JP2024519602A

JP2024519602A - 操作された細胞外小胞

Info

Publication number: JP2024519602A
Application number: JP2023568210A
Authority: JP
Inventors: シャオイー・ジァン; ウェンチャオ・グー; スージン・ルオジョン; ゼファン・ユエン
Original assignee: コーネルユニヴァーシティー
Priority date: 2021-05-04
Filing date: 2022-05-04
Publication date: 2024-05-20
Also published as: CN117580949A; EP4334445A1; WO2022235723A1

Abstract

本明細書では、標的化された組織および細胞へのカーゴの送達のための、操作された細胞外小胞の組成物が記載される。本明細書ではまた、本明細書で記載される細胞外小胞を作製および使用するための方法も記載される。最後に、本明細書では、対象を処置するための方法であって、対象へと、本明細書で記載される細胞外小胞を投与する工程を含む方法が記載される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み入れられる、２０２１年５月４日に出願された、米国特許仮出願第６３／１８３，７４９号の利益を主張する。

参照による配列表の組込み
２０２２年５月３日に作成され、３９６０４ＷＯ＿９７０４＿０２＿ＰＣ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁へと提出された、８５４ＫＢの、ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表は、参照により本明細書に組み入れられる。

診断剤または治療剤の、目的の部位への正確な投与は、未解決の難題を提示している。現在のところ、２つの主要な遺伝子治療送達システムの種類は、ウイルス性送達システム非ウイルス性送達システムである（非特許文献１；非特許文献２）。ウイルスベクターについて述べると、高度に有効であるが、安全性が、主要な懸念である。ポリプレックスおよびリポプレックス、特に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む非ウイルス性担体は、標的化特異性の欠如を難点とすることが多い。近年の研究は、それらの生体適合性、細胞間の分子交換を媒介する内因性機能、および特異的組織を標的化し、血液脳関門（ＢＢＢ）を越える天然の能力のために、ＲＮＡ薬物送達のための有望な担体の新たなクラスとして、細胞外小胞（ＥＶ）に対する関心を増大させつつある（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。しかし、ＥＶベースの治療の、臨床への橋渡しは、どの分子が、ＥＶ産生ドナー細胞から、ＥＶへとロードされるのかに対するコントロールの欠如により妨げられている。ドナー細胞型に応じて、ＥＶのカーゴは、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、栄養物、および代謝老廃物を含みうる。望ましくない細胞内構成要素が、ＥＶから除外されず、ローディング能力を妨げるだけでなく、また、ＥＶを操作するのに導入された、過剰発現構築物、および細胞老廃物など、潜在的に有害な構成要素も、標的へと送達する。

ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡなど、小型のＲＮＡカーゴを、ＥＶへとロードするのに、多くのシステムが開発されているが、ＥＶ内における、長鎖ｍＲＮＡの能動的濃縮は、難題であり続けている（非特許文献４）。内因性ＥＶ関連ＲＮＡについて、ＥＶ１つ当たりのＲＮＡ０．０２～１の範囲の、極めて低コピー数が報告されており、小型のＲＮＡは、長鎖ｍＲＮＡより効率的に、ＥＶへとパッケージングされている（ＥＶ１つ当たりのマイクロＲＮＡ０．０１～１対長鎖無傷ＲＮＡ０．００１）（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。ドナー細胞内のｍＲＮＡのうちの８％だけが、それらのＥＶ内で検出される（非特許文献１４）。ｍＲＮＡをＥＶへとローディングする、既に報告された方法は、能動的封入および受動的封入を含む（非特許文献１５）。例えば、パーキンソン病（ＰＤ）を処置するのに、超音波処理および射出、またはサポニンによる透過化処理の後における、マクロファージ由来ＥＶを伴うインキュベーションにより、カタラーゼｍＲＮＡがロードされた（非特許文献６）。白血病を処置するために、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、電気穿孔により、除核赤血球（ＲＢＣ）に由来するＥＶへと送達された（非特許文献１６）。ＥＶはまた、親細胞レベルでも操作され、デザインされたＥＶの産生を誘導するように、遺伝子構成要素が導入され、十分なローディング用量を達成するように、カーゴ構成要素の、極めて過剰な発現を伴うことが多い。これらの手順は、ＥＶを損傷し、それらの凝集をもたらす場合もあり、ＥＶ産生ドナー細胞の生理学を変更し、その後、カーゴローディングを低減する場合もある（非特許文献１５；非特許文献１７；非特許文献１８）。

核酸を細胞へと送達する、利用可能な方法は、十分に特徴付けられた限界を有する。例えば、遺伝子治療のために使用されることが多いＡＡＶウイルスベクターは、免疫原性であり、ペイロード容量が約４．４ｋｂに限定されており、生体内分布の不良を難点とし、直接的な注射だけにより投与され、組込みにより、宿主遺伝子を破壊する危険性を呈する。非ウイルス法は、異なる限界を有する。リポソームは、主に、肝臓へと送達される。細胞外小胞は、スケーラビリティーが限定されており、精製が困難である。こうして、治療用ペイロードを送達する新たな方法に対する必要が認識されている。

大半の分子は、体内において、固有のアフィニティーを有さない。他の場合に、投与された薬剤は、クリアランスのために、肝臓および腎臓に蓄積されるか、または意図されない組織もしくは細胞型に蓄積される。送達を改善するための方法は、えり抜きの薬剤を、疎水性化合物または疎水性ポリマーでコーティングするステップを含む。このような手法は、前記薬剤の、循環中の持続性を増大させ、細胞内への取込みのための疎水性を強化する。他方、この手法は、カーゴを、送達のための目的の部位へと、能動的に方向付けない。

治療が必要とされる部位を、特異的に標的化するために、場合により、治療用化合物を、標的化された細胞の表面上に提示された受容体を認識し、これに結合する、リガンド、抗体、およびアプタマーなどの部分と融合させる。目的の細胞に到達したら、治療用化合物は、場合により、細胞内標的へと、さらに送達される。例えば、治療用ＲＮＡは、細胞の細胞質内のリボソームと接触すると、タンパク質へと翻訳される。

Ｙ．Ｋ．ＳｕｎｇおよびＳ．Ｗ．Ｋｉｍ、ＢｉｏｍａｔｅｒＲｅｓ２３、８（２０１９）Ｎ．Ｎａｙｅｒｏｓｓａｄａｔら、ＡｄｖＢｉｏｍｅｄＲｅｓ１、２７（２０１２）Ｔａｎｇら、ＦｒｏｎｔＯｎｃｏｌ９、１２０８（２０１９）Ａｓｌａｎら、ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２１、２０（２０２１）Ｒｉｄｄｅｒら、ＰＬｏＳＢｉｏｌ１２、ｅ１００１８７４（２０１４）Ｈａｎｅｙら、ＪＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ２０７、１８～３０（２０１５）Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２９、３４１～３４５（２０１１）ＡｎｄｒａｓおよびＴｏｂｏｒｅｋ、ＴｉｓｓｕｅＢａｒｒｉｅｒｓ４、ｅ１１３１８０４（２０１６）ｖａｎＮｉｅｌら、ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１９、２１３～２２８（２０１８）Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｃｅｌｌ１０、（２０２１）Ｍ．Ｌｉら、ＰｈｉｌｏｓＴｒａｎｓＲＳｏｃＬｏｎｄＢＢｉｏｌＳｃｉ３６９（２０１４）Ｃｈｅｖｉｌｌｅｔら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１１、１４８８８～１４８９３（２０１４）Ｚ．Ｗｅｉら、ＮａｔＣｏｍｍｕｎ８、１１４５（２０１７）Ｈ．Ｖａｌａｄｉら、ＮａｔＣｅｌｌＢｉｏｌ９、６５４～６５９（２００７）Ｘ．Ｌｕａｎら、ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｏｌＳｉｎ３８、７５４～７６３（２０１７）Ｗ．Ｍ．Ｕｓｍａｎら、ＮａｔＣｏｍｍｕｎ９、２３５９（２０１８）Ｆ．Ｍｏｍｅｎ－Ｈｅｒａｖｉら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ１０、１５１７～１５２７（２０１４）Ｊ．Ｈ．Ｗａｎｇら、ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ１７、１１３３～１１４２（２０１８）

本開示は、操作された細胞外小胞、操作された細胞外小胞を作製する方法、治療用化合物、バイオ医薬品、またはこれらの両方を、目的の組織および細胞へと送達するために、操作された細胞外小胞を使用する方法を対象とする。

第１の態様では、本開示は、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を含むカーゴｍＲＮＡを含む、ＲＮＡ転写物組成物を対象とする。一部の実施形態では、ＲＮＡ転写物組成物は、ＡｒｃｍＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、哺乳動物に由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ヒト、マウス、およびラットからなる群から選択される、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、配列番号１～４のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、ペプチド、酵素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗原、抗体、抗体の部分、凝固因子、調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写タンパク質、および／または受容体をコードする。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、および／またはリコンビナーゼレポーターをコードする。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、配列番号５～８のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃタンパク質をコードする。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、ショウジョウバエに由来するＡｒｃタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃｍＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、ショウジョウバエに由来するＡｒｃｍＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号９～１２のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

本開示の一部の態様は、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を有するカーゴｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組換えシステムを対象とする。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を有するカーゴｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組換えシステムは、ＡｒｃｍＲＮＡをコードする第２のＤＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、哺乳動物に由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ヒト、マウス、およびラットからなる群から選択される、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、配列番号１～４のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、ペプチド、酵素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗原、抗体、抗体の部分、凝固因子、調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写タンパク質、および／または受容体をコードする。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、および／またはリコンビナーゼレポーターをコードする。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、哺乳動物に由来するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、ヒト、マウス、およびラットからなる群から選択されるＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、配列番号５～８のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、システムは、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を有するカーゴｍＲＮＡをコードするＤＮＡと、ＡｒｃｍＲＮＡをコードする第２のＤＮＡとを含む、単一のプラスミドを含む。一部の実施形態では、システムは、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を有するカーゴｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含む第１のプラスミド；およびＡｒｃｍＲＮＡをコードする第２のＤＮＡを含む第２のプラスミドを含む。一部の実施形態では、プラスミド（複数可）は、異種ＤＮＡ調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、異種ＤＮＡ調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃ配列を含む。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、配列番号１～４のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃタンパク質をコードする。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、ショウジョウバエに由来するＡｒｃタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、ショウジョウバエに由来するＡｒｃｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号９～１２のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

本開示のある特定の態様は、Ａｒｃタンパク質；およびＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含むカーゴｍＲＮＡを含む細胞外小胞を対象とする。一部の実施形態は、Ａｒｃタンパク質；およびＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含むカーゴｍＲＮＡを含む細胞外小胞を対象とし、この場合、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、哺乳動物に由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ヒト、マウス、およびラットからなる群から選択される、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、配列番号１～４のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、ペプチド、酵素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗原、抗体、抗体の部分、凝固因子、調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写タンパク質、および／または受容体をコードする。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、および／またはリコンビナーゼレポーターをコードする。一部の実施形態では、Ａｒｃタンパク質は、哺乳動物に由来するＡｒｃタンパク質配列を含む。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである。一部の実施形態では、Ａｒｃタンパク質は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃタンパク質配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃタンパク質は、配列番号１３～１６のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、哺乳動物に由来するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、配列番号５～８のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、細胞外小胞は、１つまたはそれ以上の低分子薬をさらに含む。

本開示の別の態様は、細胞外小胞を産生するための方法であって、（ａ）ＡｒｃｍＲＮＡおよびＡｒｃ５’ＵＴＲを含むカーゴｍＲＮＡを含む細胞を得る工程；（ｂ）細胞を、培地中、ＡｒｃｍＲＮＡによりコードされるＡｒｃタンパク質を発現させる条件下で増殖させる工程であって、細胞は、Ａｒｃタンパク質、およびＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を有するカーゴｍＲＮＡを含む細胞外小胞を産生する、工程；ならびに（ｃ）細胞外小胞を培地から分離する工程を含む方法である。方法についての一部の実施形態では、工程（ａ）の細胞は、ドナー細胞へと、ＡｒｃｍＲＮＡへと転写されるＤＮＡ構築物、およびカーゴｍＲＮＡへと転写されるＤＮＡ構築物を導入することにより得られる。方法についての一部の実施形態では、工程（ａ）の細胞は、ドナー細胞へと、ＡｒｃｍＲＮＡおよびカーゴｍＲＮＡを導入することにより得られる。一部の実施形態では、組換え構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方の組合せの形態で送達される。一部の実施形態では、細胞は、原核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、真核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、ドナー細胞は、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、造血細胞、結合組織細胞、筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、生殖系列細胞、脂肪細胞、幹細胞、自家由来ｅｘｖｉｖｏ分化細胞、ｉＰＳＣ由来ｅｘｖｉｖｏ分化細胞、がん細胞、およびこれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、ドナー細胞は、白血球である。一部の実施形態では、ドナー細胞は、自己由来ｅｘｖｉｖｏ分化白血球である。一部の実施形態では、ドナー細胞は、自己由来ｅｘｖｉｖｏ分化単球、マクロファージ、樹状細胞、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、ドナー細胞は、ｉＰＳＣ由来ｅｘｖｉｖｏ分化白血球である。一部の実施形態では、ドナー細胞は、ｉＰＳＣ由来ｅｘｖｉｖｏ分化単球、マクロファージ、樹状細胞、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、核酸構築物を含む細胞は、細胞に、核酸構築物をトランスフェクトすることにより調製され、トランスフェクションは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）複合体形成、電気穿孔、カチオン性脂質複合体形成、脂質ナノ粒子媒介送達、マイクロインジェクション、およびこれらの組合せにより行われる。

本開示の一態様は、ｍＲＮＡをレシピエント細胞へと送達するための方法であって、記載される細胞外小胞を得る工程；およびレシピエント細胞を細胞外小胞と接触させる工程であって、細胞外小胞は、レシピエント細胞と融合し、これにより、ｍＲＮＡをレシピエント細胞へと送達する、工程を含む方法を対象とする。一部の実施形態では、接触させる工程は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて実行される。一部の実施形態では、接触させる工程は、ｉｎｖｉｖｏにおいて実行される。一部の実施形態では、レシピエント細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、レシピエント細胞は、造血細胞、非造血細胞、幹細胞、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、疾患を処置するか、タンパク質を産生するか、細胞死を誘導するか、細胞死を抑制するか、細胞老化を変化させるか、免疫寛容を誘導するか、既存の免疫応答をモジュレートするか、細胞内活性を修飾するか、細胞挙動を修飾するか、またはこれらの組合せをもたらすために、レシピエント細胞へと送達される。

本開示の別の態様は、それを必要とする対象を処置するための方法であって、記載される細胞外小胞を得る工程；および細胞外小胞を対象へと投与する工程を含む方法を対象とする。一部の実施形態では、細胞外小胞は、経口、直腸内、静脈内、筋内、皮下、子宮内、脳血管内、または脳室内投与される。一部の実施形態では、細胞外小胞は、遺伝障害を含む疾患の処置に適合された、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態は、細胞外小胞は、神経変性疾患、老化関連障害、脳腫瘍、炎症性状態の処置のために対象へと投与され、健常細胞に影響を及ぼさずに、血液脳関門を越えて炎症性脳組織へとＲＮＡを特異的に送達する。一部の実施形態では、細胞外小胞は、アルツハイマー病の処置のために、ＡＰＯＥ４ＲＮＡを脳へと送達するように適合される。一部の実施形態では、細胞外小胞は、がんの処置のために投与され、健常組織に影響を及ぼさずに、腫瘍細胞を標的化する。一部の実施形態では、細胞外小胞は、腫瘍関連抗原に対応するｍＲＮＡを含み、細胞外小胞は、黒色腫、結腸がん、消化器がん、尿生殖器がん、肝細胞がんを含む、がんの処置のためのがんワクチンとして送達される。一部の実施形態では、細胞外小胞は、感染性疾患の防止および／または処置のために送達される。一部の実施形態では、細胞外小胞は、自己免疫疾患の処置のために送達される。

本開示の別の態様は、ｉｎｖｉｖｏにおいて構築物をレシピエント細胞へと送達して、内因性Ａｒｃを使用してｉｎｖｉｖｏにおいて記載される細胞外小胞を産生する方法を対象とする。一部の実施形態では、小胞は、ｉｎｖｉｖｏにおいて、内因性Ａｒｃにより産生される。一部の実施形態では、構築物は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの形態で送達される。一部の実施形態では、構築物は、脂質ナノ粒子、エクソソーム、ウイルス、および他の遺伝子送達法により送達される。

特許または出願ファイルは、有色で作成された少なくとも１つの図面を含有する。有色の図面（複数可）を伴う、本特許または特許出願公開の複製は、これを要望し、必要な手数料を支払えば、特許庁により提供される。

図１Ａ～１Ｊは、ｍＲＮＡをロードし、導入するｅａＥＶについての特徴付けを示す図である。（Ａ）ｅａＥＶの、ドナー細胞からの産生、およびｅａＥＶの、レシピエント細胞への形質導入である。（Ｂ）蛍光ＮＴＡは、ＥＶによる全ての光散乱の中で、蛍光標識化抗Ａｒｃ＋ｅａＥＶの濃度およびサイズ分布を測定する（Ｃに示されるスクリーンキャプチャー：赤丸、ｅａＥＶ；緑丸、非ＡｒｃＥＶ）。（Ｄ）各粒子のサイズは、その散乱強度の関数としてプロットした。（Ｅ）ＮＴＡによるサイズ分布プロファイルは、粒子濃度についてのヒストグラムとして表す。（Ｆ）ｅａＥＶの、全ＥＶ中の百分率は、全ＥＶの産生はまた、リポソームによるトランスフェクション単独によっても促進されたが、ＡｒｃｍＲＮＡがトランスフェクトされると共に増大した。（Ｇ）外膜を有するｅａＥＶ、および外膜を有さないｅａＥＶについての、代表的ＮＳＥＭ画像である。（Ｈ）全ＥＶ（ＣＭＤＲ＋）およびｅａＥＶ（抗Ａｒｃ＋）の蛍光強度を測定して、精製後におけるそれらの濃度を定量した。次いで、将来の参照のための、各試料中の絶対粒子数を計算するために、この迅速かつ容易なアッセイから得られた数を、ＮＴＡ結果と相関させた。（Ｉ）共焦点顕微鏡法は、多小胞体（ＭＶＢ）の膜融合を介するエクソソームの放出、直接的な細胞外への出芽、および／またはドナー細胞培養物中のＥＶのエンドサイトーシスを観察した（青色ピクセルが、ＥＶ内のＡｒｃタンパク質を強調するのに対し、緑ピクセルは、Ａ５Ｕ－ＧＦＰカーゴｍＲＮＡを標識化する）。（Ｊ）レシピエント細胞内の、ＧＦＰと、ＣＭＤＲとの重複：ＥＶの取込みを伴わないＤＡＰＩ＋／ＣＭＤＲ－細胞は、ＧＦＰシグナルを示さない。図１－１の続き。図１－２の続き。図１－３の続き。図１－４の続き。図１－５の続き。図１－６の続き。図１－７の続き。図２Ａ～２Ｑは、Ａ５Ｕの付加が、ｍＲＮＡの、ｅａＥＶへの封入の効率を、有意に改善したことを示す図である。（Ａ）ラットＡｒｃの５’ＵＴＲは、予測される二次構造において、ＨＩＶ１の５’ＵＴＲに対して、マウスＡｒｃおよびヒトＡｒｃの５’ＵＴＲより高度の類似性を示す。ＥＶへとロードされるＣｙ３－Ａ５Ｕ－ＧＦＰｍＲＮＡまたはＣｙ５－ＧＦＰｍＲＮＡの量は、精製ＥＶについての蛍光強度の読取り（ＢおよびＥ）、ならびにドナーＲＡＷ２６４．７細胞培養物についてのリアルタイム落射蛍光イメージング（Ｃ～ＤおよびＦ～Ｇ）により示される通り、Ａｒｃカプシドの存在下で増大した。（Ｈ）ＲＩＰに続くＲＴ－ｑＰＣＲは、Ａ５Ｕの付加が、ｍＲＮＡの、Ａｒｃカプシドへのローディングを増大させることを明らかにした。（Ｉ～Ｊ）トランスフェクション試薬の比率の最適化は、１８Ｓカーゴ、ＧＡＰＤＨカーゴ、およびｒＡｒｃカーゴと比較したＡ５Ｕ－ＧＦＰカーゴの効率的かつ選択的ローディングを可能とする。細胞総数を６１４とし、解析されるＥＶを１６１１として、レシピエント細胞内の、カーゴであるＡ５Ｕ－ＧＦＰｍＲＮＡ、カプシドであるＡｒｃのｍＲＮＡ、カプシドであるＡｒｃのタンパク質、および核を、染色し、イメージングし、代表的領域を、（Ｋ）に示し、拡大図を、（Ｌ、Ｍ～Ｏ）に示す。丸印は、個々のｅａＥＶを指し示す、Ａｒｃタンパク質を強調する。Ａｒｃ：Ａ５Ｕ－ＧＦＰ＝１．５：１の比率では、ほぼ全てのＡｒｃ（タンパク質）＋ＥＶが、Ａ５Ｕ－ＧＦＰｍＲＮＡと重複した（Ｍ～Ｏ、緑および黄）が、ＡｒｃｍＲＮＡと重複するＡｒｃ（タンパク質）＋ＥＶは見られなかった（Ｍ～Ｏ、赤）。ＡｒｃＥＶへとロードされることに加えて、Ａ５Ｕ－ＧＦＰおよびＡｒｃｍＲＮＡはまた、他のＥＶ内でも見られる（Ｌ、赤および黄）。ＧＦＰタンパク質は、ｍＲＮＡカーゴと比較して、極めて低頻度で、ＥＶへとパッケージングされる（Ｌ、Ｍ～Ｏ、紫）。カプシドタンパク質と、ＧＦＰｍＲＮＡとの共局在の百分率を定量し、ＡｒｃｍＲＮＡと比較した（Ｐ～Ｑ）。細胞外小胞内では、Ａｒｃタンパク質と、ＡｒｃｍＲＮＡとの重複は観察されなかった。図２－１の続き。図２－２の続き。図２－３の続き。図２－４の続き。図２－５の続き。図３Ａ～３Ｇは、Ａ５Ｕの付加が、ｍＲＮＡの、レシピエント細胞への送達の効率および安定性を、有意に改善したことを示す図である。（Ａ１～Ａ２）ＥＶにより形質導入したら、１５分後（Ｂ１～Ｂ４）、１時間後、４時間後（Ｃ１～Ｃ４）、３日後、６日後、および１２日後の時点において、Ｃｙ３蛍光についてのリアルタイム生細胞イメージングを実施して、レシピエント細胞により取り込まれたカーゴｍＲＮＡを定量した。Ａ５Ｕ－ＧＦＰを保有するｅａＥＶによる導入が、レシピエント細胞内に蓄積されるカーゴ量の、高度に安定的かつ大幅な増大を示した（Ａ１）のに対し、Ａ５Ｕを有さないカーゴを保有するＡｒｃＥＶは、それほど安定的でなく、かつ、それほど効率的でないと考えられた（Ａ２）。（Ｄ）まず、ＣＭＤＲ（細胞は、暗赤色を帯びる）膜染料を使用して、全ＥＶを標識化し、緩衝液中ならびにレシピエント細胞内における全ＥＶの、迅速かつ正確な定量を可能とした。滴定実験は、中程度の蛍光シグナルについて、個々のＥＶを、レシピエント細胞内で目視可能とする、最良の染料濃度である、１：５０００を示唆した。次いで、この染料濃度を使用して、レシピエント細胞へと導入されるＥＶの適量を最適化したところ、ＣＭＤＲシグナルと、ＥＶ濃度との間の、直線的相関が裏付けられた。（Ｅ）本発明者らは、各群に由来する同量のＥＶを、レシピエント細胞へと添加し、それらのＣＭＤＲ蛍光により計算した。２時間後、異なる群に由来するＥＶを施されたレシピエント細胞が、同様のＣＭＤＲ蛍光レベルを示したことは、同様の数の全ＥＶの取込みを示唆する。（Ｆ）Ａｒｃ／Ａ５Ｕ－ＧＦＰは、ＥＶによる形質導入の４時間後および１日後における対照群の間で、カーゴ翻訳の一貫した増大を示した。３日目に、対照群において、レシピエント細胞は、強い自己蛍光を示し始め、Ａｒｃ／Ａ５Ｕ－ＧＦＰによる増大は、もはや有意ではなくなった。（Ｇ）ＧＦＰを発現させるレシピエント細胞の百分率は、低値であったが、Ａｒｃ／Ａ５ＵＧＦＰにより、有意に増大した。図３－１の続き。図３－２の続き。図３－３の続き。図３－４の続き。図３－５の続き。図４Ａ～４Ｊは、Ａ５Ｕ－ｅａＥＶが、カーゴｍＲＮＡを加齢脳内で濃縮することを示す図である。（Ａ）ＢＭ細胞を、マウス大腿骨から抽出し、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ４を補充された完全培地中で、７日間にわたり培養して、単球、樹状細胞、およびマクロファージへと分化させ、ここから、対照ＥＶおよび操作されたＥＶを産生し、神経炎症についてのマウスモデルへと、静脈内注射した。（Ｂ）明色のファイル画像である、６日目における代表的ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ４ＢＭ培養物の形状である。（Ｃ）６日目における、代表的ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ４ＢＭ培養物の表現型である。ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋ＢＭＤＣ（Ｃ、左上）は、ＣＤ１１ｂおよびＭＨＣＩＩの発現（Ｃ、下）に基づき、細分される。枠囲いは、ゲートを描示し、数は、各ゲート内の細胞の百分率に対応する。ＭＨＣＩＩ^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｌｏｗサブセットおよびＭＨＣＩＩ^ｉｎｔＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈサブセットにより指し示されるマーカーの表面発現を示すヒストグラムである。（Ｄ）６日目におけるＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ４ＢＭ細胞は、ＣＭＤＲにより標識化された、その固有のＥＶを取り込むことができた。（Ｅ１～Ｅ４）ｍＲＮＡ転写物のトランスフェクション後、回収および精製の前に、４０時間にわたり、ＥＶを産生した。この長時間にわたる産生は、上清培養培地中における、ＥＶの飽和をもたらし、各試料群から、ほぼ同等数の全ＥＶをもたらした（Ｆ）。一方、ｅａＥＶの、全ＥＶ中比率は、Ａｒｃ／Ａ５Ｕ－ＧＦＰ群において、有意に高度である。精製ＥＶ（１×および２×の希釈液）を、ＣＭＤＲおよび蛍光Ａｒｃ抗体で染色し、ＥＶ濃度のために、これらの落射蛍光強度を測定した。（Ｇ）代表的ＩＶＩＳ画像は、ｅａＥＶによる全身投与を伴う加齢脳内において、ＡｒｃＡ５Ｕ－ＧＦＰのない対照だけと比較して、有意に濃縮された、Ｃｙ３＋Ａ５Ｕ－ＧＦＰｍＲＮＡの、ｉｎｖｉｖｏにおける生体内分布を示す。色範囲を、３．３ｅ＋７～４．９ｅ＋８とし、色閾値を、３．５ｅ＋８として、放射輝度についての写真の重合せを提示して、陰性対照動物に基づき、バックグラウンドシグナルを控除した。本図で示された代表的画像に加えて、モックトランスフェクション対照、ＰＢＳ（ＥＶなし）注射対照、およびＣＭＤＲ＋動物についてもまた、本図におけるＣｙ３ＩＶＩＳイメージングについての陰性対照として解析した。（Ｈ）Ｃｙ５＋ＧＦＰｍＲＮＡの、ｉｎｖｉｖｏにおける生体内分布についてのＩＶＩＳイメージングは、ｍＲＮＡカーゴが、加齢脳内において、Ａ５Ｕモチーフがカーゴ構築物へと付加されていないｅａＥＶ送達により濃縮されないことを示唆する。（Ｇ）と同様に、３．５ｅ＋８の色閾値を適用して、陰性対照動物に基づき、バックグラウンドシグナルを控除した（Ｃｙ３＋Ｃｙ５－Ａｒｃ／Ａ５Ｕ－ＧＦＰ群およびＡ５Ｕ－ＧＦＰ群）。（Ｉ～Ｊ）ＩＶＩＳシグナルの定量である。平均値±ＳＤ、実験群についてのｎ＝２であり；ＮＣ群についてのｎ＝７である。検出力を８０％とし、有意水準を５％とし、コーエンの検出力解析に従う両側ｔ検定を伴う検出力解析に基づき、群１つ当たりの試料サイズ６を使用した。図４－１の続き。図４－２の続き。図４－３の続き。図４－４の続き。図４－５の続き。図５Ａ～５Ｇは、ＢＭ－ＤＣ／Ｍ由来Ａ５Ｕ－ｅａＥＶが、ＢＢＢを越えて、ｍＲＮＡをニューロンへと送達し、慢性汎ニューロン炎症を標的化しうることを示す図である。（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’；ここで、Ａ’およびＢ’は、ＡおよびＢの拡大である）ＢＢＢを越えて、Ａ５Ｕ－ＧＦＰｍＲＮＡを送達して、炎症性加齢脳内において、ＧＦＰタンパク質を発現させることに成功した：白ピクセル（ＧＦＰ＋／ＮｅｕＮ＋）は、ニューロン内におけるＧＦＰ発現を表す、ＧＦＰとＮｅｕＮ－Ａｌｅｘａ６４７との間の共局在を強調する。これに対し、緑ピクセルは、浸潤免疫細胞である可能性が高い、非ニューロン細胞内のＧＦＰを示した。視床下部についての拡大図を、（Ｃ～Ｄ）に示す。（Ｅ～Ｆ）ＩＶ注射の２日後、およびさらに６日後、加齢脳は、ＮｅｕＮ＋細胞内におけるＧＦＰ発現レベルの、有意な上昇を示した。ｅａＥＶ／Ａ５Ｕ－ＧＦＰの全身注射は、浸潤末梢免疫細胞細胞内における、同等レベルのＧＦＰ発現をもたらした（緑ピクセル、Ｃ～Ｅ）が、加齢脳内における、ＮｅｕＮ＋ニューロンの有意な濃縮をもたらした（白ピクセル、Ｃ～Ｅ）。（Ｇ）多様な脳領域内の、対照群および実験群の間における、ＧＦＰの統合発現である。視床下部弓状核（ＡＲＨ）、内側視索前核（ＭＰＮ）、腹側被蓋領域（ＶＴＡ）など、ある特定の脳領域は、海馬および前頭前野（ＰＦＣ）を含む他の領域より、有意な増大を示した。図５－１の続き。図５－２の続き。図５－３の続き。図５－４の続き。図６Ａ～６Ｈは、ＢＭ－ＤＣ／Ｍ由来Ａ５Ｕ－ｅａＥＶが、ＢＢＢを越えて、ｍＲＮＡをニューロンへと送達し、急性虚血性脳卒中による損傷を標的化しうることを示す図である。急性虚血性脳卒中モデル（Ａ）において、ｅａＥＶは、対照領域（Ｂ～Ｃ’）に影響を及ぼさずに、ＧＦＰを、脳卒中領域（Ｂ～Ｃ）内のニューロンへと、特異的に送達した。（Ｆ～Ｇ）において、さらに拡大される拡大図（Ｄ～Ｅ）が、多くのＮｅｕＮ＋ニューロン内、および少数のＩｂａ１＋ミクログリア／マクロファージ内におけるＧＦＰ発現を示し（白矢印）、これがまた、ＧＦＰ発現を伴わない、多くのＮｅｕＮ＋／Ｉｂａ１＋細胞をも示したことは、観察されたＧＦＰシグナルが、特異的であることを示唆する。ＮｅｕＮ－／Ｉｂａ１－細胞内においてもまた、ＧＦＰ発現が見られることは明らかである。（Ｈ）脳卒中領域内では、対照領域と比較して、ＮｅｕＮ＋ニューロンの数が減少したのに対し、Ｉｂａ１＋免疫細胞（ミクログリアおよび浸潤性マクロファージ）の数は増大した。ＧＦＰ発現細胞の数は、増大した。対照領域内の全てのＧＦＰ＋細胞カウントは、微小血管内の自己蛍光に由来する、非特異的バックグラウンドシグナルである。図６－１の続き。図６－２の続き。図６－３の続き。図６－４の続き。図７Ａ～７Ｅは、それらの機能性について調べるための、操作されたＤＮＡ構築物およびＲＮＡ転写物の、ドナー細胞へのトランスフェクションを示す図である。（Ａ）リアルタイムの時間経過において、発現をモニタリングするのに適用される、生細胞落射蛍光イメージングにより、ランダム突然変異陰性対照、顕著に異なるフルオロフォアｍＣｈｅｒｒｙ対照、およびモックトランスフェクション対照を伴う、ＨＥＫ２９３細胞内およびＲＡＷ２６４．７細胞内において検証された、カーゴをコードするＤＮＡ構築物およびＲＮＡ転写物である。（Ｂ）トランスフェクションの８時間後における、ＲＡＷ２６４．７ドナー細胞による発現である。（Ｃ）トランスフェクションの２４時間後における、ＲＡＷ２６４．７ドナー細胞による発現である。（Ｄ～Ｅ）対照群および実験群の間で、産生されたＥＶの、良好かつ同等の品質を確保するように、ＥＶ産生の終了時における、ドナー細胞の数および生存率を、常時、記録および比較した。図７－１の続き。図７－２の続き。図７－３の続き。図７－４の続き。図８Ａ～８Ｃは、リアルタイム生細胞イメージングによる、ＲＮＡのトランスフェクション、およびＥＶ産生滴定の最適化を示す図である。（Ａ）リポフェクタミンの６つの用量においてトランスフェクトされたドナー細胞についての、リアルタイム生細胞イメージングを示す。（Ｂ）トランスフェクションの４時間後における、９６ウェルプレート内の細胞数をグラフ表示する。（Ｃ）トランスフェクションの２４時間後、およびトランスフェクションの９６時間後における、６ウェルプレート内の細胞数を比較する。結論は、リポフェクタミンを十分とせずに、ｍＲＮＡを増大させすぎると、ドナー細胞の生存率が低下したことである。最適用量は、ドナー細胞２０，０００個当たりの、トランスフェクトｍＲＮＡ１００ｎｇ（９６ウェル；ウェル１つ当たりのリポフェクタミンを０．３μＬとする、全ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地１００μＬ）であると決定された。図８－１の続き。図８－２の続き。図９Ａ～９Ｂは、トランスフェクション構成要素である、カプシドと、カーゴｍＲＮＡとの比率の最適化を示す図である。（Ａ）カプシドと、カーゴｍＲＮＡとの間の、トランスフェクション比率の詳密な最適化を、ＲＡＷ２６４．７細胞内で実行した。Ａｒｃ：ＧＦＰを、０：０とする最低比率を、（Ａ１）に示す一方、Ａｒｃ：ＧＦＰを３：３とする比率を、（Ａ１６）に示す。（Ｂ）トランスフェクトされるカプシドＡｒｃｍＲＮＡの量を増大させたところ、より多くのカーゴＡ５Ｕ－ＧＦＰｍＲＮＡが、翻訳されずに封入されたことから、ＧＦＰタンパク質発現の低下をもたらしたことを、グラフにより示す。これは、単独でトランスフェクトされた場合に高レベルのＧＦＰ発現をもたらす、カーゴｍＲＮＡの量に焦点を当てるだけでなく、また、カプシドｍＲＮＡが導入された場合における、カーゴ単独を有する場合と比較した、ＧＦＰ発現の有意な低下にも焦点を当てることが決定された。決定された比率は、Ａ１２に示された、３：２のＡｒｃ：Ａ５Ｕ－ＧＦＰ（または１．５：１のＡｒｃ：Ａ５Ｕ－ＧＦＰ）であった。図９－１の続き。ＲＮＡ封入の視覚化および最適化を示す図である。（Ａ）Ｃｙ３およびＣｙ５を使用する、トランスフェクト細胞についてのリアルタイム生細胞イメージングである。（Ｂ）ＲＮＡ封入についての蛍光強度読取りのグラフ表示である。ＧＦＰ発現の定量を伴う、ＤＮＡトランスフェクションの経時変化を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞へのＰＥＩによるＤＮＡトランスフェクションについて、カプシドおよびカーゴのｍＲＮＡおよびタンパク質のいずれの持続的産生のための安定的供給源も存在するので、本発明者らは、カーゴおよびカプシドの両方をトランスフェクトしているＧＦＰ発現の有意かつ安定的増大を観察した。最終的に、ドナー細胞内のＧＦＰ発現は、飽和に到達した（２４時間後までに）。図１１－１の続き。図１２Ａ～１２Ｍは、ＥＶの特徴付け、およびＥＶ産生の最適化を示す図である。（Ａ～Ｃ）ＮＴＡ結果は、全ＥＶの産生が、トランスフェクトされた全ての対照群および実験群の間で同等であることを示唆した。（Ｋ～Ｍ）Ａｒｃのトランスフェクションにより、より大型の小胞が産生されたことは、Ａｒｃエクトソームの産生である可能性が高い。（Ｄ～Ｈ）ＡｒｃカプシドおよびＡ５Ｕ－ＧＦＰカーゴの付加は、Ａｒｃ／ＧＦＰを含む、他の対照群と比較して、最も有意なＡｒｃＥＶの分泌を可能とした。（Ｈ）Ａｒｃ／Ａ５Ｕ－ＧＦＰ内の全てのＥＶのうち、大きな比率のＥＶは、Ａｒｃエクトソームであった。（Ｉ）ＥＶの無血清産生は、分泌された全てのＥＶの間で、高レベルのマウスＣＤ６３＋ＥＶの分泌、および大きな比率のｅａＥＶをもたらした。（Ｊ）ＥＶは、４℃における、短時間にわたる保存が可能であるが、次いで、凝集を開始した。図１２－１の続き。図１２－２の続き。図１２－３の続き。図１２－４の続き。図１２－５の続き。図１２－６の続き。ＥＶ取込みの定量のために使用されるように最適化されたＣＭＤＲ染料を示す図である。細胞膜染料であるＣＭＤＲによる染色を実行して、レシピエント細胞内における、ＥＶの定量を容易とした。レシピエント細胞へと導入されるＥＶの数もまた、最適化した。ＩＶ注射後３日目における、全ＥＶ（ＣＭＤＲ＋）の生体内分布を示す図である。各対照マウスまたは各被験マウスへと注射されたＥＶの総数（体重１ｋｇ当たり）を同数とすると、ＩＶ注射の３日後における、全ＥＶの生体内分布（ＥＶは、大半が分解されている）は、回収された全ての臓器内で同様であった。全ＥＶは、細胞膜染料であるＣＭＤＲにより標識化した。ＩＶ注射後３日目における、全ＥＶ（ＣＭＤＲ＋）の生体内分布を示す図である。各対照マウスまたは各被験マウスへと注射されたＥＶの総数（体重１ｋｇ当たり）を同数とすると、ＩＶ注射の３日後における、全ＥＶの生体内分布（ＥＶは、大半が分解されている）は、回収された全ての臓器内で同様であった。全ＥＶは、細胞膜染料であるＣＭＤＲにより標識化した。図１５Ａ～１５Ｅは、ｅａＥＶが、ｍＲＮＡを腫瘍へと送達しうることを示す図である。（Ａ）対照群および実験群：（１）ＥＶなしの陰性対照（ＮＣ）；（２）モックトランスフェクション（ｎｏＴｒａｎｓ）のＥＶ対照；（３）ＧＦＰｍＲＮＡまたはＡ５Ｕ－ＧＦＰｍＲＮＡを保有する、Ａｒｃ陰性ＥＶ；（４）ＧＦＰｍＲＮＡまたはＡ５Ｕ－ＧＦＰｍＲＮＡをロードされた、Ａｒｃ陽性ＥＶにおける、ＣＭＤＲ＋全ＥＶの、ｉｎｖｉｖｏにおける生体内分布である。色範囲を、３．３ｅ＋７～５．０ｅ＋９とし、閾値を、３．５ｅ＋８として、放射輝度についての写真の重合せを示した。（Ｂ）白血球ｅａＥＶを注射されたマウスにおける、ＣＭＤＲ生体内分布についての定量である。（Ｃ）高分解能ＣＬＳＭ画像は、腫瘍内では、高レベルのＧＦＰ発現を示したが、他の臓器内では、最小限の発現を示した。Ｋ－Ｒａｓ染色（Ｄ１～Ｅ１）、および大血管から遠く離れた、腫瘍深部領域についての拡大図（Ｄ２～Ｅ３）を伴う、全腫瘍イメージング（Ｄ～Ｅ）は、ｅａＥＶが、腫瘍深部への浸透およびｍＲＮＡの送達を容易とすることを示唆する。図１５－１の続き。図１５－２の続き。図１５－３の続き。ｅａＥＶが、低分子薬を、ＭＢ２３１トリプルネガティブ乳がん細胞へとロードしうることを示す図である。ＳＭ薬１を、ｅａＥＶを産生するドナー細胞へと、１：５００の濃度でロードしたところ、このようなｅａＥＶは、この蛍光標識化薬物を、レシピエント細胞へと送達することが可能であった（上）のに対し、１：５００００でロードされた薬物は、希釈され過ぎて、陰性対照としての薬物を導入できなかった（下）。操作されたＥＶのためのカプシドを調製するのに使用された、例示的ＤＮＡプラスミドについてのマップを示す図である。図１８Ａ～１８Ｂは、選択的カーゴローディングの機構、および例示的担体の構造を示す図である。（Ａ）Ａｒｃ５’ＵＴＲが、Ａｒｃカプシドタンパク質による、特異的カーゴｍＲＮＡの認識を可能とするのに対し、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、その翻訳後における、ＡｒｃカプシドｍＲＮＡに対する、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解を加速化させる。まとめると、これらは、過剰発現カプシドｍＲＮＡの干渉を伴わずに、カーゴの選択的ローディングを可能とする。（Ｂ）Ａｒｃタンパク質カプシドおよび核酸カーゴを含有する、操作されたＥＶについての例示的構造である。

天然ナノ担体である、細胞外小胞（ＥＶ）は、それらの生体適合的性格、および所望の標的へと送達する、天然の能力を伴う、射程の長い、分子の細胞間交換を媒介する内因性機能のために、薬物担体の、有望な新規クラスである。これに対し、治療用メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、近年、ますます多くの関心を惹いている。しかし、長鎖ｍＲＮＡの、ＥＶへの、効率的かつ選択的封入は、依然として問題を残している。本明細書で開示される、ウイルス様であるが、レトロトランスポゾンである、Ａｒｃタンパク質カプシドは、ＥＶ（「ＡｒｃＥＶ」）の内腔内に組み込まれる。ＡｒｃＥＶは、ウイルス性ベクターと同様である、高度の有効性と、自然発生小胞としての生体適合性とを保有する。ＡｒｃＥＶがまた、ｍＲＮＡのローディングおよびニューロン間移送においても、天然の役割を果たすことは、ＡｒｃＥＶを、ｍＲＮＡの、他の目的の標的組織および細胞の中でも、脳への送達のための、重要なツールとする。開示される操作されたＡｒｃＥＶ（ｅａＥＶ）は、特異的ｍＲＮＡカーゴの高度に効率的かつ安定的な封入をさらに可能とする。ドナー細胞による、神経炎症性微小環境へのホーミング分子を天然で装備した、白血球由来ｅａＥＶは、ｍＲＮＡの、血液脳関門を越えた、罹患ニューロンへの、効率的送達を容易とする。本開示は、特異的ｍＲＮＡをローディングし、目的の標的組織および細胞へと送達することが可能である、新規の内因性ウイルス様システムを提示する。

カーゴｍＲＮＡ内に含まれるＲＮＡモチーフに結合するウイルス様タンパク質カプシドの組込みにより可能とされる、操作されたＡｒｃＥＶは、高度なｍＲＮＡカーゴローディング／形質導入効率を有する。免疫学的に不活性であるｅａＥＶが、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて、ｍＲＮＡを送達するように、単球由来細胞を含む、多様な種類の細胞から産生され、ｉｎｖｉｖｏにおける神経炎症性微小環境を特異的に標的化することは、この、ナノスケールであり、生体適合的であり、かつ効率的である、ｍＲＮＡ薬物担体の潜在的治療可能性を裏付ける。

細胞外小胞
本明細書で使用される、「細胞外小胞（ＥＶ）」または「小胞」という用語は、多様な生体分子の封入を結果としてもたらす、エンドサイトーシスイベントと、エクソサイトーシスイベントとの組合せによりもたらされる、細胞由来小胞を指す。全ての原核細胞および真核細胞は、ＥＶを、それらの正常生理学の一部として、かつ、後天的異常時に放出する。ＥＶは、エクトソームおよびエクソソームという、２つの類別へと分けられるが、本開示の目的では、「エクトソーム」、「エクソソーム」、および「ＥＶ」という用語は、互換的に使用される。エクトソームは、細胞外への出芽を介して、細胞膜の表面からピンチオフされる小胞であり、サイズ範囲を、直径約５０ｎｍ～１μｍとする、マイクロ小胞、マイクロ粒子、および大型小胞を含む。エクソソームは、サイズ範囲を、エンドソーム由来の直径約４０～１６０ｎｍ（平均約１００ｎｍ）とするＥＶである。このような封入は、治療用核酸を、酵素による分解、または他の環境ストレス（例えば、イオン強度、ｐＨなど）から保護しうる。タンパク質の、ＥＶとの会合は、細胞外環境および細胞内環境のいずれにおいても、安定性をもたらす他、細胞間コミュニケーションのための、細胞標的化機構も容易とする。

一部の実施形態では、ＥＶは、原核生物、真核生物、またはウイルスにおいて創出される。一部の実施形態では、操作されたＥＶは、それらが、単細胞生物であれ、多細胞生物であれ、ＤＮＡを含有する非生物であれ、酵母、細菌、ウイルス、原生生物、または他の種類の細胞において作製される。

エクソソームは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞（ＤＣ）、およびマスト細胞などの免疫細胞を含む、多くの異なる種類の細胞により産生される。エクソソームはまた、例えば、神経膠芽腫細胞、血小板、網状赤血球、ニューロン、腸上皮細胞、および腫瘍細胞によっても産生される。開示された組成物および方法における使用のためのエクソソームは、上記で同定された細胞を含む、任意の適切な細胞に由来しうる。エクソソームはまた、血漿、尿、羊水、および悪性腫瘍浸出液などの体液からも単離されている。大量産生に適するエクソソーム産生細胞の非限定例は、樹状細胞（例えば、未成熟樹状細胞）、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ）細胞、２９３Ｔ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびヒトＥＳＣ由来間葉系幹細胞を含む。

一部の実施形態では、エクソソームは、未成熟ＤＣなどのＤＣに由来する。未成熟ＤＣから産生されたエクソソームは、ＭＨＣ－ＩＩ、ＭＨＣ－Ｉ、またはＣＤ８６を発現させない。このように、これらのエクソソームは、ナイーブＴ細胞を著明な程度には刺激せず、混合リンパ球反応物中における応答を誘導できないことから、未成熟樹状細胞から産生されたエクソソームが、遺伝子素材の送達における使用のための、良好な候補物質となることを可能とする。

エクソソームが送達される患者における免疫応答の発生を低減または回避するように、エクソソームはまた、任意の自家患者由来細胞、異種ハプロタイプマッチ細胞、または異種幹細胞からも得られる。任意のエクソソーム産生細胞は、この目的のために使用される。

細胞から産生されたエクソソームは、任意の適切な方法により、培養培地から回収される。典型的に、エクソソームの調製物は、細胞培養物または組織上清から、遠心分離、濾過、またはこれらの方法の組合せにより調製される。例えば、エクソソームは、大型粒子をペレット化させる、低速（＜２００００ｇ）遠心分離である示差的遠心分離に続く、エクソソームをペレット化させる、高速（＞１０００００ｇ）遠心分離、適切なフィルター（例えば、０．２２μｍフィルター）によるサイズ濾過、勾配超遠心分離（例えば、スクロース勾配による）、またはこれらの方法の組合せにより調製される。

開示されるエクソソームは、任意の適切な手段により、対象へと投与される。ヒト対象または動物対象への投与は、非経口、筋内、脳内、血管内、皮下、または経皮投与から選択される。一部の実施形態では、送達法は、注射による送達法である。好ましくは、注射は、筋内注射または血管内（例えば、静脈内）注射である。医師は、治療を必要とする各患者のために、投与経路を決定することができるであろう。

エクソソームは、好ましくは、組成物として送達される。組成物は、非経口、筋内、脳内、血管内（静脈内を含む）、皮下、または経皮投与のために製剤化される。非経口投与のための組成物は、また、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加剤も含有しうる、滅菌水溶液を含みうる。エクソソームは、エクソソームに加えて、薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、および他の薬学的に許容される担体または賦形剤などを含みうる、医薬組成物中において製剤化される。

本開示についての一部の実施形態では、操作されたＥＶの代表的な組成物は、細胞膜構成要素（例えば、構造脂質および膜タンパク質）、Ａｒｃのタンパク質またはタンパク質モチーフ（例えば、ＡｒｃのＭＡまたはＣＡドメイン）、濃縮ＲＮＡ、および潜在的な他のカーゴ構成要素（例えば、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、栄養物、代謝物、および生体活性化合物）を含む。操作されたＡｒｃＥＶは、所望のカーゴＲＮＡを濃縮し、望ましくない細胞構成要素のパッケージングを最小化する。

本開示の一部の実施形態は、Ａｒｃタンパク質、およびＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含むカーゴｍＲＮＡを含む細胞外小胞組成物を含む。

細胞外小胞組成物についての、一部の実施形態では、Ａｒｃタンパク質は、カーゴｍＲＮＡのＡｒｃ５’ＵＴＲ配列に結合する。結合は、カーゴｍＲＮＡの、エクソソームへのパッケージングを容易とする。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、カーゴｍＲＮＡの、ＥＶへのローディングを改善し、ローディングは、少なくとも２５％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、カーゴｍＲＮＡの、ＥＶへのローディングを改善し、ローディングは、少なくとも５０％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、カーゴｍＲＮＡの、ＥＶへのローディングを改善し、ローディングは、少なくとも７５％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、カーゴｍＲＮＡの、ＥＶへのローディングを改善し、ローディングは、少なくとも１０００％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、カーゴｍＲＮＡの、ＥＶへのローディングを改善し、ローディングは、少なくとも１５０％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、カーゴｍＲＮＡの、ＥＶへのローディングを改善し、ローディングは、少なくとも２００％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、カーゴｍＲＮＡの、ＥＶへのローディングを改善し、ローディングは、少なくとも２５０％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ＲＮＡによる、レシピエント細胞への形質導入を改善する。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ＲＮＡによる、レシピエント細胞への形質導入を改善し、形質導入は、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を有さないカーゴｍＲＮＡに対して、少なくとも２５％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ＲＮＡによる、レシピエント細胞への形質導入を改善し、形質導入は、少なくとも５０％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ＲＮＡによる、レシピエント細胞への形質導入を改善し、形質導入は、少なくとも７５％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ＲＮＡによる、レシピエント細胞への形質導入を改善し、形質導入は、少なくとも１００％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ＲＮＡによる、レシピエント細胞への形質導入を改善し、形質導入は、少なくとも１２５％改善される。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ＲＮＡによる、レシピエント細胞への形質導入を改善し、形質導入は、少なくとも１５０％改善される。

一部の実施形態では、ＥＶ組成物は、１つまたはそれ以上の低分子をさらに含む。一部の実施形態では、ＥＶは、所望の低分子を含む薬物溶液中に浸漬される。一部の実施形態では、薬物溶液は、所望の低分子を、所定の濃度で含有する。次いで、ＥＶは、受動輸送過程において、低分子を取り込む。一部の実施形態では、低分子は、ＥＶの膜が、低分子の、ＥＶの内腔への侵入を可能とするように操作される、超音波処理などの物理的手段を介して、ＥＶへと移入される。

「低分子」とは、生物学的過程を調節しうる、低分子量の有機化合物を意味する。低分子は、典型的に、１モル当たり少なくとも１００ｇ、１モル当たり２００ｇ、または１モル当たり５００ｇ、１モル当たり１０００ｇ、１モル当たり２０００ｇであり、かつ、１モル当たり５，０００ｇ、１モル当たり１０，０００ｇ、１モル当たり２０，０００ｇ、１モル当たり５０，０００ｇ、または１モル当たり１００，０００ｇ以下（例えば、１モル当たり１００～５０，０００ｇ、１モル当たり１００～１０，０００ｇ）の分子量を有する。多くの医薬は、低分子であり、低分子薬と呼ばれる。本明細書で使用される、低分子および低分子薬は、互換的に使用される。

低分子の一部の例は、インスリン、アスピリン、および抗ヒスタミン剤である。一部の実施形態では、低分子は、脂肪酸、グルコース、アミノ酸、およびコレステロールの他、脂質、グリコシド、アルカロイド、および天然フェノールなどの二次代謝物などの生体分子を含む。一部の実施形態では、低分子は、神経疾患を処置するのに使用される。一部の実施形態では、低分子は、自己免疫障害を処置するのに使用される。一部の実施形態では、低分子は、化学療法剤または抗がん薬である。一部の実施形態では、低分子は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達などの細胞内シグナル伝達経路に関与するチロシンキナーゼ細胞表面受容体または細胞内セリン／トレオニンキナーゼを標的化する阻害剤である。一部の実施形態では、低分子は、アポトーシスタンパク質、後成的調節因子、およびがん細胞増殖の調節を解除する他のタンパク質を標的化する阻害剤である。

Ａｒｃ
Ａｒｃ（活性調節細胞骨格関連タンパク質）は、α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチルイソキサゾール－４－プロピオン酸（ＡＭＰＡ）型グルタミン酸受容体の、エンドサイトーシスによるトラフィッキングを調節する。Ａｒｃ活性は、シナプス強度およびニューロン可塑性と連関する。実験マウスモデルにおける、Ａｒｃ喪失表現型は、長期記憶形成の欠損ならびにニューロンの活性および可塑性の低減を含んだ。

Ａｒｃは、レトロウイルスＧａｇタンパク質と同様の分子特性を呈する。Ａｒｃと、レトロウイルスＧａｇポリタンパク質との間には、構造／機能的関係が存在すると考えられる。Ａｒｃは、Ｇａｇ様タンパク質ドメインを保有する、家畜化レトロトランスポゾンについての、コンピュータによる探索において同定された。Ａｒｃは、Ｔｙ３／ｇｙｐｓｙレトロトランスポゾンファミリーに由来した可能性がある、ウイルス性群特異抗原（Ｇａｇ）ポリタンパク質内に見出される構造エレメントを含有する（Ｃａｍｐｉｌｌｏｓら、ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．、２２：５８５～５８９、２００６；Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、Ｓｅｍｉｎ．ＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．、７７、７３～７８、２０１８；Ｚｈａｎｇら、Ｎｅｕｒｏｎ、８６、４９０～５００、２０１５）。生化学的研究は、哺乳動物Ａｒｃが、可撓性リンカーにより隔てられた、正帯電Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）と、負帯電Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）とを有することを示した（Ｍｙｒｕｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、４６８、２０１５）。単離ＣＴＤについての結晶構造解析は、いずれもが、ＨＩＶＧａｇのカプシド（ＣＡ）ドメインとの、顕著な三次元相同性を伴う、２つの小葉部を明らかにした（Ｚｈａｎｇら、２０１５）。レトロウイルスでは、ＣＡの自己会合は、Ｇａｇポリタンパク質の、未成熟カプシドシェルへの組織化を可能とする（Ｌｉｎｇａｐｐａら、ＶｉｒｕｓＲｅｓ．、１９３、８９～１０７、２０１４；ＰｅｒｉｌｌａおよびＧｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、４１、４１０～４２０、２０１６）。注目すべきことに、ショウジョウバエおよびラットに由来する組換えＡｒｃは、その後、ＨＩＶＧａｇカプシドと類似したスフェロイド粒子へと自己組織化することが示された（Ａｓｈｌｅｙら、２０１８；Ｐａｓｔｕｚｙｎら、Ｃｅｌｌ、１７２、２７５～２８８．ｅ１８、２０１８）。Ａｒｃカプシドは、細胞外小胞へと放出され、ＲＮＡカーゴを、レシピエント細胞へと搬送することが可能である（Ａｓｈｌｅｙら、Ｃｅｌｌ、１７２、２６２～２７４、２０１８；Ｐａｓｔｕｚｙｎら、２０１８）。これらの研究は、Ａｒｃを、内因性ニューロン性レトロウイルスとして含意し、Ａｒｃの、ウイルス様カプシドへの、オリゴマー性組織化は、ＲＮＡの捕捉および細胞間移送を媒介する（ＰａｒｒｉｓｈおよびＴｏｍｏｎａｇａ、Ｃｅｌｌ、１７２、８～１０、２０１８；Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、２０１８）。

一部の実施形態では、Ａｒｃは、非ヒトＡｒｃポリペプチドである。一部の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、全長Ａｒｃポリペプチド（例えば、全長非ヒトＡｒｃポリペプチド）を含む。他の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、カプシドの形成に参与する、切断型Ａｒｃポリペプチドなど、非ヒトＡｒｃの断片を含む。さらなる実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、ドメインのうちの少なくとも１つが、カプシドの形成に参与する、非ヒトＡｒｃポリペプチドの、１つまたはそれ以上のドメインを含む。さらなる実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、組換えＡｒｃポリペプチドである。

一部の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、少なくともそのＲＮＡ結合性ドメインが、ヒトＡｒｃに照らして天然でないカーゴに結合するように修飾された、ヒトＡｒｃポリペプチドである。一部の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、少なくともそのＲＮＡ結合性ドメインが、ヒトＡｒｃタンパク質に照らして天然でないカーゴに結合するように修飾された、全長ヒトＡｒｃポリペプチドを含む。他の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、少なくともそのＲＮＡ結合性ドメイン内に、修飾（複数可）を含むヒトＡｒｃ断片を含む。さらなる実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、ドメインのうちの少なくとも１つが、カプシドの形成に参与し、ＲＮＡ結合性ドメインが、天然ヒトＡｒｃタンパク質が結合しないカーゴに結合するように修飾された、ヒトＡｒｃポリペプチドの、１つまたはそれ以上のドメインを含む。さらなる実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、少なくともＲＮＡ結合性ドメインが、ヒトＡｒｃタンパク質に照らして天然でないカーゴのローディングを可能とするように修飾された、組換えヒトＡｒｃポリペプチドである。

当技術分野では、Ａｒｃポリペプチドの多様なドメインについて記載されている。例えば、マウスＡｒｃ遺伝子の、高度に保存的な固有のオーソログが、四足類（哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類）を通して同定された、Ｐａｓｔｕｚｙｎら、Ｃｅｌｌ、１７２、２７５～２８８．ｅ１８、２０１８；またはＨａｌｌｉｎら、ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＡｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓＲｅｐｏｒｔｓ、２６、１００９７５、２０２１を参照されたい。例えば、カプシドの形成に参与する、ヒトＡｒｃポリペプチドのドメインは、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、受託番号：２３２３７の下に報告されているヒトＡｒｃポリペプチド（配列番号１３）などのヒトＡｒｃポリペプチドのアミノ酸２０５～３６４を含む。哺乳動物種など、他の種に由来するＡｒｃポリペプチドもまた、利用されうる。

一部の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、配列番号１３に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、配列番号１４に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、配列番号１５に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、配列番号１６に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。

Ａｒｃのカプシド
Ａｒｃ単量体は、ウイルス型カプシドへとオリゴマー化する。Ａｒｃは、ウイルス様カプシドに相似するオリゴマー構造を、自発的に形成する。ラットＡｒｃカプシドの精製調製物は、平均値直径を３２±０．２ｎｍとする、二重シェル構造を呈した（Ｐａｓｔｕｚｙｎら、Ｃｅｌｌ、１７２、２７５～２８８ｅ２１８（２０１８））。同様に、細菌により発現され、精製された、Ａｒｃのショウジョウバエ属相同体であるｄＡｒｃ１もまた、カプシド様構造へと自己組織化される。昆虫細胞発現系内で発現された、精製Ａｒｃタンパク質もまた、類似のウイルス様カプシドへと組織化され、これらの全ては、Ａｒｃのオリゴマー化が、細菌内発現のアーチファクトではないことを示す。未成熟レトロウイルス型カプシドは、非切断型Ｇａｇポリタンパク質により形成され、主要な安定化相互作用は、ＣＡ領域のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）によりもたらされる（Ｍａｔｔｅｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５４、１４３４～１４３７（２０１６））。Ａｒｃのショウジョウバエ属相同体は、ウイルス様挙動を示し、相同体の自己組織化構造は、ＨＩＶ－１カプシドおよびＴｙ３カプシドの自己組織化構造と、緊密に合致した（Ｅｒｌｅｎｄｓｓｏｎら、ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉ．、２３、１７２－１７５（２０２０））。いずれのショウジョウバエＡｒｃ相同体も、一体に、カプシドシェルを枠づける、五量体および六量体を形成したことは、他のウイルス型カプシドと符合する。相同体はまた、カプシドの表面上に、突出部も形成した（ＢｕｄｎｉｋおよびＴｈｏｍｓｏｎ、ＮａｔｕｒｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）。Ａｒｃタンパク質カプシドは、ｍＲＮＡをＥＶの内腔へと天然濃縮し、ｍＲＮＡのローディングを、ＤＮＡ、タンパク質、代謝性老廃物など、他の細胞内構成要素に対して優先する。Ａｒｃタンパク質は、ＡｒｃｍＲＮＡを封入するカプシドを形成するようにオリゴマー化する。内因性ＡｒｃｍＲＮＡの非存在下で、Ａｒｃタンパク質カプシドは、他の夥多なＲＮＡをパッケージングし、移送しうる（Ｐａｓｔｕｚｙｎら、Ｃｅｌｌ、１７２、２７５～２８８ｅ２１８（２０１８））。

ＡｒｃｍＲＮＡ
「ＡｒｃｍＲＮＡ」とは、本明細書で記載されるＡｒｃポリペプチドをコードするｍＲＮＡを意味する。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ５’ＵＴＲである、５’側非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲである、３’ ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、３つの配列のうちの２つまたは全てが異種である、すなわち、異なる種に由来する、Ａｒｃ５’ＵＴＲ、ＡｒｃポリペプチドをコードするＡｒｃｍＲＮＡコード配列、およびＡｒｃ３’ＵＴＲを含む点において、キメラである。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、全てが、同じ種に由来する、Ａｒｃ５’ＵＴＲ、ＡｒｃポリペプチドをコードするＡｒｃｍＲＮＡコード配列、およびＡｒｃ３’ＵＴＲを含む。

一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ５’ＵＴＲなどの５’ＵＴＲを含まない。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ５’ＵＴＲでない５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを含まない。

一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲなどの３’ＵＴＲを含まない。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲなどの３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列でない３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含まない。

一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、ヒトＡｒｃポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、非ヒトＡｒｃポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、マウスＡｒｃポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、ラットＡｒｃポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。

一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、非哺乳動物に由来するＡｒｃポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、ショウジョウバエＡｒｃポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。

一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号９に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号９の核酸を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号１０に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号１０の核酸を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号１１に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号１１の核酸を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号１２に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号１２の核酸を含む。

一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、ポリ（アデニル化）シグナルを含む。

一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む。

Ａｒｃ５’ＵＴＲ
ＡｒｃおよびＧａｇは、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、それらの５’側非翻訳領域（ＵＴＲ）を伴わなければ、特定のｍＲＮＡに対する特異性をほとんど示さないことが報告された（Ａｓｈｌｅｙら、Ｃｅｌｌ、１７２、２６２～２７４、ｅ２１１（２０１８）；Ｃｏｍａｓ－Ｇａｒｃｉａら、Ｖｉｒｕｓｅｓ、８、（２０１６））。本明細書で使用される、「Ａｒｃ５’ＵＴＲ（Ａ５Ｕ）」とは、自然発生のＡｒｃｍＲＮＡの５’ＵＴＲを意味する。これは、タンパク質へと翻訳されない領域である。

上記で記載された通り、一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＡｒｃｍＲＮＡについて任意である。例えば、一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを含み；他の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを含まず；他の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ５’ＵＴＲでない５’ＵＴＲを含み；他の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを、全く含まない。

ＡｒｃｍＲＮＡがＡ５Ｕを含む実施形態では、Ａ５Ｕは、哺乳動物に由来するＡ５Ｕ配列である。さらなる実施形態では、Ａ５Ｕは、ヒトに由来する。他の実施形態では、Ａ５Ｕは、マウスに由来する。他の実施形態では、Ａ５Ｕは、ラットに由来する。一部の実施形態では、Ａ５Ｕは、ショウジョウバエに由来する。

一部の実施形態では、Ａ５Ｕは、カーゴ構築物へと付加される。Ａ５Ｕの、カーゴ構築物への付加は、カーゴローディングの高度な有効性を可能とした。

一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲは、配列番号１に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲは、配列番号１を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲは、配列番号２に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲは、配列番号２を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲは、配列番号３に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲは、配列番号３を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲは、配列番号４に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ５’ＵＴＲは、配列番号４を含む。

Ａｒｃ３’ＵＴＲ
本明細書で使用される、「３’ＵＴＲ配列」という用語は、細胞外小胞内のタンパク質に結合することが可能である、ｍＲＮＡ由来３’側非翻訳リピート配列を指す。例えば、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、細胞外小胞内のＡｒｃタンパク質に結合しうる。このような３’ＵＴＲの、タンパク質への結合は、３’ＵＴＲ配列だけにより生じる場合もあり、３’ＵＴＲ配列が、非Ａｒｃ核酸へと連結された場合に生じる場合もある。

一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ配列を含まない。他の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ配列を含む。他の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列である、３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列でない、３’ＵＴＲを含む。

本開示の一部の実施形態では、タンパク質へと翻訳された後における、ＡｒｃｍＲＮＡの、迅速なクリアランスを可能とするように、Ａｒｃカプシド遺伝子の改変が施される。一部の実施形態では、このような改変は、多様な分子クローニング法を使用する、ラットＡｒｃ３’ＵＴＲ配列（部分Ａ３Ｕまたは全長Ａ３Ｕ）の付加により達成される。Ａｒｃ３’ＵＴＲは、ヒト、マウス、ラット（ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：２３２３７、１１８３８、５４３２３）に由来する場合もあり、ショウジョウバエ（ｄＡｒｃ１；ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：３６５９５）に由来する場合もある。これらの実施形態は、操作されたＥＶのための例示的カプシドを作出するようにクローニングされた、例示的ＤＮＡプラスミドのマップをもたらす（図１７）。翻訳後における、ＡｒｃｍＲＮＡの迅速な除去は、担体の産生を妨げずに、標的細胞内における、Ａｒｃの過剰発現を回避する（図１８Ａ）。本開示は、全ての種に由来する、全長Ａｒｃタンパク質、Ａｒｃタンパク質モチーフ、およびこれらのモチーフの任意のコドン最適化配列をコードする配列への、Ａ３Ｕ配列の付加をさらに含む。本開示には、Ａ３Ｕ配列を有するＡｒｃｍＲＮＡ配列、およびＡ３Ｕ配列を有さないＡｒｃｍＲＮＡ配列のいずれもが含まれる。

一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、哺乳動物Ａｒｃ３’ＵＴＲである。さらなる実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、ヒトＡｒｃ３’ＵＴＲである。他の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、マウスＡｒｃ３’ＵＴＲに由来する。他の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、ラットＡｒｃ３’ＵＴＲに由来する。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、哺乳動物Ａｒｃ３’ＵＴＲではない。さらなる実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、ショウジョウバエＡｒｃ３’ＵＴＲに由来する。

一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、配列番号５に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲｍＲＮＡは、配列番号５を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、配列番号６に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、配列番号６を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、配列番号７に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、３’ＡｒｃＵＴＲは、配列番号７を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、配列番号８に対して、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ３’ＵＴＲは、配列番号８を含む。

カーゴ
一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、ＡｒｃＥＶ）は、カーゴを含む。一部の実施形態では、ＡｒｃＥＶは、カーゴｍＲＮＡを含む。本明細書で使用された、「カーゴｍＲＮＡ」という用語は、Ａｒｃ遺伝子の部分でないか、またはＡｒｃ遺伝子から転写された、任意の核酸を指す。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、ペプチド、酵素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗原、抗体、抗体の部分、凝固因子、調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写タンパク質、および／または受容体をコードする。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、レポータータンパク質をコードする。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、および／またはリコンビナーゼレポーターをコードする。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、治療用タンパク質と、レポータータンパク質との組合せを含む。

一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、Ａｒｃ５’ＵＴＲを含む。このような実施形態では、カーゴｍＲＮＡおよびＡｒｃ５’ＵＴＲ配列は、配列が、上流のＡｒｃ５’ＵＴＲで始まり、所望のタンパク質をコードする、カーゴｍＲＮＡ配列の部分を後続させる、１つの連続配列であるようにデザインされる。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、その５’ＵＴＲだけが、Ａｒｃ５’ＵＴＲであり、そのコード部分は、非Ａｒｃコード部分である、キメラｍＲＮＡである。

一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ配列を含まない。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列でない、３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、カーゴｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列である３’ＵＴＲ配列を含む。

一部の実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡポリマー、例えば、一本鎖ＲＮＡポリマー、二本鎖ＲＮＡポリマー、または一本鎖ＲＮＡポリマーと、二本鎖ＲＮＡポリマーとのハイブリッド体である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、アンチセンスオリゴリボヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、または非コードＲＮＡを含み、かつ／またはこれらをコードする。

一部の実施形態では、核酸分子は、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド体を含む。

一部の実施形態では、核酸分子は、場合により、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド体を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

一部の実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡｉ分子を含み、かつ／またはこれらをコードする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子である。他の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ｓｉＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、場合により、二本鎖であるか、またはヘアピンとしてのｍｉＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡであり、さらに場合により、前駆体分子として封入される。

一部の実施形態では、核酸分子は、核酸ベースの治療における使用のための核酸分子である。一部の実施形態では、核酸分子は、遺伝子発現の調節（例えば、ｍＲＮＡの翻訳または分解のモジュレーティング）、ＲＮＡスプライシングのモジュレーティング、またはＲＮＡ干渉のための核酸分子である。場合によって、核酸分子は、遺伝子発現の調節、ＲＮＡスプライシングのモジュレーティング、またはＲＮＡ干渉における使用のための、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子を含み、かつ／またはこれらをコードする。

一部の実施形態では、核酸分子は、遺伝子編集における使用のための核酸分子である。例示的な遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、核酸分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＺＦＮシステム、またはＴＡＬＥＮシステムに関与する構成要素を含み、かつ／またはこれらをコードする。

一部の実施形態では、カーゴは、治療剤である。一部の実施形態では、カーゴは、低分子、タンパク質、ペプチド、抗体もしくはその結合性断片、ペプチド模倣体、またはヌクレオチド模倣体である。一部の実施形態では、カーゴは、例えば、１つまたはそれ以上の薬物を含む、治療用カーゴである。一部の実施形態では、カーゴは、プロファイリングのための診断用ツール、例えば、１つまたはそれ以上のマーカー（１つまたはそれ以上の疾患表現型と関連するマーカーなど）を含む。さらなる実施形態では、カーゴは、イメージングツールを含む。

一部の実施形態では、核酸分子は、治療剤のための抗原産生、および／または予防用ワクチン産生における使用のための核酸分子である。例えば、核酸分子は、発現され、所望の免疫応答（例えば、炎症促進性免疫応答、抗炎症性免疫応答、Ｂ細胞応答、抗体応答、Ｔ細胞応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、Ｔｈ１免疫応答、Ｔｈ２免疫応答、Ｔｈ１７免疫応答、Ｔｒｅｇ免疫応答、またはこれらの組合せ）を誘発する抗原をコードする。

一部の実施形態では、核酸分子は、核酸酵素を含む。核酸酵素とは、触媒活性を有する、ＲＮＡ分子（例えば、リボザイム）またはＤＮＡ分子（例えば、デオキシリボザイム）である。一部の実施形態では、核酸分子は、リボザイムである。他の実施形態では、核酸分子は、デオキシリボザイムである。場合によって、核酸分子は、バイオセンサーおよび／または分子スイッチとして機能するＭＮＡｚｙｍｅである（例えば、Ｍｏｋａｎｙら、ＪＡＣＳ、１３２（２）：１０５１～１０５９（２０１０）を参照されたい）。本開示の一部の実施形態は、ＡｒｃｍＲＮＡの他、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を有するカーゴｍＲＮＡを含む、ＲＮＡ転写物組成物を含む。

ベクター
本開示の一部の実施形態は、ＡｒｃｍＲＮＡをコードする第１のＤＮＡと、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を有するカーゴｍＲＮＡをコードする第２のＤＮＡとを含む組換えシステムを含む。一部の実施形態では、組換えシステムは、第１のＤＮＡと、第２のＤＮＡとを含む、単一の構築物を含む。一部の実施形態では、組換えシステムは、第１のＤＮＡを含む第１の構築物と、第２のＤＮＡを含む第２の構築物とを含む。一部の実施形態では、構築物は、異種ＤＮＡ調節エレメントをさらに含み、この場合、「ＤＮＡ調節エレメント」とは、ＲＮＡポリメラーゼを動員するかまたは阻止するために、ある特定の転写因子が認識し、結合するＤＮＡ配列である。さらなる実施形態では、異種ＤＮＡ調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、またはこれらの組合せを含む。

第１の核酸配列および第２の核酸配列の各々は、発現ベクターへと、作動可能に挿入される。一部の実施形態では、第１の核酸配列と、第２の核酸配列とは、共通の発現ベクターへと、作動可能に挿入され、一体に発現される。例えば、一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチドをコードする第２の核酸は、Ａｒｃタンパク質をコードする第１の核酸のイントロンへと、インフレームで挿入される。当技術分野では、遺伝子配列と、適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントとを含有する発現ベクターを構築する方法が周知である。これらの方法は、ｉｎｖｉｔｒｏにおける組換えＤＮＡ法、組換えＤＮＡ合成法、およびｉｎｖｉｖｏにおける遺伝子組換えを含む。このような技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）において記載されている。

ベクターは、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体を含むがこれらに限定されない。発現ベクターは、一般に、挿入されるコード配列の翻訳および／または転写に必要なエレメントである、調節配列を含有する。例えば、コード配列は、好ましくは、所望の遺伝子産物の発現を制御する一助となる、プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結される。バイオテクノロジーにおいて使用されるプロモーターは、意図される遺伝子発現の制御の種類に従い、異なる種類のプロモーターである。プロモーターは、一般に、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは発生段階特異的プロモーター、誘導的プロモーター、および合成プロモーターへと分けられる。

利用されるベクターシステムおよび宿主に応じて、任意の数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントが使用される。哺乳動物細胞システムでは、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが好ましい。

Ａｒｃ細胞外小胞を作製する方法
本開示の一部の実施形態は、ＥＶを作製する方法であって、ＡｒｃｍＲＮＡおよびＡｒｃ５’ＵＴＲを含むカーゴｍＲＮＡを含む細胞を得る工程；細胞を、培地中、ＡｒｃｍＲＮＡによりコードされるＡｒｃタンパク質を発現させる条件下で増殖させる工程でって、細胞は、Ａｒｃタンパク質、およびＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を有するカーゴｍＲＮＡを含む細胞外小胞を産生する、工程；ならびに細胞外小胞を培地から分離する工程を含む方法を含む。一部の実施形態では、ＥＶを作製する方法は、ドナー細胞へと、ＡｒｃｍＲＮＡへと転写されるＤＮＡ構築物、およびカーゴｍＲＮＡへと転写されるＤＮＡ構築物を導入することにより、ＡｒｃｍＲＮＡおよびＡｒｃ５’ＵＴＲを含むカーゴｍＲＮＡを含む細胞を得る工程を含む。一部の実施形態では、ＥＶを作製する方法は、ドナー細胞へと、ＡｒｃｍＲＮＡおよびカーゴｍＲＮＡを導入することにより、ＡｒｃｍＲＮＡおよびＡｒｃ５’ＵＴＲを含むカーゴｍＲＮＡを含む細胞を得る工程を含む。

本明細書で使用される、「ドナー細胞」とは、技術用語である。ドナー細胞は、構築物が、ドナー細胞へと挿入され、細胞が、ＥＶを産生するという点において機能する。例えば、ＡｒｃｍＲＮＡおよびＡｒｃ５’ＵＴＲを含むカーゴｍＲＮＡが、公知であり、下記で記載される方法により、ドナー細胞へと挿入される場合、ドナー細胞は、Ａｒｃポリペプチドを合成するように、ＡｒｃｍＲＮＡを翻訳する。次いで、Ａｒｃポリペプチドは、そのレトロウイルス様出芽機構（Ｇａｇのレトロウイルス様出芽機構と全く同様である）を介して、ＥＶを形成する。全ての細胞は、ＥＶを作り出すので、全ての細胞は、ドナー細胞でありうる。

ドナー細胞は、その標的化特異性を伴うＥＶをもたらしうる。これは、多様な組織の標的化における、異なるドナー細胞型に由来するＥＶの天然の能力に起因する。

一部の実施形態では、ＥＶを作製する方法は、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、造血細胞、結合組織細胞、筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、生殖系列細胞、脂肪細胞、幹細胞、自家由来ｅｘｖｉｖｏ分化細胞、ｉＰＳＣ由来ｅｘｖｉｖｏ分化細胞、がん細胞、およびこれらの組合せから選択されるドナー細胞をさらに含む。さらなる実施形態では、ドナー細胞は、白血球である。一部の実施形態では、ドナー細胞は、自己由来ｅｘｖｉｖｏ分化白血球である。一部の実施形態では、ドナー細胞は、自己由来ｅｘｖｉｖｏ分化単球、マクロファージ、樹状細胞、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、ドナー細胞は、ｉＰＳＣ由来ｅｘｖｉｖｏ分化白血球である。一部の実施形態では、ドナー細胞は、ｉＰＳＣ由来ｅｘｖｉｖｏ分化単球、マクロファージ、樹状細胞、またはこれらの組合せである。

ドナー細胞の創出は、ＡｒｃｍＲＮＡおよびＡ５Ｕへと接合されたカーゴｍＲＮＡである、２つの核酸を、ドナー細胞への移入を介してなされる。この移入は、直接的なマイクロインジェクション、バイオリスティック法による粒子送達、電気穿孔、超音波穿孔、およびレーザーベースの光学トランスフェクションなどの物理的方法；ならびにリン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、リポフェクション、ＦｕＧｅｎｅ、またはデンドリマートランスフェクションなどの化学的方法を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の方法を介してなされる。一部の実施形態では、核酸の、ドナー細胞への導入は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）複合体形成、電気穿孔、カチオン性脂質複合体形成、脂質ナノ粒子媒介送達、マイクロインジェクション、またはアデノウイルスベクターの使用を介してなされる。カーゴｍＲＮＡは、Ａ５Ｕへの接合を必要としないが、ＲＮＡによる、レシピエント細胞への形質導入は、Ａ５Ｕを組み入れない場合、図３Ａ２に見られる通り、低効率であり、低安定性である。

適用
本開示についての一部の態様は、ｍＲＮＡをレシピエント細胞へと送達するための方法を含む。一部の実施形態では、方法は、本明細書で記載される細胞外小胞を得る工程、および細胞外小胞をレシピエント細胞と接触させる工程であって、細胞外小胞は、細胞と融合し、これにより、所望のｍＲＮＡをレシピエント標的細胞へと送達する工程を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡをレシピエント細胞へと送達する方法は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて実施される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡをレシピエント細胞へと送達する方法は、下記で記載される通り、ｉｎｖｉｖｏにおいて実施される。

本開示についての一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、疾患を処置するか、タンパク質を産生するか、細胞死を誘導するか、細胞死を抑制するか、細胞老化を変化させるか、免疫寛容を誘導するか、既存の免疫応答をモジュレートするか、細胞内活性を修飾するか、細胞挙動を修飾するか、またはこれらの組合せをもたらすために、レシピエント細胞へと送達される。

本開示のｅａＥＶは、広範にわたる治療剤において適用されうる。一部の実施形態では、ＥＶは、がんの処置のために使用される。一部の実施形態では、ＥＶは、ウイルス感染を防止および／または処置するのに使用される。一部の実施形態では、ＥＶは、アレルギーの処置および／または防止において使用される。一部の実施形態では、ＥＶは、組織編成を処置するのに使用される。一部の実施形態では、ＥＶは、炎症性疾患を処置するのに使用される。例えば、末梢免疫細胞に由来するＥＶは、炎症状態下で、血液脳関門を越えて、健常組織に影響を及ぼさずに、薬物を、疾患細胞へと送達しうる。このようなＥＶはまた、薬物を、好ましくは、炎症性微小環境へも送達しうる。さらなる実施形態では、ＥＶは、治療剤を、炎症性腫瘍微小環境へと送達する。一部の実施形態では、このようなＥＶの標的は、ウイルス感染の処置のための、ウイルス感染組織を含む。他の実施形態では、ＥＶは、遺伝子治療のために使用される、カーゴｍＲＮＡを含む。

本開示についての一部の態様は、細胞外小胞により、対象を処置するための方法を含む。一部の実施形態では、ＥＶにより、対象を処置するための方法は、ＥＶを得る工程、およびそれを必要とする対象へと投与する工程を含む。一部の実施形態では、ＥＶは、経口、直腸内、静脈内、筋内、皮下、子宮内、脳血管内、または脳室内投与される。一部の実施形態では、ＥＶは、遺伝障害を含む疾患の処置に適合された、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、細胞外小胞は、神経変性疾患、老化関連障害、脳腫瘍、炎症性状態の処置のために投与され、健常細胞に影響を及ぼさずに、血液脳関門を越えて炎症性脳組織へとＲＮＡを特異的に送達する。一部の実施形態では、ＥＶは、腫瘍関連抗原に対応するｍＲＮＡを含み、細胞外小胞は、黒色腫、結腸がん、消化器がん、尿生殖器がん、肝細胞がんを含む、がんの処置のためのがんワクチンとして送達される。一部の実施形態では、ＥＶは、感染性疾患の罹患を防止するように、すなわち、ワクチン接種のために送達される。一部の実施形態では、ＥＶは、自己免疫疾患の処置のために送達される。自己免疫疾患の処置の非限定例は、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）または組換え形であるアナキンラのｍＲＮＡを、ＩＬ－１が鍵となる役割を果たす自己免疫疾患である、関節リウマチの処置のために送達することである。

本開示の別の態様は、ｉｎｖｉｖｏにおいてＡ５Ｕへと連結されたカーゴの構築物をドナー細胞へと送達して、内因性Ａｒｃタンパク質を使用してｉｎｖｉｖｏにおいてＥＶを産生する方法である。一部の実施形態では、構築物は、ＤＮＡとして送達される。一部の実施形態では、構築物は、ＲＮＡとして送達される。一部の実施形態では、構築物は、脂質ナノ粒子、エクソソーム、ウイルス、または別の遺伝子送達法により、ドナー細胞へと送達される。

実施例
以下の実施例は、本開示を例示するのに提示される。実施例は、いかなる形でも、限定的であることが意図されない。

ｍＲＮＡをロードし、送達するための、ｅａＥＶの操作、産生、および単離
ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、ｍＲＮＡを送達するそれらの能力を検証するように、Ａｒｃ小胞を、操作、産生、単離し、特徴付けた（図１Ａ）。この担体システムの２つの構成要素は、多様な適用のために、ホーミング／標的化能が異なる、エンベロープｅａＥＶを産生するように、事実上全てのドナー細胞型へと導入される、ｍＲＮＡカーゴおよびＡｒｃタンパク質カプシドである。カーゴ構築物は、効率的なｍＲＮＡの封入のために操作され、Ａ５Ｕ配列が、カーゴｍＲＮＡ配列の上流に付加された（図１Ａ）。

ヒト／マウス細胞系の他、ｉｎｖｉｖｏマウスモデルにおける内因性Ａｒｃと識別されるので、ラットＡｒｃカプシドを、特徴付けのために使用した。操作されたＡｒｃＥＶ（ｅａＥＶ）を産生するために、ＡｒｃカプシドおよびカーゴＧＦＰｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡを、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞およびマウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）細胞へと送達した（図１Ａ）。ＥＶの産生を最適化するように、拡張／包括滴定／経時実験を実行した（図７～図１１）。ＤＮＡ／ＲＮＡの電気穿孔、ＰＥＩによるＤＮＡトランスフェクション（図７および図１０）、およびリポソームによるＲＮＡトランスフェクション（図８～図１０）を含む、様々なトランスフェクション法について調べた。トランスフェクション試薬の用量は、トランスフェクション後におけるドナー細胞生存率が損なわれていないことを確認し（図７、図８）、過剰量のカプシドｍＲＮＡを導入せずに、ｍＲＮＡの封入を最大化するカプシド／カーゴ構築物の比率を確認し（図９）、ＥＶ回収効率を最大化するための、ドナー／レシピエント細胞内のｍＲＮＡローディングおよびカーゴ発現の経時変化を確認する（図１１）ように、注意深く滴定した。最後に、無血清培養培地中で、８～４０分間にわたり対照ＥＶおよびｅａＥＶを産生するように、リポソーム媒介ＲＮＡトランスフェクションを使用して、ドナー細胞１００万個当たり１２ピコモルのＡｒｃ（４．６３μｇ）、８ピコモルのＧＦＰ（１．８６μｇ）、および８ピコモルのＡ５Ｕ－ＧＦＰ（２．２６μｇ）ｍＲＮＡを送達した。限外濾過により上清培養培地から単離されたｅａＥＶ亜集団を、蛍光ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を介して特徴付けられるように、蛍光Ａｒｃ抗体により標識付けする一方、全ＥＶは、全ての粒子からの光散乱により測定した（図１Ｂ～１Ｃおよび図１２Ａ～１２Ｃ）。全ＥＶを標識付けするのに、一般ＥＶマーカー抗体（抗ＣＤ６３）および細胞膜染料（ＣｅｌｌＭａｓｋ）もまた使用した。Ａｒｃ＋ＥＶ亜集団は、Ａｒｃ小胞より大型であると考えられた（図１Ｄおよび図１２Ａ’～１２Ｃ’）。ラットＡｒｃｍＲＮＡの付加が、Ａｒｃ＋ＥＶを、６．５倍に増大させたことは、ｅａＥＶの効率的産生を示唆する（図１Ｅ～１Ｆ）。

次に、ｅａＥＶおよびＡｒｃカプシドを、それらのサイズおよび形状についてさらに特徴付けるように、陰性染色電子顕微鏡法により検討した（ＮＳＥＭ、図１Ｇ）。標識化ｅａＥＶおよび全ＥＶの蛍光強度を測定し、ＮＴＡ結果と相関させ、相関係数を計算した（図１Ｈおよび表Ｓ１）。これらと共に、蛍光強度リーダーを使用して、ｅａＥＶの、全ＥＶ中絶対粒子濃度を計算するのに、蛍光強度の測定を使用した。これは、回収されたｅａＥＶの形状、サイズ分布、産生効率、および十分な純度を確認した。

個々のｅａＥＶの分泌および導入を視覚化するために、免疫細胞化学（ＩＣＣ）および定量的ハイブリダイゼーション連鎖反応（ｑＨＣＲ）を伴う蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に続く、共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）によりＡｒｃカプシドタンパク質およびカーゴｍＲＮＡを標識付けした（図１Ｉ）。細胞外Ａｒｃ＋／ＧＦＰ＋ｅａＥＶに加えて、それらの細胞外への出芽（おそらくまた、エンドサイトーシスでもある）が、しばしば観察されたのに対し、Ａｒｃ＋ＥＶを含有するカーゴの多小胞体（ＭＶＢ）からの放出は、稀少なイベントであった（図１Ｉ）。ＥＶは、それらのサイズおよび生合成機序の差違に基づき、エクトソームおよびエクソソームへと分類されている。その相同体である、ウイルスカプシドｇａｇタンパク質と同様に、Ａｒｃは、ドナー細胞膜と融合されたＭＶＢから放出されるエクソソームより大型であるエクトソームの、細胞外への直接的な出芽を媒介すると考えられた。実際、ＮＴＡサイズ分布は、ｅａＥＶが、エクソソームであるより、エクトソームである可能性が高いことの、ドナー細胞培養物によるイメージングを確認した（図１Ｄおよび図１２Ａ’～１２Ｃ’）。レシピエント細胞への形質導入時、レシピエントＲＡＷ２６４．７細胞内における、ｅａＥＶの取込みおよびカーゴの翻訳の成功は、ＥＶ膜染色およびＧＦＰ発現についての、生細胞落射蛍光顕微鏡法（ＥＦＭ）により示された（図１Ｊ）。ＧＦＰは、ドナー細胞培養物からのそれらの単離後、レシピエント細胞へのそれらの導入の前に、ＥＶを標識づけするのに使用された細胞膜染料である、ＣＭＤＲ（ＣｅｌｌＭａｓｋＤｅｅｐＲｅｄ）を伴うレシピエント細胞だけにおいて観察された。まとめると、このデータは、ｍＲＮＡをロードし、送達しうる、操作され、産生され、単離されたｅａＥＶを示す。

Ａ５Ｕ－ｅａＥＶは、効能および選択性が改善されたｍＲＮＡをロードしうる
ＨＩＶ－１ゲノムの５’ＵＴＲの選択的パッケージングは、Ｇａｇタンパク質無傷カプシド（ＣＡ）ドメイン格子に依存する。したがって、Ａｒｃタンパク質は、そのＮ末端におけるイオン性相互作用を介して、Ａ５Ｕに結合しうる。

このように、Ａ５Ｕの付加は、ｍＲＮＡカーゴのローディング効率を著明に改善することが仮定された。このように、効率的なカーゴローディングを可能とするために、ＨＩＶ１ＲＮＡゲノムの５’ＵＴＲとして予測される二次構造において、他の種のＡ５Ｕと比較して、より大きな類似性を示すので、ラットＡ５Ｕを、カーゴ構築物へと付加した（図２Ａ）。それぞれ、蛍光標識化Ｃｙ３－ＵＴＰおよびＣｙ５－ＵＴＰを使用して、５’ＵＴＲを有するカーゴ構築物および５’ＵＴＲを有さないカーゴ構築物である、Ａ５Ｕ－ＧＦＰおよびＧＦＰｍＲＮＡ転写物を、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて転写した（ＮＥＢ；ＣｌｅａｎＣａｐ，Ｔ７－ＡＧ，ｗｉｔｈｐｓｅｕｄｏＵＴＰ）。ＥＶは、６つの対照群および実験的群：（１）モックトランスフェクション（ＮＴ）；（２）Ａｒｃ；（３）ＧＦＰ；（４）Ａ５Ｕ－ＧＦＰ；（５）Ａｒｃ／ＧＦＰ；（６）Ａｒｃ／Ａ５Ｕ－ＧＦＰについて、これらのｍＲＮＡの組合せを、ドナー細胞へとトランスフェクトすることにより産生した。カーゴであるＣｙ３＋Ａ５Ｕ－ＧＦＰおよびＣｙ５＋ＧＦＰを保有する、単離された対照および操作されたＥＶについての蛍光強度の読取りを実施して、これらのＥＶのカーゴローディング効率を比較した。結果は、Ａｒｃが、ｍＲＮＡの、ＥＶへのローディングを、有意に促進することを示した（図２Ｂおよび２Ｅ）。ドナー細胞培養物についての落射蛍光顕微鏡法が、細胞外Ｃｙ３＋／Ｃｙ５＋カーゴｍＲＮＡの量の、大幅な増大を示したことは、これらの結果を確認する（図２Ｃ～２Ｄおよび２Ｆ～２Ｇ）。

Ａｒｃカプシドの内部におけるカーゴを、さらに特徴付けるために、ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）に続き、ＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。ＥＶ外膜の溶解後、Ａｒｃ抗体を使用して、Ａｒｃタンパク質カプシドを免疫沈降させ、その後、ＲＴ－ｑＰＣＲによる定量のために、これを消化して、そのｍＲＮＡカーゴを放出させた。これらの実験は、Ａ５Ｕが、カーゴｍＲＮＡの封入を増大させることを示した（図２Ｈ）。ドナー細胞へとトランスフェクトされるカプシドと、カーゴ構築物との比率を最適化したところ、操作されたＡｒｃＥＶは、ｒＡｒｃ、ＧＡＰＤＨ、細胞質ゾルのハウスキーピング遺伝子、およびエクトソーム内で見出される、最も顕著なＲＮＡ種のうちの１つである１８Ｓを含む、他の夥多なＲＮＡの中で、Ａ５Ｕ－ＧＦＰの、効率的（図２Ｉ）かつ選択的（図２Ｊ）ローディングを可能とした。

過剰量のＡｒｃｍＲＮＡが、封入について競合するようにトランスフェクトされるのでない限りにおいて、ドナー細胞内における、カプシドＡｒｃｍＲＮＡの過剰発現にもかかわらず、カーゴＡ５Ｕ－ＧＦＰは、Ａｒｃ自体より優先的に、カプシドへと濃縮された。（１×Ａｒｃ：３×Ａ５Ｕ－ＧＦＰ）の比率を使用した場合、ＡｒｃｍＲＮＡは、任意の細胞外ｅａＥＶ内だけで観察された（図２Ｋ～２Ｑ）。Ａ５Ｕ－ｅａＥＶを有する（Ａｒｃ：Ａ５Ｕ－ＧＦＰ＝１：３）レシピエントＨＥＫ２９３細胞を、免疫細胞化学（ＩＣＨ）および定量的ハイブリダイゼーション連鎖反応（ｑＨＣＲ）を伴う蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に続く、共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）により研究した。各個別のＥＶ内の、カプシドタンパク質、カーゴｍＲＮＡ、およびカプシドｍＲＮＡを、極高分解能において視覚化し、カスタムのＩｍａｇｅＪマクロコードを使用して、これらの重複を、ＩｍａｇｅＪにより定量した。これは、ｅａＥＶが、Ａ５Ｕを有するカーゴＲＮＡを、Ａ５Ｕを有さないカプシドＡｒｃｍＲＮＡと比較して、優先してロードすることを明らかにした。他方、（３×Ａｒｃ：１×Ａ５Ｕ－ＧＦＰ）の比率を導入する場合、著明量のＡｒｃおよび１８Ｓが、Ａｒｃカプシド内に封入されるであろう（図２Ｊ）。トランスフェクション構成要素である、カプシドと、カーゴＲＮＡとの比率を、さらに最適化したところ、同じ量のカーゴｍＲＮＡが存在する場合、より多くのカプシドｍＲＮＡが添加されると、ドナー細胞内のＧＦＰ発現は低下することが見出された（図９）。これは、カーゴｍＲＮＡを封入する、より多くのカプシドが合成され、翻訳のために残された遊離ｍＲＮＡの量を減少させたためである。これらの因子全てを検討し、過剰量のＡｒｃｍＲＮＡを導入せずに、効率的かつ選択的カーゴローディングを達成するのに、［細胞１００万個当たり、１．５×Ａｒｃ（１２ピコモル）：１×Ａ５Ｕ－ＧＦＰ（８ピコモル）］の比率でトランスフェクトすることに決定した。

Ａｒｃは、ＣＮＳ内において、極めて重要な役割を果たし、薬物送達システム内におけるその過剰発現は、回避されるべきである。このため、それらのいずれもが、正確な定量を伴う、単一ＥＶ解析を可能とする、高分解能ｑＨＣＲおよび極高感度ＲＩＰ－ｑＰＣＲにより駆動される、完全な特徴付けを介して、トランスフェクション構成要素の間の比率を最適化した。ｍＲＮＡカーゴの高度に効率的かつ選択的なパッケージングを可能とするｍＲＮＡモチーフである、Ａ５Ｕを付加することにより、ＡｒｃＥＶを、さらに操作した。

Ａ５Ｕ－ｅａＥＶは、ｍＲＮＡカーゴの送達の効能および安定性を改善しうる
ｍＲＮＡ薬物担体としてのＡ５Ｕ－ｅａＥＶの有効性および安定性は、レシピエント細胞内の、カーゴｍＲＮＡの取込みの、１週間にわたる増大により検証した（図３Ａ１）。興味深いことに、Ａ５Ｕを伴わない場合、ＲＮＡによる、レシピエント細胞への形質導入は、効率性が低下し、より重要なことに、安定性が低下すると考えられた（図３Ａ２）。機構は、カプシドを安定化させるのに、その固有のゲノムの５’ＵＴＲを要求する、ＨＩＶｇａｇと類似する可能性が高い。それらの、レシピエント細胞への導入後における、ＥＶの挙動を、図３Ｂ１～３Ｄ６に示す：１５分後において、蛍光ｍＲＮＡカーゴを保有するＥＶは、レシピエント細胞膜へとドッキングし始めた（図３Ｂ１～３Ｂ４）；１時間後以降、細胞内蛍光が観察され、４時間後までに、事実上全てのレシピエント細胞が、Ｃｙ３＋Ａ５Ｕ－ｅａＥＶを受容したのに対し、対照は、それほど効率的ではなかった（図３Ｃ１～３Ｃ４）；取込み効率における、この利点は、時間経過に渡り、大幅に拡大され、全ての細胞が、カーゴを有しただけでなく、また、各細胞内のカーゴも増大した（図３Ａ１および３Ｄ１～３Ｄ６）。同じ量の全ＥＶを、各試料群へと添加したことを強調することが必要である。染料であるＣＭＤＲを使用して全ＥＶを定量する、迅速な蛍光読取りを、上記の実施例１でなされた通りに使用した。染料濃度の注意深い最適化により、この方法は、全ＥＶの相対量を、正確に定量した（図３Ｅおよび図１３）。ＣＭＤＲ＋ＥＶを、レシピエント細胞へと添加し、１時間後に、平均値蛍光を測定したところ、結果は、同様の数の全ＥＶが、レシピエント細胞により取り込まれたことを示唆した（図３Ｆ）。こうして、Ａ５Ｕ－ｅａＥＶは、ｍＲＮＡカーゴの送達効率および送達安定性を、有意に改善した。

Ａ５Ｕ－ｅａＥＶ送達を介する、ＧＦＰ発現の一貫した増大（図３Ｇ）もまた、観察された。Ａｒｃ／Ａ５Ｕ－ＧＦＰが、ドナー細胞内のｍＲＮＡ封入、およびレシピエント細胞によるｍＲＮＡの取込みを、実質的に促進するにもかかわらず、ＲＡＷ２６４．７レシピエント細胞は、弱く、疎らなＧＦＰ発現を示した。これは、ｅａＥＶカーゴの放出および翻訳が、ニューロン内だけでなく、免疫細胞内においてもまた、活性に依存するためである可能性が高い。ＲＡＷ２６４．７に加えて、このカーゴ翻訳の増大はまた、トリプルネガティブ乳がん細胞内でも検証された（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１；図３Ｈ）。結論として述べると、Ａ５Ｕ－ｅａＥＶは、ｉｎｖｉｔｒｏにおける効率および安定性が改善されたｍＲＮＡを送達しうる。

白血球由来Ａ５Ｕ－ｅａＥＶは、ＢＢＢを越えてｍＲＮＡを効率的に送達し、神経炎症を特異的に標的化しうる
血液脳関門（ＢＢＢ）とは、末梢循環を、中枢神経系（ＣＮＳ）から隔離し、高分子医薬の、脳への侵入を防止する、高度に動的かつ選択的な半透過性境界部である。ＢＢＢは、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の連鎖、それらの密着結合、基底膜、周皮細胞、および星状細胞による末端部から構成される。ＢＭＥＣは、正常では、免疫細胞の辺縁化および脳への遊走を防止するように、末梢内皮細胞と比較して、低レベルの白血球接着分子を発現させる。ＢＢＢは、炎症老化ともまた称される、加齢関連低悪性度炎症、神経変性疾患の他、全身炎症および二次損傷（例えば、脳卒中）など、より重度の病理学的変化により破壊される。脳に由来するこれらの炎症性刺激に応答して、ＢＭＥＣは、透過性および白血球接着分子発現の増大を呈し、より多くの白血球（例えば、マクロファージおよびＤＣ）および白血球由来ＥＶが、ＢＢＢを越えて、脳に侵入することを可能とすることが示されている。白血球ＥＶは、脳浸潤免疫細胞を伴わずに、独立に脳に侵入するが、このようなＥＶの蓄積は、炎症脳内で増大するようになり、ＢＢＢの透過性をさらに高める。これは、ＥＶを、脳への薬物送達のための、重要な候補物質とする。

白血球ＥＶの神経炎症標的化能に加えて、ニューロン間ｍＲＮＡ移動における、ＡｒｃＥＶの天然の役割は、ニューロンによるこれらの小胞の取込みをさらに改善する。さらに、Ａｒｃカプシドは、放出が誘発されるまで、カーゴｍＲＮＡを、ＲＮアーゼによる分解から保護し、それらの安定性を増大させる。白血球ｅａＥＶの、これらの天然の利点、および上記で観察された、ｍＲＮＡカーゴのローディングを増大させる改善を踏まえると、これらのＥＶは、ｍＲＮＡをＣＮＳへと十分に送達し、神経炎症を標的化しうる。

ｉｎｖｉｖｏ研究のために、免疫学的に不活性のＥＶのプールを産生するため、自己由来ドナー白血球を、ｅｘｖｉｖｏにおいて、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプが同種であるマウスから採取されたＢＭ細胞から分化させた。大腿骨から単離したら、ＢＭ細胞を、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４と共に、７日間にわたり培養した（図４Ａ～４Ｂ）。マクロファージおよびＤＣのいずれに由来するＥＶも、ＢＢＢを越えることを裏付けたので、両集団のための培養プロトコールを利用し、単球由来ＤＣ、単球由来マクロファージ、および従来型ＤＣを含むが、これらに限定されない亜集団を培養した（図４Ｃ）。

上記で記載された通り、対照群および実験群のＥＶは、（１）モックトランスフェクションによる陰性対照（ＮＣ）；（２）Ａｒｃ；（３）ＧＦＰ；（４）Ａ５Ｕ－ＧＦＰ；（５）Ａｒｃ／ＧＦＰ；（６）Ａｒｃ／Ａ５Ｕ－ＧＦＰをトランスフェクトすることにより、産生し、単離し、特徴付けた。ＢＭ－ＤＣ／マクロファージは、その固有のＥＶを取り込みうる（図４Ｄ）。分泌と取込みとの間の平衡の微調整は、極めて重要であった。これらの実験のために、ドナー細胞のコンフルエンシーに応じて、ＥＶの、上清培地中の飽和に到達するように、２４～４８分間にわたり、ＥＶを産生し、経時実験において、ＣＭＤＲ落射蛍光強度を介して、全ＥＶ濃度をモニタリングし、測定した。回収の前に、ほぼ同じ量の全ＥＶを含有するように、各対照群および各実験群を検証した。ｅａＥＶの比率の差違にもかかわらず、Ａｒｃ／Ａ５Ｕ－ＧＦＰ群は、全ＥＶの中で、最大比率のｅａＥＶを示した（図４Ｆ）。この測定は、トランスフェクション（４０時間の産生＋２時間の精製／染色）の４２時間後になされ、ＥＶの分解のために、十分な時間を残したので、この差違は、Ａ５Ｕ－ｅａＥＶによる高度の産生または安定性に起因しうる。ＢＢＢを越えた、高度な炎症性脳領域の標的化における、白血球ｅａＥＶの潜在的可能性について探索するために、マウスの体重１グラム当たり同量の全ＥＶを、多様な神経炎症モデルへと、静脈内（ＩＶ）注射した。

汎ニューロン炎症モデルにおける、ｅａＥＶの、ｉｎｖｉｖｏにおける生体内分布について研究するために、白血球ＥＶ（体重１グラム当たり９×１０^７個の全ＥＶ）を、老齢（体重を約４０ｇとする９０週齢）マウスへと、静脈内（ＩＶ）注射し、経心腔的灌流の７２時間後に、臓器を回収した。Ｃｙ３＋／Ｃｙ５＋蛍光標識化ｍＲＮＡは、ＩＶＩＳ（ｉｎｖｉｖｏｉｍａｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍ）を介して、ｅａＥＶ生体内分布およびカーゴ取込み視覚化を可能とした。全ＥＶの生体内分布についてのＩＶＩＳ解析のために、非蛍光ｍＲＮＡをトランスフェクトし、ＣＭＤＲ細胞膜染料により、標識化全ＥＶを回収した。これらの老齢マウスの多様な臓器（脳、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺）を、灌流し、固定し、切り出し、ＩＶＩＳによりイメージングした。実験群および対照群の間で、類似レベルのＣＭＤＲシグナルが観察されたことは、回収時（ＩＶ注射の３日後）における、各臓器内の全ＥＶまたは分解ＥＶの生体内分布を表す（図１４）。しかし、Ａｒｃは、ｉｎｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡの送達を、明らかに増大させた（図４Ｇ～４Ｈ）。驚くべきことに、Ａ５Ｕは、ｍＲＮＡの、加齢脳内における蓄積を、さらに増大させた（図４Ｇおよび４Ｉ）が、ＧＦＰｍＲＮＡはまた、ＡｒｃＥＶによっても送達され、大半は、肝臓および腎臓へと行き着いた（図４Ｈおよび４Ｊ）。このｍＲＮＡの、加齢脳へと取込みの増大が、ｉｎｖｉｔｒｏにおける取込み結果（図３Ｂ１～３Ｂ２）と同様であったことは、ｅａＥＶ産生の増大または高度の安定性に、潜在的に起因する。Ａｒｃカプシドの形成は、ＲＮＡを要求することが公知である。マウスおよびヒトのドナー細胞内で、ラットＡ５Ｕの付加は、ラットＡｒｃカプシドをさらに安定化させ、高度の産生効率をもたらす一方、同時に、ｅａＥＶを安定化させた。こうして、ＢＭ－ＤＣ／マクロファージ由来Ａ５Ｕ－ｅａＥＶは、ＢＢＢを越えてｍＲＮＡを特異的に送達し、慢性汎ニューロン炎症を標的化しうる。

白血球由来Ａ５Ｕ－ｅａＥＶは、慢性炎症下における汎ニューロン内発現のために、ＢＢＢを越えてｍＲＮＡを効率的に送達しうる
カーゴｍＲＮＡからのタンパク質翻訳について、脳内において検討した。Ａ５Ｕ－ＧＦＰｍＲＮＡを老齢マウス（約９０週齢）および対照若齢マウス（＜２４週齢）へと送達するように、Ａ５Ｕ－ｅａＥＶを全身投与し、投与の２および６日後に、脳を回収した。ＮｅｕＮ（Ｆｏｘ－３；ヘキサリボヌクレオチド結合性タンパク質３）による免疫組織化学（ＩＨＣ）染色により、ニューロンを標識化した。加齢脳では、若齢対照と比較して、高レベルのニューロンＧＦＰ発現（ＮｅｕＮ＋／ＧＦＰ＋）が観察された（図５Ａ～５Ｅ）。興味深いことに、若齢対照脳では、微小血管内の血液細胞内（図５Ａの挿入図である図５Ａ’、緑）または浸潤免疫細胞内（図５Ｃ、緑）において、ＧＦＰが、加齢脳と同等に発現された。しかし、加齢脳だけが、有意なニューロン内発現を示した（図５Ｂの挿入図である図５Ｂ’；図５Ｄ、白）。ある特定の脳領域（例えば、視床下部、図５Ｃ～５Ｄ）は、他の領域（例えば、大脳皮質）より多くのカーゴを、吸収し、発現させた。まとめると、この老化モデルは、慢性炎症に応答する、ｅａＥＶによる、ｍＲＮＡの、汎ニューロン内送達を、全脳にわたり裏付けた。

白血球由来Ａ５Ｕ－ｅａＥＶは、急性損傷下における特異的局所発現のために、ＢＢＢを越えてｍＲＮＡを効率的に送達しうる
ｅａＥＶが、限局的炎症性部位を標的化する潜在的可能性について研究するために、マウス大脳皮質内の小領域内において、腹腔内注射された、感光性ＲｏｓｅＢｅｎｇａｌ染料の光活性化を介して、虚血性損傷を誘導することにより、光血栓脳卒中モデルを作出した（図６Ａ）。脳卒中誘導の２４時間後に、白血球ＥＶ（体重１グラム当たり３×１０^７個の全ＥＶ）を、ＩＶ注射し、ＥＶ投与の２日後に、脳を回収した。Ｉｂａ１（炎症のレベルについて査定するためのミクログリア／マクロファージマーカー、図６Ｂ）の増大によりマーキングされる外傷脳領域の、ＮｅｕＮ＋ニューロン内における、高レベルＧＦＰの発現は、白血球由来ｅａＥＶが、ＢＢＢを越えて、ｍＲＮＡを送達し、損傷時の炎症部位に濃縮させることを示唆した（図６Ｃ～６Ｇ）。外傷領域内において、ニューロンは、損傷を受け、ＮｅｕＮ＋細胞の数を減少させた（図６Ｈ）。Ｉｂａ１＋細胞のカウントが増大するほど、部位は高度に炎症性であり、ミクログリアおよび浸潤性マクロファージを誘引する（図６Ｈ）。ＧＦＰ＋細胞の数は、増大した（図６Ｈ）。こうして、白血球ｅａＥＶは、ＢＢＢを越えて、ｍＲＮＡを送達し、同じ脳内の健常細胞に影響を及ぼさずに、損傷誘導性炎症を局所標的化しうる。

結論として述べると、カーゴローディングおよび送達効率が高度である、安全かつ有効なｍＲＮＡ用薬物担体が操作された。ｅａＥＶを産生および単離する方法が最適化され、カーゴローディングおよび導入効能についての、詳細なプロファイリングがもたられた。さらに、ｅａＥＶが、ＢＢＢを越え、ｍＲＮＡを神経炎症についての動物モデルへと送達する能力が示されたことは、ｅａＥＶが、ＣＮＳ内の炎症性状態のための新規の治療において使用される潜在的可能性を指し示す。

白血球由来Ａ５Ｕ－ｅａＥＶは、充実性腫瘍の深部へと浸透するｍＲＮＡを送達しうる
神経炎症に加えて、ｅａＥＶを、腫瘍炎症性微小環境において調べた。慢性炎症および透過性の増大もまた、がんの顕著な特徴であり、免疫調節の不均衡、発がん物質への曝露の他、がん遺伝子の活性化または腫瘍抑制因子の喪失をもたらす遺伝子変化など、外因性因子および内因性因子のいずれもが、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の炎症応答を誘発しうる。ＴＭＥ血管系は、周皮細胞被覆の不良、および内皮細胞の支持基底膜の破壊により引き起こされる、漏出性であり、組織化が無秩序的であり、未成熟であり、血管壁が薄層であり、灌流不良である血管ネットワークと関連する、異常な形状を保有することが多い。こうして、白血球由来ｅａＥＶは、ｍＲＮＡをＴＭＥへと送達しうることが仮定された。

まず、ＭＤＡＭＢ２３１細胞（３×１０^６個）の、マウス（４～６週齢の雌ＮＩＨ－ＩＩＩヌードマウス）への皮下注射を介して、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）マウスモデルを作出した。腫瘍体積が、約１，０００ｍｍ^３に到達した（約２週齢）ら、ＧＦＰカーゴｍＲＮＡまたはＡ５Ｕ－ＧＦＰカーゴｍＲＮＡを保有する、対照およびｅａＥＶを、ＩＶ注射した。ＥＶは、上記で記載された通りに産生し、単離し、特徴付け、定量し、マウスの体重１グラム当たり同量の全ＥＶを注射した。ｅａＥＶの、ＴＭＥ内における、ｉｎｖｉｖｏにおける生体内分布について研究するために、ＩＶＩＳ解析のためのＩＶ注射の３日後に、臓器を回収した。臓器を切り出す前に、経心腔的灌流を実施して、循環中の残留ｅａＥＶを除去した。ここで、非蛍光ｍＲＮＡおよびＣＭＤＲ膜染料による標識化全ＥＶをトランスフェクトした。Ａｒｃ＋ＥＶによる、腫瘍内における、ＣＭＤＲシグナルの、有意な増大が観察されたのに対し、他の臓器は、同様のＣＭＤＲレベルを示した（図１５Ａ）。この実験では、ＣＭＤＲ＋ＥＶの分布は、染料自体の分布から識別されなかった。白血球ｅａＥＶを施される動物は、腫瘍内において、それらのいずれもが、脂質代謝に関与する、肝臓内および腎臓内と同等量のＣＭＤＲを示した（図１５Ｂ）。十分なＣＭＤＲの蓄積を有するにもかかわらず、細胞内分解能における共焦点イメージングにより示される通り、腫瘍内では、有意に高レベルのＧＦＰが発現された（図１５Ｃ）。次いで、カーゴｍＲＮＡの翻訳について、切り出され、固定され、厚く切片化され、洗浄され、ＣＬＳＭの前に、Ｋ－ＲａｓによりＩＨＣ染色された腫瘍内において検討した。結果は、ｅａＥＶが、腫瘍組織の深部へと浸透して、ｍＲＮＡカーゴを発現させたのに対し、対照ＥＶは、膵管の近傍だけに分布したことを示唆する（図１５Ｄ～１５Ｅ）。まとめると、これらの結果は、ｍＲＮＡをロードされたｅａＥＶの、腫瘍深部への浸透が、ｍＲＮＡの効率的な取込みおよび翻訳を可能とすることを裏付けた。

Ａｒｃの付加は、腫瘍の標的化を改善するので、抗腫瘍低分子薬を、ｅａＥＶへとロードして、抗腫瘍治療における、ｅａＥＶの潜在的可能性について調べた。３つの方法：（１）カプシドおよびカーゴ構築物の、ＤＮＡ／ＲＮＡトランスフェクションの後で、低分子薬を、ドナー細胞の培養培地へと添加する；（２）低分子薬を、ドナー細胞培養物から精製されたＥＶと共にインキュベートする；（３）低出力超音波処理により、低分子薬を、精製ｅａＥＶへとロードする（２分間にわたる冷却を伴い、のべ３分間にわたる、３０秒間ずつ、６サイクルのオン／オフ）を使用して、これらの薬物をロードした。低分子薬物は、ロードに成功し、レシピエントのトリプルネガティブ乳がん細胞へと送達された（図１６）。したがって、ｅａＥＶの腫瘍標的化特徴は、低分子薬を、腫瘍の深部へと送達するのに使用される。

結論として述べると、カーゴローディングおよび送達効率が高度である、安全かつ有効なｍＲＮＡ用薬物担体が操作された。ｅａＥＶを産生および単離する方法が最適化され、カーゴローディングおよび導入効能についての、詳細なプロファイリングがもたられた。さらに、ｅａＥＶが、乳がんについての動物モデルにおいて、腫瘍深部への浸透、および効率的ｍＲＮＡ送達を可能としたことは、がんのための新規の治療における、その潜在的可能性を裏付けた。

Claims

ＲＮＡ転写物組成物であって、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を含むカーゴｍＲＮＡを含む、組成物。
ＡｒｃｍＲＮＡをさらに含む、請求項１に記載のＲＮＡ転写物組成物。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、哺乳動物に由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む、請求項１または２に記載の組成物。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ヒト、マウス、またはラットに由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む、請求項１または２に記載の組成物。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、配列番号１～４のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
カーゴｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）シグナルをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
カーゴｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
カーゴｍＲＮＡは、ペプチド、酵素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗原、抗体、抗体の部分、凝固因子、調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写タンパク質、および／または受容体をコードする、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
カーゴｍＲＮＡは、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、および／またはリコンビナーゼレポーターをコードする、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである、請求項１２に記載の組成物。
Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、配列番号５～８のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
ＡｒｃｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）シグナルをさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃタンパク質をコードする、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。
哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである、請求項１７に記載の組成物。
ＡｒｃｍＲＮＡは、ショウジョウバエに由来するＡｒｃタンパク質をコードする、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。
ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃｍＲＮＡ配列を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである、請求項２０に記載の組成物。
ＡｒｃｍＲＮＡは、ショウジョウバエに由来するＡｒｃｍＲＮＡ配列を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号９～１２のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の組成物。
組換えシステムであって、Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を含むカーゴｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含む、システム。
ＡｒｃｍＲＮＡをコードする第２のＤＮＡをさらに含む、請求項２４に記載のシステム。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、哺乳動物に由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む、請求項２４または２５に記載のシステム。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ヒト、マウス、またはラットに由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む、請求項２４～２６のいずれか１項に記載のシステム。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む、請求項２４または２５に記載のシステム。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、配列番号１～４のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２４～２８のいずれか１項に記載のシステム。
カーゴｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）シグナルをさらに含む、請求項２４～２９のいずれか１項に記載のシステム。
カーゴｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする、請求項２４～３０のいずれか１項に記載のシステム。
カーゴｍＲＮＡは、ペプチド、酵素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗原、抗体、抗体の部分、凝固因子、調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写タンパク質、および／または受容体をコードする、請求項２４～３０のいずれか１項に記載のシステム。
カーゴｍＲＮＡは、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、および／またはリコンビナーゼレポーターをコードする、請求項２４～３０のいずれか１項に記載のシステム。
ＡｒｃｍＲＮＡは、Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む、請求項２４～３３のいずれか１項に記載のシステム。
Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、哺乳動物に由来するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む、請求項２４～３４のいずれか１項に記載のシステム。
Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、ヒト、マウス、またはラットに由来するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む、請求項２４～３５のいずれか１項に記載のシステム。
Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ３’ＵＴＲ配列を含む、請求項２４～３３のいずれか１項に記載のシステム。
Ａｒｃ３’ＵＴＲ配列は、配列番号５～８のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３４～３７のいずれか１項に記載のシステム。
ＡｒｃｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）シグナルをさらに含む、請求項２４～３８のいずれか１項に記載のシステム。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を有するカーゴｍＲＮＡをコードするＤＮＡと、ＡｒｃｍＲＮＡをコードする第２のＤＮＡとを含む、単一のプラスミドを含む、請求項２４～３９のいずれか１項に記載のシステム。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を有するカーゴｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含む第１のプラスミド；および
ＡｒｃｍＲＮＡをコードする第２のＤＮＡを含む第２のプラスミド
を含む、請求項２４～３９のいずれか１項に記載のシステム。
プラスミド（複数可）は、異種ＤＮＡ調節エレメントをさらに含む、請求項４０～４１のいずれか１項に記載のシステム。
異種ＤＮＡ調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、またはこれらの組合せを含む、請求項４２に記載のシステム。
ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃｍＲＮＡ配列を含む、請求項２４～４３のいずれか１項に記載のシステム。
哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである、請求項４４に記載のシステム。
ＡｒｃｍＲＮＡは、ショウジョウバエに由来するＡｒｃｍＲＮＡ配列を含む、請求項２４～４３のいずれか１項に記載のシステム。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、配列番号１～４のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４４～４６のいずれか１項に記載のシステム。
ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃタンパク質をコードする、請求項２４～４７のいずれか１項に記載のシステム。
哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである、請求項４８に記載のシステム。
ＡｒｃｍＲＮＡは、ショウジョウバエに由来するＡｒｃタンパク質をコードする、請求項２４～４７のいずれか１項に記載のシステム。
ＡｒｃｍＲＮＡは、哺乳動物に由来するＡｒｃｍＲＮＡ配列を含む、請求項２４～５０のいずれか１項に記載のシステム。
哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである、請求項５１に記載のシステム。
ＡｒｃｍＲＮＡは、ショウジョウバエに由来するＡｒｃｍＲＮＡ配列を含む、請求項２４～５０のいずれか１項に記載のシステム。
ＡｒｃｍＲＮＡは、配列番号９～１２のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５１～５３のいずれか１項に記載のシステム。
細胞外小胞であって、
Ａｒｃタンパク質；および
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列を含むカーゴｍＲＮＡ
を含む、小胞。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、哺乳動物に由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む、請求項５５に記載の小胞。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ヒト、マウス、またはラットに由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む、請求項５５または請求項５６に記載の小胞。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を含む、請求項５５に記載の小胞。
Ａｒｃ５’ＵＴＲ配列は、配列番号１～４のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５５～５８のいずれか１項に記載の小胞。
カーゴｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）シグナルをさらに含む、請求項５５～５９のいずれか１項に記載の小胞。
カーゴｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする、請求項５５～６０のいずれか１項に記載の小胞。
カーゴｍＲＮＡは、ペプチド、酵素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗原、抗体、抗体の部分、凝固因子、調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写タンパク質、および／または受容体をコードする、請求項５５～６０のいずれか１項に記載の小胞。
カーゴｍＲＮＡは、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、および／またはリコンビナーゼレポーターをコードする、請求項５５～６０のいずれか１項に記載の小胞。
Ａｒｃタンパク質は、哺乳動物に由来するＡｒｃタンパク質配列を含む、請求項５５～６３のいずれか１項に記載の小胞。
哺乳動物は、ヒト、マウス、またはラットである、請求項６４に記載の小胞。
Ａｒｃタンパク質は、ショウジョウバエに由来するＡｒｃタンパク質配列を含む、請求項５５～６３のいずれか１項に記載の小胞。
Ａｒｃタンパク質は、配列番号１３～１６のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を含む、請求項５５～６０のいずれか１項に記載の小胞。
１つまたはそれ以上の低分子薬をさらに含む、請求項５５～６７のいずれか１項に記載の小胞。
細胞外小胞を産生するための方法であって、
（ａ）ＡｒｃｍＲＮＡおよびＡｒｃ５’ＵＴＲを含むカーゴｍＲＮＡを含む細胞を得る工程；
（ｂ）細胞を、培地中、ＡｒｃｍＲＮＡによりコードされるＡｒｃタンパク質を発現させる条件下で増殖させる工程であって、細胞は、Ａｒｃタンパク質、およびＡｒｃ５’ＵＴＲ配列を有するカーゴｍＲＮＡを含む細胞外小胞を産生する、工程；ならびに
（ｃ）細胞外小胞を培地から分離する工程
を含む方法。
工程（ａ）の細胞は、ドナー細胞へと、ＡｒｃｍＲＮＡへと転写されるＤＮＡ構築物、およびカーゴｍＲＮＡへと転写されるＤＮＡ構築物を導入することにより得られる、請求項６９に記載の方法。
工程（ａ）の細胞は、ドナー細胞へと、ＡｒｃｍＲＮＡおよびカーゴｍＲＮＡを導入することにより得られる、請求項６９に記載の方法。
組換え構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方の組合せの形態で送達される、請求項６９～７１のいずれか１項に記載の方法。
細胞は、原核細胞である、請求項６９～７１のいずれか１項に記載の方法。
細胞は、真核細胞である、請求項６９～７１のいずれか１項に記載の方法。
細胞は、哺乳動物細胞である、請求項７４に記載の方法。
細胞は、ヒト細胞である、請求項７５に記載の方法。
ドナー細胞は、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、造血細胞、結合組織細胞、筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、生殖系列細胞、脂肪細胞、幹細胞、自家由来ｅｘｖｉｖｏ分化細胞、ｉＰＳＣ由来ｅｘｖｉｖｏ分化細胞、がん細胞、およびこれらの組合せから選択される、請求項７０または請求項７１に記載の方法。
ドナー細胞は、白血球である、請求項７０または請求項７１に記載の方法。
ドナー細胞は、自己由来ｅｘｖｉｖｏ分化白血球である、請求項７８に記載の方法。
ドナー細胞は、自己由来ｅｘｖｉｖｏ分化単球、マクロファージ、樹状細胞、またはこれらの組合せである、請求項７９に記載の方法。
ドナー細胞は、ｉＰＳＣ由来ｅｘｖｉｖｏ分化白血球である、請求項７７に記載の方法。
ドナー細胞は、ｉＰＳＣ由来ｅｘｖｉｖｏ分化単球、マクロファージ、樹状細胞、またはこれらの組合せである、請求項７８に記載の方法。
請求項７０～８２のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む細胞は、細胞に、請求項７０～８２のいずれか１項に記載の核酸構築物をトランスフェクトすることにより調製され、トランスフェクションは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）複合体形成、電気穿孔、カチオン性脂質複合体形成、脂質ナノ粒子媒介送達、マイクロインジェクション、およびこれらの組合せにより行われる、請求項６９～８２のいずれか１項に記載の方法。
ｍＲＮＡをレシピエント細胞へと送達するための方法であって、
請求項５５～８３のいずれか１項に記載の細胞外小胞を得る工程；および
レシピエント細胞を細胞外小胞と接触させる工程であって、細胞外小胞は、レシピエント細胞と融合し、これにより、ｍＲＮＡをレシピエント細胞へと送達する、工程を含む方法。
接触させる工程は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて実行される、請求項８４に記載の方法。
接触させる工程は、ｉｎｖｉｖｏにおいて実行される、請求項８４に記載の方法。
レシピエント細胞は、哺乳動物細胞である、請求項８４～８６のいずれか１項に記載の方法。
レシピエント細胞は、造血細胞、非造血細胞、幹細胞、またはこれらの組合せを含む、請求項８４～８７のいずれか１項に記載の方法。
ｍＲＮＡは、疾患を処置するか、タンパク質を産生するか、細胞死を誘導するか、細胞死を抑制するか、細胞老化を変化させるか、免疫寛容を誘導するか、既存の免疫応答をモジュレートするか、細胞内活性を修飾するか、細胞挙動を修飾するか、またはこれらの組合せをもたらすために、レシピエント細胞へと送達される、請求項８４～８８のいずれか１項に記載の方法。
それを必要とする対象を処置するための方法であって、
請求項５５～８９のいずれか１項に記載の細胞外小胞を得る工程；および
細胞外小胞を対象へと投与する工程
を含む方法。
細胞外小胞は、経口、直腸内、静脈内、筋内、皮下、子宮内、脳血管内、または脳室内投与される、請求項９０に記載の方法。
細胞外小胞は、遺伝障害を含む疾患の処置に適合された、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含む、請求項９０または請求項９１に記載の方法。
細胞外小胞は、神経変性疾患、老化関連障害、脳腫瘍、炎症性状態の処置のために対象へと投与され、健常細胞に影響を及ぼさずに、血液脳関門を越えて炎症性脳組織へとＲＮＡを特異的に送達する、請求項９０～９２のいずれか１項に記載の方法。
細胞外小胞は、アルツハイマー病の処置のために、ＡＰＯＥ４ＲＮＡを脳へと送達するように適合される、請求項９０または請求項９１に記載の方法。
細胞外小胞は、がんの処置のために投与され、健常組織に影響を及ぼさずに、腫瘍細胞を標的化する、請求項９０～９２のいずれか１項に記載の方法。
細胞外小胞は、腫瘍関連抗原に対応するｍＲＮＡを含み、細胞外小胞は、黒色腫、結腸がん、消化器がん、尿生殖器がん、肝細胞がんを含む、がんの処置のためのがんワクチンとして送達される、請求項９０または請求項９１に記載の方法。
細胞外小胞は、感染性疾患の防止および／または処置のために送達される、請求項９０または請求項９１に記載の方法。
細胞外小胞は、自己免疫疾患の処置のために送達される、請求項９０または請求項９１に記載の方法。
ｉｎｖｉｖｏにおいて請求項１に記載の構築物をレシピエント細胞へと送達して、内因性Ａｒｃを使用してｉｎｖｉｖｏにおいて請求項５５に記載の細胞外小胞を産生する方法。
小胞は、ｉｎｖｉｖｏにおいて、内因性Ａｒｃにより産生される、請求項９９に記載の方法。
構築物は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの形態で送達される、請求項９９に記載の方法。
構築物は、脂質ナノ粒子、エクソソーム、ウイルス、および他の遺伝子送達法により送達される、請求項９９に記載の方法。