CN105073141A - 用于将基因递送到细胞的功能化dna树状聚合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包含连接有一个或多个DNA序列的DNA树状聚合物的组合物，所述DNA序列包含编码多肽或调控RNA的DNA序列，所述DNA序列与调控所述编码多肽或调控RNA的DNA序列的表达以产生编码所述多肽的RNA或产生所述调控RNA的DNA序列连接。还公开了通过将所述树状聚合物递送到细胞，随后表达所编码的多肽或调控RNA来治疗细胞的疾病和病症的方法。

Description

用于将基因递送到细胞的功能化DNA树状聚合物
技术领域
本发明涉及用于将基因递送到细胞并在所述细胞中表达所述基因的功能化DNA树状聚合物的领域。
背景
由于治疗性DNA的递送允许直接治疗受影响的细胞，故基因疗法是针对多种细胞异常、疾病和病症的一种颇具前景的治疗。理论上，将DNA靶向递送到期望的细胞，以及一旦DNA被细胞吸收即控制表达的能力应当提供使用常规疗法难以实现的改善水平的治疗效率和特异性。但实际上，DNA疗法的潜力尚未得到完全实现。一种挑战是用于将DNA递送到细胞的适当载体的选择。病毒载体会引起严重的副作用。因此，已经寻求非病毒载体。已经研究使用阳离子脂质体将基因转移到细胞中，但尚未得到令人满意的结果。
近来，通过使编码DNA与阳离子聚合物络合所形成的纳米粒子对于基因疗法已经显示前景，特别是当加入官能团来改善递送和治疗功效时(例如，用以改善细胞特异性和积聚的靶向部分，以及用以改善细胞吸收的膜渗透部分，及用于防止降解的特征)。这些官能团中有许多被认为是将治疗性生物试剂(包括基因)递送到细胞所必须的。不幸的是，其还增加基因治疗剂的复杂性和其生产成本。此外，DNA凝聚之后的分子量、大小、电荷以及端基封端的选择会对纳米粒子的转染潜力具有巨大并且无法预计的影响。另外，阳离子聚合物纳米粒子在与将另外改善其特异性的靶向部分偶联之后，通常会损失其DNA递送能力。然而，使用阳离子聚合物纳米粒子将DNA递送到细胞的一个优势在于其能够递送较大的DNA有效负载。
DNA树状聚合物是由互连的天然或合成核酸单体亚单位构建的复杂分支状分子。每个单体是由两条DNA链构成，这两条DNA链共用位于每条链的中心部分中的序列互补区。这两条链退火形成单体，从而产生了中心双链“腰(waist)”邻接四个单链“臂”的结构。在不同单体类型末端处的单链“臂”被设计成与互补单体类型的“臂”碱基配对。这允许从单一起始单体开始，将树状聚合物定向组装成一系列逐步单体层。树状聚合物的一个有用特征是，最后一层单体的添加在分子的表面上留下未配对的单链“臂”。表面层单链“臂”的数量随层数而增加。在表面上的单链“臂”可用于附接多个分子以为树状聚合物提供官能团，包括对特定应用特异的标记或分子。功能分子可以直接偶联到树状聚合物臂，或经由与树状聚合物臂杂交进行附接。由于可用的单链“臂”具有多样性，故可以将多种不同的官能团附接到树状聚合物，例如靶向部分和标记。已经认识到，树状聚合物可以在多种测定中提供增强的检测特异性和灵敏度。
特定细胞中白喉毒素(DT)基因的靶向表达会导致这些细胞死亡。白喉毒素是选择用于细胞消融的毒素之一，因为其作用机制是众所周知的，并且这种基因已经被克隆，测序并适用于在哺乳动物细胞中表达。由白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)分泌的前体多肽随后经酶促裂解成A链和B链片段。B链与真核细胞的表面结合并且将A链递送到细胞质中。DT-A抑制细胞内的蛋白质合成并且具有极高毒性；单一分子就足以杀死细胞。已经在用于驱动表达的细胞特异性、顺式作用转录调控元件的控制下，独立于DT-B亚单位克隆出DT-A亚单位的编码序列。在DT-A亚单位杀死细胞之后，其可以从死亡的细胞释放；然而，DT-A不能进入相邻细胞。
因此，需要将可表达的基因靶向递送到细胞的组合物和方法，这些组合物和方法是可预测的，具有特异性并且在内化这些基因的众多细胞中提供显著功效。本发明解决这些要求。
发明概要
在第一方面，本发明涉及包含连接有一个或多个DNA序列的DNA树状聚合物的组合物，所述DNA序列包含编码多肽或调控RNA的DNA序列，所述DNA序列与调控所述编码多肽或调控RNA的DNA序列的表达以产生编码所述多肽的RNA或产生所述调控RNA的DNA序列连接。此类DNA树状聚合物在本文中称为“功能化”DNA树状聚合物。
在连接有一个或多个DNA序列的DNA树状聚合物的具体实施方案中，调控表达的DNA序列包括启动子。
在前述的另一个具体实施方案中，启动子基本上仅在特定细胞类型，例如上皮细胞、病毒感染的细胞、患病或受损细胞或者肿瘤细胞中具有转录活性。基本上仅在特定肿瘤细胞中具有转录活性的启动子可以是例如与胰腺癌相关的启动子(例如，间皮素(MSLN)启动子)或与前列腺癌相关的启动子(例如细胞角蛋白5(K5)启动子)。基本上仅在病毒感染的细胞中具有转录活性的启动子可以是例如HPV16基因组的主要早期启动子p97的调控序列。或者，基本上在特定细胞类型中具有转录活性的启动子可以是基本上仅在子宫颈鳞状柱状(SC)接合部细胞中具有转录活性的启动子，如ARG2基因启动子。这一方法在本文中可以称为“靶向基因表达”。胰腺癌相关性启动子可以是MSLN启动子。前列腺癌相关性启动子可以是K5。
在前述任何实施方案中，编码多肽或调控RNA的DNA序列可以编码细胞毒素。在具体实施例中，细胞毒素是白喉毒素A。
在前述任何实施方案中，编码多肽的DNA序列可以编码免疫调节蛋白。在具体实施例中，免疫调节蛋白是细胞因子或趋化因子。细胞因子和趋化因子的其它非限制性实例包括IL-2、IL-6及RANTES。
在前述任何实施方案中，编码多肽或调控RNA的DNA序列可以编码荧光蛋白。在具体实施例中，荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)或青荧光蛋白(CFP)。
在前述任何实施方案中，编码多肽或调控RNA的DNA序列可以编码调控RNA。在具体实施例中，调控RNA是shRNA、miRNA或miRNA前体，或siRNA。在另一个具体实施例中，调控RNA是针对吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的shRNA。
在前述任何实施方案中，与DNA树状聚合物连接的一个或多个DNA序列可以包含编码多种多肽或多种调控RNA的DNA序列。在具体实施方案中，这些DNA序列编码多种多肽、多种调控RNA或多肽与调控RNA的组合。
在前述任何实施方案中，DNA树状聚合物可以另外包含与其连接的细胞内化部分。在具体实施方案中，细胞内化部分是与细胞表面蛋白质结合的抗体、与细胞表面蛋白质结合的肽或与细胞表面受体结合的配体。在一个特定实施方案中，细胞内化部分是与转铁蛋白受体结合的抗体或肽。
在另一方面，本发明提供了包含连接有一个或多个DNA序列的DNA树状聚合物以及药学上可接受的载体的药物组合物，所述DNA序列包含编码多肽或调控RNA的DNA序列，所述DNA序列与调控所述编码多肽或调控RNA的DNA序列的表达的DNA序列连接。所述药物组合物中的DNA树状聚合物可以是根据以上论述的任何实施方案的功能化DNA树状聚合物。在具体实施方案中，编码多肽或调控RNA的DNA序列编码对细胞或组织有毒性的多肽或调控RNA。毒性多肽可以是例如细胞毒素，如白喉毒素A。
在所述药物组合物的具体实施方案中，用于功能化DNA树状聚合物的药学上可接受的载体是通过促进细胞直接暴露于功能化DNA树状聚合物来将组合物靶向局部递送到细胞的一种物质。举例来说，可以使用局部递送媒介物作为功能化DNA树状聚合物的载体并且直接施用到期望的位置以促进DNA树状聚合物被细胞吸收。在一个具体实施方案中，局部递送媒介物可以是一种复合材料，包括粘膜粘附复合材料(例如，葡聚糖醛聚合物粘膜粘附材料)。在另一个具体实施方案中，药物组合物可以局部施用到子宫颈鳞状柱状接合部细胞以治疗HPV-16感染的细胞。
在又一方面，根据前述任何实施方案的功能化DNA树状聚合物可以用于治疗细胞，如病毒感染的细胞、癌细胞或癌变前细胞的疾病和病症的方法中。在所述方法的具体实施方案中，将功能化DNA树状聚合物以有效治疗疾病或病症的量向有需要的患者施用。在具体实施方案中，DNA树状聚合物通过细胞内化部分而被靶向细胞。或者，或另外，DNA树状聚合物通过如以上所描述的药物组合物的载体而被靶向细胞。编码多肽或调控RNA的DNA序列一般将针对期望细胞的毒性进行选择。选择所连接的调控编码多肽或调控RNA的DNA序列的表达的DNA序列一般基本上仅在所期望的细胞中具有转录活性；然而，如果认为调控序列对期望的细胞类型不具有足够的转录特异性，那么可以使用药学上可接受的载体的选择来改善功能化DNA树状聚合物向期望的细胞递送的特异性。或者，可以使用适于局部递送组合物的药学上可接受的载体使包含与编码多肽或调控RNA的DNA序列连接的非转录特异性序列的DNA树状聚合物靶向期望的细胞。因此，这一方面还涉及功能化树状聚合物用于治疗细胞，如病毒感染的细胞、癌细胞或癌变前细胞的疾病和病症的用途，其中调控基因转录的DNA序列在这些细胞中具有转录活性并且编码多肽或调控RNA的DNA序列对这些细胞具有毒性。
在另一方面，根据前述任何实施方案的功能化DNA树状聚合物可以用于鉴别HPV感染的上皮细胞和/或使其可视的方法中，所述方法包括将权利要求16所述的药物组合物局部施用到HPV感染的上皮细胞，其中调控基因转录的DNA序列在HPV感染的上皮细胞中具有特异性转录活性，并且所编码的多肽在HPV感染的HPV细胞中可以检测到。因此，这一方面还涉及功能化树状聚合物用于在体内、离体或体外鉴别HPV感染的上皮细胞和/或使其可视的用途，其中调控基因转录的DNA序列在HPV感染的上皮细胞中具有特异性转录活性，并且所编码的多肽在HPV感染的细胞中可以检测到。
附图简述
本专利或申请文件含有至少一个以彩色绘制的附图。这一带有彩色附图的专利或专利申请公布的复本将在提出请求并缴纳必要费用之后由专利局提供。
图1A是功能化DNA树状聚合物的结构的彩色图示。图1B是显示实施例1中所描述的体外实验的结果的彩色照片。图1C是显示实施例1中所描述的体内实验的结果的彩色照片。
图2是显示实施例2中所描述的体内实验的结果的一系列彩色照片。
发明详述
在描述本发明的若干示例性实施方案之前，应了解，本发明不限于以下说明中所陈述的构造或方法步骤的细节。本发明能够包含其它实施方案，并且能够以各种方式实施或进行。
在本说明书通篇所提到的“一个实施方案”、“某些实施方案”、“一个或多个实施方案”或“一实施方案”意思指在本发明的至少一个实施方案中包括了结合该实施方案描述的特定特征、结构、材料或特性。因此，在本说明书通篇各处出现的短语，如“在一个或多个实施方案中”、“在某些实施方案中”、“在一个实施方案中”或“在一实施方案中”未必是指本发明的相同实施方案。此外，特定特征、结构、材料或特性可以按任何适合方式组合在一个或多个实施方案中。
如本文所使用，短语“功能化DNA树状聚合物”和相关短语是指表面附接有一个或多个功能活性部分的DNA树状聚合物。功能活性部分包括但不限于，使DNA树状聚合物靶向特定细胞类型的部分、具有治疗活性的部分、使DNA树状聚合物具有可检测性的部分以及在细胞内起作用以改变细胞内的生物活性或生物化学活性的部分。调控RNA是功能活性部分的实例，并且是对细胞中的生物过程发挥调控作用的非编码RNA。此类RNA包括miRNA和siRNA。功能化DNA树状聚合物在本文中又可以称为“纳米DNA”、“DNA纳米粒子”、“树状聚合物纳米粒子”等。
如本文中结合功能化DNA树状聚合物向细胞的递送所使用的术语“有毒性”、“毒性”及类似术语是指附接到树状聚合物的功能活性部分杀死细胞的能力。
如本文中所使用，短语仅在特定细胞类型中“基本上具有转录活性”、对于特定细胞类型“具有转录特异性”或“具有特异性转录活性”及相关短语是指相对于其它(非靶)细胞类型，优先在特定(靶)细胞类型中表达的基因构建体。尽管希望100％的表达特异性，但也不排除非靶细胞中的较低水平表达。相比之下，“非转录特异性”是指基本上同等地在所有或大部分细胞类型中表达的基因构建体。
如本文中所使用，术语“治疗(treat/treating/treated)”是指减轻或消除疾病或病症；减轻或消除疾病或病症的至少一种症状；或预防疾病、病症或症状。
短语“药学上可接受的载体”是指可以用于配制用于向患者施用以达到治疗结果的DNA树状聚合物的任何适合的媒介物。药学上可接受的载体本身一般不提供另外的治疗作用。所述载体可以适用于静脉内制剂、局部制剂、口服制剂等。
术语“启动子”在本文中是以最广泛含义使用，指增强、诱导或调控下游DNA编码序列的转录以产生与该编码序列互补的RNA(基因表达)的任何调控序列。
现已发现，附接到DNA树状聚合物的可表达的基因构建体是可用于基因疗法中的有用递送媒介物，其将大量的基因构建体载入细胞中。已经发现，DNA树状聚合物和附接的基因构建体在与细胞表面接触时有效地被细胞内化，并且该基因构建体的多肽或调控RNA(即，基因产物)在细胞内有效地表达。如果基因产物是一种有毒性的分子，那么其表达杀死细胞。凭借附接到DNA树状聚合物的细胞特异性靶向部分，DNA树状聚合物还能够为基因构建体向细胞的递送提供增强的细胞特异性。此外，在基因构建体中使用基本上仅在特定细胞类型中具有转录活性的启动子将提供另外的细胞特异性水平并且进一步改善治疗作用。
本发明的第一方面提供一种连接有一个或多个DNA序列的DNA树状聚合物，所述DNA序列编码多肽或调控RNA(即，编码序列)，并且与调控所述编码序列的转录以产生编码多肽的RNA或产生调控RNA(例如启动子)的DNA序列可操作地连接。调控编码序列转录的DNA序列以及可操作地连接的编码序列一起在本文中称为“基因构建体”。DNA树状聚合物可以任选地另外与靶向部分连接，该靶向部分将DNA树状聚合物导引到特定细胞类型并且使DNA树状聚合物与该特定细胞类型的表面结合。这一类型的DNA树状聚合物适用于将基因构建体靶向递送到特定细胞类型，在该细胞类型中，其可以被内化以表达编码序列。
在另一实施方案中，选择的编码多肽或调控RNA的DNA序列应使得所编码的多肽或调控RNA在经由DNA树状聚合物递送到细胞中之后对细胞有毒性。举例来说，编码DT-A或另一细胞毒性多肽的DNA序列可以与调控转录的DNA序列可操作地连接。在另一实施例中，编码siRNA或miRNA的DNA序列可以与调控转录的DNA序列可操作地连接，所述siRNA或miRNA在经由DNA树状聚合物递送到细胞中之后，使细胞中所选基因的表达沉默。
在具体实施方案中，调控编码序列转录的DNA序列是启动子。适于在树状聚合物内化后在细胞中实现表达的任何启动子都可用于本发明中。该启动子可以基本上仅在特定细胞类型中具有转录活性，或其可以不具有转录特异性。启动子的类型将基于表达基因构建体的细胞类型以及期望的转录特异性程度选择。一般来说，优选具有高转录活性的启动子，以使编码序列的表达最大化。相对不具有转录特异性的启动子的实例包括HPV16长控制区(LCR)以及RG4X(同时在HPV16感染的细胞和未感染细胞中活化转录)和CAG(一种普遍表达的强启动子序列)。基本上仅在特定细胞类型中具有转录活性的启动子的实例包括AGR2启动子(前梯度蛋白2，在SC接合部细胞中表达)、K5启动子(在不依赖于雄激素的前列腺癌细胞中表达)及间皮素启动子(在胰腺癌细胞中表达。
编码多肽或调控RNA的DNA序列可以是编码一旦DNA树状聚合物内化，即在细胞中具有功能活性的多肽或调控RNA的任何DNA序列。举例来说，编码序列可以编码对细胞有毒性的多肽(如DT-A)、抑制或增强细胞中基因的表达的调控性肽，或在细胞内起作用的酶。编码序列还可以编码使细胞中的基因表达沉默的调控RNA，如snoRNA、shRNA、miRNA或siRNA。在具体实施例中，这些调控RNA可以靶向RNA转运蛋白HuR。或者，编码序列可以编码增强细胞中的基因表达的调控RNA。在另一实施例中，调控RNA会影响细胞内的发育过程，如miRNAlet7。
在某些实施方案中，其中DNA树状聚合物另外包括与单链臂连接的靶向部分。该靶向部分可以是与细胞上被选择用于递送树状聚合物的细胞表面标记物(如配体或受体)结合的任何蛋白质、多肽或配体。靶向部分改善树状聚合物与细胞表面的结合，并由此促进树状聚合物的有效全身施用。举例来说，靶向部分可以是抗体、激素、受体配体或毒素。有用靶向部分的具体实例包括与仅在或几乎仅在患病细胞的表面上或特定类别、类型、器官或组织的细胞的表面上表达的细胞表面标记物结合的那些。这些靶向部分可以与HER-2/neu(某些乳癌类型)、去唾液酸胎球蛋白受体(肝细胞)、病毒抗原(感染病毒的细胞)或清道夫受体(巨噬细胞)结合。
或者，有用靶向部分包括与在患病细胞的表面上或特定类别、类型、器官或组织的细胞的表面上过表达的细胞表面标记物结合的那些。这些靶向部分可以与PDGF受体、EGFR家族受体、ICAM、CD受体、MMP-9、白细胞介素受体、转铁蛋白受体、叶酸受体及本领域中已知的其它物质结合。
如果DNA树状聚合物包括靶向部分，那么该靶向部分可以通过共价或非共价键联与该树状聚合物连接。在非共价键联中，靶向部分可以与和树状聚合物的单链“臂”上的序列互补的寡核苷酸连接，由此使该靶向部分与树状聚合物间接杂交。示例性共价键联是本领域中已知的，如通过双官能交联剂和杂双官能交联剂，或使用“点击化学”形成的键联。
在其它方面，本发明提供了包含前述任何DNA树状聚合物的药物组合物。这些组合物包含DNA树状聚合物和至少一种药学上可接受的载体，其呈适于期望的施用途径的制剂形式。药物组合物中DNA树状聚合物的存在量足以在树状聚合物被靶细胞内化时，将足够的基因构建体递送到细胞中，以治疗所鉴别的疾病或病症。以药物组合物的总重量计，组合物中树状聚合物的量可以在0.1重量％至25重量％范围内。药学上可接受的载体的实例包括水、稳定剂、增稠剂、润滑剂、蜡、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、抗氧化剂、粘合剂、防腐剂、着色剂(如颜料或染料)、乳化剂或药物制剂的其它常用成分。如本领域中所知，药物组合物可以被配制用于静脉内施用、局部施用、注射、输注或口服施用。药物组合物典型地通过使用本领域中已知的方法，在适合条件下组合所有成分来制备。
在其它方面，本发明提供了使用DNA树状聚合物和包含DNA树状聚合物的药物组合物治疗有需要患者的疾病和/或病症的方法及其用途。一般来说，使基因构建体靶向所期望的细胞可以通过两种方式中的任一种实现。第一，如果启动子不具有转录特异性并且DNA树状聚合物不包括靶向部分，那么包含该DNA树状聚合物的药物组合物可以局部施用到所鉴别的细胞进行治疗。举例来说，包含DNA树状聚合物的药物组合物可以局部施用到发现患病细胞或具有病症的细胞的组织，或者其可以通过注射到发现患病细胞或具有病症的细胞的组织来局部施用。这称为“靶向递送”。还可以通过与DNA树状聚合物连接的靶向部分实现靶向递送，此时靶向部分与患有疾病或病症的细胞类型结合，但基本上不与正常细胞结合。
第二，如果基因构建体的启动子基本上仅在展现疾病或病症的细胞中具有转录活性，那么全身施用存在另外的选择，因为即使DNA树状聚合物被正常细胞内化，基因产物也不会在健康细胞中大量表达。这称为“靶向表达”。药物组合物全身递送的改善可以通过在DNA树状聚合物同时包括靶向递送和靶向表达特征(如以上所论述)来实现。
在另一方面，本发明提供了用于制备以上论述的DNA树状聚合物的方法。由多核苷酸单体组装DNA树状聚合物的方法是本领域中已知的并且例如描述于美国专利号5,487,973及T.Nilsen等人(J.Theor.Biol.(1997)187:273-284)中，其公开内容通过引用的方式整体并入本文中。靶向部分(如果存在)可以使用本领域中已知的各种适合方法与树状聚合物共价或非共价连接。这些方法包括例如经由二硫键键联、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯依赖性缩合反应、双官能交联、使用聚阳离子化合物经由电荷-电荷相互作用将该部分桥接到树状聚合物，或者如WO2010/017544中所公开，与树状聚合物臂直接或间接杂交。同样，基因构建体可以使用这些方法与树状聚合物的臂共价或非共价连接。R.Stears等人(Physiol.Genomics(2000)3:93-99)还大体上描述了使用捕捉序列通过杂交将分子与树状聚合物连接。公开用于通过氢键将分子附接到树状聚合物(杂交)的方法的其它参考文献包括Int.Arch.AllergyImmunol.(2012)157:31-40；BioTechniques(2008)44:815-818；J.Clin.Microbiol(2005)43(7):3255-3259；及Small(2009)5(15):1784-90。
实施例1：细胞角蛋白5(K5)启动子调控的白喉毒素(DT)自杀基因的DNA树状聚合物递送
2层DNA树状聚合物(2n3DNA)的制备：如先前所公开(参见例如，专利5,175,270、5,484,904、5,487,973、6,110,687及6,274,723，其各自通过引用的方式整体并入)，制造DNA树状聚合物。简单地说，由DNA单体构建DNA树状聚合物，这些DNA单体各自由两条DNA链构成，这两条DNA链共有位于每条链中心部分中的序列互补区。这两条链退火形成单体，所得结构可以描述为中心双链“腰”邻接四个单链“臂”。这种腰加臂的结构构成了基础单体。在五种单体类型各自的末端处的单链臂被设计成以精确并且特异性方式彼此相互作用。互补单体构的臂之间的碱基配对允许通过依序添加单体层来定向组装树状聚合物。树状聚合物每一层的组装包括一个交联过程，其中DNA的链彼此共价键结，由此形成完整共价分子，该分子不易受另外会引起树状聚合物结构变形的变性条件的影响。此外，用作互补捕捉寡核苷酸的38个碱基的寡核苷酸经由简单的T4DNA连接酶依赖性连接反应与可用树状聚合物臂的5'端连接，如下所示：
将捕捉序列附接到DNA树状聚合物：为了附接转铁蛋白受体(TfR/CD71)靶向肽THRPPMWSPVWP(SEQIDNO:1)，将捕捉寡核苷酸与10-15％的树状聚合物臂连接。使与捕捉寡核苷酸互补的寡核苷酸与TfR肽(Bio-Synthesis,www.biosyn.com)或抗CD71抗体偶联并以一定摩尔比杂交，以占据所有可用的捕捉序列。如以下所概述，每个树状聚合物分子附接约2-5个肽或抗CD71抗体。
利用与树状聚合物臂和捕捉寡核苷酸的相邻部分重叠的桥接寡核苷酸，将较小(15-100个核苷酸)DNA或RNA捕捉寡核苷酸(或其它生物化学类似物)经由简单的核酸连接反应共价附接到树状聚合物臂的末端，由此将捕捉寡核苷酸桥接到树状聚合物臂的末端。桥接寡核苷酸与相邻树状聚合物臂和捕捉寡核苷酸序列各自重叠至少5个碱基，以促进核酸连接酶(优选是T4DNA连接酶)的连接活性，其中每个序列重叠至少7个碱基是优选的。当使用树状聚合物特异性靶向非树状聚合物核酸或其它分子时，桥接寡核苷酸还可以充当其互补序列的核酸阻断剂。
将以下组分添加到微量离心管中：
1.含2层DNA树状聚合物(500ng/μL)的1XTE缓冲液5.4μL(2680ng)
2.a(-)LIG-BR7桥接寡核苷酸(14mer)(50ng/μL)，2.7μL(134ng)
3.10X连接酶缓冲液10.2μL
4.10X连接酶缓冲液10.2μL
5.Cap03捕捉寡核苷酸(38mer)(50ng/μL)，4.0μL(200ng)
6.T4DNA连接酶(1U/μL)，10.0μL(10个单位)
前四种反应物一起添加，加热到65℃并冷却到室温。然后添加第5种和第6种反应物并温育45分钟。通过添加2.8μL的0.5MEDTA溶液来停止连接反应。经由使用100k截留分子量的离心过滤器(MilliporeCorp.)去除未连接的寡核苷酸，并且在纯化洗涤期间，将缓冲液更换成1x无菌PBS，pH7.4。将捕捉寡核苷酸与树状聚合物的第一个单链表面臂连接。
为了靶向细胞表面并且起始内化，使与TfR结合的抗体或肽与DNA树状聚合物偶合。将针对转铁蛋白受体(TfR/CD71)的抗体或TfR靶向肽THRPPMWSPVWP(SEQIDNO:1)共价附接到与先前与树状聚合物连接的捕捉寡核苷酸(参看上文)互补的寡核苷酸。简单地说，使用市售化学试剂将捕捉寡核苷酸补体(cplCap03)，即5’-TTCTCGTGTTCCGTTTGTACTCTAAGGTGGATTTTT-3’(SEQIDNO:2)通过3’端共价偶合至抗CD71抗体(Solulink)或TfR靶向肽(Biosynthesis)，并通过HPLC纯化以去除过量的试剂。然后，在最终的试剂组装期间(参考下述3DNA制备部分)，使这些偶联物与树状聚合物捕捉寡核苷酸杂交。
K5/CFP和K5/XX3DNA的制备：用KpnI-HF(NewEnglandBiolabs)限制性切割700μg的pK5/CFP(一种含有与青荧光蛋白(CFP)的编码序列可操作地连接的细胞角蛋白5基因(Krt5)启动子的质粒)和350μg的pK5/XX(一种仅含有细胞角蛋白5基因的启动子(即，不含编码序列)的质粒)以使该质粒线性化，然后在37℃下用虾碱性磷酸酶(Affymetrix)使其脱膦酸，保持2小时，最终体积分别为7mL和3.5mL。随后，通过加热到80℃，保持10分钟来停止这一反应。取出各自的等分试样进行凝胶分析以确认质粒的消化。接下来，使用如以上所描述的市售化学试剂将与树状聚合物的第二个单链表面臂互补的寡核苷酸与线性化质粒共价连接。确切地说，将与第二个单链树状聚合物臂互补的杂交寡核苷酸、10X连接缓冲液及T4DNA连接酶添加到线性化质粒中，达到8.4mL(对于K5/CFP)和4.2mL(对于K5/XX)的最终体积。室温下，在烧杯水浴中开始连接，然后将其放入4℃下以缓慢冷却并持续冷却过夜。次日早晨，从每一种质粒取出等分试样用于凝胶分析。执行Lonza1.2％琼脂糖凝胶电泳以确定杂交寡核苷酸与每一种质粒成功连接。DNA树状聚合物与每一连接的质粒的组合使连接的质粒转移到含DNA树状聚合物的孔中，证实了这些质粒的成功连接。然后使用Amicon100K柱纯化连接的质粒以去除过量的杂交寡核苷酸。使用nanodrop测定每一纯化的经纯化的连接质粒的最终产率。
使用本领域中已知的方法，通过将Cy3附接到与树状聚合物的第三个单链表面臂互补的寡核苷酸来制备标记的寡核苷酸。
接下来，通过使TfR肽/捕捉补体(“TfR肽-cplCap03偶联物”)或抗CD71/捕捉补体(“抗CD71-cplCap03偶联物”)、与第二个单链树状聚合物臂的补体连接的质粒(“连接的质粒”)及与第三个单链树状聚合物臂互补的标记的寡核苷酸(“Cy3标记的寡核苷酸”)与树状聚合物杂交来制备每个完全修饰的3DNA树状聚合物。这是通过将以下试剂按其所列次序组合来实现。对于2n-Cy33DNA-抗CD71-K5/CFP，制备450μl达到10ng/μl2n3DNA和489.8ng/μl质粒DNA的最终浓度如下：4500ng的2n(-)3DNA、445ng的c(+)Cy3标记的寡核苷酸、192.3ng的抗CD71-cplCap03偶联物、328.9μl的无菌1XPBS及220.4μg连接的K5/CFP。对于2n-Cy33DNA-TfR肽-K5/CFP，制备450μl达到10ng/μl2n3DNA和489.8ng/μl质粒DNA的最终浓度如下：4500ng的2n(-)3DNA、445ng的c(+)Cy3标记的寡核苷酸、192.3ng的TfR肽-cplCap03偶联物、347.7μl的无菌1XPBS及220.4μg连接的K5/CFP。对于2n-Cy33DNA-TfR肽-K5/XX，制备450μl达到10ng/μl2n3DNA和489.8ng/μl质粒DNA的最终浓度如下：4500ng的2n(-)3DNA、445ng的c(+)Cy3标记的寡核苷酸、192.3ng的TfR肽-cplCap03偶联物、347.7μl的无菌1XPBS及220.4μg连接的K5/XX。每一3DNA树状聚合物在37℃下温育30分钟，然后在4℃下储存待用。构建体的图示于图1A中。
体外和体内前列腺肿瘤研究：
体外：为了确认体外结合和递送，将1X105个LAPC4-AS细胞(雄激素敏感性人前列腺癌细胞)铺板于24孔板中，并在37℃、5％CO2(平衡空气)下培养2天。将十(10)微升K5/CFP-TFR(10ng/ml3DNA，500ng/mlDNA)或K5/XX-TFR树状聚合物(10ng/ml3DNA，444ng/mlDNA)与100微升的OptiMEM培养基(Gibco)混合。从24孔培养板中取出培养基，并且添加树状聚合物混合物，并在37℃下温育4小时。添加一(1)毫升完全培养基并且继续培养2天。使用抗EGFP抗体(Clonetech1:1000)对细胞进行免疫染色，并使用倒置荧光显微镜拍照(图1B)。
体内：为了在体内测试树状聚合物构建体，将含有5X105个PC-3ML/Luc细胞(稳定表达萤火虫荧光素酶的不依赖于雄激素的人前列腺癌细胞)并且含20％Matrigel的100μlPBS皮下(s.c.)注射到NOG小鼠体内。7周后，对小鼠眼球后注射100μl如以上所制备的树状聚合物制剂。注射树状聚合物构建体之后二十四(24)小时，处死小鼠并且将肿瘤、脾、肝、皮肤、脾、肾、脑、肺及正常前列腺固定于10％福尔马林中，保持2小时，并包埋于石蜡中。用抗GFP抗体(抗GFP抗体也识别CFP)对包埋的切片进行免疫染色以确定CFP(青荧光蛋白)的表达水平并用荧光显微镜获取照片。结果概述于图1C中。在分析各种组织之后，观察到仅肿瘤呈现CFP的大量表达，表明树状聚合物K5/CFP构建体在肿瘤细胞中选择性表达。
实施例2：胰腺肿瘤靶向
2层DNA树状聚合物的制备：如先前所公开(参见例如，专利5,175,270、5,484,904、5,487,973、6,110,687及6,274,723，其各自通过引用的方式整体并入)，制造DNA树状聚合物。简单地说，由DNA单体构建DNA树状聚合物，这些DNA单体各自由两条DNA链构成，这两条DNA链共有位于每条链中心部分中的序列互补区。这两条链退火形成单体，所得结构可以描述为中心双链“腰”邻接四个单链“臂”。这种腰加臂的结构构成基础单体。在五种单体类型各自的末端处的单链臂被设计成以精确并且特异性方式彼此相互作用。互补单体的臂之间的碱基配对允许通过依序添加单体层来定向组装树状聚合物。树状聚合物每一层的组装包括一个交联过程，其中DNA的链彼此共价键结，由此形成完整共价分子，该分子不易受另外会引起树状聚合物结构变形的变性条件的影响。此外，用作互补捕捉寡核苷酸的38个碱基的寡核苷酸经由简单的T4DNA连接酶依赖性连接反应与可用树状聚合物臂的5'端连接，如下所示：
将捕捉序列附接到DNA树状聚合物：为了附接转铁蛋白受体(TfR/CD71)靶向肽THRPPMWSPVWP(SEQIDNO:1)，将捕捉序列与10-15％的树状聚合物臂连接。使与这一捕捉序列互补的寡核苷酸与TfR肽(Bio-Synthesis,www.biosyn.com)偶联并以一定摩尔比杂交，以占据所有可用的捕捉序列。如以下所概述，每个树状聚合物分子附接约2-5个肽。
利用与树状聚合物臂和捕捉寡核苷酸的相邻部分重叠的桥接寡核苷酸，将较小(15-100个核苷酸)DNA或RNA捕捉寡核苷酸(或其它生物化学类似物)经由简单的核酸连接反应共价附接到树状聚合物臂的末端，由此将捕捉寡核苷酸桥接到树状聚合物臂的末端。桥接寡核苷酸与相邻树状聚合物臂和捕捉寡核苷酸序列各自重叠至少5个碱基，以促进核酸连接酶(优选是T4DNA连接酶)的连接活性，其中每个序列重叠至少7个碱基是优选的。当使用树状聚合物特异性靶向非树状聚合物核酸或其它分子时，桥接寡核苷酸还可以充当其互补序列的核酸阻断剂。
将以下组分添加到微量离心管中：
1.含2层DNA树状聚合物(500ng/μL)的1XTE缓冲液5.4μL(2680ng)
2.a(-)LIG-BR7桥接寡核苷酸(14mer)(50ng/μL)，2.7μL(134ng)
3.10X连接酶缓冲液10.2μL
4.不含核酸酶的水81.7μL
5.Cap03捕捉寡核苷酸(38mer)(50ng/μL)，4.0μL(200ng)
6.T4DNA连接酶(1U/μL)，10.0μL(10个单位)
前四种反应物一起添加，加热到65℃并冷却到室温。然后添加第5种和第6种反应物并温育45分钟。通过添加2.8μL的0.5MEDTA溶液来停止连接反应。经由使用100k截留分子量的离心过滤器(MilliporeCorp.)去除未连接的寡核苷酸，并且在纯化洗涤期间，将缓冲液更换成1x无菌PBS，pH7.4。将捕捉寡核苷酸与树状聚合物的第一个单链表面臂连接。
为了靶向细胞表面并且起始内化，使与TfR结合的肽与DNA树状聚合物偶合。将靶向肽THRPPMWSPVWP(SEQIDNO:1)共价附接到与先前与树状聚合物连接的捕捉序列互补的寡核苷酸。简单地说，使用市售化学试剂将捕捉序列补体(cplCap03)，即5’-TTCTCGTGTTCCGTTTGTACTCTAAGGTGGATTTTT-3’(SEQIDNO:2)通过3’端共价偶合至TfR靶向肽(Biosynthesis)，并通过HPLC纯化以去除过量的试剂。然后，在最终的试剂组装期间(参考下述3DNA制备部分)，使这些偶联物与树状聚合物捕捉序列杂交。
MSLN/DT和MSLN/XX3DNA的制备：用KpnI-HF(NewEnglandBiolabs)分别限制性切割1mg的两种质粒(MSLN/DT，含有与白喉毒素A链的编码序列可操作地连接的人间皮素基因(MSLN)的启动子；及MSLN/XX，含有MSLN启动子并且不含编码序列)以使质粒线性化，并且在37℃下用虾碱性磷酸酶(Affymetrix)使其脱膦酸，保持2小时，最终体积为10mL。随后，通过加热到80℃，保持10分钟来停止这一反应。取出各自的等分试样进行凝胶分析以确认质粒的消化。接下来，使用如以上所描述的市售化学试剂将与树状聚合物的第二个单链表面臂互补的寡核苷酸与线性化质粒共价连接。确切地说，将与第二个单链树状聚合物臂互补的杂交寡核苷酸、10X连接缓冲液及T4DNA连接酶添加到线性化质粒中，达到12mL最终体积。室温下，在烧杯水浴中开始连接，然后将其放入4℃下以缓慢冷却并持续冷却过夜。次日早晨，从每一种质粒取出等分试样用于凝胶分析。执行Lonza1.2％琼脂糖凝胶电泳以确定杂交寡核苷酸与质粒成功连接。DNA树状聚合物与每一种连接的质粒的组合使连接的质粒转移到含DNA树状聚合物的孔中，证实了这些质粒的成功连接。然后，使用Qiagen无内毒素质粒大量提取试剂盒(QiagenEndo-freeplasmidMaxiKit)和Qiagentip-500纯化连接的质粒。每个质粒使用两个柱，因为这些柱的最大容量是500μg。在从Qiagentip-500洗脱之后，最后一个步骤是乙醇沉淀。用无菌1XPBS使沉淀再悬浮，并且使用nanodrop测定每一经纯化的连接质粒的最终产率。
使用本领域中已知的方法，通过将Cy3附接到与树状聚合物的第三个单链表面臂互补的寡核苷酸来制备标记的寡核苷酸。
接下来，通过使TfR肽/捕捉补体(“TfR肽-cplCap03偶联物”)、与第二个单链树状聚合物臂的补体连接的质粒(“连接的质粒”)及与第三个单链树状聚合物臂互补的标记的寡核苷酸(“Cy3标记的寡核苷酸”)与树状聚合物杂交来制备每个完全修饰的3DNA试剂。这是通过将以下试剂按其所列次序组合来实现。对于2n(-)Cy33DNA-TfR肽-MSLN/DT，制备600μl达到10ng/μl2n3DNA和317ng/μl质粒DNA的最终浓度如下：6000ng的2n(-)3DNA、600ng的c(+)Cy3标记的寡核苷酸、256.4ng的TfR肽-cplCap03偶联物、385.2μl的无菌1XPBS及190.2μg连接的MSLN/DT。对于2n(-)Cy33DNA-TfR肽-MSLN/XX，制备600μl达到10ng/μl2n3DNA和229ng/μl质粒DNA的最终浓度如下：6000ng的2n(-)3DNA、600ng的c(+)Cy3标记的寡核苷酸、256.4ng的TfR肽-cplCap03偶联物、425.2μl的无菌1XPBS及137.4μg连接的MSLN/XX。随后，每一3DNA树状聚合物混合物在37℃下温育30分钟，然后在4℃下储存待用。
体内小鼠研究：为了在小鼠中诱导肿瘤形成，将含2X105个PAN02-Luc细胞(稳定表达萤火虫荧光素酶的小鼠胰腺癌细胞)的20mlMatrigel直接注射到B6小鼠的胰腺中。四周后，对小鼠眼球后注射100μl的1xPBS(阴性对照)、MSLN/DT树状聚合物(10ng/ml3DNA，311ng/mlDNA)或MSLN/XX(10ng/ml3DNA，229ng/mlDNA)。每周注射两次，持续两周，总计4次剂量。最后一次剂量后3天，处死小鼠，并且将肿瘤、肝、脾固定于10％福尔马林中，保持2小时，并制备石蜡包埋的切片并将其固定到载片上供进一步研究。为了测定由处理引起的细胞死亡的水平，使用原位细胞死亡检测试剂盒(InsituCellDeathDetectionKit,Roche)进行TUNEL测定。结果概述于图2中，并且比较各情形，MSLN/DT树状聚合物构建体所呈现的细胞死亡水平明显高于PBS缓冲液对照或MSLN/XX(无毒素基因)对照所呈现的细胞死亡水平。
结论
转染数据显示，功能化DNA树状聚合物在体外将K5/CFPDNA递送到LAPC-4AS细胞并且在全身施用后递送到异种移植物。K5/DT在体外杀死LAPC-4AI细胞。由于LAPC-4AI细胞是由LAPC-4AS细胞通过在剥夺雄激素的培养基(即，模拟雄激素剥夺疗法(ADT))中生长而得到，故在用K5/DTDNA树状聚合物处理后细胞死亡证实，ADT和纳米DNA-K5/DT将一起作用。靶向TfR增强TfR肽衍生的树状聚合物与表达TfR的LAPC-4细胞的结合，在体外增强这些细胞的DNA转染，并且在全身递送后增强表达TfR的异种移植物中DNA的表达。不含TfR的组织对于结合呈阴性。
实施例3：用于子宫颈癌前病变的基于靶向DNA树状聚合物的基因疗法
近来，前梯度蛋白2(AGR2)已被鉴别为生物标记物，其在子宫颈鳞状柱状(SC)接合部细胞中的表达水平是相邻鳞状和柱状细胞的25倍。经鉴别和显示，先前鉴别的AGR2基因的启动子序列对于靶向SC接合部细胞的基因表达具有适当生理活性。
2层DNA树状聚合物的制备：如先前所公开(参见例如，专利5,175,270、5,484,904、5,487,973、6,110,687及6,274,723，其各自通过引用的方式整体并入)，制造DNA树状聚合物。简单地说，由DNA单体构建DNA树状聚合物，这些DNA单体各自由两条DNA链构成，这两条DNA链共有位于每条链中心部分中的序列互补区。这两条链退火形成单体；所得结构可以描述为中心双链“腰”邻接四个单链“臂”。这种腰加臂的结构构成基础单体。在五种单体类型各自的末端处的单链臂被设计成以精确并且特异性方式彼此相互作用。互补单体的臂之间的碱基配对允许通过依序添加单体层来定向组装树状聚合物。树状聚合物每一层的组装包括一个交联过程，其中DNA的链彼此共价键结，由此形成完整共价分子，该分子不易受另外会引起树状聚合物结构变形的变性条件的影响。此外，用作互补捕捉寡核苷酸的38个碱基的寡核苷酸经由简单的T4DNA连接酶依赖性连接反应与可用树状聚合物臂的5'端连接。
将捕捉序列附接到DNA树状聚合物：为了附接转铁蛋白受体(TfR/CD71)靶向肽THRPPMWSPVWP(SEQIDNO:1)，将捕捉序列与10-15％的树状聚合物臂连接。使与这一捕捉序列互补的寡核苷酸与TfR肽(Bio-Synthesis,www.biosyn.com)偶联并以一定摩尔比杂交，以占据所有可用的捕捉序列。如以下所概述，每个树状聚合物分子附接约2-5个肽。
利用与树状聚合物臂和捕捉寡核苷酸的相邻部分重叠的桥接寡核苷酸，将较小(15-100个核苷酸)DNA或RNA捕捉寡核苷酸(或其它生物化学类似物)经由简单的核酸连接反应共价附接到树状聚合物臂的末端，由此将捕捉寡核苷酸桥接到树状聚合物臂的末端。桥接寡核苷酸与相邻树状聚合物臂和捕捉寡核苷酸序列各自重叠至少5个碱基，以促进核酸连接酶(优选是T4DNA连接酶)的连接活性，其中每个序列重叠至少7个碱基是优选的。当使用树状聚合物特异性靶向非树状聚合物核酸或其它分子时，桥接寡核苷酸还可以充当其互补序列的核酸阻断剂。
将以下组分添加到微量离心管中：
1.含2层DNA树状聚合物(500ng/μL)的1XTE缓冲液5.4μL(2680ng)
2.a(-)LIG-BR7桥接寡核苷酸(14mer)(50ng/μL)，2.7μL(134ng)
3.10X连接酶缓冲液10.2μL
4.不含核酸酶的水81.7μL
5.Cap03捕捉寡核苷酸(38mer)(50ng/μL)，4.0μL(200ng)
6.T4DNA连接酶(1U/μL)，10.0μL(10个单位)
前四种反应物一起添加，加热到65℃并冷却到室温。然后添加第5种和第6种反应物并温育45分钟。通过添加2.8μL的0.5MEDTA溶液来停止连接反应。经由使用100k截留分子量的离心过滤器(MilliporeCorp.)去除未连接的寡核苷酸，并且在纯化洗涤期间，将缓冲液更换成1x无菌PBS，pH7.4。将捕捉寡核苷酸与树状聚合物的第一个单链表面臂连接。
为了靶向细胞表面并且起始内化，使与TfR结合的抗体或肽与DNA树状聚合物偶合。将针对转铁蛋白受体(TfR/CD71)的抗体或靶向肽THRPPMWSPVWP(SEQIDNO:1)共价附接到与和树状聚合物连接的捕捉寡核苷酸互补的寡核苷酸。简单地说，使用市售化学试剂将捕捉寡核苷酸补体(cplCap03)，即5’-TTCTCGTGTTCCGTTTGTACTCTAAGGTGGATTTTT-3’(SEQIDNO:2)通过3’端偶合至抗CD71抗体(Solulink)或TfR靶向肽(Biosynthesis)，并通过HPLC纯化以去除过量的试剂。然后，在最终的试剂组装期间(参考下述3DNA制备部分)，使这些偶联物与树状聚合物捕捉寡核苷酸杂交。
AGR2/DT和AGR2/XX3DNA的制备：用限制性酶分别限制性切割1mg的两种质粒(AGR2/DT，含有与白喉毒素A链的编码序列可操作地连接的人前梯度蛋白2(AGR2)基因的启动子；及AGR2/XX，含有AGR2启动子并且不含编码序列)以使其线性化，并且在37℃下用虾碱性磷酸酶(Affymetrix)使其脱膦酸，保持2小时，最终体积为10mL。随后，通过加热到80℃，保持10分钟来停止这一反应。取出各自的等分试样进行凝胶分析以确认质粒的消化。接下来，使用如以上所描述的市售化学试剂将与树状聚合物的第二个单链表面臂互补的寡核苷酸与线性化质粒共价连接。确切地说，将与第二个单链树状聚合物臂互补的杂交寡核苷酸、10X连接缓冲液及T4DNA连接酶添加到线性化质粒中，达到12mL最终体积。室温下，在烧杯水浴中开始连接，然后将其放入4℃下以缓慢冷却并持续冷却过夜。次日早晨，从每一种质粒取出等分试样用于凝胶分析。执行Lonza1.2％琼脂糖凝胶电泳以确定杂交寡核苷酸与成功连接。DNA树状聚合物与每一连接的质粒的组合使连接的质粒转移到含DNA树状聚合物的孔中，证实了这些质粒的成功连接。然后，使用Qiagen无内毒素质粒大量试剂盒和Qiagentip-500纯化连接的质粒。每个质粒使用两个柱，因为这些柱的最大容量是500μg。在从Qiagentip-500洗脱之后，最后一个步骤是乙醇沉淀。用无菌1XPBS使沉淀再悬浮，并且使用nanodrop测定每一种经纯化的连接质粒的最终产率。
使用本领域中已知的方法，通过将Cy3附接到与树状聚合物的第三个单链表面臂互补的寡核苷酸来制备标记的寡核苷酸。
接下来，通过使TfR肽/捕捉补体(“TfR肽-cplCap03偶联物”)、与第二个单链树状聚合物臂的补体连接的质粒(“连接的质粒”)及与第三个单链树状聚合物臂互补的标记的寡核苷酸(“Cy3标记的寡核苷酸”)与树状聚合物杂交来制备每个完全修饰的3DNA试剂。这是通过将以下试剂按其所列次序组合来实现。对于2n(-)Cy33DNA-TfR肽-AGR2/DT，制备600μl达到10ng/μl2n3DNA和317ng/μl质粒DNA的最终浓度如下：6000ng的2n(-)3DNA、600ng的c(+)Cy3标记的寡核苷酸、256.4ng的TfR肽-cplCap03偶联物、385.2μl的无菌1XPBS及190.2μg连接的AGR2/DT。对于2n(-)Cy33DNA-TfR肽-AGR2/XX，制备600μl达到10ng/μl2n3DNA和229ng/μl质粒DNA的最终浓度如下：6000ng的2n(-)3DNA、600ng的c(+)Cy3标记的寡核苷酸、256.4ng的TfR肽-cplCap03偶联物、425.2μl的无菌1XPBS及137.4μg连接的AGR2/XX。随后，每一3DNA树状聚合物混合物在37℃下温育30分钟，然后在4℃下储存待用。
离体研究：在用粘膜粘附材料与DNA树状聚合物的组合离体处理人癌变前子宫颈组织之后，对AGR2/DT和AGR2/XX3DNA基因表达和细胞死亡进行测试。粘膜粘附材料可以是PEG:葡聚糖复合物和/或具有热可逆特性的复合物，如LutrolF127。将每一样品放入24孔培养盘的孔中，用含有编码AGR2/DT和AGR2/XX的DNA树状聚合物的粘附材料覆盖，并孵育24小时。进行光学成像以检测荧光素酶生物发光并且进行TUNEL测定以检测凋亡的细胞。
预期在与载有AGR2/DTDNA树状聚合物的粘附材料孵育的样品中观察到生物发光，而在用AGR2/XXDNA树状聚合物处理的对照样品中未观察到。同样，预期在与AGR2/DT树状聚合物孵育的样品中观察到许多凋亡的细胞，并且在用对照树状聚合物处理的组织中观察到极少凋亡细胞。
尽管已经参照特定实施方案在本文中描述本发明，但应了解，这些实施方案只是对本发明的原理和应用的说明。本领域技术人员将显而易见，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的方法和设备进行各种修改和变更。因此，预计本发明包括在所附权利要求书及其等效内容范围内的修改和变更。

Claims (29)

1.一种包含DNA树状聚合物的组合物，其中与调控基因转录的DNA序列的可操作地连接的编码多肽或调控RNA的一个或多个DNA序列与所述DNA树状聚合物连接。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述DNA树状聚合物包含3-216个杂交的DNA单链。
3.如权利要求1所述的组合物，其中与所述DNA树状聚合物连接的所述DNA序列包含在病毒感染细胞、子宫颈鳞状柱状接合部细胞、患病或受损的细胞或肿瘤细胞中具有特异性转录活性的启动子。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述启动子在HPV感染的细胞、胰腺癌细胞或前列腺癌细胞中具有特异性转录活性。
5.如权利要求1所述的组合物，其中与所述DNA树状聚合物连接的所述DNA序列编码细胞毒素。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述细胞毒素是白喉毒素A链。
7.如权利要求1所述的组合物，其中与所述DNA树状聚合物连接的所述DNA序列编码免疫调节蛋白。
8.如权利要求1所述的组合物，其中与所述DNA树状聚合物连接的所述DNA序列编码荧光蛋白。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述荧光蛋白是GFP或CFP。
10.如权利要求8所述的组合物，其另外包含编码调控RNA序列的DNA序列。
11.如权利要求1所述的组合物，其包含多个连接的DNA序列，其中所述多个连接的DNA序列编码多种多肽或调控RNA，或其组合。
12.如权利要求1所述的组合物，其另外包含与所述DNA树状聚合物连接的细胞内化部分。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述细胞内化部分是与细胞表面蛋白质结合的抗体、与细胞表面蛋白质结合的肽或与细胞表面受体结合的配体。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述内化部分是与转铁蛋白受体结合的抗体或肽。
15.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的DNA树状聚合物和药学上可接受的载体。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是粘膜粘附复合物。
17.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是用于全身施用的载体。
18.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述DNA树状聚合物与细胞内化部分连接。
19.如权利要求15所述的药物组合物，其包含如权利要求1-12中任一项所述的DNA树状聚合物。
20.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述粘膜粘附复合物是葡聚糖醛(PEG:葡聚糖)粘膜粘附复合物。
21.一种用于治疗患者的患病细胞的方法，所述方法包括向所述患者施用有效治疗所述患病细胞的量的如权利要求1或权利要求3所述的DNA树状聚合物，其中调控基因转录的所述DNA序列在所述患病细胞中具有转录活性并且编码所述多肽或调控RNA的所述DNA序列对所述患病细胞有毒性。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述调控基因转录的DNA序列在HPV感染的细胞、胰腺癌细胞或前列腺癌细胞中具有特异性转录活性。
23.如权利要求21所述的方法，其典型地包括将如权利要求16所述的药物组合物局部施用到HPV感染的上皮细胞，其中所述调控基因转录的DNA序列在HPV感染的上皮细胞中或在SC接合部细胞中具有特异性转录活性，并且所述编码的多肽或调控RNA对所述HPV感染的上皮细胞有毒性。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述上皮细胞是鼻咽细胞或子宫颈细胞。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述上皮细胞是癌细胞。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述HPV感染的细胞以生殖器疣形式存在。
27.一种用于鉴别HPV感染的上皮细胞和/或使其可视的方法，所述方法包括将如权利要求16所述的药物组合物局部施用到所述HPV感染的上皮细胞，其中所述调控基因转录的DNA序列在所述HPV感染的上皮细胞中具有特异性转录活性，并且所述编码的多肽在所述HPV感染的细胞中可检测到。
28.如权利要求1或权利要求3所述的DNA树状聚合物用于治疗患病细胞或细胞病症的用途，其中所述调控基因转录的DNA序列在所述细胞中具有转录活性并且所述编码所述多肽或调控RNA的DNA序列对所述细胞有毒性。
29.如权利要求1或权利要求3所述的DNA树状聚合物用于鉴别HPV感染的上皮细胞和/或使其可视的用途，其中所述调控基因转录的DNA序列在所述HPV感染的上皮细胞中具有特异性转录活性，并且所述编码的多肽在所述HPV感染的细胞中可检测到。
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