KR20210116324A - 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 세포 사멸 유도 방법 - Google Patents

게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 세포 사멸 유도 방법 Download PDF

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명경재
권태준
백인준
라재선
박용환
정우재
오타르바예브 대니야르
조승우
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기초과학연구원
울산과학기술원
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Abstract

본 발명은 게놈 서열 변이를 가지는 세포 (cells having genomic sequence variation) 내 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 서열 중 정상세포에는 존재하지 않는 고유 서열을 포함하는 핵산 서열 복수개를 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 전달 수단, 상기 전달 수단을 포함하는 조성물 및 상기 전달 수단 또는 조성물을 이용한 게놈 서열 변이를 가지는 세포의 사멸 유도 방법에 관한 것이다.

Description

게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 세포 사멸 유도 방법 {Composition For Inducing Death of Cells Having Genomic Sequence Variations And Method For Inducing Death of Cells Having Genomic Sequence Variations Using the Same}
본 발명은 게놈 서열 변이를 가지는 세포 (cells having genomic sequence variation) 내 세포 특이적 변이영역 서열 중 정상세포에는 존재하지 않는 고유 서열을 포함하는 핵산 서열 복수개를 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 전달 수단, 상기 전달 수단을 포함하는 조성물 및 상기 전달 수단 또는 조성물을 이용한 게놈 서열 변이를 가지는 세포의 사멸 유도 방법에 관한 것이다.
CRISPR/Cas는 RNA 가이드를 통한 유전자 교정 도구로, 박테리아 유도 엔도뉴클레아제 Cas9 (또는 돌연변이 니케이즈)와 가이드 RNA를 사용하여, 가이드 RNA와 게놈 DNA 사이의 서열을 매칭시켜, 게놈 내 특정 위치에 이중 (또는 단일) 가닥 브레이크를 도입할 수 있다. CRISPR/Cas 매개 유전자 녹아웃은 RNA 간섭 매개 유전자 녹다운 (RNA interference-mediated gene knockdown) 보다 더 효율적인 것으로 예상되고, 유전자 기능을 연구하기 위한 유용한 실험 도구를 제공하고 있다.
포유동물 세포에서 CRISPR-Cas 시스템이 작동할 수 있다는 연구들이 보고되었고, 미생물의 적응면역에서 비롯된 유전자 편집 기술은 Cas9(CRISPR associated protein 9 : RNA-guided DNA endonuclease enzyme) 및 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)를 포함한다. 가이드 RNA는 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 포함하며, Cas9에 결합하여 타겟 서열에 대한 염기 쌍결합을 통해 목적하는 게놈 서열로 안내하여, 이중나선절단 (Double strand break, DSB)이 생성된다.
생명체는 살아가는 과정에서 여러 가지 형태의 세포분열을 하며, 이러한 세포분열은 다양한 방식으로 수리(repair)하는 과정을 거쳐 게놈서열이 가능한 동일하게 유지되도록 하고 있으나, 상황에 따라 게놈 서열에 변이가 발생하고 있다. 이렇게 게놈 서열에 변이가 발생한 세포들은 생명체의 생존에 위협이 되거나 좋지 않은 영향을 미치게 된다. 이러한 게놈 서열 변이 중에 가장 심각하게 대두되고 있는 것이 암 이다.
암은 변이의 축적에 의해 발생하고 이것은 생식세포를 통해 유전되거나 세포 주기동안 체세포 내에 획득되게 된다. 이러한 종양유전자, 종양억제유전자, DNA 복구 유전자들의 변화는 세포가 성장과 조절 메커니즘에서 벗어나 암을 발생시키기도 한다.
한편, 게놈 서열 변이를 가지는 세포에 의해 유래되는 대표적 질환인 암을 치료하기 위해, 다양한 항암제가 지속적으로 개발되고 있다. 항암제는 1970년대부터 시작된 1세대 화학항암제, 2000년대부터 대두된 2세대 표적항암제 및 2010년대부터 적용된 3세대 면역항암제로 개발되어 왔다 (Nature reviews Cancer. 5(1):65-72.).
1세대 화학항암제는 Paclitaxel 등과 같은 항암 화합물로, 정상세포에 비해 분열 속도가 빠른 암세포를 공격한다. 다만, 암세포뿐 아니라 정상세포도 공격하여 환자의 면역체계를 파괴하며, 강한 독성으로 인해 탈모, 구토, 식욕저하, 피로감, 극심한 체력저하 등 각종 부작용이 발생하는 문제가 있었다 (Critical reviews in oncology/hematology 89(1):43-61. 및 Chemistry & Biology Volume 20, Issue 5, 23 May 2013, Pages 648-659).
이를 해결하기 위해, 특정 변이에 의한 종양세포만 식별하여 공격하는 표적항암제 예를 들어, Rituximab 또는 imatinib 등이 암 치료제로 대두되었다. 탈모, 구토 등의 부작용이 적고 치료제 반응률이 높은 것으로 확인되나, 암 유발 특정 변이가 있는 환자에게만 사용 가능하므로 다양한 암치료가 불가능하고, 표적항암 치료제에 대한 내성이 발생하는 문제가 있었다 (Adv Pharm Bull. 2017 Sep; 7(3): 339-348.).
최근, 종양 자체를 공격하는 다른 항암제와 달리 Ipilimumab 또는 Tisagenlecleucal 등과 같이, 면역세포 활성화를 통해 종양세포를 공격하고 제거하는 면역항암제가 주목받고 있다 (Cytotherapy. 2019 Feb;21(2):224-233). 이러한 면역항암제는 부작용이 적고 치료 반응이 보이는 환자에게서 약효가 장기간 유지될 수 있다. 다만, 반응률이 약 20-30% 정도로 특정 환자에게만 효과가 있고, 면역관문억제제의 내성 문제가 대두되고 있으며, 면역세포치료제 등에서는 사이토카인 분비 신드롬 및 신경독성의 부작용 등이 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다 (Nat Rev Drug Discov. 2018 Nov 28;17(12):854-855).
이와 같이 치료에 사용되고 있는 다수의 항암제에도 불구하고, 목적하는 항암 효과가 충분하게 달성하지 않거나, 항암제 적용시 수반되는 부작용이 있어, 여전히 새로운 암 치료 기술의 개발 및 적용이 필요한 실정이다.
새로운 암 치료 기술 중의 하나로, 암에서는 정상세포에서 발견되지 않는 새로운 DNA 서열이 삽입되거나 (Insertion: IN), 정상세포의 DNA 일부가 잘려지는 (Deletion: Del) 현상이 다수 관찰되는데 이러한 암세포 DNA에 나타나는 특이적 삽입 또는 삭제 DNA(INDEL)는 정상세포에 존재하지 않는 DNA 서열이기 때문에 이들을 정상세포와 암세포의 차별적 공격 타겟으로 설정하면 암을 치료할 수 있다.
DNA 이중사슬절단은 세포 수준에서 가장 심각한 손상 중의 하나로, 손상된 DNA는 비상동 말단 연결(non-homologous end joining), 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 복구되지만, 복구되지 못한 DNA는 유전 정보의 손상 또는 재배열을 일으켜 세포사(apoptosis)가 유도될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템을 인간의 암 치료에 적용할 수 있음이 보고되고 있다 (Oncotarget. 2016 Mar 15;7(11):12305-17). 그러나, 이는 암의 유발과 상관성 있는 변이에 기초하여, 게놈 중 하나 이상을 수정 또는 절제하는 것이 암에 대한 강력한 치료를 제공할 가능성을 높일 수 있음을 제시할 뿐이다.
이와 관련하여, 미국특허공개 제2017/0114413호에는 암 특이적 서열 변이를 타겟하는 가이드 RNA를 적용한 CRISPR/Cas 시스템이 제안되어 있다. 암 특이적 서열 변이는 단일 타겟의 암 특이적 DNA의 CNV (copy number variation)를 대상으로 할 수 있음이 기재되어 있다. 특정 기준 이상의 CNV를 나타내는 암을 CRISPR/Cas 시스템을 적용하여 치료할 수 있는 기술로, 치료 가능한 암의 종류가 극히 제한적이다.
한국등록특허 제2023577호에는 암세포에 특이적으로 존재하는 유전자복제수변이(CNV)가 적어도 7인 유전자에 상보적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드 및 Cas9과 엑소뉴클레아제인 RecJ가 결합된 융합단백질을 이용한 종양세포 살해용 조성물이 기재되어 있다. 본 발명에 따르면, Cas9 이외에 엑소뉴클레아제인 ExoI을 사용하여, 복수의 가이드 RNA 수를 최소화함으로써 목적하는 암 치료 효과를 나타낼 수 있다. 그러나, RecJ를 엑소뉴클레아제로 사용하는 경우, 목적하는 정도로 투여되는 가이드 RNA 수를 감소하거나 또는 최소화할 수 없었다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 게놈 서열 변이를 가지는 세포에서 복수의 변이영역을 특이적으로 인식하는 절단인자 복수개를 이용하여, 복수의 변이영역에 DSB (double strand break)를 유도함으로써 게놈 서열 변이를 가지는 세포가 사멸될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 핵산절단효소 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 캐리어를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 엑소좀을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 벡터를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 캐리어를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 엑소좀을 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소, 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 캐리어를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 엑소좀을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 벡터를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 캐리어를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 엑소좀을 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물, 벡터, 리보핵산단백질 복합체, 캐리어 또는 엑소좀을 제공하는 단계를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포의 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 개체에 처리하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, (i) 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 핵산절단효소; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 리보핵산단백질 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 캐리어를 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 엑소좀을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 (i) 및 (ii)가 동일 또는 상이한 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 (ii)가 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 핵산절단효소; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)가 리보핵산단백질 복합체를 형성하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)가 캐리어에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 엑소좀을 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 환자 맞춤형 질병 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물 을 제공한다. 본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 개체에 처리하는 단계를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 리보핵산단백질 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 캐리어를 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 엑소좀을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 (i) 및 (ii)가 동일 또는 상이한 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 (ii)가 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)가 리보핵산단백질 복합체를 형성하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)가 캐리어에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)가 엑소좀에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 환자 맞춤형 질병 치료용 조성물을 제공한다.
도 1은 CINDELA가 암세포에서 선택적인 세포사멸을 유도함을 보여주는 결과이다. (A) CINDELA (암 특이적 INDELs 공격자) 모식도. (B) 동시다발적 복수 DNA DSB (제한효소 AsiSI로 생성됨)은 골육종 세포 (U2OS)에서 세포사멸을 유도. (C) CRISPR-Cas9에 기인한 DSB는 세포사멸을 유도. 1에서 104 이상의 많은 사이트를 대상으로 하는 sgRNA을 테스트, HEK293T 세포의 생존율을 측정. (D) SpCas9 RNP 복합체로 인한 CINDELA에 의해 유도된 암세포 사멸. 스케일 바는 300μm. P-값은 unpaired two-sided t-test 사용하여 계산.
도 2는 RNP 복합체에 의해 전달되는 CINDELA gRNA에 의해 유도된 동시다발적 DNA DSB에 의한 세포사멸의 단계적인 증가를 보여주는 결과이다. HCT116에 대한 세포 특이적인 InDels을 타겟팅하는 18개의 gRNA을 ATTO 표지된 추적 RNA로 처리. ATTO 신호(적색)을 감지하여 RNP 복합체가 성공적으로 전달된 것을 확인. 유도된 DNA DSB의 효과를 확인하기 위해 특정 영역에서 살아있는 세포를 정량화. 6개 (A-C) 12개 (D-F) 18개 (G) gRNA 및 추적 RNA를 SpCas9 함께 HCT116 세포에 전달. (H) SpCas9만 HCT116 세포에 전달. (I) 세포의 생존도는 각각의 표시된 CINDELA 처리로 정량화.
도 3은 AAV 유래 CRISPR/SaCas9 포함 CINDELA에 대한 결과이다. (A) SaCas9 및 sgRNA 발현 플라스미드의 형질감염을 동반한 CINDELA는 U2OS 세포를 사멸. 30개의 비특이적 sgRNA를 발현하는 세포 (HCT116 특이적 InDels을 타겟하는 sgRNA)와 비교하여 U2OS InDels에 특이적인 CINDELA sgRNA 발현 세포는 증가된 사멸을 나타냈다. (B) SaCas9 및 CINDELA sgRNA 플라스미드의 형질감염 후 상대적인 세포생존율을 모니터했다. 유의성은 unpaired two-sided t-test를 사용하여 평가되었다. (C) sgRNA 및 SaCas9 발현 AAV를 U2OS에 형질도입하고 72시간 후 세포 생존율을 관찰했다. 대조군으로 동일한 AAV를 RPE1 세포에 적용하고 SaCas9만을 발현하는 AAV를 U2OS 세포에 형질도입했다. 스케일 바는 300μm. (D) 아폽토시스는 AAV 형질도입 후 시간 의존적으로 증가. 세포주 특이적 타겟팅은 유의하게 증가 (p 값은 unpaired two-sided t-test 사용하여 계산).
도 4는 플라스미드로 전달된 CINDELA sgRNA에 의해 유도된 동시다발적 DNA DSB 의한 세포사멸의 단계적인 증가를 보여주는 결과이다. (A) U2OS 및 RPE1 세포에 SaCas9만 포함 (sgRNA 없음) 또는 U2OS 세포에 특이적인 서열을 타겟하는 30개의 sgRNA 포함 SaCas9 중 하나를 발현하는 AAV를 형질도입. (B) (A)에서 관찰 된 세포생존도 정량화. 각 웰의 70% EtOH 중 염색된 1 % 브로모 페놀 블루를 30 % 아세테이트로 추출하고 OD595 측정. (C) SaCas9만 (sgRNA 없음) 또는 U2OS 세포에 특이적인 서열을 타겟하는 30개의 sgRNA 포함 SaCas9 중 하나를 발현하는 AAV로 형질도입된 U2OS 세포에서 염색질 결합 단백질을 표시된 항체로 면역블롯. (D) U2OS 및 RPE1 세포 이미지는 SaCas9만을 발현하거나, 5개 sgRNA (그룹 A와 B), 10개 sgRNA, 20개 sgRNA 또는 30개 sgRNA 포함 SaCas9을 발현하는 AAV 형질도입 3 일후 캡처. (E) (D)에서 관찰된 아폽토시스 세포사멸의 정량화.
도 5는 마우스 이종이식모델에서 CINDELA 효과를 나타낸 결과이다. U2OS 골육종 세포주로 마우스 이종이식모델을 확립하고 AAV를 사용하여 SaCas9와 함께 30 CINDELA sgRNA을 전달했다. (A) 종양 증식은 SaCas9만을 발현하는 AAV로 형질도입된 이종이식모델 종양과 비교하여 U2OS 특이적 CINDELA sgRNA 및 SaCas9 발현하는 AAV로 형질도입된 종양에서 유의하게 지연됨. 상대적인 종양 부피 차이는 unpaired two-sided t-test을 사용하여 분석. (B) SaCas9만으로 처리된 종양과 비교하여 CINDELA sgRNA 및 SaCas9로 처리된 이종이식모델 종양 샘플에서 세포 사멸의 증가. AAV 주사 6일 후 이종이식모델 조직을 채취하여 TUNEL 분석에서 세포사멸 측정 (스케일 바 : 100 μm 상단 패널; 20 μm 하단 패널). (C) CINDELA에 의해 유도된 아폽토시스 세포사멸은 FACS 분석을 통해 Annexin V 발현을 측정함으로써 확인 (p-값은 unpaired two-sided t-test 사용하여 계산).
도 6은 U2OS 유래 이종 이종이식모델 조직의 CINDELA 효과를 나타낸 것이다. (A) CINDELA 종양에 SaCas9의 발현은 항-HA (SaCas9에 태그됨) 항체를 이용한 면역 염색에 의해 검출. (B) 마우스의 체중은 AAV 주사 일정 동안 측정되었다. No sgRNA (SaCas9만 포함) 및 CINDELA sgRNA (U2OS 특이적)는 SaCas9만 또는 U2OS 세포에 특정 서열을 타겟으로 하는 30개 sgRNA 포함 SaCas9 중 하나를 발현하는 AAV를 주입한 것을 나타냄.
도 7은 환자 유래의 종양세포와 PDX (환자 유래의 이종이식) 모델의 CINDELA 효과를 나타낸 것이다. (A) 교모세포종 환자 (GBL-67) 유래 종양세포를 AAV 형질도입을 사용하여 26개 CINDELA sgRNA 및 SaCas9로 처리. 신경 줄기세포주 (NSC-10)과 비교하여 CINDELA 처리는 GBL-67 세포를 특이적으로 사멸함. 스케일 바는 300μm. (B) 폐암 PDX 모델은 CINDELA sgRNAs과 SaCas9로 처리. 주목해야 할 것은 종양의 성장이 SaCas9만 포함하는 대조군과 비교하여 CINDELA sgRNA 및 SaCas9 치료에서 유의하게 지연됨 (유의성은 two-sided unpaired t-test).
도 8은 CINDELA 치료에 의해 폐암 PDX의 증식이 억제됨을 보여주는 것이다. (A) SaCas9만 또는 PDX-073 암에 특이적인 서열을 타겟으로 하는 29개의 sgRNA을 포함하는 SaCas9 중 하나를 발현하는 AAV를 3일 간격으로 5회, 2주간 주사하였다. 종양을 가진 마우스 (상단 패널)와 마우스에서 추출된 종양 (하단 패널)의 사진. (B) SaCas9만 또는 PDX-318 암에 특이적인 서열을 타겟으로 하는 22개의 sgRNA을 포함 SaCas9 중 하나를 발현하는 AAV를 3일 간격으로 5회, 2주간 주사하였다. 종양을 가진 마우스 (상단 패널)와 마우스에서 추출된 종양 (하단 패널)의 사진. (C) 마우스의 체중은 AAV 주사 일정 동안 측정되었다.
도 9는 U2OS 세포주에서 30개의 DNA 서열을 타겟하여 세포사멸을 유도할 수 있는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 U2OS 세포주에서 10개의 DNA 서열을 타겟하여 세포사멸을 유도할 수 있는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 U2OS 세포주에서 5개의 DNA 서열을 타겟하여 세포사멸을 유도할 수 있는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 U2OS 세포주에서 도 11과 상이한 5개의 DNA 서열을 타겟하여 세포사멸을 유도할 수 있는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 U2OS 세포주에서 3개의 DNA 서열을 타겟하여 세포사멸을 유도할 수 있는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 Exo-saCas9 및 이를 이용하여 DSB를 유도하는 기작에 대한 모식도이다.
도 15는 Chromosome 3을 타겟팅하는 가이드 RNA 5개를 형질감염하여 HCT116 세포사멸 효과를 실험한 결과를 나타낸 것이다. saCas9를 단독으로 사용하는 경우에는 가이드 RNA 5개로 세포사멸이 미미하였으나, Exo-saCas9을 사용하면 가이드 RNA 5개로 충분히 세포사멸을 일으키는 것을 확인하였다.
도 16은 U2OS 세포주에서 Exo-saCas9을 사용하여 가이드 RNA 5개로 충분히 세포사멸을 일으킬 수 있음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17는 DNA damage marker인 g-H2AX를 통해, Exo-Cas9이 세포 사멸을 더 잘 유도하는 이유가 saCas9에 의한 DNA DSB 유도 이후에 손상 복구 (repair)를 저해하기 때문임을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 Exo-Cas9를 이용하였을 때, DR-GFP assay를 통해 HR (Homologous recombination)되는 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과 Exo-Cas9을 이용했을 때 HR이 현저하게 떨어지는 것을 확인하였다. Exo-Cas9 이 HR을 저해함을 증명한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
1. 게놈 서열 변이를 가지는 세포
정상적인 체세포 복제시에도 DNA 중합효소(DNA polymerase)는 뉴클레오타이드 107 쌍을 합성하는 동안 약 1개의 오류가 발생한다. DNA 회복기작에 의해 이러한 실수의 99%는 교정이 되어 전체적으로 109개의 뉴클레오타이드 복제시 1개의 오류를 범한다. 이러한 돌연변이는 축적되고 유전체 불안정성(genome instability)을 야기한다.
이러한 유전체 불안정((genome instability)은 세포 외적 환경요인에 의하여 가속될 수 있는데, X-선, 자외선 또는 방사선에 노출, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 등이다.
유전체 불안정의 결과는 유전체가 손상된 세포 즉, "게놈 서열 변이를 가지는 세포"가 발생하고 이들은 변이된 유전정보가 후대의 딸세포에게 유전되어 증식하게 된다.
즉, 상기 "게놈 서열 변이를 가지는 세포"는 돌연변이의 축적에 의해 유전체의 염기 서열에 변화가 발생한 세포이다. 이러한 유전체 염기서열의 변화는 세포의 활성 및 기능이 정상세포와 다르게 되며, 이는 생물체 또는 생물의 기관이 살아가거나 작동하는데 있어 문제 즉, 질환을 야기한다.
예를 들어 "게놈 서열 변이를 가지는 세포"에 의한 질환 발병 상태의 세포로서, 구체적으로 노화세포(senescent cell), 양성종양(benign tumor), 악성종양(malignant tumor) 즉 암세포 등이며 여기에 국한되지 않는다.
이러한 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 정상세포에서 발견되지 않는 DNA 서열이 삽입되거나 (Insertion:In), 정상세포의 DNA 일부가 잘려지는 결실(Deletion:Del)을 통하여 이루어지는 데, 통상적으로 이러한 변이서열을 '인델(InDel)'이라고 한다. 게놈 서열 변이의 형태로는 ''인델(InDel)' 이외에 특정 서열이 다른 서열로 대체(substitution)되는 경우도 있다.
이른바 점돌연변이(point mutation)로서 DNA와 RNA의 염기서열에서 염기쌍 하나가 바뀌어서(대체, substitution) 발생하는 돌연변이도 그러한 경우이다. 본 발명에서 '인델(InDel)'은 정상세포의 DNA의 서열에 대하여 삽입 또는 결실된 서열은 물론 대체된 서열 또는 삽입, 결실 및 대체의 조합의 과정으로 정상세포에 존재하지 않는 염기서열을 의미한다.
이러한 유전적 변이세포의 DNA에 나타나는 특이적 '인델' 서열은 정상세포에 존재하지 않는 염기 서열이기 때문에 이들을 정상세포와 질환을 야기하는 세포의 차별적 공격 타겟으로 설정할 수 있다.
본 발명에서 InDel 서열은 질환을 발생시키는 유전자와 관련된 서열만 의미하지 않는다. 또한 특정 단백질을 암호화하는 유전정보는 갖고 있는 서열은 물론 이른바 정크(junk) DNA 서열도 본 발명의 InDel이 될 수 있다. 즉, 본 발명에서 주 타겟으로 하는 InDel은 1) 정상세포에는 존재하지 않는 서열로서 2) 질환 발병상태의 세포에 공통적으로 존재하는 염기서열이다.
상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포는 유전자 변형 또는 손상에 의해 세포의 활성이 정상세포와 다르게 된 세포를 의미하고, 예를 들어 유전자 변형 또는 손상에 의해 질환 발병 상태의 세포를 의미할 수 있다.
상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포에 의해 예를 들어, 암, 노화, 면역질환, 심혈관 질환 등의 질환이 유발될 수 있다.
암(cancer)과 세포 노화 (cellular senescence)는 유전체의 불안정성(genomic instability)으로 인하여 발생하는 대표적 질환 또는 현상이다. 세포노화의 경우 노화된 세포가 신체조직과 장기 등에 축적되고 이는 만성 염증반응이 생기는 환경은 물론 주변조직과 세포도 쉽게 손상시킨다. 결국 생체조직의 재생능력이 떨어져 치매, 당노병, 퇴행성 관절염 같은 퇴행성 질환도 유발된다. 본 발명은 "게놈 서열 변이를 가지는 세포"를 선택적으로 사멸시키는 방법을 제공한다. 따라서, "게놈 서열 변이를 가지는 세포"로부터 유래하는 질환들을 효과적으로 치료할 수 있다.
암세포는 돌연변이 축적에 의하여 발생하는데 이러한 과정에서 DNA에 많은 InDel이 만들어지고, 이러한 유전적 변이에 의해 다음의 두 가지 유전적 특징을 구비하면 암세포가 된다. (1) 정상적인 규제를 무시하고 증식하며 (2) 다른 세포를 위해 정상적으로 준비된 영역에 침입하여 대신 자리를 차지한다. 첫번째 특징은 있으나 두 번째 특징이 없는 세포는 과도한 증식은 하지만 한 덩어리로만 남아 있는 종양을 형성한다. 이러한 경우의 종양을 양성(benign)이라고 하며, 이러한 종양은 외과적인 수술에 의해 제거될 수 있다. 그러나, 한 종양이 주변 조직으로 침입하는 능력이 있으면 악성(malignant)이라 불리는 암이 된다. 침투 능력이 있는 악성종양 세포는 1차종양으로부터 떨어져 나와 혈류나 림프관으로 들어가 신체의 다른 부위로 전이(metastasis)되어 2차종양을 형성할 수 있다.
상기 암은 예를 들어, 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 골육종, 담관암 또는 표피암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
모든 암세포에는 정상세포에서 발견되지 않는 새로운 DNA 서열이 삽입되거나 (Insertion: IN), 정상세포의 DNA 일부가 잘려지는 (Deletion: Del) 현상이 다수 관찰되며, 각 암세포마다 특이적으로 삽입/결실된 DNA 서열이 존재할 수 있다.
세포는 DNA 이중나선이 절단되면, 이를 복구하려는 DNA 손상 복구 기작이 있다. 그러나, 이러한 손상 복구 기작은 DNA 이중나선 절단의 수가 적은 경우 효과적으로 복구하나, 그 수가 많아지면 사멸하게 된다. 박테리아의 경우 한 개의 DNA 이중나선 절단으로 박테리아가 사멸될 수 있으나, 동물 세포의 경우 그보다 많은 DSB가 필요하다고 알려져 있다.
본 발명에 따르면, 위 사실을 기초로 게놈 서열 변이를 가지는 세포 예를 들어, 암세포의 InDel을 찾아내어 이를 인식할 수 있는 절단인자를 제작하고, 핵산절단효소를 이용하여 게놈 서열 변이를 가지는 세포 예를 들어, 암세포 등을 특이적으로 사멸하도록 유도할 수 있다.
노화의 경우, 노화된 세포에서 DNA 손상이 축적되어 있다는 것과 DNA 복구활성이 감소되어 있으나, 노화된 세포에서 DNA 손상이 많을 것이고 이런 손상을 치료하기 위해 복구가 활발하게 진행되어야 하지만, 노화된 세포와 조직에서 특히 이중가닥절단 복구가 감소되어 있고 DNA 변이가 많이 관찰된다.
세포노화 (cellular senescence)의 경우 DNA 손상 등에 의한 유전체의 불안정성이 주요한 노화 경로이다. DNA 손상이 발생하면 중요한 유전자가 망가지거나 전사 조절 과정 등이 변화하여 특정한 생화학적 경로에 관여하는 단백질의 생산과 기능에 문제가 발생하고 세포의 정상적인 기능이 파괴될 수 있다. 이러한 세포가 제거되지 않고 축적된다면, 단일 세포의 망가짐에서 끝나지 않고 개체 전체의 항상성을 위태롭게 할 수도 있다.
정상세포에서 발견되지 않는 새로운 DNA 서열이 삽입되거나 (Insertion: IN), 정상세포의 DNA 일부가 잘려지는 (Deletion: Del) 현상이 다수 관찰되며, 각 노화세포마다 특이적으로 삽입/결실된 DNA 서열이 존재할 수 있다.
본 발명에 따르면, 위 사실을 기초로 게놈 서열 변이를 가지는 세포 예를 들어, 노화세포의 InDel을 찾아내어 이를 인식할 수 있는 절단인자를 제작하고, 핵산절단효소를 이용하여 게놈 서열 변이를 가지는 세포 예를 들어, 노화세포 등을 특이적으로 사멸하도록 유도할 수 있다.
노화세포(senescent cells)를 선택적으로 제거함으로써 노화와 관련된 특성을 완화할 수 있다. 세포노화의 표지자 역할을 하는 p16 프로모터에 세포사멸 유전자를 발현시킴으로써 노화된 세포를 선택적으로 사멸시켰을 때 그 조직의 기능을 살펴보니 노화와 관련되어 나타나는 특성의 완화가 일어남을 확인하였다. 쥐를 이용한 모델에서 조기에 노화된 세포를 제거함으로써 대표적인 노화 표현형인 백내장과 근육소실이 발생하지 않았으며 운동능력도 더 뛰어남을 연구결과로 얻었다 (Baker, D. J., T, (2011) Nature 479:232-236).
면역질환의 경우, 포유류의 림프구세포에는 B-cell receptor, T-cell receptor가 존재하는데 이들은 V(D)J recombination 과정을 통해 variable(V), diversity(D), joining(J) 유전자들이 혼합되면서 이를 통해 다양한 종류의 항원들을 인식할 수 있다. 이 과정에서 이중 가닥 절단이 일어나는데 이를 조절하는 단백질들이 결여될 시 V(D)J recombination 과정이 제대로 작동할 수 없게 됨으로써, 면역결핍, 신경결함 등 여러 질병들이 나타나게 된다.
정상세포에서 발견되지 않는 새로운 DNA 서열이 삽입되거나 (Insertion: IN), 정상세포의 DNA 일부가 잘려지는 (Deletion: Del) 현상이 다수 관찰되며, 각 면역질환 발병 세포마다 특이적으로 삽입/결실된 DNA 서열이 존재할 수 있다.
본 발명에 따르면, 위 사실을 기초로 게놈 서열 변이를 가지는 세포 예를 들어, 면역질환 발병 세포의 InDel을 찾아내어 이를 인식할 수 있는 절단인자를 제작하고, 핵산절단효소를 이용하여 게놈 서열 변이를 가지는 세포 예를 들어, 면역질환 발병 세포 등을 특이적으로 사멸하도록 유도할 수 있다.
심혈관 질환과 관련하여, 예를 들어 심부전증은 심장의 펌프기능이 약해졌을 때 발생하는 질환으로 현재까지 심부전환자에서 심부전과 당뇨병 및 인슐린 저항성간의 연관관계가 있다는 것이 알려져 있다. 또한 심부전증에는 심장조직과 내장지방에서 DNA 손상이 축적된다고 알려져 있는데, 이는 지방조직의 염증반응과 인슐린 저항성으로 인해 일어나는 것이라 알려져 있다. 실제로 쥐에 고칼로리 음식을 주었을 때 많은 지방산이 지방조직으로 유입되어 ROS의 과량생성을 야기하고 그로 인해 DNA 손상이 축적되는 것과 또한 p53이 지방조직의 염증반응과 인슐린 저항성에 관여한다는 것이 밝혀졌다. 이렇게 과도한 지방의 분해는 신경계에서 산화적 스트레스를 유도하고 이는 DNA 손상과 지방조직의 p53 의존적인 염증반응을 유도한다. 이밖에도 아테롬성동맥경화증(atherosclerosis)의 초기, 병기진행에서 DNA 손상이 축적된다고 보고되었다. 더불어 DNA 손상은 플라크(plaque)의 레벨을 증가시키고 이 플라크의 레벨증가는 동맥경화로 이어진다는 보고도 있다. 이는 동맥경화에서도 DNA 손상이 중요한 역할을 할 수 있다.
"게놈 서열 변이를 가지는 세포"에서 유래하는 질환들은 대부분 DNA repair나 DNA damage response의 결핍에 의해 야기된다. 대표적인 질환으로는 Aicardi-Goutieres syndrome (뇌의 위측증과 근육이상), 근육위축성측삭경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis 4; ALS4, 신경세포의 퇴화), Meier-Gorlin Syndrome (소뇌증, 무릎뼈의 이상), Seckel syndrome (혈구수가 줄어드는 질병), Schimke immune-osseous dysplasia (작은키, 소뇌증, 신장이상, 면역결핍, 등이 휘는 질현), 혈관확장성운동실조증 (Ataxia telangiectasia; 모세혈관확장성증, 면역체계이상, 백혈병), 니즈메겐절단증후군 (면역체계이상, 림프종 발생), 블룸증후군 (피부발진에 의한 혈관 확장, 피부 색소 이상, 면역계 이상, 폐질환), 워너증후군 (빠른 노화), 로스문더-톰슨증후군 (피부이상, 붉은 반점, 혈관확장, 백내장), 판코니빈혈증 (빈혈, 혈소판 감소, 백혈병증가), 색소성건피증 (태양광 민감성, 피부암, 색소증), 코케인증후군 (소과증, 왜소증, 태양광 민감성), 린치증후군 (대장암), 가족성선종폴립증 (대장암, 직장암 증가) 등이 있다. 이러한 질병의 환자들은 많은 게놈 서열 변이를 가지는 세포를 만들게 되고, 이를 통해 각 기관에서 다양한 질환이 야기된다.
정상세포에서 발견되지 않는 새로운 DNA 서열이 삽입되거나 (Insertion: IN), 정상세포의 DNA 일부가 잘려지는 (Deletion: Del) 현상이 다수 관찰되며, 심혈관 질환 발병 세포마다 특이적으로 삽입/결실된 DNA 서열이 존재할 수 있다.
본 발명에 따르면, 위 사실을 기초로 게놈 서열 변이를 가지는 세포 예를 들어, 심혈관 질환 발병 세포의 InDel을 찾아내어 이를 인식할 수 있는 절단인자를 제작하고, 핵산절단효소를 이용하여 게놈 서열 변이를 가지는 세포 예를 들어, 심혈관 질환 발병 세포 등을 특이적으로 사멸하도록 유도할 수 있다.
유전적 변이세포에 특이적으로 존재하는 InDel은 정상세포와 Genome sequence를 분석하여 서로 다른 InDel을 찾을 수 있다. 염기서열 분석에는 Whole Genome sequnece를 비교할 수 있고, 경우에 따라서는 특정의 염색체만 선택하여 염기서열을 분석비교할 수 있다.
경우에 따라서, InDel 선별시 암세포는 WGS하지 않고, 알려진 WGS를 쓸 경우 정상세포에는 존재하지 않는 InDel만 검증할 수 있다. 향후 환자의 암세포에서 많은 InDEL을 발견하게 될 때, 공통적으로 나타나는 InDEL이 존재할 수 있다. 이러한 경우 공통적으로 나타나는 InDEL만을 PCR등으로 암세포에서 관찰하고, 타깃 조성물에 포함시키는 전략이 포함될 수 있다. 또한, WGS을 하여 InDel을 검출하는 것이 현재 가장 효과적인 방법이지만, subtraction hybridization (정상세포의 DNA와 암세포의 DNA를 denaturation시키고, 다시 hybridization시키는 것을 통해, 서로 결합하지 않는 부위를 InDel로 찾아내는 방식)도 가능하다. 따라서, WGS를 포함한 InDel을 찾아낼 수 있는 다양한 방법을 이용하여 유전자변형 세포의 특이적 InDel을 발견해 내는 방식을 이용할 수 있다.
2. 변이영역
하나의 실시예에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 세포사멸을 유도하기에 충분한 타겟에 해당하는 서로 다른 4개 이상일 수 있다. 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 예를 들어 서로 다른 30개 이하일 수 있다. 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 예를 들어, 서로 다른 각각의 4-30개일 수 있다.
상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 구체적으로 서로 다른 각각의 4-30개, 구체적으로 5-30개, 5-29개, 5-28개, 5-27개, 5-26개, 5-25개, 5-24개, 5-23개, 5-22개, 5-21개, 5-20개, 5-19개, 5-18개, 5-17개, 5-16개, 5-15개, 5-14개, 5-13개, 5-12개, 5-11개, 5-10개, 6-30개, 6-29개, 6-28개, 6-27개, 6-26개, 6-25개, 6-24개, 6-23개, 6-22개, 6-21개, 6-20개, 6-19개, 6-18개, 6-17개, 6-16개, 6-15개, 6-14개, 6-13개, 6-12개, 6-11개, 6-10개, 7-30개, 7-29개, 7-28개, 7-27개, 7-26개, 7-25개, 7-24개, 7-23개, 7-22개, 7-21개, 7-20개, 7-19개, 7-18개, 7-17개, 7-16개, 7-15개, 7-14개, 7-13개, 7-12개, 7-11개, 7-10개, 8-30개, 8-29개, 8-28개, 8-27개, 8-26개, 8-25개, 8-24개, 8-23개, 8-22개, 8-21개, 8-20개, 8-19개, 8-18개, 8-17개, 8-16개, 8-15개, 8-14개, 8-13개, 8-12개, 8-11개, 8-10개, 9-30개, 9-29개, 9-28개, 9-27개, 9-26개, 9-25개, 9-24개, 9-23개, 9-22개, 9-21개, 9-20개, 9-19개, 9-18개, 9-17개, 9-16개, 9-15개, 9-14개, 9-13개, 9-12개, 9-11개, 9-10개, 10-30개, 10-29개, 10-28개, 10-27개, 10-26개, 10-25개, 10-24개, 10-23개, 10-22개, 10-21개, 10-20개, 10-19개, 10-18개, 10-17개, 10-16개, 10-15개, 10-14개, 10-13개, 10-12개, 10-11개, 11-30개, 11-29개, 11-28개, 11-27개, 11-26개, 11-25개, 11-24개, 11-23개, 11-22개, 11-21개, 11-20개, 11-19개, 11-18개, 11-17개, 11-16개, 11-15개, 11-14개, 11-13개, 11-12개, 12-30개, 12-29개, 12-28개, 12-27개, 12-26개, 12-25개, 12-24개, 12-23개, 12-22개, 12-21개, 12-20개, 12-19개, 12-18개, 12-17개, 12-16개, 12-15개, 12-14개, 12-13개, 13-30개, 13-29개, 13-28개, 13-27개, 13-26개, 13-25개, 13-24개, 13-23개, 13-22개, 13-21개, 13-20개, 13-19개, 13-18개, 13-17개, 13-16개, 13-15개, 13-14개, 14-30개, 14-29개, 14-28개, 14-27개, 14-26개, 14-25개, 14-24개, 14-23개, 14-22개, 14-21개, 14-20개, 14-19개, 14-18개, 14-17개, 14-16개, 14-15개, 15-30개, 15-29개, 15-28개, 15-27개, 15-26개, 15-25개, 15-24개, 15-23개, 15-22개, 15-21개, 15-20개, 15-19개, 15-18개, 15-17개, 15-16개일 수 있다.
상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 구체적으로, 서로 다른 각각의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 (숫자 사이의 범위도 포함)일 수 있다.
변이가 존재하는 위치가 포함된 게놈은 세포에서 이배체 (diploid) 및/또는 삼배체 (triploid)일 수 있으므로, 서로 다른 각각의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 (숫자 사이의 범위도 포함) 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30쌍의 변이영역을 고려하여, 서로 다른 4-60개 예를 들어, 서로 다른 60개, 59개, 58개, 57개, 4-56개, 55개, 54개, 53개, 52개, 51개, 50개, 49개, 48개, 47개, 46개, 45개, 44개, 43개, 42개, 41개, 40개, 39개, 38개, 37개, 36개, 35개, 34개, 33개, 32개, 31개, 30개, 29개, 28개, 27개, 26개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개 또는 4개 (숫자 사이의 범위도 포함)의 이중가닥절단(Double-stranded break, DSB)을 유도하여 세포를 사멸시킬 수 있다.
상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 핵산 서열로 예를 들어, 코딩 또는 비코딩 핵산일 수 있다. 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역의 핵산은 코딩 핵산일 수 있고, 게놈(genome)으로부터 전사되어 단백질로 번역될 수 있다. 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역의 핵산은 비코딩 핵산일 수 있고, 게놈으로부터 전사되어 단백질로 번역되지 않는다.
본 발명에 따른 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 변이는 정상세포에서 발견되지 않을 수 있다. 이러한 변이는 게놈 서열 변이를 가지는 세포와 정상세포를 WGS (whole genome sequencing)하여 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역의 서열 예를 들어, 서열의 삽입, 결실, 치환로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 서열의 매핑은 WGS (whole genome sequencing), 또는 차감 혼성화 (subtractive hybridization) 및 시퀀싱의 방법을 통하여 수행될 수 있고, 이 때 도출된 InDel의 경우 암에서 발견된 삽입의 경우에는 바로 가이드 RNA를 제작하고, 결실의 경우에는 절단 지점 (break point)을 매핑한 후에 절단 지점을 포함하는 가이드 RNA를 제작하여 사용할 수 있다.
WGS는 차세대 시퀀싱 (next generation sequencing)에 의한 전장 유전체 시퀀싱을 10 X, 20 X, 40 X 형식으로 여러 배수로 유전체를 읽는 방법을 의미한다. "차세대 시퀀싱"은 칩 (Chip) 기반, 그리고 PCR 기반 페어드 엔드 (paired end) 형식으로 전장 유전체를 조각내고, 상기 조각을 화학적인 반응 (hybridization)에 기초하여 초고속으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미한다.
차감 혼성화는 여러 조직 또는 세포 간에 발현의 차이가 있는 유전자의 클로닝에 이용되는 방법이다. 시험하는 세포의 DNA 시료 특이적 유전자가 검출될 수 있다. 시험하는 세포의 DNA를 한 가닥 DNA로 변성시킨 후에 어닐링(annealing)시킨다. 어닐링 조건을 조절함으로써, 시험하는 세포 특이적 DNA 서열을 2 가닥 DNA로 분리할 수 있다.
게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역의 핵산 서열은 예를 들어, 해당 서열을 타겟으로 하여 핵산절단효소에 의해 핵산 서열 내 DNA의 DSB가 일어나는 유전자 부위를 의미하는 것으로, 핵산 서열 내 핵산절단효소가 특이적으로 인식하는 서열 예를 들어 핵산절단효소가 Cas9인 경우 Cas9 단백질이 인식하는 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 약 17bp 내지 23bp 길이의 핵산 서열을 의미할 수 있다.
게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역의 서열을 특이적으로 인식하는 가이드 RNA는 PAM 서열이 위치하는 DNA 가닥의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로, 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 결합 가능하다.
게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역의 서열은 해당 서열 부위의 두 개의 DNA 가닥 중 PAM 서열이 위치하는 가닥의 핵산 서열로 표시된다. 이 때, 실제로 가이드 RNA가 결합하는 DNA 가닥은 PAM 서열이 위치하는 가닥의 상보적 가닥이므로, 상기 가이드 RNA에 포함된 표적화 서열은, RNA 특성상 T를 U로 변경하는 것을 제외하고, InDel을 포함하는 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 갖게 된다.
상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이고, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 고유의 변이 서열을 포함하는 핵산 서열은 서열 내 5'-NGG-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNAGAAW-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이고, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 고유의 변이 서열은 서열 내 5'-NNAGAAW-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
상기 Cas9 단백질이 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNGRRT-3' (N은 A, T, G, 또는 C이고, R은 A 또는 G)이고, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 고유의 변이 서열은 서열 내 5'-NNGRRT-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
상기 Cas9 단백질이 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNNNRYAC-3' (N은 A, T, G, 또는 C이고, R은 A 또는 G 이고, Y는 C 또는 T임)이고, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 고유의 변이 서열은 서열 내 5'-NNNNRYAC-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
3. 절단인자
본 발명에서 절단인자란, 정상세포와 비교하여 게놈 서열 변이를 가지는 세포에서 변이되어 달라진 부분, 즉 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역의 핵산서열을 인식하여 절단할 수 있도록 유도하는 염기서열을 의미한다.
게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역을 특이적으로 인식하는 가이드 RNA는 PAM 서열이 위치하는 DNA 가닥의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로, 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 결합 가능하다.
게놈 서열 변이를 가지는 세포의 InDel을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 예를 들어 가이드 RNA일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 예를 들어, CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로 crRNA와 tracrRNA가 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체, 또는 crRNA 또는 그 일부와 tracrRNA 또는 그 일부가 올리고뉴클레오타이드 링커로 연결된 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.
본 발명의 구체적 실시예에서, crRNA와 tracrRNA가 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA를 절단인자로 사용할 수 있다. crRNA가 표적 부위와 결합된 것을 인식하여 엔도뉴클레아제 기능이 활성화될 수 있다. 경우에 따라서, 절단인자로 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 복수개로, 복수개 각각의 절단인자의 서열이 상이하여 서로 다른 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 정상세포의 염기서열과 비교하여 세포의 사멸을 유도할 수 있는 충분한 복수개의 숫자여야 하고, 서로 다른 서열을 가지는 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 또는 30개 이상일 수 있다. 상기 절단인자는 서로 다른 서열을 가지는 30개 이하, 29개 이하, 28개 이하, 27개 이하, 26개 이하, 25개 이하, 24개 이하, 23개 이하, 22개 이하, 21개 이하, 20개 이하, 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 정상세포의 염기서열과 비교하여 세포의 사멸을 유도할 수 있는 충분한 복수개의 숫자여야 하고, 서로 다른 서열을 가지는 4-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 4-59개, 4-58개, 4-57개, 4-56개, 4-55개, 4-54개, 4-53개, 4-52개, 4-51개, 4-50개, 4-49개, 4-48개, 4-47개, 4-46개, 4-45개, 4-44개, 4-43개, 4-42개, 4-41개, 4-40개, 4-39개, 4-38개, 4-37개, 4-36개, 4-35개, 4-34개, 4-33개, 4-32개, 4-31개, 4-30개, 4-29개, 4-28개, 4-27개, 4-26개, 4-25개, 4-24개, 4-23개, 4-22개, 4-21개, 4-20개, 4-19개, 4-18개, 4-17개, 4-16개, 4-15개, 4-14개, 4-13개, 4-12개, 4-11개, 또는 4-10개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 정상세포의 염기서열과 비교하여 세포의 사멸을 유도할 수 있는 충분한 복수개의 숫자여야 하고, 서로 다른 서열을 가지는 예를 들어, 4-30개, 4-29개, 4-28개, 4-27개, 4-26개, 4-25개, 4-24개, 4-23개, 4-22개, 4-21개, 4-20개, 4-19개, 4-18개, 4-17개, 4-16개, 4-15개, 4-14개, 4-13개, 4-12개, 4-11개, 4-10개, 5-30개, 5-29개, 5-28개, 5-27개, 5-26개, 5-25개, 5-24개, 5-23개, 5-22개, 5-21개, 5-20개, 5-19개, 5-18개, 5-17개, 5-16개, 5-15개, 5-14개, 5-13개, 5-12개, 5-11개, 5-10개, 6-30개, 6-29개, 6-28개, 6-27개, 6-26개, 6-25개, 6-24개, 6-23개, 6-22개, 6-21개, 6-20개, 6-19개, 6-18개, 6-17개, 6-16개, 6-15개, 6-14개, 6-13개, 6-12개, 6-11개, 6-10개, 7-30개, 7-29개, 7-28개, 7-27개, 7-26개, 7-25개, 7-24개, 7-23개, 7-22개, 7-21개, 7-20개, 7-19개, 7-18개, 7-17개, 7-16개, 7-15개, 7-14개, 7-13개, 7-12개, 7-11개, 7-10개, 8-30개, 8-29개, 8-28개, 8-27개, 8-26개, 8-25개, 8-24개, 8-23개, 8-22개, 8-21개, 8-20개, 8-19개, 8-18개, 8-17개, 8-16개, 8-15개, 8-14개, 8-13개, 8-12개, 8-11개, 8-10개, 9-30개, 9-29개, 9-28개, 9-27개, 9-26개, 9-25개, 9-24개, 9-23개, 9-22개, 9-21개, 9-20개, 9-19개, 9-18개, 9-17개, 9-16개, 9-15개, 9-14개, 9-13개, 9-12개, 9-11개, 9-10개, 10-30개, 10-29개, 10-28개, 10-27개, 10-26개, 10-25개, 10-24개, 10-23개, 10-22개, 10-21개, 10-20개, 10-19개, 10-18개, 10-17개, 10-16개, 10-15개, 10-14개, 10-13개, 10-12개, 10-11개, 11-30개, 11-29개, 11-28개, 11-27개, 11-26개, 11-25개, 11-24개, 11-23개, 11-22개, 11-21개, 11-20개, 11-19개, 11-18개, 11-17개, 11-16개, 11-15개, 11-14개, 11-13개, 11-12개, 12-30개, 12-29개, 12-28개, 12-27개, 12-26개, 12-25개, 12-24개, 12-23개, 12-22개, 12-21개, 12-20개, 12-19개, 12-18개, 12-17개, 12-16개, 12-15개, 12-14개, 12-13개, 13-30개, 13-29개, 13-28개, 13-27개, 13-26개, 13-25개, 13-24개, 13-23개, 13-22개, 13-21개, 13-20개, 13-19개, 13-18개, 13-17개, 13-16개, 13-15개, 13-14개, 14-30개, 14-29개, 14-28개, 14-27개, 14-26개, 14-25개, 14-24개, 14-23개, 14-22개, 14-21개, 14-20개, 14-19개, 14-18개, 14-17개, 14-16개, 14-15개, 15-30개, 15-29개, 15-28개, 15-27개, 15-26개, 15-25개, 15-24개, 15-23개, 15-22개, 15-21개, 15-20개, 15-19개, 15-18개, 15-17개, 15-16개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 6-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 6-59개, 6-58개, 6-57개, 6-56개, 6-55개, 6-54개, 6-53개, 6-52개, 6-51개, 6-50개, 6-49개, 6-48개, 6-47개, 6-46개, 6-45개, 6-44개, 6-43개, 6-42개, 6-41개, 6-40개, 6-39개, 6-38개, 6-37개, 6-36개, 6-35개, 6-34개, 6-33개, 6-32개, 6-31개, 6-30개, 6-29개, 6-28개, 6-27개, 6-26개, 6-25개, 6-24개, 6-23개, 6-22개, 6-21개, 6-20개, 6-19개, 6-18개, 6-17개, 6-16개, 6-15개, 6-14개, 6-13개, 6-12개, 6-11개, 또는 6-10개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 8-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 8-59개, 8-58개, 8-57개, 8-56개, 8-55개, 8-54개, 8-53개, 8-52개, 8-51개, 8-50개, 8-49개, 8-48개, 8-47개, 8-46개, 8-45개, 8-44개, 8-43개, 8-42개, 8-41개, 8-40개, 8-39개, 8-38개, 8-37개, 8-36개, 8-35개, 8-34개, 8-33개, 8-32개, 8-31개, 8-30개, 8-29개, 8-28개, 8-27개, 8-26개, 8-25개, 8-24개, 8-23개, 8-22개, 8-21개, 8-20개, 8-19개, 8-18개, 8-17개, 8-16개, 8-15개, 8-14개, 8-13개, 8-12개, 8-11개, 또는 8-10개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 10-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 10-59개, 10-58개, 10-57개, 10-56개, 10-55개, 10-54개, 10-53개, 10-52개, 10-51개, 10-50개, 10-49개, 10-48개, 10-47개, 10-46개, 10-45개, 10-44개, 10-43개, 10-42개, 10-41개, 10-40개, 10-39개, 10-38개, 10-37개, 10-36개, 10-35개, 10-34개, 10-33개, 10-32개, 10-31개, 10-30개, 10-29개, 10-28개, 10-27개, 10-26개, 10-25개, 10-24개, 10-23개, 10-22개, 10-21개, 10-20개, 10-19개, 10-18개, 10-17개, 10-16개, 10-15개, 10-14개, 10-13개, 또는 10-12개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 12-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 12-59개, 12-58개, 12-57개, 12-56개, 12-55개, 12-54개, 12-53개, 12-52개, 12-51개, 12-50개, 12-49개, 12-48개, 12-47개, 12-46개, 12-45개, 12-44개, 12-43개, 12-42개, 12-41개, 12-40개, 12-39개, 12-38개, 12-37개, 12-36개, 12-35개, 12-34개, 12-33개, 12-32개, 12-31개, 12-30개, 12-29개, 12-28개, 12-27개, 12-26개, 12-25개, 12-24개, 12-23개, 12-22개, 12-21개, 12-20개, 12-19개, 12-18개, 12-17개, 12-16개, 12-15개, 12-14개, 또는 12-13개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 서로 다른 서열을 가지는 14-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 14-59개, 14-58개, 14-57개, 14-56개, 14-55개, 14-54개, 14-53개, 14-52개, 14-51개, 14-50개, 14-49개, 14-48개, 14-47개, 14-46개, 14-45개, 14-44개, 14-43개, 14-42개, 14-41개, 14-40개, 14-39개, 14-38개, 14-37개, 14-36개, 14-35개, 14-34개, 14-33개, 14-32개, 14-31개, 14-30개, 14-29개, 14-28개, 14-27개, 14-26개, 14-25개, 14-24개, 14-23개, 14-22개, 14-21개, 14-20개, 14-19개, 14-18개, 14-17개, 14-16개, 또는 14-15개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 16-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 16-59개, 16-58개, 16-57개, 16-56개, 16-55개, 16-54개, 16-53개, 16-52개, 16-51개, 16-50개, 16-49개, 16-48개, 16-47개, 16-46개, 16-45개, 16-44개, 16-43개, 16-42개, 16-41개, 16-40개, 16-39개, 16-38개, 16-37개, 16-36개, 16-35개, 16-34개, 16-33개, 16-32개, 16-31개, 16-30개, 16-29개, 16-28개, 16-27개, 16-26개, 16-25개, 16-24개, 16-23개, 16-22개, 16-21개, 16-20개, 16-19개, 16-18개, 또는 16-17개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 18-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 18-59개, 18-58개, 18-57개, 18-56개, 18-55개, 18-54개, 18-53개, 18-52개, 18-51개, 18-50개, 18-49개, 18-48개, 18-47개, 18-46개, 18-45개, 18-44개, 18-43개, 18-42개, 18-41개, 18-40개, 18-39개, 18-38개, 18-37개, 18-36개, 18-35개, 18-34개, 18-33개, 18-32개, 18-31개, 18-30개, 18-29개, 18-28개, 18-27개, 18-26개, 18-25개, 18-24개, 18-23개, 18-22개, 18-21개, 18-20개, 또는 18-19개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 20-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 20-59개, 20-58개, 20-57개, 20-56개, 20-55개, 20-54개, 20-53개, 20-52개, 20-51개, 20-50개, 20-49개, 20-48개, 20-47개, 20-46개, 20-45개, 20-44개, 20-43개, 20-42개, 20-41개, 20-40개, 20-39개, 20-38개, 20-37개, 20-36개, 20-35개, 20-34개, 20-33개, 20-32개, 20-31개, 20-30개, 20-29개, 20-28개, 20-27개, 20-26개, 20-25개, 20-24개, 20-23개, 20-22개, 또는 20-21개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 22-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 22-59개, 22-58개, 22-57개, 22-56개, 22-55개, 22-54개, 22-53개, 22-52개, 22-51개, 22-50개, 22-49개, 22-48개, 22-47개, 22-46개, 22-45개, 22-44개, 22-43개, 22-42개, 22-41개, 22-40개, 22-39개, 22-38개, 22-37개, 22-36개, 22-35개, 22-34개, 22-33개, 22-32개, 22-31개, 22-30개, 22-29개, 22-28개, 22-27개, 22-26개, 22-25개, 22-24개, 또는 22-23개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 24-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 24-59개, 24-58개, 24-57개, 24-56개, 24-55개, 24-54개, 24-53개, 24-52개, 24-51개, 24-50개, 24-49개, 24-48개, 24-47개, 24-46개, 24-45개, 24-44개, 24-43개, 24-42개, 24-41개, 24-40개, 24-39개, 24-38개, 24-37개, 24-36개, 24-35개, 24-34개, 24-33개, 24-32개, 24-31개, 24-30개, 24-29개, 24-28개, 24-27개, 24-26개, 또는 24-25개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 26-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 26-59개, 26-58개, 26-57개, 26-56개, 26-55개, 26-54개, 26-53개, 26-52개, 26-51개, 26-50개, 26-49개, 26-48개, 26-47개, 26-46개, 26-45개, 26-44개, 26-43개, 26-42개, 26-41개, 26-40개, 26-39개, 26-38개, 26-37개, 26-36개, 26-35개, 26-34개, 26-33개, 26-32개, 26-31개, 26-30개, 26-29개, 26-28개, 또는 26-27개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 28-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 28-59개, 28-58개, 28-57개, 28-56개, 28-55개, 28-54개, 28-53개, 28-52개, 28-51개, 28-50개, 28-49개, 28-48개, 28-47개, 28-46개, 28-45개, 28-44개, 28-43개, 28-42개, 28-41개, 28-40개, 28-39개, 28-38개, 28-37개, 28-36개, 28-35개, 28-34개, 28-33개, 28-32개, 28-31개, 28-30개, 또는 28-29개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 30-60개 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 30-59개, 30-58개, 30-57개, 30-56개, 30-55개, 30-54개, 30-53개, 30-52개, 30-51개, 30-50개, 30-49개, 30-48개, 30-47개, 30-46개, 30-45개, 30-44개, 30-43개, 30-42개, 30-41개, 30-40개, 30-39개, 30-38개, 30-37개, 30-36개, 30-35개, 30-34개, 30-33개, 30-32개, 또는 30-31개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 또는 4개 포함할 수 있다 (숫자 사이의 범위도 포함).
상기 절단인자는 예를 들어, 5-30개일 수 있다. 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개를 포함할 수 있다. 상기 절단인자는 정상세포의 염기서열과 비교하여 세포의 사멸을 유도할 수 있는 충분한 숫자여야 하고, 서로 다른 서열을 가지는 4-30개일 수 있다. 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개를 포함할 수 있다.
절단인자가 타겟하는 염색체가 이배체 (diploid) 및/또는 삼배체 (triploid)인지 여부에 따라, 각 절단인자가 타겟하는 서열을 2개 및/또는 3개 포함할 수 있다. 따라서, 절단인자에 의해 유도되는 이중 가닥 절단 (DSB)는 세포의 사멸을 유도할 수 있는 절단인자 수의 2배 및/또는 3배일 수 있다. 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 5개의 절단인자를 포함하는 경우 세포사멸을 위해 10개 내지 15개의 이중 가닥 절단 (DSB)이 필요하다.
상기 가이드 RNA는 다음과 같은 단계를 통해 제작할 수 있다: 게놈 서열 변이를 가지는 세포와 일반 세포의 WGS 결과 데이터를 비교하여 게놈 서열 변이를 가지는 세포 고유의 변이서열을 찾는다. 이를 바탕으로 가이드 RNA 제작 조건에 충족한 게놈 서열 변이를 가지는 세포 고유의 변이서열 특이적인 가이드 RNA를 설계한다. 그 후 게놈 서열 변이를 가지는 세포 고유의 변이 사이트의 길이를 고려하여 임의적 순위를 부여하고 모든 염색체(chromosome)에 골고루 가이드 RNA가 설계될 수 있도록 하여 최종 가이드 RNA 조합을 완성한다.
가이드 RNA 제작 조건은 다음과 같다. (a) PAM 사이트를 제외한 가이드 RNA의 염기 서열 길이는 20염기(base pair)이다. (b) 가이드 RNA에 존재하는 구아닌(guanine)과 시토신 (cytosine)의 합 비율이 40%에서 60% 사이이다. (c) 게놈 서열 변이를 가지는 세포 고유의 변이서열이 PAM 사이트 근처 바로 앞 영역에 존재한다. (d) 최대 단일 중합체 (homopolymer) 길이가 4염기(base pair) 이하이다. (e) 정상세포의 WGS 결과 데이터에 하나의 불일치(mismatch)를 허용하는 매핑 했을 때, 매핑 결과가 없어야 한다.
세포주 특이적인 InDel을 WGS를 통해 전장유전체 해독하여 확인한 이후, 해당 영역을 강하게 결합하는 PAM 사이트 영역에 포함하도록 가이드 RNA를 설계한다. 설계된 가이드 RNA는 정상을 대표하는 인간 표준 유전체에 확인하여 비특이적 반응이 없음을 확인한다. 그 이후 InDel 사이트의 길이를 고려하여 임의적 순위를 부여하고 이를 바탕으로 모든 염색체(chromosome)에 골고로 가이드 RNA 가 설계될 수 있도록 하여 최종 가이드 RNA 조합을 완성한다. 가이드 RNA 숫자는 게놈 서열 변이를 가지는 세포의 종류 및 DSB를 일으키는 실험 방법에 따라 조정 가능하다.
4. 핵산절단효소
이러한 DNA 이중나선 절단의 수단인 핵산절단효소는 제한효소 (restriction enzyme), ZNFN (zinc finger nuclease), TALEN(transcriptional activator-like effector nuclease) 또는 Cas 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Cas 단백질은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas14, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, CsMT2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 또는 Csf4의 엔도뉴클레아제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 Cas 단백질은 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 피리팩터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus: Streptococcus pyogenes), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라즈마(Mycoplasma), 박터로이드(Bacteroides), 플라비플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파비바큐럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus: Staphylococcus aureus), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 코리네박터리움(Corynebacterium) 및 캠필로박터(Campylobacter)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Cas 단백질의 오소로그(ortholog)를 포함하는 미생물 속으로부터 유래하고, 이들로부터 단순 분리된 것 또는 재조합된 것일 수 있다.
5. 전달수단
게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 서열 중 정상세포에는 존재하지 않는 고유 서열을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 전달 수단을 포함할 수 있다.
상기 전달 수단과 관련하여, 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일 또는 상이한 전달 수단에 위치할 수 있다.
유적적 변이 세포를 선택적으로 사멸시키는 데 있어 발생하는 대표적 부작용은 OFF-Target 효과이다. 이는 정상 세포의 DNA 서열을 유전적 변이세포의 InDel로 잘 못 인식하여 절단하는 경우에 발생할 수 있다. 이러한 오류를 줄이기 위해서는 InDel의 서열 길이가 길게하는 것이 바람직하다. CAS9 의 경우 보통 17-21개의 서열길이의 가이드 RNA를 탑재할 수 있다.
이러한 OFF-타겟 효과와 함께 세포내 다량의 형질도입에 따른 부작용 즉, 독성효과를 낮추기 위해서 그 세포 사멸 유도용 조성물의 투여량을 최소화할 필요가 있다. 최근 유전자 치료의 발전으로 유전자를 세포에 도입하는 여러 방법이 개발되었다. 그리고, 유전자를 도입하는 여러 방법 중 viral vector를 사용하는 방법의 도입은 인체에서 해롭지 않게 도입하는 유전자를 delivery하기 위한 독성여부도 활발히 연구되었다. 이러한 연구는 세포에 도입되는 효소의 숫자를 줄이는 식의 방법으로도 달성될 수 있다. 이는 유도용 조성물이 RNP복합체인 경우에는 RNP 복합체의 투여량을 최소화해야 하거나 유도용 조성물이 벡터를 활용하여 형질전환시키는 것이라면 벡터의 투여량이 최소화되는 것을 의미한다.
i) 첫 번째의 경우 RNP복합체의 절단효소가 다수개의 절단인자를 발현할 수 있다면 투입되는 RNP 복합체의 개수를 줄일 수 있다. 특히, CAS12, CASΦ의 경우는 가이드 RNA 복수개를 하나의 라인으로 집어 넣을 수 있어 복수개의 절단인자를 하나의 RNP 복합체에 포함시킬 수 있다.
ii) 두 번째의 경우에는, 벡터에 복수개의 절단인자를 발현시키는 가이드 RNA를 포함시키면 된다.
위와 같은 방법을 활용할 경우 세포사멸 유도용 조성물의 투여량을 줄여 독성효과를 줄일 수 있는 효과가 획득된다. 이와 더불어, 이와 같은 발명의 경우 각각의 세포에 도입되는 절단인자들이 동일하므로 세포사멸 작용의 uniformity를 높힐 수 있는데 아래에 상술한다.
만일 절단인자 a, b, c, d, e, f 총 5개 세포사멸에 필요하다면 각각의 절단인자에 대응하는 절단효소(A)가 세포에 전부 투여하거나 형질 전환되어야 한다. 어떤 세포에 절단효소가 5개 투입되었다하더라도, 모든 절단인자가 투입되지 않아 세포사멸로 귀결되지 않을 수 있다. 이런 경우 세포사멸을 확실히 일으키기 위해 세포에 도입되는 절단효소의 평균적 개수가 5개 이상으로 과도하게 투입될 필요가 있다. 만일 a, b, c, d, e, f를 절단인자로 인식하는 절단효소를 활용하는 경우 그 효소 하나만 세포에 투입되더라도 세포사멸은 이루어질 것이다. 마찬가지로 5개의 다른 종의 벡터를 활용하지 않고 5개의 절단인자를 발현하는 벡터 하나만 세포에 투입되더라도 그 세포는 충분히 사멸시킬 수 있다. 따라서, 본 발명을 통하여 세포내 투입되어 발현되는 절단효소의 양을 줄여 독성을 효과적으로 줄이고, 세포사멸 효과의 정확도 또는 uniformity를 대폭 향상 시킬 수 있다. 이러한 것을 가능하게 하는 CAS12, CASΦ의 사용이 효과를 높일 것으로 생각된다 (Science (2020) 369:333).
또한, viral delivery외에 nanoparticle을 이용하여 RNP복합체를 delivery하는 방법을 사용하여 세포 사멸을 유도할 수 있다. nanoparticle을 이용하는 경우에는 nanoparticle 바깥쪽에 암세포에 특이적으로 결합하는 peptide를 결합하여 정상세포에 야기될 수 있는 부작용을 최소화 할 수 있다. 암세포 특이 targeting 하는 RPARPAR peptide등과 같은 것을 포함하여 사용할 수 있다 (Sugahara et al., Cancer Cell (2009) 16:510-520).
상기 전달수단은 예를 들어 바이러스 전달수단일 수 있다. 바이러스 전달수단은 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 예를 들어, Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV) 또는 Retroviral Vector (RV)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전달수단은 예를 들어 비바이러스 전달수단일 수 있다. 비바이러스 전달수단은 예를 들어, 바이러스 레플리콘을 포함하는 에피좀 벡터를 포함할 수 있다. 비바이러스 전달수단은 mRNA 형태의 전달, RNP (Ribonucleoprotein) 또는 캐리어에 의한 전달을 포함할 수 있다. mRNA 형태의 전달로 synthetic modified mRNA 또는 self-replicating RNA (srRNA)를 포함할 수 있다. 캐리어로, 나노입자, 세포투과 펩타이드 (CPP) 또는 중합체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 전달 수단은 예를 들어, 벡터를 포함할 수 있다. "벡터"는 핵산 분자로서 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어, 단일-가닥, 이중-가닥 또는 부분적 이중-가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단, 비 자유 말단(예를 들어, 환형)을 포함하는 핵산 분자; DNA, RNA 또는 이 둘 모두를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에 공지된 다른 다양한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
예를 들어, 상기 벡터는 "플라스미드"이며, 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 것으로서, 여기에 예컨대, 표준 분자 클로닝 기법에 의해 추가적인 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 바이러스 전달 수단은 예를 들어, 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 예를 들어, Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV) 또는 Retroviral Vector (RV)를 포함할 수 있다 (Acta Biochim Pol. 2005, 52(2): 285-291. 및 Biomolecules. 2020 Jun, 10(6): 839.).
바이러스 벡터의 경우, 바이러스-유도된 DNA 또는 RNA 서열은 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)에서는 바이러스 내로 패키징하기 위한 벡터에 존재한다. 바이러스 벡터는 숙주세포 내로의 형질감염을 위한 바이러스에 의해 운반된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
경우에 따라서, 벡터는 도입되는 숙주세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 Ori을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주세포 내로 도입시 숙주세포의 게놈으로 통합되어, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다.
특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 재조합 DNA 기술에서 유용한 일반적인 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다.
재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 핵산을 포함할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현을 위해 사용되도록 즉, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게-연결되도록 숙주세포를 기반을 선택될 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함함을 의미한다.
재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주세포 내로 도입되는 경우 숙주세포에서) 조절 요소에 연결됨을 의미한다.
"조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 기타 발현 조정 요소(예를 들어, 전사 종결 신호 예컨대, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)을 포함할 수 있다. 조절 요소는 많은 유형의 숙주세포에서 뉴클레오티드 서열의 유도 또는 항상 발현을 지시하는 요소 및 특정 숙주세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 요소(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)를 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 요망되는 관심 조직 예컨대, 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 기관(예를 들어, 간, 췌장), 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 지시할 수 있다. 조절 요소는 또한 조직 또는 세포-유형 특이적일 수 있거나 아닐 수 있는 세포-주기 의존성 또는 발달 단계-의존적 방식과 같은 일시적-의존적 방식으로 발현을 지시할 수 있다.
경우에 따라서 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터, 하나 이상의 pol II 프로모터, 하나 이상의 pol I 프로모터, 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예는 비제한적으로 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. pol II 프로모터의 예는 비제한적으로, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(임의로 RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐)(예를 들어, Boshart et al(1985) Cell 41:521-530), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함한다.
"조절 요소"에는 인핸서 예를 들어, WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR에서 R-U5' 세그먼트; SV40 인핸서; 및 토끼 β-글로빈의 엑손 2 및 3 사이의 인트론 서열 등이 포함될 수 있다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주세포의 선택, 요망되는 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다. 벡터는 숙주세포 내로 도입되어 본원에 기재된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 전사물, 단백질 또는 펩티드를 생성할 수 있다(예를 들어, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) 전사물, 단백질, 효소, 이의 돌연변이체, 이의 융합 단백질 등). 유익한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하고, 이러한 벡터의 유형은 또한 특정 유형의 세포를 표적화하기 위해 선택될 수 있다.
"폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지된 또는 비공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리머의 어셈블리 전 또는 후에 가능할 수 있다.
벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 본 발명에 따른 핵산절단효소 (예를 들어, 핵산 전사물, 단백질 또는 효소) 및 절단인자의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 핵산절단효소 및 절단인자 전사물은 대장균과 같은 박테리아 세포, 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 세포, 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 경우에 따라서, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관 내에서 전사되고 번역될 수 있다.
벡터는 원핵 생물에서 도입되고 증식될 수 있다. 일부 구현예에서, 원핵생물은 진핵 세포 내로 도입될 벡터의 복사체를 증폭시키기 위해 또는 진핵 세포로 도입될 벡터의 생성에서 중간 벡터로서 사용될 수 있다(예를 들어, 바이러스 벡터 패키징 시스템의 일부로서 플라스미드를 증폭시킴). 원핵생물은 벡터의 복사물을 증폭시키고 하나 이상의 핵산을 발현시키며, 예를 들어 숙주세포 또는 숙주 유기체로 전달하기 위한 하나 이상의 단백질의 공급원을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 원핵생물에서의 단백질의 발현은 항상 또는 유도성 프로모터를 포함하는, 벡터를 갖는 대장균에서 수행될 수 있다.
상기 벡터는 각각 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등을 통해 생체 내 또는 세포 내로 전달될 수 있다.
A. 바이러스 벡터
AAV는 세포 및 동물모델 대상으로 in vivo 유전자 편집에 사용될 수 있다. ITR (역방 말단 반복 서열)을 추가할 수 있다. ITR은 AAV 게놈 및/또는 목적하는 도입 유전자에 위치하여 복제원점으로 작용할 수 있다. Rep 및/또는 cap 단백질이 전사하여 타겟 세포로 전달하기 위한 AAV 게놈을 캡슐화할 수 있도록 캡시드를 형성한다. 이러한 캡시드 상의 표면 수용체가 AAV serotype을 결정한다.
AdV는 이중 DNA 가닥을 유전물질로 하며, 세포 및 동물모델 대상으로 in vivo 유전자 편집에 사용될 수 있다. LV는 random integration 및 insertional mutagenesis로 인해 oncogene으로 integration되는 경우 종양 발생 가능성 높아, in vitro 및 ex vivo로만 사용 가능할 수 있다 (Popescu N.C., Zimonjic D., DiPaolo J.A. Viral integration, fragile sites, and proto-oncogenes in human neoplasia. Hum. Genet. 1990,84:383-386.). RV를 이용하여 유전자 전달을 통한 질병 치료를 임상적으로 시도하였음이 보고된 바 있다 (J. Clin. Investig. 2008,118:3132-3142.).
(1) AAV
AAV는 ssDNA를 유전물질로 포함하며 약 ~4.7 kb의 패키징 용량을 가진다. AAV가 세포 및 동물모델 대상으로 in vivo 유전자 편집시 가장 많이 사용되고 있다 (Viruses 2019, 11, 28, Current Gene Therapy, 2008, 8, 147-161).
AAV의 genome은 선형의 single-strand DNA로 길이는 약 4.7kb이다. AAV genome의 양 말단에는 inverted terminal repeats (ITRs)로 불리는 hairpin 구조가 존재한다. ITR은 AAV genome의 복제와 AAV particle의 packaging에 관여한다.
AAV 기반 벡터는 타겟 세포에서의 형질감염 및 게놈을 핵에 위치시키기 위한 바이러스 기능은 유지하고, AAV의 복제 및 자손 생성능은 결여된 상태이다. AAV는 인간에게는 면역원성이 없는 것으로 알려져 있어 AAV 벡터는 다른 바이러스 전달 시스템에 비해 면역원성이 낮다.
에피좀에 대부분 잔류하며, 암을 생성하지 않는 미토콘드리아 DNA 및 AAVS1 염색체 19에 일부 integration될 수 있다. Non-dividing cells에서 장기간 안정적으로 transgene 발현 가능하다.
특정 조직에서 CRISPR 편집에 적합한 다양한 Serotype이 존재한다. AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 또는 AAV9의 serotype을 포함할 수 있다.
Figure pat00001
AAV는 Packaging Capacity가 ~4.7Kb 정도이므로 transgene 코딩 유전자 패키징에 어려움이 있다. 크기가 큰 핵산절단효소를 사용하는 경우 유전자 치료에서 가장 널리 사용되는 전달 시스템인 AAV의 패키징 한계를 고려하여 적용 가능한 방법을 찾으려는 시도가 있다.
본 발명에 따른 조성물의 효율적 전달을 위해 dual 또는 그 이상의 AAV 시스템을 적용할 수 있다. Dual 또는 그 이상의 AAV 시스템을 제작하기 위한 방법은 예를 들어, fragmented vector, overlapping vector, trans-splicing vector또는 hybrid vector 제작을 포함할 수 있다 (Viruses 2019, 11, 28).
Fragmented vector는 특정 지점에서 transgene을 truncation한 다음 각 단편을 별도의 AAV에 패키징하는 방법으로 제작될 수 있고, 중첩되는 transgene의 HR (homologous recombination)을 통해 완전한 transgene 생산할 수 있다. Overlapping vector는 지정된 overlap을 포함하는 transgene을 통해 HR 유도하는 방법으로 제작될 수 있고, Transgene 말단에 ITR (inverted terminal repeat sequence)를 포함시켜 dual AAV가 세포에 형질감염되면 ITR이 집합되어 HR이 발생할 수 있다. Trans-splicing vector는 overlap을 포함하지 않으나, splice donor/splice acceptor site에 의해 분리된 transgene 단편을 포함하여 제작될 수 있고, Genome의 splicing mechanism에 의해, transgene 단편을 연결시킬 수 있다. Hybrid vector는 overlap 부위 및 splice donor/splice acceptor site 포함하여 overlapping 및 trans-splicing 기능을 조합하여 제작될 수 있고, 목적 transgene 산물은 dual vector가 공동 감염, splice donor/splice acceptor site에 의한 splicing 및 overlapping 부위에 의한 HR을 통해 제조될 수 있다.
AAV 시스템에 효율적으로 적용하기 위해 핵산절단효소를 사용하는 경우 CRISPR/Cas 시스템이 적용될 수 있다. 상기 Cas는 예를 들어, split Cas9, SaCas9, CjCas9, Cas12a 또는 Cas12j 등일 수 있다.
Split Cas9은 1,368 amino acids, 4.10 kbp의 Streptococcus pyogenes 유래 Cas9(SpCas9)을 대상으로 한다. 2개의 AAV 벡터에 2개로 분리된 split SpCas9 각각을 패키징할 수 있다. 다만, 원래의 SpCas9에 비해 활성이 낮아질 수 있다는 단점이 있으며, in vivo에서 2개의 AAV 벡터에 의한 전달 효율이 단일 AAV 벡터에 비해 낮을 수 있다.
SaCas9은 1,053 amino acids, 3.16 kbp의 Staphylococcus aureus Cas9(SaCas9)로, SaCas9를 sgRNA와 함께 단일 AAV에 패키징할 수 있다. 다만, 2개 이상의 sgRNA와 함께 패키징하기에는 공간이 부족할 수 있다. SaCas9에 의해 인지되는 PAM (protospacer-adjacent motif) 서열 5'-NNGRRT-3'은 SpCas9의 PAM 서열인 5'-NGG-3'에 비해 낮은 빈도로 존재하여 타겟 사이트 설정에 제한이 있을 수 있다.
CjCas9은 984 amino acids, 2.95 kbp의 Campylobacter jejuni 유래 Cas9으로 5'-NNNNACAC-3'를 PAM으로 인지할 수 있다.
Cas12a (type-V Cpf1)는 Lachnospiraceae bacterium ND2006 (LbCpf1) 유래 및 Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCpf1) 유래로 구분될 수 있다. 3.9 kb T nucleotide-rich PAM site (5′-TTTV), self-catalysis of crRNA maturation, staggered dsDNA cut 포함하고 non-homologous end joining (NHEJ) 통해 유전자가 삽입될 수 있다. 포유동물 세포에서 SpCas9에 비해 높은 targeting specificity를 가지는 것으로 알려져 있다.
경우에 따라서, 벡터간 트랜스펙션 비율 차이 및 발현율 차이를 최소화하기 위하여 핵산절단효소를 코딩하는 핵산과 절단인자인 가이드 RNA 복수개를 하나의 벡터에 클로닝하여 생체 내 또는 세포 내로 트랜스펙션할 수 있다. 이 때, 핵산절단효소로 Cpf1 (Cas12a)을 포함할 수 있다. 이 경우 단일의 프로모터를 사용하여 crRNA의 발현을 유도할 수 있다.
Cas12a 의한 암 특이적 삽입-결실 표적화 세포사멸 (Cancer specific INsertion-DELetion targeting Apoptosis: CINDELA)을 유도할 수 있다. 이를 통해, 암 세포를 죽일 정도로 벡터 수를 최소화할 수 있다. Cas12a을 암 특이적인 삽입 결실을 표적으로 하고 DNA 이중 가닥 절단을 생성하고, 이를 통해 세포 사멸을 유도하는 데 사용할 수 있다.
Cas12a은 단일 가이드 RNA에 의해 가이드되는 프로그램 가능한 DNA 엔도뉴클레아제이다. CRISPR-Cas9의 경우 각 sgRNA는 일반적으로 개별 벡터 또는 각 sgRNA 자신의 프로모터를 필요로하는 멀티 카세트 벡터에서 발현된다. 대조적으로, Cas12a을 통한 다중 게놈 편집은 Cas12a 자체에 의해 개별 crRNA를 처리하여 하나의 트랜스크립트로 가이드 RNA가 발현될 수 있도록 할 수 있다.
예를 들어, pCE048-SiT-Cas12a 벡터를 사용하여 하나의 벡터로 여러 가이드 RNA를 유도할 수 있다. 벡터 수를 최소화하여 암 세포를 제거하고 암 특이적 삽입-결실 표적화 세포사멸의 효율성을 개선할 수 있다.
Cas12j는 single ~70Kda CasΦ로, Cas9/Cas12a에 비해 분자량이 절반이다. 5' TBN 3' PAM으로 인식 (B는 G, T or C)하고, tracrRNA 없이 crRNA 상보적 DNA를 절단 가능하다. 이러한 특징에 기반하여, compact system을 제공할 수 있다.
국제공개특허 WO2016/176191에 유전질환 치료를 위한 듀얼 벡터 시스템이 기재되어 있다. 벡터 시스템은 AAV 벡터로, Cas9 유전자 포함하는 AAV 벡터 및 하나 이상의 sgRNA 포함 AAV 벡터 포함할 수 있다. 이 때, 상기 Cas9 유전자 포함하는 AAV 벡터와 하나 이상의 sgRNA 포함 AAV 벡터의 포함 비율과 관련하여, sgRNA 포함 AAV 벡터가 Cas9 유전자 포함하는 AAV 벡터를 초과할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 sgRNA 포함 AAV 벡터에 대한 Cas9 유전자 포함하는 AAV 벡터의 비율은 약1:3 내지 약 1:100, 구체적으로 약1:10일 수 있다. 도너 템플릿에 대한 핵산절단효소(예를 들면 Cas9 혹은 Cpf)의 비율은 핵산절단효소가 AAV 벡터 이외의 공급원에 의해 부가적으로 혹은 대체하여 공급되는 경우에도 유지될 수 있는 것으로 기재되어 있으며, 본 발명에도 적용될 수 있다.
AAV의 적용과 관련하여, 미국등록특허 제10577630호에 Guide RNA 및 CRISPR enzyme을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 입자를 통해 포유동물의 간세포 중 목적하는 게놈 로커스에서의 타겟 서열을 편집하여 포유동물을 변형하는 방법이 기재되어 있다. AAV 입자를 타겟 세포에 전달하는 방법을 포함하여, in vivo 타겟 서열 편집함으로써 포유동물을 변환시킬 수 있음이 기재되어 있다. AAV의 패키징 사이즈 고려하여, Guide RNA 및 CRISPR enzyme을 한번에 탑재할 수 있도록, CRISPR enzyme이 SaCas9인 것으로 기재되어 있다. 본 발명에 따른 조성물 및 이의 전달에도 적용될 수 있으며, 참조로 도입될 수 있다.
(2) AdV
AdV는 dsDNA를 유전물질로 포함하며 약 ~35 kbp의 패키징 용량을 가진다. AdV 역시 세포 및 동물모델 대상으로 유전자 편집에 사용될 수 있음이 검증되었다. AdV 기반 벡터는 타겟 세포에서의 형질감염 및 게놈을 핵에 위치시키기 위한 바이러스 기능은 유지하고, AdV의 복제 및 자손 생성능은 결여된 상태이다 (Genes & Diseases Volume 4, Issue 2, June 2017, Pages 43-63).
AdV는 dividing cell 및 non-dividing cell 모두 형질감염 가능하다. 세포 게놈으로 integration되지 않고 염색체 외부에 존재하므로, 본 발명에 따른 조성물과 같이 세포에 벡터 전달시 목적하는 타겟 사이트 이외 원하지 않는 변이가 발생하는 오프타겟 효과 줄일 수 있다.
형질도입 효율을 높이고, 부작용 최소화하기 위해 AdV를 유전자 전달 벡터로 사용하기 위한 최적화 시도가 있었다.
1세대 AdV의 경우 Viral gene E1 제거함으로써, 복제 결함 벡터로 제작되었다. 다만, Viral capsid 및/또는 바이러스 유전자 발현에 의해 여전히 급성 또는 만성 면역반응 발생할 수 있다.
2세대 AdV의 경우 Viral gene E2 및 E4 제거하여 만성 면역반응을 조절하고자 하였다. E2 및 E4 제거에 의해 Packaging capacity ~8kb로 증가할 수 있다.
3세대 AdV의 경우 바이러스 유전자 전부를 제거하고, ITR 및 encapsidation (ψ) 관련 유전자만 포함시킬 수 있다. Packaging capacity ~35 kb로 증가하여 단일 벡터에 핵산절단효소 및 복수의 절단인자를 전부 포함하여 전달 가능할 수 있다. 또한, 만성 면역반응 유도하지 않을 수 있다.
3세대 Adv인 HCAdV (high-capacity adenoviral vectors)를 이용하여 CRISPR/Cas9을 전달할 수 있음이 보고된 바 있다 (Nature Scientific Reports volume 7, Article number: 17113 (2017)). AAV와 달리 CRISPR/Cas9 시스템의 모든 구성이 단일 벡터에 포함될 수 있다. 지속적 또는 유도성 Cas9이 발현될 수 있고 복수의 gRNA 포함할 수 있다. HPV 18 (human papillomavirus 18) oncogene E6, DMD (dystrophin gene causing Duchenne muscular dystrophy) 및 CCR5 (HIV co-receptor C-C chemokine receptor type 5) 타겟 CRISPR/Cas9-HCAdV를 제작하여, CRISPR/Cas9-HCAdV 발현 유닛이 타겟에 전달되고, 목적하는 타겟 위치에 DNA DSB가 유도될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물 및 이의 전달에도 적용될 수 있으며, 참조로 도입될 수 있다.
(3) LV
LV는 Retrovirus ssRNA를 유전물질로 포함하며 약 ~8 kb의 패키징 용량을 가진다. LV를 통해 외부 유전자를 희석없이 dividing cells에 형질감염시킬 수 있다 (Cancer Gene Therapy pp 379-391).
LV의 integrase 활성을 제거하여, 바이러스 게놈이 integration되지 않도록 하고, 이에 영향을 받지 않으면서 transcription 및 pre-integrating complex를 nucleus 인근으로 transport하는 능력은 유지시키고자 하는 시도가 있었다 (IDLV (Integrase-deficient lentiviral vectors), Cell Rep. 2017; 20: 2980-2991). 또한, CRISPR/Cas 시스템 전달과 관련하여 two-lentivirus CRISPR/Cas9 전달을 통해, Functional CRISPR/Cas9 sequences 숙주 게놈으로 integration 이후 Cas9-targeting sgRNA 공동발현 시켜, Cas9 open reading frame (ORF)을 불활성화시키고자 하는 시도가 있었다 (Nat. Commun. 2017; 8: 15334). 본 발명에 따른 조성물 및 이의 전달에도 적용될 수 있으며, 참조로 도입될 수 있다.
LV는 dividing cell 및 non-dividing cell 모두 형질감염 가능하다. Transfer Vector, Packaging Vector 및 Envelope Vector를 포함하고, 3개의 vector를 co-transfection 시켜, 바이러스 입자 생성 후 정량-정제하여 목적하는 유전자가 잘 전달된 세포를 선별할 수 있다.
상기 transfer vector는 Tat (유전자 발현 위한 전사 유도 단백질) binding site인 5' LTR 및 3' LTR, packaging signal(ψ) 및 도입유전자를 포함할 수 있다. 상기 packaging vector는 복제성이 제거된 packaging signal(Δψ)이 결실되고, capsid, reverse transcriptase, protease, integrase 등과 같은 효소가 발현되는 gag 및/또는 pol과 같은 바이러스 구조 유전자를 포함할 수 있다. Transcription을 유도하는 Tat 및/또는 mRNA를 수송하기 위한 Rev와 같은 바이러스 조절 유전자 (tat 및/또는 rev)를 포함할 수 있다. 상기 envelope vector는 바이러스 envelope 발현 유전자인 viral env를 포함할 수 있다.
(4) RV
유전 정보 가지는 RNA가 역전사 효소에 의해 이중가닥의 DNA로 전환된 provirus DNA 통해 복제 개시된다. 약 ~8kb의 외부 유전자 도입이 가능하다. LTR 포함 치료유전자가 도입된 플라스미드를 바이러스 입자화 세포주에 도입하여 바이러스 입자 제조할 수 있다. 세포주는 gag, pol, env 단백질을 공급한다 (Genetic Vaccines and Therapy 2004, 2:9).
Transfer Vector, Packaging Vector 및 Envelope Vector를 포함하고, 3개의 vector를 co-transfection 시켜, 바이러스 입자 생성 후 정량-정제하여 목적하는 유전자가 잘 전달된 세포를 선별할 수 있다.
상기 transfer vector는 Tat (유전자 발현 위한 전사 유도 단백질) binding site인 5' LTR, 3' LTR, 및 도입유전자를 포함할 수 있다. 5' LTR 및 3' LTR를 통해 바이러스 복제, 숙주로의 삽입, 바이러스 유전자 발현을 유도한다. 상기 packaging vector는 복제성이 제거된 packaging signal(Δψ)이 결실되고, capsid, reverse transcriptase, protease, integrase 등과 같은 효소가 발현되는 gag 및/또는 pol과 같은 바이러스 구조 유전자를 포함할 수 있다. 바이러스 envelope 발현 유전자인 viral env를 포함할 수 있다.
(5) 기타
이외에도 예를 들어, WO2017/223330에 기재된 바와 같이 단일 가닥 RNA (single-stranded RNA : ssRNA) 바이러스의 게놈을 이용하여 CRISPR/Cas를 전달할 수 있다. LV 및 AAV는 ex vivo 및 in vivo 형태로 세포 변형에 사용되어 왔으나, 바이러스 DNA 기반 복제는 숙주 게놈에 바람직하지 않는 유전 독성 또는 발암의 위험을 수반하고 있어, 종래와 다른 형태의 ssRNA 바이러스 벡터를 제시한다. 선형으로 단일가닥의 마이너스 극성을 가지는 비감염성 RNA 사슬을 포함하는 모노네거티브 바이러스 (Mononegavirales)가 예시될 수 있다. 극성 순차적 전사(polar sequential transcription)를 통해 5~10의 다른 mRNA를 생산하고 완전한 안티게놈(antigenome)를 합성함으로써 복제된다. 예를 들어, 모노네거티브 바이러스는 bornaviridae, filoviridae, nyamiviridae, paramyxodiridae, 또는 rhabdoviridae를 포함할 수 있다. Bornaviridae에 bornavirus가 포함된다. Filovindae에 cuevavirus, ebolavirus, marburgvirus가 포함된다. Nyamiviridae에 nyavirus가 포함된다. Paramyxoviridae에 aquaparamyxovirus, avulavirus, feravirus, heniparvirus, morbillivirus, respirovirus, rubulavirus, pneumovirus, metapneumovirus 및 sendai virus가 포함된다. Rhabdoviridae에 alemndravirus, baiavirus, curiovirus, cytorhabdovirus, dichorhavirus, ephemerovirus, hapavirus, ledantevirus, lyssavirus, novirhabdovirus, nuclearhabdovirus, perhabdovirus, sawgravirus, sigmavirus, sprivivirus, tibrovirus, tupavirus, 및 vesiculovirus가 포함된다. 특히, WO2017/223330에서는 sendai virus를 통해 CRISPR/Cas 전달 시스템을 구축하였다. 이 때, CRISPR/Cas 시스템의 gRNA에 self-cleaving ribozyme을 적용하여, 숙주세포에 도입시 gRNA 효과적 절단/유리 가능하도록 할 수 있다. 이를 통해, RNA 형질감염 효율이 증대된 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 조성물 및 이의 전달에도 적용될 수 있으며, 참조로 도입될 수 있다.
치료학적 효과를 달성하기 위한 벡터 용량은 벡터 유전체 용량/체중kg(vg/kg)로 제공될 수 있으나, (a) 투여 경로, (b) 치료학적 효과를 달성하는데 요구되는 치료 유전자의 발현 수준, (c) 벡터에 대한 임의의 숙주 면역 반응, (d) 발현된 단백질의 안정도와 같은 요건에 따라 변동될 수 있다.
B. 비-바이러스 전달 수단
비바이러스 전달 수단은 예를 들어, Simian virus 40 (SV40) ori, bovine papilloma virus (BPV) ori 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV) ori를 포함하는 에피좀 벡터, mRNA 형태로 전달되는 방법, Ribonucleoprotein (RNP) 형태로 전달되거나 또는 Nanoparticle, CPP, Polymer 등의 캐리어를 통해 전달될 수 있다 (Nature Reviews Genetics volume 15, pages541-555(2014)).
(1) 에피좀 벡터
Viral plasmid replicon을 포함하는 에피좀 벡터를 제작하여, 본 발명에 따른 조성물을 전달할 수 있다. 사용 가능한 viral plasmid replicon은 예를 들어, Simian virus 40 (SV40), bovine papilloma virus (BPV) 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV)의 복제원점 (Ori)를 포함할 수 있다. 상기 복제원점 (Ori)을 포함하는 플라스미드 벡터를 구축할 수 있다. 상기 플라스미드 벡터로, Escherichia coli 유래 플라스미드, Actinomyces 유래 플라스미드, Bacillus subtilis 유래 플라스미드 또는 효모 유래 플라스미드를 사용할 수 있다. 상기 Escherichia coli 유래 플라스미드로 예를 들어 pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 또는 pBluescript 등을 포함할 수 있다. 상기 Actinomyces 유래 플라스미드로 예를 들어 pIJ486 등을 포함할 수 있다. 상기 Bacillus subtilis 유래 플라스미드로 pUB110, pSH19 등을 포함할 수 있다. 상기 효모 유래 플라스미드로 YEp13, YEp 24, Ycp50 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상업적으로 입수가능한 pCMV6-XL3 (OriGene Technologies Inc.), EGFP-C1 (Clontech), pGBT-9 (Clontech), pcDNAI (FUNAKOSHI), pcDM8 (FUNAKOSHI), pAGE107 (Cytotechnology, 3,133, 1990), pCDM8 (Nature, 329, 840, 1987), pcDNAI/AmP (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Blochem., 101, 1307, 1987), pAGE210 등을 플라스미드로 사용할 수 있다.
이러한 viral plasmid replicon을 포함하는 벡터는 숙주세포의 염색체에 통합되지 않는다. 벡터는 경우에 따라서, 바이러스 ori를 활성화시키는 산물인 viral early gene을 포함할 수 있다. 이를 통해 에피좀이 형질감염된 숙주세포주에서 잘 조절되어 위치할 수 있도록 한다.
에피좀 벡터는 목적하는 삽입 유전자가 세포 DNA 통합시 보여지는 제어 인자들에 의해 방해받거나 영향을 받지 않는다. 삽입된 이종 유전자가 세포 고유의 중요한 영역을 재배열시키거나 방해하지 않는다. 핵에서 복수 카피로 유지되어, 바이러스 트랜스 활성 인자들이 제공되기만 하면 목적하는 유전자의 증폭을 유도할 수 있다. 안정적인 형질감염 과정을 통해 형질감염 효율이 높으며, 진핵세포 뿐 아니라 원핵세포에서도 복제가능한 플라스미드 구조이므로 하나의 세포 시스템에서 다른 세포 시스템으로 전환이 용이하다.
예를 들어, SV40은 숙주세포의 제어 기작과 커플링되지 않고 독립적인 복제 패턴을 보이므로, 바이러스 게놈 각각이 세포 싸이클 중 수회 복제될 수 있어, SV40 Ori는 카피수가 100-1000으로 매우 높다. 따라서, 세포 분열 동안 높은 효율의 복제 및 핵에서의 지속적 유지 효과를 나타낼 수 있다. Oncoprotein인 T-antigen이 존재하여 인간 적용에 제한이 있어, T-antigen 제거된 형태로 사용되거나 숙주세포에서 trans로 발현되도록 할 수 있다.
BPV Ori는 바이러스에 의해 코딩된 E1 단백질에 대한 결합 사이트 가지며, E1은 E2의 도움으로 helicase로 조합되어 세포 내 유전자의 nuclear localization에 도움을 준다. BPV Ori의 카피수는 50-150이다. E2 단백질이 염색체에 결합할 수 있어, 유전자 운반 효과 (piggy back)를 나타내므로, 유전자의 핵 내 위치하는 것을 지속시키고, 안정성을 유지할 수 있다.
EBNA Ori는 숙주세포 내 도입 후 DNA 복제 잠재기에 EBV 게놈이 FR (family of repeats) 및 DS (dyad symmetry)를 포함하는 oriP와 FR 및 DS 각각과 결합가능한 EBNA1 (EBV nuclear antigen 1)을 통해 카피수 5-20의 플라스미드로 복제될 수 있다. DS와 결합한 EBNA1이 DNA 복제에 필요한 숙주세포 기작을 모으고, FR이 결합한 EBNA1가 유전자 운반 효과 (piggy back)를 통해 유전자의 핵 내 위치하는 것을 지속시키고, 안정성을 유지할 수 있다 (Current Gene Therapy, 2008, 8, 147-161, Eur. J. Biochem. 267, 5665ㅁ5678 (2000)). 본 발명에 따른 조성물 및 이의 전달에도 적용될 수 있으며, 참조로 도입될 수 있다.
경우에 따라서, 국제공개특허 WO2018/075235에서와 같이 알파바이러스 레플리콘 RNA를 포함할 수 있다. 알파바이러스는 스파이크 단백질을 함유하는 외피에 의해 둘러싸인 뉴클레오캡시드에 봉입된 양의 극성의 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는다. 예를 들어, 신드비스 바이러스(SIN), 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 로스 리버 바이러스(RRV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 및 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV)를 포함할 수 있다.
변형된 5'-UTR을 포함하고 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부가 없는 변형된 레플리콘 RNA를 포함할 수 있다. 상기 변형된 5'-UTR은 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다. 이를 통해, 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않을 수 있다. 이러한 핵산 분자는 숙주 게놈에 통합, 에피솜으로 복제되거나 일시적 발현 가능할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물 및 이의 전달에도 적용될 수 있으며, 참조로 도입될 수 있다.
(2) mRNA 형태로 전달
mRNA 형태로 전달하는 경우 DNA를 이용한 벡터 형태로 전달하는 것에 비해, mRNA로의 전사 과정이 불필요하여 유전자 편집 개시가 빠를 수 있다. 일시적 단백질 발현 (transient protein expression) 가능성이 높다. DNA에 비해 불안정할 수 있고, RNAse에 의해 분해 가능성이 높은 편이다.
본 발명에 따른 조성물의 핵산절단효소 및/또는 절단인자 각각을 mRNA 형태로 전달할 수 있다. 핵산절단효소 및/또는 절단인자의 mRNA를 화학변형 (chemical modification) 하거나, 합성 자기-복제 RNA (synthetic self-replicative RNA) 형태로 전달할 수 있다.
국제공개특허 WO2011/071931에 단일 가닥 mRNA 분자 형태로 세포내로 전달하기 위한 변형 방법이 기재되어 있다. 변형 뉴클레오사이드가 포함될 수 있다. 예를 들어, 변형 뉴클레오사이드로 m5C (5-메틸사이티딘), m5U(5-메틸유리딘), m6A(N6-메틸아데노신), s2U(2-티오유리딘), ψ(유사유리딘), Um(2'-O-메틸유리딘), mlA(l-메틸아데노신), m2A(2-메틸아데노신), Am(2'-O-메틸아데노신), ms2mGA(2-메틸티오-N6-메틸아데노신), iGA(~아이소펜테닐아데노신), mszi6A(2-메틸티오-N6아이소펜테닐아데노신), io 6 A (N6-(시스-하이드록시아이소펜테닐)아데노신), ms2io6A(2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시아이소펜테닐)아데노신), g6A(N6-글라이시닐카바모일아데노신), t6A(N6-트레오닐카바모일아데노신), ms2t6A(2-메틸티오-N6-트레오닐카바모일아데노신), m6 t 6 A(N6-메틸-N6-트레오닐카바모일아데노신), hn6A(N6하이드록시노발일카바모일아데노신), ms2hn6A(2-메틸티오-N6-하이드록시노발일 카바모일아데노신), Ar(p)(2'-O-라이보실아데노신(포스페이트)), I(아이노신), m1I(l-메틸아이노신), mlIm(l,2'-O-다이메틸아이노신), m3C(3-메틸사이티딘), Cm(2'-O-메틸사이티딘), S2C(2티오사이티딘), ac4C(N4-아세틸사이티딘), f5C(5-포밀사이티딘), m5Cm(5,2'-O-다이메틸사이티딘), ac4Cm(N4-아세틸-2'-O-메틸사이티딘), k2C(라이시딘), m1G(l-메틸구아노신), m2G(N2-메틸구아노신), m7G (7-메틸구아노신), Gm(2'-O-메틸구아노신), m2 2G(N2,N2-다이메틸구아노신), m2Gm (N2,2'-O-다이메틸구아노신), m2 2Gm(N2,N2,2'-O-트라이메틸구아노신), Gr(p)(2'-O-라이보실구아노신(포스페이트)), yW(와이부토신), o2yW(퍼옥시와이부토신), OHyW(하이드록시와이부토신), OHyW*(미완성변형(undermodified) 하이드록시와이부토신), imG (와이오신), mimG(메틸와이오신), Q(퀘오신), oQ(에폭시퀘오신), galQ(갈락토실-퀘오신), manQ(만노실퀘오신), preQ0(7-시아노-7-데아자구아노신), preQl(7-아미노메틸-7-데아자구아노신), G+(아캐오신(archaeosine)), D(다이하이드로유리딘), m5Um (5,2'-O-다이메틸유리딘), S4U(4-티오유리딘), m5s2U(5-메틸-2-티오유리딘), s2Um (2-티오-2'-O-메틸유리딘), acp3U(3-(3-아미노-3-카복시프로필)유리딘), ho5U(5-하이드록시유리딘), mo5U(5-메톡시유리딘), cmo5U(유리딘 5-옥시아세틱액시드), mcmo5U(유리딘 5-옥시아세틱액시드 메틸에스터), chm5U(5-(카복시하이드록시메틸)유리딘)), mchm5U(5(카복시하이드록시메틸)유리딘 메틸에스터), mcm5U(5-메톡시카보닐메틸유리딘), mcm5Um(5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸유리딘), mcm5s2U(5-메톡시카보닐메틸-2-티오유리딘), nm5s2U(5-아미노메틸-2-티오유리딘), mnm5U(5-메틸아미노메틸유리딘), mnm5s2U(5-메틸아미노메틸-2-티오유리딘), mnmse2U(5-메틸아미노메틸-2-셀레노유리딘), ncm5U(5-카바모일메틸유리딘), ncm5Um(5-카바모일메틸-2'-O-메틸유리딘), cmnm5U(5-카복시메틸아미노메틸유리딘), cmnm5Um(5-카복시메틸아미노메틸-2'-메틸유리딘), cmnm5s2U(5-카복시메틸아미노메틸-2-티오유리딘), m6 2A(N6,N6-다이메틸아데노신), Im(2'-O-메틸아이노신), m4C(N4-메틸사이티딘), m4Cm(N4,2'-O-다이메틸사이티딘), hm5C(5-하이드록시메틸사이티딘), m3U(3-메틸유리딘), cm5U(5-카복시메틸유리딘), m6Am(N6,2'-O-다이메틸아데노신), m6 2Am(N6,N6, 2'-O-트라이메틸아데노신), m2,7G(N2,7-다이메틸구아노신), m2,2,7G (N2,N2,7-트라이메틸구아노신), m3Um(3,2'-O-다이메틸유리딘), m5D(5-메틸다이하이드로유리딘), f5Cm(5-포르밀-2'-O-메틸사이티딘), mlGm(l,2'-O-다이메틸구아노신), m1Am(1,2'-O-다이메틸아데노신), τm5U(5-타우리노메틸유리딘), τm5s2U(5-타우리노메틸-2-티오유리딘)), imG-14(4-디메틸와이오신), imG2(아이소와이오신), 또는 ac6A (N6-아세틸아데노신)을 기재하고 있으며, 본 발명의 조성물 및 이의 전달에 적용할 수 있다.
Synthetic Self-Replicative RNA 형태로 전달될 수 있다 (Cell Stem Cell. 2013 Aug 1, 13(2): 10). 비감염성으로 패키징될 가능성이 없고, 자가복제 가능한 VEE (Venezuelan Equine Encephalitis) 바이러스의 RNA replicon을 포함할 수 있다. RNA replicon을 코딩하는 nsP1 내지 nsP4를 포함할 수 있다. 경우에 따라서, mRNA에 5′-Cap 및 poly(A) tail을 부가할 수 있다.
미국등록특허 제10370646호에 기재된 바와 같이 5′ to 3′: (VEE RNA replicases)-(promoter)-(GOI)-(IRES or optional promoter)-(optional selectable marker)-(VEE 3′UTR and polyA tail)-(optional selectable marker)-promoter의 배열을 가지는 구조물을 제작하여, 알파 바이러스의 자기 복제 골격 포함하는 자기 복제 RNA 레플리콘을 포함하여, Synthetic Self-Replicative RNA를 제작할 수 있으며, 본 발명의 조성물 및 이의 전달에 적용할 수 있다.
세포로 mRNA를 전달하는 방법 또는 생체 내에서 mRNA를 인간, 동물과 같은 유기체의 세포로 전달하는 방법을 포함하여, 시험관 내 또는 생체 내에서 mRNA 분자를 세포로 전달할 수 있는 방법을 고려할 수 있다. 예를 들어, 지질(예를 들어, 리포좀, 마이셀 등)을 포함하거나, 나노파티클 또는 나노튜브를 포함하거나, 양이온성 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌이민 또는 PEI)을 포함하거나, 양이온성 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌이민 또는 PEI)을 포함하여, mRNA 분자를 세포로 전달할 수 있다. 경우에 따라서, mRNA를 세포로 전달하기 위해서 유전자 총 또는 바이오리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템과 같은 볼리스틱 방법(bolistics method)을 사용할 수 있다.
다만, 핵산절단효소를 mRNA 형태로 전달시 RNA 형태인 절단인자와 동일 벡터에 존재한다면 본 발명에 따른 세포사멸 유도를 위해 핵산절단효소는 단백질 형태로 존재하여야 하므로 전달된 핵산절단효소 mRNA는 단백질로 번역되는 반면, 번역 중 절단인자는 분해가 시작될 수 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 절단인자의 전달을 지연시키거나, 절단인자의 chemical modification을 유도하거나, 또는 바이러스 벡터에 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함시키는 방법을 고려할 수 있다.
핵산절단효소 mRNA를 전달한 이후 ~6시간 내 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전달할 수 있다 (Cell Res. 2017,27(3):440-443.). 이러한 전달 방법을 통해 editing efficiency가 향상될 수 있다. 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 chemical modification을 통해 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전달 후 안정성을 향상시킬 수 있다 (Nat Biotechnol. 2017 Dec, 35(12): 1179-1187.). 경우에 따라서, 핵산절단효소 코딩 mRNA 형태로 전달하고, 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터에 클로닝하여 전달할 수 있으며, 분해되기 쉬운 절단인자를 안정적으로 전달할 수 있다.
절단인자의 chemical modification과 관련하여, synthetic modified RNA 형태로 전달될 수 있다 (Stem Cells Int. 2019 Jun 19,2019:7641767.). In vitro 전사 (IVT) 과정에서 mRNA 말단에 cap 구조 및/또는 poly A tail을 부가할 수 있다. 경우에 따라서, Pseudo-UTP (pseudouridine) 또는 5mCTP (5-methylcytidine) 등의 변형 nucleoside가 부가될 수 있다. mRNA 및 번역된 단백질의 안정성이 증대될 수 있다. 합성 변형 RNA를 세포질로 전달하면 즉시 단백질로 번역될 수 있다. 다만, mRNA 형태로 다수의 daily mRNA transfection하는 경우 innate immnune response가 유도될 가능성이 높고, 이에 의해 cellular stress와 severe cytotoxicity 유도될 수 있다.
(3) RNP
벡터를 통해 세포사멸을 유도하기 위해서는 다음의 과정을 거쳐야 한다: 본 발명에 따른 핵산절단효소 및 절단인자를 포함하는 조성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 세포에 형질감염하고, 플라스미드가 세포 내 핵으로 이동하여 전사가 시작된 다음, 핵산절단효소에 대한 mRNA가 핵 외부로 이동하여 단백질로 번역된다. 절단인자 RNA는 플라스미드에서 전사되어 핵외로 이동한다. 핵산절단효소와 절단인자 RNA가 결합하여 ribonucleoprotein (RNP) 형성한 다음 핵으로 다시 운송된다.
그러나, pre-formed RNP는 세포로 도입되어 타겟 게놈 DNA 편집을 시작할 수 있다. 이러한 RNP 형태의 전달은 벡터 전달에 비해 오프 타겟 효과를 감소시킬 수 있고, 세포의 핵으로 핵산절단효소와 절단인자 RNA를 직접 전달 가능하다는 장점이 있다 (Scientific Reports volume 8, Article number: 14355 (2018)).
RNP (ribonucleoprotein) 형성을 위해 핵산절단효소와 절단인자 각각을 합성 및 정제하여 RNP 형태로 제작할 수 있다. 경우에 따라서 CL7 태그된 핵산절단효소 및 절단인자 RNA를 플라스미드를 통해 직접 발현 후 self-assembly 형태로 조립된 RNP를 정제하여 제작할 수 있다 (Curr Protoc Mol Biol 2017 Oct 2,120:31.10.1-31.10.19).
국제공개특허 WO2019/089884에서는 세포 내 TGFBR2 gene 발현 변형하는 방법으로 gRNA 및 RNA-guided nuclease 코딩 폴리뉴클레오티드 포함 벡터 이외에, gRNA 및 RNA-guided nuclease 포함 genome editing system을 제안하고 있다. WO2019/089884에 따르면, gRNA 및 RNA-guided nuclease는 ribonucleoprotein (RNP) complex 포함할 수 있고, 2개 이상의 상이한 ribonucleoprotein (RNP) complex를 포함할 수 있으며, 상이한 타겟 도메인을 가지는 gRNA 포함하는 것이 가능하다.
경우에 따라서, 한국등록특허 제2107735호에서와 같이 하나 이상의 내재적 유전자 변형 (결손 또는 도입) 위해 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인비트로에서 혼합하여 선조립된 Cas 단백질-가이드 RNA RNP (ribonucleoprotein) 사용할 수 있다. KR2107735에서는 식물 원형질체(protoplast)에서 하나 이상의 식물의 내재적 유전자를 결손 또는 도입시키기 위해 선조립된 Cas 단백질-가이드 RNA RNP를 적용하였으나, 본 발명에서와 같이 인간을 대상으로 하는 질병 치료 경우에도 동일하게 적용할 수 있다.
구체적으로, Cas9 protein 및 gRNA 포함 복합체 형성 조건에서 Cas9 protein 및 gRNA를 in vitro 조립하고, Cas9 protein 및 gRNA 포함 복합체를 타겟 DNA와 접촉시키는 것을 포함하는 타겟 DNA 변형방법이 기재되어 있는 미국등록특허 제9637739호에서와 같이, 본 발명에서도 핵산절단효소 및 절단인자를 in vitro 조립하고, 핵산절단효소 및 절단인자 포함 RNP (ribonucleoprotein) 복합체를 처리하여 세포사멸을 유도할 수 있다.
Cas9 protein 및 gRNA 포함 복합체를 타겟 DNA와 접촉시키는 것을 포함하는 타겟 DNA 표적 및 결합방법이 기재되어 있는 미국등록특허 제10626419호에서와 같이, 본 발명에서도 핵산절단효소 및 절단인자의 복합체를 형성하고, 복합체가 타겟 DNA에 결합하도록 하여, 타겟 DNA를 표적할 수 있다.
(4) 캐리어를 통한 전달
핵산절단효소를 코딩하는 mRNA 및/또는 절단인자 RNA 각각이 개별적으로 또는 RNP (ribonucleoprotein) 형태로 제작되어, 캐리어 전달 시스템을 통해 전달될 수 있다. 상기 캐리어는 예를 들어, 세포 투과성 펩타이드(CPP), 나노입자, ZIF (zeolitic imidazole frameworks), RNA aptamer-streptavidin, 또는 중합체를 포함할 수 있다 (Biomaterials. 2018 July , 171: 207-218.).
CPP는 다양한 분자 카고(나노크기 입자로부터 작은 화학 분자 및 DNA의 큰 단편까지)의 세포 흡수를 용이하게 하는 짧은 펩타이드이다. 카고는 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 세포 투과성 펩타이드 및 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복합체를 제조할 수 있다. 구체적으로, 세포 투과성 펩타이드가 접합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 세포 투과성 펩타이드가 복합체화된 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 세포 투과성 펩타이드 및 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공유 결합을 통한 화학적 결합 또는 비-공유 상호작용을 통해 조립될 수 있다. 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 티오에스테르 결합을 통해 CPP에 컨쥬게이트되는 반면, 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CPP와 복합체화되어, 축합된 양으로 하전된 입자를 형성한다. 배아 줄기 세포, 피부 섬유아세포, HEK293T 세포, HeLa 세포, 및 배아 암종 세포를 포함하는 인간 세포의 동시 및 순차적 치료가 플라스미드 형질감염에 비하여 감소된 표적외 돌연변이로 효율적인 유전자 파괴를 유도하였다. (Genome Res. 2014, 24:1020-1027.).
미국등록특허 제10584322호에서도, guide polynucleotide 및 Cas endonuclease 이외에 cell-penetrating peptide (CPP)를 포함하여, 타겟위치를 변형하며, 본 발며엥 적용할 수 있다. 상기 guide polynucleotide, Cas endonuclease 및 CPP가 covalently 또는 non-covalently 방식으로 연결되어 guide polynucleotide/Cas endonuclease-CPP complex 형성될 수 있다. 이를 통해, 상기 complex가 microbial cell의 세포막 또는 세포벽을 통과하여 Cas endonuclease가 microbial cell의 게놈 중 타겟 위치에서 double-strand break 유도할 수 있다.
나노입자와 관련하여, 본 발명에 따른 조성물은 고분자 나노입자, 금속 나노입자, 금속/무기 나노입자 또는 지질 나노입자를 통해 전달될 수 있다.
상기 고분자 나노입자는 예를 들어, 롤링 써클 증폭에 의해 합성된 DNA nanoclew, 실 유사 DNA 나노입자일 수 있다. DNA nanoclew, 실 유사 DNA 나노입자에 Cas9/sgRNA를 로딩하고, 엔도좀 탈출능을 향상시키기 위해 PEI를 코팅하였다. 이러한 복합체가 세포막에 결합하여, 내재화된 다음 엔도좀 탈출을 통해 핵으로 이동하여, Cas9 단백질과 단일 가이드 RNA가 동시에 전달된다 (Angew Chem Int Ed Engl. 2015 Oct 5; 54(41) 12029-12033). 본 발명에 따른 조성물 전달에 적용할 수 있으며, 참조로서 도입된다.
또 다른 예시로, 양이온성 및 음이온성 아크릴레이트 모노머를 통해 Cas9 단백질과 단일 가이드 RNA의 RNP와 electrostatic interactions을 통해 코팅될 수 있도록 할 수 있다. Imidazole 포함 monomer, GSH-degradable crosslinker, acrylate mPEG, 및 acrylate PEG conjugated ligands를 연결하여 RNP 표면에 부착되도록 할 수 있다. in situ free-radical polymerization을 통해 RNP 주위에 glutathione (GSH)-cleavable 나노캡슐이 형성될 수 있도록 하고, 나노캡슐을 GSH-cleavable linker인 N,N'-bis(acryloyl)cystamine과 crosslink하여 세포질에서 분해될 수 있도록 하고 세포질에서 RNP가 분해될 수 있도록 한다 (Nature Nanotechnology volume 14, pages974-980(2019)). 본 발명에 따른 조성물 전달에 적용할 수 있으며, 참조로서 도입된다.
상기 금속 나노입자와 관련하여, DNA에 금입자를 연결시키고 양이온성 endosomal disruptive polymer와 복합체를 형성하여, Cas9 ribonucleoprotein 및 donor DNA를 세포에 전달할 수 있다 (Nature Biomedical Engineering volume 1, pages889-901(2017)). 상기 양이온성 endosomal disruptive polymer는 예를 들어, polyethylene imine, poly(arginine), poly(lysine), poly(histidine), poly-[2-{(2-aminoethyl)amino}-ethyl-aspartamide] (pAsp(DET)), poly(ethylene glycol) (PEG)와 poly(arginine)의 block co-polymer, PEG와 poly(lysine)의 block co-polymer, 또는 PEG와 poly{N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide} (PEG-pAsp(DET))의 block co-polymer일 수 있다.
또 다른 예에서, 자성 나노입자와 재조합 baculoviral vector가 복합체를 형성하도록 하여 magnetic field를 통해 국소적으로 활성화시켜 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집이 일어나도록 할 수 있다 (Nature Biomedical Engineering volume 3, pages126-136 (2019)). 본 발명에 따른 조성물 전달에 적용할 수 있으며, 참조로서 도입된다.
또 다른 예에서, 빛에 불안정한 photolabile 반도체 고분자 nanotransducer (pSPN)를 CRISPR/Cas9 플라스미드를 세포에 전달하는 유전자 벡터로 이용하여, 유전자 편집을 원격으로 활성화하기 위한 광 조절제로서 사용 가능하다. pSPN는 1O2로 절단 가능한 링커를 통해 polyethylenimine brush로 그라프트된 단일 산소 (1O2) 생성 백본을 포함할 수 있다. 근적외선 (NIR) 광 조사에 의해 pSPN에서 유전자 벡터의 절단을 자발적으로 유도하고 CRISPR/Cas9 플라스미드가 방출되도록 하여 유전자 편집을 시작한다 (Angew Chem Int Ed Engl 2019 Dec 9; 58 (50) 18197-18201). 본 발명에 따른 조성물 전달에 적용할 수 있으며, 참조로서 도입된다.
금속/무기 나노입자와 관련하여, 예를 들어 zeolitic imidazolate framework-8 (ZIF-8)를 통해 CRISPR/Cas9을 캡슐화할 수 있으며, 효율적 엔도좀 탈출을 통해 목적하는 타겟 유전자의 발현을 변경시킬 수 있다 (Advanced Therapeutics Volume2, Issue4 April 2019). 본 발명에 따른 조성물 전달에 적용할 수 있으며, 참조로서 도입된다.
또 다른 예에서, 아르기닌으로 변형된 금 입자를 사용할 수 있다. 아르기닌으로 변형된 금 입자를 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 함께 조립할 수 있다. 이를 통해 타겟세포의 막과 융합하여, 세포질로 이동하게 된다 (ACS Nano. 2017, 11:2452-2458). 본 발명의 조성물 및 이의 전달에 적용할 수 있다.
ZIF (zeolitic imidazole frameworks)를 통해 음으로 하전된 CRISPR RNP를 양으로 하전된 nanoscale ZIF로 캡슐화할 수 있다. 이러한 ZIF에 의해 RNP의 엔도좀 탈출능 (endosomal escape)이 향상될 수 있다 (J Am Chem Soc. 2018, 140:143-146). 본 발명의 조성물 및 이의 전달에 적용할 수 있다.
RNA aptamer-streptavidin 예를 들어, S1mplex (modular RNA aptamer-streptavidin strategy)를 사용할 수 있다. 예를 들어, sgRNAs의 3' 말단에 streptavidin과 비공유 상호결합하는 60 nucleotide S1m aptamer를 부가할 수 있다. 이후 streptavidin 및 Cas9 단백질과 복합체를 형성하고, 이를 S1mplexes로 하여 세포 내로 전달할 수 있다. 경우에 따라서, streptavidin에 높은 친화도를 보이는 비오틴이 결합한 biotinylated single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODNs)을 핵산 donor template로 결합시킬 수 있다. 이러한 구조의 복합체를 통해 정교하게 핵산 변형시킬 수 있음을 확인하였다. 표준 sgRNA RNP에 비해 증가된 유전자 교정 효율을 나타낼 수 있다 (Nat Commun. 2017, 8:1711.). 본 발명의 조성물 및 이의 전달에 적용할 수 있다.
음이온을 띠는(negatively charged) CRISPR/Cas9을 이루는 DNA 혹은 핵산은 양이온을 띠는(cationic) 물질들과 결합하여 나노입자 (nanoparticles)를 형성할 수 있고, 이는 세포로 receptor-mediated endocytosis 혹은 phagocytosis 등을 통해 침투할 수 있다. 예를 들어 미국등록특허 제10682410호에 양성을 띠는 Cas9 단백질과 강한 음이온을 띠는 안내자 RNA가 서로 결합하여 음이온을 띠는 Cas9 단백질-RNA와 초하전된 단백질(supercharged protein) (예를 들어 양으로 하전된 초하전 단백질), 양이온성 중합체 또는 양이온성 지질을 사용하여 핵산절단효소를 세포에 전달하는 기술이 기재되어 있으며, 본 발명에 적용할 수 있다. 초하전 단백질, 양이온성 중합체 또는 양이온성 지질을 핵산절단효소와 접촉시켜 세포에 도입할 수 있다. 표적 세포에의 전달을 위하여 Cas9 단백질은 음이온성 전하를 제공하고, 초하전 형광 단백질로 초하전된 GFP, 예를 들면 +36 GFP 또는 -30 GFP와 결합된다. 초하전 단백질에 의해 엔도좀을 유리하게 붕괴시키고 엔도좀 탈출능이 증가될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 이의 전달에 적용할 수 있다.
양이온성 중합체의 경우, Cas9:gRNA 복합체가 양이온성 중합체에 결합될 수 있다. 양이온성 중합체로 폴리알릴아민 (PAH); 폴리에틸렌이민 (PEI); 폴리(L-리신) (PLL); 폴리(L-아르기닌) (PLA); 폴리비닐아민 단일- 또는 공중합체; 폴리(비닐벤질-트리-C1-C4-알킬암모늄염); 지방족 또는 방향지방족 디할로겐화물 및 지방족 N,N,N',N'-테트라-C1-C4-알킬-알킬렌디아민의 중합체; 폴리(비닐피리딘) 또는 폴리(비닐피리디늄염); 폴리(N,N-디알릴-N,N-디-C1-C4-알킬-암모늄할로겐화물); 4차화된 디-C1-C4-알킬-아미노에틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트의 단일- 또는 공중합체; 폴리쿠아드(POLYQUAD)™; 폴리아미노아미드 등이 포함될 수 있다.
양이온성 지질로 양이온성 리포솜 제제를 포함할 수 있다. 리포솜의 지질 이중층은 캡슐화된 핵산을 분해로부터 보호하며, 핵산에 결합할 수 있는 항체에 의한 특이적 중화를 방지할 수 있다. 엔도좀 성숙 동안 엔도좀 멤브레인과 리포좀이 융합되어, 양이온성 지질-핵산절단효소의 효율적인 엔도좀 탈출이 가능하다. Cas9:gRNA 복합체가 양이온성 지질에 의해 캡슐화될 수 있다. 양이온성 지질로 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민 (PAMAM) 성화 수지상체, 리포펙틴 (DOTMA와 DOPE의 조합), 리포펙타제, 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)® (예컨대 리포펙타민® 2000, 리포펙타민® 3000, 리포펙타민® RNAiMAX, 리포펙타민® LTX), 세인트-레드(SAINT-RED) (시노볼룩스 세라퓨틱스(Synvolux Therapeutics)사, 네덜란드 그로닝겐 소재), DOPE, 시토펙틴 (길레드 사이언시즈(Gilead Sciences) 사, 캘리포니아 포스터 시티 소재), 및 유펙틴 (JBL사, 캘리포니아 산 루이스 오비스포 소재)가 포함될 수 있다. 대표적인 양이온성 리포솜은 N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드; 또는 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)으로부터 제조될 수 있다.
고분자의 경우, 예를 들어 flexible dendritic polymer와 CRISPR Cas 시스템을 세포내로 전달할 수 있다 (Chem Sci. 2017, 8:2923-2930.). 또한, 예를 들어 polypeptides 및 polysaccharide로 제조된 하이브리드 폴리머 마이크로캐리어를 통해 CRISPR Cas 시스템을 세포내로 전달할 수 있다 (Nanomedicine. 2018, 14:97-108.). 더욱이, 예를 들어 GO-PEG-PEI (graphene oxide-poly(ethylene glycol)-polyethylenimine) 나노캐리어를 통해 CRISPR Cas 시스템을 세포내로 전달할 수 있다 (Nanoscale. 2018, 10:1063-1071).
미국공개특허 제2019/0099381호에는 Cas9 폴리펩티드 및 guide RNA를 포함하는 RNP complex를 코어로 포함, biodegradable crosslinked polymer를 shell로 포함하는 나노입자가 기재되어 있다. biodegradable crosslinked polymer는 imidazolyl acryloyl monomers, bisacryloyl disulfides, optionally PEG acryloyl monomers, cationic acryloyl monomers, anionic acryloyl monomers, cationic 및 anionic acryloyl monomers, 또는 non-ionic acryloyl monomers의 중합체를 포함할 수 있다. 이 때, biodegradable crosslinked polymer과 RNP의 질량비는 0.4 내지 3.5의 비율에서 조정될 수 있다. 이러한 나노입자를 본 발명에 따른 조성물을 전달하기 위해 적용할 수 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
지질 나노입자와 관련하여, 캐리어로 리포좀을 이용하여 CRISPR Cas 시스템을 전달할 수 있다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일 또는 다중 라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구체 소낭 구조이다. 리포좀 제형은 주로 천연 인지질 및 지질, 예컨대 1,2-디스테아로릴-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(DSPC), 스핑고미엘린, 포스파티딜콜린 또는 모노시알로강글리오사이드 등을 포함할 수 있다. 경우에 따라서, 혈장 내 불안정성을 해소하기 위하여, 지질막에 콜레스테롤 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 추가할 수 있다. 콜레스테롤의 첨가는 캡슐화된 생활성 화합물의 혈장 내로의 신속한 방출을 감소시키거나 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)은 안정성을 증가시킨다(Semple et al., Nature Niotechnology, Volume 28 Number 2 February 2010, pp. 172-177).
미국등록특허 제10363217호에 따르면, Cas9 및 guide RNA 전달에 lecithin, cholesterol 및 metal chelating lipid 포함 나노리포좀 전달체를 사용할 수 있음이 기재되어 있다. metal chelating lipid로 예를 들어, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt) ("DOGS-NTA-Ni"); 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriamine-pentaacetic acid (gadolinium salt) ("DMPE-DTPA-Gd"); 또는 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriamine-pentaacetic acid (copper salt) ("DMPE-DTPA-Cu") 등이 포함될 수 있다. Cas9 및 guide RNA는 cationic polymer 예를 들어, poly-L-lysine, polyamidoamine, poly[2-(N,N-dimethylamino)ethyl methacrylate], chitosan, poly-L-ornithine, cyclodextrin, histone, collagen, dextran, 또는 polyethyleneimine (PEI)를 포함하여 복합체를 형성하며, 나노리포좀 전달체가 hybrid CRISPR complex를 캡슐화하여 전달할 수 있다.
경우에 따라서, CRISPR Cas 시스템은 핵산-지질 입자(SNALP)와 같은 리포좀으로 투여될 수 있다. SNALP 제형은 지질 3-N-[(w메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 2000) 카바모일]-1,2-디미리스틸옥시-프로필아민(PEG-C-DMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 및 콜레스테롤을 2:40:10:48 몰 백분율 비로 함유할 수 있다 (Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006). 또한, SNALP는 합성 콜레스테롤, 디팔미토일포스파티딜콜린, 3-N-[(w-메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바모일]-1,2-디미레스틸옥시프로필아민, 및 양이온성 1,2-디리놀레일옥시-3-N,N-디메틸아미노프로판을 포함할 수 있다 (Geisbert et al., Lancet 2010, 375: 1896-905). 더욱이, SNALP는 양이온성 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질을, 예를 들어 각각 40:10:40:10의 몰비로, 예를 들어 에탄올 중에 용해시킴으로써 제조될 수 있다(Semple et al., Nature Niotechnology, Volume 28 Number 2 February 2010, pp. 172-177).
미국등록특허 제10626393호에는 지질 나노입자를 이용하여 핵산 전달하기 위한 약학적 조성물이 기재되어 있다. gRNA 포함 제1핵산-지질 나노입자 및 Cas9 단백질 코딩 mRNA 포함 제2핵산-지질 나노입자를 포함한다. 이 중, 제1핵산-지질 나노입자는 양이온성 지질 및 비양이온성 지질을 포함한다. 이러한 지질 나노입자를 적용하여 생체 내 Cas9 단백질 코딩 mRNA 및 gRNA를 효과적으로 전달하여 표적 특이적 변이를 유발할 수 있다. 상기 양이온성 지질은 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLinDMA), 1,2-dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLenDMA), 1,2-di-γ-linolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane (γ-DLenDMA; Compound (15)), 3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yloxy)-N,N-dimethylpropan-1-amine (DLin-MP-DMA; Compound (8)), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate) (Compound (7)), (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enyl)docosa-6,16-dien-11-yl 5-(dimethylamino)pentanoate (Compound (13)) 등을 포함한다. 상기 비양이온성 지질은 인지질 또는 콜레스테롤을 포함한다. 이러한 지질 나노입자는 본 발명에 적용될 수 있다.
경우에 따라서, 표적 핵산의 발현을 조절하기 위해 guide RNA의 3' 또는 5'에 MS2 박테리오파지 코트 단백질과 같은 RNA binding domain target을 포함하는 압타머를 연결할 수 있으며, 미국등록특허 제10640789호를 참조할 수 있다. 세포에서 RNA binding domain target에 결합하는 RNA binding domain 포함 transcriptional activator 또는 repressor 발현시킬 수 있다. 세포내에서 guide RNA에 transcriptional activator 또는 repressor가 연결되어, transcriptional activator 또는 repressor를 통해 타겟 핵산의 발현이 조절됨으로써, 교정 효율을 증대시킬 수 있다.
(5) 엑소좀을 통한 전달
"엑소좀"은 세포-유래된 작은 (20-300 nm 직경, 더 바람직하게는 40-200 nm 직경) 소포로서, 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하고, 직접적인 원형질막 버딩 또는 후기 엔도솜과 원형질막의 융합에 의해 상기 세포로부터 생성되는 소포를 지칭한다. 일반적으로, 엑소좀의 생산은 생산 세포의 파괴를 초래하지 않는다. 엑소좀은 지질 또는 지방산 및 폴리펩타이드를 포함하며, 선택적으로 페이로드 (예를 들어 치료제), 리시버 (예를 들어 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어 핵산, RNA, 또는 DNA), 당 (예를 들어 단당, 다당류, 또는 글리칸) 또는 다른 분자를 포함한다. 엑소좀은 생산 세포로부터 유도되고, 그것의 크기, 밀도, 생화학적 파라미터, 또는 이들의 조합에 기초하여 생산 세포로부터 단리될 수 있다.
이러한 엑소좀은 세포외 소포 또는 소기관을 9 내지 14의 pH를 갖는 수용액으로 처리하여 개방시켜 막을 수득하고, 소포내 또는 소기관 내용물을 제거한 다음, 막을 재조립(re-assembling)하여 막 소포 형태를 형성함으로써 수득할 수 있다.
상기 엑소좀에 전달대상물을 혼합하고, 재조립하여 막 소포를 형성하도록 할 수 있다. 전달대상물은 게놈 편집 시스템일 수 있다. 게놈 편집 시스템은, 비제한적으로, 메가뉴클레아제(meganuclease) 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nuclease; ZFN) 시스템, 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 (transcription activator-like effector nuclease; TALEN) 시스템, 및 클러스터링된 규칙적으로 공간을 둔 짧은 회문 반복 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats; CRISPR) 시스템을 포함한다. CRISPR 시스템은 CRISPR-Cas9 시스템일 수 있다. CRISPR-Cas9 시스템은 Cas9 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 표적 서열과 혼성화된 CRISPR RNA (crRNA)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. crRNA 및 tracrRNA는 하나의 가이드 RNA에 융합될 수 있다. CRISPR-Cas 시스템의 성분은 동일한 벡터에 또는 상이한 벡터에 위치할 수 있다. CRISPR-Cas9 시스템은 추가로, 핵 국재화 신호 (nuclear localization signal; NLS)를 포함할 수 있다. 이러한 엑소좀은 본 발명에 따른 조성물 전달에 적용될 수 있으며, 참조로서 도입될 수 있다.
기능기화된 엑소좀을 통해 CRISPR-Cas9 시스템을 전달할 수 있다 (Biomater Sci. 2020 May 19;8(10):2966-2976.). GFP 및 GFP nanobody를 엑소좀 막 단백질인 CD63과 결합시키고 Cas9 단백질을 엑소좀에 융합시킬 수 있다. 이를 통해 Recipient cell에서 타겟 유전자 효율적으로 편집할 수 있음이 확인되었다. 이러한 엑소좀을 통해 본 발명에 따른 조성물을 전달할 수 있으며, 참조로서 도입된다.
국제공개특허 제WO2020/101740 및 미국공개특허 제US2020/0155703호에서와 같이 치료용 막 소포는 그것의 표면 분자를 통해 수령 세포와 상호작용하는 능력에 의해 세포외 소포, 예컨대 엑소좀을 모방한다. 치료용 막 소포는 세포외 소포 또는 소기관으로부터 유래된 막으로부터 형성된다. 예를 들어, 상기 막은 그와 같은 세포외 소포 또는 소기관의 개방에 의해 세포외 소포 또는 소기관으로부터 유래될 수 있다. 따라서 결과적으로 비어 있는 치료용 막 소포는 유해한 내인성 분자 예컨대 DNA 또는 핵막 성분, 또는 임의의 원치않는 RNA 종, 효소 또는 다른 단백질, 뿐만 아니라 감염성 성분 예컨대 바이러스, 바이러스 게놈 물질 및 또는 프리온을 포함하는 바이러스 성분 또는 유사한 감염성 요소를 포함하여, 천연 세포외 소포 또는 소기관이 함유하는 해로운 내용물이 없을 수 있다.
치료용 막 소포는 치료 전달대상물로 로딩될 수 있다. 로딩된 전달대상물을 포함하는 치료용 막 소포는 그것의 표면 분자를 통해 수령 세포와 상호작용하고 상기 수령 세포에 그것의 전달대상물을 전달하는 능력을 갖는다는 점에서 자연 발생 세포외 소포를 모방한다.
치료용 막 소포는 예를 들어 표적화 효능, 전달을 개선시키고, 수령 세포/기관/대상으로의 치료 전달대상물을 증가시킴으로써 현재의 세포외 소포 치료제가 갖는 여러 문제를 해결할 수 있다. 치료용 막 소포는 그것의 표면 분자를 통해 수령 세포와 상호작용하고/하거나 수령 세포에 치료 전달대상물을 전달하는 능력에서 엑소좀 또는 임의의 다른 세포외 소포를 모방함으로써 엑소좀 또는 임의의 다른 세포외 소포를 모방한다고 할 수 있다. 동시에, 치료용 막 소포는 가능한 부정적인 부작용을 갖는 원치않는 세포외 소포, 뿐만 아니라 이들이 자연적으로 함유할 수 있는 임의의 해로운 내용물로의 가능한 오염을 경감시킬 수 있다는 점에서 엑소좀 및 다른 자연 발생 세포외 소포와 상이하다.
유럽공개특허 제3706796호 및 유럽등록특허 제3463465호에서와 같이, 엑소좀 폴리펩타이드를 통해 본 발명에 따른 조성물을 전달할 수 있으며, 참조로서 도입된다.
"엑소좀 폴리펩타이드"는 폴리펩타이드 작제물의 소포체 구조물, 예를 들어, 엑소좀으로의 수송, 트래픽킹 또는 셔틀링을 가능하게 할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 (상기 언급된 바와 같이 전형적으로 적어도 하나의 PoI 및 적어도 하나의 폴리펩타이드 기반 방출 시스템을 포함하지만 또한 표적화 펩타이드/폴리펩타이드를 포함할 수 있는)를 포함한다.
예를 들어 CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, Fc 수용체, 인터류킨 수용체, 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 성분들, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A 또는 VTI1B일 수 있다.
상기 엑소좀은 핵산을 포함하고, 단일-가닥 RNA 또는 DNA, 이중-가닥 RNA 또는 DNA, 화학적으로 합성 그리고/또는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 엑소좀은 목적하는 폴리펩타이드 (PoI)를 포함하고, 여기서, 상기 목적하는 폴리펩타이드는 엑소좀 폴리펩타이드에 방출가능하게 부착되어 있다. 목적하는 폴리펩타이드의 엑소좀 폴리펩타이드로의 부착은 방출가능하여 목적하는 치료학적 폴리펩타이드의 EV로의 효율적이고, 방해받지 않는 로딩 및 내인성으로 유발된 방출을 가능하게 한다. 목적하는 폴리펩타이드와 엑소좀 폴리펩타이드 간의 방출가능한 부착은 EV 내부에서 및/또는 후속적으로 표적 세포 또는 표적 조직 내부에서 목적하는 폴리펩타이드의 내인성으로 활성화될 수 있는 방출을 가능하게 하여 로딩 및 치료학적 활성을 최적화할 수 있는 방출 시스템에 의해 매개되는 특성이다. 상기 방출 시스템은 외부 자극에 대한 필요 없이 활성화되거나 유발될 수 있는 다양한 방출가능한 폴리펩타이드 상호작용 시스템(즉, 상기 방출 시스템은 전형적으로 세포 또는 EV 내, 또는 필수적으로 임의의 생물학적 시스템 내에서 내인성 활성에 의해 유발된다), 예를 들어, 시스-절단 폴리펩타이드-기반 방출 시스템(예를 들어, 인테인을 기준으로), 핵 국소화 신호 (NLS) - NLS 결합 단백질 (NLSBP) 기반 방출 시스템 또는 다른 단백질 도메인을 기준으로 하는 방출 시스템을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있는 폴리펩타이드 기반 시스템을 포함할 수 있다. 단량체성 광-유도된 절단-기반 방출 시스템이 사용될 수 있고, 여기서, 단지 매우 짧은 광 부스트를 사용하여 단량체성 단백질 도메인의 내인성 단백질용해 절단을 개시하고 목적하는 폴리펩타이드를 방출할 수 있다.
한국등록특허 제1900465호에 따르면, 광특이적 결합 단백질을 이용하여 Cas9 단백질을 포함하는 엑소좀이 기재되어 있다. 광특이적 결합 단백질을 사용하여, 일시적으로 목적 단백질을 마커 단백질과 결합시켜서, 목적 단백질이 내부에 포함되도록 엑소좀을 제조하는 기술이 기재되어 있다. 예를 들어, 광특이적 결합 단백질인 CIBN과 CRY2을 이용할 수 있는데, 구체적으로, 상기 CIBN은 상기 마커 단백질의 하나인 CD9과 융합된 형태로 발현되도록 하고, 상기 CRY2는 목적 단백질과 융합된 형태로 발현되도록 이들 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 엑소좀 생산 세포에 도입하였다. 상기 엑소좀 생산세포에서 발현된 CIBN-CD9 융합 단백질은 CD9으로 인하여 엑소좀에 포함되는데, 이때, 상기 세포에 푸른 빛 LED 조명을 조사하면, 상기 엑소좀 생산세포에서 발현된 목적단백질-CRY2 융합 단백질의 CRY2 도메인이 CD9에 융합된 CIBN 도메인에 결합되므로, 목적단백질-CRY2-CIBN-CD9 형태의 가역적으로 유도된 융합 단백질이 형성되고, 이와 같은 융합 단백질은 CD9으로 인하여 엑소좀 내부에 포함된다. 이처럼 목적단백질이 내부에 포함된 엑소좀이 생산된 후, 상기 푸른 빛 LED 조명을 더 이상 조사하지 않으면, CIBN-CRY2 결합이 해제되어, 목적단백질이 엑소좀의 세포막에 결합되지 않은 상태로 엑소좀 내부에 포함되게 되므로, 결과적으로는 목적 단백질을 포함하는 엑소좀을 제조할 수 있다.
광특이적 단백질로 CRY(chryptochrome) 이외에도 CIB(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix protein), CIBN(N-terminal domain of CIB), PhyB(phytochrome B), PIF(phytochrome interacting factor), FKF1(Flavinbinding, Kelch repeat, F-box 1), GIGANTEA 또는 PHR(phytolyase homolgous region) 등이 사용될 수 있다.
엑소좀 막에 부착되어 있는 상태로 있으므로 엑소좀 막으로부터 분리되지 못하므로, 엑소좀이 표적 세포의 세포막에 융합되는 경우에만, 상기 목적 단백질이 표적 세포로 전달될 수 있고, 이처럼 표적 세포에 융합된 후에도, 엑소좀막에 융합된 엑소좀에 결합된 형태로 존재하기 때문에, 상기 목적 단백질이 표적 세포내에서 그의 효과를 나타낼 확률이 매우 낮다는 한계가 있었다. 그러나, 엑소좀 내부에 목적 단백질이 막에 결합되지 않은 상태로 포집되어 있는 경우, 엑소좀이 표적 세포에 의하여 endocytosis되어 세포질로 들어갔을 때, 엑소좀 막에 부착되어 있는 것이 아니므로 엑소좀이 분해되는 경우, 목적 단백질이 표적 세포의 세포질로 전달될 수 있으며, 표적 세포의 세포질 내에서 자유롭게 이동이 가능하므로, 목적 단백질이 표적 세포질에서 생리 활성을 충분히 나타낼 수 있다.
CRY2 및 mCherry의 융합 단백질과 CIB 및 CD9의 융합 단백질을 엑소좀을 많이 만들어내는 불멸세포주인 HEK293T 세포 내에서 발현한 결과, 세포질에 균일하게 퍼져있던 mCherry 단백질의 분포가 푸른 빛을 쬐어주었을 때 세포막, 엔도솜 유사 구조등의 막에 있는 것이 관찰되었다. FKF1 및 mCherry의 융합 단백질과 GIGANTEA 및 CD9의 융합 단백질을 HEK293T 세포에서 발현시켰을 때도 유사한 결과를 관찰할 수 있었다. 또한, CRY2 및 mCherry의 융합 단백질과 CIBN 및 CD9의 융합 단백질을 HEK293T에 발현시키고, 푸른 빛의 세기를 조절한 결과, 20 내지 50 μW의 빛을 조사하였을 때, 엑소좀 내에 포집된 mCherry 단백질이 가장 높은 수준을 나타냄을 확인하였으며, 상기 세포에서 생산 분리된 엑소좀을 이종세포인 HT1080 세포에 약 250㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, HT1080 세포에 대하여 특별한 세포독성을 나타내지 않았고, 상기 HT1080 세포의 세포질로 mCherry 단백질이 전달됨을 확인하였다. 이러한 결과에 따라, 본 발명에 따른 조성물 전달시 엑소좀을 적용할 수 있으며, 참조로서 도입될 수 있다.
6. 전달방법
A. 전달대상
본 발명에 따른 조성물은 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 서열 중 정상세포에는 존재하지 않는 고유 서열을 포함하는 핵산 서열 복수개를 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 각각을 전달하기 위해 단일 또는 전달 수단을 동일 또는 상이한 구성으로 조합하여 사용할 수 있다.
국제공개특허 WO2015/191693에 따르면, gRNA는 제1전달 수단에 포함되고 핵산 편집 시스템은 제2전달 수단에 포함하는 전달 시스템이 기재되어 있다. 각각의 전달 시스템은 동시에 바이러스 전달수단이거나, 하나는 바이러스 전달수단이고 다른 하나는 비-바이러스 전달수단이거나, 동시에 비-바이러스 전달수단일 수 있음이 기재되어 있다. 본 발명에 따른 조성물을 전달하기 위해 적용할 수 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
상기 복수개의 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA 서열, DNA 서열, 또는 이의 조합(RNA-DNA 조합 서열)일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에서 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 절단인자의 RNA 서열 또는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물에서 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 핵산절단효소 단백질, 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 RNA 서열 또는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
B. 벡터에 의한 전달
본 발명에 따른 조성물을 전달하기 위한 방법으로, 절단인자의 DNA 서열 및 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 절단인자의 DNA 서열 및 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 DNA 서열이 벡터와 같은 전달 수단을 통해 제공될 수 있다.
일 관점에서, 본 발명은 (i) 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 벡터에 관한 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 (i) 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 (i) 및 (ii)가 동일 또는 상이한 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시예에서 (i) 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 각각은 동일 또는 상이한 벡터에 포함될 수 있다.
(1) 개별 벡터를 이용한 전달
벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 복수개의 절단인자 및 핵산절단효소의 핵산 전사물, 단백질 또는 효소)의 발현을 위해 설계될 수 있다. 절단인자의 DNA 서열 및 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 DNA 서열 각각을 별개의 다른 벡터상에 위치하도록 하여 전달할 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터 예를 들어, Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV) 또는 Retroviral Vector (RV), 이외 기타 바이러스 벡터, 예를 들어, Simian virus 40 (SV40) ori, bovine papilloma virus (BPV) ori 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV) ori를 포함하는 에피좀 벡터를 사용하여 전달할 수 있다.
(2) 단일 벡터를 이용한 전달
절단인자의 DNA 서열 및 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 DNA 서열이 동일한 벡터 상에 위치하도록 하여 하나의 벡터를 통해 동시에 전달할 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터 예를 들어, Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV) 또는 Retroviral Vector (RV), 이외 기타 바이러스 벡터, 예를 들어, Simian virus 40 (SV40) ori, bovine papilloma virus (BPV) ori 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV) ori를 포함하는 에피좀 벡터를 사용하여 전달할 수 있다.
복수개의 절단인자를 포함하여 다중 유전자 편집하는 것은 crRNA-processing mechanism과 연관이 있다 (Nature Communications volume 11, Article number: 1281 (2020), Nature Biotechnology volume 35, pages31-34(2017)).
핵산절단효소의 종류와 관련하여 Cas12a/Cas13a은 tracrRNA 없이 crRNA을 가공할 수 있다. 자체 nuclease 특성을 보유하여, precursor crRNA (pre-crRNA) 가공에 필요한 repetitive sequence인 DR (direct repeat) 제거할 수 있다.
Cas6는 final effector complex 형성을 위해 accessory protein 필요하고, Cas6에 의해 가공된 crRNA가 cascade로 불리는 Cas5, Cas6, Cas7, Cas8로 구성된 타겟 인지 모듈에 도입되고, 이러한 cascade 복합체가 외부 유전자의 PAM을 인지하여 DNA를 편집한다.
Cas9, Cas12b, Cas12c는 tracrRNA (transactivating crRNA) 및 RNase III를 통해 precursor crRNA (pre-crRNA) 가공한다.
복합 유전자 교정에서 예를 들어, Cas9이 적용되는 경우 Cas9의 gRNA는 crRNA:tracrRNA complex 포함하고, crRNA:tracrRNA가 융합하여 sgRNA를 형성하기 때문에 복합 유전자 교정을 위해 각각의 crRNA 사이에 precursor crRNA (pre-crRNA) 가공에 필요한 repetitive sequence인 direct repeat를 삽입하고, tracrRNA를 별도로 발현되도록 하여, RNase III가 tracrRNA에 따라 작동하여 direct repeats를 제거하면서 복수의 유전자를 편집할 수 있다.
경우에 따라서, 각각의 RNA 사이에 ribozymes과 같은 self-cleaving sequence 결합시키거나, RNA 중 28-nt stem-loop sequence를 인지하여 20번째 뉴클레오티드를 절단하는 효소인 Csy4 인지 부위를 결합시키거나, 또는 내인성 RNase P/RNase Z에 의해 가공 가능한 tRNA를 삽입함으로써, precursor crRNA (pre-crRNA)가 crRNA로 가공될 수 있도록 한다.
복수의 gRNA 각각 사이에 ribozymes과 같은 self-cleaving sequence 결합시킬 수 있다. Pol II 및 Pol III 프로모터를 적용하여 Pol II 및 Pol III 프로모터에 의해 매개되는 전사를 통해 pre-crRNA를 가공할 수 있다.
또한, RNA 중 28-nt stem-loop sequence를 인지하여 20번째 뉴클레오티드를 절단하는 효소인 Csy4 인지 부위를 결합시킬 수 있다. Csy4 인지 서열을 포함하는 gRNA와 Csy4를 공동 발현 시키면 다중 gRNA가 발현되고 단일 프로모터를 통해 가공될 수 있다.
더욱이, 내인성 RNase P/RNase Z에 의해 가공 가능한 tRNA를 삽입하여, pre-crRNA를 가공할 수 있다. RNase P/RNase Z는 pre-tRNA의 5' 말단 및 3' 말단을 절단하며, 다중 gRNA가 tRNA-gRNA로부터 가공될 수 있다.
C. 벡터 및 mRNA, 캐리어 또는 엑소좀 조합
본 발명에 따른 조성물을 전달하기 위한 방법으로, 절단인자의 DNA 서열 및 핵산절단효소 단백질 또는 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 RNA 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 (ii)가 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
상기 절단인자의 DNA 서열은 벡터를 통해 전달될 수 있다. 본 명세서 중 기재된 임의의 벡터를 적용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV) 또는 Retroviral Vector (RV), 이외 기타 바이러스 벡터, 예를 들어, Simian virus 40 (SV40) ori, bovine papilloma virus (BPV) ori 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV) ori를 포함하는 에피좀 벡터를 사용하여 전달할 수 있다.
핵산절단효소 단백질을 코딩하는 RNA 서열을 mRNA 형태로 전달할 수 있다. mRNA 형태의 전달로 synthetic modified mRNA 또는 self-replicating RNA (srRNA)를 포함할 수 있다.
핵산절단효소 단백질 또는 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 RNA 서열은 변형 뉴클레오시드를 포함하거나, 합성 자기-복제 RNA (synthetic self-replicative RNA)를 포함하거나, 본 명세서 중 기재된 캐리어 또는 엑소좀을 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, nanoparticle, cpp, polymer 등의 캐리어 또는 엑소좀을 통해 전달할 수 있다.
D. mRNA 또는 캐리어에 의한 전달
본 발명에 따른 조성물을 전달하기 위한 방법으로, 절단인자의 RNA 서열 및 핵산절단효소 단백질 또는 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 RNA 서열을 포함할 수 있다. 절단인자의 mRNA 형태로 전달할 수 있다. 핵산절단효소는 단백질 형태 또는 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 mRNA 형태로 전달할 수 있다.
본 발명은 (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 캐리어에 관한 것이다.
본 발명은 (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)가 캐리어에 포함되는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 엑소좀에 관한 것이다.
본 발명은 (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)가 엑소좀에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
mRNA 형태의 전달로 synthetic modified mRNA 또는 self-replicating RNA (srRNA)를 포함할 수 있다.
절단인자의 mRNA, 핵산절단효소 단백질 또는 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 mRNA 서열을 핵산절단효소 단백질 형태로 전달, 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 mRNA 형태로 전달, 또는 본 명세서 중 기재된 캐리어 또는 엑소좀 예를 들어, nanoparticle, cpp, polymer 등의 캐리어 또는 엑소좀을 통해 전달할 수 있다.
E. RNP에 의한 전달
절단인자의 mRNA, 핵산절단효소 단백질을 RNP 형태로 in vitro에서 복합체를 형성하도록 하여 전달할 수 있다.
본 발명은 (i) 핵산절단효소; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체에 관한 것이다.
본 발명은 (i) 핵산절단효소; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)가 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체를 형성하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
경우에 따라서 RNP를 본 명세서 중 기재된 캐리어 또는 엑소좀 예를 들어, nanoparticle, cpp, polymer 등의 캐리어 또는 엑소좀을 통해 전달할 수 있다.
7. 엑소뉴클레아제
본 발명의 구체적 실시예에서, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 사용하는 경우 세포사멸 유도에 필요한 절단인자 수를 줄일 수 있음을 확인하였다.
다른 관점에서, 본 발명은 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
상기 엑소뉴클레아제는 5'-3'의 뉴클레오티드 절단능을 가질 수 있다. 본 발명에 따르면, Cas9의 경우 5개의 gRNA로 세포사멸이 일어나지 않았지만 Exo-Cas9을 사용하면 5개의 gRNA로도 충분히 세포사멸을 일으키는 것을 확인하였다. 이론에 구애받지 않으나, Cas9에 의한 DNA double strand break 이후에 복구를 저해하기 때문인 것으로 판단된다.
상기 엑소뉴클레아제 I은 미생물, 효소, 곤충, 마우스 또는 인간 유래일 수 있다. 구체적으로, 상기 엑소뉴클레아제 I은 서열번호 31의 서열을 포함할 수 있다.
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엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 사용하는 경우, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 세포사멸을 유도하기에 충분한 타겟에 해당하는 서로 다른 2개 이상일 수 있다. . 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 예를 들어 서로 다른 20개 이하일 수 있다. 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 예를 들어, 서로 다른 각각의 2-20개일 수 있다.
상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 구체적으로 서로 다른 각각의 2-20개, 2-19개, 2-18개, 2-17개, 2-16개, 2-15개, 2-14개, 2-13개, 2-12개, 2-11개, 2-10개, 2-9개, 2-8개, 2-7개, 2-6개, 2-5개, 2-4개, 또는 2-3개일 수 있다.
상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 구체적으로, 서로 다른 각각의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 (숫자 사이의 범위도 포함)일 수 있다.
변이가 존재하는 위치가 포함된 게놈은 세포에서 이배체 (diploid) 및/또는 삼배체 (triploid)일 수 있으므로, 서로 다른 각각의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 (숫자 사이의 범위도 포함) 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20쌍의 변이영역을 고려하여, 서로 다른 2-40개 예를 들어, 서로 다른 40개, 39개, 38개, 37개, 36개, 35개, 34개, 33개, 32개, 31개, 30개, 29개, 28개, 27개, 26개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개 또는 2개(숫자 사이의 범위도 포함)의 이중가닥절단(Double-stranded break, DSB)을 유도하여 세포를 사멸시킬 수 있다.
상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역은 핵산 서열로 예를 들어, 코딩 또는 비코딩 핵산일 수 있다. 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역의 핵산은 코딩 핵산일 수 있고, 게놈(genome)으로부터 전사되어 단백질로 번역될 수 있다. 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역의 핵산은 비코딩 핵산일 수 있고, 게놈으로부터 전사되어 단백질로 번역되지 않는다.
본 발명에 따른 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 변이는 정상세포에서 발견되지 않을 수 있다. 이러한 변이는 게놈 서열 변이를 가지는 세포와 정상세포를 WGS (whole genome sequencing)하여 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역의 서열 예를 들어, 서열의 삽입, 결실, 치환로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 서열의 매핑은 WGS (whole genome sequencing), 또는 차감 혼성화 (subtractive hybridization) 및 시퀀싱의 방법을 통하여 수행될 수 있고, 이 때 도출된 InDel의 경우 암에서 발견된 삽입의 경우에는 바로 가이드 RNA를 제작하고, 결실의 경우에는 절단 지점 (break point)을 매핑한 후에 절단 지점을 포함하는 가이드 RNA를 제작하여 사용할 수 있다.
WGS는 차세대 시퀀싱 (next generation sequencing)에 의한 전장 유전체 시퀀싱을 10 X, 20 X, 40 X 형식으로 여러 배수로 유전체를 읽는 방법을 의미한다. "차세대 시퀀싱"은 칩 (Chip) 기반, 그리고 PCR 기반 페어드 엔드 (paired end) 형식으로 전장 유전체를 조각내고, 상기 조각을 화학적인 반응 (hybridization)에 기초하여 초고속으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미한다.
차감 혼성화는 여러 조직 또는 세포 간에 발현의 차이가 있는 유전자의 클로닝에 이용되는 방법이다. 시험하는 세포의 DNA 시료 특이적 유전자가 검출될 수 있다. 시험하는 세포의 DNA를 한 가닥 DNA로 변성시킨 후에 어닐링(annealing)시킨다. 어닐링 조건을 조절함으로써, 시험하는 세포 특이적 DNA 서열을 2 가닥 DNA로 분리할 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 복수개로, 복수개 각각의 절단인자의 서열이 상이하여 서로 다른 서열을 포함할 수 있다.
상기 절단인자는 정상세포의 염기서열과 비교하여 세포의 사멸을 유도할 수 있는 충분한 복수개의 숫자여야 하고, 서로 다른 서열을 가지는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상일 수 있다. 상기 절단인자는 서로 다른 서열을 가지는 20개 이하, 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하일 수 있다.
상기 절단인자의 숫자가 많아질수록 세포 사멸이 더 잘 이루어지지만, 10개 정도되면 충분한 변이 세포 사멸 효과를 보여준다. 따라서, 절단인자의 숫자는 2개부터 10개까지, 바람직하게는 2개부터 8개까지, 보다 바람직하게는 3개부터 5개까지 선택할 수 있다.
상기 절단인자는 서로 다른 서열을 가지는 4-20개, 4-19개, 4-18개, 4-17개, 4-16개, 4-15개, 4-14개, 4-13개, 4-12개, 4-11개, 또는 4-10개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 6-20개, 6-19개, 6-18개, 6-17개, 6-16개, 6-15개, 6-14개, 6-13개, 6-12개, 6-11개, 또는 6-10개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 8-20개, 8-19개, 8-18개, 8-17개, 8-16개, 8-15개, 8-14개, 8-13개, 8-12개, 8-11개, 또는 8-10개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 10-20개, 10-19개, 10-18개, 10-17개, 10-16개, 10-15개, 10-14개, 10-13개, 또는 10-12개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 12-20개, 12-19개, 12-18개, 12-17개, 12-16개, 12-15개, 12-14개, 또는 12-13개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 14-20개, 14-19개, 14-18개, 14-17개, 14-16개, 또는 14-15개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 16-20개, 16-19개, 16-18개, 또는 16-17개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 18-20개, 또는 18-19개일 수 있다.
본 발명에서 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 또는 4개 포함할 수 있다 (숫자 사이의 범위도 포함). 상기 절단인자는 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개를 포함할 수 있다(숫자 사이의 범위도 포함).
상기 절단인자는 정상세포의 염기서열과 비교하여 세포의 사멸을 유도할 수 있는 충분한 숫자여야 하고, 서로 다른 서열을 가지는 2-20개일 수 있다. 2-20개, 2-19개, 2-18개, 2-17개, 2-16개, 2-15개, 2-14개, 2-13개, 2-12개, 2-11개, 2-10개, 2-9개, 2-8개, 2-7개, 2-6개, 2-5개, 2-4개, 또는 2-3개일 수 있다.
절단인자가 타겟하는 염색체가 이배체 (diploid) 및/또는 삼배체 (triploid)인지 여부에 따라, 각 절단인자가 타겟하는 서열을 2개 및/또는 3개 포함할 수 있다. 따라서, 절단인자에 의해 유도되는 이중 가닥 절단 (DSB)는 세포의 사멸을 유도할 수 있는 절단인자 수의 2배 및/또는 3배일 수 있다. 예를 들어, 서로 다른 서열을 가지는 2개의 절단인자를 포함하는 경우 세포사멸을 위해 4개 내지 6개의 이중 가닥 절단 (DSB)이 필요하다.
경우에 따라서, DNA 이중나선절단을 통해 세포 사멸 효율을 높이고자 DNA 이중나선 복구를 저해하도록 예를 들어, Caffeine, Wortmannin, CP-466722, KU-55933, KU-60019, KU-559403으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 ATM (Ataxia telangiectasia mutated) 저해제, Schisandrin B, NU6027, NVP-BEZ235, VE-821, VE-822 (VX-970), AZ20, AZD6738로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 ATR (Ataxia telangiectasia and Rad-3 mutated) 저해제, 또는 DNA-PKcs (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)의 DNA 이중나선 복구 저해제를 추가로 포함할 수 있다.
A. 전달대상
본 발명에 따른 조성물은 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 세포 특이적 변이영역의 서열 중 정상세포에는 존재하지 않는 고유 서열을 포함하는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 각각을 전달하기 위해 단일 또는 전달 수단을 동일 또는 상이한 구성으로 조합하여 사용할 수 있다.
상기 복수개의 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA 서열, DNA 서열, 또는 이의 조합(RNA-DNA 조합 서열)일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에서 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 절단인자의 RNA 서열 또는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물에서 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단백질, 단백질을 코딩하는 RNA 서열 또는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
B. 벡터에 의한 전달
본 발명에 따른 조성물을 전달하기 위한 방법으로, 절단인자의 DNA 서열 및 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 절단인자의 DNA 서열 및 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 DNA 서열이 벡터와 같은 전달 수단을 통해 제공될 수 있다.
일 관점에서, 본 발명은 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 벡터에 관한 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 (i) 및 (ii)가 동일 또는 상이한 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시예에서 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 인식하는 하나 이상의 절단인자 각각은 동일 또는 상이한 벡터에 포함될 수 있다.
(1) 개별 벡터를 이용한 전달
벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 복수개의 절단인자 및 핵산절단효소의 핵산 전사물, 단백질 또는 효소)의 발현을 위해 설계될 수 있다. 절단인자의 DNA 서열 및 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 DNA 서열 각각을 별개의 다른 벡터상에 위치하도록 하여 전달할 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터 예를 들어, Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV) 또는 Retroviral Vector (RV), 이외 기타 바이러스 벡터, 예를 들어, Simian virus 40 (SV40) ori, bovine papilloma virus (BPV) ori 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV) ori를 포함하는 에피좀 벡터를 사용하여 전달할 수 있다.
(2) 단일 벡터를 이용한 전달
절단인자의 DNA 서열 및 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 DNA 서열이 동일한 벡터 상에 위치하도록 하여 하나의 벡터를 통해 동시에 전달할 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터 예를 들어, Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV) 또는 Retroviral Vector (RV), 이외 기타 바이러스 벡터, 예를 들어, Simian virus 40 (SV40) ori, bovine papilloma virus (BPV) ori 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV) ori를 포함하는 에피좀 벡터를 사용하여 전달할 수 있다.
복수개의 절단인자를 포함하여 다중 유전자 편집하는 것은 crRNA-processing mechanism과 연관이 있다 (Nature Communications volume 11, Article number: 1281 (2020), Nature Biotechnology volume 35, pages31-34(2017)).
핵산절단효소의 종류와 관련하여 Cas12a/Cas13a은 tracrRNA 없이 crRNA을 가공할 수 있다. 자체 nuclease 특성을 보유하여, precursor crRNA (pre-crRNA) 가공에 필요한 repetitive sequence인 DR (direct repeat) 제거할 수 있다.
Cas6는 final effector complex 형성을 위해 accessory protein 필요하고, Cas6에 의해 가공된 crRNA가 cascade로 불리는 Cas5, Cas6, Cas7, Cas8로 구성된 타겟 인지 모듈에 도입되고, 이러한 cascade 복합체가 외부 유전자의 PAM을 인지하여 DNA를 편집한다.
Cas9, Cas12b, Cas12c는 tracrRNA (transactivating crRNA) 및 RNase III를 통해 precursor crRNA (pre-crRNA) 가공한다.
복합 유전자 교정에서 예를 들어, Cas9이 적용되는 경우 Cas9의 gRNA는 crRNA:tracrRNA complex 포함하고, crRNA:tracrRNA가 융합하여 sgRNA를 형성하기 때문에 복합 유전자 교정을 위해 각각의 crRNA 사이에 precursor crRNA (pre-crRNA) 가공에 필요한 repetitive sequence인 direct repeat를 삽입하고, tracrRNA를 별도로 발현되도록 하여, RNase III가 tracrRNA에 따라 작동하여 direct repeats를 제거하면서 복수의 유전자를 편집할 수 있다.
경우에 따라서, 각각의 RNA 사이에 ribozymes과 같은 self-cleaving sequence 결합시키거나, RNA 중 28-nt stem-loop sequence를 인지하여 20번째 뉴클레오티드를 절단하는 효소인 Csy4 인지 부위를 결합시키거나, 또는 내인성 RNase P/RNase Z에 의해 가공 가능한 tRNA를 삽입함으로써, precursor crRNA (pre-crRNA)가 crRNA로 가공될 수 있도록 한다.
복수의 gRNA 각각 사이에 ribozymes과 같은 self-cleaving sequence 결합시킬 수 있다. Pol II 및 Pol III 프로모터를 적용하여 Pol II 및 Pol III 프로모터에 의해 매개되는 전사를 통해 pre-crRNA를 가공할 수 있다.
또한, RNA 중 28-nt stem-loop sequence를 인지하여 20번째 뉴클레오티드를 절단하는 효소인 Csy4 인지 부위를 결합시킬 수 있다. Csy4 인지 서열을 포함하는 gRNA와 Csy4를 공동 발현 시키면 다중 gRNA가 발현되고 단일 프로모터를 통해 가공될 수 있다.
더욱이, 내인성 RNase P/RNase Z에 의해 가공 가능한 tRNA를 삽입하여, pre-crRNA를 가공할 수 있다. RNase P/RNase Z는 pre-tRNA의 5' 말단 및 3' 말단을 절단하며, 다중 gRNA가 tRNA-gRNA로부터 가공될 수 있다.
C. 벡터 및 mRNA, 캐리어 또는 엑소좀 조합
본 발명에 따른 조성물을 전달하기 위한 방법으로, 절단인자의 DNA 서열 및 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 핵산절단효소를 코딩하는 RNA 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 (ii)가 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
상기 절단인자의 DNA 서열은 벡터를 통해 전달될 수 있다. 본 명세서 중 기재된 임의의 벡터를 적용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV) 또는 Retroviral Vector (RV), 이외 기타 바이러스 벡터, 예를 들어, Simian virus 40 (SV40) ori, bovine papilloma virus (BPV) ori 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV) ori를 포함하는 에피좀 벡터를 사용하여 전달할 수 있다.
엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 RNA 서열을 mRNA 형태로 전달할 수 있다. mRNA 형태의 전달로 synthetic modified mRNA 또는 self-replicating RNA (srRNA)를 포함할 수 있다.
엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 핵산절단효소를 코딩하는 RNA 서열은 변형 뉴클레오시드를 포함하거나, 합성 자기-복제 RNA (synthetic self-replicative RNA)를 포함하거나, 본 명세서 중 기재된 캐리어 또는 엑소좀을 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, nanoparticle, cpp, polymer 등의 캐리어 또는 엑소좀을 통해 전달할 수 있다.
D. mRNA 또는 캐리어에 의한 전달
본 발명에 따른 조성물을 전달하기 위한 방법으로, 절단인자의 RNA 서열 및 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 핵산절단효소를 코딩하는 RNA 서열을 포함할 수 있다. 절단인자의 mRNA 형태로 전달할 수 있다. 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소는 단백질 형태 또는 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 mRNA 형태로 전달할 수 있다.
본 발명은 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 캐리어에 관한 것이다.
본 발명은 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)가 캐리어에 포함되는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 엑소좀에 관한 것이다.
본 발명은 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)가 엑소좀에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
mRNA 형태의 전달로 synthetic modified mRNA 또는 self-replicating RNA (srRNA)를 포함할 수 있다.
절단인자의 mRNA, 핵산절단효소 단백질 또는 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 mRNA 서열을 핵산절단효소 단백질 형태로 전달, 핵산절단효소 단백질을 코딩하는 mRNA 형태로 전달, 또는 본 명세서 중 기재된 캐리어 또는 엑소좀 예를 들어, nanoparticle, cpp, polymer 등의 캐리어 또는 엑소좀을 통해 전달할 수 있다.
E. RNP에 의한 전달
절단인자의 mRNA, 핵산절단효소 단백질을 RNP 형태로 in vitro에서 복합체를 형성하도록 하여 전달할 수 있다.
본 발명은 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체에 관한 것이다.
본 발명은 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소; 및 (ii) 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 변이 중 2-10개 변이영역을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 상기 (i) 및 (ii)가 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체를 형성하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
경우에 따라서 RNP를 본 명세서 중 기재된 캐리어 또는 엑소좀 예를 들어, nanoparticle, cpp, polymer 등의 캐리어 또는 엑소좀을 통해 전달할 수 있다.
본 발명을 통해 환자 맞춤형 치료 의약품을 제조할 수 있다. 환자 맞춤형은 환자 고유의 특성 또는 환자의 질병 특성을 충분히 반영하여, 효과적으로 질병을 치료할 수 있음을 의미한다. 환자 맞춤형 질병 치료용 조성물을 통해 치료제의 선별 및 치료 방법의 선택 등에 유용하게 사용할 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 환자 맞춤형 질병 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 환자에 처리하는 환자 맞춤형 질병 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 정상세포와 다른 게놈 변이 서열을 복수개 선택하는 1단계; 및 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 환자 맞춤형 질병 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 환자 맞춤형 질병 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 환자에 처리하는 환자 맞춤형 질병 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 정상세포와 다른 게놈 변이 서열을 복수개 선택하는 1단계; 및 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 복수의 변이영역 각각을 특이적으로 인식하는 복수개의 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물을 처리하는 단계;를 포함하는 환자 맞춤형 질병 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물, 방법 및 용도는 이를 필요로 하는 대상체에 충분량 또는 유효량으로 투여될 수 있다. '유효량' 또는 '충분량'은 단일 또는 다중 용량으로 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료용 조성물, 프로토콜, 또는 치료 요법과 조합되어 임의의 기간 동안 대상체에 이로움을 주거나 대상체에 예상되거나 요망되는 결과를 제공하는 양을 나타낸다. 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 동시다발적 DNA DSB가 세포 사멸 유도
InDels을 타겟하는 경우 많은 양의 암세포 특이적 DNA DSB가 생성되어 암세포를 선택적으로 사멸할 수 있다고 가정하였다 (도 1A). ER-AsiSI U2OS 세포를 사용하여 효소적으로 유도된 DSB가 증식하는 암세포를 사멸시키기 충분한지 여부를 테스트하였다.
ER-AsiSI (17)를 갖춘 U2OS 세포는 Tanya Paull 박사 (텍사스 오스틴 대학, 미국)에 의해 기증되었다. ER-AsiSI U2OS 세포는 10% 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM (GE Healthcare)에서 배양하였다. 다음은 1 X 105 세포를 6웰 플레이트에 파종하여 4- 하이드록시타목시펜 (4-OHT) (Cat#. H7904; Merck, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 최종 처리 농도를 300 nM로 하였다. 4-OHT 처리 4시간 후 배지를 재생하고 세포를 추가로 6 일간 인큐베이션하였다. 세포의 생존율은 제조업체 프로토콜(G9241; Promega, Madison, WI, USA)에 따라 메틸렌블루 염색에 의한 콜로니 형성 분석 (Cat# M9140; Merck) 또는 Celltiter-Glo 분석을 통해 확인하였다.
ER-AsiSI U2OS 세포는 타목시펜 (4OHT)의 존재하에서 핵으로 이동하는 AsiSI 제한효소를 발현한다 (도 1B). 인간 게놈(GRCh38)의 현재 버전에는 1,225의 AsiSI 인식 사이트가 포함되어 있다. 따라서 이러한 세포 유형에서는 약 100~1,000의 DSB가 발생할 가능성이 있다고 예측하였다. 4OHT 처리 후 AsiSI이 핵으로 이동한 경우 4OHT를 처리한 U2OS 세포와 비교하여 거의 모든 ER-AsiSI U2OS 세포가 사멸하였다 (도 1B). 이러한 데이터는 효소에 의해 생성된 다수의 DSB가 증식중인 암세포를 죽일 수 있다는 것을 보여준다.
CRISPR-Cas9 의해 유도된 DNA DSB가 암세포도 죽일 수 있는지 여부를 테스트하였다.
인간 게놈의 다양한 loci를 타겟으로 하는 sgRNA를 구축하기 위해 sgRNA을 설계하고 인간 GRCh38 참조 게놈에 대하여 Cas-OFFinder를 사용하여 타겟의 수를 검증하였다. 각 sgRNA 서열은 pMJ179 플라스미드 (Cat# 85996; Addgene, Watertown, MA, USA)에서 변형된 마우스 U6 프로모터를 포함하는 sgRNA 발현 벡터에 클로닝되었다. 형질감염 1 일 전에 1.5 X 104 개의 HEK293T 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 파종하였다. 다음은 200 ng의 SpCas9 (Cat # 43945; Addgene) 및 sgRNA 발현 플라스미드를 Lipofectamine 3000 (Cat # L3000015; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 세포에 형질감염하였다. 형질감염 3 일 후, 제조업체의 지시에 따라 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Cat # G7570; Promega)를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. 마이크로 플레이트 리더 (microplate reader)와 Gen5 소프트웨어 (BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 발광도를 측정하였다.
인간 게놈에 반복적으로 존재하는 공지의 CRISPR-Cas9 타겟 서열을 선택하였다 (도 1C 및 도 2). sgRNA 수가 10 이상으로 증가하여 이수체 HEK293T 세포의 게놈에 20 DSB가 생성되면 세포가 사멸되기 시작하는 것이 관찰되었다. 암 세포주에서 CINDELA 세포사멸을 테스트하기 위한 출발점으로 30개의 gRNA을 선택하였다.
[표 1] 인간 게놈의 복수 loci를 타겟하는 가이드 RNA
Figure pat00003
CRISPR-Cas9에 의해 생성된 특정 InDels의 DSB가 선택적으로 암세포를 사멸하는지 여부를 테스트하기 위해 골육종과 결장암에서 각각 유래한 U2OS과 HCT116 세포의 전체 게놈 염기 서열 (whole-genome nucleotide sequences)을 결정하였다. 비교를 위해 텔로머라아제 발현에 의해 불멸화된 비종양 세포주인 RPE1의 전체 게놈 또한 시퀀싱하였다. 각 세포주에서 식별된 InDels에 대해, InDels을 타겟하는 sgRNA를 설계하였다.
제조업체의 지시에 따라 150bp쌍 말단 리드 (150-bp paired-end read)를 포함하는 30X 범위를 타겟으로 하는 IlluminaNovaSeq 6000을 사용하여 세포주 및 제노그래프트 조직의 전체 게놈 시퀀싱 (whole genome sequencing)를 실행하였다 (Illumina, San Diego, CA, USA). 어댑터 서열을 trimmomatic (version 0.39) (31)로 가공한 후 BMA-MEM (version 0.7.17-r1188)를 사용하여 인간 게놈 (GRCh38)에 대한 리드를 매핑하였다. 인간 (GRch38) 게놈과 마우스 (mm10) 게놈에 대한 데이터베이스에 리드를 매핑하였다. 필터링된 리드는 이후 제노그래프트 샘플에 대하여 추가 분석하기 위해 인간 게놈에 우선적으로 매핑되었다. samtools (version 1.10)을 이용하여 중복된 일치를 제거한 후 생식세포 계열의 변형을 확인하기 위한 디폴트 세팅으로 strelka2 (version 2.9.10)를 사용하였다.
암세포주 특이적 InDels에 대한 sgRNA을 설계하기 위해 먼저 3-8 bps의 InDels을 필터링하고 SpCas9 또는 SaCas9 중 하나에 대하여 해당 InDels을 사용하여 sgRNA을 설계하였다. gnomAD 데이터베이스 (version 2.1.1) 또는 이전에 테스트한 다른 암세포 중 하나에서 불균일성 (heterogeneity), 대립유전자의 깊이 (allele depth) 및 InDel 가용성 (InDel availability)을 고려하여 sgRNA의 우선순위를 선정하였다. exonerate (version 2.4.0)를 사용하여 2개의 불일치를 허용치로 하고 오프타겟의 가능성을 확인하였고, 모든 최종 후보 대상을 시각적으로 검사하였다. 분석에서 사용되는 모든 코드는 Github (https://github.com/taejoon/CRISPR-toolbox)에서 이용가능하다.
[표 2] CINDELA 가이드 RNA 설계에 사용되는 변이와 InDels의 통계
Figure pat00004
암 특이적 InDels을 타겟으로 하는 가이드 RNA와 tracer RNA (Integrated DNA Technologies, Inc, Coralville, IA, USA)를 사용하였다. RNP (ribonucleoprotein) 복합체는 20μg의 가이드 RNA와 tracer RNA를 동일 몰농도로 혼합한 혼합물과 SpCas9 15μg을 조합하여 형성되었다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9 Transfection Reagent (Cat# CMAX00001, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 RNP를 전달하였다.
이러한 sgRNA이 세포 특이적 DNA DSB을 유도할 수 있는지 여부를 알아보기 위해 30 개의 CRISPR-SpCas9RNP 복합체를 U2OS 세포에 형질감염하였다. U2OS 특이적 InDel을 타겟팅하는 CRISPR-RNP 복합체를 포함하는 U2OS 세포의 세포사멸은 형질감염 72시간 후에 관찰되었다. HCT116 특이적인 InDel을 타겟하는 CRISPR-RNP 복합체가 형질감염된 U2OS 세포에서는 세포사멸이 관찰되지 않았다 (도 1D). RNP 전달을 위해 gRNA의 수를 30에서 18, 12 또는 6으로 줄이면 용량 의존적으로 세포사멸이 관찰되었다. (도 2).
[표 3] SpCas9 (HCT116)에 대한 가이드 RNA
Figure pat00005
[표 4] SpCas9 (U2OS)에 대한 가이드 RNA
Figure pat00006
실시예 2. AAV-SaCas9를 포함하여 CINDELA 처리시 암 특이적 세포사멸 유도됨
CMV 프로모터 하에서 CRISPR/SaCas9 발현을 위한 AAV 플라스미드 Addgene (# 61591)를 제작하고, HEK293T 세포에 형질감염한 후 3 일째에 AAV 바이러스 입자를 회수하고, 농축했습니다 (Addgene, AAV Production in HEK293T Cells). AAV 혈청형 2를 바이러스 패키징에 사용하고 2.81 X 1010 바이러스 입자를 사용하여 CINDELA에 대한 표적 세포에 형질도입하였다.
AAV 전달에 사용된 SaCas9에 3xHA를 태깅하고, 단클론 항-HA 항체 (Cat# H3663; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 검출하였다. DNA 손상이 있는 세포는 γH2AX를 감지하는 항-인산화-히스톤 H2A.X 항체 (Cat# 05-636; Sigma-Aldrich)를 사용하여 분석하였다. 아포토시스 세포사멸은 Annexin V Alexa FluorTM 488 콘쥬 게이트 (Cat#. A13201; Thermo Fisher Scientific)과 Flow-Jo 소프트웨어 (version 10)을 갖춘 BD FACSVerse 기기를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 정량화하였다.
생체 내 종양 환경에 RNP 복합체를 전달하는 것은 쉽지 않기 때문에, CINDELA 치료에 AAV (Adeno-Associated Virus) 기반 SaCas9을 사용할 수 있는지 여부를 테스트했다. 플라스미드 형질감염을 통해, SaCas9 단백질을 발현하고 하나는 U2OS InDels을 타겟으로 하고 다른 하나는 HCT116 InDels을 타겟으로 하는 두 개의 서로 다른 CINDELA sgRNA 세트를 포함하는 플라스미드를 형질감염시키고, U2OSCINDELA의 효과를 관찰하였다. RNP 복합체 전달과 유사하게, U2OS 세포는 U2OS InDel을 타겟하는 sgRNA과 SaCas9가 공동 발현한 경우에만 사멸하였다 (도 3A). CRISPR-RNP 형질감염 후의 annexin V 신호의 증가는 apoptosis에 의해 세포가 사멸된 것임을 보여주었다 (도 3B). in vivo CINDELA 테스트를 위해 암 특이적인 InDels을 타겟으로 하는 sgRNA와 SaCas9를 공동 발현하는 AAV를 제작하였다. 서로 다른 sgRNA과 SaCas9을 공동 발현하는 30개의 AAV를 U2OS 세포와 RPE1 세포에 형질도입하였다. AAV의 형질 도입은 SaCas9 발현에 대한 웨스턴 블랏에 의해 확인되었다.
[표 5] SaCas9 (HCT116)에 대한 가이드 RNA
Figure pat00007
U2OS 특이적 InDel을 타겟으로 하는 AAV로 인한 선택적 U2O2 세포 사멸은 형질도입한 후 2일 뒤에 시작되었다 (도 3C; 도 4A 및 도 4B). 대조적으로, RPE1 세포에는 영향을 주지 않았다. 강력한 γH2AX 신호는 CRISPR-Cas9의 표적이 된 U2OS 세포에서만 관찰되어, 표적 세포주에서 선택적인 DSB가 확인되었다 (도 4C). 형질감염을 통한 접근과 유사하게, CINDELA로 형질도입된 AAV도 시간 의존적으로 세포사멸을 일으켰다 (도 4D).
[표 6] SaCas9 (U2OS)에 대한 가이드 RNA
Figure pat00008
각 세포에 필요한 CINDELA 타겟의 최소 수를 확인하기 위해, AAV로 전달되는 sgRNA 수를 체계적으로 줄였다. CINDELA 의해 유도된 U2OS 세포사멸은 SaCas9 단백질 발현과 함께 5개 이상의 sgRNA가 필요하였다 (도 4D). U2OS 세포는 일부 염색체에서 diploid에서 triploid이기 때문에 U2OS 게놈은 각 가이드 RNA가 타겟하는 2 개 이상의 DNA 서열을 운반하고, 세포사멸에 10 내지 15 개의 DSB가 필요하다. 일관되게 타겟하는 sgRNA 수의 증가에 따라 CINDELA 유도 세포 사멸율이 증가한다는 것이 관찰되었다 (도 4E). 1개 또는 3개의 AAV가 U2OS 세포에 형질 도입되는 경우 명백한 세포사멸이 발생하지 않았다.
실시예 3. CINDELA 처리시 in vivo 이종이식모델 종양 성장 억제됨
NOD-SCID 마우스는 표준 조건에서 사육되었다. 모든 동물 실험은 UNIST의 동물 관리 사용 위원회 (IACUC-19-05)에서 승인된 프로토콜을 사용하여 실시되었다. 6 주령의 마우스에 2 X 106의 암세포를 하나의 측면에 피하주사 하였다. 종양의 크기가 약 1cm에 도달했을 때, AAV 입자를 3일 간격으로 4회 주사하였다. 첫 AAV 주사 2주 후 종양을 채취하여 분석하였다. Promega DeadEnd™ Colorimetric TUNEL System (Cat#G7360, Promega)을 사용하여 TUNEL 분석을 수행하였다. PDX 실험은 PDX models of human lung squamous cell carcinoma: consideration of factors in preclinical and co-clinical applications. J.Transl.Med 18, 307 (2020) 통해 알려진 방법을 사용하여 DNAlink, Inc.에서 실시되었다.
CINDELA가 in vivo에서 종양 성장을 억제할 수 있는지 여부를 테스트했다. U2OS 세포 이종이식모델 NOD-SCID 마우스에서 제작하고, 종양 크기가 약 1cm에 도달할 때까지 모니터했다. 다음으로, U2OS 특이적 CINDELA sgRNA과 SaCas9를 발현하는 AAV 또는 SaCas9만을 발현하는 AAV를 3일 간격으로 2주 동안 마우스에 5회 주사하였다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, U2OS 특이적 CINDELA sgRNA 및 SaCas9 발현 AAV의 주사에 의해 종양 증식이 선택적으로 억제되는 것을 관찰했다. SaCas9의 HA 태그는 SaCas9만을 주사한 마우스와 sgRNA을 포함한 SaCas9 종양 절편에서 검출되었다 (도 6A). AAV 치료 기간 동안 마우스는 유의한 증상을 보이지 않았고, AAV에 의해 전달된 CINDELA가 정상적인 조직 및 세포에 영향을 미치지 않았음을 시사했다 (도 6B). CINDELA 처리에 의해 유도된 특이적 세포 사멸 경로를 확인하기 위해 남은 종양을 채취하여 γH2AX 또는 TUNEL 염색했다. 예상대로, CINDELA가 타겟한 종양은 대조군 종양과 비교했을 때 아폽토시스 세포 사멸 (도 5C) 이외에, γH2AX 및 TUNEL 신호의 상당한 유도를 나타냈다 (도 5A와 도 5B).
실시예 4. CINDELA 처리시 환자 유래 1차 종양 및 PDX를 선별적으로 사멸함
CINDELA 치료가 실제 종양 샘플에 적용할 수 있는지 여부를 증명하기 위해 한국 교모세포종 환자 유래 종양 세포주 GBL-67을 사용했다. 전체 게놈 시퀀스 데이터를 기반으로 GBL-67 InDels을 특이적으로 타겟하는 26개의 SaCas9 CINDELA 가이드 RNA를 설계했다. 같은 개체의 정상세포를 입수할 수 없었기 때문에 타겟하는 InDels이 없는 NSC-10 신경 줄기세포를 대조군으로 사용했다. sgRNA 및 SaCas9를 발현하는 각각의 AAV가 생성되고 동시에 원발성 교모세포종 GBL-67 및 NSC-10 세포에 형질도입 되었다. CINDELA 처리에 의해 약 50개의 세포 특이적 DSB가 유도 되어 교모세포종 세포를 충분히 사멸할 수 있음을 확인하였다 (도 7A). 대조적으로, NSC-10 세포는 동일하게 형질도입 후 성장이 약화되지 않았다.
[표 7] SaCas9 (GBL-67)에 대한 가이드 RNA
Figure pat00009
마지막으로, 암 치료에 대한 예측 전임상 모델인 환자 유래의 이종이식모델 (PDX: patient-derived xenografts)에서 CINDELA의 유효성을 테스트했다. 확립된 폐암 PDX에서 조직을 시퀀싱한 후 약 30개의 CINDELA 타겟을 특정했다 (SPX4-073에 대하여 29개 gRNA, SPX4-318에 대하여 22개 gRNA). 타겟 sgRNA 함께 SaCas9를 발현하는 AAV를 3일 간격으로 5회 주사한 후 이종이식모델의 종양 크기를 2주 모니터했다. PDX 종양 성장은 sgRNA와 SaCas9를 발현하는 AAV에 의해 저해되었다. 대조적으로, SaCas9만 발현된 AAV는 종양 성장을 억제하지 않았다 (도 7B; 도 8A 및 도 8B). 마우스 AAV 치료 기간 동안 유의한 증상을 보이지 않았다 (도 8C).
[표 8] SaCas9 (SPX4-318)에 대한 가이드 RNA
Figure pat00010
[표 9] SaCas9 (SPX4-073)에 대한 가이드 RNA
Figure pat00011
실시예 5. AAV transduction을 통해 염색체 5번 타겟 선별적 세포사멸 유도
5-1. 30 CINDELA with saCas9
골육종 세포를 선택적으로 타겟할 수 있는 30개의 sequence를 WGS(whole genome sequencing)을 통하여 확인 후 AAV-saCAS9 vector(pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA)에 각 각의 sequence를 넣은 후 HEC293T 세포를 이용하여 5개의 sequence를 한 group으로하여 총 6개의 AAV particle group을 제작하였다. 제작된 AAV particle을 qPCR을 이용하여 정량한 후 정상세포인 RPE1 세포와 골육종 세포인 U2OS 세포에 transduction 하였다. 96시간 후 골육종 세포에서만 선택적으로 세포사멸이 이루어 지는 것을 확인하였다.
Figure pat00012
U2OS 세포에 30개의 DNA sequence를 targeting하여 골육종 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있음을 확인하였다 (도 9).
5-2. 10 CINDELA with saCas9
골육종 세포를 타겟할 수 있는 30개의 sequence중 chromosome 5번을 타겟팅할 수 있는 10개의 sequence를 이용하여 1-1.과 같은 방법으로( 5개의 sequence를 한 group으로 하여 2개의 AAV particle group 제작) 세포사멸을 유도 할 수 있는지 확인하였다.
Figure pat00013
U2OS 세포에 10개의 DNA sequence를 targeting하여 골육종 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있음을 확인하였다. 30개의 sequence를 targeting 했을 시와 동일하게 세포사멸 유도할 수 있음을 확인하였다 (도 10).
5-3. 5 CINDELA with saCas9
Chromosome 5번을 타겟팅할 수 있는 10개의 sequence중 1개의 group(5개의 DNA sequence를 타겟: 그룹 5A)만으로 세포사멸을 유도할 수 있는지 확인하였다.
U2OS 세포에 5개의 DNA sequence를 targeting하여 골육종 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있음을 확인하였다. 30개 혹은 10개의 sequence를 targeting 했을 시와 비교했을 시 살아있는 세포의 비율이 조금 늘지만 대부분의 세포가 사멸됨을 확인하였다 (도 11).
5-4. 5 CINDELA with saCas9
1-3과 다른 chromosome5 번을 타켓할 수 있는 1개의 group (그룹 5B) 으로 새포사멸이 유도되는지 확인하였다.
U2OS 세포에 실시예 1-3에서와 다른 sequence인 5개의 DNA sequence를 targeting하여 골육종 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있음을 확인하였다. 30개 혹은 10개의 sequence를 targeting 했을 시와 비교했을 시 살아있는 세포의 비율이 조금 늘지만 대부분의 세포가 사멸됨을 확인하였다 (도 12).
5-5. 3 CINDELA with saCas9
Chromosome 5번을 타겟팅할 수 있는 10개의 sequence중 3개의 sequence를 임의로 선택하여 1개의 AAV particle group을 제작한 후 세포사멸이 유도되는지 확인하였다.
Figure pat00014
U2OS 세포에 3개의 DNA sequence를 targeting하여 골육종 세포를 선택적으로 사멸을 시도하였으나 세포 사멸이 이루어지지 않음을 확인하였다 (도 13).
실시예 6. 염색체 3번 타겟 선별적 세포사멸 유도
6-1. HCT116 gRNA (5) targeting for Chromosome 3
saCas9 단백질에 E.coli exonuclease를 결합한 Exo-saCas9 재조합 단백질을 생성하였다. 형질감염 12시간 전 HCT116 세포를 (6 X 105/6 well plate) 준비한다. Choromosome3을 targeting하는 gRNA 5개와 saCas9 혹은 Exo-Cas9을 lipofectamine3000을 이용하여 형질감염한 후 48시간이 지났을 때 현미경을 이용하여 세포사멸을 관찰한다.
Chromosome 3을 targeting 하는 gRNA 5개를 형질감염하여 실험하였다. saCas9를 단독 사용한 경우 5개의 gRNA로 세포사멸이 일어나지 않았지만 Exo-saCas9을 사용하면 5개의 gRNA로도 충분히 세포사멸을 일으키는 것을 확인하였다 (도 15).
6-2. U2OS gRNA (5) targeting for Chromosome 1
형질감염 12시간 전 U2OS 세포를 (3 X 105/6 well plate) 준비한다. U2OS choromosome1을 targeting하는 gRNA 5개과 saCas9 혹은 Exo-Cas9을 lipofectamine3000을 이용하여 형질감염한 후 48시간이 지났을 때 현미경을 이용하여 세포사멸을 관찰한다.
Chromosome 1을 targeting 하는 gRNA 5개을 형질감염하여 실험하였다. saCas9를 단독 사용한 경우 5개의 gRNA로 세포사멸이 일어나지 않았지만 Exo-saCas9을 사용하면 5개의 gRNA로도 충분히 세포사멸을 일으키는 것을 확인하였다 (도 16).
6-3. 복구 저해 여부 확인
2-1과 2-2에서와 같이 형질감염된 세포들을 48 시간후 PBS를 이용하여 세포를 수확한다. 5000 rpm 에서 5분동안 원심분리해서 supernatant를 버리고 pellet에 버퍼A (세포막, 핵막 제거용 buffer) 200 ul 를 처리한다. 5000 rpm 에서 5분동안 원심분리해서 supernatant를 제거한다. Pellet을 50 ul의 RIPA buffer 로 resuspension 시킨 후 1분 동안 50 amp로 sonication을 수행한다. 13,200 rpm 으로 25분 동안 원심분리후 supernatant를 정량하여 SDS-PAGE gel로 분리시키고 g-H2AX 안티바디를 사용하여 western blotting을 수행한다.
도 14에 따른 Exo-Cas9을 사용하는 경우 DNA damage marker인 g-H2AX 발현이 높음을 확인하였다 (도 17). Exo-Cas9을 사용하는 경우 세포사멸을 더 잘 유도하는 것은 saCas9에 의한 DNA double strand break 이후에 복구 (repair)를 저해하기 때문인 것으로 판단된다.
6-4. DR-GFP assay
DR-GFP가 발현되는 U2OS 세포를 saCas9 혹은 exo-saCas9과 DR-GFP 특이적 gRNA와 함께 lipofectamine3000으로 형질감염시키고 72 시간후에 수확한다. 수확한 세포에서 GFP 발현양을 FACS (Fluorescence-activated cell sorting)를 이용해서 측정한다.
HR (Homologous recombination) 되는 정도를 DR-GFP assay를 통해 확인한 결과 Exo-Cas9을 이용했을 때 HR이 현저하게 떨어지는 것을 확인하였다. Exo-Cas9이 HR을 저해할 수 있음을 증명하였다 (도 18).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다
<110> Institute for Basic Science Ulsan National Institute of Science and Technology <120> Composition For Inducing Death of Cells Having Genomic Sequence Variations And Method For Inducing Death of Cells Having Genomic Sequence Variations Using the Same <130> 048 <160> 254 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 1 tacctatgcc tcatgtagaa a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 2 atcgtcaggt tctgggaccg t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 3 cagaagagag agagtagtag a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 4 gaatgtttaa ggtatagttt a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 5 tgtttcagca ggggttgaag c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 6 ctatacccta gacttattcc t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 7 gtttctttct acagaataga g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 8 ataggttaac aaagatattc a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 9 ctacaaaata ggtgacataa c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 10 ttaaaatggc gcaaataaat t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 11 ttttatgagt ctgccaggaa t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 12 gaagaaacaa ttttcactgg g 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 13 caggaaggga gctagtgagc t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 14 cctctcctgc tgatgatccc c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 15 tgggccgcac gtgtgagtgc c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 16 aggaaacaag cccatgttcc c 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 17 catggcagaa aacagaagac a 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 18 aacagtctct gtgatagggc a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 19 gggaaaatca gacggatatt c 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 20 atttctgttc ttccctcact t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 21 taataactgt gtagttataa c 21 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<400> 29 ccttagcctc cttttcacac a 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 30 agagaagaga aaatagggga a 21 <210> 31 <211> 475 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exonuclease I <400> 31 Met Met Asn Asp Gly Lys Gln Gln Ser Thr Phe Leu Phe His Asp Tyr 1 5 10 15 Glu Thr Phe Gly Thr His Pro Ala Leu Asp Arg Pro Ala Gln Phe Ala 20 25 30 Ala Ile Arg Thr Asp Ser Glu Phe Asn Val Ile Gly Glu Pro Glu Val 35 40 45 Phe Tyr Cys Lys Pro Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Gln Pro Gly Ala Val 50 55 60 Leu Ile Thr Gly Ile Thr Pro Gln Glu Ala Arg Ala Lys Gly Glu Asn 65 70 75 80 Glu Ala Ala Phe Ala Ala Arg Ile His Ser Leu Phe Thr Val Pro Lys 85 90 95 Thr Cys Ile Leu Gly Tyr Asn Asn Val Arg Phe Asp Asp Glu Val Thr 100 105 110 Arg Asn Ile Phe Tyr Arg Asn Phe Tyr Asp Pro Tyr Ala Trp Ser Trp 115 120 125 Gln His Asp Asn Ser Arg Trp Asp Leu Leu Asp Val Met Arg Ala Cys 130 135 140 Tyr Ala Leu Arg Pro Glu Gly Ile Asn Trp Pro Glu Asn Asp Asp Gly 145 150 155 160 Leu Pro Ser Phe Arg Leu Glu His Leu Thr Lys Ala Asn Gly Ile Glu 165 170 175 His Ser Asn Ala His Asp Ala Met Ala Asp Val Tyr Ala Thr Ile Ala 180 185 190 Met Ala Lys Leu Val Lys Thr Arg Gln Pro Arg Leu Phe Asp Tyr Leu 195 200 205 Phe Thr His Arg Asn Lys His Lys Leu Met Ala Leu Ile Asp Val Pro 210 215 220 Gln Met Lys Pro Leu Val His Val Ser Gly Met Phe Gly Ala Trp Arg 225 230 235 240 Gly Asn Thr Ser Trp Val Ala Pro Leu Ala Trp His Pro Glu Asn Arg 245 250 255 Asn Ala Val Ile Met Val Asp Leu Ala Gly Asp Ile Ser Pro Leu Leu 260 265 270 Glu Leu Asp Ser Asp Thr Leu Arg Glu Arg Leu Tyr Thr Ala Lys Thr 275 280 285 Asp Leu Gly Asp Asn Ala Ala Val Pro Val Lys Leu Val His Ile Asn 290 295 300 Lys Cys Pro Val Leu Ala Gln Ala Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ala 305 310 315 320 Asp Arg Leu Gly Ile Asn Arg Gln His Cys Leu Asp Asn Leu Lys Ile 325 330 335 Leu Arg Glu Asn Pro Gln Val Arg Glu Lys Val Val Ala Ile Phe Ala 340 345 350 Glu Ala Glu Pro Phe Thr Pro Ser Asp Asn Val Asp Ala Gln Leu Tyr 355 360 365 Asn Gly Phe Phe Ser Asp Ala Asp Arg Ala Ala Met Lys Ile Val Leu 370 375 380 Glu Thr Glu Pro Arg Asn Leu Pro Ala Leu Asp Ile Thr Phe Val Asp 385 390 395 400 Lys Arg Ile Glu Lys Leu Leu Phe Asn Tyr Arg Ala Arg Asn Phe Pro 405 410 415 Gly Thr Leu Asp Tyr Ala Glu Gln Gln Arg Trp Leu Glu His Arg Arg 420 425 430 Gln Val Phe Thr Pro Glu Phe Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Glu Leu Gln 435 440 445 Met Leu Val Gln Gln Tyr Ala Asp Asp Lys Glu Lys Val Ala Leu Leu 450 455 460 Lys Ala Leu Trp Gln Tyr Ala Glu Glu Ile Val 465 470 475 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 32 gaagccgacg tacactgaaa 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 33 gctccgatcg ggttacaaca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 34 tgacatcaat tattatacat 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 35 aggtgtggtt ccagaaccgg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 36 aactacacgg agagcaagag 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 37 acgccattgt taatgcacgg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 38 gcaactggag cctcagatga 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 39 actcaggagg ctgatgtgga 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 40 gaacatgtcc gaacatcaga 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 41 ggagactcat ctaacacata 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 42 cctagctact cggtaggctg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 43 taagtaggaa tgcctagagt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 44 gcaggcaaga gaacatgtgc 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 45 gaacacttac acactgctgg 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 46 gaggttacag tgagctatga 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 47 tgtcttgtgc agttgagata 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 48 gcagaggcag gtggatcatg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 49 gcaacctcta gagtcggcat 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 50 gagaattgct tgaatgcagg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 51 aggttgcctg ttgactctga 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 52 ggaagaacat tccatgctcg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 53 gaatagtgag ttgtggagga 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 54 tgagaccagc atggccaaca 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 55 tactcaagcc tcagtaatgg 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 56 agagtgcagt ggcgcgatct 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 57 gaagtcaaga attgaggttt 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 58 caggagaatc acttgaacct 20 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 59 gttcatggcc agaaggacga a 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 60 ataatagtgc aatcaataaa a 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 61 ggaccgtcaa ataaagaagt a 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 62 ttcccaggtg ttagggtgtt a 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 63 aacaaaaata tcaaaccccc a 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 64 cttcctcccg gtgacggtga c 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 65 gtcggaggca aggagagctc a 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 66 cagccacaga agactctgtc t 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 67 tcagcagctt tgagaagctg t 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 68 tttggcttta attcagccat a 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 69 aaaaaatgtg ctgcattagt a 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 70 agacagcctt cggcattgct t 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 71 ggacccacaa gaaaaggcat c 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 72 atattccaca ggtatatgca a 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 73 gatggtatca tgaggtctta a 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 74 agttgtacaa tagacgagca t 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 75 tgttgtgtgg gcatcacctt g 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 76 tgatttagtt cttcatgctg t 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 77 catttgacaa tcagattata a 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 78 gtctggggaa tataagtttt t 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 79 aacaaatctt taagcacttg a 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 80 ccagagtagg gcatcatccc a 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 81 tataaaaata tgcaaactaa a 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 82 cgacgagagc ttagccagag t 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 83 ggcttaaacg tttctaggac a 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 84 tatgtagcta ttgactgaca a 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 85 aatttagctg tagaattatg t 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 86 ctgaaatttc agcttatgaa t 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 87 atctgaaata ttgacactct t 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 88 caaatgacct tgtgattgat a 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 89 tttggaagtg ctctcatcag t 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> 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21 <210> 197 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 197 agaaaaccac agcggctgtg g 21 <210> 198 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 198 cgctgaaatt tctgagccat g 21 <210> 199 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 199 tagtattatc tgcaataaca a 21 <210> 200 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 200 gaatcaggtg taatcaattg t 21 <210> 201 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 201 tttccaggtt ttgattgagg t 21 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 202 ccctgcaggt tggtgtgagc a 21 <210> 203 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 203 tcacctttgg acgtttttaa a 21 <210> 204 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 204 ccaaggctca gtaggaaagc t 21 <210> 205 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 205 aagccgattt agtgcatttg c 21 <210> 206 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 206 aattccactc tatacacccg g 21 <210> 207 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 207 ccagaaagaa ttcttataga t 21 <210> 208 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 208 ctagatttta tcattctgtt a 21 <210> 209 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 209 agtcccctct tgaagaagat g 21 <210> 210 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 210 ctatctactg gtgataaact g 21 <210> 211 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 211 cctggatatc ttatgccatg c 21 <210> 212 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 212 agactgtaga agcttataaa a 21 <210> 213 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 213 aatttagatg tattcattca a 21 <210> 214 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 214 atgtttcttc agttaagaca a 21 <210> 215 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 215 atcaaaggtc tgttttcagt c 21 <210> 216 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 216 gggcaataag ctaggggctc c 21 <210> 217 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 217 atggtatagc caaactcaaa a 21 <210> 218 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 218 tagtaacttt agactaagtt c 21 <210> 219 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 219 tacctccccc cactgagaag t 21 <210> 220 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 220 ctggcatgaa gctctccagc c 21 <210> 221 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 221 ctgtaagacc tggattatca a 21 <210> 222 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 222 ggtgagcagg tgttggcctg a 21 <210> 223 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 223 ctggggccct gcttcctaca g 21 <210> 224 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 224 caaaatgttg tgttagttta a 21 <210> 225 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 225 gccataaaaa tttcttctga c 21 <210> 226 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 226 gaggctattg gatttcattt c 21 <210> 227 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 227 gcactcacga ggtcacgagg t 21 <210> 228 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 228 ctttcttaaa catagaatct a 21 <210> 229 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 229 gaacagtgca aggataggtg t 21 <210> 230 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 230 tggtgccccg ggtttacact t 21 <210> 231 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 231 cttcatctat aggagcctcc a 21 <210> 232 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 232 ggccttgagt gaggagaagg c 21 <210> 233 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 233 ggtgaagtac atattctcat a 21 <210> 234 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 234 gggctcagtt ttcccaccag t 21 <210> 235 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 235 atacgttttg acggccaata g 21 <210> 236 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 236 gtcaaactaa acagccatgg g 21 <210> 237 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 237 acctatgatg tgatagtttg t 21 <210> 238 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 238 taagacctct taggaagtag a 21 <210> 239 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 239 tggaagagtg gaaaaaggtg g 21 <210> 240 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 240 tttgagaggc aggggcacca g 21 <210> 241 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 241 tgtagaattt ttaactgtta a 21 <210> 242 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 242 gtctaatctt gctctgggtg c 21 <210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 243 cagccaatgg tgtaataagc t 21 <210> 244 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 244 tctgcagaac aggcgcccag t 21 <210> 245 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 245 taaagagact caggagagaa g 21 <210> 246 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 246 agtctatttt gattgttttt a 21 <210> 247 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 247 gcatcactga agaatcagcc t 21 <210> 248 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 248 caagggaggt gcctggttgc c 21 <210> 249 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 249 gattttaatc ataactgcat g 21 <210> 250 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 250 gtcacaagtt tctgtttctt g 21 <210> 251 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 251 tccatctctg aaatgtggat g 21 <210> 252 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 252 taaagggtgc ttttcttatt a 21 <210> 253 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 253 tttgggagtg gagagatttg g 21 <210> 254 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding gRNA <400> 254 aggctctcag ggaatgagag g 21

Claims (43)

  1. (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포의 사멸 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포는 암세포, 노화세포, 면역질환 유발 세포 또는 심혈관 질환 유발 세포인 조성물.
  3. (i) 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포의 사멸 유도용 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (i) 및 (ii)가 동일 또는 상이한 벡터에 포함되는, 벡터.
  5. 제3항에 있어서, 상기 벡터는 Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV), 및 Retroviral Vector (RV)로 구성된 군에서 선택되는 바이러스 벡터; 또는 바이러스 레플리콘을 포함하는 에피좀 벡터를 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 에피좀 벡터는 Simian virus 40 (SV40), bovine papilloma virus (BPV) 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV)의 복제원점 (Ori)을 포함하는 벡터.
  7. (i) 핵산절단효소; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체.
  8. (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 캐리어.
  9. (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 엑소좀.
  10. (i) 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 (i) 및 (ii)가 동일 또는 상이한 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물.
  11. (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 (ii)가 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, (i)의 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 핵산절단효소를 코딩하는 RNA이고, 선택적으로 변형 뉴클레오시드를 포함하거나, 합성 자기-복제 RNA (synthetic self-replicative RNA)를 포함; 또는
    (i)의 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 캐리어 또는 엑소좀에 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. (i) 핵산절단효소; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고,
    상기 (i) 및 (ii)가 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체를 형성하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물.
  14. (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고,
    상기 (i) 및 (ii)가 캐리어에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 캐리어는 세포 투과성 펩타이드(CPP), 나노입자, ZIF (zeolitic imidazole frameworks), RNA aptamer-streptavidin 또는 중합체를 포함하는 조성물.
  16. (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고,
    상기 (i) 및 (ii)가 엑소좀에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서로 다른 서열을 가지는 절단인자 4개 이상을 포함하는 조성물.
  18. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 4-30개의 변이영역을 특이적으로 인식하는 절단인자를 포함하는 조성물.
  19. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서로 다른 서열을 가지는 4-30개의 절단인자를 포함하는 조성물.
  20. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 고유의 삽입 및/또는 결실을 포함하는 핵산 서열 부위 4-60개에 이중가닥절단(Double-stranded break, DSB)을 유도하여 세포를 사멸시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산절단효소는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas14, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, CsMT2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 또는 Csf4인 조성물.
  22. (i) 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 4개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 환자 맞춤형 질병 치료용 조성물.
  23. (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물.
  24. (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 상기 (i) 및 (ii)가 동일 또는 상이한 벡터에 포함되는, 벡터.
  26. 제25항에 있어서, Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV), 및 Retroviral Vector (RV)로 구성된 군에서 선택되는 바이러스 벡터; 또는 바이러스 레플리콘을 포함하는 에피좀 벡터를 포함하는 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 상기 에피좀 벡터는 Simian virus 40 (SV40), bovine papilloma virus (BPV) 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV)의 복제원점 (Ori)을 포함하는 벡터.
  28. (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체.
  29. (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 캐리어.
  30. (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 엑소좀.
  31. (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 (i) 및 (ii)가 동일 또는 상이한 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물.
  32. (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 (ii)가 벡터에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물.
  33. 제32항에 있어서, (i)의 핵산절단효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 핵산절단효소를 코딩하는 RNA이고, 선택적으로 변형 뉴클레오시드를 포함하거나, 합성 자기-복제 RNA (synthetic self-replicative RNA)를 포함; 또는
    (i)의 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 캐리어 또는 엑소좀에 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고,
    상기 (i) 및 (ii)가 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체를 형성하는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물.
  35. (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고,
    상기 (i) 및 (ii)가 캐리어에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 캐리어는 세포 투과성 펩타이드(CPP), 나노입자, ZIF (zeolitic imidazole frameworks), RNA aptamer-streptavidin 또는 중합체를 포함하는 조성물.
  37. (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고,
    상기 (i) 및 (ii)가 엑소좀에 포함되는, 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물.
  38. 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 내 2-10개의 변이영역을 특이적으로 인식하는 절단인자를 포함하는 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 서로 다른 서열을 가지는 2개 이상의 절단인자를 포함하는 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 서로 다른 서열을 가지는 2-10개의 절단인자를 포함하는 조성물.
  41. 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제 I은 미생물, 효소, 곤충, 마우스 또는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제 I은 서열번호 31의 서열을 포함하는 조성물.
  43. (i) 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 I이 융합된 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (ii) 게놈 서열 변이 (genomic sequence variation)를 가지는 세포에서, 상기 게놈 서열 변이를 가지는 세포 특이적 변이영역 2개 이상을 각각 인식하는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 환자 맞춤형 질병 치료용 조성물.




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