CN115151277A

CN115151277A - 负载核酸的红细胞细胞外囊泡

Info

Publication number: CN115151277A
Application number: CN202180008703.7A
Authority: CN
Inventors: T·戈查; H·罗迪什; W·M·乌斯曼; R·杨
Original assignee: Carmine Therapeutics Pte Ltd
Current assignee: Carmine Therapeutics Pte Ltd
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2021-01-12
Publication date: 2022-10-04
Also published as: KR20220127851A; EP4090373A1; AU2021209012A1; EP4090373A4; US11970718B2; CA3164176A1; JP2023511271A; US20210214217A1; US20230050813A1; WO2021145821A1

Abstract

公开了一种负载有核酸货物的红细胞细胞外囊泡(RBCEV)；用于制备所述经负载的囊泡的方法；以及其囊泡的治疗性用途。所述核酸货物可以是DNA或RNA，单链的或双链的，以及线性的或环状的。

Description

负载核酸的红细胞细胞外囊泡

本申请要求2020年1月13日提交的US 62/960,569和2020年2月26日提交的US 62/981,880的优先权，所述专利的内容和要素出于所有目的以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及细胞外囊泡，并且特别地但非排他性地涉及源自红细胞的细胞外囊泡。

背景技术

细胞外囊泡(EV)是介导细胞间生物分子的转移的细胞来源的脂质膜结合囊泡。普遍认为，存在两类EV，即1)外泌体，所述外泌体由内体膜向内出芽而产生、从而在多泡体中形成最终将与质膜融合并将外泌体释放到细胞外空间中的腔内囊泡；和2)微泡，所述微泡由质膜直接出芽而形成。通常，外泌体的直径是30-100nm，而微泡大于100nm。

由于其天然的跨细胞膜转运较大的大分子的能力，EV已被提出作为药物递送媒介物用于转运小分子、蛋白质和核酸，包括短RNA如反义寡核苷酸(ASO)、短干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)，长RNA如信使RNA(mRNA)，或甚至是双链DNA(dsDNA)。EV介导的核酸递送受到高度追捧，因为这些大分子是有前景的药物候选物，具有治疗多种疾病的潜力，但核酸作为药物的开发由于多种原因而受到阻碍，所述原因包括它们无法穿透细胞膜、免疫原性和对体循环中的核酸酶的易感性。其它几种类型的递送媒介物如脂质纳米颗粒和阳离子聚合物已用于核酸递送，但由于肝毒性和有限肝外生物分布，它们的应用受到限制。

在EV中负载核酸将克服大部分这些挑战，因为EV具有生物相容性，具有独特的嗜性，并且根据它们的细胞来源，它们几乎没有毒性或免疫原性威胁。EV可通过在细胞源中转染或过表达有效载荷、然后纯化由这些细胞产生的EV而被内源性地负载，或者通过使用机械手段(即电穿孔、超声处理、冻融、细胞挤出)或化学手段(即脂转染或氯化钙处理)直接负载分离的EV而被外源性地负载。根据文献，负载核酸的大多数尝试涉及短RNA，如siRNA、miRNA和ASO，并且这些有效载荷是通过外源性手段(通常是电穿孔)负载的。

将大于1000个碱基对的核酸负载到细胞外囊泡中的尝试遇到了挑战并且效率非常低(Mol Pharm.2015年10月5日；12(10):3650–3657)。有效载荷的大小是纯化EV的外源负载的通常限制因素(PNAS3月24日,2015 112(12)E1433-E1442)(Mol Pharm.2015年10月5日；12(10):3650–3657)。此外，在不引起囊泡聚集、产量或功能损失的情况下成功地将大核酸负载到EV中是不可能的(Mol Pharm.2015年10月5日；12(10):3650–3657)。因此，通常大小超过1000个碱基对的DNA基因表达载体被认为是EV的具有挑战性的货物。

Yang等人(Nature Biomedical Engineering,可在安全http站点doi.org/10.1038/s41551-019-0485-1获得)解释，将外源核酸，特别是大信使RNA插入细胞分泌的外泌体中导致低产量。为了解决这个问题，他们开发了一种细胞纳米穿孔方法，其中将源细胞用质粒DNA转染，随后用局部和瞬时电刺激进行刺激以促进携带转录mRNA和靶向肽的外泌体的释放。与批量电穿孔和其它外泌体产生策略相比，他们报告了多达50倍的外泌体和超过103倍的外泌体mRNA转录物增加，即使来自基础外泌体分泌水平较低的细胞也是如此。

WO2010/119256描述了用环状和线性化pEGFP-NAD对外泌体进行电穿孔。电穿孔似乎保护环状DNA质粒免受DNA酶I降解，但不能保护线性DNA。他们取得了不一致的结果，并且通常针对降解的保护水平较低。

注意到只有小RNA(siRNA和miRNA)已成功负载到细胞外囊泡中，Lamichhane等人(Exogenous DNA Loading into Extracellular Vesicles via Electroporation isSize-Dependent and Enables Limited Gene Delivery.Mol Pharm.2015年10月5日；12(10):3650–3657)研究了将DNA负载到来自HEK293T细胞、HUVEC细胞和人间充质干细胞的细胞外囊泡中。他们确定细胞外囊泡中的负载效率和容量取决于DNA大小，其中与较大的线性DNA和质粒DNA相比，长度小于1000bp的线性DNA分子与细胞外囊泡更有效地缔合，特别是注意“大小限制截断值在750-1000bp的范围内”。

Usman等人(Efficient RNA drug delivery using red blood cellextracellular vesicles.Nature Communications Nat Commun 9,2359(2018)doi:10.1038/s41467-018-04791-8)描述了一种产生大量红细胞来源的细胞外囊泡用以递送RNA的策略。

鉴于以上考虑而设计了本发明。

发明内容

本发明人开发了一种用于将货物负载到细胞外囊泡中的方法。特别地，所述方法允许将诸如DNA的核酸货物负载到细胞外囊泡，如红细胞来源的细胞外囊泡或外泌体中。所得的经负载细胞外囊泡可用于治疗和研究中，以用于在体外和体内将货物递送至靶细胞中。

在本公开的一个方面，提供了一种负载有货物的细胞外囊泡或此类细胞外囊泡的群体。所述货物优选地是核酸。所述核酸可以是DNA、RNA或其它寡核苷酸或多核苷酸。所述核酸最优选地是DNA。所述核酸可以是环状的或环化的，或线性的。所述核酸可以是双链的或单链的，优选双链的。在一些方面，所述核酸是环状DNA，如DNA微环、质粒或纳米质粒(Aldevron)。

在所述核酸货物为单链的情况下，它可具有至少250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000或30000个碱基中的一种的长度。任选地，在所述核酸货物为单链DNA(ssDNA)的情况下，它可具有4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000或30000个碱基中的一种的最大长度。在优选的实施方案中，单链核酸货物可具有2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、6000、7000、8000、9000、10000或多于10000个碱基中的一种的最小长度。

在核酸货物为单链的情况下，它可具有250-750、500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000、7000-8000、8000-9000、9000-10000、10000-11000、250-1000、1000-3000、1000-4000、1000-5000、1000-6000、1000-7000、1000-8000、1000-9000、1000-10000、1000-11000、2000-4000、2000-5000、2000-6000、2000-7000、2000-8000、2000-9000、2000-10000、2000-11000、3000-5000、3000-6000、3000-7000、3000-8000、3000-9000、3000-10000、3000-11000、4000-6000、4000-7000、4000-8000、4000-9000、4000-10000、4000-11000、5000-7000、5000-8000、5000-9000、5000-10000、5000-11000、6000-8000、6000-9000、6000-10000、6000-11000、7000-9000、7000-10000或7000-11000个碱基中的一种的长度。

在所述核酸货物为单链的一些实施方案中，它可具有高达2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000或50000个碱基中的一种的长度。所述单链核酸货物可具有5000-10000、5000-15000、5000-20000、5000-25000、5000-30000、5000-35000、5000-40000、10000-15000、10000-20000、10000-25000、10000-30000、10000-35000、10000-40000、15000-20000、15000-25000、15000-30000、15000-35000、15000-40000、20000-25000、20000-30000、20000-35000、20000-40000、25000-30000、25000-35000、25000-40000、30000-35000、30000-40000、35000-40000、35000-45000、35000-50000、40000-50000或40000-45000个碱基中的一种的长度。

在所述核酸货物为双链的情况下，它可具有至少250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000个碱基对中的一种的长度。任选地，在所述核酸货物为双链的情况下，它可具有4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000个碱基对中的一种的最大长度。在优选的实施方案中，双链核酸货物可具有2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、6000、7000、8000、9000、10000或多于10000个碱基对中的一种的最小长度。

在所述核酸货物为双链的情况下，它可具有250-750、500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000、7000-8000、8000-9000、9000-10000、10000-11000、250-1000、1000-3000、1000-4000、1000-5000、1000-6000、1000-7000、1000-8000、1000-9000、1000-10000、1000-11000、2000-4000、2000-5000、2000-6000、2000-7000、2000-8000、2000-9000、2000-10000、2000-11000、3000-5000、3000-6000、3000-7000、3000-8000、3000-9000、3000-10000、3000-11000、4000-6000、4000-7000、4000-8000、4000-9000、4000-10000、4000-11000、5000-7000、5000-8000、5000-9000、5000-10000、5000-11000、6000-8000、6000-9000、6000-10000、6000-11000、7000-9000、7000-10000、7000-11000、8000-12000、8000-13000、8000-14000、8000-15000、9000-13000、9000-14000、9000-15000、9000-16000、9000-17000、10000-14000、10000-15000、10000-16000、10000-17000或10000-18000个碱基对中的一种的长度。

在所述核酸货物为双链的一些实施方案中，它可具有高达2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000或40000个碱基对中的一种的长度。所述双链核酸货物可具有5000-10000、5000-15000、5000-20000、5000-25000、5000-30000、5000-35000、5000-40000、10000-15000、10000-20000、10000-25000、10000-30000、10000-35000、10000-40000、15000-20000、15000-25000、15000-30000、15000-35000、15000-40000、20000-25000、20000-30000、20000-35000、20000-40000、25000-30000、25000-35000、25000-40000、30000-35000、30000-40000或35000-40000个碱基对中的一种的长度。

所述货物可优选地负载到细胞外囊泡的内腔中(即内腔负载)。在一些情况下，一些货物被负载到细胞外囊泡上(例如，负载到细胞外囊泡的膜的外表面上)。负载到细胞外囊泡的膜的外表面上的货物分子可通过使所述囊泡与核酸酶(例如DNA酶或RNA酶)接触而除去。

所述细胞外囊泡可以是微泡或外泌体。尽管细胞外囊泡可来源于任何合适的细胞，但特别优选来源于红细胞(RBC)的细胞外囊泡。

根据本公开的细胞外囊泡可以分离的形式提供。

本公开进一步提供了一种组合物，所述组合物包含负载有核酸货物的细胞外囊泡。在此类组合物中，所述细胞外囊泡可包含平均每个囊泡至少1.0、2.0、3.0、4.0个或更多个核酸分子。

在本公开的另一个方面，提供了一种负载有DNA货物的红细胞细胞外囊泡(RBCEV)。

在一个实施方案中，提供了一种分离的红细胞细胞外囊泡(RBCEV)，所述分离的红细胞细胞外囊泡含有在RBCEV的内腔中的至少一种DNA货物。

所述DNA货物可以是单链的或双链的。

在所述DNA货物为单链DNA(ssDNA)的情况下，它可具有至少250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000或30000个碱基中的一种的长度。任选地，在所述DNA货物为单链DNA(ssDNA)的情况下，它可具有4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000或30000个碱基中的一种的最大长度。在优选的实施方案中，单链DNA货物可具有2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、6000、7000、8000、9000、10000或多于10000个碱基中的一种的最小长度。

在所述DNA货物为单链DNA(ssDNA)的情况下，它可具有250-750、500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000、7000-8000、8000-9000、9000-10000、10000-11000、250-1000、1000-3000、1000-4000、1000-5000、1000-6000、1000-7000、1000-8000、1000-9000、1000-10000、1000-11000、2000-4000、2000-5000、2000-6000、2000-7000、2000-8000、2000-9000、2000-10000、2000-11000、3000-5000、3000-6000、3000-7000、3000-8000、3000-9000、3000-10000、3000-11000、4000-6000、4000-7000、4000-8000、4000-9000、4000-10000、4000-11000、5000-7000、5000-8000、5000-9000、5000-10000、5000-11000、6000-8000、6000-9000、6000-10000、6000-11000、7000-9000、7000-10000或7000-11000个碱基中的一种的长度。

在所述DNA货物为双链DNA(dsDNA)的情况下，它可具有至少250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000个碱基对中的一种的长度。任选地，在所述DNA货物为双链DNA(dsDNA)的情况下，它可具有4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000个碱基对中的一种的最大长度。在优选的实施方案中，双链DNA货物可具有2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、6000、7000、8000、9000、10000或多于10000个碱基对中的一种的最小长度。

在所述DNA货物为双链DNA(dsDNA)的情况下，它可具有250-750、500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000、7000-8000、8000-9000、9000-10000、10000-11000、250-1000、1000-3000、1000-4000、1000-5000、1000-6000、1000-7000、1000-8000、1000-9000、1000-10000、1000-11000、2000-4000、2000-5000、2000-6000、2000-7000、2000-8000、2000-9000、2000-10000、2000-11000、3000-5000、3000-6000、3000-7000、3000-8000、3000-9000、3000-10000、3000-11000、4000-6000、4000-7000、4000-8000、4000-9000、4000-10000、4000-11000、5000-7000、5000-8000、5000-9000、5000-10000、5000-11000、6000-8000、6000-9000、6000-10000、6000-11000、7000-9000、7000-10000、7000-11000、8000-12000、8000-13000、8000-14000、8000-15000、9000-13000、9000-14000、9000-15000、9000-16000、9000-17000、10000-14000、10000-15000、10000-16000、10000-17000或10000-18000个碱基对中的一种的长度。

所述DNA货物可以是包含编码蛋白质或肽的基因的表达载体。

所述DNA货物可以是环状的(例如微环或质粒)或线性的。所述DNA货物可在RBCEV的内腔中。所述RBCEV优选地源自或获自人或哺乳动物红细胞。所述RBCEV可以是分离的。

在本公开的一个相关方面，提供了一种分离的红细胞细胞外囊泡(RBCEV)，所述分离的红细胞细胞外囊泡含有在RBCEV的内腔中的至少一个核酸(优选DNA)货物(如本文所述)。

还提供了一种分离的红细胞细胞外囊泡(RBCEV)群体，其中平均每个RBCEV负载有至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0个或更多个核酸(优选DNA)货物(如本文所述)。还提供了一种分离的红细胞细胞外囊泡(RBCEV)群体，所述群体平均含有在每个RBCEV的内腔中的至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0个或更多个核酸(优选DNA)货物(如本文所述)。

在本公开的一个相关方面，提供了一种组合物，所述组合物包含如本文所述的多个RBCEV或RBCEV群体。在所述组合物中，平均每个RBCEV可负载有至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0个或更多个DNA货物。在所述组合物中，平均每个RBCEV可负载有1.0至4.0个DNA货物，或0.1至1.0、0.5至1.0、0.5至1.5、0.5至2.0、0.5至2.5、0.5至3.0、0.5至3.5、0.5至4.0、1.0至1.5、1.0至2.0、1.0至2.5、1.0至3.0、1.0至3.5、1.0至4.0、1.5至2.0、1.5至2.5、1.5至3.0、1.5至3.5、1.5至4.0、2.0至2.5、2.0至3.0、2.0至3.5、2.0至4.0、2.5至3.0、2.5至3.5、2.5至4.0、3.0至3.5、3.0至4.0或3.5至4.0个或更多个货物中的一种。所述平均值可以是平均值。

所述组合物可以是药物组合物或药物，并且还可包含药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或稳定剂。

本文所述的细胞外囊泡可用于疗法，特别是基因疗法中，用于将核酸递送至靶细胞以引起基因在所述靶细胞中的表达。

在本公开的另一个方面，提供了一种治疗需要治疗的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的细胞外囊泡、优选RBCEV，或包含多个如本文所述的细胞外囊泡、优选RBCEV的组合物，从而治疗所述受试者。

在本公开的另一个方面，提供了如本文所述的细胞外囊泡、优选RBCEV或包含多个细胞外囊泡、优选RBCEV的组合物用于治疗受试者的疾病的方法中。

在本公开的另一个方面，提供了如本文所述的一个或多个细胞外囊泡、优选如本文所述的一个或多个RBCEV在制造用于治疗受试者的疾病的方法中的药物组合物或药物中的用途。

所述受试者可以是需要治疗的受试者。所述治疗受试者的方法可涉及通过表达来自DNA货物的基因序列的蛋白质或肽来治疗所述受试者的疾病。所述治疗可包括疾病的预防和/或改善。

在本公开的另一个方面，提供了一种用于使细胞外囊泡负载核酸货物的方法，以及使用这种方法负载(或制备或通过使用这种方法获得)的细胞外囊泡。

所述方法是化学转染方法。此类方法可涉及使所述核酸与转染试剂接触，任选地允许形成核酸/转染试剂复合物；将所述核酸和转染试剂与细胞外囊泡在足以使所述细胞外囊泡负载所述核酸的条件下一起孵育；以及任选地洗涤所述经负载的细胞外囊泡。在某些方法中，将核酸和转染试剂与所述细胞外囊泡一起孵育多于一次(即将所述核酸和转染试剂与所述细胞外囊泡一起温育的步骤重复至少一次)。

在优选的方法中，所述转染试剂是(例如MW25000Da或MW40,000Da的)线性聚乙烯亚胺盐酸盐。

本文所述的某些方法包括除去不包含在所述细胞外囊泡的内腔内的核酸货物的步骤。除去不包含在所述细胞外囊泡的内腔内的核酸货物可包括使所述经负载的细胞外囊泡与核酸酶(例如DNA酶或RNA酶)接触。可使所述经负载的细胞外囊泡在与所述核酸酶接触之前与肝素接触。

在本文所述的用于负载细胞外囊泡的方法中，所述核酸货物可包含如本文所述的核酸分子。在一些优选的实施方案中，待负载的细胞外囊泡是红细胞细胞外囊泡。在其它实施方案中，所述细胞外囊泡是外泌体。

因此，在本公开的一个方面，提供了一种用于使细胞外囊泡负载核酸货物的方法，所述方法包括：

a.提供待负载到细胞外囊泡中的核酸；

b.使所述核酸与细胞外囊泡在转染试剂存在下在足以使所述细胞外囊泡负载所述核酸的条件下且任选地持续合适量的时间接触或孵育；以及

c.任选地洗涤所述经负载的细胞外囊泡。

在优选的实施方案中，所述细胞外囊泡是红细胞细胞外囊泡，或红细胞细胞外囊泡群体。

所述方法可包括重复步骤b一次、二次、三次或更多次。可通过提供更多的用于负载到细胞外囊泡中的核酸在步骤c之前或之后重复步骤b。本发明人发现，在转染试剂存在下重复使所述核酸与细胞外囊泡接触或孵育的负载步骤提高了负载至所述细胞外囊泡的核酸的量。

在本公开的一个方面，提供了一种用于使细胞外囊泡负载核酸货物的方法，所述方法包括：

a.提供待负载到细胞外囊泡中的核酸；

b.使所述核酸与转染试剂接触以允许形成核酸/转染试剂复合物；以及

c.使所述核酸/转染试剂复合物与细胞外囊泡在足以使所述细胞外囊泡负载核酸/转染试剂复合物的条件下且任选地持续合适量的时间孵育或接触；以及

d.任选地洗涤所述经负载的细胞外囊泡。

所述方法可包括通过一个、两个、三个或更多个循环重复步骤b-d。这可涉及提供更多的用于负载到细胞外囊泡中的核酸。本发明人发现，在转染试剂存在下重复使所述核酸与细胞外囊泡接触或孵育的负载步骤提高了负载至所述细胞外囊泡的核酸的量。

在本公开的一个相关方面，提供了一种用于使细胞外囊泡负载核酸货物的方法，所述方法包括：

a.提供待负载到细胞外囊泡中的核酸；

c.使所述核酸/转染试剂复合物与细胞外囊泡在足以使所述细胞外囊泡负载核酸/转染试剂复合物的条件下且任选地持续合适量的时间孵育或接触；

d.任选地洗涤所述经负载的细胞外囊泡；

e.使所述经负载的细胞外囊泡与另外的核酸/转染试剂复合物接触；以及

f.将所述另外的核酸/转染试剂复合物与所述经负载的细胞外囊泡孵育或接触。

所述方法可包括在进行到后续步骤，例如到步骤e之前重复步骤b-d至少一次。

在任何上述方法中，所述转染试剂可以是任选地MW25,000Da或MW40,000Da的线性聚乙烯亚胺盐酸盐。

所述方法还可包括除去不包含在所述细胞外囊泡的内腔内的核酸货物的步骤。这可包括使所述经负载的细胞外囊泡与核酸酶，例如RNA酶或DNA酶接触。可使所述经负载的细胞外囊泡在与所述核酸酶接触之前与肝素接触。

所述核酸货物可包含核酸分子，其中每个核酸分子是单链的并且具有至少250个碱基、或至少2000个碱基、或2000-11000个碱基或更多个碱基的长度。

所述核酸货物可包含核酸分子，其中每个核酸分子是双链的并且具有至少250个碱基对、或至少2000个碱基对、或2000-11000个碱基对或更多个碱基对的长度。

所述核酸货物可以是环状的，例如微环或质粒。所述核酸货物可以是线性的。所述核酸货物可以是DNA或RNA。

所述细胞外囊泡可以是微泡或外泌体。

还提供了一种负载有核酸货物的细胞外囊泡，其通过根据本公开的方法制备或获得。

本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除了这种组合是明显不允许的或者明确避免的情况。

附图说明

现在将参考附图论述说明本发明的原理的实施方案和实验，其中：

图1.通过电穿孔的RBCEV将mRNA与DNA递送到293T细胞中。(a)将未负载的RBCEV、与GFP mRNA混合的RBCEV(RBCEV+mRNA)和具有通过电穿孔负载的GFP mRNA的RBCEV(mRNA-eRBCEV)添加至293T细胞。在48小时后，通过显微术对细胞进行成像，并使用流式细胞术对GFP阳性细胞进行定量。(b)将未负载的RBCEV、与GFP微环混合的RBCEV(RBCEV+MC)和具有通过电穿孔负载的GFP微环的RBCEV(MC-eRBCEV)添加至293T细胞。在48小时后，通过显微术对细胞进行成像，并使用流式细胞术对GFP阳性细胞进行定量。

图2.通过化学转染的RBCEV将mRNA与DNA递送至293T细胞中。使RBCEV化学负载微环DNA(MC)或编码GFP的mRNA，并处理至293T细胞。在48小时后，通过显微术对细胞进行成像，并使用流式细胞术对GFP阳性细胞进行定量。GFP阳性细胞的百分比在散点图中指示。

图3.RBCEV与MSC-exo之间DNA微环递送的比较。(a)将RBCEV或MSC-exo用编码GFP的微环DNA化学转染，然后处理至293T细胞(MC-RBCEV和MC-MSC-exo)。在EV不存在下的微环DNA用作对照(MC对照)。在48小时后，通过显微术对细胞进行成像，并使用流式细胞术对GFP阳性细胞进行定量。(b)每组中GFP阳性细胞的百分比。n＝3，*p<0.001(学生t检验)

图4.在注射负载DNA的RBCEV后，小鼠中的体内基因表达的评估。在第0天，通过尾静脉注射向6周龄的雌性NSG小鼠施用未负载的RBCEV(n＝3)或负载编码荧光素酶的MC的RBCEV(n＝3)。在注射荧光素底物后在x轴所指示的时间点通过全身生物发光成像评估随时间推移的荧光素酶活性。在右侧示出在所指示的时间点小鼠的代表性腹侧和背侧图像。

图5.两种不同优化参数的比较。将未负载的RBCEV与GFP微环和转染试剂混合30分钟或120分钟，一次或两次。然后将5μg、10μg、20μg或50μg的RBCEV添加至293T细胞。在48小时后，使用流式细胞术对GFP阳性细胞进行定量。GFP阳性细胞的百分比在散点图中指示。

图6.对负载的RBCEV中DNA的位置的评估。将未处理的负载DNA的RBCEV以20,000xg离心。在SDS-PAGE凝胶上对上清液级分和Triton-X裂解的沉淀级分进行电泳，表明DNA在沉淀级分中分离，从而表明RBCEV负载有DNA。当将负载DNA的RBCEV用肝素预处理以使DNA与PEI-Max解离时，DNA在上清液和沉淀级分两者中分离，从而指示RBCEV的外部和内腔负载。用另外的肝素处理裂解的沉淀级分表明内化的DNA存在于与PEI-Max的复合物中。

图7.评估RBCEV的DNA货物限制。(a)将增加大小的DNA构建体(泳道1-2.kb；泳道2-6.6kb，泳道3-9.6kb，泳道4-11.4kb；泳道5-34.2kb)通过单个独特切割位点的限制性消化进行线性化，并通过琼脂糖凝胶电泳分离。这些构建体各自含有由CMV启动子驱动的copGFP转基因的单个拷贝。(b)使RBCEV负载这些构建体中的每一者，并添加至HEK293T细胞。48小时后使用荧光显微术检测转基因表达。(c)还通过流式细胞术分析表达转基因的细胞。每个DNA货物的代表性点图用设门区域中指示的GFP阳性细胞的百分比来描绘。平均荧光强度绘制在条形图中(n＝3)。

图8.RBCEV中负载的DNA的血清稳定性。用小鼠血清(M1至M4)或PBS(P1至P4)处理裸MC(微环)、与转染试剂复合的MC和负载于RBCEV中的MC。单独血清用作背景对照(M0)。基于DNA质量-强度标准曲线(S1至S5)，通过凝胶光密度测定法对回收的DNA的百分比进行定量。

图9.在注射负载DNA的RBCEV后，小鼠中的体内基因表达的评估。(a)在第0天，通过尾静脉注射向6周龄的雌性NSG小鼠施用未负载的RBCEV(n＝3)或负载编码荧光素酶的MC的RBCEV(n＝3)。线图描绘在注射荧光素底物后在x轴所指示的时间点通过全身生物发光成像追踪的随时间推移的荧光素酶活性。左侧示出在所指示的时间点小鼠的代表性腹侧和背侧图像。(b)大小高达34kb的DNA质粒的体内递送。在第0天，通过尾静脉注射向6周龄的雌性BALB/c小鼠施用未负载的RBCEV(n＝2)或负载有编码荧光素酶的2kb、8kb和34kb DNA货物的RBCEV(n＝2)。在注射荧光素底物后，通过全身生物发光成像在48小时后评估荧光素酶活性。在左侧示出小鼠的全身发光图像。在右侧示出用不同大小的DNA货物处理的小鼠的平均生物发光光子通量。

具体实施方式

现在将参考附图论述本发明的方面和实施方案。其它方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本文中提及的所有文献均以引用的方式并入本文。

细胞外囊泡

如本文所用的术语“细胞外囊泡”(EV)是指从细胞释放到细胞外环境中的小囊泡样结构。在本文公开的特别优选的方面，细胞外囊泡来源于红细胞(RBCEV)。

细胞外囊泡(EV)基本上是直径介于50与1000nm之间的质膜或内体膜的球形片段。在病理和生理条件下，细胞外囊泡从各种细胞类型释放。细胞外囊泡具有膜。膜可以是双层膜(即脂质双层)。膜可起源于质膜。因此，细胞外囊泡的膜可具有与其所来源的细胞相似的组成。在本文公开的一些方面，细胞外囊泡基本上是透明的。

术语细胞外囊泡涵盖外泌体、微泡、膜微颗粒、核外颗粒体、膜泡(bleb)和凋亡小体。细胞外囊泡可通过向外出芽和裂变产生。产生可以是自然过程，或化学诱导或增强的过程。在本文公开的一些方面，细胞外囊泡是通过化学诱导产生的微泡。

根据细胞外囊泡的大小和形成来源，细胞外囊泡可分类为外泌体、微泡或凋亡小体。根据本文公开的本发明，微泡是特别优选的细胞外囊泡类别。优选地，本发明的细胞外囊泡已经从质膜脱落，并且不起源于内体系统。在本文所述的某些方面，细胞外囊泡不是外泌体。在本文所述的优选方面中，细胞外囊泡是通过质膜的向外出芽和裂变源自红细胞的质膜的红细胞来源的细胞外囊泡。

在本公开的一些方面和实施方案中，细胞外囊泡不是外泌体。在本公开的一些方面和实施方案中，细胞外囊泡不是核外颗粒体。在本公开的一些方面和实施方案中，细胞外囊泡不是膜泡。在本公开的一些方面和实施方案中，细胞外囊泡不是凋亡小体。

在本公开的一些方面和实施方案中，细胞外囊泡是微泡或膜微颗粒。

本文公开的细胞外囊泡可来源于各种细胞，如红细胞、白细胞、癌细胞、干细胞、树突细胞、巨噬细胞等。在一个优选的实施方案中，细胞外囊泡来源于红细胞，尽管可使用来自任何来源(如来自白血病细胞和细胞系)的细胞外囊泡。在本文描述的优选方面中，细胞外囊泡来源于红细胞。

微泡或微颗粒通过质膜的直接向外出芽和裂变产生。微泡通常比外泌体大，具有在100-500nm范围内的直径。在一些情况下，微泡组合物包含直径在50-1000nm、50-750nm、50-500nm、50-300nm、50-200nm、50-150nm、101-1000nm、101-750nm、101-500nm、101-300nm、100-300nm或100-200nm范围内的微泡。优选地，直径是100-300nm。

例如如存在于组合物、药物组合物、药物或制剂中的微泡群体将包含具有不同直径范围的微泡，微泡样品中微泡的中值直径可在50-1000nm、50-750nm、50-500nm、50-300nm、50-200nm、50-150nm、101-1000nm、101-750nm、101-500nm、101-300nm、100-300nm、100-200nm或100-150nm的范围内。优选地，中值直径在以下范围之一内：50-300nm、50-200nm、50-150nm、100-300nm、100-200nm或100-150nm。平均直径可以是50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm中的一种，任选地±1、2、3、4、5、6、7、8、9或10nm。

外泌体的直径在约30至约100nm的范围内。在一些情况下，可存在于组合物中的外泌体群体包含直径在10-200nm、10-150nm、10-120nm、10-100nm、20-150nm、20-120nm、25-110nm、25-100nm或30-100nm范围内的外泌体。优选地，直径是30-100nm。例如如存在于组合物、药物组合物、药物或制剂中的外泌体群体将包含具有不同直径范围的外泌体，样品中外泌体的中值直径可在10-200nm、10-150nm、10-120nm、10-100nm、20-150nm、20-120nm、25-110nm、25-100nm或30-100nm的范围内。优选地，中值直径介于30-100nm之间。平均直径可以是10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm或120nm中的一种，任选地±1、2、3、4、5、6、7、8、9或10nm。

细胞外囊泡群体可包含至少10、100、1000、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴个细胞外囊泡(任选地每ml载剂)中的一种。

外泌体在多种培养细胞中观察到，所述培养细胞包括淋巴细胞、树突细胞、细胞毒性T细胞、肥大细胞、神经元、少突胶质细胞、雪旺氏细胞(Schwann cell)和肠上皮细胞。外泌体起源于位于多泡体内的内体网络，即细胞质中的大囊。这些囊在被释放到细胞外环境中之前与质膜融合。

凋亡小体或膜泡是在1-5μm范围内的最大细胞外囊泡。经历细胞凋亡的有核细胞经历了若干阶段，从核染色质的凝缩开始、膜起泡和包括凋亡小体在内的EV的最终释放。

优选地，细胞外囊泡来源于人细胞或人起源的细胞。本发明的细胞外囊泡可能由与囊泡诱导剂接触的细胞诱导。囊泡诱导剂可以是钙离子载体、溶血磷脂酸(LPA)或佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)。优选地，囊泡诱导剂是钙离子载体。

在本文所述的许多方面，细胞未经修饰。特别地，细胞外囊泡所来源的细胞不包含外源核酸或蛋白质。在一些情况下，细胞是离体的，如来自抽血。在一些情况下，细胞未经修饰，如转导、转染、感染或以其它方式修饰，但与体内细胞相比基本没有变化。在细胞是红细胞的情况下，所述细胞可不含DNA，或者可基本上不含DNA。红细胞可不含DNA。因此，在优选的实施方案中，在细胞外囊泡已经形成和分离之后，所述细胞外囊泡负载有它们的核酸货物。优选地，细胞外囊泡不包含存在于它们所来源的细胞中的核酸，特别是DNA。例如，优选细胞外囊泡不含基因组或线粒体DNA。

红细胞细胞外囊泡(RBCEV)

在本文公开的某些方面，细胞外囊泡来源于红细胞(red blood cell)(红细胞(erythrocyte))。出于多种原因，红细胞是EV的良好来源。由于红细胞是无核的，所以与来自其它来源的EV相比，RBCEV含有更少核酸。RBCEV不含内源性DNA。RBCEV可含有miRNA或其它RNA。RBCEV不含致癌物质，如致癌DNA或DNA突变。由于红细胞缺乏细胞器(包括内体)，所以RBCEV不能来源于内体，并且因此不是外泌体。相反，RBCEV来源于红细胞的质膜的向外出芽。因此，RBCEV的膜具有与红细胞的膜非常相似的组成，如具有大约15k_BT的弯曲模量，如介于14与16k_BT之间、介于13与17k_BT之间、介于12与18k_BT之间，其与红细胞的膜研究中发现的弯曲模量相似。弯曲模量可使用囊泡刚度、半径和热力来评估，如Daan Vorselen等人,(2018)Nature Communications 9:4960所阐述。

一种用于分离和表征RBCEV的方法描述于Usman等人(Efficient RNA drugdelivery using red blood cell extracellular vesicles.Nature Communications 9,2359(2018)doi:10.1038/s41467-018-04791-8)中，所述文献以引用的方式整体并入本文。

RBCEV可包含血红蛋白和/或stomatin和/或浮舰蛋白(flotillin)-2。它们可以是红色的。通常，RBCEV在透射电子显微镜下呈现圆顶(凹)表面或“杯形”。RBCEV的特征可在于具有细胞表面CD235a。RBCEV可包含红细胞标志物，如血红蛋白α或stomatin。

根据本发明的RBCEV的直径可以是约100nm至约300nm。在一些情况下，RBCEV组合物包含直径在50-1000nm、50-750nm、50-500nm、50-300nm、50-200nm、50-150nm、101-1000nm、101-750nm、101-500nm、101-300nm、100-300nm、100-200nm或100-150nm范围内的RBCEV。优选地，直径是50-300nm、50-200nm、50-150nm、100-300nm、100-200nm或100-150nm。

例如如可存在于组合物中的RBCEV群体将包含具有不同直径范围的RBCEV，RBCEV样品中RBCEV的中值直径可在50-1000nm、50-750nm、50-500nm、50-300nm、50-200nm、50-150nm、101-1000nm、101-750nm、101-500nm、101-300nm、100-300nm、100-200nm或100-150nm的范围内。优选地，中值直径介于50-300nm、50-200nm、50-150nm、100-300nm、100-200nm或100-150nm之间。平均直径可以是50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm中的一种，任选地±1、2、3、4、5、6、7、8、9或10nm。

优选地，RBCEV来源于人或动物血液样品或来源于原代细胞或固定化红细胞系的红细胞。血细胞可与待治疗的患者类型匹配，并且因此血细胞可以是A型、B型、AB型、O型或Oh血型。优选地，血液是O型。血液可以是恒河猴阳性或恒河猴阴性。在一些情况下，血液是O型和/或恒河猴阴性，如O-型。血液可能已经被确定为没有疾病或病症，如没有HIV、镰状细胞贫血、疟疾。然而，可使用任何血型。在一些情况下，RBCEV是自体的，并且来源于从待治疗患者获得的血液样品。在一些情况下，RBCEV是同种异体的，并且并非来源于从待治疗患者获得的血液样品。

RBCEV可从红细胞样品中分离。用于从红细胞获得EV的方案在本领域中是已知的，例如在Danesh等人(2014)Blood.2014年1月30日；123(5):687–696中。可用于获得EV的方法可包括提供或获得包含红细胞的样品、诱导红细胞产生细胞外囊泡和分离所述细胞外囊泡的步骤。样品可以是全血样品。优选地，已经从样品中除去了除红细胞以外的细胞，使得样品的细胞组分是红细胞。

样品中的红细胞可浓缩或与全血样品的其它组分如白细胞分级分离。红细胞可通过离心浓缩。可对样品进行白细胞去除。

包含红细胞的样品可基本上仅包含红细胞。通过使红细胞与囊泡诱导剂接触，可从所述红细胞诱导胞外囊泡。囊泡诱导剂可以是钙离子载体、溶血磷脂酸(LPA)或佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)。

RBCEV可通过离心(用或不用超速离心)、沉淀、过滤过程如切向流过滤或尺寸排阻色谱法分离(例如参见Usman等人，同上)。以这种方式，RBCEV可与RBC和混合物的其它组分分离。

可通过包括以下的方法从红细胞获得细胞外囊泡：获得红细胞样品；使所述红细胞与囊泡诱导剂接触；以及分离所述经诱导的细胞外囊泡。

通过低速离心和使用白细胞耗减过滤器，可将红细胞从含有白细胞和血浆的全血样品中分离出来。在一些情况下，红细胞样品不包含其它细胞类型，如白细胞。换言之，红细胞样品基本上由红细胞组成。在与囊泡诱导剂接触之前，红细胞可在缓冲液如PBS中稀释。囊泡诱导剂可以是钙离子载体、溶血磷脂酸(LPA)或佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)。囊泡诱导剂可以是约10nM钙离子载体。可使红细胞与囊泡诱导剂接触过夜，或持续至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12或超过12小时。可对混合物进行低速离心以除去RBC、细胞碎片或其它非RBCEV物质和/或使上清液通过约0.45μm注射器过滤器。RBCEV可通过超速离心浓缩，如以约100,000x g离心。可通过超速离心至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少1小时来浓缩RBCEV。可将经浓缩的RBCEV悬浮于冷PBS中。可将它们层叠在60％蔗糖垫上。蔗糖垫可包含冷冻的60％蔗糖。可对层叠于蔗糖垫上的RBCEV以100,000g进行超速离心持续至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时或更长时间。优选地，可对层叠于蔗糖垫上的RBCEV以100,000g进行超速离心持续约16小时。然后收集蔗糖垫上方的红色层，从而获得RBCEV。可对所获得的RBCEV进行进一步加工，如洗涤、标记和任选地负载。

表面标记

组合物中的细胞外囊泡可包含标签，所述标签优选附接至或插入通过囊泡膜。

细胞外囊泡可在其表面具有标签。标签优选地是蛋白质或肽序列。标签可以是肽或蛋白质。它可以是经修饰的肽或蛋白质，如糖基化或生物素化的蛋白质或肽。标签可与细胞外囊泡共价连接，如与细胞外囊泡中的膜蛋白共价连接。标签可在细胞外囊泡形成后添加至细胞外囊泡中。标签可通过如下序列连接至细胞外囊泡，所述序列包含是或源自蛋白质连接酶识别序列的序列或由所述序列组成。例如，标签可通过如下序列连接至细胞外囊泡，所述序列包含与蛋白质连接酶识别序列的100％序列同一性或与蛋白质连接酶识别序列的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％或约40％序列同一性。氨基酸序列可包含LPXT。

标签可呈现在囊泡的外表面上，并且因此暴露于囊泡外环境。

标签可以是外源分子。换言之，标签是自然界中不存在于囊泡外表面上的分子。在一些情况下，标签是不存在于细胞外囊泡所来源的细胞或红细胞中的外源分子。

标签可增加细胞外囊泡的循环的稳定性、摄取效率和可用性。

在一些情况下，标签用于呈现细胞外囊泡和含有身体循环和器官中的货物的细胞外囊泡。肽和蛋白质可充当治疗性分子，如阻断/激活靶细胞功能或呈递用于疫苗接种的抗原。它们还可充当生物标志物检测如毒素诊断的探针。

标签可含有功能结构域和蛋白质连接酶识别序列。功能结构域可能能够结合至靶部分、能够检测或能够诱导治疗效果。功能结构域可能能够结合至靶分子。包含这种功能结构域的标签在本文中可被称为结合分子。结合分子是能够与靶分子特异性地相互作用的分子。包含结合部分的细胞外囊泡可特别用于将货物或治疗剂递送至具有靶分子的细胞。合适的结合分子包括抗体和抗原结合片段(有时称为抗体片段)、配体分子和受体分子。结合分子将结合至目标靶标。靶标可以是与目标细胞缔合的分子，如在目标细胞表面上表达的分子。配体可与靶细胞上的生物分子如受体分子形成复合物。

合适的结合分子包括抗体和抗原结合片段。可使用诸如Fab和Fab2片段的片段，也可使用遗传工程化的抗体和抗体片段。抗体的可变重(VH)和可变轻(VL)结构域参与抗原识别，这是早期蛋白酶消化实验首先认识到的事实。通过啮齿动物抗体的“人源化”发现了进一步的确认。啮齿动物来源的可变结构域可与人来源的恒定结构域融合，使得所得抗体保留啮齿动物亲本抗体的抗原特异性(Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sd.USA 81,6851-6855)。可用于本文公开的细胞外囊泡中的抗体或抗原结合片段将识别和/或结合至靶分子。

所述抗原特异性由可变结构域赋予并且不依赖于恒定结构域，这是从涉及抗体片段的细菌表达的实验中已知的，其中所有抗体片段都含有一个或多个可变结构域。这些分子包括Fab样分子(Better等人(1988)Science 240,1041)；Fv分子(Skerra等人(1988)Science 240,1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL配偶体结构域通过柔性寡肽连接(Bird等人(1988)Science 242,423；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sd.USA 85,5879)；和包含分离的V结构域的单结构域抗体(dAb)(Ward等人(1989)Nature 341,544)。涉及合成保留其特异性结合位点的抗体片段的技术的一般综述将在Winter和Milstein(1991)Nature349,293-299中找到。可用于本文的抗体和片段可以是人的或人源化的、鼠的、骆驼的、嵌合的或来自任何其它合适的来源。

“ScFv分子”是指其中VH和VL配偶体结构域例如通过肽或通过柔性寡肽直接共价连接的分子。Fab、Fv、scFv和sdAb抗体片段都可在大肠杆菌中表达并且从其分泌，因而允许大量所述片段的容易产生。

全抗体和F(ab')2片段是“二价的”。“二价”是指所述抗体和F(ab')2片段具有两个抗原结合位点。相比之下，Fab、Fv、ScFv和sdAb片段是单价的，只有一个抗原结合位点。单价抗体片段因其较小大小而特别用作标签。

优选的结合分子可以是sdAb。“sdAb”是指由一个、两个或更多个单一单体可变抗体结构域组成的单结构域抗体。sdAb分子有时被称为dAb。

在一些情况下，结合分子是单链抗体或scAb。scAb由共价连接的VH和VL配偶体结构域(例如通过肽或通过柔性寡肽直接共价连接)和任选的轻链恒定结构域组成。

其它合适的结合分子包括对靶分子具有亲和力的配体和受体。标签可以是细胞表面受体的配体。实例包括链霉亲和素和生物素、亲和素和生物素，或其它受体的配体，如纤连蛋白和整联蛋白。生物素的较小大小对结合分子的生物活性几乎没有影响。由于生物素和链霉亲和素、生物素和亲和素、以及纤连蛋白和整联蛋白以高亲和力和特异性结合它们的对，所以它们作为结合分子非常有用。亲和素-生物素复合物是蛋白质与配体之间已知的最强非共价相互作用(Kd＝10-15M)。键形成快速，并且一旦形成就不会受到pH、温度、有机溶剂和其它变性剂的极端条件影响。生物素与链霉亲和素的结合也较强，形成迅速并且可用于生物技术应用。

功能结构域可包含治疗剂或由治疗剂组成。治疗剂可以是酶。它可以是凋亡诱导剂或抑制剂。

功能结构域可包含抗原或抗体识别序列。标签可包含源自一种或多种抗原肽的一种或多种短肽。肽可以是抗原肽的片段。合适的抗原肽是本领域技术人员已知的。

功能结构域可包含可检测部分或由可检测部分组成。可检测部分包括荧光标记、比色标记、光致变色化合物、磁性颗粒或其它化学标记。可检测部分可以是生物素或His标签。

标签可包含间隔区或接头部分。间隔区或接头可排列在标签与蛋白质连接酶识别序列之间。间隔区或接头可连接至标签的N端或C端。间隔区或接头可排列成不干扰或阻碍标签的功能，如标签的靶结合活性。间隔区或接头可以是肽序列。在一些情况下，间隔区或接头是一系列至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸、至少11个氨基酸、至少12个氨基酸、至少13个氨基酸、至少14个氨基酸或至少15个氨基酸。间隔区或接头可以是柔性的。间隔区可包含多个甘氨酸和/或丝氨酸氨基酸。

间隔区和接头序列是熟练的技术人员已知的，并且描述于例如Chen等人,AdvDrug Deliv Rev(2013)65(10):1357-1369中，所述文献特此以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，接头序列可以是柔性接头序列。柔性接头序列允许通过接头序列连接的氨基酸序列的相对移动。柔性接头是熟练的技术人员已知的，并且在Chen等人,Adv DrugDeliv Rev(2013)65(10):1357-1369中鉴定了若干。柔性接头序列通常包含高比例的甘氨酸和/或丝氨酸残基。

在一些情况下，间隔区或接头序列包含至少一个甘氨酸残基和/或至少一个丝氨酸残基。在一些实施方案中，接头序列由甘氨酸残基和丝氨酸残基组成。在一些情况下，间隔区或接头序列具有1-2、1-3、1-4、1-5或1-10个氨基酸的长度。

包含间隔区或接头可提高细胞外囊泡与标签部分之间的蛋白质连接酶反应的效率。如本文所用的术语“标签”可涵盖包含标签、间隔区和蛋白质连接酶识别序列的肽。

合适的蛋白质连接酶识别序列是本领域已知的。蛋白质连接酶识别序列由用于标记细胞外囊泡的方法中使用的蛋白质连接酶识别。例如，如果方法中使用的蛋白质连接酶是分选酶，那么蛋白质连接酶识别序列就是分选酶结合位点。在那些情况下，序列可以是LPXTG(其中X是任何天然存在的氨基酸)，优选LPETG。可替代地，在酶是AEP1的情况下，蛋白质连接酶识别序列可以是NGL。蛋白质连接酶结合位点可排列在肽或蛋白质的C端。

标签可另外包含一个或多个另外的序列以在标签本身的产生期间、在标记方法期间或对于随后纯化帮助标签的纯化或加工。可使用本领域已知的任何合适的序列。例如，所述序列可以是HA标签、FLAG标签、Myc标签、His标签(如poly His标签或6xHis标签)。

标签可与群体或组合物中的基本上所有的细胞外囊泡连接。本文公开的组合物可包含细胞外囊泡，其中至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％或至少97％的细胞外囊泡包含标签。优选地，至少85％、至少90％、至少95％、至少96％或至少97％的细胞外囊泡包含标签。在一些情况下，组合物中的不同细胞外囊泡包含不同的标签。在一些情况下，细胞外囊泡包含相同或基本上相同的标签。

用于并入标签的方法在PCT/SG2019/050481、WO 2014/183071 A2、WO 2014/83066A2和US 2014/0030697 A1中进行了描述，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。

货物

本文公开的细胞外囊泡可负载有或含有货物。本公开特别涉及核酸货物，所述核酸货物包含DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)或经化学修饰的DNA或RNA或由其组成。在优选的实施方案中，货物包含DNA或经化学修饰的DNA或由其组成。术语“货物”在本文中与“负载”可互换使用。

核酸货物是指负载到细胞外囊泡中或细胞外囊泡上的核酸(例如寡核苷酸或多核苷酸)。核酸货物通常是指寡核苷酸链(其可呈任何形式，例如单链、双链、超螺旋或非超螺旋、染色体或非染色体)。DNA可与其它分子(例如载剂、稳定剂、组蛋白、亲脂剂)缀合或复合。

本文公开的方法可用于任何核酸货物，但特别有利于负载大核酸，并且特别是用于负载DNA货物。核酸可以是双链的或单链的。优选地，核酸是双链的。核酸可以是环状的。

货物优选地是外源的。换言之，核酸在新产生时不存在于细胞外囊泡中，和/或不存在于细胞外囊泡所来源的细胞中。货物可以是合成的，已经在体外或计算机设计和/或构造。

货物可以是治疗性寡核苷酸或诊断性寡核苷酸。核酸可编码目标基因。例如，货物可编码功能性基因以替代缺失基因、修复缺陷型基因或在靶组织中诱导治疗效果。在一些情况下，货物是报告基因或编码易于检测的分子。

货物可包含表达载体或表达盒序列。合适的表达载体和表达盒是本领域已知的。可用于本文所述的方法中的表达载体包含促进一个或多个核酸序列在靶细胞中表达的元件。可用于本公开中的表达载体可包含转基因或其它DNA序列。

表达载体是指用作将外来遗传物质转移至细胞中以在所述细胞中/由所述细胞表达的媒介物的寡核苷酸分子(例如DNA或RNA)。此类载体可包括与编码待表达的基因序列的核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。载体还可包含终止密码子和表达增强子。可使用本领域已知的任何合适的启动子、增强子和终止密码子。

在本说明书中，术语“可操作地连接”可包括其中选定核苷酸序列和调控核苷酸序列(例如启动子和/或增强子)以使得核苷酸序列的表达处于调控序列的影响或控制下的这样的方式共价连接(从而形成表达盒)的情况。因此，如果调控序列能够影响选定核苷酸序列的转录，则所述调控序列与所选核苷酸序列可操作地连接。在适当的情况下，然后可将所得转录物翻译成所需的蛋白质、肽或多肽。所需的蛋白质、肽和多肽包括全长抗体和抗体片段、激素、细胞因子、酶、肽抗生素、蛋白质前药、标记蛋白、膜蛋白、转运蛋白、受体蛋白、生长因子、组蛋白、伴侣蛋白、结构蛋白、转录因子、信号传导蛋白、核酸结合蛋白、脂质结合蛋白、膜融合蛋白、细胞粘附蛋白和凝血因子。

环状货物分子的实例包括微环和质粒。

核酸货物可以是微环。微环是小的(大约4kbp)环形复制子。微环通常包含DNA，通常是双链的。尽管微环天然存在于一些真核细胞器基因组中，但本文优选的微环是合成来源的。在一些情况下，微环不包含复制起点，并且因此不在细胞内复制。本文公开的微环可以是约1.5kbp、约2kbp、约2.5kbp、约3kbp、约3.5kbp、约4kbp、约4.5kbp、约5kbp、约5.5kbp、约6kbp、约6.5kbp或约7kbp。微环是本领域普通技术人员已知的，例如参见Gaspar等人,Minicircle DNA vectors for gene therapy:advances and applications.Expert OpinBiol Ther2015年3月；15(3):353-79.doi:10.1517/14712598.2015.996544.Epub2014年12月24日。

在一些情况下，核酸货物是质粒。质粒通常能够在细胞中独立复制。质粒通常包含DNA，通常是双链的，并且可在约1kbp至几兆碱基对(Mbp)的大小范围内。质粒可包含复制起点序列。

在一些情况下，核酸是DNA哑铃(Dumbbell)。DNA哑铃是包含线性双链DNA表达盒的最小载体，所述表达盒在两端以单链环结构共价闭合。DNA哑铃可通过由核酸酶辅助的酶促连接(ELAN)合成，包括同时分子间连接和对错误连接的途径外产物的消化。可替代地，DNA哑铃可以两步法合成，其中首先使用经化学修饰的引物通过PCR扩增表达盒以形成易于连接的DNA结构，随后进行高效分子内连接反应(例如Yu等人,Nucleic Acids Res.2015年10月15日；43(18):e120.)。

在一些情况下，货物是核酸，所述核酸是或编码siRNA或反义寡核苷酸(ASO)。这种货物在基因沉默的方法中可能是有用的。siRNA或ASO可对应于在靶细胞中表达的序列。它可用于抑制或增强特定目标基因或蛋白质的表达。核酸可编码对应于在靶细胞中表达的miRNA的siRNA或ASO。

货物可包含或编码mRNA。mRNA可编码转基因。

在一些情况下，核酸未经修饰以含有结合至囊泡表面上的蛋白质的序列。例如，货物核酸不含反式激活应答(TAR)元件。在一些情况下，细胞外囊泡未经修饰以含有经修饰的表面蛋白，如外源ARRDC1蛋白或源自ARRDC1蛋白的序列。

在一些情况下，核酸货物包含一个或多个经修饰的核苷酸或其它修饰。化学修饰可包括在核酸的糖位置、磷酸位置和/或碱基位置的化学取代，包括例如经修饰核苷酸的并入、加帽部分(例如3'加帽)的并入、与高分子量非免疫原性化合物(例如聚乙二醇(PEG))缀合、与亲脂性化合物缀合、在磷酸主链中的取代。例如，核酸可包含一种或多种2'-位糖修饰，如2'-氨基(2'-NH)、2'-氟(2'-F)和2'-O-甲基(2'-OMe)。碱基修饰可包括5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿苷取代、5-溴-或5-碘-尿嘧啶取代、主链修饰、甲基化、不寻常的碱基配对组合如异碱基异胞苷和异胍。修饰还可包括3'和5'修饰，如加帽。其它修饰可包括，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如像，具有不带电荷的键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酸酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯(carbamate)等)和具有带电荷的键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些、含有烷化剂(alkylator)的那些以及具有经修饰的键联(例如，α端基异构核酸等)的那些。此外，任何通常存在于糖上的任何羟基均可被膦酸酯基团或磷酸酯基团替代；受标准保护基团保护；或被激活以制备与另外核苷酸或与固体载体的另外键联。5'和3'端OH基团可被磷酸化或被胺、约1至约20个碳原子的有机加帽基团部分或约1至约20个聚乙二醇(PEG)聚合物或其它亲水性或疏水性生物或合成聚合物取代。核酸可具有变体类型，如锁核酸(LNA)或缺口聚物(gapmer)。

根据本公开的细胞外囊泡可包含(例如负载有)至少0.1个核酸分子/囊泡。细胞外囊泡可包含(例如负载有)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0个或更多个核酸拷贝中的一种/囊泡。细胞外囊泡可包含(例如负载有)至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0个核酸拷贝中的一种/囊泡。细胞外囊泡可包含(例如负载有)至少0.5、至少1、至少2、至少3、至少3.5、至少4、至少5或更多个拷贝/囊泡。细胞外囊泡可包含(例如负载有)约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个核酸拷贝/囊泡。细胞外囊泡可包含(例如负载有)0.1-1.0、0.1-2.0、0.1-3.0、0.1-4.0、0.1-5.0、0.1-6.0、0.1-7.0、0.1-8.0、0.1-9.0、0.1-10、0.1-15.0、0.1-20.0、0.1-25.0、0.1-30.0、0.1-35.0、0.1-40.0、0.1-45.0、0.1-50、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-25、2-30、2-35、2-40、2-45、2-50、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-25、3-30、3-35、3-40、3-45、3-50、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-15、4-20、4-25、4-30、4-35、4-40、4-45、4-50、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、6-7、6-8、6-9、6-10、6-15、6-20、6-25、6-30、6-35、6-40、6-45、6-50、7-8、7-9、7-10、7-15、7-20、7-25、7-30、7-35、7-40、7-45、7-50、8-9、8-10、8-15、8-20、8-25、8-30、8-35、8-40、8-45、8-50、9-10、9-15、9-20、9-25、9-30、9-35、9-40、9-45、9-50、10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-45、15-50、20-25、20-30、20-35、20-40、20-45、20-50、25-30、25-35、25-40、25-45、25-50、30-35、30-40、30-45、30-50、35-40、35-45、35-50、40-45、40-50或45-50个核酸拷贝/囊泡。

每个囊泡的核酸数量可以是例如如存在于组合物中的整个EV群体的平均数量，优选平均值。每个囊泡的核酸拷贝数可通过将经负载的核酸货物的拷贝总数除以EV的总数来确定。换句话说，每个EV的拷贝数＝经负载的核酸拷贝数/EV颗粒的总数。核酸的拷贝数可通过qPCR来确定。EV的数量可通过纳米颗粒追踪分析(NPA，例如，如Wang等人,ASMMs as aversatile platform for intracellular delivery of macromolecules.NatureCommunications 2018 9-960中所描述)来确定。纳米颗粒追踪分析(NTA)是用于可视化和分析液体中的颗粒的方法。所述技术与超显微镜和激光照明单元结合使用，它们共同允许液体悬浮液中的小颗粒在布朗运动下的可视化移动。使用CCD或EMCCD相机在多个帧上捕获由颗粒散射的光。然后使用计算机软件来从帧到帧追踪每个颗粒的运动。

如本文所用且除非另外指明，否则术语“平均值”是指数学平均值。这可指样品中测定的核酸总量除以所述样品中的囊泡总数。

尽管可能希望将货物负载到组合物中基本上所有的细胞外囊泡中，但本文公开的组合物可包含细胞外囊泡，其中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％中的一种的细胞外囊泡含有货物。优选地，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％中的至少一种的细胞外囊泡含有货物。在一些情况下，组合物中的不同细胞外囊泡含有不同的货物。在一些情况下，细胞外囊泡含有相同或基本上相同的货物分子。

核酸货物的大小可根据其以碱基(对于单链核酸)或碱基对(对于双链核酸)为单位的长度来定义。在本说明书中，在未指明核酸货物的单链或双链性质的情况下，以碱基(例如以kb(千碱基))给出的长度也是以碱基对(例如以kbp)给出的相同长度的公开。因此，1kb(1000个碱基)的长度也是1kbp(1000个碱基对)的公开。

在核酸货物为单链的情况下，它可具有至少250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750或11000个碱基中的一种的长度。任选地，在核酸货物为单链DNA(ssDNA)的情况下，它可具有4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750或11000个碱基中的一种的最大长度。在优选的实施方案中，单链核酸货物可具有2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000或多于5000个碱基中的一种的最小长度。

在核酸货物为单链的一些实施方案中，它可具有高达2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000或40000个碱基中的一种的长度。单链核酸货物可具有5000-10000、5000-15000、5000-20000、5000-25000、5000-30000、5000-35000、5000-40000、10000-15000、10000-20000、10000-25000、10000-30000、10000-35000、10000-40000、15000-20000、15000-25000、15000-30000、15000-35000、15000-40000、20000-25000、20000-30000、20000-35000、20000-40000、25000-30000、25000-35000、25000-40000、30000-35000、30000-40000或35000-40000个碱基中的一种的长度。

在核酸货物为双链的情况下，它可具有至少250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750或11000个碱基对中的一种的长度。任选地，在核酸货物为双链的情况下，它可具有4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750、8000、8250、8500、8750、9000、9250、9500、9750、10000、10250、10500、10750或11000个碱基对中的一种的最大长度。在优选的实施方案中，双链核酸货物可具有2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000或多于5000个碱基对中的一种的最小长度。

在核酸货物为双链的情况下，它可具有250-750、500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000、7000-8000、8000-9000、9000-10000、10000-11000、250-1000、1000-3000、1000-4000、1000-5000、1000-6000、1000-7000、1000-8000、1000-9000、1000-10000、1000-11000、2000-4000、2000-5000、2000-6000、2000-7000、2000-8000、2000-9000、2000-10000、2000-11000、3000-5000、3000-6000、3000-7000、3000-8000、3000-9000、3000-10000、3000-11000、4000-6000、4000-7000、4000-8000、4000-9000、4000-10000、4000-11000、5000-7000、5000-8000、5000-9000、5000-10000、5000-11000、6000-8000、6000-9000、6000-10000、6000-11000、7000-9000、7000-10000或7000-11000个碱基对中的一种的长度。

每个核酸货物可以是介于约0.5kb与约4kb之间、介于约0.5kb与约3kb之间、介于约0.5kb与约2.5kb之间、介于约1kb与约3kb之间、介于约1.5kb与约2.5kb之间或约2kb。每个核酸货物可以是至少0.5kb、至少1.0kb、至少1.5kb、至少2.0kb、至少2.5kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb、至少13kb、至少14kb、至少15kb、至少16kb、至少17kb、至少18kb、至少19kb、至少20kb、至少21kb、至少22kb、至少23kb、至少24kb、至少25kb、至少26kb、至少27kb、至少28kb、至少29kb、至少30kb、至少31kb、至少32kb、至少33kb、至少34kb、至少35kb、至少36kb、至少37kb、至少38kb、至少39kb、至少40kb、至少41kb、至少42kb、至少43kb、至少44kb、至少45kb、至少46kb、至少47kb、至少48kb、至少49kb、至少50kb或更多。在一些优选的实施方案中，每个核酸货物是至少2kb。

在一些情况下，总核酸货物可以是介于约0.5kb与约4kb之间、介于约0.5kb与约3kb之间、介于约0.5kb与约2.5kb之间、介于约1kb与约3kb之间、介于约1.5kb与约2.5kb之间或约2kb。每个核酸货物可以是至少0.5kb、至少1.0kb、至少1.5kb、至少2.0kb、至少2.5kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb或更多。换言之，货物包含多个核酸，并且每个囊泡中这些核酸的组合长度是平均介于约0.5kb与约4kb之间、介于约0.5kb与约3kb之间、介于约0.5kb与约2.5kb之间、介于约1kb与约3kb之间、介于约1.5kb与约2.5kb之间或约2kb。每个核酸货物可以是至少0.5kb、至少1.0kb、至少1.5kb、至少2.0kb、至少2.5kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb、至少13kb、至少14kb、至少15kb、至少16kb、至少17kb、至少18kb、至少19kb、至少20kb、至少21kb、至少22kb、至少23kb、至少24kb、至少25kb、至少26kb、至少27kb、至少28kb、至少29kb、至少30kb、至少31kb、至少32kb、至少33kb、至少34kb、至少35kb、至少36kb、至少37kb、至少38kb、至少39kb、至少40kb、至少41kb、至少42kb、至少43kb、至少44kb、至少45kb、至少46kb、至少47kb、至少48kb、至少49kb、至少50kb或更多。

在一些情况下，核酸货物是同质的(即，EV组合物中的每个核酸是相似或基本上相同的)。在一些情况下，核酸货物是异质的(即，EV组合物中的核酸彼此不相似或基本上相同)。

在本说明书中，细胞外囊泡负载货物是指将细胞外囊泡和货物以稳定或半稳定的形式缔合，使得细胞外囊泡可用作货物的载剂，例如允许其递送至细胞。可以至少两种方式负载货物分子。一种是货物存在于细胞外囊泡的内腔中(内腔负载)。另一种是将货物附接至、粘附至、插入通过细胞外囊泡的外表面(例如膜)或与所述外表面复合(外表面负载)。负载到细胞外囊泡的外表面上的货物分子通常可通过使所述囊泡与核酸酶(例如DNA酶或RNA酶)接触而除去。

本发明人已经表明，细胞外囊泡可通过内腔和外表面负载的组合来负载，并且此类细胞外囊泡可在体外和体内有效地将货物核酸递送至靶细胞。

任选地，在一些实施方案中，对负载的提及可以仅是内腔负载。任选地，在一些其它实施方案中，对负载的提及可以仅是外表面负载。

如本文所述，将核酸负载到细胞外囊泡中可在体内或体外赋予对核酸降解的抗性。例如，与未负载至细胞外囊泡中的核酸相比，负载核酸的细胞外囊泡可具有增加的对血清降解的抗性。例如，负载核酸的细胞外囊泡可抵抗血清降解，并且因此保留核酸、优选功能性核酸与血清接触持续至少30分钟、至少一小时、至少两小时、至少三小时、至少四小时、至少五小时或超过五小时。优选地，在负载核酸的细胞外囊泡与血清接触两小时后仍可检测到核酸。

负载细胞外囊泡的方法

本文公开了一种负载细胞外囊泡的方法。所述方法使用化学转导，其中使细胞外囊泡、核酸和转染试剂在合适的条件下聚集在一起并保持足够的时间以允许发生负载。

优选地，所述方法不涉及电穿孔。优选地，所述方法不涉及纳米穿孔。

本文公开的方法涉及使待负载的核酸与转染试剂接触的步骤。合适的转染试剂包括阳离子试剂，如阳离子脂质试剂。本领域已知几种转染试剂，包括Lipofectamine^TM3000^TM(ThermoFisher)、Turbofect^TM(ThermoFisher)、Lipofectamine^TM MessengerMAX^TM(ThermoFisher)、Exofect^TM(System Biosciences)和例如平均分子量为25,000Da或40,000Da的线性聚乙烯亚胺盐酸盐，如PEIMax^TM(Polysciences,Inc.)和

(Polyplustransfection)。

本文公开的一些方法涉及制备待负载的核酸的步骤。在制备步骤中，使待负载至细胞外囊泡中的核酸在适合于在转染试剂和核酸之间形成复合物的条件下与转染试剂接触。使核酸和转染试剂接触足够的时间以发生复合物形成。优选地，核酸和转染试剂形成复合物，如DNA:PEIMax复合物。用于负载的核酸的制备可包括另外的步骤，如核酸的浓缩或稀释、或添加缓冲剂或其它试剂或培养基，如Opti-MEM减少的血清培养基(Gibco)。可使核酸和转染试剂接触至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟、至少10分钟、至少11分钟、至少12分钟、至少13分钟、至少14分钟、至少15分钟、至少16分钟、至少17分钟、至少18分钟、至少19分钟、至少20分钟或超过20分钟。

本文公开的方法可涉及使细胞外囊泡负载核酸:转染试剂复合物的步骤。使所制备的核酸:转染试剂复合物与待负载的细胞外囊泡接触。在优选的方法中，将细胞外囊泡添加至所制备的核酸:转染试剂复合物。换言之，与细胞外囊泡接触是在待负载的核酸货物与转染试剂接触之后进行。通常，使核酸:转染试剂复合物与包含多个细胞外囊泡的组合物接触。可将核酸:转染试剂复合物和细胞外囊泡在适当的条件下孵育足够的时间，以允许细胞外囊泡负载一种或多种核酸:转染试剂复合物。所述复合物可被内化到细胞外囊泡中，或者以其它方式负载到细胞外囊泡上，如负载到细胞外囊泡的表面上。优选地，所述复合物被内化到细胞外囊泡中。

在负载步骤之后，可分离、洗涤和/或浓缩细胞外囊泡。在优选的方法中，洗涤步骤在负载步骤之后。在负载步骤之后，可用PBS洗涤混合物。优选地，洗涤包括将混合物离心以沉淀细胞外囊泡，将沉淀重悬于合适的缓冲液(如PBS)中。洗涤步骤可重复1、2、3、4、5、6次或更多次。

可重复使细胞外囊泡负载核酸:转染试剂复合物的步骤。换言之，在使细胞外囊泡负载核酸:转染试剂复合物的步骤之后，可任选地洗涤细胞外囊泡并与另外的核酸:转染试剂复合物接触。在此类方法中，待负载核酸:转染试剂复合物的细胞外囊泡可以是经负载的细胞外囊泡，并且因此可能已经含有核酸货物。可替代地，细胞外囊泡可能已经经历了负载步骤，但尚未负载货物，或者已经负载了低水平的货物。在需要第二或另外的负载步骤的情况下，可将细胞外囊泡与另外的核酸:转染试剂复合物在相同或不同条件下孵育相同或不同时间，如在前面负载步骤中使用的。在第二或另外的负载步骤之后，可使用另外的洗涤步骤。

优选地，所述方法涉及将细胞外囊泡与核酸:转染试剂复合物一起孵育，并且不涉及将细胞与核酸:转染试剂复合物一起孵育和随后诱导由此类细胞形成细胞外囊泡。

在一些方面，将货物负载至细胞外囊泡。在一些方面，将货物负载至细胞外囊泡的内腔中。在一些方面，将货物负载到细胞外囊泡上，如负载到囊泡的膜上，或负载到囊泡的膜的蛋白质上。在一些方面，将一些货物负载到细胞外囊泡的内腔中并且将一些货物负载到细胞外囊泡上，如负载到囊泡的膜上，或负载到囊泡的膜的蛋白质上。

所述方法可涉及除去不包含在细胞外囊泡的内腔内的核酸货物的步骤。这样的步骤可包括使经负载的细胞外囊泡与DNA酶接触。可使经负载的细胞外囊泡在与DNA酶接触之前与肝素接触，以解离核酸或核酸:转染试剂复合物。

组合物

本文公开了包含细胞外囊泡的组合物。组合物可包含多个细胞外囊泡，从而形成细胞外囊泡群体。组合物的实例包括药物组合物和药物。

所述组合物可包含介于10⁶至10¹⁴个之间的颗粒/ml。所述组合物可包含至少10⁵个颗粒/ml、至少10⁶个颗粒/ml、至少10⁷个颗粒/ml、至少10⁸个颗粒/ml、至少10⁹个颗粒/ml、至少10¹⁰个颗粒/ml、至少10¹¹个颗粒/ml、至少10¹²个颗粒/ml、至少10¹³个颗粒/ml、或至少10¹⁴个颗粒/ml。

将预期组合物中的细胞外囊泡群体具有一系列尺寸特征，如直径。群体可表现出大小分布，具有可能不同的中值和平均大小。上文描述了此类特性。

群体中的每个囊泡不太可能含有相同数量的货物。因此，可根据每个囊泡的平均货物分子数量来描述细胞外囊泡群体，如上所述。

组合物可以是药物组合物。组合物可包含一个或多个细胞外囊泡，以及任选的药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。药物组合物可被配制用于通过特定的施用途径施用。例如，药物组合物可被配制用于静脉内、肿瘤内、腹膜内、皮内、皮下、鼻内或其它施用途径。

组合物可包含缓冲溶液。组合物可包含防腐剂化合物。组合物可包含药学上可接受的载剂。

本发明的含有核酸的组合物可在无菌生理上可接受的载剂中储存和施用，其中核酸与任何有助于将DNA引入细胞中的剂一起分散。

多种无菌溶液可用于组合物的施用，包括水、PBS、乙醇、脂质等。DNA的浓度将足以提供治疗剂量，这将取决于转运到细胞中的效率。

组合物可以冷冻或冻干形式提供。

治疗方法和细胞外囊泡的用途

如本文所述的细胞外囊泡和包含细胞外囊泡的组合物可用于疗法中，例如用于治疗、预防和/或改善疾病或病症。特别地，所述疗法可以是基因治疗或基因沉默的方法。

优选以“治疗有效量”施用，这足以显示对个体的益处。实际施用量以及施用速率和时程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方(例如关于剂量等的决定)在全科医生和其它医师的职责内，并且典型地要考虑待治疗的病症、个体患者的状况、递送的部位、施用方法以及执业医生已知的其它因素。上文提及的技术和方案的实例可在Remington’s Pharmaceutical Sciences,第20版,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins中找到。

待治疗的受试者可以是任何动物或人。优选地，受试者是哺乳动物，更优选是人。受试者可以是非人哺乳动物，但更优选是人。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是患者。治疗用途可用于人或动物(兽医用途)。

本文公开的细胞外囊泡可用于治疗方法中。特别地，所述方法可用于治疗患有与靶基因相关的疾病或病症的受试者。靶基因可能在受试者中异常表达。与健康受试者相比，靶基因可能在受试者中上调或过表达。与健康受试者相比，靶基因可能在受试者中下调、表达不足或不表达。靶基因的功能缺陷形式可在受试者中表达，例如突变形式(与功能性野生型相比)。所述方法可包括向所述受试者施用有效量的经负载的细胞外囊泡的步骤，其中所述经负载的细胞外囊泡包含治疗性核酸货物，如用于增加、降低或调节靶基因在靶细胞中的表达的核酸。

本文公开的细胞外囊泡特别可用于治疗如由靶基因表达的上调、过表达、下调、表达不足或缺乏(例如与健康受试者相比)或与健康受试者相比在受试者中靶基因的功能缺陷型拷贝或型式的表达引起的具有遗传基础的疾病或病症(遗传病症)。

RBCEV可能对治疗CNS、肺、肝脏、脾脏或骨髓的病症特别有用。在一些情况下，RBCEV可能有助于治疗胰腺或心脏的病症。靶细胞/组织取决于待治疗的病症。

货物可以是被设计用于抑制或增强靶基因的表达的核酸，或者可被设计用于进行基因编辑以沉默特定基因的表达或校正特定基因的序列。货物可以是编码在靶细胞中表达不足或不正确表达的肽、多肽或蛋白质的核酸。例如，核酸可编码不表达、表达不足或不正确表达的功能性肽、多肽或蛋白质，从而修复或补偿靶细胞中不正确的蛋白质功能。

本文所述的经负载的EV的施用可导致由核酸货物编码的蛋白质、肽或多肽在患者中的表达。例如，患者中DNA和/或转基因的表达。本文所述的经负载的EV的施用可导致蛋白质、肽或多肽在患者靶细胞中的表达。本文所述的经负载的EV的施用可导致蛋白质、肽或多肽在患者的CNS、肺、肝脏、脾脏、骨髓、胰腺的细胞或心脏细胞中的表达。

本文所述的细胞外囊泡和组合物可通过多种途径施用或被配制用于通过多种途径施用施用，包括但不限于全身、肿瘤内、腹膜内、肠胃外、静脉内、动脉内、皮内、皮下、肌内、玻璃体内、视网膜下、经口和经鼻。药物和组合物可被配制成流体或固体形式。流体制剂可被配制用于通过注射施用至人体或动物体的选定区域。

细胞外囊泡可包含结合至待处理的细胞或组织的表面上的分子的标签。标签可特异性地结合至待处理的细胞或组织。细胞外囊泡可包含治疗性货物。治疗性货物可以是用于与靶细胞中的靶基因相互作用的非内源性物质。

细胞外囊泡可单独或与其它治疗组合施用(同时或依序地，取决于待治疗的疾患)。

如本文所述负载有货物的细胞外囊泡可用于将所述货物递送至靶细胞。在一些情况下，所述方法是体外或离体方法。在其它情况下，所述方法是体内方法。术语“体外”旨在涵盖在实验室条件或培养中对材料、生物物质、细胞和/或组织进行的实验，而术语“体内”旨在涵盖用完整多细胞生物体进行的实验和程序。“离体”是指存在或发生在生物体之外的事物，例如在人或动物体之外，其可在取自生物体的组织(例如整个器官)或细胞上。

药盒

本文还公开了包含细胞外囊泡的药盒。所述药盒可包括选自一个或多个细胞外囊泡、核酸(诸如表达载体、DNA微环、质粒或RNA)以及转染试剂(诸如PEIMax)的一种或多种组分。所述药盒还可包括适用于本文所述的方法中的说明书和/或缓冲剂和/或试剂。

*****

在前述描述中或在以下权利要求书中或在附图中公开的以它们的具体形式或根据用于执行所公开功能的手段、或用于获得所公开结果的方法或工艺(在适当情况下)来表述的特征可单独地或以此类特征的任何组合用于以它们的各种形式实现本发明。

虽然已结合上述示例性实施方案描述了本发明，但是当给出本公开时，许多等效的修改和变型对于本领域的技术人员将显而易见。因此，以上列出的本发明的示例性实施方案被认为是说明性的而不是限制性的。在不背离本发明的精神和范围的情况下，可对所描述实施方案进行各种改变。

为避免任何疑问，本文提供的任何理论解释都是为了提高读者的理解而提供。本发明人不希望受任何这些理论解释的束缚。

本文所用的任何章节标题仅出于组构目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。

在整个本说明书，包括下面的权利要求书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”和“包括(include)”以及诸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”和“包括(including)”的变型应理解为包含规定的整数或步骤或整数或步骤的组但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。

必须指出的是，除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一种/个(a)”、“一种/个(an)”和“所述(the)”包括多种/个指示物。范围可在本文中表示为自“约”一个特定值起和/或至“约”另一个特定值止。当表示这样的范围时，另一实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，在通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解具体值形成另一个实施方案。相对于数值的术语“约”是任选的并且是指例如+/-10％。

实施例

实施例1

描述了一种用于通过细胞外囊泡如红细胞细胞外囊泡(RBCEV)体外和体内有效递送DNA和其它核酸的方法。发现，尽管与编码GFP的mRNA相比，编码GFP的DNA微环(MC)的大小和分子量要大得多，但与GFP mRNA相比，可以更高的效率负载到RBCEV中并更有效地递送至细胞。此外，发现DNA递送是RBCEV的独特特征，并且在尝试使用外泌体时效率非常低。

虽然不受理论约束，但假设这种负载大的DNA货物的能力可归因于RBCEV的独特膜特性。据报告，RBCEV表现的弯曲模量接近高柔性RBC膜(Vorselen等人,NatureCommunications 9,4960(2018))。在另一方面，由于膜上富含胆固醇、神经节苷脂和鞘磷脂的高浓度脂筏，因此外泌体是高度刚性的囊泡(He等人,Theranostics.,ExosomeTheranostics:Biology and Translational Medicine.2018；8(1):237–255)。这一证据表明RBCEV与外泌体膜之间可能存在结构差异，这可能解释了它们负载DNA货物的不同能力。还表明，全身注射负载DNA的RBCEV的大丸剂导致小鼠中的长期基因表达，从而证明RBCEV/DNA组合物可作为新型非病毒基因治疗实体，并且可能绕过与当今最先进基因治疗载体如AAV相关的限制。

如下文所述，观察到负载有微环DNA(MC)的RBCEV转染的细胞比负载mRNA的RBCEV多。这种效果与使用的负载方法无关，当使用电穿孔或化学转染作为负载方法时，MC转染比mRNA更有效。数据表明，DNA微环可以比mRNA更高的效率负载，并且更有效地递送至靶细胞。

还观察到，使用化学转染负载的RBCEV在转导细胞方面比使用电穿孔负载的RBCEV更有效。无论核酸是mRNA还是DNA微环，情况都是如此。这些数据表明，我们的化学转染方法产生的货物水平高于电穿孔。令人感兴趣地，通过使RBCEV两次负载货物，细胞的转染效率远高于仅负载一次的RBCEV。

令人感兴趣地，尽管有很多关于使用外泌体来将核酸、并且特别是siRNA递送至靶细胞的文献，但数据表明，负载MC的RBCEV转染的细胞比负载MC的外泌体更多。这些数据支持RBCEV作为核酸递送媒介物的临床应用，因为RBCEV可从供体血液中大量纯化，可容易地负载大量的大尺寸核酸(DNA表达载体和mRNA)，以前认为一般而言EV是不可能的并且是非免疫原性的。

方法

材料和试剂

GFP mRNA购自TriLink Biotechnologies，并且使用MC-Easy试剂盒(SystemBiosciences)产生GFP和荧光素酶微环DNA(MC)。人骨髓来源的间充质干细胞外泌体(MSC-exo)购自System Biosciences(SBI)。293T细胞购自ATCC，并在37℃CO₂孵育箱中在含有10％胎牛血清的杜尔贝科氏改良的伊格尔氏培养基中培养。

从人RBC和MSC中纯化和定量EV

全血样品是通过Innovative Research,Inc从获得知情同意的健康供体获得的。通过使用离心和白细胞耗减过滤器(Terumo Japan)将RBC与血浆和白细胞分离。将分离的RBC在PBS中稀释，并用10mM钙离子载体(Sigma-Aldrich)处理过夜。为了纯化EV，通过在4℃下以600g离心20分钟、1600g离心15分钟、3700g离心15分钟和10,000g离心30分钟来除去RBC和细胞碎片。使上清液通过0.45μm过滤器。用4渗滤体积的PBS洗涤EV，并通过切向流过滤(Pall Minimate)浓缩，然后使用100kD MWCO Amicon超离心装置(Merck Millipore)进一步浓缩。将纯化的RBCEV储存在-80℃。通过使用血红蛋白测定试剂盒(Abcam)评估其血红蛋白含量来定量EV。

RBCEV的核酸负载

使用GenePulser Xcell电穿孔器(BioRad)进行RBCEV的电穿孔，指数程序以150μF的固定电容与0.4cm比色皿进行。将75μg RBCEV在含有4％海藻糖的OptiMEM(ThermoFisherScientific)中稀释，并与1.5μg的GFP MC或GFP mRNA混合至总体积200μl。将100μl EV混合物的等分试样添加至每个比色皿中，并在冰上孵育10分钟。电穿孔在400V下进行。

在一些实验中，将1μg的mRNA或DNA添加至Opti-MEM(ThermoFisher)中的5-7μl基于化学的转染试剂(PEI Max(Polysciences,Inc.)，一种线性聚乙烯亚胺盐酸盐(MW 40,000))中，并在室温下孵育10分钟以促进复合物形成。将混合物添加至50μg洗涤的RBCEV中并轻轻混合。将反应物在37℃下旋转孵育30分钟，然后在冰上孵育10分钟。此后，将负载的RBCEV以21,000×g沉淀，并用PBS洗涤两次。对于涉及与MSC-exo比较的实验，将MSC-exo以与上述相同的方式负载DNA，并且为了一致性，将负载的RBCEV和MSC-exo两者根据制造商的说明书用ExoQuick-TC(SBI)进行纯化。

评估RBCEV中经负载的核酸的拷贝数

分别对已知量的mRNA和DNA进行qRT-PCR和qPCR，并将Ct值针对拷贝数作图以生成标准曲线。使用Trizol(ThermoFisher)提取来自负载mRNA的RBCEV的总RNA，并按照制造商的方案使用qScript cDNA合成试剂盒(Quantabio)将其转化为cDNA。使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)提取来自负载DNA MC的RBCEV的总DNA。对cDNA/DNA样品进行qPCR以确定拷贝数。基于纳米颗粒追踪分析的原理，通过ZetaView(Particle Metrix)对RBCEV进行定量。

流式细胞术分析

使用MACSQuant分析仪10(Miltenyi Biotec)对FACS缓冲液(含0.5％胎牛血清的PBS)中的细胞进行流式细胞术，并使用Flowjo V10(Flowjo,USA)进行分析。对293T细胞最初根据FSC-A和SSC-A进行设门，以排除碎片和死细胞(低FSC-A)。基于FSC宽度对FSC高度对细胞进行进一步设门以排除双重峰和聚集体。随后，使用未处理的细胞作为对照，对GFP阳性细胞在FITC通道中进行设门，并评估GFP阳性细胞的百分比和平均荧光强度。

负载DNA的RBCEV的血清稳定性

如所述，使用转染试剂使RBCEV负载MC。通过心脏穿刺从6周龄的雌性Balb/C小鼠收集1-1.2mL全血。通过将凝结的全血以3,000g离心10分钟来分离血清。血清或对照(PBS)处理是通过将100μL血清或PBS与80μg MC或等量的转染试剂复合MC或经负载的RBCEV在37℃下在搅拌下孵育2小时来进行。孵育后，将经负载的RBCEV以21,000g离心30分钟以收集沉淀和上清液。将EDTA添加至所有经血清处理的样品中，最终浓度为5mM。将含有EDTA的样品在75℃下加热5分钟以使DNA酶失活。将样品和DNA标准品与DNA负载染料混合并负载到1％琼脂糖凝胶上进行电泳。

负载DNA的RBCEV的全身性体内施用

所有动物实验均按照新加坡A*STAR生物资源中心机构动物护理和使用委员会批准的实验方案进行。6周龄的雌性BALB/c或NSG小鼠购自The Jackson Laboratory(ME,US)。通过化学转染使RBCEV负载荧光素酶编码的质粒。通过凝胶光密度测定法定量RBCEV中负载的DNA的量。通过尾静脉注射以单次200μl大丸剂全身施用未负载的对照和负载DNA的RBCEV。为了检测荧光素酶的表达，在腹膜内注射150mg/kg D-荧光素(PerkinElmer)后15分钟，使用IVIS Spectrum系统(PerkinElmer)在所指示时间点捕获全身生物发光图像。视觉输出将每秒发射的光子总数表示为假彩色图像，其中最大值为红色，且最小值为深蓝色。

结果

与mRNA相比，RBCEV的DNA递送效率更高

评估了RBCEV负载2类主要核酸、环状双链DNA(微环，MC)和线性单链mRNA的能力。通过电穿孔评估GFP MC(2000bp)和GFP mRNA(1000个碱基)在RBCEV中的负载效率。在此比较中，与mRNA(ssRNA)相比，MC(dsDNA)的分子量为约4倍大。因此，原则上，将较大的MC有效载荷负载到RBCEV中应该更具挑战性。通过电穿孔将GFP MC和GFP mRNA负载到RBCEV中。观察到，在用负载mRNA的RBCEV处理的细胞中，GFP表达水平不足以高至通过流式细胞术检测到(图1a)。然而，在用负载DNA MC的RBCEV处理的细胞中，约3％的细胞对GFP呈阳性(图1b)。

还用DNA和mRNA化学转染了RBCEV，然后在体外将它们处理至细胞。如图2a所示，与mRNA相比，使用这种货物负载方法，设法将更多的DNA拷贝负载到RBCEV中。通过将通过qPCR测量的cDNA总拷贝数除以通过纳米颗粒追踪分析测量的EV颗粒的总数，计算出1.16个GFPmRNA拷贝被负载到每个囊泡中，其与每个囊泡负载3.74个GFP DNA MC拷贝相比显著减少(数据未显示)。当用这些经负载的囊泡处理293T细胞时，观察到，与mRNA货物相比，用DNAMC货物处理细胞后48小时，更大百分比的细胞变得对绿色荧光呈阳性(99.5％对73.5％，图2)。

与MSCEV相比，RBCEV是更好的DNA货物递送媒介物

MSC是外泌体的多产生产者，并且据报告，由MSC产生的外泌体保留细胞的免疫调节性质，并且因此这些外泌体可同种异体地施用于患者。由于这些原因，正在积极探索MSC-exo作为用于各种治疗有效载荷的新型药物递送媒介物。然而，MSC-exo的临床使用伴随着一些挑战，如广泛细胞培养以获得治疗性人体剂量的EV，并且迄今为止，一般而言在将大型核酸有效载荷(mRNA或DNA表达载体)负载到EV方面几乎没有成功，因此限制了它们在基因传递中的应用。试图使用上述化学转染方法比较RBCEV与MSC-exo的DNA负载能力。将等量的RBCEV和MSC-exo负载相同量的编码GFP的DNA MC，并且为了保持一致性，使用ExoQuick纯化了两种类型的囊泡。发现，用负载DNA的RBCEV处理的293T细胞对GFP的阳性率为59.3％，相比之下对于负载DNA的MSC-exo而言阳性率为26.1％(图3，a和b)。这表明，RBCEV鉴于其安全性和生物相容性、可从单个单位的血液中获得高产量以及它们易于负载大核酸是理想的非病毒基因治疗媒介物。

RBCEV可递送各种大小的DNA货物

基因疗法主要由病毒载体介导，其中AAV处于体内基因疗法的最前沿。然而，除了免疫原性和制造方面的挑战外，使用病毒载体的其它限制之一是有效载荷容量。AAV基因组的容量是4.7kb，并且这极大地限制了可插入的转基因的大小。试图鉴定RBCEV可递送的DNA货物的大小限制。将等质量的各自含有由CMV启动子驱动的copGFP转基因单拷贝的各种大小的DNA货物(2.4、6.6、9.6、11.4和34.2kb-参见图7a)化学负载到RBCEV中，并且将等量的负载和洗涤过的RBCEV添加至培养中的293T细胞中。48小时后，通过荧光显微术对细胞进行成像，然后使用流式细胞仪进行分析。如图7b所示，对于所有DNA货物都观察到成功转染的荧光细胞。令人感兴趣地，GFP阳性细胞的百分比以及平均荧光强度随着货物的大小增加而降低(2.4kb货物的阳性细胞为99.7％，并且34.2kb货物的阳性细胞减少至59.2％)，并且这很可能是递送等质量的DNA的结果，所述DNA根据其大小含有不同拷贝数的有效载荷(图7b和7c)。然而，结果表明，RBCEV可递送各种大小的DNA货物。

RBCEV保护负载的DNA免受血清降解

对于涉及全身施用负载DNA的RBCEV的应用，重要的是确保负载的DNA货物对循环中核酸酶的活性保持稳定。因此，通过用来自Balb/C小鼠的血清处理MC、与转染试剂复合的MC和负载MC的RBCEV来评估负载的DNA的稳定性，并使用凝胶电泳分析残留DNA(图5)。正如在泳道M0中观察到的，所用血清样品中没有污染DNA。血清中的DNA酶不仅能够降解裸DNA(泳道M4)，而且能够降解与转染试剂复合的DNA(泳道M3)。在PBS处理的对照(分别为泳道P4和P3)中未观察到裸DNA或与转染试剂复合的DNA。然而，即使在血清孵育后，与PBS处理的对照相比，负载的RBCEV仍保留了93％的完整DNA有效载荷(泳道M2对比P2)。这表明RBCEV能够保护DNA有效载荷免受血清核酸酶降解，并且可全身施用而无需担心血清稳定性。

体内递送DNA货物以在小鼠中长期基因表达

基因疗法媒介物的关键特征之一是能够在体内递送基因并在靶组织中赋予持续、长期的基因表达。为了证明这一点，将负载编码荧光素酶的DNA的RBCEV以2mg/kg的DNA剂量注射到NSG小鼠的尾静脉中。使用IVIS Spectrum生物发光成像仪监测全身荧光素酶表达的动力学。RBCEV介导的体内递送至细胞导致小鼠躯干区域中的持续、长期的荧光素酶活性。监测生物发光信号超过30dpi(迄今为止45dpi)，没有任何可观察到的减少(图4)且在超过279天最小减少(图9a)。

为了证明在体内递送大DNA货物的潜力，将负载有3kb、8kb和34kb编码荧光素酶的DNA货物的RBCEV以2.5mg/kg的相等DNA剂量全身性施用到BALB/c小鼠的尾静脉中。无论DNA货物的大小如何，所有注射了负载DNA的RBCEV的小鼠在48小时时间点都显示出发光(图9b)。然而，确实观察到随着DNA货物的大小增加，转基因表达减少，这再次归因于有效载荷取决于其分子量的不同拷贝数。总之，已经证明了RBCEV能够在小鼠中递送大DNA货物并触发长期转基因表达，从而突出显示了其成为新型非病毒基因治疗载体的潜力。

参考文献

以上引用了许多出版物，以便更全面地描述和公开本发明以及本发明所属的现有技术水平。下面提供这些参考文献的完整引用。这些参考文献中的每一者的全部内容以引用的方式并入本文。

对于标准分子生物学技术，参见Sambrook,J.,Russel,D.W.《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning,A Laboratory Manual).第3版2001,冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)

1.Kanada等人,通过细胞外囊泡递送至靶细胞的生物分子的不同命运(Differential fates of biomolecules delivered to target cells viaextracellular vesicles).《美国科学院学报》(PNAS)3月24日,2015112(12)E1433-E1442；2015年2月23日首次刊发

2.Yang,Z.,Shi,J.,Xie,J.等人.通过细胞纳米穿孔大规模生成功能性mRNA封装外泌体(Large-scale generation of functional mRNA-encapsulating exosomes viacellular nanoporation).《自然·生物医学工程》(Nat Biomed Eng)(2019)doi:10.1038/s41551-019-0485-1

3.WO2010/119256

4.Lamichhane等人,通过电穿孔将外源DNA负载到细胞外囊泡中是大小依赖性的，并且能使有限的基因传递成为可能(Exogenous DNA Loading into ExtracellularVesicles via Electroporation is Size-Dependent and Enables Limited GeneDelivery).《分子药理学》(Mol Pharm).2015 10月5日；12(10):3650–3657.

5.Usman等人,使用红细胞胞外囊泡进行高效RNA药物递送(Efficient RNA drugdelivery using red blood cell extracellular vesicles).《自然通讯》(NatureCommunications Nat Commun)9,2359(2018)doi:10.1038/s41467-018-04791-8.

6.Wang等人,ASMM作为大分子细胞内递送的多功能平台(ASMMs as a versatileplatform for intracellular delivery of macromolecules).《自然通讯》(NatureCommunications)2018 9-960.

Claims

1.一种红细胞细胞外囊泡(RBCEV)，其负载有DNA货物。

2.如权利要求1所述的RBCEV，其中所述DNA货物是单链的并且具有至少250个碱基的长度。

3.如权利要求1或2所述的RBCEV，其中所述DNA货物是单链的并且具有至少2000个碱基或2000-30000个碱基或更多个碱基的长度。

4.如权利要求1所述的RBCEV，其中所述DNA货物是双链的并且具有至少250个碱基对的长度。

5.如权利要求1或4所述的RBCEV，其中所述DNA货物是双链的并且具有至少2000个碱基对或2000-17000个碱基对或更多个碱基对的长度。

6.如任何前述权利要求所述的RBCEV，其中所述DNA货物是包含编码蛋白质或肽的基因的表达载体。

7.如权利要求1至6中任一项所述的RBCEV，其中所述DNA货物是环状的。

8.如权利要求1至7中任一项所述的RBCEV，其中所述DNA货物是微环或质粒。

9.如权利要求1至6中任一项所述的RBCEV，其中所述DNA货物是线性的。

10.如任何前述权利要求所述的RBCEV，其中所述DNA货物在所述RBCEV的内腔中。

11.如任何前述权利要求所述的RBCEV，其中所述RBCEV来源于或获自人或哺乳动物红细胞。

12.如任何前述权利要求所述的RBCEV，其中所述RBCEV是分离的。

13.一种分离的红细胞细胞外囊泡(RBCEV)，其含有在所述RBCEV的内腔中的至少一个DNA货物。

14.一种组合物，其包含多个根据前述权利要求中任一项所述的RBCEV。

15.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物中的每个RBCEV平均负载有至少1.0个DNA货物。

16.如权利要求14或15所述的组合物，其中所述组合物中的每个RBCEV平均负载有至少2.0或3.0个DNA货物。

17.如权利要求14至16中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的每个RBCEV平均负载有1.0至4.0个DNA货物。

18.如权利要求14至17中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物或药物。

19.如权利要求18所述的组合物，其中所述组合物或药物还包含药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或稳定剂。

20.一种治疗需要治疗的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的RBCEV或根据权利要求14至19中任一项所述的组合物，从而治疗所述受试者。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述方法涉及通过从所述DNA货物的基因序列表达蛋白质或肽来治疗所述受试者的疾病。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述治疗包括所述疾病的预防和/或改善。

23.一种用于使细胞外囊泡负载核酸货物的方法，所述方法包括：

a.提供待负载到细胞外囊泡中的核酸；

b.使所述核酸与细胞外囊泡在转染试剂存在下在足以使所述细胞外囊泡负载所述核酸的条件下接触；以及

c.任选地洗涤所述经负载的细胞外囊泡。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述细胞外囊泡是红细胞细胞外囊泡。

25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述方法包括重复步骤b。

26.一种用于使细胞外囊泡负载核酸货物的方法，所述方法包括：

a.提供待负载到细胞外囊泡中的核酸；

b.使所述核酸与转染试剂接触以允许形成核酸/转染试剂复合物；

c.使所述核酸/转染试剂复合物与细胞外囊泡在足以使所述细胞外囊泡负载核酸/转染试剂复合物的条件下孵育或接触；以及

d.任选地洗涤所述经负载的细胞外囊泡。

27.一种用于使细胞外囊泡负载核酸货物的方法，所述方法包括：

a.提供待负载到细胞外囊泡中的核酸；

c.使所述核酸/转染试剂复合物与细胞外囊泡在足以使所述细胞外囊泡负载核酸/转染试剂复合物的条件下孵育或接触；

d.任选地洗涤所述经负载的细胞外囊泡；

f.使所述另外的核酸/转染试剂复合物与所述经负载的细胞外囊泡孵育或接触。

28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述细胞外囊泡是红细胞细胞外囊泡。

29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述方法还包括重复步骤b-d。

30.如权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述转染试剂是任选地MW 25,000Da或MW 40,000Da的线性聚乙烯亚胺盐酸盐。

31.如权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述方法还包括除去不包含在所述细胞外囊泡的内腔内的核酸货物的步骤。

32.如权利要求31所述的方法，其中除去不包含在所述细胞外囊泡的内腔内的核酸货物包括使所述经负载的细胞外囊泡与核酸酶，优选RNA酶或DNA酶接触。

33.如权利要求32所述的方法，其中使所述经负载的细胞外囊泡在与核酸酶接触之前与肝素接触。

34.如权利要求23至33中任一项所述的方法，其中所述核酸货物包含核酸分子，其中每个核酸分子是单链的并且具有至少250个碱基、或至少2000个碱基、或2000-30000个碱基或更多个碱基的长度。

35.如权利要求23至33中任一项所述的方法，其中所述核酸货物包含核酸分子，其中每个核酸分子是双链的并且具有至少250个碱基对、或至少2000个碱基对、或2000-17000个碱基对或更多个碱基对的长度。

36.如权利要求23至35中任一项所述的方法，其中所述核酸货物是环状的。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述核酸货物是微环或质粒。

38.如权利要求23至35中任一项所述的方法，其中所述核酸货物是线性的。

39.如权利要求23至38中任一项所述的方法，其中所述核酸货物是DNA。

40.如权利要求23至39中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡是微泡。

41.如权利要求23至39中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡是外泌体。

42.一种负载有核酸货物的细胞外囊泡，其通过权利要求23至41中任一项所述的方法制备或获得。