JP7512207B2 - 核酸治療薬のための調節可能な共カップリングポリペプチドナノ粒子送達系の組成物および方法 - Google Patents
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本出願は、２０１８年５月２４日出願の米国仮特許出願第６２／６７６，２１８号の利点および優先権を主張し、この全体を参照により本明細書に組み込む。
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本発明は、核酸および医薬を哺乳動物細胞ならびにヒトおよび他の哺乳動物に送達するためのナノ粒子の調製において有用な特定のペプチドおよびポリペプチドに関する。
ヌクレオチドをベースとする医薬、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびＤＮＡワクチンを含む、有力な新規のバイオ医薬では、哺乳動物における機能的ＲＮＡｉ経路の発見により、逆遺伝学のための強力なツールが、遺伝子機能を同定するための方法として提供されたため、ＲＮＡｉが任意の遺伝子を発現抑制する可能性により、ＲＮＡｉが魅力的な治療手法となった。最近、ｓｉＲＮＡは、この配列特異的転写後遺伝子発現抑制能力のため、多くの疾患、例えば、がん、感染症、黄斑変性症、心血管疾患、神経系障害、および他の遺伝子関連疾患を治療するための有望な新規の治療候補となった。任意の遺伝子の発現を低減させるこれらの能力のため、ｓｉＲＮＡは、「創薬不可能な」標的を含む多種多様な疾患を治療するための理想的な候補として期待されている。
しかし、有力な臨床薬としてのＲＮＡｉを制限している主な課題は、有効な送達ビヒクルの必要性である。有効な送達ビヒクルは、細胞に遭遇すると、搭載物を保護して輸送しなければならず、原形質膜を通過してＲＮＡｉ機構が位置するサイトゾル区画に到達しなければならない。ｓｉＲＮＡの細胞質への送達に対する重要な障壁は、（ａ）生細胞の透過性が、高分子量の分子、例えば、タンパク質およびオリゴヌクレオチドに対して非常に低いこと、（ｂ）細胞膜が典型的には全体的に負荷電の２重層構造を典型的に有するため、負荷電ｓｉＲＮＡが透過し、膜を越えて細胞に侵入することが非常に困難であること、（ｃ）ｓｉＲＮＡの安定性が低く、このためｉｎ ｖｉｖｏにおいて血漿に高濃度で存在する種々の酵素により非常に短期間に分解されること、（ｄ）輸送されたｓｉＲＮＡ送達複合体がエンドソームから脱出してサイトゾルに移動し、この標的遺伝子に達することが、考慮すべき別の重要な事項であること、および（ｅ）ｓｉＲＮＡが外来物質として認識され、有害免疫作用を誘導し得ることが挙げられる。理想的な送達系によって、このような大多数の技術的課題に取り組み、所望の治療的利点を達成しなければならない。
最近では、イオン化可能なカチオン性脂質、例えば、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用してｓｉＲＮＡを肝臓に送達している。２０件を超える臨床試験が、ｓｉＲＮＡの臨床適用を評価するのに現在、進行中である。ｓｉＲＮＡの局所送達の例としては、加齢黄斑変性症［ＡＭＤ］のための眼内経路（Ｑｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、血管新生促進因子、第ＩＩ相）；先天性爪肥厚症［ＰＣ］のための上皮経路（ＴｒａｎｓＤｅｒｍ社、ケラチン６ａ遺伝子、第Ｉｂ相）；喘息症状のための肺経路（ＺａＢｅＣｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、キナーゼＳｙｋ、第ＩＩ相）；呼吸器合胞体ウイルス［ＲＳＶ］感染症のための経鼻経路（Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、第ＩＩ相）；および家族性大腸腺腫症［ＦＡＰ］のための経口経路（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、βカテニン、第Ｉ／ＩＩ相）によるものが挙げられる。ｓｉＲＮＡの全身性送達の例としては、固形腫瘍のため（Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ポロ様キナーゼ１［ＰＬＫ１］、第Ｉ相）および肝細胞癌のため（Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、血管内皮増殖因子［ＶＥＧＦ］およびキネシン紡錘体タンパク質［ＫＳＰ］、第Ｉ相）［３］のカチオン性脂質ナノ粒子である安定型核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）［１、２］の使用が挙げられる。その上、Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）では、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症のためのコレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡを使用する動的ポリコンジュゲート送達系（ＤＰＣ）を開発した（第Ｉ相臨床治験）［４］。この送達系では、ｓｉＲＮＡは、可逆的ジスルフィド結合により、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＮアセチルガラクトサミンの肝細胞標的リガンドとともに、両親媒性ポリ（ビニルエーテル）（ＰＢＡＶＥ）にコンジュゲートする。ナノ粒子送達系は、他の方法に勝る明白な利点を有する［５］。詳細には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、他の新興送達プラットフォームの中でもｓｉＲＮＡの全身性送達における最も進歩した送達プラットフォームのうちの１つとなった［６］。
最近では、Ｓｉｒｎａｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．（ゲイザースバーグ、ＭＤ州）では、２重ｓｉＲＮＡ（トランスフォーミング増殖因子ベータ、ＴＧＦ－β１およびシクロオキシゲナーゼ－２、ＣＯＸ－２）の全身性送達のためのヒスチジン－リジンリッチポリペプチド送達系を開発し、肥厚性瘢痕の縮小および予防（第ＩＩ相、臨床治験）ならびに肝線維症疾患または他の線維症疾患の治療のための相乗効果を達成した［７、８］。この送達系では、安定型ナノ粒子が、主に、静電相互作用および水素結合により、正荷電ポリペプチドと負荷電ｓｉＲＮＡとの間で形成された。これは、現在の臨床治験において、良好な安全性および有効性を実証し、多重配列特異的標的ｓｉＲＮＡを送達して、種々の疾患を治療する２重の治療目的を達成するための新規の送達系を代表する［９］。
本発明は、生分解性ポリペプチド（「ＨＫＣ２－核酸送達系」と呼ぶ）を含み、これにより生体適合性ポリペプチドが、好ましい非共有結合性相互作用により核酸と複合して、ナノ粒子を形成する。ポリペプチドは、生体適合条件下のヒスチジン－リジンリッチペプチドにおける生分解性共有結合により、自己共有結合性に架橋する。この全体的デザインおよび送達系により、核酸のｉｎ ｖｉｖｏでの安定性および送達効率が向上し、特定の組織における発現抑制を得るための有効な手段として使用することができる。ＨＫＣ２核酸送達系は、種々の疾患治療に適用可能な新規のナノ粒子送達担体であり、核酸をＨＫＣ２ペプチドと単独または分枝鎖ポリペプチド（ＨＫＰ）からなる共送達物質の存在下で複合させることにより機能する。このペプチドは、適切な正電荷を有し、特異性の標的化および毒性の低減のためにさらに修飾することが可能な官能基を有する。
本発明では、核酸および医薬を哺乳動物細胞ならびにヒトおよび他の哺乳動物に送達するためのナノ粒子の調製において有用な特定のペプチドおよびポリペプチドを提供する。
ペプチド
本発明は、式Ｋｐ｛［（Ｈ）ｎ（Ｋ）ｍ］｝ｙ－Ｃ－ｘ－Ｚまたは式Ｋｐ｛［（Ｈ）ａ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｂ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｃ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｄ（Ｋ）ｍ］｝ｙ－Ｃ－ｘ－Ｚ［式中、Ｋはリジンであり、Ｈはヒスチジンであり、Ｃはシステインであり、ｘはリンカーであり、Ｚは哺乳動物細胞標的リガンドであり、ｐは０または１であり、ｎは１～５の整数（好ましくは３）であり、ｍは０～３の整数（好ましくは０または１）のであり、ａ、ｂ、ｃおよびｄは３または４のいずれかであり、ｙは３～１０の整数（好ましくは４または８）である］を有するペプチドを含む。一実施形態では、ペプチドは、式Ｋ［（Ｈ）ｎ（Ｋ）ｍ］ｙ－Ｃ－ｘ－Ｃ［式中、Ｋはリジンであり、Ｈはヒスチジンであり、Ｃはシステインであり、ｎは１～５の整数（好ましくは３）であり、ｍは０～３の整数（好ましくは０または１）であり、ｙは３～７の整数（好ましくは４）であり、ｘはリンカーである］を有する。ペプチドは、直鎖または分枝鎖であり得る。これらは、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、例えばヒト腫瘍細胞に内部移行されることが可能である。
本発明は、式Ｋｐ｛［（Ｈ）ｎ（Ｋ）ｍ］｝ｙ－Ｃ－ｘ－Ｚまたは式Ｋｐ｛［（Ｈ）ａ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｂ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｃ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｄ（Ｋ）ｍ］｝ｙ－Ｃ－ｘ－Ｚ［式中、Ｋはリジンであり、Ｈはヒスチジンであり、Ｃはシステインであり、ｘはリンカーであり、Ｚは哺乳動物細胞標的リガンドであり、ｐは０または１であり、ｎは１～５の整数（好ましくは３）であり、ｍは０～３の整数（好ましくは０または１）のであり、ａ、ｂ、ｃおよびｄは３または４のいずれかであり、ｙは３～１０の整数（好ましくは４または８）である］を有するペプチドを含む。一実施形態では、ペプチドは、式Ｋ［（Ｈ）ｎ（Ｋ）ｍ］ｙ－Ｃ－ｘ－Ｃ［式中、Ｋはリジンであり、Ｈはヒスチジンであり、Ｃはシステインであり、ｎは１～５の整数（好ましくは３）であり、ｍは０～３の整数（好ましくは０または１）であり、ｙは３～７の整数（好ましくは４）であり、ｘはリンカーである］を有する。ペプチドは、直鎖または分枝鎖であり得る。これらは、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、例えばヒト腫瘍細胞に内部移行されることが可能である。
哺乳動物細胞標的リガンド（Ｚ）は、ペプチド、タンパク質、抗体、低分子、炭水化物部分、またはオリゴヌクレオチドである。標的リガンドは、特異的細胞表面で特異的受容体に結合し、その後、この搭載物を内部移行させる分子である。
一実施形態では、Ｚは、１～６０アミノ酸の長さのペプチドである。この実施形態の一態様では、Ｚは、１アミノ酸、好ましくはＣである。別の態様では、Ｚが２アミノ酸以上である場合、いくつかの不活性アミノ酸（例えば、セリン）の「スペーサー領域」を含み得る。Ｚは、哺乳動物細胞表面の受容体（例えば、トランスフェリン受容体、ＥＧＦＲまたはＧＬＰ１Ｒ）を標的とする、ペプチドリガンドをさらに含み得る。目的の細胞型に独占的に発現する受容体の多くの例が存在し、このような受容体を結合させ得る任意のリガンドは、ｓｉＲＮＡをこの受容体を発現する細胞に特異的に局所送達するのに役立ち得る。
一実施形態では、ｘは、単一アミノ酸残基または２～１５アミノ酸を有するペプチド配列である。この実施形態の一態様では、ペプチド配列は、３～８アミノ酸を有する。
また、本発明は、式Ｋ［（Ｈ）ｎ（Ｋ）ｍ］ｙ－Ｃ［式中、Ｋはリジンであり、Ｈはヒスチジンであり、Ｃはシステインであり、ｎは１～５の整数（好ましくは３）であり、ｍは０～３の整数（好ましくは０または１）であり、ｙは３～７の整数（好ましくは４）である］を有するペプチドを含む。
ポリペプチド
本発明は、ジスルフィド結合により架橋した少なくとも２つの上記のペプチドを含むポリペプチドを含む。ポリペプチドは、直鎖または分枝鎖であり得る。結合は、生分解性システインのジスルフィド結合であり得る。あるいは、生分解性システインのジスルフィド結合は、開裂可能な任意の結合により置換することができ、無水物結合、ヒドラジン結合、酵素特異的ペプチド結合、またはこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
本発明は、ジスルフィド結合により架橋した少なくとも２つの上記のペプチドを含むポリペプチドを含む。ポリペプチドは、直鎖または分枝鎖であり得る。結合は、生分解性システインのジスルフィド結合であり得る。あるいは、生分解性システインのジスルフィド結合は、開裂可能な任意の結合により置換することができ、無水物結合、ヒドラジン結合、酵素特異的ペプチド結合、またはこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
ナノ粒子
本発明は、前述のポリペプチドの１つまたは複数および核酸を含むナノ粒子を含む。ナノ粒子は、ヒスチジン－リジン共重合体、第２の核酸、および／または医薬をさらに含み得る。ナノ粒子は、哺乳動物細胞に内部移行されることが可能である。一実施形態では、ポリペプチドおよびナノ粒子は、例えば、グルタチオン還元または酵素または細胞内のｐＨの変化により、哺乳動物細胞において生分解性である。このような実施形態の一態様では、ナノ粒子サイズは、５０～３００ｎｍである。別の態様では、ナノ粒子サイズは、８０～１３０ｎｍであり、０．２以下の多分散指数を有する。
本発明は、前述のポリペプチドの１つまたは複数および核酸を含むナノ粒子を含む。ナノ粒子は、ヒスチジン－リジン共重合体、第２の核酸、および／または医薬をさらに含み得る。ナノ粒子は、哺乳動物細胞に内部移行されることが可能である。一実施形態では、ポリペプチドおよびナノ粒子は、例えば、グルタチオン還元または酵素または細胞内のｐＨの変化により、哺乳動物細胞において生分解性である。このような実施形態の一態様では、ナノ粒子サイズは、５０～３００ｎｍである。別の態様では、ナノ粒子サイズは、８０～１３０ｎｍであり、０．２以下の多分散指数を有する。
１つまたは複数の核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、またはアプタマー配列を含む。
一実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡを含む。本明細書において使用する場合、「ｓｉＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ分子」は、短い２本鎖のポリヌクレオチドであり、分子が細胞に導入された後に、ＲＮＡを生成する細胞における遺伝子の発現に干渉する、二重鎖オリゴヌクレオチドである。例えば、これは、１本鎖（ｓｓ）標的ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）における相補的ヌクレオチド配列を標的として結合する。次いで、標的ＲＮＡは、細胞により分解される。このような分子は、当業者に公知の技術により構築する。このような技術は、米国特許第５，８９８，０３１号、第６，１０７，０９４号、第６，５０６，５５９号、第７，０５６，７０４号、第ＲＥ４６，８７３Ｅ号、および第９，６４２，８７３号明細書、ならびに欧州特許第１２１４９４５号および第１２３０３７５号に記載されており、このすべては、この全体を参照により本明細書に組み込む。当技術分野における慣例により、ｓｉＲＮＡ分子が、特定のヌクレオチド配列により同定されている場合、配列は、二重鎖分子のセンス鎖を指す。
ｓｉＲＮＡ分子は、天然に存在するリボヌクレオチド、すなわち、生細胞に見出されるものからなり得るか、またはこのヌクレオチドの１つまたは複数は、当技術分野において公知の技術により化学的に修飾することができる。この個々のヌクレオチドの１つまたは複数のレベルで修飾することに加えて、オリゴヌクレオチドの骨格も修飾することができる。さらなる修飾は、低分子（例えば、糖分子）、アミノ酸分子、ペプチド、コレステロール、およびｓｉＲＮＡ分子にコンジュゲートするための他の大型分子の使用を含む。
一実施形態では、分子は、１６～２７塩基対の長さを有する２本鎖オリゴヌクレオチドである。この実施形態の一態様では、分子は、約１９～約２７塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドである。別の態様では、分子は、約２１～約２５塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドである。このような態様のすべてでは、分子は、両端に平滑末端、または両端に付着末端、または一端に平滑末端および他端に付着末端を有し得る。一態様では、付着末端は、１～３ヌクレオチドのオーバーハングを有する。この実施形態の別の態様では、核酸は、本明細書の表１～３において同定されているｓｉＲＮＡ分子を含む。
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、表１～３において同定されているものに由来する分子を含む。このような分子は、ａ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する２４塩基対からなる生成された二重鎖；ｂ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する２３塩基対からなる生成された二重鎖；ｃ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する２２塩基対からなる生成された二重鎖；ｄ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する２１塩基対からなる生成された二重鎖；ｅ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する２０塩基対からなる生成された二重鎖；ｆ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する１９塩基対からなる生成された二重鎖；ｇ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する１８塩基対からなる生成された二重鎖；ｈ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する１７塩基対からなる生成された二重鎖；およびｉ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する１６塩基対からなる生成された二重鎖を含む。
ヒスチジン－リジン共重合体（ＨＫＰ）は、２００６年７月４日発行の米国特許第７，０７０，８０７号明細書、２００７年１月１６日発行の第７，１６３，６９５号明細書、２０１０年８月１０日発行の第７，７７２，２０１号明細書、２０１８年５月２９日発行の第ＲＥ４６，８７３Ｅ号、および２０１７年５月９日発行の第９，６４２，８７３号明細書に開示されており、これらのすべては、この全体を参照により本明細書に組み込む。一実施形態では、この共重合体は、Ｈ３Ｋ４ｂを含む。別の実施形態では、この共重合体は、ＨＫＰ（＋Ｈ）を含む。図２Ａを参照されたい。
一実施形態では、ナノ粒子は、部分的遊離チオール基残基を介して結合している官能基をさらに含む。この実施形態の一態様では、チオール基残基は、ナノ粒子の表面に存在する。これは、ナノ粒子の形成後に加える。別の態様では、チオール基残基は、ペプチド配列内のシトシン側鎖上に存在する。これは、ナノ粒子の形成前に加える。
官能基は、低分子（例えば、細胞表面受容体に結合可能な分子、または内部移行した場合に細胞の死滅を誘導可能な分子、例えば、ドキソルビシンもしくはゲムシタビン）、保護ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、脂質、ペプチドもしくはタンパク質（例えば、抗体）、またはオリゴヌクレオチド（例えば、アプタマーまたはｓｉＲＮＡ分子の１鎖）、およびアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を認識する炭水化物結合部位を有する有機分子（例えば、ＧａｌＮａｃ、マンノース６Ｐ、アシアロフェツイン等）からなる群から選択される。ペプチド／タンパク質／炭水化物糖類および他の物質は、別々の細胞に存在する受容体に対する親和性を有し、ナノ粒子の細胞への取込みにより、ナノ粒子がこのような細胞に結合することが可能となる。例えば、ＧａｌＮａｃは、肝細胞上のＡＳＧＰＲに結合し、肝臓における肝細胞への特異性を示している。特定の一態様では、官能基は、体内分布の向上または細胞への非特異的結合の最小化に役立つ保護ＰＥＧ分子である。
さらなる実施形態では、ナノ粒子は、医薬を含む。この実施形態の一態様では、薬物は、低分子薬、ペプチド薬、およびタンパク質薬からなる群から選択される。
生成する方法
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に開示の教示を考慮して、当業者に公知の技術により調製する。一実施形態では、ペプチドは、ａ）最初のリジン（Ｋ）を固体支持体に結合させる工程；ｂ）さらなるアミノ酸を相次いで最初のリジンに結合させる工程；およびｃ）合成したペプチドを回収する工程を含む方法により調製する。一実施形態では、ポリペプチドは、ａ）本発明のペプチドを化学酸化により架橋して、開裂可能な結合を有するポリペプチドを形成する工程；およびｂ）ポリペプチドを回収する工程を含む方法により調製する。この実施形態の一態様では、開裂可能な結合は、ジスルフィド結合である。
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に開示の教示を考慮して、当業者に公知の技術により調製する。一実施形態では、ペプチドは、ａ）最初のリジン（Ｋ）を固体支持体に結合させる工程；ｂ）さらなるアミノ酸を相次いで最初のリジンに結合させる工程；およびｃ）合成したペプチドを回収する工程を含む方法により調製する。一実施形態では、ポリペプチドは、ａ）本発明のペプチドを化学酸化により架橋して、開裂可能な結合を有するポリペプチドを形成する工程；およびｂ）ポリペプチドを回収する工程を含む方法により調製する。この実施形態の一態様では、開裂可能な結合は、ジスルフィド結合である。
本発明のナノ粒子は、本明細書に開示の教示を考慮して、当業者に公知の技術により調製する。一実施形態では、ナノ粒子は、ａ）本発明のペプチドを化学酸化により架橋して、開裂可能な結合を有するポリペプチドを形成する工程、ｂ）ポリペプチドを核酸と混合する工程、およびｃ）ナノ粒子を回収する工程を含む方法により調製する。この実施形態の一態様では、開裂可能な結合は、ジスルフィド結合である。別の実施形態では、ナノ粒子は、ａ）本発明のポリペプチドを核酸と混合して、ナノ粒子を形成する工程、およびｂ）ナノ粒子を回収する工程を含む方法により調製する。さらに別の実施形態では、ナノ粒子は、ａ）本発明のペプチドを核酸と混合する工程、ｂ）ペプチドを化学酸化により架橋し、開裂可能な結合を有するポリペプチドを形成して、ナノ粒子の形成を生じる工程、およびｃ）ナノ粒子を回収する工程を含む方法により調製する。この実施形態の一態様では、開裂可能な結合は、ジスルフィド結合である。このような実施形態の一態様では、ポリペプチドおよび核酸は、水溶液、例えば、ｐＨの範囲が６．０～８．０の水性バッファー中で混合する。このような実施形態のさらなる態様では、ナノ粒子は、窒素対リン酸（Ｎ：Ｐ）比（ｗ：ｗ＝２：１～８：１）により、調節可能な広範な混合条件下で形成する。このような実施形態のまたさらなる態様では、核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、またはアプタマー配列である。
一実施形態では、本発明のナノ粒子を生成する方法は、ヒスチジン－リジン共重合体を加えるさらなる工程を含む。ヒスチジン－リジン共重合体の割合は、２０％～９７％の範囲である。
別の実施形態では、本発明のナノ粒子を生成する方法は、医薬をポリペプチドおよび核酸と混合するさらなる工程を含む。医薬は、低分子薬、ペプチド薬、またはタンパク質薬を含む。
使用の方法
本発明のナノ粒子は、核酸および医薬をヒト、他の哺乳動物、および哺乳動物細胞に送達するのに有用である。
本発明のナノ粒子は、核酸および医薬をヒト、他の哺乳動物、および哺乳動物細胞に送達するのに有用である。
本発明は、核酸を哺乳動物細胞に送達する方法であって、ナノ粒子が、細胞に取り込まれて核酸を放出する条件下で、十分な量の本発明のナノ粒子を細胞に送達することを含む、方法を含む。前述のように、核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、またはアプタマー配列を含む。一態様では、核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に送達される。別の態様では、これは、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に送達される。一態様では、哺乳動物細胞は、実験動物の細胞である。このような実験動物は、げっ歯類、イヌ、ネコ、および非ヒト霊長類を含む。別の態様では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。特定の一態様では、核酸は、ｓｉＲＮＡであり、この例は、上に記載している。
本発明は、哺乳動物における遺伝子治療の方法であって、治療的有効量の本発明のナノ粒子を哺乳動物に投与することを含む、方法をさらに含む。十分な量のナノ粒子は、ナノ粒子が標的細胞により取り込まれて核酸が細胞内に放出される条件下で、哺乳動物に送達される。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は、実験動物、例えば、前段落において同定した実験動物である。このような実施形態の一態様では、核酸は、ｓｉＲＮＡであり、この例は、上に記載している。
本発明は、治療化合物を哺乳動物に送達する方法であって、治療的有効量の本発明のナノ粒子を哺乳動物に送達することを含む、方法をさらに含む。十分な量のナノ粒子は、ナノ粒子が標的細胞により取り込まれて治療化合物が細胞内に放出される条件下で、哺乳動物に送達される。一態様では、哺乳動物は、ヒトである。別の態様では、哺乳動物は、実験動物、例えば、上に同定した実験動物である。
用量、投与方法、および投与時間は、本明細書に含む教示を考慮して、当業者により容易に決定することができる。一実施形態では、組成物は、哺乳動物の組織への注射により投与する。別の実施形態では、組成物は、哺乳動物への皮下注射により投与する。さらに別の実施形態では、組成物は、哺乳動物に静脈内投与する。好ましい実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
実験のデザインおよび技術
背景
本発明では、核酸送達系を提供する。系は、還元感受性ジスルフィド結合による架橋遮蔽系を含み、これは、標的機能、正荷電ポリペプチド物質、および核酸を含み得る。これらは、正荷電ペプチドと負荷電ｓｉＲＮＡとの間の非共有結合性相互作用により、ナノ粒子複合体を形成し、この場合、表面がポリペプチドにより遮蔽されており、毒性が低減する。安定な複合体により、搭載された遺伝物質が細胞内に送達および輸送される。濃縮された還元的細胞内環境では（細胞外環境と比較して）、送達ポリペプチドは、グルタチオン（ＧＳＨ）により分解され、搭載したこの核酸配列を放出して、トランスフェクションプロセスを完了する。その上、送達系の利点は、この単純性および有効性であり、ナノ粒子表面の部分的遊離システインにより、標的リガンド官能基のさらなるカップリングが可能となる。このような標的機能は、結合したリガンドにより特異的に標的化された細胞への核酸トランスフェクションの効率を増強することができる。
背景
本発明では、核酸送達系を提供する。系は、還元感受性ジスルフィド結合による架橋遮蔽系を含み、これは、標的機能、正荷電ポリペプチド物質、および核酸を含み得る。これらは、正荷電ペプチドと負荷電ｓｉＲＮＡとの間の非共有結合性相互作用により、ナノ粒子複合体を形成し、この場合、表面がポリペプチドにより遮蔽されており、毒性が低減する。安定な複合体により、搭載された遺伝物質が細胞内に送達および輸送される。濃縮された還元的細胞内環境では（細胞外環境と比較して）、送達ポリペプチドは、グルタチオン（ＧＳＨ）により分解され、搭載したこの核酸配列を放出して、トランスフェクションプロセスを完了する。その上、送達系の利点は、この単純性および有効性であり、ナノ粒子表面の部分的遊離システインにより、標的リガンド官能基のさらなるカップリングが可能となる。このような標的機能は、結合したリガンドにより特異的に標的化された細胞への核酸トランスフェクションの効率を増強することができる。
本発明では、ジスルフィド結合により架橋して、主に、静電相互作用および水素結合によりｓｉＲＮＡと複合した、システイン含有ヒスチジン－リジンリッチペプチドを含む、ポリペプチドナノ粒子を提供する。
また、本発明では、少なくとも１つの核酸（および２つの異なる核酸も）ならびに薬学的に許容される担体を提供する。ｓｉＲＮＡの例では、二重鎖のうちの一方は、ＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡ分子に結合し、他方は、ＶＥＧＦＲ２をコードするｍＲＮＡ分子に結合する。一実施形態では、組成物は、ＴＧＦβ１をコードするｍＲＮＡ分子に結合するｓｉＲＮＡ２本鎖をさらに含む。このような実施形態の一態様では、２本鎖は、ヒトｍＲＮＡと相同マウスｍＲＮＡの両方を標的とする。
本発明は、酸化条件下で架橋されてポリペプチドを形成し得る、ペプチドまたは直鎖分子であり得る酸化還元活性成分に、さらに関する。ポリペプチドは、核酸と複合してナノ粒子を形成する。サイズ範囲は、５０～３００ｎｍであり、２つの成分間の相対比に依存する。サイズは、好ましくは、８０～１３０ｎｍの間であり、狭い範囲の多分散指数値を有する。
本発明は、生分解性ペプチド成分およびｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはＤＮＡを含む組成物に、さらに関する。これは、ナノ粒子またはナノ凝集物を形成する。複合形成体は、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはＤＮＡを効果的に保護して細胞内に送達する。ｓｉＲＮＡまたは他の搭載物は、細胞の内部の還元環境下（ＧＳＨ濃度、サイトゾルでは０．５～１０ｍＭおよび核では２０ｍＭ）で放出することができ、これは、ヒスチジン－リジン反復単位により引き起こされるエンドサイトーシスを介した標的細胞による高度な取込みの後に、ジスルフィド結合の開裂を促進する。
新規Ｈ３Ｋ４Ｃ２系のデザイン
このデザインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの実験におけるｓｉＲＮＡ送達のための、これまでに確立されたＨ３Ｋ４ｂ［ＫＫＫ（ＫＨＨＨＫＨＨＨｎＫＨＨＨＫＨＨＨＫ）４］、ＨＫＰ（式中ｎ＝１）、ＨＫＰ（＋Ｈ）（式中ｎ＝２）、図２Ａを参照］系の成功に基づく。２つのｓｉＲＮＡ（それぞれ同一遺伝子または異なる遺伝子を標的とする）は、形成においてＨ３Ｋ４ｂと効果的に複合させて、安定型ナノ粒子（約１５０ｎｍ）を形成した。これは、細胞への結合時に細胞内に送達され、次いで、エンドソームから、ｓｉＲＮＡが遺伝子発現抑制に影響することが可能な細胞質へ脱出した。封入されたｓｉＲＮＡがエンドソームから放出された後、これは、がん細胞において遺伝子発現抑制を誘導した。２重標的ｓｉＲＮＡの送達のための強力かつ有効な担体として、これが実証されたにもかかわらず、密接に結合した正荷電Ｈ３Ｋ４ｂナノ粒子からの負荷電ｓｉＲＮＡの放出におけるものを含み、改善の余地が残っている。結合は、トランスフェクション工程におけるｓｉＲＮＡの有効性の低下を生じ得る。言い換えれば、高用量のｓｉＲＮＡは、治療効果を生じるように形成しなければならない可能性がある。
このデザインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの実験におけるｓｉＲＮＡ送達のための、これまでに確立されたＨ３Ｋ４ｂ［ＫＫＫ（ＫＨＨＨＫＨＨＨｎＫＨＨＨＫＨＨＨＫ）４］、ＨＫＰ（式中ｎ＝１）、ＨＫＰ（＋Ｈ）（式中ｎ＝２）、図２Ａを参照］系の成功に基づく。２つのｓｉＲＮＡ（それぞれ同一遺伝子または異なる遺伝子を標的とする）は、形成においてＨ３Ｋ４ｂと効果的に複合させて、安定型ナノ粒子（約１５０ｎｍ）を形成した。これは、細胞への結合時に細胞内に送達され、次いで、エンドソームから、ｓｉＲＮＡが遺伝子発現抑制に影響することが可能な細胞質へ脱出した。封入されたｓｉＲＮＡがエンドソームから放出された後、これは、がん細胞において遺伝子発現抑制を誘導した。２重標的ｓｉＲＮＡの送達のための強力かつ有効な担体として、これが実証されたにもかかわらず、密接に結合した正荷電Ｈ３Ｋ４ｂナノ粒子からの負荷電ｓｉＲＮＡの放出におけるものを含み、改善の余地が残っている。結合は、トランスフェクション工程におけるｓｉＲＮＡの有効性の低下を生じ得る。言い換えれば、高用量のｓｉＲＮＡは、治療効果を生じるように形成しなければならない可能性がある。
ポリヌクレオチドにおける生分解性結合による結合は、ジスルフィド結合、無水物結合、ヒドラジン結合、開裂可能な酵素特異的ペプチド結合、および当業者に公知の他の化学的結合から選択することができる。同様に、結合は、複数の結合型の組合せであり得る。このような結合は、選択的生物環境下で分解され得る。本発明では、ポリペプチド中の単一ペプチドを他の部分に結合する生分解性結合（例えば、還元感受性Ｓ－Ｓ結合、低ｐＨの開裂可能なイミン等）は、選択された生体刺激、例えば、酵素的曝露、ｐＨの変化、例えば、酸性度の上昇（ｐＨ調節）および特異的生物環境（例えば、腫瘍細胞における高濃度の細胞内ＧＳＨの存在下）または他の化学的刺激により生分解可能であり得る。したがって、封入されたｓｉＲＮＡは、特異的生物学的条件下でポリペプチドが分解されるため、ＨＫＣ２ペプチドのポリペプチドナノ粒子から放出される。
その後、ｓｉＲＮＡの放出による標的遺伝子発現の抑制は、この標的遺伝子に達すると達成される。例えば、ｓｉＲＮＡの放出効率を向上させて、細胞に送達されるｓｉＲＮＡの有効性を増強するために、Ｈ３Ｋ４ｂと類似の構造を有する、単一の分枝鎖ＨＫの反復単位を有するポリペプチドＨＫＣ２を形成する、分枝鎖ＨＫのシステインと骨格のシステインとの間のジスルフィド結合による結合に基づいて、化学的生分解性ヒスチジン－リジン－システインＨＫＣ２重合体をデザインした。これにより、核酸のヌクレアーゼに対する有効な保護、および非還元環境、例えば、細胞外空間および血液（グルタチオン［ＧＳＨ］濃度、０．５～１０μＭ）を通過する間の安定化が生じる。しかし、この重合体ＨＫＣ２は、細胞内部で高濃度のＧＳＨ（０．５～１０ｍＭ）に曝露されると、開裂し得る。特に、これまでの報告における、がん細胞内のグルタチオン（ＧＳＨ）の濃度の上昇を考慮すると、生分解性結合、例えば、ポリペプチド－ｓｉＲＮＡナノ粒子送達担体におけるジスルフィド結合は、効果的に分解して、ｓｉＲＮＡをこの標的に放出および送達することができる［１０、１１］。分枝鎖ＨＫを骨格に結合するＳ－Ｓ結合の開裂は、分枝鎖ＨＫを別々の断片に切り分け、これは、ｓｉＲＮＡと安定な複合体をもはや形成することが期待されない。したがって、ＧＳＨは、ＨＫＣ２重合体／ｓｉＲＮＡ複合体を細胞内レベルで分解することによりｓｉＲＮＡの放出を引き起こす（図１）。
ｓｉＲＮＡ放出およびトランスフェクション有効性を増強する酸化還元活性ＨＫＣ２ポリペプチドのデザイン
１．ヒスチジン－リジン（ＨＫ）分枝鎖重合体の構造
Ｈ２Ｋ、Ｈ３Ｋ、Ｈ３Ｋ４ｂを含む、試験したすべてのヒスチジン－リジン（ＨＫ）重合体の中で（図２Ａ）、これまでの報告［１２、１３］および発明者らの形成物および有効性試験は、Ｈ３Ｋ４ｂが、ｓｉＲＮＡと複合すると、有効なナノ粒子を形成可能であることを示した。報告された実験的証拠に基づくと、ＨＫの直鎖構造は、ｓｉＲＮＡと複合体を効果的に形成してｓｉＲＮＡを送達することができない［１２、１３］。しかし、発明者らはまた、インタクトな重合体Ｈ３Ｋ４ｂの正荷電リジンとｓｉＲＮＡの負荷電リン酸骨格との間の強力な非共有結合性相互作用に基づくトランスフェクション工程の間にｓｉＲＮＡの徐放の一部を観察した。
１．ヒスチジン－リジン（ＨＫ）分枝鎖重合体の構造
Ｈ２Ｋ、Ｈ３Ｋ、Ｈ３Ｋ４ｂを含む、試験したすべてのヒスチジン－リジン（ＨＫ）重合体の中で（図２Ａ）、これまでの報告［１２、１３］および発明者らの形成物および有効性試験は、Ｈ３Ｋ４ｂが、ｓｉＲＮＡと複合すると、有効なナノ粒子を形成可能であることを示した。報告された実験的証拠に基づくと、ＨＫの直鎖構造は、ｓｉＲＮＡと複合体を効果的に形成してｓｉＲＮＡを送達することができない［１２、１３］。しかし、発明者らはまた、インタクトな重合体Ｈ３Ｋ４ｂの正荷電リジンとｓｉＲＮＡの負荷電リン酸骨格との間の強力な非共有結合性相互作用に基づくトランスフェクション工程の間にｓｉＲＮＡの徐放の一部を観察した。
したがって、重合体が還元条件（例えば、腫瘍細胞における高ＧＳＨ濃度）に曝露されると、酸化条件下でｓｉＲＮＡとの重合体を形成し、ｓｉＲＮＡ放出工程において分裂することが可能な、さらに有効なＨＫＰ重合体をデザインおよび開発する必要性が存在した［１４、１５］。理想的には、このような生分解性の応答性ＨＫＰ重合体は、ｓｉＲＮＡと効果的に複合して送達の間の分解を防ぎ、最終的には、封入されたｓｉＲＮＡをｓｉＲＮＡ機構に到達する細胞質に効果的に放出し、治療的標的ｍＲＮＡに到達して発現抑制し得る（図１）。
２．生分解性ヒスチジン－リジン－システインＨＫＣ２重合体のデザインおよび調製
Ｈ３Ｋ４ｂ重合体の４つの同一の直鎖ペプチドビルディングブロックへ分解したものを以下に示す。このような分枝鎖重合体は、２つのビルディングブロック：ペプチドＲＳＨを含む直鎖システインおよび複数の遊離チオールを含む骨格から、ジスルフィド結合による結合により調製することができる。このようなＳ－Ｓ結合は、酸化還元応答性である。例えば、ＳＨは、ｓｉＲＮＡとの形成においてＳ－Ｓ結合に酸化させ、Ｈ３Ｋ４ｂ重合体を形成して、ｓｉＲＮＡを封入することができるが、Ｓ－Ｓ結合は、高濃度の細胞内ＧＳＨに曝露されると、分解され、これによりｓｉＲＮＡを放出することができる。ペプチドは、連続的固相合成により合成することができる。発明者らは、２つの化学成分を、２つのアミノ酸スペーサー基（－ＣＳＳＣ、またはＣ－リンカー－Ｃ型の配列、ＨＫＣ２と略すヒスチジン－リジン－システインのいずれか）を有する末端部位に２つのシステイン配列を有する１つのペプチドＨ３Ｋ４２Ｃに単純化して、分子間ではなく分子におけるジスルフィド結合による架橋の可能性を低下させた。この構造では、ペプチドは、リジンおよび３つのヒスチジン反復配列（Ｋ（ＨＨＨＫ）４ＣＳＳＣ）を有する。この配列は、ポリペプチドＨ３Ｋ４ｂの単一分枝と類似の構造を有する。しかし、この配列の製造では、分枝鎖ポリペプチドと比較して、合成コストを顕著に低減させることができる（図２Ａ）。
Ｈ３Ｋ４ｂ重合体の４つの同一の直鎖ペプチドビルディングブロックへ分解したものを以下に示す。このような分枝鎖重合体は、２つのビルディングブロック：ペプチドＲＳＨを含む直鎖システインおよび複数の遊離チオールを含む骨格から、ジスルフィド結合による結合により調製することができる。このようなＳ－Ｓ結合は、酸化還元応答性である。例えば、ＳＨは、ｓｉＲＮＡとの形成においてＳ－Ｓ結合に酸化させ、Ｈ３Ｋ４ｂ重合体を形成して、ｓｉＲＮＡを封入することができるが、Ｓ－Ｓ結合は、高濃度の細胞内ＧＳＨに曝露されると、分解され、これによりｓｉＲＮＡを放出することができる。ペプチドは、連続的固相合成により合成することができる。発明者らは、２つの化学成分を、２つのアミノ酸スペーサー基（－ＣＳＳＣ、またはＣ－リンカー－Ｃ型の配列、ＨＫＣ２と略すヒスチジン－リジン－システインのいずれか）を有する末端部位に２つのシステイン配列を有する１つのペプチドＨ３Ｋ４２Ｃに単純化して、分子間ではなく分子におけるジスルフィド結合による架橋の可能性を低下させた。この構造では、ペプチドは、リジンおよび３つのヒスチジン反復配列（Ｋ（ＨＨＨＫ）４ＣＳＳＣ）を有する。この配列は、ポリペプチドＨ３Ｋ４ｂの単一分枝と類似の構造を有する。しかし、この配列の製造では、分枝鎖ポリペプチドと比較して、合成コストを顕著に低減させることができる（図２Ａ）。
本発明では、生分解性ポリペプチド－核酸送達系により、他の系と比較して、いくつかの利点がもたらされる。１）類似のポリペプチドＨ３Ｋ４ｂの相対的安定性および有効性が、種々の動物モデルおよびさらには臨床治験において検討されている。この生分解性系は、合成重合体または混合脂質を含む親油性系よりも生体適合性である。２）相対的に低いコストおよび製造の容易さが、生成における顕著な利点である。３）重合体複合体は、生理的条件下で生分解性である。４）２つ以上の核酸を同時に充填して、相乗的治療効果（複数の依存性または非依存性経路による遺伝子の標的化）を達成することができる。５）ポリペプチド（カチオン性の特徴）および核酸（負荷電表面）は、静電相互作用および水素結合相互作用により、ともに結合する。６）系の単純性は、実験における別の利点となる。自己架橋については、図３および図１に示す。
ポリペプチドを単一または複数の核酸（複数可）と混合することによる、本発明に記載するポリペプチド／核酸送達担体の調製は、（ａ）生分解性官能基、例えば、２つの遊離チオール基を直鎖ヒスチジン－リジンリッチペプチドに導入する工程；（ｂ）空気または水性媒体中低い割合のＤＭＳＯを使用した酸化により、ポリペプチドにペプチドをジスルフィド結合によって生物学的に共有結合させる工程；および（ｃ）工程（ｂ）で生成したポリペプチドを１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子と混合して、主に、好ましい電荷相互作用により、安定型ナノ粒子を生成する工程を含む、これらの方法により実行し得る。
あるいは、ポリペプチド／核酸はまた、直鎖ペプチドと核酸をともに混合することにより生成することができる。ポリペプチドは、ｉｎ ｓｉｔｕで架橋して、ナノ粒子がもたらされる。
ｓｉＲＮＡ結合およびナノ粒子形成の機構によれば、上記の方法において同時に、さらなる工程を実行し得る。
前述の方法により生成したポリペプチドナノ粒子は、ポリペプチド複合体および各種の核酸から、水溶液中での自己集合によりナノ粒子を形成する。また、化学療法薬を複合体に導入し、ナノ粒子に形成して特定の疾患、例えば、がん、瘢痕、および炎症性疾患を治療することができる。例としては、ゲムシタビンまたは５－ＦＵまたはシスプラチンを組込んで、がんを治療する。
本発明におけるポリペプチドナノ粒子のサイズは、記載する生成方法に基づいて１０ｎｍ～３０００ｎｍの範囲であり得る。前臨床試験に応じて、好ましいサイズは、８０～１３０ｎｍである（粒子サイズおよび分布を測定する動的光散乱装置を使用して決定する）。
加えて、本発明によるＨＫＣ２ポリペプチド－核酸送達系は、有効な薬学的組成物として使用し得る。したがって、本発明では、有効用量のＨＫＣ２ペプチドおよび核酸を含む薬学的組成物を提供する。これは、投与のためのＨＫＣ２ポリペプチド－核酸送達系に加えて、１つまたは複数の種類の薬学的適合性重合体または担体を含み得る。
生じる生成物は、液体、固体の形態、カプセル剤、注射液等のように、種々の方法で製剤化し、１つまたは複数の有効成分、例えば、食塩水溶液、バッファー溶液、または他の適合する成分を混合して、核酸－ペプチド／ポリペプチドナノ粒子の安定性および有効性を維持することができる。
ＨＫＣ２の構造は、ＨＰＬＣおよび質量分析により特徴づけられ、保持時間８．０５３分において、純度≧９０．０％を有する主要なピークが、ＲＰＨＰＬＣにより観察された。ＥＳＩ－ＭＳスペクトルでは（図２Ｂ）、分子イオンピークが、二重荷電イオン［Ｍ＋２Ｈ］２＋として観察された。同様に、三重荷電の４＋および５＋種がまた、観察された。これは、２６８３Ｄａの分子量をもたらし、このことは、理論値と十分一致している。ペプチドの正味荷電は、ｐＨ７．０において６＋であるため、これは、水に容易に溶解することができる（図２Ａ）。このことは、水性媒体中でのｓｉＲＮＡによるこの形成に対する利点である。
ＲＮＡｉによる治療的手法
発明者らは、ヒスチジン－リジン重合体（ＨＫＰ）として公知のポリペプチドをベースとする担体を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてｓｉＲＮＡを送達した。この技術（２０１４年５月２７日発行の米国特許第８，７３５，５６７号明細書および２０１７年５月９日発行の米国特許第９，６４２，８７３号明細書を参照、これらの全体は参照により本明細書に組み込む）により、標的ｍＲＮＡを発現抑制する効果を発揮する患部組織における適切な細胞へのｓｉＲＮＡの送達を実質的に増強して、タンパク質の生成を遮断し、これにより病状、例えば、瘢痕の治癒、肝線維症疾患、および特に、がんに影響することが可能である。
発明者らは、ヒスチジン－リジン重合体（ＨＫＰ）として公知のポリペプチドをベースとする担体を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてｓｉＲＮＡを送達した。この技術（２０１４年５月２７日発行の米国特許第８，７３５，５６７号明細書および２０１７年５月９日発行の米国特許第９，６４２，８７３号明細書を参照、これらの全体は参照により本明細書に組み込む）により、標的ｍＲＮＡを発現抑制する効果を発揮する患部組織における適切な細胞へのｓｉＲＮＡの送達を実質的に増強して、タンパク質の生成を遮断し、これにより病状、例えば、瘢痕の治癒、肝線維症疾患、および特に、がんに影響することが可能である。
ＲＮＡｉおよび治療剤
ＲＮＡｉは、遺伝子発現をノックダウンして、ｍＲＮＡを配列特異的方法で破壊するのに使用可能な強力な方法である。ＲＮＡｉは、生物学的機能を迅速かつ持続的方法でもたらすように扱うことができる。本発明では、有力な治療薬における使用のためのＲＮＡｉ送達方法を提供する。本発明では、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴヌクレオチド（オーバーハング、付着もしくは平滑末端を有するか、または有しない）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびＤＮＡ由来ＲＮＡ（ｄｄＲＮＡ）を含む、多くの形態のｓｉＲＮＡ分子を治療剤として提供する。
ＲＮＡｉは、遺伝子発現をノックダウンして、ｍＲＮＡを配列特異的方法で破壊するのに使用可能な強力な方法である。ＲＮＡｉは、生物学的機能を迅速かつ持続的方法でもたらすように扱うことができる。本発明では、有力な治療薬における使用のためのＲＮＡｉ送達方法を提供する。本発明では、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴヌクレオチド（オーバーハング、付着もしくは平滑末端を有するか、または有しない）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびＤＮＡ由来ＲＮＡ（ｄｄＲＮＡ）を含む、多くの形態のｓｉＲＮＡ分子を治療剤として提供する。
ｓｉＲＮＡ配列のデザイン
ＲＮＡｉ物質は、標的遺伝子配列の一部と適合するヌクレオチド配列を有するようにデザインする。標的遺伝子の選択されたｓｉＲＮＡ配列は、遺伝子の発現により生成されたｍＲＮＡの任意の部分に存在し得る。ＲＮＡｉは、標的遺伝子由来のｍＲＮＡとハイブリダイズする配列－ｓｉＲＮＡ配列の「アンチセンス鎖」を含む。ｓｉＲＮＡ配列は、アンチセンス鎖とハイブリダイズする配列、ｓｉＲＮＡ配列の「センス鎖」を含む。標的遺伝子に対して選択されたｓｉＲＮＡ配列は、細胞により生成された他のいかなるｍＲＮＡとも、ｍＲＮＡに転写されない標的遺伝子のいかなる配列とも、相同であってはならない。標的ｍＲＮＡ配列の２０～２７塩基の配列を選択するための多数のデザインルールは、公知であり、市販の方法を含む。デザインは、少なくとも３つの方法から得ることができ、最優先の単一共通リストは、このような方法により構築して集合させる。発明者らは、少なくとも６つの最優先候補配列の調製と、その後の遺伝子阻害についての細胞培養試験により、ほぼすべての場合において、少なくとも２つの活性ｓｉＲＮＡ配列が明らかとなることを見出した。明らかとならない場合は、第２のラウンド（６つの最優先候補配列の取得および試験）を使用することができる。
ＲＮＡｉ物質は、標的遺伝子配列の一部と適合するヌクレオチド配列を有するようにデザインする。標的遺伝子の選択されたｓｉＲＮＡ配列は、遺伝子の発現により生成されたｍＲＮＡの任意の部分に存在し得る。ＲＮＡｉは、標的遺伝子由来のｍＲＮＡとハイブリダイズする配列－ｓｉＲＮＡ配列の「アンチセンス鎖」を含む。ｓｉＲＮＡ配列は、アンチセンス鎖とハイブリダイズする配列、ｓｉＲＮＡ配列の「センス鎖」を含む。標的遺伝子に対して選択されたｓｉＲＮＡ配列は、細胞により生成された他のいかなるｍＲＮＡとも、ｍＲＮＡに転写されない標的遺伝子のいかなる配列とも、相同であってはならない。標的ｍＲＮＡ配列の２０～２７塩基の配列を選択するための多数のデザインルールは、公知であり、市販の方法を含む。デザインは、少なくとも３つの方法から得ることができ、最優先の単一共通リストは、このような方法により構築して集合させる。発明者らは、少なくとも６つの最優先候補配列の調製と、その後の遺伝子阻害についての細胞培養試験により、ほぼすべての場合において、少なくとも２つの活性ｓｉＲＮＡ配列が明らかとなることを見出した。明らかとならない場合は、第２のラウンド（６つの最優先候補配列の取得および試験）を使用することができる。
活性ｓｉＲＮＡ配列の同定に加えて、デザインによっても、標的ｍＲＮＡ配列のみとの相同性を保証しなければならない。標的遺伝子ｍＲＮＡの配列以外のゲノム配列とのｓｉＲＮＡ配列の相同性が不十分であると、ｍＲＮＡレベルまたは遺伝子レベルのいずれかにおいて、オフターゲット効果が低下する。また、ｓｉＲＮＡ配列の「センス鎖」の相同性が不十分であっても、オフターゲット効果が低下する。Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｕｉｔｅを使用したＤＮＡ比較およびオンラインでのＢｌａｓｔによる検索により、選択された遺伝子の標的配列が、ヒトの対応物を含む他の遺伝子に対して、ユニークであり、配列相同性を欠くことが確認され得る。例えば、ｍＶＥＧＦ－ＡのｍＲＮＡと適合する配列は、ｍＶＥＧＦ－Ｂ ｍＲＮＡ、ｍＶＥＧＦ－Ｃ ｍＲＮＡ、ｍＶＥＧＦ－Ｄ ｍＲＮＡ、またはｈＶＥＧＦ１６５－ａ（ＡＦ４８６８３７）を含むヒト対応物に対する相同性を有しないｍＶＥＧＦ－Ａに対してユニークであることが確認される。しかし、適合配列は、ｍＶＥＧＦ－Ａの複数のアイソフォーム、例えば、ｍＶＥＧＦ（Ｍ９５２００）、ｍＶＥＧＦ１１５（Ｕ５０２７９１）、ｍＶＥＧＦ－２（５３８１００）、ｍＶＥＧＦ－Ａ（ＮＭ．ｓｕｂ．－－１９２８２３）を標的とし、これらは、１９０アミノ酸（ａａ）、１４１ａａ、１４６ａａおよび１４８ａａのｍＶＥＧＦ－Ａタンパク質をそれぞれコードする。ｍＶＥＧＦ－Ａ（ＮＭ．ｓｕｂ．－－１９２８２３、タンパク質の成熟形態）を除く、このようなｍＶＥＧＦ－Ａアイソフォームの公表されたｃＤＮＡ配列のすべては、２６ａａのシグナルペプチドをＮ末端に含む。ｍＶＥＧＦの標的配列は、シグナルペプチド部分においてではなく、このようなすべてのｍＶＥＧＦ－Ａアイソフォームに共有される成熟タンパク質部分において選択される。
また、ｍＶＥＧＦ－Ｒ２の標的配列は、このような２つの遺伝子に対してそれぞれユニークであることが確認される。種々の形態の干渉ＲＮＡが、本発明に含まれる。例として、ｓｉＲＮＡ配列は、公知のガイドラインを使用して、上記の標的配列に従ってデザインする。このようなｓｉＲＮＡは、２５塩基の平滑末端鎖ＲＮＡオリゴである（表１～３）。
ＲＮＡｉ物質は、標的遺伝子配列に特異的であり、これは、発明者らが標的化を試みている生物（動物）の種に依存する。ほとんどの哺乳動物遺伝子は、かなりの相同性を共有し、この場合、ＲＮＡｉ物質は、目的の遺伝子のｍＲＮＡのこの相同セグメントを有する複数の種において、遺伝子に対する活性を付与するように選択することができる。好ましいｓｉＲＮＡ阻害物質デザインは、ヒト遺伝子ｍＲＮＡと試験動物遺伝子ｍＲＮＡの両方との完全な相同性を有するべきである。試験動物（複数可）は、有効性および毒性試験に一般に使用される動物、例えば、マウス、ウサギまたはサルであるべきである。
ｓｉＲＮＡが配列依存的オフターゲット効果をもたらすのに、他の遺伝子配列と相同の最低１７ヌクレオチド（ｎｔ）を必要とすることがわかっているため、１つの２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ由来の８つの１７ｎｔ配列のそれぞれについて、配列依存的オフターゲット効果の可能性を検討するのに、ｂｌａｓｔが必要であり、いくつかのｓｉＲＮＡ治療プログラムのＡＰＩ（医薬品有効成分）のためのｓｉＲＮＡの選択を完了させる１つの重要なパラメータとして、この情報を使用し得る。
また、発明者らは、ｓｉＲＮＡ候補を確認して、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＬＲ経路を介してＩＦＮ経路の活性化を誘導し得る、公知の免疫刺激モチーフ（ＧＵリッチ領域、５’－ＵＧＵＧＵ－３’または５’－ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ－３’）を含むものを除外したが、本発明のＲＰＰ送達系は、インターフェロン経路のＴＯＬＬ様受容体媒介活性を誘導する可能性が極めて低い。最終的に、発明者らはまた、試験した各ｓｉＲＮＡ配列の標的領域を、これらの標的ｍＲＮＡ配列にマッピングした。このマッピングは、標的ｍＲＮＡおよびこの代替転写物に対するｓｉＲＮＡ候補の標的能力を理解するのに特に有用である。
強力なｓｉＲＮＡ標的配列の選択は、以下の表に列挙する。選択されたｓｉＲＮＡ配列は、最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞株において試験し、その後、ｉｎｖｉｖｏで、投与前に選択されたトランスフェクション薬を用いて複合させることにより、効力および有効性について試験した。
本明細書において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他に指示しない限り１つまたは複数を指す。
以下の実施例は、本発明の特定の態様を例示し、この範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
実施例１．空気を用いたジスルフィド結合によるペプチドの架橋
最初の試験は、ペプチドのジスルフィド結合による架橋によるポリペプチド形成を調べるために行った。ペプチドＨＫＣ２（３．０ｍｇ）を脱イオン水（０．５ｍＬ）中に室温で溶解し、溶液を４℃で１０時間保存した。生じる混合物を、水（０．１％ＴＦＡ）およびアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）により溶出した逆相Ｃ－８ ＨＰＬＣにより分析したところ、保持時間３．３分でクロマトグラム上に１つのピークを示す。出発物質ＨＫＣ２を表す、保持時間８．０５３分で溶出した場合のピークは存在しない。ペプチドが、酸化されて空気により架橋され得ることが確認される（図３）。
最初の試験は、ペプチドのジスルフィド結合による架橋によるポリペプチド形成を調べるために行った。ペプチドＨＫＣ２（３．０ｍｇ）を脱イオン水（０．５ｍＬ）中に室温で溶解し、溶液を４℃で１０時間保存した。生じる混合物を、水（０．１％ＴＦＡ）およびアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）により溶出した逆相Ｃ－８ ＨＰＬＣにより分析したところ、保持時間３．３分でクロマトグラム上に１つのピークを示す。出発物質ＨＫＣ２を表す、保持時間８．０５３分で溶出した場合のピークは存在しない。ペプチドが、酸化されて空気により架橋され得ることが確認される（図３）。
実施例２．ＤＭＳＯを用いたジスルフィド結合によるペプチドの架橋
ペプチドＨＫＣ２を、水中５％のＤＭＳＯの使用により、同様に酸化させた。ペプチドＨＫＣ２（３．０ｍｇ）を脱イオン水中に室温で溶解し、溶液を４℃で１０時間保存した。生じる混合物を、水（０．１％ＴＦＡ）およびアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）を使用して溶出した逆相Ｃ－８ ＨＰＬＣにより分析した。これは、保持時間３．３分でクロマトグラム上に１つのピークを示す。保持時間８．０５３分溶出した場合の、出発物質ＨＫＣ２についてのピークは、存在しなかった。ペプチドが、ＤＭＳＯにより酸化され得ることが確認される（図３）。
ペプチドＨＫＣ２を、水中５％のＤＭＳＯの使用により、同様に酸化させた。ペプチドＨＫＣ２（３．０ｍｇ）を脱イオン水中に室温で溶解し、溶液を４℃で１０時間保存した。生じる混合物を、水（０．１％ＴＦＡ）およびアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）を使用して溶出した逆相Ｃ－８ ＨＰＬＣにより分析した。これは、保持時間３．３分でクロマトグラム上に１つのピークを示す。保持時間８．０５３分溶出した場合の、出発物質ＨＫＣ２についてのピークは、存在しなかった。ペプチドが、ＤＭＳＯにより酸化され得ることが確認される（図３）。
実施例３．架橋ＨＫＣ２ペプチドとｓｉＲＮＡの自己集合によるナノ粒子形成
水中でのＨＫＣ２の架橋の検証後、発明者らは、ＨＫＣ２とｓｉＲＮＡとにおける（ＴＧＦ－β１に対する）自己集合を検討した。はじめに、架橋ＨＫＣ２の濃縮した保存液を、５％のＤＭＳＯを加えた水中に調製した。一連のＨＫＣ２をｓｉＲＮＡとの種々の比率（ｗｔ：ｗｔ）（１：１、２：１、４：１等）でｓｉＲＮＡと混合し、ボルテックスすることにより急速に撹拌した。ＨＫＣ２とＴＧＦβ１とにおけるポリペプチドナノ粒子のサイズ分布は、動的光散乱装置（ＤＬＳ）により測定し、３０分後に決定した。混合比１：１～１：６のＴＧＦβ１（２．５μｇ／μＬ）とＨＫＣ２（３０μｇ／μＬ）における高濃度下でのサイズ分布により、大型のナノ粒子サイズ（２０００～３０００ｎｍ）および沈殿が、一部の場合において観察された。ｓｉＲＮＡとＨＫＣ２との間にいかなる追加の配列を使用したとしても、サイズは同一のままであった（図１）。
水中でのＨＫＣ２の架橋の検証後、発明者らは、ＨＫＣ２とｓｉＲＮＡとにおける（ＴＧＦ－β１に対する）自己集合を検討した。はじめに、架橋ＨＫＣ２の濃縮した保存液を、５％のＤＭＳＯを加えた水中に調製した。一連のＨＫＣ２をｓｉＲＮＡとの種々の比率（ｗｔ：ｗｔ）（１：１、２：１、４：１等）でｓｉＲＮＡと混合し、ボルテックスすることにより急速に撹拌した。ＨＫＣ２とＴＧＦβ１とにおけるポリペプチドナノ粒子のサイズ分布は、動的光散乱装置（ＤＬＳ）により測定し、３０分後に決定した。混合比１：１～１：６のＴＧＦβ１（２．５μｇ／μＬ）とＨＫＣ２（３０μｇ／μＬ）における高濃度下でのサイズ分布により、大型のナノ粒子サイズ（２０００～３０００ｎｍ）および沈殿が、一部の場合において観察された。ｓｉＲＮＡとＨＫＣ２との間にいかなる追加の配列を使用したとしても、サイズは同一のままであった（図１）。
実施例４．ＨＫＣ２－ｓｉＲＮＡポリペプチドナノ粒子（ＰＮＰ）のＨＥＫ２９３細胞への細胞内送達
ＨＥＫ２９３細胞を３×１０４細胞／ウェルで４８ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。翌日、ＡＦ４８８標識ｓｉＲＮＡ／ＨＫＣ２複合体を次のように調製した。ｓｉＲＮＡ（０．０２５μｇ／μＬ、２１－ｍｅｒ）およびＨＫＣ２（０．０５μｇ／μＬ）の水溶液を次のＨＫＣ２対ｓｉＲＮＡ質量比：１：１、１．７：１、２：１、４：１、８：１および１：２で混合した。３０分後、ｓｉＲＮＡ／ＨＫＣ２複合体を細胞に加えた。トランスフェクションの２４時間後、蛍光画像を取得した。図７の画像により、発明者らは、ｓｉＲＮＡが細胞内部に送達されたことを観察した（図７）。
ＨＥＫ２９３細胞を３×１０４細胞／ウェルで４８ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。翌日、ＡＦ４８８標識ｓｉＲＮＡ／ＨＫＣ２複合体を次のように調製した。ｓｉＲＮＡ（０．０２５μｇ／μＬ、２１－ｍｅｒ）およびＨＫＣ２（０．０５μｇ／μＬ）の水溶液を次のＨＫＣ２対ｓｉＲＮＡ質量比：１：１、１．７：１、２：１、４：１、８：１および１：２で混合した。３０分後、ｓｉＲＮＡ／ＨＫＣ２複合体を細胞に加えた。トランスフェクションの２４時間後、蛍光画像を取得した。図７の画像により、発明者らは、ｓｉＲＮＡが細胞内部に送達されたことを観察した（図７）。
実施例５．ＨＫＣ２－ｓｉＲＮＡ ＰＮＰのＡ５４９細胞への細胞内送達
蛍光標識したｓｉＲＮＡ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）をペプチドＨＫＣ２と複合させて、ｓｉＲＮＡ送達の検証に使用した。トランスフェクションの前日に、Ａ５４９細胞を３×１０４細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートのウェルに播種した。翌日、ＡＦ４８８標識ｓｉＲＮＡ／ＨＫＣ２複合体を次のように調製した。ｓｉＲＮＡ（０．０２５μｇ／μＬ、２１－ｍｅｒ）およびＨＫＣ２（０．０５μｇ／μＬ）の水溶液を次のＨＫＣ２対ｓｉＲＮＡ比：１：１、１．７：１、２：１、４：１、８：１および１：２で混合した。３０分後、ｓｉＲＮＡ／ＨＫＣ２複合体を細胞に加えた。トランスフェクションの２４時間後、蛍光画像を取得した。図８の画像により、発明者らは、ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内部に明らかに送達されたことを観察した（図８）。
蛍光標識したｓｉＲＮＡ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）をペプチドＨＫＣ２と複合させて、ｓｉＲＮＡ送達の検証に使用した。トランスフェクションの前日に、Ａ５４９細胞を３×１０４細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートのウェルに播種した。翌日、ＡＦ４８８標識ｓｉＲＮＡ／ＨＫＣ２複合体を次のように調製した。ｓｉＲＮＡ（０．０２５μｇ／μＬ、２１－ｍｅｒ）およびＨＫＣ２（０．０５μｇ／μＬ）の水溶液を次のＨＫＣ２対ｓｉＲＮＡ比：１：１、１．７：１、２：１、４：１、８：１および１：２で混合した。３０分後、ｓｉＲＮＡ／ＨＫＣ２複合体を細胞に加えた。トランスフェクションの２４時間後、蛍光画像を取得した。図８の画像により、発明者らは、ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内部に明らかに送達されたことを観察した（図８）。
実施例６．ｓｉＲＮＡの移入を遅らせるＨＫＣ２の量を決定するゲル遅延度アッセイ
ｓｉＲＮＡ（ＴＧＦ－β１、５００ｎｇ）と複合した種々の比率のＨＫＣ２を調製し、ゲル電気泳動に３０分間供した（３％ゲル）。ＨＫＣ２ポリペプチド対ｓｉＲＮＡの種々の比率をゲル上に表す（図９）。実験では、２５ｎｇ／μＬのｓｉＲＮＡを、１：２、１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１の比率の種々の量のＨＫＣ２ペプチドまたは参照ＨＫＰ（４：１）とともにインキュベートした。２０分間のインキュベーション後、２０μＬのｓｉＲＮＡ／ペプチド（ｓｉＲＮＡを各５００ｎｇ）複合体をゲル内のウェルに充填した。遊離および結合したｓｉＲＮＡを３．０％の非変性アガロースゲル上に１００Ｖの印加電圧下で３０分間分離した。ゲルは、臭化エチジウムＲＮＡ色素で染色し、ＵＶ＝２９０ｎｍで生じる蛍光バンドをＦｕｊｉ ＬＡＳ４０００イメージャで可視化した（図９）。
ｓｉＲＮＡ（ＴＧＦ－β１、５００ｎｇ）と複合した種々の比率のＨＫＣ２を調製し、ゲル電気泳動に３０分間供した（３％ゲル）。ＨＫＣ２ポリペプチド対ｓｉＲＮＡの種々の比率をゲル上に表す（図９）。実験では、２５ｎｇ／μＬのｓｉＲＮＡを、１：２、１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１の比率の種々の量のＨＫＣ２ペプチドまたは参照ＨＫＰ（４：１）とともにインキュベートした。２０分間のインキュベーション後、２０μＬのｓｉＲＮＡ／ペプチド（ｓｉＲＮＡを各５００ｎｇ）複合体をゲル内のウェルに充填した。遊離および結合したｓｉＲＮＡを３．０％の非変性アガロースゲル上に１００Ｖの印加電圧下で３０分間分離した。ゲルは、臭化エチジウムＲＮＡ色素で染色し、ＵＶ＝２９０ｎｍで生じる蛍光バンドをＦｕｊｉ ＬＡＳ４０００イメージャで可視化した（図９）。
実施例７．ＨＫＣ２の分解およびグルタチオン（ＧＳＨ）の存在下でのｓｉＲＮＡの放出を検証するゲル遅延度アッセイ
ｓｉＲＮＡ（ＴＧＦ－β１、５００ｎｇ）と複合した種々の比率のＨＫＣ２またはＨＫＰを調製し、ゲル電気泳動に３０分間供した（３％ゲル）。ＨＫＣ２ポリペプチド対ｓｉＲＮＡの種々の比率をゲル上に表す（図１０）。実験では、２５ｎｇ／μＬのｓｉＲＮＡを、４：１および８：１の比率の種々の量の架橋ＨＫＣ２ペプチドまたは参照ＨＫＰ（４：１）とともに、２０ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）の存在下または非存在下でインキュベートした。４０分間のインキュベーション後、２０μＬのｓｉＲＮＡ／ペプチド（ｓｉＲＮＡを各５００ｎｇ）複合体をゲルのウェルに充填した。遊離および結合したｓｉＲＮＡを３．０％のアガロースゲル上に１００Ｖの印加電圧下で３０分間分離した。ゲルは、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ＝２９０ｎｍで生じる蛍光バンドをＦｕｊｉ ＬＡＳ４０００イメージャで可視化した。提示する結果は、複数の試験から得た画像の代表である。
ｓｉＲＮＡ（ＴＧＦ－β１、５００ｎｇ）と複合した種々の比率のＨＫＣ２またはＨＫＰを調製し、ゲル電気泳動に３０分間供した（３％ゲル）。ＨＫＣ２ポリペプチド対ｓｉＲＮＡの種々の比率をゲル上に表す（図１０）。実験では、２５ｎｇ／μＬのｓｉＲＮＡを、４：１および８：１の比率の種々の量の架橋ＨＫＣ２ペプチドまたは参照ＨＫＰ（４：１）とともに、２０ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）の存在下または非存在下でインキュベートした。４０分間のインキュベーション後、２０μＬのｓｉＲＮＡ／ペプチド（ｓｉＲＮＡを各５００ｎｇ）複合体をゲルのウェルに充填した。遊離および結合したｓｉＲＮＡを３．０％のアガロースゲル上に１００Ｖの印加電圧下で３０分間分離した。ゲルは、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ＝２９０ｎｍで生じる蛍光バンドをＦｕｊｉ ＬＡＳ４０００イメージャで可視化した。提示する結果は、複数の試験から得た画像の代表である。
実施例８．ナノ粒子の形成におけるＨＫＣ２：ＨＫＰ：ＴＧＦβ１の形成物のサイズ分布および多分散
ＨＫＣ２＝Ｋ（ＨＨＨＫ）４ＣＳＳＣ。ＨＫＰ＝Ｈ３Ｋ４ｂ。ＴＧＦβ１を水中８０ｎｇ／μＬで使用した。これらを等容積のＨＫＣおよびＨＫＰと水中で混合した。ＨＫＣ２、ＨＫＰおよびｓｉＲＮＡ（ＴＧＦβ１）のナノ粒子形成を種々の比率で評価した。ＨＫＣ２をＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ形成物に追加すると、類似のナノ粒子サイズが維持されたが、対照ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ（Ｎ：Ｐ質量比＝４：１）と比較した場合、多分散指数（ＰＤＩ）が顕著に狭まった。ＨＫＣ２／ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡを０：４：１、１：４：１、１：３：１、２：３：１、２：２：１、３：１：１の質量比で形成した。ＨＫＣ２（１６０ｎｇ／μＬ）、ＨＫＰ（３２０ｎｇ／μＬ）およびｓｉＲＮＡ（８０ｎｇ／μＬ）の水溶液を定義の比率で混合し、ＲＴで３０分間インキュベートした。その後、生じた試料は、Ｎａｎｏｐｌｕｓ ９０装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ社）を使用した動的光散乱により測定した。動的半径および多分散を記録し、図１１および１２に示した。
ＨＫＣ２＝Ｋ（ＨＨＨＫ）４ＣＳＳＣ。ＨＫＰ＝Ｈ３Ｋ４ｂ。ＴＧＦβ１を水中８０ｎｇ／μＬで使用した。これらを等容積のＨＫＣおよびＨＫＰと水中で混合した。ＨＫＣ２、ＨＫＰおよびｓｉＲＮＡ（ＴＧＦβ１）のナノ粒子形成を種々の比率で評価した。ＨＫＣ２をＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ形成物に追加すると、類似のナノ粒子サイズが維持されたが、対照ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ（Ｎ：Ｐ質量比＝４：１）と比較した場合、多分散指数（ＰＤＩ）が顕著に狭まった。ＨＫＣ２／ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡを０：４：１、１：４：１、１：３：１、２：３：１、２：２：１、３：１：１の質量比で形成した。ＨＫＣ２（１６０ｎｇ／μＬ）、ＨＫＰ（３２０ｎｇ／μＬ）およびｓｉＲＮＡ（８０ｎｇ／μＬ）の水溶液を定義の比率で混合し、ＲＴで３０分間インキュベートした。その後、生じた試料は、Ｎａｎｏｐｌｕｓ ９０装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ社）を使用した動的光散乱により測定した。動的半径および多分散を記録し、図１１および１２に示した。
実施例９．ＨＫＰ単独または種々の量のＨＫＰおよびＨＫＣと組み合わせて形成したＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社）による、ヒト膠芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞株に対する処理の効果
種々の質量比のＨＫＰ／ＨＫＣ２／ｓｉＲＮＡを使用し、リポフェクタミンも対照として使用した。はじめに、ＨＫＣ（１６０ｎｇ／μｌ）の水溶液をｓｉＲＮＡ（８０ｎｇ／μｌ）の水溶液に加え、混合し、手短にボルテックスし、次いで、同様にＨＫＰ（３２０ｎｇ／μｌ）を加えた。混合物をＲＴで３０分間インキュベートした。トランスフェクション複合体をＯＰＴＩ－ＭＥＭで希釈し、新鮮培地を添加した培地１００μｌ中の細胞に加えた。トランスフェクションの６時間後、培地を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭまたはＥＭＥＭと交換した。トランスフェクションの７２時間後、生細胞の数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により評価した。非処理細胞（ブランク）から得た値を１００％として設定した。すべての値は、４回の反復の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。ＮＳ－非発現抑制ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、ジャーマンタウン、ＭＤ州）、ＣＤ－Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、ジャーマンタウン、ＭＤ州）（図１３を参照）。
種々の質量比のＨＫＰ／ＨＫＣ２／ｓｉＲＮＡを使用し、リポフェクタミンも対照として使用した。はじめに、ＨＫＣ（１６０ｎｇ／μｌ）の水溶液をｓｉＲＮＡ（８０ｎｇ／μｌ）の水溶液に加え、混合し、手短にボルテックスし、次いで、同様にＨＫＰ（３２０ｎｇ／μｌ）を加えた。混合物をＲＴで３０分間インキュベートした。トランスフェクション複合体をＯＰＴＩ－ＭＥＭで希釈し、新鮮培地を添加した培地１００μｌ中の細胞に加えた。トランスフェクションの６時間後、培地を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭまたはＥＭＥＭと交換した。トランスフェクションの７２時間後、生細胞の数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により評価した。非処理細胞（ブランク）から得た値を１００％として設定した。すべての値は、４回の反復の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。ＮＳ－非発現抑制ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、ジャーマンタウン、ＭＤ州）、ＣＤ－Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、ジャーマンタウン、ＭＤ州）（図１３を参照）。
実施例１０．ＨＫＰ単独または種々の量のＨＫＰおよびＨＫＣと組み合わせて形成したＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社）による、ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞に対する処理の効果
種々の質量比のＨＫＰ／ＮＫＣ２／ｓｉＲＮＡを使用し、リポフェクタミンを対照として使用した。ＨＫＣ（１６０ｎｇ／μｌ）の水溶液をｓｉＲＮＡ（８０ｎｇ／μｌ）の水溶液に加え、混合し、手短にボルテックスし、次いで、ＨＫＰ（３２０ｎｇ／μｌ）を加えた。混合物をＲＴで３０分間インキュベートした。トランスフェクション複合体をＯＰＴＩ－ＭＥＭで希釈し、新鮮培地を添加した培地１００μｌ中の細胞に加えた。トランスフェクションの６時間後、培地を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭまたはＥＭＥＭと交換した。トランスフェクションの７２時間後、生細胞の数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により評価した。非処理細胞（ブランク）から得た値を１００％として設定した。すべての値は、４回の反復の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。ＮＳ－非発現抑制ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、ジャーマンタウン、ＭＤ州）、ＣＤ－ＣｅｌｌＤｅａｔｈ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、ジャーマンタウン、ＭＤ州）。
種々の質量比のＨＫＰ／ＮＫＣ２／ｓｉＲＮＡを使用し、リポフェクタミンを対照として使用した。ＨＫＣ（１６０ｎｇ／μｌ）の水溶液をｓｉＲＮＡ（８０ｎｇ／μｌ）の水溶液に加え、混合し、手短にボルテックスし、次いで、ＨＫＰ（３２０ｎｇ／μｌ）を加えた。混合物をＲＴで３０分間インキュベートした。トランスフェクション複合体をＯＰＴＩ－ＭＥＭで希釈し、新鮮培地を添加した培地１００μｌ中の細胞に加えた。トランスフェクションの６時間後、培地を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭまたはＥＭＥＭと交換した。トランスフェクションの７２時間後、生細胞の数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により評価した。非処理細胞（ブランク）から得た値を１００％として設定した。すべての値は、４回の反復の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。ＮＳ－非発現抑制ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、ジャーマンタウン、ＭＤ州）、ＣＤ－ＣｅｌｌＤｅａｔｈ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、ジャーマンタウン、ＭＤ州）。
参考文献：
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2. Judge A. D., Robbins M., Tabakoli I., Levi J., Hu L., Fronda A., Maclachian L. (2009): Confirming the RNAi-mediated mechanism of action of siRNA-based cancer therapeutics in mice. J. Clin. Invest., 119, 661-673.
3. Semple S. C., Akinc A., Chen J., Sandhu A. P., Mui B. L., Cho C. K., Hope M. J. (2010): Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat. Biotechnol., 28, 172-176.
4. Rozema D. B., Lewis D. L., Wakefield D. H., Wong S. C., Klein J. J., Roesch P. L., Bertin S. L., Reppen T. W., Chu Q., Blokhin A. V., Hagstrom J. E., Wolff J. A. (2007): Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of siRNA to hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 12982-12987.
5. Wooddell C. I., Rozema D. B., Hossbach M., John M., Hamilton H. L., Chu Q., Hegge J. O., Klein J. J., Wakefield D. H., Oropeza C. E., Deckert J., Roehl I., Jahn-Hofmann K., Hadwiger P., Vornlocher H.P., McLachaln A., Lewis D.L. (2013): Hepatocyte-targeted RNAi therapeutics for the treatment of chronic hepatitis B virus infection. Mol. Ther., 21, 973-985.
6. Tatiparti K., Sau S., Kashaw S. K., Iyer A. K. (2017): siRNA Delivery Strategies: A Comprehensive review of recent developments, Nanomaterials (Basel). 7(4), e77.
7. U.S. Patent No. 8,735,567 B2 of Lu et al., issued May 27, 2014 for Multi-Targeted RNAi Therapeutics for Scarless Wound Healing of Skin.
8. U.S. Patent No. 9,642,873 B2 of Lu et al., issued May 9, 2017 for Combinations of TGFβ and COX-2 Inhibitors and Methods for their Therapeutic Application.
9. Jia Zhou, Yixuan Zhao, Vera Simonenko, John J. Xu, Kai Liu, Deling Wang, Jingli Shi, Tianyi Zhong, Lixia Zhang, Lun Zeng, Bin Huang, Shenggao Tang, Alan Y. Lu, A. James Mixson, Yangbai Sun, Patrick Y. Lu and Qingfeng Li (2017): Simultaneous silencing of TGF-β1 and COX-2 reduces human skin hypertrophic scar through activation of fibroblast apoptosis, Oncotarget, 8, 80651-80665.
10. Cheng R., Feng F., Meng F., Deng C., Feijen J., Zhong Z. (2011): Glutathione-responsive nano-vehicles as a promising platform for targeted intracellular drug and gene delivery. J. Control. Release, 152, 2-12.
11. Zhu L., and Vladimir P. T., (2013): Stimulus-responsive nanopreparations for tumor targeting, Integr. Biol. (Camb). 5, 96-107.
12. Leng Q. and Mixson A. J. (2005): Modified branched peptides with a histidine-rich tail enhance in vitro gene transfection, Nucleic Acids Research, 33, e40.
13. Chou S. T., Hom K., Zhang D., Leng Q., Tricoli L. J., Hustedt J. M., Lee A., Shapiro M. J., Seog J., Kahn J. D., Mixson A. J. (2014): Enhanced silencing and stabilization of siRNA polyplexes by histidine-mediated hydrogen bonds, Biomaterials, 35, 846-855.
14. Anajafi T., Yu J., Sedigh A., Haldar M. K., Muhonen W. W., Oberlander S., Wasness H., Froberg J., Molla M. S., Katti K. S., Choi Y., Shabb J. B., Srivastava D. K., Mallik S. (2017): Nuclear Localizing Peptide-Conjugated, Redox-Sensitive Polymersomes for Delivering Curcumin and Doxorubicin to Pancreatic Cancer Microtumors, Mol. Pharmaceutics, 14, 1916-1928.
15. David P. F., Aline D. de A. (2016): Review Stapling Peptides Using Cysteine Crosslinking, PeptideScience, 106, 843-852.
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発行された特許および公表された特許出願を含む、本明細書において特定するすべての公表文献、ならびにｕｒｌアドレスまたは受託番号により本明細書において特定するすべての登録データベースの開示は、これらの全体を参照により本明細書に組み込む。
本発明は、この特定の実施形態に関して記載されており、多くの詳細が、例示目的のために記載されているが、本発明が、さらなる実施形態を受け入れる余地があり、本明細書に記載する詳細のいくつかが、本発明の基本的原理から逸脱することなく、大幅に変更され得ることは当業者に明らかである。
Claims (58)
- 式Ｋｐ｛［（Ｈ）ｎ（Ｋ）ｍ］｝ｙ－Ｃ－ｘ－Ｃまたは式Ｋｐ｛［（Ｈ）ａ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｂ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｃ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｄ（Ｋ）ｍ］｝ｙ－Ｃ－ｘ－Ｃ［式中、Ｋはリジンであり、Ｈはヒスチジンであり、Ｃはシステインであり、ｘはリンカーであり、ｐは０または１であり、ｎは１～５の整数であり、ｍは０～３の整数であり、ａ、ｂ、ｃおよびｄは３または４のいずれかであり、ｙは３～１０の整数である］からなり、ｘはＳｅｒ－Ｓｅｒである、ペプチド。
- ｎが３であり、ｍが０または１であり、ｙが４または８である、請求項１に記載のペプチド。
- ペプチド配列が、少なくとも７アミノ酸長かつ最大で８アミノ酸長からなる、請求項１に記載のペプチド。
- ペプチドが、哺乳動物細胞に内部移行されることが可能である、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド。
- ペプチドが、ヒト細胞に内部移行されることが可能である、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド。
- ペプチドが、直鎖である、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド。
- ペプチドが、分枝鎖である、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド。
- 開裂可能な結合を介して架橋された、少なくとも２つの請求項１に記載のペプチドを含むポリペプチド。
- 開裂可能な結合を介して架橋された、少なくとも２つの請求項２から７のいずれか一項に記載のペプチドを含むポリペプチド。
- 開裂可能な結合が、ジスルフィド結合である、請求項８または請求項９に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが、直鎖である、請求項８から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが、分枝鎖である、請求項８から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項８に記載のポリペプチドおよび核酸を含むナノ粒子。
- 請求項９から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび核酸を含むナノ粒子。
- ヒスチジン－リジン共重合体をさらに含む、請求項１３または請求項１４に記載のナノ粒子。
- ヒスチジン－リジン共重合体が、Ｈ３Ｋ４ｂまたはＨＫＰ（＋Ｈ）を含む、請求項１５に記載のナノ粒子。
- 核酸が、ｓｉＲＮＡを含む、請求項１３から１６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
- ポリペプチドおよびナノ粒子が、哺乳動物細胞において生分解性である、請求項１３から１７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
- ナノ粒子サイズが、５０～３００ｎｍである、請求項１３から１８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
- ナノ粒子サイズが、８０～１３０ｎｍである、請求項１３から１８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
- ナノ粒子の表面の部分的遊離チオール基残基を介して結合している官能基をさらに含む、請求項１３から２０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
- ペプチド配列内のシステイン側鎖上の遊離チオール基残基を介して結合している官能基をさらに含む、請求項１３から２０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
- 官能基が、低分子、保護ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、脂質、ペプチドまたはタンパク質、オリゴヌクレオチド、およびアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を認識する炭水化物結合部位を有する有機分子からなる群から選択される、請求項２１または請求項２２に記載のナノ粒子。
- 官能基が、保護ＰＥＧ分子である、請求項２３に記載のナノ粒子。
- 核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、およびアプタマー配列からなる群から選択される、請求項１３から２４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
- 第２の核酸をさらに含む、請求項１３から２５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
- 第２の核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、およびアプタマー配列からなる群から選択される、請求項２６に記載のナノ粒子。
- ｓｉＲＮＡ分子が、１６～２７塩基対の長さを有する２本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項２５または２７に記載のナノ粒子。
- ｓｉＲＮＡ分子が、２１～２５塩基対の長さを有しかつ平滑末端または１～３ヌクレオチドのオーバーハングを有する２本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項２５または請求項２７に記載のナノ粒子。
- 医薬をさらに含む、請求項１３から２９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
- 医薬が、低分子薬、ペプチド薬、およびタンパク質薬からなる群から選択される、請求項３０に記載のナノ粒子。
- 核酸が、表１～３において同定されているｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項１３から３１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
- 核酸が、ａ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する２４塩基対からなる生成された二重鎖；ｂ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する２３塩基対からなる生成された二重鎖；ｃ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する２２塩基対からなる生成された二重鎖；ｄ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する２１塩基対からなる生成された二重鎖；ｅ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する２０塩基対からなる生成された二重鎖；ｆ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する１９塩基対からなる生成された二重鎖；ｇ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する１８塩基対からなる生成された二重鎖；ｈ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する１７塩基対からなる生成された二重鎖；およびｉ）表１～３の二重鎖のうちのいずれか１つの近接する１６塩基対からなる生成された二重鎖からなる群から選択されるｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項１３から３１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
- 請求項１３から３３のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、核酸を哺乳動物細胞に送達するための組成物。
- 核酸が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に送達される、請求項３４に記載の組成物。
- 核酸が、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に送達される、請求項３４に記載の組成物。
- 哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の組成物。
- 治療的有効量の請求項１３から３３のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、哺乳動物における遺伝子治療のための医薬。
- 哺乳動物が、ヒトである、請求項３８に記載の医薬。
- 治療的有効量の請求項１３から３３のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、治療化合物を哺乳動物に送達するための組成物。
- 哺乳動物が、ヒトである、請求項４０に記載の組成物。
- 請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドを生成する方法であって、ａ）最初のリジン（Ｋ）を固体支持体に結合させる工程；ｂ）さらなるアミノ酸を相次いで最初のリジンに結合させる工程；およびｃ）合成したペプチドを回収する工程を含む、方法。
- 請求項８から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、ａ）請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドを化学酸化により架橋して、開裂可能な結合を有するポリペプチドを形成する工程；およびｂ）ポリペプチドを回収する工程を含む、方法。
- 請求項１３または請求項１４に記載のナノ粒子を生成する方法であって、ａ）請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドを化学酸化により架橋して、開裂可能な結合を有するポリペプチドを形成する工程、ｂ）ポリペプチドを核酸と混合する工程、およびｃ）ナノ粒子を回収する工程を含む、方法。
- 請求項１３または請求項１４に記載のナノ粒子を生成する方法であって、ａ）請求項８から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを核酸と混合して、ナノ粒子を形成する工程、およびｂ）ナノ粒子を回収する工程を含む、方法。
- 請求項１３または請求項１４に記載のナノ粒子を生成する方法であって、ａ）請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチドを核酸と混合する工程、ｂ）ペプチドを化学酸化により架橋し、開裂可能な結合を有するポリペプチドを形成して、ナノ粒子の形成を生じる工程、およびｃ）ナノ粒子を回収する工程を含む、方法。
- 開裂可能な結合が、ジスルフィド結合である、請求項４３、４４および４６のいずれか一項に記載の方法。
- 医薬をポリペプチドおよび核酸と混合するさらなる工程を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
- ヒスチジン－リジン共重合体を加えるさらなる工程を含む、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
- 医薬が、低分子薬、ペプチド薬、およびタンパク質薬からなる群から選択される、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
- 核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、およびアプタマー配列からなる群から選択される、請求項４４から５０のいずれか一項に記載の方法。
- 式Ｋ［（Ｈ）ｎ（Ｋ）ｍ］ｙ－Ｃ－ｘ－Ｃ［式中、Ｋはリジンであり、Ｈはヒスチジンであり、Ｃはシステインであり、ｎは１～５の整数であり、ｍは０～３の整数であり、ｙは３～７の整数であり、ｘはリンカーである］からなり、ｘはＳｅｒ－Ｓｅｒである、ペプチド。
- ｎが３であり、ｍが０または１であり、ｙが４である、請求項５２に記載のペプチド。
- リンカーが、２つのシステイン残基の架橋機能を保存し、ペプチドの官能性を維持する、請求項５２または請求項５３に記載のペプチド。
- ペプチドが、直鎖である、請求項５２から５４のいずれか一項に記載のペプチド。
- ペプチドが、分枝鎖である、請求項５２から５４のいずれか一項に記載のペプチド。
- 開裂可能な結合を介して架橋された２～１０個の、請求項５２から５６のいずれか一項に記載のペプチドを含むポリペプチド。
- 開裂可能な結合が、ジスルフィド結合である、請求項５７に記載のポリペプチド。
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|---|---|---|---|
| US201862676218P | 2018-05-24 | 2018-05-24 | |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021525508A JP2021525508A (ja) | 2021-09-27 |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030165567A1 (en) | 1999-12-29 | 2003-09-04 | Mixson A. James | Histidine copolymer and methods for using same |
| JP2008520209A (ja) | 2004-11-17 | 2008-06-19 | ユニヴァーシティ・オブ・メリーランド，バルチモア | ｓｉＲＮＡの有効なキャリアとしての高度に枝分かれしたＨＫペプチド |
| WO2011011631A2 (en) | 2009-07-22 | 2011-01-27 | Samuel Zalipsky | Nucleic acid delivery vehicles |
| WO2018081726A2 (en) | 2016-10-30 | 2018-05-03 | Sirnaomics, Inc. | Pharmaceutical compositions and methods of use for activation of human fibroblast and myofibroblast apoptosis |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Biomacromolecules，2009年，Vol. 10，pp. 119-127 |
| Int. J. Pharmaceut.，2013年，Vol. 455，pp. 40-47 |
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