소를 포함할 수 있다. 키트는 설명서 및/또는 본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 완충제 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
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특정한 형태로 또는 개시된 기능을 수행하기 위한 수단, 또는 적절한 경우, 개시된 결과를 수득하기 위한 방법 또는 과정 면에서 표현된 전술된 설명, 또는 하기 청구범위, 또는 첨부 도면에 개시된 특징은 별도로, 또는 이러한 특징의 임의의 조합으로, 이의 다양한 형태로 본 발명을 실현하는 데 활용될 수 있다.
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실시예
실시예 1
본 발명자들은 적혈구 세포외 소포(RBCEV)와 같은 세포외 소포에 의한 DNA 및 다른 핵산의 효율적인 시험관내 및 생체내 전달을 위한 방법을 설명한다. 본 발명자들은 GFP-암호화 DNA 미니서클(MC)이 GFP-암호화 mRNA와 비교하여 크기 및 분자량이 훨씬 더 크지만 GFP mRNA와 비교하여 더 큰 효율로 RBCEV 내에 로딩되고 세포에 효과적으로 전달될 수 있음을 발견하였다. 게다가, 본 발명자들은 DNA 전달이 RBCEV의 고유한 특징이며 엑소좀을 사용하려고 시도할 때 매우 비효율적임을 발견하였다.
이론에 얽매이지 않지만, 본 발명자들은 큰 DNA 운반물을 로딩하는 이 능력이 RBCEV의 고유한 막 특성에 기인할 수 있다는 가설을 제기한다. RBCEV는 매우 가요성인 RBC 막에 가까운 굽힘 계수를 나타내는 것으로 보고되었다(Vorselen et al., Nature Communications 9, 4960 (2018)). 반면에, 엑소좀은 막 상의 콜레스테롤, 강글리오시드 및 스핑고미엘린에 풍부한 고농도의 지질 뗏목으로 인해 매우 단단한 소포이다(He et al., Theranostics., Exosome Theranostics: Biology and Translational Medicine. 2018; 8(1): 237-255). 이 증거는 RBCEV와 엑소좀 막 사이의 가능한 구조적 차이를 시사하며, 이는 DNA 운반물이 로딩될 능력의 차이를 설명할 수 있다. 본 발명자들은 또한 DNA 로딩된 RBCEV의 전신으로 주사된 볼루스가 마우스에서 장기간 유전자 발현을 야기함을 나타내었으며, 이는 RBCEV/DNA 조성물이 신규 비바이러스 유전자 요법 실체(entity)로서 역할을 하고 잠재적으로 AAV와 같은 오늘날의 가장 진보된 유전자 요법 벡터와 연관된 한계를 우회한다는 것을 입증한다.
아래에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 미니서클 DNA(MC)이 로딩된 RBCEV가 mRNA가 로딩된 RBCEV보다 더 많은 세포를 형질감염시켰음을 관찰하였다. 이 효과는 사용된 로딩 방법과 무관하였으며, 전기천공 또는 화학적 형질감염이 로딩 방법으로 사용되었을 때 MC가 mRNA보다 더 효율적으로 형질감염된다. 본 발명의 데이터는 DNA 미니서클이 mRNA보다 더 높은 효율로 로딩되고, 표적 세포에 더 효과적으로 전달될 수 있음을 시사한다.
본 발명자들은 또한 화학적 형질감염을 사용하여 로딩된 RBCEV가 전기천공을 사용하여 로딩된 RBCEV보다 세포를 형질도입하는 데 더 효과적이었음을 관찰하였다. 이는 핵산이 mRNA이든 또는 DNA 미니서클이든 마찬가지다. 이러한 데이터는 본 발명의 화학적 형질감염 방법이 전기천공보다 더 높은 수준의 운반물을 초래하였음을 시사한다. 흥미롭게도, RBCEV에 운반물을 2 회 로딩함으로써, 세포는 1 회만 로딩된 RBCEV보다 훨씬 더 효율적으로 형질감염되었다.
흥미롭게도, 엑소좀을 사용하여 핵산, 특히 siRNA를 표적 세포에 전달할 가능성에 대한 많은 문헌이 있지만, 본 발명의 데이터는 MC가 로딩된 RBCEV가 MC가 로딩된 엑소좀보다 더 많은 세포를 형질감염시킴을 시사한다. 이들 데이터는 RBCEV가 공여자 혈액으로부터 다량으로 정제될 수 있고, 이전에 일반적으로 EV에 대해 불가능하고 비면역원성이라고 생각되었던 다량의 크기가 큰 핵산(DNA 발현 벡터 및 mRNA)이 용이하게 로딩될 수 있기 때문에, 핵산 전달 비히클로서 RBCEV의 임상 용도를 시사한다.
방법
재료 및 시약
GFP mRNA는 TriLink Biotechnologies로부터 구입하였고 GFP 및 루시퍼라제 미니서클 DNA(MC)는 MC-이지 키트(System Biosciences)를 사용하여 생산하였다. 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포 엑소좀(MSC-exo)은 System Biosciences(SBI)로부터 구입하였다. 293T 세포는 ATCC로부터 구입하고 37℃ CO2 인큐베이터에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 듈베코의 변형된 이글 배지에서 배양하였다.
인간 RBC 및 MSC로부터 EV의 정제 및 정량화
전혈 샘플은 Innovative Research, Inc를 통해 사전 동의한 건강한 공여자로부터 수득하였다. RBC를 원심분리 및 백혈구 제거 필터(Terumo Japan)를 사용하여 혈장 및 백혈구로부터 분리하였다. 단리된 RBC를 PBS에 희석하고 10mM 칼슘 이온운반체(Sigma-Aldrich)로 밤새 처리하였다. EV를 정제하기 위해, RBC 및 세포 파편을 4℃에서 600g에서 20 분, 1600g에서 15 분, 3700g에서 15 분, 및 10,000g에서 30 분 동안 원심분리하여 제거하였다. 상청액을 0.45 μm 필터를 통해 통과시켰다. EV를 4 정용부피(diavolume)의 PBS로 세척하고 접선 유동 여과(Pall Minimate)에 의해 농축한 후, 100 kD MWCO 아미콘 초원심분리 유닛(Merck Millipore)을 사용하여 추가 농축하였다. 정제된 RBCEV를 -80℃에서 저장하였다. EV를 헤모글로빈 검정 키트(Abcam)를 사용하여 헤모글로빈 함량을 평가함으로써 정량화하였다.
RBCEV의 핵산 로딩
RBCEV의 전기천공은 0.4 cm 큐벳을 사용하여 150 μF의 고정 정전용량에서 지수 프로그램인 GenePulser Xcell 전기천공기(BioRad)를 사용하여 수행하였다. 75 μg RBCEV를 4% 트레할로스를 함유하는 OptiMEM(ThermoFisher Scientific)에 희석하고 1.5 μg의 GFP MC 또는 GFP mRNA와 200 μl의 최종 부피로 혼합하였다. 100 μl EV 혼합물의 분취량을 각 큐벳에 첨가하고 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 전기천공을 400 V에서 수행하였다.
일부 실험에서, 1 μg의 mRNA 또는 DNA를 Opti-MEM (ThermoFisher) 중 5-7 μl의 화학적-기반 형질감염 시약(PEI Max(Polysciences, Inc.), 선형 폴리에틸렌이민 하이드로클로라이드(MW 40,000))에 첨가하고 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 복합체 형성을 용이하게 하였다. 혼합물을 50 μg의 세척된 RBCEV에 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. 반응물을 회전시키면서 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, 얼음에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 그후에, 로딩된 RBCEV를 21,000 x g에서 펠릿화하고 PBS로 2 회 세척하였다. MSC-exo와의 비교를 수반하는 실험을 위해, 상기 기재된 바와 동일한 방식으로 MSC-exo에 DNA를 로딩하고, 일관성을 위해 로딩된 RBCEV 및 MSC-exo를 둘 다 제조업체의 지침에 따라 ExoQuick-TC(SBI)로 정제하였다.
RBCEV에 로딩된 핵산의 카피 수 평가
qRT-PCR 및 qPCR을 각각 알려진 양의 mRNA 및 DNA에 대해 수행하였고, Ct 값을 카피 수에 대해 플롯팅하여 표준 곡선을 생성하였다. mRNA-표지된 RBCEV로부터의 총 RNA를 트리졸(ThermoFisher)을 사용하여 추출하고 제조업체의 프로토콜에 따라 qScript cDNA 합성 키트(Quantabio)를 사용하여 cDNA로 전환하였다. DNA MC-로딩된 RBCEV로부터의 총 DNA를 DNeasy 혈액 및 조직 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하였다. qPCR을 cDNA/DNA 샘플에 대해 수행하여 카피 수를 결정하였다. RBCEV를 나노입자 추적 분석 원리에 기반한 ZetaView(Particle Metrix)로 정량화하였다.
유세포 분석법 분석
FACS 완충액(0.5% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS) 중 세포의 유세포 분석법을 MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행하고 Flowjo V10(Flowjo, USA)을 사용하여 분석하였다. 293T 세포를 초기에 FSC-A 및 SSC-A에 기반하여 게이팅하여 파편 및 사멸된 세포(낮은 FSC-A)를 제외하였다. 세포를 FSC-너비 vs. FSC-높이에 기반하여 추가로 게이팅하여, 이중체 및 응집체를 제외하였다. 후속적으로, GFP-양성 세포를 대조군으로서 처리되지 않은 세포를 사용하여 FITC 채널에서 게이팅하였고, GFP-양성 세포의 백분율 및 평균 형광 강도를 평가하였다.
DNA-로딩된 RBCEV의 혈청 안정성
기재된 바와 같은 형질감염 시약을 사용하여 RBCEV에 MC를 로딩하였다. 1-1.2 mL의 전혈을 심장 천자를 통해 6 주령 암컷 Balb/C 마우스로부터 수집하였다. 응고된 전혈을 3,000 g에서 10 분 동안 원심분리하여 혈청을 단리하였다. 혈청 또는 대조군(PBS) 처리를 100 μL 혈청 또는 PBS를 80 μg의 MC, 또는 동등한 양의 형질감염 시약-복합체화된 MC, 또는 로딩된 RBCEV와 함께 교반하면서 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션함으로써 수행하였다. 인큐베이션 후, 로딩된 RBCEV를 21,000 g에서 30 분 동안 스핀 다운시켜 펠릿 및 상청액을 수집하였다. EDTA를 5 mM의 최종 농도로 모든 혈청-처리된 샘플에 첨가하였다. EDTA가 있는 샘플을 75℃에서 5 분 동안 가열하여 DNAse를 비활성화하였다. 샘플 및 DNA 표준을 DNA 로딩 염료와 혼합하고 전기영동을 위해 1% 아가로스 겔 위에 로딩하였다.
DNA-로딩된 RBCEV의 전신 생체내 투여
모든 동물 실험은 싱가포르 A*STAR 생물 자원 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인된 실험 프로토콜에 따라 수행하였다. 6 주령 암컷 BALB/c 또는 NSG 마우스는 The Jackson Laboratory(ME, US)에서 구입하였다. 화학적 형질감염에 의해 RBCEV에 루시퍼라제-암호화된 플라스미드를 로딩하였다. RBCEV에 로딩된 DNA 양을 겔 밀도계로 정량화하였다. 로딩되지 않은 대조군 및 DNA-로딩된 RBCEV를 꼬리 정맥 주사에 의해 단일 200 μl 볼루스로 전신으로 투여하였다. 루시퍼라제의 발현을 검출하기 위해, 전신 생물발광 이미지를 150 mg/kg D-루시페린(PerkinElmer)의 i.p. 주사 후 15 분에 IVIS 스펙트럼 시스템(PerkinElmer)을 사용하여 표시된 시점에서 캡쳐하였다. 시각적 출력은 최대값이 적색이고 최소값이 짙은 청색인 거짓 컬러 이미지에 따라 초당 방출된 광자의 총 수로 나타낸다.
결과
RBCEV에 의한 DNA 전달은 mRNA와 비교하여 더 효율적이었다
본 발명자들은 RBCEV에 핵산의 2 가지 주요 부류인 원형 이중 가닥 DNA(미니서클, MC) 및 선형 단일 가닥 mRNA가 로딩되는 능력을 평가하였다. GFP MC(2000 bp) 및 GFP mRNA(1000 개 염기)를 전기천공에 의해 RBCEV에서의 로딩 효율에 대해 평가하였다. 이 비교에서, MC(dsDNA)는 mRNA(ssRNA)와 비교하여 분자량이 ~4x 더 크다. 따라서, 원칙적으로, 더 큰 MC 페이로드를 RBCEV 내에 로딩하는 것이 더 어려워야 한다. GFP MC 및 GFP mRNA를 전기천공에 의해 RBCEV 내에 로딩하였다. 본 발명자들은 mRNA-로딩된 RBCEV로 처리된 세포에서, GFP 발현 수준이 유세포 분석법에 의해 검출된 만큼 충분히 높지 않았다는 것을 관찰하였다(도 1a). 그러나, DNA MC-로딩된 RBCEV로 처리된 세포에서, 세포의 ~3%가 GFP에 대해 양성이었다(도 1b).
본 발명자들은 또한 RBCEV를 시험관내에서 세포에 처리하기 전에 DNA 및 mRNA로 화학적으로 형질감염시켰다. 도 2a에 예시된 바와 같이, 이 운반물 로딩 방법을 사용하여, 본 발명자들은 mRNA와 비교하여 RBCEV 내에 더 많은 DNA 카피가 로딩된다는 것을 관찰하였다. 나노입자 추적 분석에 의해 측정된 EV 입자의 총 수에 대해 qPCR에 의해 측정된 cDNA 카피의 총 수를 나눔으로써, 본 발명자들은 GFP mRNA의 1.16 개 카피가 각 소포 내에 로딩되었음을 계산하였으며, 이는 소포 당 로딩된 GFP DNA MC의 3.74 개 카피와 비교하여 상당히 적었다(데이터는 제시되지 않음). 293T 세포가 이러한 로딩된 소포로 처리되었을 때, 본 발명자들은 세포가 mRNA 운반물과 비교하여 DNA MC 운반물로 처리되었을 때 48 시간에 녹색 형광에 대해 양성이 되는 더 큰 백분율의 세포를 관찰하였다(99.5% vs 73.5%, 도 2).
RBCEV는 MSCEV와 비교하여 DNA 운반물에 대한 더 나은 전달 비히클이다
MSC는 엑소좀의 다산성 생산자이며 MSC에 의해 생산된 엑소좀이 세포의 면역조절 특성을 유지하고, 따라서 이러한 엑소좀이 환자에게 동종이형으로 투여될 수 있음이 당분야에 보고되어 있다. 이러한 이유로 인해, MSC-exo는 광범위한 치료용 페이로드를 위한 신규 약물 전달 비히클로서 활발히 탐구되고 있다. 그러나, 치료용 인간 용량의 EV를 수득하기 위한 광범위한 세포 배양물과 같은 MSC-exo의 임상 사용은 몇가지 문제를 동반되고, 현재까지 일반적으로 큰 핵산 페이로드(mRNA 또는 DNA 발현 벡터)를 EV 내에 로딩하는 데 거의 성공하지 못했으며, 따라서 유전자 전달에서 적용이 제한되고 있다. 본 발명자들은 상기 언급된 화학적 형질감염 방법을 사용하여 MSC-exo에 대한 RBCEV의 DNA 로딩 용량을 비교하려 하였다. 동일한 양의 RBCEV 및 MSC-exo에 동일한 양의 GFP-암호화 DNA MC를 로딩하였고 일관성을 위해 2 가지 유형의 소포를 ExoQuick을 사용하여 정제하였다. 본 발명자들은 DNA-로딩된 RBCEV로 처리된 293T 세포가 DNA-로딩된 MSC-exo에 대해 26.1% 양성인 것과 비교하여 GFP에 대해 59.3% 양성이었음을 발견하였다(도 3, a 및 b). 이는 RBCEV가 안전성 및 생체적합성, 단일 혈액 단위로부터 수득가능한 높은 수율, 뿐만 아니라 큰 핵산으로 로딩될 용이성을 고려하면, 이상적인 비바이러스 유전자 요법 비히클임을 시사한다.
RBCEV는 광범위한 크기의 DNA 운반물을 전달할 수 있다
유전자 요법은 주로 바이러스 벡터에 의해 매개되며, AAV는 생체내 유전자 요법의 선두에 있다. 그러나, 면역원성 및 제조에 대한 문제 이외에도, 바이러스 벡터 사용의 다른 제한 중 하나는 페이로드 용량이다. AAV 게놈의의 용량은 4.7kb이고 이는 삽입될 수 있는 이식유전자의 크기를 크게 제한한다. 본 발명자들은 RBCEV에 의해 전달될 수 있는 DNA 운반물의 크기 제한을 식별하려 하였다. CMV 프로모터에 의해 구동된 copGFP 이식유전자의 단일 카피를 각각 함유하는 다양한 크기(2.4, 6.6, 9.6, 11.4 및 34.2 kb- 도 7a 참조)의 동일 질량의 DNA 운반물을 RBCEV 내에 화학적으로 로딩하고 동일한 양의 로딩 및 세척된 RBCEV를 배양물 중 293T 세포에 첨가하였다. 48 시간 이후, 세포를 형광 현미경으로 이미지화한 후 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 성공적으로 형질감염된 형광 세포를 모든 DNA 운반물에 대해 관찰하였다. 흥미롭게도, GFP-양성 세포의 백분율 뿐만 아니라 평균 형광 강도는 운반물의 크기가 증가함에 따라 감소되었고(2.4kb 운반물의 경우 99.7% 양성 세포 및 34.2 kb 운반물의 경우 59.2% 양성 세포로 감소), 이는 크기에 따라 페이로드의 상이한 카피 수를 함유하는 동일 질량의 DNA를 전달한 결과일 가능성이 있다(도 7b 및 7c). 그럼에도 불구하고, 결과는 RBCEV가 광범위한 크기의 DNA 운반물을 전달할 수 있음을 시사한다.
RBCEV는 혈청 분해로부터 로딩된 DNA를 보호한다
DNA-로딩된 RBCEV의 전신 투여를 수반하는 적용의 경우, 로딩된 DNA 운반물이 순환 시 뉴클레아제의 활성에 대해 안정적임을 보장하는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명자들은 MC, 형질감염 시약과 복합체화된 MC, 및 MC-로딩된 RBCEV를 Balb/C 마우스로부터의 혈청으로 처리함으로써 로딩된 DNA의 안정성을 평가하고 겔 전기영동을 사용하여 잔류 DNA를 분석하였다(도 5). 레인 M0에서 관찰된 바와 같이, 사용된 혈청 샘플로부터 오염된 DNA는 없다. 혈청 내 DNAse는 네이키드 DNA(레인 M4), 뿐만 아니라 형질감염 시약과 복합체화된 DNA(레인 M3)를 분해할 수 있었다. 네이키드 DNA도 형질감염 시약과 복합체화된 DNA도 PBS-처리된 대조군에서 관찰되지 않았다(각각 레인 P4 및 P3). 그러나, 혈청 인큐베이션 후에도, 로딩된 RBCEV는 PBS-처리된 대조군과 비교할 때 온전한 DNA 페이로드의 93%를 유지하였다(레인 M2 vs P2). 이는 RBCEV가 혈청 뉴클레아제 분해로부터 DNA 페이로드를 보호할 수 있었고 혈청 안정성에 대한 어떠한 우려 없이 전신으로 투여될 수 있음을 시사한다.
마우스에서 장기간 유전자 발현을 위한 DNA 운반물의 생체내 전달
유전자 요법 비히클에 대한 핵심 특징 중 하나는 생체내에서 유전자를 전달하고 표적 조직에서 지속된 장기간 유전자 발현을 부여하는 능력이다. 이를 입증하기 위해, 본 발명자들은 루시퍼라제-암호화된 DNA-로딩된 RBCEV를 2 mg/kg의 DNA 용량으로 NGS 마우스의 꼬리 정맥 내에 주사하였다. 전신 루시퍼라제 발현의 동역학을 IVIS 스펙트럼 생물발광 이미저를 사용하여 모니터링하였다. 생체내에서 세포에 RBCEV-매개 전달은 마우스의 몸통 영역에서 지속적인 장기간 루시퍼라제 활성을 야기하였다. 생물발광 신호를 임의의 관찰가능한 감소 없이 30 dpi(현재까지 45 dpi)(도 4) 및 최소 감소가 있는 279 일(도 9a)에 걸쳐 모니터링하였다.
생체내에서 큰 DNA 운반물을 전달할 가능성을 입증하기 위해, 3 kb, 8 kb, 및 34 kb 루시퍼라제-암호화된 DNA 운반물이 로딩된 RBCEV를 2.5mg/kg의 동일한 DNA 용량으로 BALB/c 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하였다. DNA 운반물의 크기와 무관하게, DNA-로딩된 RBCEV가 주사된 모든 마우스는 48 시간 시점에서 발광을 나타내었다(도 9b). 그러나, 본 발명자들은 DNA 운반물의 크기가 증가함에 따라 감소된 이식유전자 발현을 관찰하였으며, 이는 다시 분자량에 따라 페이로드의 카피 수가 상이하였기 때문이다. 종합하면, 분 발명자들은 큰 DNA 운반물을 전달하고 마우스에서 장기간 이식유전자 발현을 촉발하는 RBCEV의 능력을 입증하였으며, 이는 신규 비바이러스 유전자 요법 벡터가 될 가능성을 강조한다.
참고문헌
본 발명 및 본 발명이 속하는 분야의 상태를 보다 완전히 설명하고 개시하기 위해 다수의 간행물이 상기 인용된다. 이들 참고문헌에 대한 전체 인용은 하기에 제공된다. 이들 참고문헌 각각의 전문은 참조로 본원에 포함된다.
표준 분자 생물 기술에 대해, Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조한다.
Figure pct00001

Claims (42)

  1. DNA 운반물이 로딩된 적혈구 세포외 소포(RBCEV).
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 운반물이 단일 가닥이고 적어도 250 개 염기 길이를 갖는 것인, RBCEV.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DNA 운반물이 단일 가닥이고 적어도 2000 개 염기 또는 2000-30000 개 염기 또는 그 이상의 길이를 갖는 것인, RBCEV.
  4. 제1항에 있어서, 상기 DNA 운반물이 이중 가닥이고 적어도 250 개 염기쌍 길이를 갖는 것인, RBCEV.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 DNA 운반물이 이중 가닥이고 적어도 2000 개 염기쌍 또는 2000-17000 개 염기쌍 또는 그 이상의 길이를 갖는 것인, RBCEV.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 운반물이 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터인, RBCEV.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 운반물이 원형인, RBCEV.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 운반물이 미니서클 또는 플라스미드인, RBCEV.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 하에 있어서, 상기 DNA 운반물이 선형인, RBCEV.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 운반물이 RBCEV의 내강 내에 있는 것인, RBCEV.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RBCEV가 인간 또는 포유동물 적혈구로부터 유래되거나 또는 수득되는 것인, RBCEV.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RBCEV가 단리되는 것인, RBCEV.
  13. RBCEV의 내강에 적어도 하나의 DNA 운반물을 함유하는 단리된 적혈구 세포외 소포(RBCEV).
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 복수의 RBCEV를 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물 내 각 RBCEV에 평균적으로 적어도 1.0 개의 DNA 운반물이 로딩되는 것인, 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 조성물 내 각 RBCEV에 평균적으로 적어도 2.0 또는 3.0 개의 DNA 운반물이 로딩되는 것인, 조성물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 내 각 RBCEV에 평균적으로 1.0 내지 4.0 개의 DNA 운반물이 로딩되는 것인, 조성물.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적 조성물 또는 약제인, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조성물 또는 약제가 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  20. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 RBCEV 또는 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 대상체에게 투여하여, 대상체를 치료하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 방법은 DNA 운반물의 유전자 서열로부터 단백질 또는 펩티드의 발현에 의해 대상체에서 질환의 치료를 수반하는 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 치료는 질환의 예방 및/또는 개선을 포함하는 것인, 방법.
  23. 세포외 소포에 핵산 운반물을 로딩하는 방법으로서,
    a. 세포외 소포 내에 로딩될 핵산을 제공하는 단계;
    b. 세포외 소포에 핵산이 로딩되기에 충분한 조건 하에 형질감염 시약의 존재 하에 핵산을 세포외 소포와 접촉시키는 단계; 및
    c. 임의적으로 상기 로딩된 세포외 소포를 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 세포외 소포가 적혈구 세포외 소포인, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 방법은 단계 b를 반복하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  26. 세포외 소포에 핵산 운반물을 로딩하는 방법으로서,
    a. 세포외 소포 내에 로딩될 핵산을 제공하는 단계;
    b. 핵산을 형질감염 시약과 접촉시켜 핵산/형질감염 시약 복합체의 형성을 허용하는 단계;
    c. 세포외 소포에 핵산/형질감염 시약 복합체가 로딩되기에 충분한 조건 하에 핵산/형질감염 시약 복합체를 세포외 소포와 인큐베이션하거나 또는 접촉시키는 단계; 및
    d. 임의적으로 상기 로딩된 세포외 소포를 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 세포외 소포에 핵산 운반물을 로딩하는 방법으로서,
    a. 세포외 소포 내에 로딩될 핵산을 제공하는 단계;
    b. 핵산을 형질감염 시약과 접촉시켜 핵산/형질감염 시약 복합체의 형성을 허용하는 단계;
    c. 세포외 소포에 핵산/형질감염 시약 복합체가 로딩되기에 충분한 조건 하에 핵산/형질감염 시약 복합체를 세포외 소포와 인큐베이션하거나 또는 접촉시키는 단계;
    d. 임의적으로 상기 로딩된 세포외 소포를 세척하는 단계;
    e. 로딩된 세포외 소포를 추가의 핵산/형질감염 시약 복합체와 접촉시키는 단계; 및
    f. 추가의 핵산/형질감염 시약 복합체를 로딩된 세포외 소포와 인큐베이션하거나 또는 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 세포외 소포가 적혈구 세포외 소포인, 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 단계 b-d를 반복하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질감염 시약이 임의적으로 MW 25,000Da 또는 MW 40,000Da의 선형 폴리에틸렌이민 하이드로클로라이드인, 방법.
  31. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 세포외 소포의 내강 내에 함유되지 않은 핵산 운반물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 세포외 소포의 내강 내에 함유되지 않은 핵산 운반물을 제거하는 단계는 상기 로딩된 세포외 소포를 뉴클레아제, 바람직하게는 RNase 또는 DNase와 접촉시키는 것을 포함하는 것인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 로딩된 세포외 소포는 뉴클레아제와의 접촉 전에 헤파린과 접촉시키는 것인, 단계.
  34. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 운반물은 핵산 분자를 포함하고, 상기 각 핵산 분자는 단일 가닥이고 적어도 250 개 염기, 또는 적어도 2000 개 염기, 또는 2000-30000 개 염기 또는 그 이상의 길이를 갖는 것인, 방법.
  35. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 운반물은 핵산 분자를 포함하고, 상기 각 핵산 분자는 이중 가닥이고 적어도 250 개 염기쌍, 또는 적어도 2000 개 염기쌍, 또는 2000-17000 개 염기쌍 또는 그 이상의 길이를 갖는 것인, 방법.
  36. 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 운반물이 원형인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 핵산 운반물이 미니서클 또는 플라스미드인, 방법.
  38. 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 운반물이 선형인, 방법.
  39. 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 운반물이 DNA인, 방법.
  40. 제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소포가 미세소포인, 방법.
  41. 제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소포가 엑소좀인, 방법.
  42. 제23항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되거나 또는 수득되는, 핵산 운반물이 로딩된 세포외 소포.
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