KR101484373B1

KR101484373B1 - 유전자 전달을 위한 ｐｍｐ 복합체

Info

Publication number: KR101484373B1
Application number: KR20120136067A
Authority: KR
Inventors: 최준식; 김태훈; 유광식; 최혜
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2012-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2015-01-21
Also published as: KR20140073617A

Abstract

본 발명은 비바이러스성 유전자 전달체 및 이의 용도에 대한 발명으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 트랜스펙션 효율이 높고 세포독성이 낮은 폴리에틸렌이민(PEI) 기반의 양이온 중합체 PMP(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine)를 이용하는, 비바이러스성 유전자 전달 시스템에 대한 발명이다.

Description

유전자 전달을 위한 ＰＭＰ 복합체{A PMP Complex for Gene Delivery}

본 발명은 비바이러스성 유전자 전달체 및 이의 용도에 대한 발명으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 트랜스펙션 효율이 높고 세포독성이 낮은 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI) 기반의 양이온 중합체 PMP(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine)를 이용하는, 비바이러스성 유전자 전달 시스템에 대한 발명이다.

유전자 치료(gene therapy)란 통상적인 방법으로는 치료가 곤란한 선천적 또는 후천적 유전자 이상을 유전공학적 방법으로 치료하는 방법을 일컫는다. 보다 구체적으로, 유전자 치료는 선천적 또는 후천적 유전자 결함,바이러스성 질병, 암 또는 심혈관계 질환 등과 같은 만성 질환의 치료와 예방을 위하여, DNA 및 RNA 등의 유전물질을 인체 내에 투여하여 치료 단백질을 발현시키거나 특정 단백질의 발현을 억제하도록 하는 치료 방법으로서, 질병의 원인을 유전자 차원에서 해석하여 근본적으로 치료할 수 있기 때문에 난치병의 극복은 물론 기존 의료 방식의 대체 수단으로 기대되고 있는 방법이다

이러한 유전자 치료가 일반적인 약물 치료와 다른 점은 유전자를 전달하는 수단인 유전자 전달체가 반드시 필요하다는 점이다. DNA 또는 RNA 는 음전하를 띠고 있는 분자량이 큰 분자로서 생체 내에서 가수분해되기 쉬우며, 단독으로 세포 또는 조직 내로 투입되기가 용이하지 않으므로, 유전 물질의 세포 또는 조직 내로의 투입을 원활하게 할 수 있는 전달 물질이 반드시 필요하기 때문이다. 따라서, 유전자 치료에서 가장 중요한 물질은 치료 유전자를 생체 내로 전달하는 유전자 전달체라 할 수 있다.

이러한 유전자 전달 시스템은 크게 바이러스성 벡터-매개 시스템 및 비바이러스성 벡터-매개 시스템으로 분류될 수 있다.

레트로바이러스(retrovirus) 또는 아데노바이러스(adenovirus) 등을 이용하여 만든 바이러스성 벡터는 세포 내로의 높은 형질 주입 (트랜스펙션(transfection)) 효율을 갖는다는 장점이 있으나, in vivo 에서 면역원성의 문제 및 유전자 재조합과 같은 내재적 문제점 등을 갖는다. 이러한 바이러스성 벡터의 안정성 문제를 극복하기 위하여, 다양한 중합체성 유전자 전달 시스템이 전통적인 바이러스성 벡터-기재 유전자 전달 방법에 대한 대안으로서 발달되어 왔다. 그러나, 중합체성 벡터는 엔도좀 탈출(endosomal escape) 및 핵 편재화(nuclear localization)와 같은 세포내 트래피킹(trafficking) 장벽을 갖는다는 문제점이 있다.

양이온성 중합체는 유전자와 중합체-유전자 복합체를 형성하여 진핵세포의 트랜스펙션을 유도하게 된다. 그 구체적인 메커니즘은 중합체-유전자 복합체 표면의 양전하와 세포 표면의 음전하의 전기적 상호작용에 의하여 복합체가 세포 표면에 결합한 후 엔도좀으로부터 세포질로 유전자가 방출되는 것으로 고려된다. 이러한 양이온성 중합체의 구체적 예로서, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리L-리신, 폴리아미노에스테르, 폴리아미도아민, 폴리프로필렌이민과 같은 양이온성 단일중합체 및 폴리에틸렌글라이콜(PEG)-블록-폴리L-리신 및 PEG-PEI 와 같이 상기의 단일중합체에 기초한 양이온성 블록 공중합체 또는 그래프트 공중합체 등을 들 수 있다.

상기 중합체들은 플라스미드 DNA(pDNA)를 나노크기 입자로 응축시키고, pDNA 가 분해되지 않도록 이를 보호할 뿐만 아니라, 바람직하지 않은 상호 작용으로부터 pDNA 입자를 보호하고, 세포질 및 핵 내로의 세포내 전달을 강화시킬 수 있다는 장점이 있다. 그 중에서도, 폴리에틸렌이민(PEI)은 최근 유전자 치료 연구 분야에서 가장 광범위하게 사용되고 있는 비바이러스성 벡터라 할 수 있다.

그러나, 중합체성 벡터는 엔도좀 탈출(endosomal escape) 및 핵 편재화(nuclear localization)와 같은 세포내 트래피킹(trafficking) 장벽이 있고, 세포 및 생체 독성이 크고 핵산 전달 효율이 낮다는 문제점이 있어왔다.

이에, 본 발명자는 신규한 비바이러스성 유전자 전달체로서, 폴리에틸렌이민(PEI)을 기반으로 하여, 플라스미드 DNA(pDNA)를 효과적으로 압축하고 엔도좀에서 PEI/DNA 복합체를 신속하게 방출시킨다는 장점을 가지면서도, PEI-MA-PEI의 신규 구조의 복합체를 형성시킴으로써 트랜스펙션의 효율을 높이고 세포 독성 또한 현저히 낮아지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1035364호

본 발명의 주요 목적은 유전자 전달 효율이 높고 세포 독성이 낮은, 우수한비바이러스성 유전자 전달체 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 전달체를 이용하여 목적하는 유전자를 전달하는 방법 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 PEI-MA-PEI(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine) 구조를 이루는 PMP를 포함하는, 비바이러스성 핵산 전달용 중합체 및 이의 용도를 제공한다.

제한은 없지만, 상기 PEI는 분지형을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 중합체에서 PMP는, 거의 100%의 PEI-MA의 카르복시기가 PEI 그래프트와 결합하고 있다.

또한, 상기 PMP는 분자량 800 내지 2000 달톤의 범위를 가지는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 약 800달톤의 분자량을 가지는 것을 사용한다.

본 발명은 다른 관점에서, PEI-MA-PEI(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine) 구조를 이루는 PMP에 목적 유전자가 결합되어 있는 비바이러스성 핵산 전달용 복합체 및 이의 용도를 제공한다.

전달 대상인 핵산의 종류로는 제한이 없지만, 바람직하게는 DNA, 가장 바람직하게는 플라스미드 DNA(pDNA)를 효과적으로 전달할 수 있다. 이 때, 함유되는 PMP : DNA의 중량비는 0.3 ~ 3 : 1인 것이 바람직하고, 0.5~1 : 1의 범위가 더욱 바람직하다.

특히, 상기 DNA는 PMP에 의해 직경 100-110 nm의 나노입자로 압축되므로, 세포내 유전자 전달에 매우 효율적이다.

이와 같이, 본 발명은 신규한 비바이러스성 핵산 전달용 중합체 PMP를 기반으로 하는 유전자 전달체 및 전달 시스템에 관한 것으로, 낮은 세포 독성 및 우수한 트랜스펙션 효율을 나타내는 바, 유전자 전달에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 PEI-MA-PEI(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine) 구조를 이루는 PMP를 포함하는, 비바이러스성 핵산 전달용 중합체 및 이를 기반으로 하는 복합체는, 현저히 낮은 세포독성 및 높은 트랜스펙션 효율을 제공할 수 있어 효과적인 핵산 전달체로서 사용할 수 있어, 세포내 유전자 전달에 효율적인 바, 의학산업 상 매우 유용하다.

도 1은 본 발명의 PMP 합성 공정을 도식화한 그림이다.
도 2는 PMP 800의 ¹H NMR 및 FT-IR 분석 결과 그래프이다.
도 3은 PMP 2000의 ¹H NMR 및 FT-IR 분석 결과 그래프이다.
도 4는 PMP/DNA 중량비에 따른 아가로스 겔 전기영동 지연 분석 결과이다[A:PMP 800, B:PMP 2000]
도 5는 PMP/DNA 복합체의 평균 입자 크기(A) 및 제타 포텐셜값(B) 결과 그래프이다.
도 6은 PMP의 산-염기 적정 프로파일이다.
도 7은 293, HeLa, HepG2 세포에 있어서의 세포 독성 분석 결과이다.
도 8은 HepG2 세포로의 트랜스펙션 24시간 후, 각각의 복합체에 대한 공초점 현미경 이미지 사진이다.
도 9은 293, HeLa, HepG2 세포에 있어서의 PMP의 트랜스펙션 효율 분석 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산(nucleic acid)"이라는 용어는 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 디옥시리보뉴클레오티드 등 온갖 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차적 구조만을 의미하고, 따라서 이중 또는 단일 사슬의 DNA 또는 RNA를 의미한다. 이것은 또한 변형의 알려진 유형, 예를 들어 당해 분야에서 알려진 표지(label), 메틸화, "caps", 유사체의 하나 혹은 그 이상의 자연 발생의 뉴클레오티드 치환, 탈결합(예: methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate, 등)과 결합(예:phosphorothioate, phosphorodithioate, 등), 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드(signal peptide), poly-Llysine,등) 등의 부속물을 포함하는 것, 삽입물(예: 아크리딘, Psolalen, 등)을 가지는 것, 킬레이트(예: 금속원소, 방사성 금속원소, 붕소, 산화 금속원소, 등)을 가지는 것, 알킬화합물을 가지는 것, 변형된 결합(예: alpha anomeric 핵산, 등)을 가지는 것, 또한 폴리뉴클레오티드의 비변형을 포함한 뉴클레오티드간 변형을 의미한다. 일반적으로, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 부분은 지놈(genome)의 파편과 짧은 올리고뉴클레오티드 결합자 또는 일련의 올리고뉴클레오티드, 미생물 또는 바이러스 오페론(operon)이나 진핵세포 유전자로부터 유도된 조절인자(regulatory element)를 포함하는 재조합 전사 단위로 발현될 수 있는 합성 핵산을 제공하는 특유의 뉴클레오티드들로 뭉쳐질 것이다

"벡터(vector)"라는 용어는 다른 핵산을 그것이 연관된 곳으로 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. "발현벡터(expression vector)"라는 용어는 벡터에 의해 운반된 각각의 재조합 유전자에 의해 암호화된 단백질을 합성할 수 있는 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 파지(phage)를 포함한다. 바람직한 벡터는 연관된 핵산의 자가복제와 발현이 가능한 것이다.

"트랜스펙션(transfection)"은 배양동물 세포에 핵산(DNA, PNA 등)을 직접 도입하여 세포 내에서 유전형질을 발현시키는 방법을 의미한다. 본 발명에서는 상기 "트랜스펙션" 용어를, "형질감염", "세포내 전달" 등의 용어와 혼용하여 사용하고 있다. 도입한 핵산은 목적으로 하는 유전자를 플라스미드 등의 매개체에 넣어 도입하는 것이 일반적인 방법이다. 도입한 유전자가 세포에서 안정화된 경우는 염색체에 끼어들어간 경우가 많았다. 핵산을 도입한 세포를 형질도입체라고 한다.

"제타 포텐셜(zeta potential)"이란 대전된 입자표면에 붙어 있는 불가동수분과 입자로부터 쉽게 떨어져 나갈 수 있는 가동수분의 확산 이중층에서의 양전하 밀도차이에서 유래되는 전기역학적인 전위차를 의미한다. 세포표면과 주변 배양액 사이의 전기적 전위차 또는 제타전위로 나타내기도 한다.

"루시퍼라아라제(luciferase)"는 루시페린의 산화를 촉진하여 화학에너지를 빛에너지로 전환시켜 광을 발산하게하는 효소로, 생체 내에서 연속적, 실시간적으로 발현을 측정하고, 목적의 물질들에 대한 효과를 검증할 수 있게 하는 리포터 유전자(reporter gene) 기능을 한다. 반딧불이(firefly; 개똥벌레) 또는 딱정벌레(glow-worm)와 같은 곤충체로부터 직접 수득하거나 이러한 효소를 암호화하는 재조합 DNA 절편을 포함하는 미생물로부터의 발현에 의해 수득할 수 있다.

"담체(carrier)"는, 생물체 내에 있는 활성물질이 다른물질과 결합하여 존재하는 경우, 또는 세포막을 통한 물질의 이동인 운반체수송을 담당하는 고분자 물질을 총칭한다. 담체의 예로는 비제한적으로 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량 폴리펩티드(약 10 잔기 미만), 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머, 글리신 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트화제, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올, 나트륨과 같은 염-형성 반대이온(salt-forming counterion), 및/또는 TWEEN　, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PLURONICS　같은 무이온 계면활성제를 포함한다.

"치료"는 임상 결과를 포함하여 이로운 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 질환, 장애 또는 병태의 "치료" 또는 "완화"는, 장애를 치료하지 않는 것과 비교하여,병태, 장애 또는 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 적어지고/적어지거나 경시적인 진행 추이가 느려지거나 길어지는 것을 의미한다. 예를 들어, 비만 치료에서, 체중 감소, 예를 들어, 적어도 5％의 체중 감소는 바람직한 치료 결과의 예이다. 본 발명의 목적을 위하여, 이롭거나 바람직한 임상 결과는, 검출가능 또는 검출불능 여부와 상관없이, 1가지 이상의 증상의 경감 또는 개선, 질환 정도의 축소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 (부분적 또는 전체적)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 또한 의미할 수 있다. 또한, 치료는 1회 용량의 투여에 의해 발생할 필요가 없고, 일련의 용량의 투여 시에 종종 발생한다. 따라서, 치료상 유효량, 완화에 충분한 양, 또는 질환, 장애 또는 병태의 치료에 충분한 양이 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.

"질환(disorder)"이라는 용어는 본 발명의 유전자도입 동물 모델을 사용하여 동정되는 분자를 이용하여 치료하는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 어떤 상태이다. 이것은 포유류를 의문의 질환에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 조건들을 포함한 만성과 급성 질환들 또는 질병들을 포함한다.

"치료상 유효량"은 치료될 장애의 증상의 경감이 포함되는, 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의학자에 의해 추구되는 조직, 시스템, 대상 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 응답을 도출할 조성물 내의 활성 화합물의 양을 의미한다.

"예방적 유효량"은 비만 또는 비만 관련 장애, 병태 또는 질환 위험이 있는 대상에서 비만 또는 비만 관련 장애, 병태 또는 질환의 발병을 방지하기 위해, 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의학자에 의해 추구되는 조직, 시스템, 대상 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 응답을 도출할 조성물 내의 활성 화합물의 양을 의미한다.

"유전자 치료(gene therapy)"는 돌연변이를 일으킨 유전자를 정정하여 유전병을 치료하거나, 유전자 혹은 RNAi를 이용하여 단백질 발현을 조절하여 질병을 치료하는 것을 말한다. 즉 환자의 세포에 외부에서 정상유전자를 이식하여 그 세포의 표현형을 변화시킴으로써 병을 치료하는 방법이다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 핵산(nucleic acid)의 세포 내 전달(transfection)에 관한 것이다. 특히, 신규한 비-바이러스성 유전자 전달체로서, 트랜스펙션 효율이 높고 세포독성이 낮은, PEI-MA-PEI(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine) 구조를 이루는 PMP를 유전자 전달 담체로 이용하는 것을 주요한 특징으로 하고 있다.

[PMP 중합체]

본 발명은 일 관점에서 PMP(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine)를 기반으로 하는 유전자 전달체, 즉 유전자 전달 벡터에 관한 것이다.

비바이러스성 유전자 전달 벡터는 바이러스를 이용하지 않고 유전자를 세포내로 운반하는 캐리어를 총칭하는 의미로서, 유전자를 구성하는 핵산이 음전하를 띠는 성질을 이용하여 양이온상의 양이온 부위와 핵산상의 음이온 부위의 전기적 상호작용을 이용하여 핵산을 코팅하는 형태의 벡터가 대표적인 예이다.

본 발명의 양이온 중합체는 PMP(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine)는, 폴리에틸렌이민(PEI)을 기반으로 하여 플라스미드 DNA(pDNA)를 효과적으로 압축하고 엔도좀에서 PEI/DNA 복합체를 신속하게 방출시킨다는 장점을 가지면서도, PEI-MA-PEI의 신규 구조의 중합체를 형성함으로써 트랜스펙션의 효율을 높이고 세포 독성 또한 현저히 낮은 특성을 지닌다.

본 발명의 PMP(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine)는 당업계에 알려진 공지의 기술을 적용하여 폴리에틸렌이민(PEI) 코어 상에 메틸아크릴레이트(methyl acrylate, MA)를 결합시킨 후(PEI-MA), 이에 폴리에틸렌이민(PEI)을 그래프트시켜 제조할 수 있다. 보다 구체적인 PMP 합성 공정은 도 1에 도시하였다. 본 발명의 PMP에서는 거의 100%의 PEI-MA의 카르복실기가 PEI 그래프트와 결합하고 있다.

이 때, 다양한 분자량 및 형태의 PEI가 사용될 수 있다.

분지형인 경우, 백본 PEI 반복 단위의 분자량은 바람직하게 약 400 내지 5,000 달톤 범위, 더욱 특히 바람직하게 약 600 내지 2000 달톤 범위이다. 선형인 경우, 백본 PEI 반복 단위의 분자량은 바람직하게 약 200 내지 5,000 달톤 범위이다.

또한, 사용하는 PEI에 따라 본 발명의 PMP의 중량 평균 분자량은 달라질 수 있다. 특정 양태에서, PMP의 중량평균 분자량은 약 500 달톤 내지 약 10,000 달톤 범위일 수 있다. 한 양태에서, 중량 평균 분자량은 약 800 달톤 내지 약 2000 달톤 범위일 수 있다. 분자량은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 또는 아가로스 겔 전기영동에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는 중량평균 분자량 약 800 달톤의 PMP를 사용한다.

본 발명의 PMP는 전달 대상인 핵산, 특히 DNA의 응축을 효과적으로 촉진하여 안정한 복합체 및 DNA의 세포 내로의 내재화를 형성하고, 내재화 후에는 복합체가 이황화결합의 환원에 의하여 엔도좀으로부터 세포질 공간으로 탈출하도록 돕는다.

[PMP-핵산 복합체]

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 본 발명의 양이온 중합체 PMP와 전달 대상이 되는 유전자, 즉 핵산이 결합된 복합체 및 이의 이용에 관한 것이다.

전달 대상이 되는 유전 물질인 핵산의 종류는 제한이 없으나, 바람직하게, 핵산은 DNA이고, 가장 바람직하게는 플라스미드 DNA(pDNA)이다. 상기 DNA는 또한 혼합된 RNA/DNA 분자 또는 혼합된 단백질/DNA 분자를 포함할 수 있다.

이 때, PMP : DNA의 중량비는 0.3 ~ 3 : 1의 범위를 가지고, 바람직하게는 0.5 ~1 : 1의 범위를 가진다. 중량비가 증가함에 따라 제타 포텐셜값도 증가하는데, 본 발명의 일 실시예에서는 1~3 중량비에서 약 40mV 안정기의 제타 포텐셜값을 나타냈다.

특히, 세포 내 핵산을 전달하기 위한 본 발명의 유전자 전달체 및 복합체는 다음과 같은 장점을 가진다.

(1) 본 발명의 "PMP"은 DNA를 효과적으로 응축시킨다.

본 발명의 PMP/핵산(예를 들어, DNA) 복합체의 입자 크기는 세포에 의한 전달 복합체의 내재화(internalization)에 영향을 미치므로, 트랜스펙션 효율에 영향을 끼친다.

본 발명의 PMP는 DNA를 직경 100-110 nm의 나노입자로 응축시켜 유전자 전달에 적합한 나노-크기를 가질 수 있게 한다.

즉, DNA와 결합하는 경우, 상대적으로 낮은 N/P 비율(polymer nitrogen(+)/pDNA phosphate(-))에서 전정기적 상호작용에 의해 보다 효과적으로 DNA를 농축하는 장점이 있다. 즉, 중성 조건에서 양성 전하를 나타내어 효과적으로 DNA를 나노크기 사이즈로 농축할 수 있고(약 200 nm 이하), 전하 비율 1 이상의 양(positive)의 제타 포텐셜을 가질 수 있다.

(2) 본 발명의 PMP는 양이온 유전자 담체의 우수한 양성자-완충 능력으로 트랜스펙션 효율에 기여한다.

코어로서 PEI에 대하여 외층으로서의 PEI 그래프트와의 결합으로 인해, 이차 및 삼차 아민의 증가에 따라 PMP의 완충능력을 촉진시키기 때문에, 우수한 트랜스펙션 효율을 가질 수 있다.

(3) 본 발명의 PMP/DNA 복합체는 세포독성이 낮다.

통상의 고분자 양이온 담체 PEI 등과 비교하여, 본 발명의 PMP/DNA 복합체는 현저히 낮은 독성을 나타낸다.

이처럼, 본 발명의 PMP/DNA 복합체는 우수한 트랜스펙션 효율 및 낮은 세포독성을 가지므로, 세포 내에서 유전자의 발현율을 향상시키는 결과를 가져온다.

[트랜스펙션]

그러므로, 본 발명은 상기 PMP/핵산 복합체의 세포 내로의 유입방법 및 이의 활용 또한 포함한다.

본원에 기술된 방법에 따른 용도에 적합한 세포들은 원핵생물, 효모, 또는 식물 및 동물 세포, 특히 포유류 세포를 포함한 고등 진핵 세포를 포함한다.

특정 양태에서, 세포는 암 세포이다. 특정 바람직한 양태에서, 암의 모델 시스템인 세포주, 예를 들어, 유방암 (MCF-7, MDA-MB-438 세포주), U87 교모세포종 세포주, B16F0 세포(흑색종), HeLa 세포 (자궁경부암), A549 세포 (폐암) 및 HepG2(간암) 세포 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 293세포, HeLa 세포 및 HepG2를 사용하였다.

트랜스펙션(형질감염)을 위한 세포의 배양은 당업계에서 알려진 통상의 지식을 활용하여 당업자가 적절히 수행할 수 있다. 일례로, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep)과 함께 10%의 열 불활성화된 소태아 혈청(FBS)를 함유하는 DMEM 배지 내 성장시킨다. 당업자는 특정 세포는 성장 인자 및 아미노산과 같은 특정 영양분을 필요로 하기 때문에 특정 배지에서 배양되어야 함을 이해할 수 있을 것이다. 세포의 최적 밀도는 세포 종류 및 실험 목적에 따라 달라진다. 또한, 세포 유형에 따라 적합한 조건(예: 37℃, 5-10% CO₂)에서 배양한다. 배양 시간은 실험 목적에 따라 달라진다. 일반적으로, 유전자 트랜스펙션 실험에서는 세포가 표적 유전자를 발현하도록 24 내지 48시간 동안 배양한다.

한편, 본 발명의 PMP에 따른 핵산 전달, 즉 트랜스펙션(형질감염) 결과는 상이한 방법으로 분석될 수 있다.

유전자 트랜스펙션 및 안티센스 핵산 전달의 경우, 표적 유전자 발현 수준이 리포터 유전자, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자, 루시페라제 유전자, β-갈락토시다제 유전자 발현 등에 의해 검출될 수 있다. 당업자는 이들 리포터가 작용하는 방법 및 이들 리포터가 유전자 전달계에 도입될 수 있는 방법에 친숙할 것이다. 핵산 및 이의 생성물, 단백질, 펩티드 또는 기타 바이오분자들이 본원에 기술된 방법에 의해 전달되며, 이들 바이오분자에 의해 조절되는 표적물이 다양한 방법, 예를 들어, 면역형광법, 효소 면역세포화학법, 오토라디오그래피 또는 동일반응계(in situ) 하이브리드화법에 의해 측정될 수 있다. 인코딩된 단백질의 발현을 검출하기 위해 면역형광법이 사용되는 경우, 표적 단백질에 결합하는 형광물질이 라벨링된 항체가 사용된다(예를 들어 단백질에 항체가 결합하기에 적합한 조건으로 슬라이드에 첨가됨). 이후 단백질을 함유하는 세포는 형광 시그날을 탐지함으로써 확인된다. 전달된 분자가 유전자 발현을 조절할 수 있다면, 표적 유전자 발현 수준이 또한 오토라디오그래피, 동일 반응계 하이브리드화, 및 동일 반응계 PCR과 같은 방법에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 확인 방법은 전달된 바이오분자의 특성, 이의 발현 생성물, 이에 의해 조절되는 표적물 및/또는 바이오분자의 전달로 인해 생성되는 최종 생성물에 따라 달라질 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, PMP 및 목적 유전자를 함유하는 복합체를 함유하는 목적 질환의 치료용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

즉, 본 발명의 복합체는 질환 치료제로서 투여될 수 있다. 질환 상태에서 발현이 억제되거나 비정상적으로 발현되는 유전자의 코딩 부위의 전부 또는 일부에 상응하는 DNA를 치료가 필요한 환자에게 투여한다.

본원에 기술된 조성물 및 약제학적 조성물의 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 따라 개별 의사에 의해 선택될 수 있다

일반적으로 환자에게 투여되는 조성물의 용량 범위는 환자의 체중 1kg 당 0.5 내지 1000 mg, 또는 1 내지 500 mg, 또는 10 내지 500 mg, 또는 50 내지 100 mg이다. 상기 용량은 단일 용량이거나, 환자에 따라 요구되는 경우 1일 이상의 기간 동안 2회 이상 제공되는 연속용량일 수 있다. 인간 용량이 확립되어 있지 않은 경우, 적합한 인간 용량은 동물을 대상으로 한 독성 연구 및 효능 연구에 의해 보증되는 바와 같이, ED₅₀ 또는 ID₅₀ 값으로부터 추정될 수 있거나 시험관 내 또는 생체 내 연구로부터 도출된 기타 적합한 값으로부터 추정될 수 있다

투여량 및 투여 간격은, 조절 효과 또는 최소 유효 농도(MEC)를 유지하기에 충분한 양으로 활성 부분의 혈장 농도가 제공되도록 개별적으로 조정될 수 있다. MEC는 각 화합물에 따라 달라지며, 시험관 내 데이타로부터 측정될 수 있다. MEC를 달성하기 위해 요구되는 투여량은 개인 특성 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 그러나, HPLC 검사 또는 생검이 혈장 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 투여 간격은 MEC 값을 사용하여 결정될 수 있다. 조성물은 10 내지 90%의 시간 동안, 바람직하게 30 내지 90%의 시간 동안 또는 가장 바람직하게 50 내지 90%의 시간 동안, 혈장 농도가 MEC를 초과하도록 하는 용량법을 사용하여 투여되어야 한다.

조성물의 투여량은 치료되어야 하는 대상체, 대상체의 체중, 질환의 중증도, 투여 방식 및 처방하는 의사의 판단에 따라 달라질 수 있다.

또한, 본 발명의 복합체는 핵산 전달 개선제를 추가로 더 포함할 수 있다.

세포 내로의 핵산 전달에 있어서 문제가 되는 세포 막, 엔도좀 막 및 운반체로부터 바이오분자의 방출현상을 막기 위한 다양한 방법을 함께 적용할 수 있다.

DNA 등의 핵산-운반체 복합체는 일차로 세포 막을 통과해야 한다. 이것이 엔도시토시스로 실시될 때, 핵산-운반체 복합체는 이후 내재화된다. 핵산-카고(cargo)와 함께 운반체는 포켓 형성에 의해 세포막에 의해 봉입되고, 이 포켓은 후속적으로 핀치 오프(pinch off)된다. 이 결과는 세포 엔도좀으로 이는 핵산 카고 및 운반체를 포함하는 거대 막-결합 구조물이다. 핵산-운반체 복합체는 이후 엔도좀 막으로부터 세포질내로 탈출해야 하며 세포질 내에서는 효소 분해를 피해야 한다. 핵산 카고는 운반체로부터 분리되어야 한다. 일반적으로 위에서 기술한 하나 이상의 장벽를 극복하도록 고안된 임의의 것이 전달 개선제로 고려될 수 있다.

비-바이러스 전달 개선제는 중합체계이거나 지질계 중 어느 하나일 수 있다. 이 전달 개선제는 일반적으로 핵산의 음전하를 균형잡히게 하는 폴리양이온이다. PEI 및 스타버스트(Starburst) 덴드리머와 같은 폴리양이온의 분지쇄 버젼이 엔도좀 방출을 매개할 수 있다[참조: Boussif, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA vol.92: 7297-7301]. PEI는 pH 6.9에서 이온화할 수 있는 말단 아민과 pH 3.9에서 이온화할 수 있는 내부 아민을 가진 고급 분지된 중합체로, 이러한 구조로 인해 소포(vesicle)의 pH를 변화시켜 소포 팽창 및 종국적으로 엔도좀 포획으로부터의 방출에 이른다.

전달을 개선시키는 기타 수단은 운반체 상에 리간드를 고안하는 것이다. 리간드는 카고 전달에서 표적화되는 세포 상 수용체를 가져야 한다. 세포 내로의 바이오분자 전달은 이후 수용체 인식에 의해 개시된다. 리간드가 이의 특이적 세포 수용체에 결합하면, 엔토시토시스가 자극된다. 바이오분자 이송을 촉진시키기 위해 다양한 세포 종류에 사용되어 온 리간드의 예는 갈락토스, 트랜스페린, 글리코단백질 아시알로오로소뮤코이드, 아데노바이러스 섬유, 말라리아 서컴스포로지트 단백질, 상피세포 성장 인자, 인간 유두종 바이러스 캡시드, 섬유아세포 성장 인자 및 엽산이다

세포의 세포질 내로 DNA와 같은 바이오분자의 방출은 엔도좀 붕괴를 매개하거나, 분해를 감소시키거나 이러한 과정을 모두 함께 우회하는 제제에 의해 촉진될 수 있다. 엔도좀 pH를 높이는 클로로퀸은 리소좀 가수분해 효소를 억제함으로써 내포된(endocytosed) 물질의 분해를 감소시키는 데 사용될 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 비-바이이러스성 유전자 전달체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 PEI-MA-PEI(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine) 구조를 이루는 PMP를 기반으로 하는, 세포독성이 적고 트렌스펙션 효율이 높은 핵산 전달용 중합체 및 그 제조방법에 관한 것이며, 또한 상기 중합체를 담체로하여 제조된 비-바이러스성 유전자 전달체인 중합체/DNA 복합체에 관한 것이다.

이러한 본 발명은 높은 트랜스펙션 효율, 낮은 세포독성, 높은 목적 유전자 발현 효율을 가지므로 효과적인 비바이러스성 유전자 전달 시스템으로 매우 유용할 것이다.

< 실시예 >

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다

통계학적 분석은 unpaired Students t-test (GraphPad Prism 5)을 이용하여 수행하였다. 모든 결과들을 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다. 그룹간 차이는 P < 0.05 (*), P < 0.01 (**), 및 P < 0.001 (***)에서 통계학적으로 유의미하다.

실험준비

폴리에틸렌이민(가지형, 800Da, 2kDa 및 25kDa), EtBr(ethidium bromide), MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide), 메틸 아크릴레이트 및 메탄올을 Sigma-Aldrich (Seoul, South Korea)에서 구입하였다. 루시퍼라아제 1000 분석 키트 및 리포터 용해 버퍼는 Promega (Madison, WI, USA)으로부터 구입하였다.

루시퍼라아제 발현 플라스미드 DNA(pCN-Luci)를 공지 기술을 참조하여 제조하였다(J. S. Choi, K. Nam, J. Y. Park, J. B. Kim, J. K. Lee and J. S. Park, J. Controlled Release, 99, 445 (2004)) 293, HeLa 및 HepG2 세포주를 한국세포주로부터 수득하였다. FBS(Fetal bovine serum), DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium), 100× antibiotic-antimycotic reagent를 GIBCO (Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입하고, Micro BCATM 단백질 분석 키트는 Pierce (Rockford, IL, USA)로부터 구입하였다.

세포독성 분석

PMP의 In vitro 세포독성을 293, HeLa, 및 HepG2 세포에서 MTT 분석을 이용하여 평가하였다.

세포들을 96 웰 플레이트에 2?104 cells/well 밀도로 씨딩하고 폴리머 첨가 전에 1일 동안 배양하였다. 37°C 에서 24시간동안PEI 25kDa, PEI 800Da, PEI 2kDa, 및 다양한 농도의 PMP를 세포들에게 처리하였다. 그리고, 26 μL 의 MTT 스톡 용액(2 mg/mL)을 첨가하고 4시간동안 37°C 에서 배양하였다. MTT-함유 배지를 제거하고 150 μL DMSO를 각 웰에 첨가하여 살아있는 세포들에 의해 형성된 포마잔 결정들을 용해하였다. 각웰의 흡광도를 570 nm에서 마이크로플레이트 리더기(VersaMax, Molecular Devices, US) 상에서 읽었다. 모든 실험을 3회 실시하였다.

공초점 현미경 분석

공초점 현미경에 대하여, HepG2 세포들을35 mm 유리 베이스 디쉬 (SPL Life Science, Gyeonggi-Do, South Korea) 상에 씨딩하고 37°C에서 하루동안 배양하였다. 중량비 16/1, 4/1, 16/1 및 8/1로 Alexa Fluor 532 표지된 pDNA와 PEI 2kDa, PEI 25kDa, PMP 800 및 PMP 2000 복합체를 각각 형성하였다 그리고, HepG2 세포와 배양하였다. 추가 24시간동안의 배양 후, 이전 배지를 제거하고 상기 세포들을 PBS로 세척하였다. 핵을 DAPI 시약 (Molecular Probes)으로 7분동안 염색하고, PBS로 여러 번 세척하였다. 형광신호를 Zeiss LSM 5 라이브 공초점 레이저 현미경을 이용하여 분석하였다.

세포 배양 및 트랜스펙션 분석

인간 배아 신장 293 세포, 인간 상피 암종 HeLa 세포들 및 HepG2(human hepatocellular liver carcinoma cell line) 세포들을 10% FBS, 1% antibiotic-antimycotic agent이 함유된 DMEM에서 배양하였다. 세포주들을 인큐베이터 (5% CO₂, 95% 상대습도, 37°C)에서 유지시켰다. 트랜스펙션 실험을 위해, 세포들을 96 웰 플레이트에 2x10⁵ cells/well 밀도로 씨딩하고, 70-80% 컨플루언시에 도달할때까지 24시간동안 배양하였다.

트랜스펙션 복합체를, 0.5 μg 플라스미드 DNA와 10% FBS 를 함유하는 다양한 양의 PMP와 상온에서 30분동안 혼합함으로써 제조하였다. 트랜스펙션 효율을 비교하기 위해, PEI 25kDa/pDNA (중량비(폴리머/pDNA): 2:1-8:1, 최적 조건) 복합체를 대조군으로 준비하였다. PEI 800Da/pDNA 복합체, PEI 2kDa/pDNA 복합체, 및 PMP/pDNA 복합체들을 중량비(polymer/pDNA) 2:1 내지 24:1로 준비하여 트랜스펙션 조건을 최적화시켰다.

그 후, 세포들을 복합체 용액으로 처리하고, 24시간동안 37°C에서 배양하였다. 구 배지는 제거하고, 세포들을 DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline)로 헹군 후, 각 웰에 첨가된100 μL 리포터 용해 버퍼(Promega, Madison, WI) 내에서 30분 동안 상온에서 흔들었다.

상기 세포들을 수확하여 마이크로 원심분리 튜브에 옮겼다. 15초 볼텍싱 후, 세포들을 12,600 rpm에서 5분동안 원심분리하였다. 루시퍼라아제 활성을 Lumat LB 9507 instrument (Berthold Technology, Bad Wildbad, Germany)을 이용하여 측정하였고, 단백질 함량을 Micro BCATM 단백질 분석 키트를 이용하여 측정하였다. 루시퍼라아제의 최종 부피를 RLU/μg 전체 단백질의 관점에서 기록하였다. 모든 실험은 3회씩 수행하였다.

실시예 1 : PMP ( Polyethylenimine - methyl acrylate - polyethylenimine ) 합성

PEI 2kDa 코어 및 외층으로서 분자량 800Da 및 2kDa의 PEIs로 다가지형 폴리머를 각각 합성하였다. 합성 공정을 도 1에 도시하였다

우선, PEI (2kDa) 를 1,000-배 과잉몰(molar excess) 메탈 아크릴레이트와 함께 3 mL 메탄올에 용해하였다. 상기 용액을 질소 대기에서 37°C 하 7일 동안 교반하고, 상기 샘플을 감압하 증발시켜 용매를 제거하였다. 샘플(PEI-MA)을 100-배 과잉몰 PEI (800Da) 및 PEI (2kDa) 각각과 함께 7 mL 메탄올에 용해하였다. 2개의 용액을 질소 대기에서 37°C 하 3일동안 교반하고 상기 샘플을 감압하 증발시켜 용매를 제거하한 후 과량의 차가운 에틸 에테르의 첨가에 의해 켄칭하였다. 침전된 산물을 물에 가용화하고 증류수에 대해 투석막((MWCO 3,500, Spectra/por)을 이용하여 1일동안 투석하였다. 이를 동결 건조하고 노란색 생성물을 수득하였다. 반응 생성물의 화학구조를 NMR 분광학 및 FT-IR 스펙트럼에 의해 규명하였다.

1H NMR 스펙트럼을 Varian Inova 400NB (400 MHz) 분광계를 이용하여 측정하였고, D2O를 용매로 사용하였다. FT-IR 스펙트럼을 JASCO 4100 Fourier Transform Infrared Spectrometer를 이용하여 결정하였다.

그리고, 그 결과를 도 2에 도시하였다.

PMP(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine) 800 및 PMP 2000의 1H NMR 스펙트럼은 PEI 2kDa 코어 (2.3-2.9 ppm) 및 PEI 그래프트 (2.1-2.3 및 2.9-3.3 ppm) 모두로부터의 신호를 보여주었다 (도 2, 3), 그리고 상기 폴리머 합성 성공 여부를 평가하였다. 메틸 아크릴레이트 양성자 피크 및 그래프트된 PEI양성자 피크의 적분법(integration) 사이의 비율 계산으로, 거의 100%의 PEI-MA의 카르복실기가 PEI 그래프트와 결합하고 있음을 확인하였다. 2 생성물의 FT-IR 스펙트럼에서 케톤기의 흡광도 출현은 PEIs가 성공적으로 PEI 2kDa 코어에 통합됨을 의미한다 (도 2, 3).

실시예 2 : 아가로오스 겔 지연분석

PMP/pDNA 폴리폴렉스 형성을 유도하는, 마이너스 전하의 핵산 및 양이온성 PMP 사이의 정전기 상호작용을 아가로스 겔 지연에 의해 조사하였다.

PMP 및 플라스미드DNA 복합체 형성을 전기영동법에 의해 분석하였다. PMP/pDNA 복합체를 HEPES 버퍼 (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4)에서 0.3~4 범위로 다른 중량비(polymer/pDNA) 에서 준비하였다. 복합체 형성을 위해 상온에서 30분 배양하였다.

상기 샘플들을 0.7%(w/v) 아가로스 겔 상에서 EtBr(0.5 μg/mL of the gel)로 전기영동을 수행하였다. 30분 동안 100V에서 수행하였고, 결과물 겔을 UV-illumination 하 사진을 수득하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, PMP 800/pDNA 및 PMP 2000/pDNA가 각각 0.5 및 0.8 중량비 상에서 완전히 지연됨을 확인하였다.

실시예 3 : PMP /플라스미드 DNA 복합체의 크기 측정 및 제타 포텐셜 분석

폴리머/pDNA 복합체의 입자 크기는 세포에 의한 전달 복합체의 내재화(internalization)에 영향을 미치므로, 트랜스펙션 효율에 영향을 끼친다.

이를 알아보기 위해, 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering) 및 ζ-포텐셜 측정 실험을 수행하였다.

다양한 중량비에서의 PMP 800, PMP 2000/플라스미드 복합체의 크기 및 표면 전위(제타-포텐셜)을 각각 Zeta-potential & Particle size Analyzer ELS-Z (Photal, Otsuka Electronics, Japan) 및 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK)에 의해 측정하였다. 크기 측정을 위해, 평균값을 30회 데이터로부터 계산하였다. 제타 포텐셜 측정을 위해, 평균값을 12회 데이터로부터 수득하였다.

그 결과, 도 5A에서 나타난 바와 같이, 복합체의 입자 크기는 중량비 증가와 함께 감소하였다.

0.5 중량비에 도달한 후, PMP는 pDNA를 직경 100-110 nm의 나노입자로 압축시킬 수 있고, 이러한 복합체에 대한 크기에서 비자명한 변화가 중량비의 증가에 따라 관찰되었다. 높은 중량비에서 PMP 800/pDNA 및 PMP 2000/pDNA 복합체 사이의 현저한 직경 차이는 나타나지 않았다.

이러한 결과는 PMP가 pDNA를 유전자 전달에 적합한 나노-크기 입자로 응축시킬 수 있음을 보여준다. 폴리플렉스의 양으로 하전된 표면은 음전하의 인지질 세포막의 흡수능에 필요하다. 이는 또한 효율적인 세포내 트래피킹(intracellular trafficking)을 가져온다. 폴리머/pDNA 복합체의 표면 전하를 평가하기 위해, 제타 포텐셜을 측정하였다.

도 5B에 도시한 바와 같이, PMP 800 및 PMP 2000은 다양한 중량비에서 유사한 표면전하를 나타냈다. 중량비가 증가함에 따라, PMP/pDNA 복합체의 제타 포텐셜은 빠르게 증가하여 1~3 중량비에서 약 40mV 안정기(plateaus)에 도달하였다.

이와 같은 크기 및 제타 포텐셜 결과는 중량비 ≥ 1에서 아가로스 겔 전기영동 분석으로 평가하였고, PMP는pDNA를 완전히 압축함을 알 수 있었다.

실시예 4 : 산-염기 적정 분석

양성자 스펀지 이론에 의해, 양이온 유전자 담체의 양성자-완충 능력은 트랜스펙션 효율에 기여하는 것으로 생각된다. 이는 엔도시토시스 후 DNA를 보호함에 있어서 폴리머성 담체를 도우고, 엔도좀으로부터 DNA 복합체 방출을 돕는다. 산-염기 적정으로 PMP의 양성자 첨가 능력(protonation ability)을 평가하였다.

150 mM NaCl 내 폴리머들(PEI 800Da, PEI 2kDa, PEI 25kDa and PMP) (10 mg/ml)의 현탁액을 0.1 N NaOH로 pH 10으로 조절하였다. 그리고, 25 μL aliquot의 0.1 N HCl pH를 3.0로 낮추었다. NaCl (150 mM)를 대조군으로서 적정하였다. pH-meter (pH 211 microprocessor pH meter, HANA Instruments, Seoul, South Korea)를 이용하여 각 첨가 후에 pH값을 측정하였다. pH에 대한 플롯에서 선의 기울기 및 사용된 HCl의 양은 전달체의 고유 완충 능력을 의미한다.

그 결과, 도 6에 도시한 바와 같이, PEI 25kDa, PEI 800Da, 및 PEI 2kDa는 pH 7.4 에서 5.1 (즉, 엔도좀 pH 범위)로 감소시키기 위해, 약 0.020 mmol HCl 을 요구히였다. 반면, PMP의 경우에는 0.024 mmol이 필요하였다.

이러한 결과는 PMP가 PEI 25kDa, PEI 800Da, 및 PEI 2kDa보다 더 우수한 완충능을 가짐을 보여준다. 이러한 효과는 코어로서 PEI 2kDa에 대하여 PEI 800Da 또는 2kDa의 결합으로 인해, 이차 및 삼차 아민의 증가에 따라 PMP의 완충능력을 촉진시키기 때문일 것으로 생각된다.

실시예 5 : 폴리플렉스의 세포내 확산

각 폴리머들은 최적 중량비에서 Alexa Fluor 532-표지된pDNA와 복합체를 형성시키고, HepG2 세포내로 트랜스펙션하여 폴리플렉스의 세포내 확산을 분석하였다.

37°C에서의 24시간 배양 후, 폴리플렉스의 세포내 확산을 공초점 현미경으로 확인하였다. PEI 2kDa/pDNA로 트랜스펙션된 세포들은 핵주위에 위치한 DNA 입자가 거의 없음을 보여주었다(붉은색)(도 8A). 대조적으로, PEI 25kDa/pDNA, PMP 800/pDNA, 및PMP 2000/pDNA 복합체들은 응집체로서 세포질 내 또는 핵관련하여 관찰되었다 (도 8B, 8C, 8D). 추가로, 많은 PMP 800/pDNA 및 PMP 2000/pDNA 복합체들이 PEI 25kDa/pDNA 복합체보다 핵막과 결합함을 명백히 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 트랜스펙션 후 24시간 째 상이한 양성자-완충 능력으로 인해 세포내 위치화가 다양하게 나타날 것임을 예상하였다.

5-1. 다른 세포주에서의 트랜스펙션 효율

PMP에 의한 293, HeLa, 및 HepG2 세포에서의 in vitro 트랜스펙션 효율을 도 9에 도시하였다. 293, HeLa, 및 HepG2 세포들에 대한 PMP 유전자 발현 수준은 모 PEI 2kDa보다 높은 1.2-2.9 자리수(orders of magnitude)를 보였다. 293 세포에서, PMP는 PEI 25kDa 와 유사하게 가장 높은 트랜스펙션 효율을 보였다. 이는 높은 트랜스펙션 효율을 보이는 골드 표준 트랜스펙션 시약(gold standard transfection reagent)이다. HeLa 세포에서, PMP 800 및 PMP 2000의 가장 높은 트랜스펙션 효율은 PEI 25kDa의 경우보다 각각 유사하거나 조금 더 높다.

HepG2 세포에서, PMP의 가장 효율적인 유전자 트랜스펙션은 PEI 25kDa의 경우보다 다소 높은 반면, 이들의 세포독성은 PEI 25kDa 보다 매우 현저히 낮다.

이러한 우수한 PMP의 효과는 보다 적절한 양성자-완충 능력 및 낮은 세포독성에서 기인하고, 향상된 유전자 발현으로 이끄는 것으로 생각된다.

3개의 세포주에서 최적 트랜스펙션 중량비에서 PMP 800 및 PMP 2000의 두 효율 간 현저한 차이는 없었다.

5-2. 세포생존율 분석

두 담체는 높은 트랜스펙션을 보였지만, PMP 800은 PMP 2000보다 현저히 높은 세포 생존율을 보였다. 그러므로, 효율적인 유전자 트랜스퍼 및 적은 독성의 두 가지 사항을 고려하여, PMP 800이 보다 우수한 유전자 전달 담체임을 알 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

PEI-MA-PEI(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine) 구조로 이루어진, 분자량이 800 또는 2000 달톤인 것을 특징으로 하는, 다가지형의 비바이러스성 핵산 전달용 중합체.
제1항에 있어서,
PEI-MA의 카르복시기가 PEI 그래프트와 결합하고 있는 것을 특징으로 하는, 다가지형의 비바이러스성 핵산 전달용 중합체.
삭제
삭제
삭제
PEI-MA-PEI(polyethylenimine-methyl acrylate-polyethylenimine) 구조를 이루는 PMP에 DNA로 구성된 목적 유전자가 결합되어 있는, 다가지형의 비바이러스성 핵산 전달용 복합체.
제6항에 있어서,
상기 PMP는 분자량 800 내지 2000 달톤의 범위를 가지는 것을 특징으로 하는, 다가지형의 비바이러스성 핵산 전달용 복합체.
삭제
제7항에 있어서,
PMP : DNA의 중량비는 0.5 ~ 3 : 1인 것을 특징으로 하는, 다가지형의 비바이러스성 핵산 전달용 복합체.
제7항에 있어서,
상기 DNA는 PMP에 의해 직경 100-110 nm의 나노입자로 압축되어 있는 것을 특징으로 하는, 다가지형의 비바이러스성 핵산 전달용 복합체.