KR102125961B1

KR102125961B1 - 세포질 내 shRNA의 지속적 발현을 위한 변형된 pT7/T7 폴리머라제 시스템 및 이를 포함하는 리포좀 전달체

Info

Publication number: KR102125961B1
Application number: KR1020180093845A
Authority: KR
Inventors: 안형준; 곽서영
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2020-06-24
Also published as: US20200046753A1; KR20200018071A

Abstract

본 발명은 T7 RNA 폴리머라제(polymerase) mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는, 핵-비의존적 및 지속적 유전자 발현 억제용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 유전자 발현 억제인자의 전달체, 및 상기 전달체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 본 발명의 리포좀 전달체는 세포질 내에서 핵-비의존적 및 지속적인 T7 RNA 폴리머라제 자가증폭을 통해 shRNA의 발현을 향상시키고, 이를 암 조직 선택적으로 장기간 전달할 수 있는바, 투여 회수를 줄이면서도 장기간의 유전자 발현 억제가 요구되는 만성 질환의 치료 목적으로 활용될 수 있다.

Description

세포질 내 shRNA의 지속적 발현을 위한 변형된 pT7/T7 폴리머라제 시스템 및 이를 포함하는 리포좀 전달체{Modified pT7/T7 polymerase system for sustainable shRNA expression in cytoplasm and liposome transporter comprising it}

본 발명은 T7 RNA 폴리머라제(polymerase) mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는, 핵-비의존적 및 지속적 유전자 발현 억제용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 유전자 발현 억제인자의 전달체, 및 상기 전달체의 제조방법에 관한 것이다.

RNA 간섭현상(RNA interference, RNAi)은 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA(double strand RNA)을 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적 유전자의 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상을 말한다. RNAi 는 처음에 선충에서 발견되었지만, 현재는 효모, 곤충, 식물, 인간 등 각종 동식물에서 매우 잘 보존이 되어 있는 생명현상으로 관찰되고 있다.

small interference RNA(siRNA)는 RNAi를 유도하는 물질로서, 약 20 내지 30개의 뉴클레오타이드(nucleotides)로 구성된 짧은 RNA 이중나선 가닥을 말한다. siRNA를 세포 내로 주입시켜 이 siRNA와 염기서열이 상보적인 mRNA를 표적으로 삼아 유전자 발현을 억제하게 된다. siRNA는 질병에 대한 치료 효과를 가지며, 쉬운 제조법 및 높은 표적 선택성 등으로 인해 표적이 되는 생명 프로세스를 조절할 수 있는 효과적인 수단으로 각광을 받고 있다. 현재 siRNA를 이용하여 치료할 수 있는 질환으로, 암, 바이러스 감염 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환 등이 연구되고 있으며, 임상적 시도로서 노인성 황반변성, 호흡기 신시치아 바이러스 감염증에 대한 치료제로서의 가능성이 보고되었다 (Melnikova I. Nat Rev Drug Discov 2007, 6, 863-864). 또한 트랜스페린을 표적으로 하는 사이클로덱스트린 기반의 나노입자 중합체를 이용하여 인간 암 치료에서 siRNA의 전달 시스템이 가능함이 보고되었다(Oh YK. et al., Adv Drug Deliver Rev 2009, 61, 850-862).

그러나, 합성 siRNA를 이용한 유전자 사일런싱은 2-4 일 정도로 지속기간이 매우 짧은 문제점을 가지고 있는데, 이는 세포질 내의 각종 핵산분해효소로 인해 siRNA가 쉽게 분해되고 세포분열이 일어날 경우에는 siRNA의 농도가 희석되기 때문이다. 이러한 짧은 지속성 문제로 인해 합성 siRNA를 빈번하게 주입해야 하는 문제점이 발생하고 있을 뿐만 아니라, 긴 반감기를 가지는 표적단백질을 유전자 사일런싱하기에는 그 지속성이 너무 짧아서 효율이 매우 저조하다는 한계도 가지고 있으며, 이러한 한계점들은 siRNA를 이용한 치료제 개발을 더디게 하고 있다.

기존의 유전자 사일런싱 지속성을 향상시키려는 노력들은 다양한 전달체를 이용하여 siRNA의 탑제효율을 증가시킴으로써 되도록 많은 양의 siRNA를 전달하려는 시도들로 나타났다. 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 또는 리포좀에 기반한 전달체가 주로 사용되었으나, 양이온성 분자 또는 합성 고분자를 이용한 전달체의 경우 세포 내로의 수송 효율이 낮으며 세포 내로의 유전자 전달과정에서 유발될 수 있는 세포 독성에 대한 문제가 지적되었다. 또한, 유전자 사일런싱의 지속성이 오랫동안 나타날 수 있는 바이러스 벡터의 경우, 그 우수한 지속성에도 불구하고 바이러스 벡터의 표면 단백질의 면역원성으로 인한 면역 부작용을 일으켜 체내 안정성이 보장되지 못하는 문제가 지적되었다. 무엇보다 외래 유전자가 환자의 게놈(genome)에 삽입될 수 있는 위험성 문제로 인해 바이러스를 이용한 유전자 사일런싱은 인체적용에 제한을 가질 수 밖에 없었다.

한편, 유전자 사일런싱 지속성을 향상시키기 위한 노력으로, 핵-의존적 프로모터에 기반한 shRNA 발현이 가능한 플라스미드 DNA 개발이 알려져 있다. 주로 U6 소핵(small nuclear) RNA, H1 RNA 유전자로부터 유래한 RNA 폴리머라제 Ⅲ(Pol Ⅲ) 프로모터가 가장 많이 활용되고 있으며, 이러한 핵-의존적 프로모터를 이용한 핵에서의 shRNA 발현은 효과적으로 핵에서 shRNA를 장기간 생산할 수 있는 방법을 제공하고 있다. 그러나, 세포막 투과에 비해 그 효율이 1%에 머무른다고 알려진 핵막 투과에 의존하는 이러한 플라스미드 DNA 방법은 그 유전자 사일런싱 효율이 매우 낮다. 특히 플라스미드 DNA의 전달효율이 현저히 떨어지는 in vivo 응용에서는 낮은 효율성으로 인하여 적용이 제한을 받고 있다. 또한, 핵에서 발현된 고농도의 shRNA의 경우, 세포질로 분출되어야만 다이서(Dicer) 등에 의해 유전자 사일런싱에 참여할 수 있는 성숙된 siRNA로 변환이 가능하나, 이러한 세포질로의 분출에 관여하는 엑스포틴(exportin)-5 운반체가 고농도의 shRNA에 의하여 포화(saturation)되는 문제를 발생시켜서 다른 세포내 기능에 관여하는 microRNA의 세포질 분출까지도 방해하는 문제점을 일으키며, 이러한 microRNA의 세포질 분출 이상은 심각한 독성문제로 이어진다. 그 밖에 현재 다양한 플라스미드 DNA를 이용한 핵-의존적 shRNA 발현방법이 알려져 있으나, in vivo 모델에서는 아직까지 짧은 지속성이라는 한계점을 여전히 가지고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 핵-비의존적으로 세포질 내에서 shRNA의 발현을 지속적으로 유지할 수 있는 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 전달체가 세포질 내에서 shRNA를 장기간 지속적으로 발현시킬 수 있고, 특히 암 조직 선택적으로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 T7 RNA 폴리머라제(polymerase) mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는, 지속적인 유전자 발현 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 유전자 발현 억제인자의 전달체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태로, T7 RNA 폴리머라제(polymerase) mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는, 지속적인 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 “T7 RNA 폴리머라제(polymerase)”는 박테리오파지 T7 유래의 약 20 염기쌍으로 구성된 파지 고유의 프로모터 배열을 인식하는 RNA 중합효소로, 5'-말단에서 3'-말단 방향으로 RNA로부터 DNA의 합성을 촉매하는 효소이다. T7 RNA 폴리머라제는 프로모터에 대한 특이성이 매우 높으며, T7 프로모터 하류의 DNA만을 전사할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 T7 RNA 폴리머라제를 사용함으로써 세포 내에 다른 프로모터와 반응하지 않고 오직 T7 프로모터를 갖는 플라스미드 DNA에 결합 및 전사를 수행하게 되고, 높은 효율로 T7 RNA 폴리머라제 자신을 자가증폭할 수 있다.

구체적으로, 다양한 세포 내 보조인자(cofactor)들을 필요로 하는 진핵생물의 RNA 폴리머라제와는 다르게, T7 RNA 폴리머라제는 추가적인 세포 내 보조인자가 없이도 전사를 일으킬 수 있다는 장점이 있다(M. Chamberlin, J. McGrath, L. Waskell, New RNA polymerase from Escherichia coli infected with bacteriophage T7, Nature 228 (1970) 227-231). 또한, 진핵생물의 세포 내에는 T7 프로모터에 특이성을 가지는 다른 RNA 폴리머라제가 존재하지 않기 때문에 T7 프로모터/T7 RNA 폴리머라제를 이용하는 전사 시스템은 세포 내 다른 전사시스템의 간섭을 받지도 않을 뿐만 아니라, 다른 전사 시스템에 간섭을 일으키지도 않는다. 반면, T7 프로모터와 동일한 RNA 폴리머라제 III 타입에 속하는 다른 프로모터들, 예를 들면 U1 프로모터 혹은 H1 프로모터들은 세포 내에 이미 존재하고 있기 때문에 T7 프로모터가 갖는 이러한 간섭을 일으키지 않는 특성을 가지지 못하며, 본 발명 전사 시스템상 전사를 제어하기에 적당하지 못하다. 보다 구체적으로, 본 발명의 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편은 5'-cap 구조를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 5'-cap 구조는 대부분의 진핵세포와 바이러스의 mRNA의 5'-말단에 존재하는 7-메틸구아노신(7-methylguanosine)을 의미하는 것으로, mRNA가 라이보핵산분해효소(ribonuclease, RNase)에 의해 분해되는 것을 막아주며, 세포질에서는 번역개시인자와 결합하여 리보솜 결합 위치로 작용할 수 있다. 일반적으로 세포질 내 전사체(cytoplasmic transcript)는 핵 전사체(nuclear transcript)가 필수적으로 가지는 5'-cap 구조가 없기 때문에 리보솜에 의한 번역 효율이 떨어진다는 문제점을 가진다. 이에, 본 발명은 5'-cap 구조를 갖는 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편을 사용하여 세포내 안정성 및 세포질 내 번역 효율을 높일뿐 만 아니라, 기존에 핵-의존적 shRNA 발현을 위해 사용된 플라스미드 DNA의 낮은 핵막 투과의 한계점을 극복하여, 세포질 내에 효과적으로 초기 T7 RNA 폴리머라제를 제공할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 5′-cap 구조를 갖는 T7 폴리머라제 mRNA을 합성하기 위해, 먼저 T7 프로모터-T7 폴리머라제 서열을 갖는 dsDNA 단편을 화학 합성법에 의하여 합성하고(Bioneer), 이러한 T7 프로모터-T7 폴리머라제 DNA 단편에 대하여 HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)를 이용하여 5′-cap 구조를 갖는 T7 폴리머라제 mRNA를 시험관 내에서 합성하였다.

본 발명에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 T7 RNA 폴리머라제 발현 루프(loop)의 반복에 의해 상기 T7 RNA 폴리머라제를 세포질 내에서 자가증폭시키는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 플라스미드 DNA는 T7 프로모터, IRES(Internal ribosome entry site) 영역, T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자, 폴리 아데닌 꼬리(poly A tail), 및 T7 종결서열(terminator)이 작동 가능하게 연결되어 구성된 것일 수 있다. 상기 플라스미드 DNA 내부에 포함된 IRES 영역은 viral IRES일 수 있으며, IRES-융합된 T7 폴리머라제 전사체를 생성함으로써 플라스미드 DNA의 전사 안정성을 높일 뿐만 아니라, 세포질 내에서 T7 폴리머라제의 낮은 발현효율을 개선할 수 있다. 구체적으로, 상기 T7 프로모터는 서열번호 2의 염기서열, 상기 IRES 영역은 서열번호 3의 염기서열, T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열, T7 종결서열은 서열번호 5의 염기서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, pT7CFE1-NHis 플라스미드(Thermo Fisher)의 멀티클로닝 자리의 BamHI/XhoI 자리를 이용하여 T7 폴리머라제 유전자(GenBank accession no. FJ881694.1)를 삽입하였으며, 상기 T7 폴리머라제 유전자가 T7 프로모터 및 viral IRES 영역의 하류에 위치하면서 동시에 폴리 아데닌 꼬리 및 T7 종결서열의 상류에 위치하는 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA(auto_T7pol plasmid)를 제조하였다.

상기 “자가증폭”은 본 발명 조성물에 포함된 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편 및 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA에 의한 T7 RNA 폴리머라제 발현 루프에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편이 세포질 내에서 리보솜에 의해 번역되어 T7 RNA 폴리머라제를 생성하고, 생성된 T7 RNA 폴리머라제는 상기 플라스미드 DNA에 존재하는 T7 프로모터를 인식하여 T7 RNA 폴리머라제의 전사를 수행한다. 이후 생성된 T7 RNA 폴리머라제의 mRNA는 세포질 내에서 다시 리보솜에 의해 번역되어 T7 RNA 폴리머라제를 생성하는 것을 반복함으로써, T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭이 이루어진다. 따라서, 본 발명의 조성물은 T7 RNA 폴리머라제 발현 루프에 의해 자가증폭된 T7 RNA 폴리머라제를 세포질 내에서 장기간 고농도로 유지시킬 수 있음을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 플라스미드 DNA(auto_T7pol plasmid)를 포함하는 DOPC 리포좀 전달체(auto_shRFP@LS)를 처리한 B16F10/RFP 세포에서 시간에 따른 T7 폴리머라제의 세포질 발현을 웨스턴 블랏으로 조사한 결과, T7 폴리머라제는 세포질 내에서 적어도 9일 이상 고농도로 유지되는 것을 확인하였다(도 3의 A).

본 발명의 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편은 T7프로모터, 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA, 및 T7 종결서열이 작동 가능하게 연결되어 구성된 것일 수 있다. 상기 유전자 발현 억제인자는 siRNA, shRNA, microRNA 및 압타머로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로 shRNA일 수 있으나, 본 발명의 목적상 자가증폭된 T7 RNA 폴리머라제에 의해 상기 DNA 단편이 전사되어 생성되는 것으로, 특정 유전자의 발현을 저해할 목적으로 사용되는 것이라면 제한없이 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 유전자 발현 억제인자로 siRFP(Red Fluorescent Protein)를 사용하였으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 “siRNA(small interfering RNA)”는 RNA 간섭현상(RNA interference, RNAi)을 유도하는 물질로, 약 20 내지 30개의 뉴클레오타이드(nucleotides)로 구성된 짧은 RNA 이중나선 가닥을 말한다. siRNA를 세포 내로 주입시킬 경우, siRNA의 염기서열과 상보적인 염기서열의 mRNA를 표적으로 삼아 그 유전자 발현을 억제하게 된다. 상기 “shRNA(samll hairpin RNA)”는 RNA 간섭 현상을 통해 표적 유전자의 발현을 억제시키는 데 사용할 수있는 머리핀 구조의 고리를 가진 인공 RNA 분자를 의미하는 거으로, shRNA는 상대적으로 낮은 분해 속도와 턴오버를 가지는 점에서 RNAi에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 “microRNA”는 약 22개의 염기 길이를 갖는 리보핵산 분자로, 모든 진핵세포에서 발견된다. microRNA는 그와 상보적인 서열을 가지는 표적 RNA 전사체와 결합함으로써 전사체의 번역을 억제하거나, 히스톤 수식화(Histone modification) 및 프로모터(Promoter)에 DNA 메틸화를 유도하여 특정 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 DOPC 리포좀 전달체(auto_shRFP@LS)에 의한 장기간 세포질 내 shRNA 발현 및 이들의 siRNA로의 변환 여부를 평가한 결과, auto_shRFP@LS를 처리한 세포에서는 적어도 13일 동안 고농도의 siRFP를 관찰할 수 있었으나, 대조군으로 이용된 auto(-)_shRFP@LS을 처리한 세포에서는 이보다 현저히 적은 농도의 siRFP만을 10일 동안만 측정 가능함을 확인하였다(도 3의 B 및 C).

본 발명의 지속적인 유전자 발현 억제용 조성물은 핵-비의존적으로 세포질 내 T7 RNA 폴리머라제의 발현을 증가시켜 상기 유전자 발현 억제인자를 장기간 지속적으로 발현시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자 발현 억제인자의 지속적 발현은 상기 조성물로부터 세포질 내 장기간 지속적으로 shRNA를 생성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

기존의 핵-의존적 프로모터를 갖는 플라스미드 DNA 이용한 핵에서의 shRNA 발현 방법은 세포막 투과에 비해 그 효율이 1%에 불과한 핵막 투과에 의존하는바, 유전자의 발현 억제 효율이 매우 낮다. 또한, 핵에서 발현된 shRNA는 세포질로 배출되어야만 다이서 등에 의해 유전자 발현 억제에 관여할 수 있는 siRNA로 변환이 가능하나, 이러한 세포질로의 분출에 관여하는 엑스포틴(exportin)-5 운반체가 고농도의 shRNA에 의하여 포화되는 문제로 인해 다른 세포내 기능에 관여하는 microRNA의 세포질 분출까지도 방해하는 문제를 수반한다.

이에, 본 발명은 5'-cap 구조를 갖는 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편 및 T7 RNA 폴리머라제 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA에 의해 수행되는 T7 RNA 폴리머라제 발현 루프를 통해 핵-비의존적으로 세포질 내에서 T7 RNA 폴리머라제를 장기간 고농도로 유지하고, 이에 따라 유전자 발현 억제인자 또한 장기간 지속적으로 발현시키는 것을 특징으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태로, T7 RNA 폴리머라제(polymerase) mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 상기 조성물을 포함하는, 유전자 발현 억제인자의 전달체를 제공한다. 상기 T7 RNA 폴리머라제, 자가증폭, 플라스미드 DNA, 유전자 발현 억제인자 및 조성물에 관한 내용은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 “전달체”는 본 발명 목적상 상기 유전자 발현 억제인자의 세포 안으로의 전달을 높여주는 물질이라면 제한없이 포함된다. 구체적으로, 상기 전달체는 리포좀, 폴리머 기반의 나노입자(nanoparticle), 덴드리머(dendrimer), 금 나노입자(gold nanoparticle)일 수 있으며, 보다 구체적으로 유전물질 전달에 일반적으로 사용되는 양이온성 리포좀일 수 있으며, 상기 리포좀은 DC-Chol/DOPE 리포좀, DMRIE/DOPE 리포좀, EDMPC/Chol 리포좀, GL-67/DOPE/DMPE/PEG 리포좀, 또는 DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 리포좀일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 전달체는 T7 RNA 폴리머라제(polymerase) mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 모두 포함하는 것으로, 세포 내에 전달되어 T7 RNA 폴리머라제 발현 루프를 수행하여 세포질내 T7 RNA 폴리머라제의 발현 및 그에 따른 유전자 발현 억제인자(shRNA)의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

상기 전달체는 DOPC로 구성된 리포좀일 수 있으며, T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 DOPC를 1:5 내지 1:10(w/w)의 비율, 보다 구체적으로 1:10의 비율로 혼합하여 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편:T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편:T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA = 0.4:1:1의 몰비(molar ratio) 조건에서 상기 올리고뉴클레오티드와 DOPA를 각각 1:5, 1:7.5 및 1:10의 비율로 혼합하여 제조하였고, 그 결과 상기 비율이 1:10일 경우 대부분의 올리고뉴클레오티드가 DOPC 리포좀 전달체 내에 탑제될 수 있음을 확인하였다(도 3의 A).

본 발명의 조성물을 포함하는 상기 전달체는 단순 합성 siRNA 및 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA가 없는 대조군 대비 표적 유전자 및 상기 유전자로부터 생성되는 단백질의 발현을 장기간 효과적으로 억제시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, B16F10/RFP 세포에 auto_shRFP@LS을 처리하고 일정 시간 경과 후 qRT-PCR를 수행하여 표적 유전자인 RFP mRNA의 변화량을 측정한 결과, 적어도 10일 동안 합성 RFP siRNA 및 대조군인 auto(-)_shRFP@LS 대비 RFP mRNA의 현저한 감소가 있음을 확인하였다(도 4의 A). 또한, B16F10/RFP 세포에 auto_shRFP@LS를 처리하고 일정 시간 경과 후 RFP 단백질의 변화량을 측정한 결과, 대조군인 RFP@LS 대비 auto_shRFP@LS를 처리한 경우 10일 동안 RFP 단백질의 현저한 감소가 있음을 확인하였다(도 4의 B). 아울러 유세포분석(flow cytometry)을 통한 RFP 단백질의 발현 정도를 평가한 경우에도, siRFP 및 대조군인 auto(-)_shRFP@LS 대비 auto_shRFP@LS를 처리한 경우 적어도 10일 동안 RFP 형광신호의 현저한 감소를 확인하였다(도 4의 C).

또한, 본 발명의 조성물을 포함하는 상기 전달체는 기존의 핵-의존적 shRNA 발현 시스템 대비 표적 유전자 및 상기 유전자로부터 생성되는 단백질의 발현을 장기간 효과적으로 억제시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 기존의 핵-의존적 shRNA 발현을 위한 플라스미드 DNA(pSuper_shRFP@LS) 대비 auto_shRFP@LS의 유전자 억제 효과를 평가한 결과, auto_shRFP@LS를 처리한 경우에 적어도 7일 이상 동안 RFP mRNA의 현저한 감소가 있음을 확인하였다(도 4의 D). 또한 유세포분석(flow cytometry)을 통한 RFP 단백질의 발현 정도를 평가한 경우에도, auto_shRFP@LS를 처리한 세포는 4일째에서도 보다 효과적인 단백질 발현 감소가 있음을 확인하였다(도 4의 E).

본 발명에 있어서, 상기 전달체는 암 조직에 선택적으로 축적되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 암은 폐암, 위암, 결장암, 유방암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 두경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨 림프종(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 전립선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장골반암, 혈액암, 뇌암, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, B16F10 암세포를 마우스에 접종한 후, 형광 표지된 본 발명의 전달체(Cy5.5-auto_shRFP@LS)의 투여하고 주요 장기와 종양 조직을 적출하여 Cy5.5-auto_shRFP@LS의 축적 정도를 평가한 결과, 대조군인 형광표지된 Cy5.5-siRFP를 투여한 경우에는 신장에서의 축적이 가장 높았으나, Cy5.5-auto_shRFP@LS 나노입자를 투여한 경우에는 종양 조직에서의 축적이 가장 높음을 확인하였다(도 5). 즉, 이러한 결과는 본 발명의 조성물을 포함하는 전달체가 EPR 효과에 의해 유전자 발현 억제인자를 암 조직에 장기간 선택적, 지속적으로 전달할 수 있음을 나타내는 것이다.

또한, B16F10/RFP 암세포를 마우스에 접종한 후 auto_shRFP@LS를 투여하여 RFP 형광세기의 변화를 관찰한 결과, 대조군 대비 시간 경과(~6일)에 따른 암 조직에서의 형광세기 및 상대적인 RFP mRNA 발현 수준이 현저히 억제됨을 확인하였다(도 6의 A 내지 E). 즉, 이러한 결과는 본 발명의 조성물을 포함하는 전달체는 6일 이상의 기간 동안에도 암 조직에서의 표적 유전자를 효과적으로 억제할 수 있음을 나타내는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태로, 상기 유전자 발현 억제인자의 전달체의 제조방법을 제공한다. 상기 T7 RNA 폴리머라제, 자가증폭, 플라스미드 DNA, 유전자 발현 억제인자, 조성물, 및 전달체에 관한 내용은 전술한 바와 같다.

구체적으로, 상기 제조방법은 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 각각 제조하는 단계; 및 상기 mRNA 단편; 플라스미드 DNA 및 DNA 단편을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 DOPC를 혼합하는 단계를 포함할 수 있으며, 추가로 상기 혼합하는 단계 이후 유리 올리고뉴클레오티드를 여과하여 제거하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 혼합하는 단계에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드와 DOPC를 1:5 내지 1:10(w/w)의 비율로 혼합할 수 있으며, 보다 구체적으로 1:10의 비율로 혼합하여 제조할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편:T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편:T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA = 0.4:1:1의 몰비(molar ratio)로 혼합될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 본 발명의 리포좀 전달체는 세포질 내에서 핵-비의존적 및 지속적인 T7 RNA 폴리머라제 자가증폭을 통해 shRNA의 발현을 향상시키고, 이를 암 조직 선택적으로 장기간 전달할 수 있는바, 투여 회수를 줄이면서도 장기간의 유전자 발현 억제가 요구되는 만성 질환의 치료 목적으로 활용될 수 있다.

도 1의 A는 본 발명에 따른 T7 polymerase의 pT7/T7 polymerase 자가증폭 및 발현된 T7 polymerase에 의한 shRNA의 세포질내 발현 메커니즘에 대한 모식도이고,
도 1의 B는 T7 polymerase에 의한 shRNA의 세포질 발현이 가능한 pT7/shRNA DNA 단편의 모식도 및 발현되는 shRNA의 2차원적 구조를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA(auto_T7pol plasmid)의 제조를 위해 사용된 pT7CFE1-NHis 플라스미드(Thermo Fisher)의 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 3의 A는 지속적인 세포질내 shRNA 발현시스템을 구성하는 3가지 oligonucleotide에 대하여, pT7/shRNA DNA template: 5′-capped T7pol mRNA:auto_T7pol plasmid DNA=0.4:1:1의 몰비로 고정한 후, 3가지 oligonucleotide의 일정한 양과 DOPC 리포좀을 특정 결합비율(1:0, 1:5, 1:7.5, 1:10, w/w)로 결합한 후에 1.5% 아가로스겔 전기영동한 결과이다. 1:10 (w/w)의 결합비율에서 대부분의 oligonucleotides는 DOPC 리포좀과 복합체를 형성할 수 있음을 보여준다.
도 3의 B는 표적유전자 RFP를 사일런싱할 수 있는 RFP shRNA (shRFP) 서열을 포함하는 oligonucleotides/DOPC 복합체 (auto_shRFP@LS)를 Dynamic light scattering을 이용하여 직경을 측정한 결과이며, 최적의 결합 비율 (1:10, w/w)에서 31.4 nm의 직경을 보여준다.
도 3의 C는 MTT assay를 이용하여 B16F10/RFP 세포에서의 auto_shRFP@LS의 세포독성을 조사한 결과를 보여준다. 24시간 혹은 48시간 후의 세포독성을 조사하였을 경우, auto_shRFP@LS는 약 60 μg/mL의 고농도에서도 세포독성은 관찰되지 않았다.
도 3의 D는 flow cytometry를 이용하여 B16F10 세포에서 Cy5.5-labeled auto_shRFP@LS의 세포투과를 조사한 결과는 보여준다. transfection한지 1시간 후 결과로서 Cy5.5-labeled auto_shRFP@LS이 효과적으로 대부분의 세포들에 투과되었음을 보여준다.
도 3의 E는 공초점 형광현미경을 이용하여 Cy5.5-labeled auto_shRFP@LS가 효과적으로 세포질 안으로 투과됨을 보여준다.
도 3의 F는 다양한 면역자극물질을 처리한 human peripheral blood mononuclear cells (PBMC)에서의 4시간 혹은 24시간이 경과한 후에 innate immune response에 의한 TNF-α release 및 INF-α release 를 보여준다; PBS (5 μM), auto_shRFP@LS (15 μg/mL), 지질다당류(lipopolysaccharides, 55 ng/mL), 혹은 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(oligodeoxynucleotides, 6 μM). lipopolysaccharides은 TNF-α 대한 positive control로 사용되었고, CpG oligodeoxynucleotide은 INF-α대한 positive control로 사용되었다.
도 4의 A는 auto_shRFP@LS를 처리한 B16F10/RFP 세포에서 자가증폭하는 T7 polymerase의 세포질 발현량을 T7 polymerase 항체를 이용하여 시간에 따라 측정한 결과를 보여준다. 대조군으로는 도 1의 A의 auto_T7pol plasmid가 생략된 auto(-)_shRFP@LS를 처리한 세포에서의 T7 polymerase 발현량을 측정하였다. 자가증폭이 가능한 auto_shRFP@LS는 적어도 9일 이상동안 고농도의 T7 polymerase을 발현하였으나, 자가증폭이 불가능한 auto(-)_shRFP@LS은 이보다 T7 polymerase 발현효율이 낮았음을 보여준다.
도 4의 B는 siRFP-specific small RNA TaqMan assay 방법을 이용한 합성 RFP siRNA (siRFP) guide strand 농도와 CT (Cycle Threshhold) value 사이의 standard curve를 보여준다. 이러한 standard curve를 이용하면 CT value 측정을 통해 세포내의 siRNA 농도 측정이 가능하다.
도 4의 C는 siRFP-specific small RNA TaqMan assay 방법을 이용하여, auto_shRFP@LS를 처리한 B16F10/RFP 세포에서 생성된 shRFP가 RNAi machinery에 의하여 active 분자형태인 siRNA로 변환된 것을 정량화한 결과를 보여준다. 도 3의 B에서 준비된 standard curve와 세포내의 siRFP가 보여주는 CT value에 기반하여 세포내에 존재하는 siRFP의 양을 측정한 결과에 따르면, auto_shRFP@LS는 13일 이상 동안 고농도의 siRFP가 세포내에 존재함을 보여주고 있으나, T7 polymerase의 자가증폭이 불가능한 auto(-)_shRFP@LS는 현저히 저조한 효율로 siRFP를 생성하고 있음을 보여준다.
도 5의 A는 auto_shRFP@LS을 처리한 B16F10/RFP 세포에서 표적유전자인 RFP 유전자 mRNA가 시간에 따라 감소하는 것을 qRT-PCR 방법을 이용하여 정량한 결과를 보여준다. 대조군으로 합성 RFP siRNA를 이용한 siRFP@LS(실시예 2의 방법으로 DOPC 리포좀 형태로 제조) 및 auto(-)_shRFP@LS을 사용하였다. auto_shRFP@LS은 적어도 10일에서 RFP mRNA의 뚜렷한 감소를 유도하였으나, siRFP@LS은 4일 동안에서만 RFP mRNA의 감소가 관찰되었다. 한편, auto(-)_shRFP@LS은 적어도 10일에서 RFP mRNA의 뚜렷한 감소를 유도할 수 있었으나 그 감소효율은 auto_shRFP@LS 보다 현저히 뒤떨어짐을 관찰할 수 있었다.
도 5의 B는 auto_shRFP@LS을 처리한 B16F10/RFP 세포에서 RFP 단백질이 시간에 따라 감소함을 RFP 항체를 이용하여 Western blot 방법으로 측정한 결과이다. auto_shRFP@LS은 적어도 10일에서 RFP 단백질의 뚜렷한 감소를 유도하였으나, 대조군으로 사용된 siRFP@LS은 약 3일 동안만 뚜렷한 RFP 단백질의 감소를 보여주었을 뿐 4일째부터는 원래의 RFP 단백질 수준으로 회복되었다.
도 5의 C는 flow cytometry를 이용하여 auto_shRFP@LS을 처리한 B16F10/RFP 세포에서 형광단백질 RFP의 형광세기가 시간에 따라 억제되는 것을 정량적으로 측정한 결과를 보여준다. auto_shRFP@LS은 적어도 10일에서 뚜렷한 RFP 형광세기의 감소가 관찰되었으나, 대조군으로 이용된 siRFP@LS은 이러한 형광세기 감소가 7일째부터는 관찰되지 못하였다. 또한 대조군으로 이용된 auto(-)_shRFP@LS은 7일 동안 RFP 형광세기의 감소가 관찰되었으나 그 감소효율은 auto_shRFP@LS에 비해 현저히 뒤떨어짐을 관찰할 수 있었다.
도 5의 D는 HI promoter에 기반하여 핵-의존적 shRNA 발현이 가능한 pSuper_shRFP plasmid@LS와 핵 비의존적 세포질 shRNA 발현이 가능한 auto_shRFP@LS의 B16F10/RFP 세포내에서의 RFP mRNA 감소능력을 비교한 결과를 보여준다. pSuper_shRFP plasmid@LS은 약 3일 동안 RFP mRNA의 감소를 유도하였으나, auto_shRFP@LS은 적어도 7일 동안 뚜렷한 RFP mRNA의 감소를 유도하였음을 보여준다.
도 5의 E는 flow cytometry를 이용하여 pSuper_shRFP plasmid@LS와 auto_shRFP@LS을 B16F10/RFP 세포에 각각 처리한 후 RFP 형광세기의 감소를 측정한 결과를 보여준다. pSuper_shRFP plasmid@LS은 3일 동안만 RFP 형광세기의 감소를 유도할 수 있는 반면, auto_shRFP@LS은 이보다 오랜기간동안 RFP 형광세기의 감소를 유도하였다.
도 6는 형광표지된 Cy5.5-labeled auto_shRFP@LS를 정맥주사한 지 24시간이 경과한 마우스에서 적출한 장기 및 암 조직에서의 Cy5.5 형광세기를 측정한 결과를 보여준다. 대조군으로 이용된 Cy5.5-labeled siRFP@LS는 대부분이 신장에 축적된 반면, Cy5.5-labeled auto_shRFP@LS은 비록 신장과 간에서의 축적이 함께 관찰되었으나 암 조직에서 가장 많이 축적되었다.
도 7의 A는 auto_shRFP@LS를 정맥주사한 B16F10/RFP tumor-bearing mice에서 시간에 따른 암 조직에서의 RFP 단백질 형광세기의 감소를 시간 (0, 3, 4, 5, 6일)에 따라 측정한 결과를 보여준다. 정맥주사는 한 번만 이루어졌으며, 대조군으로 PBS 버퍼 및 siRFP@LS가 정맥주사되었다.
도 7의 B는 도 6의 A의 결과를 정량적으로 나타낸 것이다. 대조군으로 이용된 PBS 버퍼를 정맥주사한 마우스에서는 시간에 따라 암 조직이 성장하고 이에 비례하여 암 조직에서의 RFP 형광세기가 증가하였다(도 6의 B). siRFP@LS를 정맥주사한 마우스에서는 약 3일 동안 암 조직에서의 RFP 형광세기가 억제됨을 보여주었으나 4일째부터는 다시 형광세기가 증가됨을 관찰할 수 있었다. 그러나 auto_shRFP@LS를 정맥주사한 마우스에서는 관찰기간 6일 내내 형광세기가 억제되고 있음을 관찰할 수 있었다.
도 7의 C는 도 6의 A에서의 마우스에서 정맥주사한지 6일이 경과한 후에 암 조직을 적출한 후 RFP 형광세기를 측정한 결과를 보여준다. siRFP@LS를 정맥주사한 마우스에서 적출된 암 조직에서의 RFP 형광세기는 PBS 버퍼를 정맥주사한 마우스에서 적출된 암 조직에서의 RFP 형광세기와 비슷하였으나, auto_shRFP@LS를 정맥주사한 마우스에서 적출된 암 조직에서는 현저히 감소된 RFP 형광세기를 관찰하였다.
도 7의 D는 도 6의 C에서 적출된 암 조직에 대해 RFP 항체를 이용하여 immunohistochemistry 분석을 한 결과를 보여준다. PBS 버퍼 및 siRFP@LS를 정맥주사한 마우스에서 적출된 암 조직에서는 많은 양의 RFP 단백질 존재가 관찰되고 있으나(갈색으로 염색됨), auto_shRFP@LS를 정맥주사한 마우스에서 적출된 암 조직에서는 RFP 단백질의 뚜렷한 감소를 알 수 있다.
도 7의 E는 도 6의 C에서 적출된 암 조직에서의 상대적인 RFP mRNA양을 qRT-PCR 방법을 이용하여 정량화한 결과를 보여준다.
도 8은 5′-capped T7pol mRNA와 5′-cap-free T7pol mRNA의 상대적 분자량 차이를 agarose gel electrophoresis를 이용하여 보여주는 결과이다. 이러한 밴드의 상대적인 이동차이는 5′-cap의 분자량 차이로 인해 발생한다.
도 9은 H1 promoter 기반의 핵-의존적 shRNA 발현 시스템인 pSuper_shRFP plasmid의 모식도 및 발현되는 shRFP 서열의 2차원적 구조를 예측한 결과이다.
도 10는 auto_shRFP@LS를 정맥주사한 C57BL/6J mice에서의 proinflammatory cytokine induction을 조사하기 위하여 정맥주사한지 1시간 혹은 24시간 경과후의 마우스 혈액샘플에서 측정한 TNF-α 및 INF-α의 결과를 보여준다. 대조군으로는 siRFP@Lipofectamine 및 PBS 버퍼가 이용되었다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 지속적 shRNA 세포질 발현이 가능한 pT7/T7 폴리머라제 시스템 디자인 및 제조

1-1. 지속적인 T7 폴리머라제의 세포질 내 자가증폭이 가능한 auto_T7pol plasmid 디자인

pT7CFE1-NHis plasmid (Thermo Fisher)의 멀티클로닝 자리의 BamHI/XhoI 자리를 이용하여 T7 polymerase 유전자 (GenBank accession no. FJ881694.1)를 삽입하기 위하여, 우선 E. coli BL21 (DE3) (Novagen, US) chromosomal DNA를 template로 이용하여 PCR 방법으로 T7 polymerase 유전자를 증폭하였다. 이때 양 말단은 BamHI/XhoI site sequences가 포함되어 있다. 증폭된 PCR product는 BamHI/XhoI 제한효소처리를 한 후 T4 DNA ligase를 이용하여 pT7CFE1-NHis plasmid에 삽입되었다. 이 때 T7 polymerase 유전자는 pT7CFE1-NHis plasmid에서 제공하는 T7 promoter와 viral IRES element의 downstream에 위치하면서, 동시에 polyA 서열 및 T7 termination 서열의 upstream에 위치하게 된다(T7 promoter/viral IRES element/T7 polymerase/polyA tail/T7 termination). 본 실시예에서 제조한 auto_T7pol plasmid의 디자인을 도 1의 A에 나타냈다.

1-2. 세포질 내 shRNA 발현용 DNA template 및 최초 T7 polymerase 공급용 5'-capped T7pol mRNA의 제조

상기 실시예 1-1에서 발현되는 T7 polymerase가 결합하여 shRNA를 발현할 수 있는 pT7/shRNA DNA template를 제조하기 위하여, 아래 서열번호 6과 7(표 1)을 화학합성법에 의하여 합성하였다(Bioneer 외주업체 의뢰). T7 promoter는 소문자, RFP siRNA 서열은 bold체, hairpin의 loop 서열은 밑줄로 표시하였다.

[표 1]

상기 실시예 1-1의 auto_T7pol plasmid에서 T7 polymerase의 자가증폭을 시작하기 위해서는 최초 T7 polymerase 공급이 필요한데, 본 발명에서는 낮은 핵막투과 문제를 해결하기 위하여 5′-capped T7pol mRNA을 이용하였다. 5′-capped T7pol mRNA을 합성하기 위하여, 먼저 T7 promoter-T7 polymerase 서열을 가지는 dsDNA template를 화학합성법에 의하여 합성하였다(Bioneer 외주업체 의뢰). 이러한 T7 promoter-T7 polymerase DNA template에 대하여 HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (NEB)를 이용하여 5′-capped T7pol mRNA를 시험관 내에서 합성할 수 있었다. 보다 구체적으로, anti-reverse cap analog (ARCA) (3′-O-Me-7mG(5′)ppp(5′)G cap analog라고도 부름)을 in vitro transcription 반응시 4가지 standard NTP와 함께 넣어주는데, 이때 ARCA:GTP=4:1의 몰비를 사용하였다. dsDNA template를 제거하기 위해서 DNA nuclease를 첨가하였고, 남아있는 5′-capped T7pol mRNA는 LiCl 추출법과 에탄올 침전법을 이용하여 정제하였다. 대조군으로 5′-cap-free T7pol mRNA 합성은 동일한 T7 promoter-T7 polymerase DNA template에 대하여 MEGAscript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 실시하였다. 합성된 5′-capped T7pol mRNA와 5′-cap-free T7pol mRNA 사이의 5'-cap의 분자량 차이는 agarose gel electrophoresis를 실시하여 확인하였다(도 7).

1-3. H1 promoter 기반 핵-의존적 shRNA 발현용 pSuper_shRFP plasmid 제조 (대조군으로 이용)

핵에서 H1 promoter에 의하여 shRNA를 발현할 수 있는 pSuper_shRFP plasmid를 제조하기 위하여, 양 말단에 BglII and XhoI 제한효소 서열을 포함하는 아래 서열번호 8과 9를(표 2) 화학합성법에 의하여 합성하였다(Bioneer 외주업체 의뢰). RFP siRNA 서열은 밑줄표시, 헤어핀(hairpin) 구조의 루프(loop) 부분의 서열은 소문자로 표시하였다.

[표 2]

이러한 dsDNA를 BglII and XhoI 제한효소로 처리한 후 T4 DNA ligase를 이용하여 pSuper_basic plasmid (OligoEngine)의 멀티클로닝 자리의 BglII/XhoI 자리에 삽입하였다(도 8). pSuper_shRFP plasmid에 의하여 핵에서 발현되는 shRFP hairpin의 2차원적 구조는 도 8에 표시하였다.

실시예 2. 지속적 shRNA 세포질 발현 시스템을 탑제한 DOPC 리포좀 전달체 제조

지속적 shRNA 세포질 발현시스템을 탑제한 DOPC 리포좀을 제조하기 위하여, 먼저 DOPC 리피드 26.5 μg을 상기 실시예 1-1에서 제조한 auto_T7pol plasmid 1.875 μg, 상기 실시예 1-2에서 제조한 pT7/shRNA DNA template 0.15 μg 및 5′-capped T7pol mRNA 0.625 μg과 과량의 t-butanol에서 혼합하여 혼합물을 제조하였다. Tween 20:oligonucleotides/DOPC=1:19 (w/w)의 조건에서 Tween 20을 위의 혼합물에 첨가한 후 유기 용매를 제거하기 위해 aceton/dry ice bath에서 동결건조(lyophilize)하였다. 다음으로, 0.9% saline 용액을 이러한 동결건조된 혼합물에 첨가한 후, amino ultracentrifuge filter (30K MWCO, Millipore)을 이용하여 리포좀에 탑제되지 않은 유리 oligonucleotide를 제거하였다. Nanodrop spectrophotometer를 이용하여 필터를 통과한 유리 oligonucleotide의 양을 측정할 때 리포좀에 탑제된 oligonucleotide (oligonucleotide/DOPC 리포좀 복합체)의 농도는 150 μg/mL이었다.

실시예 3. 지속적 shRNA 세포질 발현 시스템을 탑제한 DOPC 리포좀 전달체의 생물리화학적 특성 조사

pT7/shRNA DNA template:5′-capped T7pol mRNA:auto_T7pol plasmid DNA=0.4:1:1 (molar ratio)의 조건에서 total oligonucleotides:DOPC=1:10 (w/w)의 조건을 만족할 때 대부분의 oligonucleotide가 DOPC 리포좀에 탑제될 수 있음을 아가로스 겔을 이용한 전기영동을 이용하여 확인하였다(도 2의 A). dynamic light scatter를 이용하여 파티클 사이즈를 측정하였을 때 oligonucleotide/DOPC 리포좀 복합체(auto_shRNA@LS)는 31.4 nm의 직경을 갖는다는 것을 알 수 있었다(도 2의 B).

도 2C에서 보여지듯이, auto_shRFP@LS의 세포내 생체적합성을 조사기 위하여 MTT 분석을 수행하였다(Choi, Y. H.; Liu, F.; Kim, J. S.; Choi, Y. K.; Park, J. S.; Kim, S. W. J. Control. Rel. 1998, 54, 39-48). 구체적으로, 기하급수적인 증가 단계(Exponential growth phase)에 있는 B16F10/RFP 세포를 96-웰 플레이트에서 웰당 20,000 세포가 되도록 키운 후, 상기 실시예 2에서 제조한 auto_shRFP@LS을 다양한 농도로 각 웰에 처리하고 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. MTT 용액(0.5mg/mL)을 웰 당 200uL씩 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 후 DMSO 200uL를 넣고 10분간 반응시키고 570nm 파장에서 ELISA를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 상기 auto_shRFP@LS 나노입자는 B16F10/RFP 세포에서 24 시간 혹은 48시간 배양시간 모두에서 60 μg/mL까지 우수한 생체적합성을 보여주었다(도 2의 C).

auto_shRFP@LS 나노입자의 세포내 투과성을 조사하기 위하여 Cy5.5 형광체가 결합된 auto_shRFP@LS 나노입자를 B16/F10 세포에 처리하고 1시간 후에 flow cytometry와 공초점 형광현미경으로 분석하였다(도 2의 D 및 2의 E). 유세포 분석(flow cytometry) 결과, 처리한지 1시간 후에 B16/F10 세포에 대부분의 Cy5.5 형광체가 결합된 auto_shRFP@LS 나노입자가 세포투과되었음이 관찰되었다. 공초점 형광현미경 분석에서, 처리한지 1시간 후에 B16/F10 세포에 Cy5.5 형광체가 결합된 auto_shRFP@LS 나노입자가 다수가 세포질로 투과됨을 관찰할 수 있었다.

본 발명의 oligonucleotide 혹은 oligonucleotide/DOPC 전달체가 일으킬 수 있는 선천 면역원성(innate immunogenicity)을 조사하기 위하여 human PBMC 세포에서 auto_shRFP@LS 나노입자를 처리하고 나서, 4시간 혹은 24시간 후에서의 TNF-α 및 INF-α induction을 조사하였다(도 2의 F). 그 결과, TNF-α induction을 일으키는 lipopolysaccharide에 비교하여 auto_shRFP@LS 나노입자는 TNF-α induction을 일으키지 않았다. INF-α induction을 조사하였을 때, CpG oligodeoxynucleotide이 상당히 많은 양의 INF-α을 분비하는 것에 비해, auto_shRFP@LS 나노입자는 거의 INF-αinduction을 일으키지 않았다. 이러한 결과들은 auto_shRFP@LS 나노입자가 innate immunogenicity을 자극하지 않음을 알 수 있으며 따라서 임상적용 시에 정맥주사가 가능함을 보여준다.

실시예 4. 변형된 pT7/T7 polymerase system을 이용한 T7 polymerase 발현 지속성 실험

auto_shRFP@LS을 처리한 B16F10/RFP 세포에서 시간에 따른(1, 3, 5, 7, 9일 동안) T7 polymerase의 세포질 발현을 T7 polymerase 항체를 이용하여 western blot 방법으로 조사하였다(도 3의 A). 언급된 특정시간 동안 auto_shRFP@LS이 처리된 세포를 cocktail protease inhibitor가 포함된 RIPA 버퍼로 lysis한 뒤 원심분리를 이용하여 단백질 샘플을 준비하였다. 이러한 샘플들은 10% SDS-PAGE 전기영동을 한 후 PVDF 멤브레인으로 transfer하였다. 이러한 멤브레인은 비특이적 염색을 예방하기 위해 0.2% Tween-20 및 5% dry milk에서 blocking을 한 후, T7 polymerase 항체로 1차 염색, HRP가 결합된 2차 항체로 2차 염색을 하고 chemiluminescence를 이용하여 인화하였다.

도 3의 A에서 보여지듯이, T7 polymerase은 세포질 내에서 적어도 9일 이상 고농도로 유지되었는데, 이것은 5′-capped T7 polymerase mRNA와 IRES element이 pT7/T7 polymerase system에 결합되어 T7 polymerase의 효율적인 자가증폭이 가능한 결과이다. 초기에 세포에 transfect된 5′-capped T7 polymerase mRNA은 세포질 내 리보솜을 포함하는 translational machinery에 의하여 T7 polymerase을 발현하고 이러한 T7 polymerase은 auto_T7pol plasmid의 T7 promoter에 결합함으로써 반복적으로 cytoplasmic T7 polymerase transcript를 생성하게 된다.

그 결과, 대조군으로 auto_T7pol plasmid가 결핍된 auto(-)_shRFP@LS을 처리한 세포에서는 이러한 T7 polymerase의 세포질 내 자가증폭이 불가능함으로 인하여 세포질 내에 발현되는 T7 polymerase의 농도가 상대적으로 낮았다(도 3의 A). 또한, auto_T7pol plasmid에서 IRES element를 제거한 경우에는 auto(-)_shRNA@LS과 비슷한 수준의 세포질 내 T7 polymerase 양을 관찰하였다. 이러한 결과들은 IRES element와 5′-capped T7 polymerase mRNA를 포함하는 변형된 pT7/T7 polymerase system이 지속적으로 장기간에 걸쳐(적어도 9일 이상) T7 polymerase을 세포질에서 발현 가능하게 함을 보여준다.

실시예 5. Auto_shRFP@LS에 의한 장기간 세포질 내 shRNA 발현 및 이들의 siRNA로의 변환 조사

auto_T7pol plasmid 및 5′-capped T7 polymerase mRNA에 의한 T7 polymerase의 자가증폭 결과로 세포질에서 장기간 고농도로 유지되는 T7 polymerase이 반복적으로 pT7/shRNA DNA template의 T7 promoter에 결합함으로써 shRNA 발현이 장기간 지속적으로 유지되고 이러한 shRNA는 실제 유전자 사일런싱에 참여하는 siRNA 형태로 변환되는 것을 small RNA-specific TaqMan assay 방법을 이용하여 조사하였다(도 3의 B 및 3의 C).

먼저, 세포질에 존재하는 siRNA의 양을 측정하기 위하여 Custom TaqMan® Small RNA assay kit를 이용하여 합성 RFP siRNA의 guide strand에 대하여 standard curve를 작성하였다(도 3의 B). 구체적으로, 합성 RFP siRNA의 guide strand에 대하여 custom-made siRFP-specific stem-loop TR primers을 이용하여 합성 RFP siRNA의 guide strand의 cDNA를 합성하고 난 후, 생성된 cDNA에 대하여 형광염료가 부착된 custom-made siRFP-specific primers를 이용하여 quantitative PCR(qPCR)을 실시함으로써 합성 RFP siRNA의 guide strand와 amplification pattern 사이의 exponential correlation을 추출하고 이를 도 3B로 제작하였다. 이러한 standard curve에 기반하여, auto_shRFP@LS를 처리한 B16F10/RFP 세포에서 추출한 RNA에 대하여 RFP siRNA의 양을 정량한 결과를 도 3의 C에나타내었다.

보다 구체적으로는, 추출한 약 2 μg RNA에 대하여 custom-made siRFP-specific stem-loop TR primers을 이용하여 RFP siRNA의 cDNA를 합성하고 난 후, 생성된 cDNA에 대하여 형광염료가 부착된 custom-made siRFP-specific primers를 이용하여 quantitative PCR (qPCR)을 실시하여 RFP siRNA와 amplification pattern 사이의 exponential correlation을 추출하였다. 추출된 exponential correlation을 도 3B의 standard curve에 적용하여 세포질 내 RFP siRNA의 양을 측정한 결과를 도 3의 C에 나타내었다.

그 결과, Auto_shRFP@LS를 처리한 세포에서는 적어도 13일 동안 고농도의 siRFP를 관찰할 수 있었으나, 대조군으로 이용된 auto(-)_shRFP@LS을 처리한 세포에서는 이보다 훨씬 적은 농도의 siRFP만을 10일 동안만 측정할 수 있었다. 이러한 결과들은 auto_shRFP@LS을 이용한 세포질 내 shRNA의 발현이 장기간에 걸쳐서 이루어지고 있으며, 생성된 shRNA 분자들은 dicer를 포함하는 세포질 내 RNAi machinery에 의하여 효과적으로 siRNA 분자들로 변환되었음을 보여준다.

실시예 6. Auto_shRNA@LS 나노입자의 in vitro 유전자 사일런싱(gene silencing) 조사

B16F10/RFP 세포에 auto_shRFP@LS을 처리(최종농도 15 μg/mL)하고 3, 4, 7, 10, 13일 경과한 후 qRT-PCR를 수행하여 표적유전자인 RFP mRNA의 변화량을 측정하였다. 구체적으로, RFP mRNA에 매칭될 수 있는 프라이머(정방향 프라이머 5’- GCGTGATGAACTTCGAGGA-3’ (서열번호 10) 및 역방향 프라이머 5’-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3’ (서열번호 11)), 및 대조군 실험을 위한 β-actin과 매칭되는 프라이머 (정방향 프라이머 5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3' (서열번호 12) 및 역방향 프라이머 5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3' (서열번호 13))를 이용하여 세포 내의 RFP 유전자의 mRNA의 양을 정량하기 위한 qRT-PCR을 수행하였다(변성 단계 95℃/30초, 어닐링 단계 51℃/30초, 신장 단계 72℃/30초, 20 사이클). 대조군으로는 합성 RFP siRNA를 탑제한 siRFP@LS(최종농도 siRFP 50 nM)을 처리한 후 동일한 시간이 경과한 후 RFP mRNA의 변화량을 측정하였다.

그 결과, 합성 RFP siRNA가 탑제된 siRFP@LS를 처리한 경우 4일 동안 RFP mRNA의 감소를 관찰하였고 6일째에서는 RFP mRNA의 양이 원래로 회복되었다. 그러나 auto_shRFP@LS을 처리한 경우 적어도 10일 동안 RFP mRNA의 감소가 현저하게 관찰되었다. 대조군으로 auto(-)_shRFP@LS를 처리한 경우 RFP mRNA의 감소가 10일 동안 관찰되었으나 그 감소 정도는 auto_shRFP@LS와 비교시 매우 낮았다(도 4의 A). 즉, auto_shRFP@LS은 지속적으로 shRFP를 생성함으로써 RFP mRNA를 적어도 10일 동안 효과적으로 분해할 수 있음을 보여준다.

또한, 항-RFP 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하여 auto_shRNA@LS 나노입자의 유전자 사일런싱을 조사하였다. B16F10/RFP 암세포에 auto_shRFP@LS를 처리(최종 농도 15 μg/mL)하고 0, 3, 4, 7, 10일이 경과한 후 RFP 단백질의 변화량을 측정하였다. 대조군으로 siRFP@LS을 처리한 뒤 (최종 농도 50 nM siRFP) 동일시간이 경과한 후에 웨스트 블랏을 수행하여 RFP 단백질의 변화량을 측정하였다. Si

그 결과, siRFP@LS을 처리한 경우 3일 동안만 RFP 단백질의 감소가 관찰되었으나, auto_shRFP@LS를 처리한 경우 10일 동안 전체에서 RFP 단백질의 감소가 관찰되었다(도 4의 B). RFP 단백질의 감소세기도 auto_shRFP@LS를 처리한 경우에 더욱 효과적임을 알 수 있다.

아울러, auto_shRFP@LS 나노입자의 RFP 유전자 사일런싱을 검증하는 또 하나의 방법으로 flow cytometry를 이용하여 세포에서 발현되는 RFP 단백질의 형광신호 억제를 관찰하였다. B16F10/RFP 암세포에 auto_shRFP@LS를 처리(최종 농도 15 μg/mL)하고 0, 3, 4, 7, 10일이 경과한 후 RFP 단백질의 형광신호 세기를 관찰하였다.

그 결과, 대조군으로 siRFP@LS(최종 농도 50 nM siRFP)을 처리한 경우 4일 동안만 RFP 형광신호의 감소를 관찰할 수 있었나, auto_shRFP@LS를 처리한 경우 적어도 10일 동안 RFP 형광신호의 감소를 관찰할 수 있었다. 또한 대조군으로, T7 polymerase의 자가증폭기능이 생략된 auto(-)_shRFP@LS를 처리한 경우 적어도 7일 동안 형광신호의 감소가 관찰되었는데, 그 감소세기는 auto_shRFP@LS를 처리한 경우와 비교할 때 약하였다(도 4의 C). 이러한 결과 역시 auto_shRFP@LS 나노입자가 효과적으로 shRFP를 지속적으로 발현시킴으로써 장기간동안 RFP 유전자 발현을 억제할 수 있음을 보여준다.

도 4 D와 4E는 기존 핵 의존적 shRNA 발현시스템(pSuper_shRFP@LS)과 본 발명의 auto_shRFP@LS을 비교하여 유전자 억제효과 지속기간이 얼마나 차이가 나는지를 비교한 결과를 보여준다. 구체적으로, auto_shRFP@LS 및 pSuper_shRFP@LS을 동일한 농도 (15 μg/mL)로 B16F10/RFP 세포에 처리한 후, 세포안의 감소된 RFP mRNA의 양을 qRT-PCR 방법을 이용하여 측정하였다(도 4의 D).

그 결과, pSuper_shRFP@LS을 처리한 경우, 3일 동안 RFP mRNA의 감소가 관찰되었으나, auto_shRFP@LS를 처리한 경우는 적어도 7일 이상동안 RFP mRNA의 감소가 관찰되었다. 또한, flow cytometry를 이용하여 세포에서의 RFP 형광단백질의 형광세기의 감소를 측정한 경우, pSuper_shRFP@LS을 처리한 세포는 3일 동안에서만 형광세기의 감소가 관찰된 반면, auto_shRFP@LS를 처리한 세포는 4일째에서도 효과적인 형광세기의 감소가 관찰되었다. 이러한 결과들은 기존 핵 의존적 shRNA 발현시스템이 가지는 짧은 유전자 억제 한계점을 본 발명의 auto_shRNA@LS 나노입자가 효과적으로 해결할 수 있음을 보여준다.

실시예 7. auto_shRNA@LS 나노입자의 마우스 xenograft 모델에서의 암 축적성 조사

B16F10 암세포 (1 ⅹ 10⁷)를 5주 주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스의 왼쪽 허벅지에 접종한 후 암조직의 부피가 80 mm³ 정도로 자라도록 하였다. 형광표지된 Cy5.5-auto_shRFP@LS 나노입자를 마우스의 꼬리혈관을 통해 정맥주입(50 μg)하고, 24시간이 경과한 후 주요 장기와 암 조직을 적출하여 IVIS Spectrum (Caliper Life Science Inc., USA)를 이용하여 형광표지된 Cy5.5-auto_shRFP@LS 나노입자의 축적정도를 측정하였다(도 5).

그 결과, 대조군으로 형광표지된 Cy5.5-siRFP를 정맥주사한 경우에는 신장에서의 축적이 가장 높았으나, Cy5.5-auto_shRFP@LS 나노입자를 정맥주사한 경우에는 암 조직에서의 축적이 가장 높음을 확인하였다. 이러한 결과는 EPR 효과에 의하여 auto_shRFP@LS 나노입자가 효과적으로 암 조직에 선택적으로 축적될 수 있음을 보여준다.

실시예 8. auto_shRNA@LS 나노입자의 마우스 xenograft 모델에서의 유전자 사일런싱 조사

RFP 형광단백질을 발현하는 B16F10/RFP 암세포 (1 ⅹ 10⁷)를 5주 주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스의 왼쪽 허벅지에 접종한 후, 암조직이 5-7 mm 크기로 자라서 RFP 형광신호가 강하게 관찰되는 마우스 모델을 준비하였다. Auto_shRFP@LS 나노입자 40 μg을 정맥주사한 후, IVIS Spectrum을 이용하여 일정시간동안 암조직에서의 RFP 형광세기의 변화를 관찰하였다(도 6의 A 및 6의 B). 대조군으로는 PBS 버퍼 혹은 siRFP@LS를 정맥주사한 마우스를 준비하였다.

그 결과, 시간이 경과할수록 PBS 버퍼를 정맥주사한 마우스에서는 암이 자라면서 RFP 형광신호가 이에 비례하면서 증가하였다. 그러나 auto_shRFP@LS를 정맥주사한 마우스에서는 암 조직이 성장하는 반면 암 조직에서의 형광세기는 억제되었다. siRFP@LS를 정맥주사한 마우스에서는 처음 3일 동안은 암에서의 형광세기가 감소되다가 다시 증가하는 것을 관찰하였고 6일째에서의 형광세기는 PBS 버퍼를 정맥주사한 마우스와 비슷함을 관찰하였다. 2~3일 간격으로 반복적으로 정맥주사하는 기존의 siRNA 전달방법과는 다르게, 본 발명의 auto_shRFP@LS 나노입자는 1회성의 정맥주사로도 6일 이상 효과적으로 암 조직에서의 표적유전자를 사일런싱할 수 있음을 보여준다.

정맥주사한지 6일이 경과한 후 마우스에서 암조직을 적출하여 형광신호를 측정한 결과, 대조군 마우스 암조직에서는 강한 RFP 형광신호를 관찰하였으나 auto_shRFP@LS 나노입자를 처리한 마우스에서는 상대적으로 훨씬 감소된 RFP 형광신호가 관찰되었다(도 6의 C). 적출된 암 조직을 항-RFP 항체를 이용하여 immunohistochemical staining을 실시하였을 때 PBS 버퍼 혹은 siRFP@LS를 정맥주사한 마우스 암 조직에서는 많은 양의 RFP 단백질이 염색되었으나, auto_shRFP@LS 나노입자를 처리한 마우스 암 조직에서는 상대적으로 적은 양의 RFP 단백질이 염색되었다(도 6의 D). 또한, 적출된 암 조직에 남아있는 RFP mRNA를 qRT-PCR를 이용하여 정량하였을 때, auto_shRFP@LS 나노입자를 처리한 암 조직에서만 상대적으로 많은 양이 감소된 것을 관찰하였다(도 6의 E).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Modified pT7/T7 polymerase system for sustainable shRNA expression in cytoplasm and liposome transporter comprising it <130> KPA180528-KR <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2655 <212> DNA <213> Bacteriophage T7 <400> 1 atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60 ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120 catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180 gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240 atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300 acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360 accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420 atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480 cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540 gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600 tggtcttcgt 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Claims

5'-cap 구조를 포함하는 T7 RNA 폴리머라제(polymerase) mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는, 지속적인 유전자 발현 억제용 조성물로서,
상기 플라스미드 DNA는 T7 프로모터, IRES(Internal ribosome entry site) 영역, T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자, 폴리 아데닌 꼬리(poly A tail), 및 T7 종결서열이 작동 가능하게 연결되어 구성되는 것이고,
상기 유전자 발현 억제인자는 shRNA인 것인, 지속적인 유전자 발현 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 mRNA 단편은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것인, 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 mRNA 단편은 최초의 T7 RNA 폴리머라제를 공급하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA의 백본은 pT7CFE1-NHis 플라스미드인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 T7 RNA 폴리머라제 발현 루프(loop)의 반복에 의해 상기 T7 RNA 폴리머라제를 자가증폭시키는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 shRNA는 siRNA로 전환되는, 조성물.
삭제
제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 핵-비의존적으로 세포질 내 T7 RNA 폴리머라제의 발현을 증가시켜 유전자 발현 억제인자를 장기간 지속적으로 발현시키는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 유전자 발현 억제인자의 전달체.
제10항에 있어서, 상기 전달체는 리포좀 형태인 것을 특징으로 하는 것인, 전달체.
제11항에 있어서, 상기 리포좀은 DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)로 구성된 리포좀인 것인, 전달체.
제12항에 있어서, 상기 전달체는 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 DOPC를 1:5 내지 1:10(w/w)의 비율로 혼합하여 제조되는 것인, 전달체.
제12항에 있어서, 상기 전달체는 암 조직에 선택적으로 축적되는 것을 특징으로 하는 것인, 전달체.
제12항에 있어서, 상기 전달체는 유전자 발현 억제인자를 장기간 지속적으로 전달하는 것을 특징으로 하는 것인, 전달체.
(a) T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편; 상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA; 및 유전자 발현 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 각각 제조하는 단계;
(b) 상기 mRNA 단편; 플라스미드 DNA 및 DNA 단편을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)를 혼합하는 단계를 포함하는, 유전자 발현 억제인자의 전달체의 제조방법으로서,
상기 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편은 5'-cap 구조를 포함하는 T7 RNA 폴리머라제(polymerase) mRNA 단편이고,
상기 T7 RNA 폴리머라제의 자가증폭을 위한 플라스미드 DNA는 T7 프로모터, IRES(Internal ribosome entry site) 영역, T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자, 폴리 아데닌 꼬리(poly A tail), 및 T7 종결서열(termination)이 작동 가능하게 연결되어 구성되는 것이고,
상기 유전자 발현 억제인자는 shRNA인, 유전자 발현 억제인자의 전달체의 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 (b) 단계 이후 (c) 유리 올리고뉴클레오티드를 여과하여 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 및 DOPC는 1:5 내지 1:10(w/w)의 비율로 혼합되는 것인, 제조방법.