TWI418369B - 以表現ｐｄｘ－１之神經內分泌腫瘤中ｐｄｘ－１致癌基因為標的之新穎治療性ｒｎａ干擾技術 - Google Patents

以表現ｐｄｘ－１之神經內分泌腫瘤中ｐｄｘ－１致癌基因為標的之新穎治療性ｒｎａ干擾技術 Download PDF

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Description

以表現PDX-1之神經內分泌腫瘤中PDX-1致癌基因為標的之新穎治療性RNA干擾技術
本發明大體上係關於一種以基因為標的之癌症療法，且更特定言之，係關於發展一種用於治療胰臟神經內分泌腫瘤之新穎療法及藥物遞送系統。
無意於限制本發明之範圍，由設計及遞送一種作為胰臟神經內分泌腫瘤治療法之靶向PDX-1致癌基因表現的基於shRNA之療法等相關方面闡述先前技術。
胰島增生症總體上係關於自胰島細胞發生之病症，諸如胰臟神經內分泌腫瘤(NET)、胰島瘤、及類癌。胰島細胞腫瘤之5年存活率為35-50%[1,2]。胰島增生症影響相當年輕之患者(診斷年齡50歲)[3,4]。胰島瘤患者特別受苦於失控之低血糖症，而對此仍無有效治療法。低血糖症係由高胰島素症導致，且表現出神經血糖過少症狀，諸如頭痛、眩暈、嗜睡、複視、抽搐及交感神經活化[3]。外科手術仍然為最有效之治療形式，且沒有有效之輔佐療法。當可能同時切除原發性腫瘤及轉移腫瘤時，復發率仍高。此外，無法藉由全身療法改善存活率[5,6]。因此，需要一種新穎且有效之治療方法來治療NET。
PDX-1(胰臟十二指腸同源異型盒-1)係胰臟器官形成之胚胎轉錄因子，其在大多數NET及所有胰島細胞型胰島瘤中過度表現。轉錄因子PDX-1基因直接負責調節良性及惡性胰島瘤中之胰島素分泌[7-10]。於許多表觀上與增殖、分化、及轉移相關之癌症中亦發現其過度表現，且其在NET發展及胰臟胚胎生成中發揮主要作用[7-14]。於成人胰臟中，90% β細胞表現PDX-1，於該等β細胞中已顯示PDX-1調節胰島素、葡糖激酶、及2型葡萄糖轉運體(GLUT2)之表現[15-19]。於急性及慢性兩種高血糖症中，該等基因均對維持葡萄糖動態平衡具有關鍵作用。於急性高血糖症中，PDX-1自β-細胞之細胞質轉移至細胞核，並活化胰島素基因，其係胰島素產生及分泌增加之第一步[20,21]。
本發明者等人已發現PDX-1於許多癌症中過度表現[22-25]。特定言之，本發明人發現，PDX-1於80種以上之胰臟癌及胰島細胞增生症中過度表現[26]。於百分之百之胰島瘤中亦出現PDX-1過度表現。本發明人近日證實，PDX-1調節胰臟癌及胰島瘤細胞株之增殖及擴散[27]。熟習此項技術者咸瞭解，若提供一種可調節癌症中之PDX-1過度表現的組合物及方法，則該等組合物及方法會具有正面價值，且其係對相關技術之實質性貢獻。熟習藥物遞送技術者亦咸瞭解，若提供一種可繞過非標的器官，且遞送治療劑至過度表現PDX-1之標靶器官的遞送系統，則該種遞送系統會在臨床上適用於醫學操作。Brunicardi之美國專利案第6,716,824號(2004)提供一種藉由靶向PDX-1而治療胰臟癌之策略，該專利案係關於一種RIP-tk(大鼠胰島素啟動子-胸苷激酶)構築體之重組核酸，其選擇性靶向胰島素分泌細胞，諸如β-細胞、PDX-1陽性人類胰管癌、及含有某些轉錄因子之其他細胞。Brunicardi之發明適用於治療胰臟癌，諸如β-細胞胰島瘤。
經預臨床研究證實，RNA干擾技術(RNAi)可用於使與癌症相關之標靶沉默[28-38]。於活體內研究中亦已顯示，藉由RNAi靶向對於腫瘤細胞生長[29,39-42]、轉移[43-45]、血管生成[46,47]、及化療藥物耐受性[48-50]具關鍵作用之組分所取得之令人可喜之成果。應用RNAi技術需首先使用兩種分子：經化學合成之雙股小干擾RNA(siRNA)或基於短髮夾RNA(shRNA)之載體。雖然siRNA及shRNA可獲得類似之基因減弱作用，但siRNA與shRNA為本質上不同之分子。shRNA之生物合成途徑與天然存在之小RNA(miRNA)相同，其在加工後轉運至細胞質，並於細胞質中裝載至RNA干擾沉默複合物(RISC)[51]。自細胞核中之基因組DNA合成內源性miRNA之第一轉錄本，其係具髮夾結構之長RNA鏈，且由一系列內源性RNase III酶將其加工成成熟之具21至23個鹼基對之雙股miRNA。至少有兩種RNase III酶複合物參與成熟化過程：首先，Drosha/DGCR8複合物先產生前-miRNA髮夾結構，其在核輸出(nuclear export)後併入RLC，於此處第二種酶Dicer剪切該環，產生成熟miRNA[52]，其係用於裝載RNAi至RISC之效應子分子[53]。
Argonaute(Ago)家族蛋白質通常與細胞質RISC相關。該等蛋白質參與siRNA或miRNA之裝載，且亦參與轉錄時基因沉默(靶向異染色質)及轉錄後基因沉默。裝載至與Ago複合之RISC中的siRNA或miRNA中之引導股藉由序列互補性找出標靶mRNA。於核內經活化之Ago-2裂解mRNA，並起動mRNA降解[54,55]。或者，由與標靶mRNA之3' UTR部份互補結合，透過加工體(processing body，P-body)中之螯合作用而抑制轉譯[56]。於加工體中，已觀察到脫腺苷化會導致標靶mRNA不穩定[57,58]。現已於許多動物模式中強有力地證實，由RNAi介導之基因減弱係強力、具特異性、且耐受性良好。該等結果為RNAi療法轉變成臨床療法提供科學原理。現有至少10種基於RNAi之藥物正在進行早期臨床試驗[59]，其中四種係與癌症相關[60-63]。其他siRNA亦已證實在動物模式中有效[60,61,64]，且在非人類靈長類動物中安全[65]。
美國專利公開案第20090163431號(Kazhdan等人，2009)揭示一種抑制PDX-1之方法及組合物。該發明方法及組合物所包含之抗-PDX-1藥劑包括抗體、適體、反義寡核苷酸、核酶及/或抑制性化合物。本發明提供一種在腫瘤細胞中抑制PDX-1表現的方法，其包括使腫瘤細胞與有效量之抗-PDX-1藥劑接觸，該藥劑係與編碼PDX-1之RNA分子中之特定區域高度或完全互補。該種藥劑可與編碼PDX-1之RNA分子特異性雜交，並抑制腫瘤細胞中之PDX-1基因表現。本發明闡述一種包含抗-PDX-1 siRNA及/或shRNA之組合物。本發明闡述一種根據本發明之可編碼抗-PDX-1 siRNA或shRNA之重組表現構築體。
本發明包括一種PDX bi-shRNA，其係用於同時誘導其標的物之轉譯抑制及轉錄後mRNA降解。PDX bi-shRNA構築體比具相同mRNA標靶特異性之siRNA更高效且更長效。本發明人已說明，減弱PDX-1會誘發細胞凋亡，終止增殖，及減少NET腫瘤細胞擴散，並改善負載癌瘤異種移植物之SCID小鼠的存活率。本發明人亦已證實，多種經靜脈內投與之BIV脂質體PDX-1 shRNA治療法使得SCID小鼠中之人類PC異種移植物近乎完全消融，且已於鼠科動物胰島瘤模式中證實具有反應結果優勢及存活率優勢。
雙層內陷式囊泡(vesicle)(BIV)係一種遞送系統，其中使用暫時經遮蔽之具靶向性之脂質體，藉由其與細胞膜融合而遞送治療劑至細胞中。該等經遮蔽之隱形脂質體因可避免細胞內嗜途徑而獲得較高轉染效力。哥白尼緊縮核酸遞送技術(Copernicus compacted nucleic acid delivery technology)係另一種非病毒性合成之模組平台，其中藉由聚陽離子緊縮DNA或RNA單分子，產生具極高轉染效力之奈米顆粒。本發明人已發展出一種新穎之癌症療法，其係藉由將緊縮之含shRNA之DNA奈米顆粒封裝入經遮蔽而隱形之BIV脂質體。
本發明包括一種表現載體，其包含啟動子及可操作地連接於該啟動子之核酸插入物，其中該插入物編碼一種或多種短髮夾RNA(shRNA)，其能夠與編碼PDX-1轉錄因子之轉錄本之一區域雜交。shRNA與轉錄本結合可經RNA干擾而抑制PDX-1表現。shRNA可具雙功能，同時併入siRNA(裂解依賴性)及miRNA(非裂解依賴性)基元。於本發明之一項實施例中，shRNA為PDX-1表現之裂解依賴性及非裂解依賴性抑制劑。shRNA所標靶之mRNA序列並不限於PDX-1 mRNA轉錄本之3'未轉譯(UTR)區域；於本發明之一項實施例中，shRNA可靶向編碼序列。於一態樣中，該一種或多種shRNA包含選自由以下組成之群之序列：SEQ. ID NO：3、SEQ. ID NO：4、SEQ. ID NO：5、SEQ. ID NO：6、SEQ. ID NO：7、SEQ. ID NO：8、及其組合或經修飾物。
本發明亦提供一種用於遞送shRNAs至PDX-1 mRNA標靶之系統。該遞送系統包含治療劑載體(諸如脂質體)偶聯於表現載體，該表現載體包含啟動子及可操作地連接於該該啟動子之核酸插入物，其中該插入物編碼一或多種短髮夾RNA(shRNA)，其能夠與編碼PDX-1轉錄因子之轉錄本之一區域雜交。該一種或多種shRNA包含選自由以下組成之群之序列：SEQ. ID NO：3、SEQ. ID NO：4、SEQ. ID NO：5、SEQ. ID NO：6、SEQ. ID NO：7、SEQ. ID NO：8、及其組合或經修飾物。shRNA與轉錄本結合可經RNA干擾而抑制PDX-1表現。shRNA可具雙功能，併有siRNA(裂解依賴性)及miRNA(非裂解依賴性)基元。於本發明之一項實施例中，shRNA為PDX-1表現之裂解依賴性及非裂解依賴性抑制劑。shRNA所標靶之mRNA序列並不限於PDX-1 mRNA轉錄本之3'未轉譯(UTR)區域；於本發明之一項實施例中，shRNA可靶向編碼序列。該治療劑載體可為緊縮之DNA奈米顆粒。於一項實施例中，表現載體之DNA可藉由與聚陽離子組合來緊縮。更特定言之，該DNA可藉由與CK30 PEG10k(經10 kD聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸30聚(30-mer)肽)組合來緊縮。該治療劑載體亦可為脂質體，其中DNA可藉由與30聚離胺酸縮合肽組合來緊縮。於一項實施例中，脂質體可為雙層內陷式囊泡(BIV)。脂質體可藉由經「智慧型(smart)」受體靶向部份修飾而特異性靶向標的組織。於一項實例中，靶向部份可為小分子二價β轉折(turn)模擬物。該脂質體可經可逆性遮蔽而迴避非標靶器官。於一項實例中，可逆性遮蔽可藉由諸如正十二烷基-β-D-哌喃麥芽糖苷之小分子量脂質(分子量約500及更低者)包被脂質體而完成。在本發明另一項實施例中，可組合已緊縮之DNA奈米顆粒與脂質體遞送系統。為此，可將含shRNA表現載體之緊縮DNA奈米顆粒囊封於脂質體中。該等含經緊縮之DNA奈米顆粒之脂質體可為BIVs。脂質體可經靶向部份修飾，且亦可經可逆性遮蔽。
於本發明之另一項實施例為一種遞送shRNA至表現PDX-1之標靶組織的方法，其包括如下步驟：(i)製備表現載體，其包括啟動子、及與該啟動子以操作方式連接之核酸插入物，其可編碼一種或多種能夠與可編碼PDX-1之mRNA轉錄本中之一區域雜交的shRNA；(ii)組合表現載體與治療藥劑載體；及(iii)對有需要之患者投與治療有效量之表現載體與治療藥劑載體之複合物。治療藥劑載體可為緊縮之DNA奈米顆粒。於一項實施例中，表現載體中之DNA可藉由與聚陽離子組合而緊縮。更特定言之，DNA可經與CK30 PEG10k組合來緊縮。治療藥劑載體亦可為脂質體。治療藥劑載體亦可為脂質體。於一項實施例中，脂質體可為BIV。脂質體可經過「智慧型」受體靶向部份修飾而特異性靶向標靶組織。於一項實例中，靶向部份可為小分子二價β轉折模擬物。脂質體可經過可逆性遮蔽而繞過非標靶器官。於一項實例中，可藉由諸如正十二烷基-β-D-哌喃麥芽糖苷之小分子量脂質(分子量約500及更低者)包被而完成可逆性遮蔽。本發明另一項實施例中，可組合已緊縮之DNA奈米顆粒與脂質體遞送系統。因此，可將含shRNA表現載體之已緊縮DNA奈米顆粒囊封於脂質體中。該等含緊縮之DNA-奈米顆粒之脂質體可為BIV。脂質體可經過靶向部份修飾，且亦可經可逆性遮蔽。於一態樣中，該一種或多種shRNA包括自如下組成之群中選出之序列：SEQ. ID NO：3、SEQ. ID NO：4、SEQ. ID NO：5、SEQ. ID NO：6、SEQ. ID NO：7、SEQ. ID NO：8、及其組合或經修飾物。
本發明亦提供一種使標靶細胞中之PDX-1表現沉默之方法，該方法包括如下步驟：(i)選擇標靶細胞；及(ii)以表現能夠與編碼PDX-1之mRNA轉錄本中之一區域雜交的一種或多種shRNA之載體轉染該標靶細胞，其中以載體轉染癌細胞可藉由RNA干擾而抑制PDX-1表現。shRNA可具雙功能：同時併入裂解依賴性及非裂解依賴性基元。於本發明之一項實施例中，shRNA同時為PDX-1表現之裂解依賴性及非裂解依賴性抑制劑。shRNA之標靶mRNA序列並不限於PDX-1 mRNA轉錄本中之3'未轉譯(UTR)區域；於本發明之一項實施例中，shRNA可靶向編碼序列。該一種或多種shRNA包括自如下組成之群中選出之序列：SEQ. ID NO：3、SEQ. ID NO：4、SEQ. ID NO：5、SEQ. ID NO：6、SEQ. ID NO：7、SEQ. ID NO：8、及其組合或經修飾物。
本發明亦包括一種抑制癌症患者中之腫瘤細胞生長之方法，包括如下步驟：(i)鑑別出需要治療腫瘤之患者；及(ii)以表現能夠與編碼PDX-1之mRNA轉錄本中之一區域雜交之一種或多種shRNA的載體轉染該腫瘤細胞，其中經轉染載體之腫瘤細胞經歷細胞凋亡、停止增殖、或減少擴散。shRNA可具雙功能：同時併入裂解依賴性及非裂解依賴性基元，並包括自如下組成之群中選出之序列：SEQ. ID NO：3、SEQ. ID NO：4、SEQ. ID NO：5、SEQ. ID NO：6、SEQ. ID NO：7、SEQ. ID NO：8、及其組合或經修飾物。於本發明之一項實施例中，shRNA同時為PDX-1表現之裂解依賴性及非裂解依賴性抑制劑。shRNA之標靶mRNA序列並不限於PDX-1 mRNA轉錄本之3'未轉譯(UTR)區域；於本發明之一項實施例中，shRNA可靶向編碼序列。更特定言之，標靶癌症可為胰臟神經內分泌腫瘤(NET)。
為了更全面理解本發明之特徵及優點，現參照實施方式、及隨附圖示更詳細說明。
雖然下文論述本發明之多項製造及使用實施例，但應瞭解，本發明提供許多可依多種特定方式實施之可應用之發明概念。文中論述之特定實施例僅用於闡述製造及使用本發明之特定方式，且並不限制本發明之範圍。
為了便於理解本發明，下文定義許多術語。文中所定義之術語具有本發明相關領域中之一般技術者所一般理解之含意。諸如「一」(「a」、「an」)及「該」(「the」)之術語無意於僅指單個實體，而是包括可供闡述該特定實例之通類。文中之術語係用於闡述本發明之特定實施例，但除非於技術方案中指出，否則其使用並不限制本發明。
本發明包括為了同時誘發標的之轉譯抑制及轉錄後mRNA降解而發展出之PDX bi-shRNA。構築體原型比具相同mRNA標靶特異性之siRNA更高效且更長效。本發明人已顯示，減弱PDX-1可誘發NET癌細胞細胞凋亡、終止增殖、及減少擴散，並改善負載癌瘤異種移植物之SCID小鼠的存活率。本發明人亦已證實，多次經靜脈內投與之BIV脂質體PDX-1 shRNA治療法導致SCID小鼠中之人類PC異種移植物幾乎完全消融，且已於鼠科動物胰島瘤模式中證實其反應優勢及存活率優勢。
bi-shRNA：本發明人已領先發展出第三種獨特之RNAi平台，稱為雙功能shRNA。概念上，可透過負載有shRNA之RISC啟動減弱裂解依賴性或非裂解依賴性mRNA，從而達成RNAi。吾人已顯示，同時表現兩種shRNA組態(因此命名為雙功能shRNA)可比siRNA更高效率減弱標靶基因，更快速啟動沉默(未考慮mRNA與蛋白質代謝之速率)，且更持久。雙功能shRNA表現單元之基本設計包括兩個莖-環shRNA結構：一個係由完全配對之過渡股及引導股組成，其係用於裝載裂解依賴性RISC，而第二個莖-環具有錯誤配對之過渡股(於位置9至12)，其係用於裝載非裂解依賴性RISC。該雙功能設計更有效，其原因有二：首先，雙功能啟動引導股裝載至各獨立RISC類型，由此啟動mRNA靶向；第二，存在針對相同標靶mRNA之裂解依賴性及非裂解依賴性RISC則可藉由降解及轉譯抑制/螯合兩種過程來啟動沉默。於單一pol II啟動子控制下，該強力基因減弱效應子受到多個shRNA之空間及時間控制。本發明人設計之平台模擬該天然過程。其他人之許多研究及文獻支持本發明人之方法[66-70]。
利用miR30骨架，本發明人已製得靶向微管重塑癌蛋白胞漿磷蛋白(STMN1、癌蛋白18、prosolin、p19、op18)之新穎雙功能shRNA(bi-shRNA)。已證實Bi-shRNASTMN1 比靶向相同標的位點之siRNA具更高效之沉默活性。STMN1重要地參與有絲分裂紡錘體形成[71,72]。已證實本發明bi-shRNASTMN1 構築體可安全有效地減弱標靶基因，且在殺死腫瘤細胞上，比靶向相同標的之siRNA具有顯著之劑量優勢。此外，已證實，於活體內，bi-shRNASTMN1 脂複合體具顯著之腫瘤生長控制及存活率優勢(圖1A及1B)。本發明人已利用可區分配對與錯誤配對之過渡股的RT-PCR方法證實，可於細胞內轉錄及加工成熟分子及效應子分子(具完全配對股之dsRNA、及具特定錯誤配對之dsRNA)[73]。大多數癌細胞的Drosha及Dicer表現量高。而癌細胞中之內源性Dicer含量則相反[74]。然而，大多數研究已指出，於即使具低Dicer表現量之癌細胞中，減弱sh或bi-sh RNAi亦極有效[75]。本發明人已證實對應於bi-shRNASTMN1 之成熟miRNA/siRNA組件的預期配對及錯誤配對shRNA之表現，此點在對照之siRNASTMN1 處理細胞中則相反，僅有完全配對之過渡股[76]。為了進一步支持bi-sh RNASTMN1 之機轉，利用5' RACE方法之本發明研究之成果已證實，存在具有預期之對應於bi-shRNASTMN1 之siRNA(配對)組分的標靶裂解位點的STMN-1裂解產物。觀察到表現STMN1之腫瘤細胞之有效基因減弱率(93%)，其反映bi-shRNASTMN1 之由裂解依賴性及非依賴性所介導減弱基因的成果。更進一步，在利用分開之組分(裂解依賴性(GBI-1)及非裂解依賴性)載體(GBI-3)載體減弱基因後，觀察STMN1 mRNA動力學，其與利用bi-shRNASTMN1 (GBI-2)減弱基因後所觀察到之結果比較，發現係與預期之機轉一致。
在證實bi-sh RNASTMN1 載體之效應子機轉及功能效力之後，本發明人進一步於活體外探討抗癌活性，並成功證實於數種癌細胞細胞株中可有效殺死細胞。雖然靶向相同序列，但bi-sh RNASTMN1 所達成之IC50 莫耳濃度比siRNASTMN1 低5個對數值(圖2)。
胰島瘤為最常見類型之胰島細胞腫瘤。惡性胰島瘤係由高胰島素血症惡化，並最終導致不可控制之低血糖症。如前文所述，胰臟十二指腸同源異型盒-1(PDX-1)屬於含同源異型域(homeodomain-containing)之轉錄因子家族，其在胰臟器官生成中發揮主要作用。PDX-1藉由調節胰島素、葡糖激酶及2型葡萄糖轉運體之轉錄而維持β-細胞功能。於胰島瘤中，PDX-1過度表現，且導致高胰島素血症。亦發現，於胰臟腫瘤中，PDX-1普遍過度表現。轉移性胰臟癌自診斷後有4至6個月之存活期。
小鼠胰島瘤模式中shRNA減弱PDX-1：為了證實於胰島瘤中之PDX-1表現，Brunicardi博士實驗室發展出一種針對PDX-1之強力抗體。本發明人已利用該種抗體證實，於鼠科動物之胰島瘤中，PDX-1顯著過度表現，其表現量與人類胰島瘤近似(圖11)。本發明人已構築一種鼠科動物(mu)shRNA，其係用於測試於鼠科動物模式中之基因減弱效力。然而由於隨著胰島瘤尺寸增大而出現失控之低血糖症，該等小鼠之壽命為2至3個月，因此研究受到限制。於初始之研究中，於活體外，以mu-shPDX-1 shRNA處理β TC-6細胞，並進行MTS分析，以檢測細胞存活率。對比於空載體，經mu-shPDX-1處理之細胞經過多個時間點之細胞增殖大幅減少。本發明人進一步證實，由於基因減弱，於多個時間點之DNA分析值顯著減少，且藉由因應減弱PDX-1之數種細胞週期相關蛋白質進行西方墨點分析，證實已減弱基因(圖12)。
使PDX-1表現沉默係一種值得注意之抑制腫瘤生長之方法。本發明人設計出一種用於使PDX-1基因表現沉默之雙功能shRNA。將靶向人類PDX-1(SEQ. ID NO. 1)或小鼠PDX-1(SEQ. ID No. 1)之基於MiR30之雙功能shRNA卡匣選殖入pUMVC3載體。使靶向小鼠或人類PDX-1之雙功能shRNA與表現小鼠或人類PDX-1之表現載體經共同電穿孔進入人類結腸癌細胞株。採用RACE-PCR檢測人類及小鼠PDX1 mRNA之可能裂解產物。採用RT-QPCR及免疫墨點分析法檢測對人類PDX-1或小鼠PDX-1之表現之基因減弱。
人類胰臟十二指腸同源異型盒1(PDX1)mRNA(SEQ. ID NO. 1)：
小鼠胰臟十二指腸同源異型盒1(PDX1)mRNA(SEQ. ID NO. 2)：
圖3A及3B分別顯示雙功能shRNA對強制過度表現之人類及小鼠PDX1之效力。於轉染後24小時觀察到雙功能shRNA對人類PDX-1之沉默效應，且沉默效應可持續至少96小時(圖4)。於轉染後72小時達到最大沉默效應(減弱80%人類PDX-1)。此外，靶向小鼠PDX-1(與人類序列具有68%同源性)之雙功能shRNA不影響人類PDX-1之表現(圖8)。類似地，於轉染後24小時，小鼠PDX-1之表現沉默，且該沉默效用持續至少96小時(圖4)。於轉染後48小時觀察到最大沉默效應(小鼠PDX-1表現量之95%)。此外，靶向人類PDX-1(與小鼠序列具有79%序列同源性)之雙功能shRNA亦不會改變小鼠PDX-1之表現情形(圖8)。
由RACE-PCR鑑別之人類及小鼠PDX-1 mRNA之裂解產物分別示於圖5A及5B中。圖5A及5B顯示，人類PDX1 mRNA及小鼠PDX1 mRNA皆在預期標靶區域之中心處精確地裂解。此外，靶向人類PDX-1之雙功能shRNA不會導致小鼠PDX-1 mRNA裂解，反之亦然。
前文所示之研究證實，靶向人類或小鼠PDX1之雙功能shRNA具效力及物種專一性。Bi-shRNAhPDX1 減弱人類PDX1表現，且對小鼠PDX1表現沒有出現沉默效應。類似地，Bi-shRNAmPDX1 減弱小鼠PDX1表現，且對人類PDX1表現沒有出現沉默效應。
脂質體遞送系統：本發明人先前證實有效之脂質體遞送系統涉及1,2-二油醯基-3-三甲基-銨基丙烷(DOTAP)及膽固醇[77]。該調配物與DNA組合形成複合物，將核酸囊封入雙層內陷式囊泡(脂質體BIV)。其中一位發明人已優化BIV遞送系統之數個特徵，用以改善RNA、DNA、及RNAi質體之遞送。脂質體BIV具融合性，因此可繞過由胞吞作用介導之DNA細胞進入途徑，否則該由胞吞作用介導之DNA進入細胞途徑將會導致核酸降解[78]及由TLR介導之脫靶效應。本發明人等人已於臨床試驗中成功使用該脂質體遞送系統[79-83]。近十年來所累積之研究顯示，為了有效經靜脈內輸送，最佳遞送載體需為ζ電位10 mV之隱形(通常由PEG化達成)奈米顆粒[84-86]，以使與諸如血清白蛋白之帶負電荷之血清蛋白質之間的非特異性結合最少(調理作用)[87]。併入諸如抗體及其單鏈衍生物(scFv)、醣、或肽之靶向部份可進一步加強對標靶細胞之轉殖基因定位(transgene localization)。
本發明人已創造一種不使用PEG即可於活體內靶向遞送複合物之方法，藉此避免過度延長循環半衰期[86、88-90]。雖然為了改善膜通透性，PEG化可用於DNA或siRNA寡核苷酸遞送，但已由本發明人等人顯示，該方法會在BIV脂質體結構中產生空間位阻，導致低效之DNA囊封，且基因表現減少。更進一步，PEG化複合物主要透過胞吞途徑進入細胞，導致溶酶體中大量核酸降解。雖然PEG提供極長之循環半衰期，但此對患者構成問題，例如多星(doxil)，一種囊封細胞毒性藥劑多柔比星(doxorubicin)之PEG化脂質體調配物[90-92]。曾嘗試在多星上添加配位體，用於遞送至特定細胞表面受體(例如HER2/neu)，但未加強腫瘤特異性遞送[93]。
基於該原因，已採用適宜之人工擠壓製程(manual extrusion process)，利用DOTAP、及合成性膽固醇製備本發明BIV[94]。更進一步，已利用可逆性遮蔽技術優化該遞送系統。可逆性遮蔽法使用不帶電荷之小分子量脂質(分子量約500及更低，例如正十二烷基-β-D-哌喃麥芽糖苷)與BIV複合物之表面疏鬆結合，藉此暫時保護帶正電荷之BIV複合物繞過非標靶器官。該等小型脂質再於血流中受到剪切力而移除。一旦到達標靶細胞，即重新暴露出電荷(最佳~45 mV)，以利於進入。圖6A顯示於BALB/c小鼠中，利用以BIV囊封之含CAT之質體經靜脈內轉染肺之最佳狀態，且圖6B顯示經靜脈內轉染心臟之最佳狀態。當經可逆性遮蔽之複合物在全身循環時，轉染率最小，雖然由ζ電位分析計所測之電荷為4.8 mV。當遮蔽物可逆地自BIV複合物解離時，該等複合物轉變成其天然帶電荷狀態(45.5 mV)，藉此經膜融合促進進入細胞，並促進於肝臟肝細胞中大量表現轉殖基因(CAT)(圖6C)。轉殖基因表現量增加100倍以上，且近似利用「一般」BIV複合物時於肺中所產生之CAT量。採用可逆性遮蔽術，於任一其他器官中，均未觀察到產生CAT。
吾人之BIV遞送系統特別有效之一個原因係該複合物係藉由與細胞膜融合而將治療劑遞送進入細胞，且避免胞吞途徑。脂質體進入之兩種主要進入機轉為經由胞吞作用或直接與細胞膜融合。本發明人發現，如於小鼠肺泡巨噬細胞中利用聚乙二胺(PEI)之比較研究證實，囊封於BIV複合物中之核酸在於活體外及活體內遞送時，皆藉由直接融合而進入細胞，且BIV極大避免攝入內小體。已知PEI可快速被胞內小體攝入，此點可由轉染後2至3小時之定位分析經若丹明(rhodamine)標記之寡核苷酸≧95%證實[95-97]。
利用經修飾之BIV之靶向癌症之遞送：最近，Bartlett及Davis顯示，較之未經修飾之奈米顆粒(NP)，經靶向腫瘤之NP全身遞送之siRNA可顯著更有效抑制皮下腫瘤生長[98]。靶向遞送並不會顯著影響藥物動力學或生物分佈，其主要係由於EPR(加強通透性及駐留性)效應[95]，但似乎可透過加強細胞攝入來改善轉殖基因表現[95-97]。
事實上，於發展治療用BIV時之關鍵「丟失片段」(「missing piece」)已鑑定為該種無免疫原性配位體，其可置於BIV-複合物之表面，以引導複合物靶向細胞。雖然可利用於脂質體表面上多聚化之小型肽來實現，但其可於重複注射後產生免疫反應。包括抗體、抗體片段、蛋白質、部份蛋白質等之其他更大配位體遠比小型肽更難用於脂質體表面上之靶向遞送。本發明複合物因此獨特，因為其不僅可穿透包括實體腫瘤中之腫瘤血管內皮孔及間隙壓力梯度之嚴密壁障[99]，而且可直接靶向腫瘤細胞。因此，本發明治療方法不僅依賴EPR效應進行遞送，還依賴直接靶向腫瘤[100-102]。
設計用於選擇性結合蛋白質之小分子可用於本發明。重要的是，所製得之小分子為「二價」，使得其特別適於結合細胞表面受體，並類似蛋白質-配位體相互作用時之熱點上之二級結構基元。Burgess團隊已成功設計出一種對細胞表面受體具親和力之二價β轉折模擬物[103-105]。本發明人採取該策略用於產生具有烴尾部之二價分子，且吾人已由該等經調整之小分子製得功能化之BIV複合物。已發展出一種用於篩選該集合庫之高效高通量技術，並已運行。
經緊縮之DNA奈米顆粒：安全且有效遞送DNA於有絲分裂後之細胞中：哥白尼(Copernicus)核酸遞送技術係一種非病毒合成及模組平臺，其中用聚陽離子緊縮DNA或siRNA單分子以產生具有最小可能體積之奈米顆粒[106]。適於活體內遞送之聚陽離子為經10 kDa聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸30聚肽(CK30 PEG10k)。該等複合物之外型一部份取決於緊縮DNA時之離胺酸抗衡離子[107]。無論有效負載(payload)質體之尺寸，棒形奈米顆粒之最小橫截面直徑為8至11 nm，而通常橢球體表現質體之最小直徑為20至22 nm(圖7A)[107]。重要的是，該等DNA奈米顆粒能夠穩健地轉染培養基中非分裂細胞。緊縮DNA之脂質體混合物產生基因表現之量比裸露DNA之脂質體混合物高1,000倍以上(圖7B)。於活體內投藥之後，緊縮之DNA穩健地轉染肺[108]、腦[109,110]、及眼[111,112]中有絲分裂後之細胞。於各該等系統中，經緊縮之DNA轉染有絲分裂後之細胞的顯著能力似乎由於該等奈米粒子之尺寸小，其可穿過25 nm之核膜孔[106]。
該等DNA奈米顆粒之一種攝取機轉係基於與細胞表面核仁素之結合(26 nm KD )，隨後經由非降解途徑經細胞質運輸進入細胞核，於細胞核中奈米顆粒打開釋放生物活性DNA[113]。已證實可長期活體內表現，長達基因轉移後一年。該等奈米顆粒具有良性毒性曲線，且不會刺激類鐸受體(toll-like receptor)，因此避免毒性細胞激素反應，甚至當經緊縮DNA具有數百個CpG島且與脂質體混合時，仍未觀察到毒性作用[114,115]。已對進行囊腫纖維化試驗之人類投與DNA奈米顆粒，結果令人鼓舞，沒有由於奈米顆粒所致之不良反應，且大多數患者證實CFTR蛋白質具生物活性[116]。
於本發明人與Copernicus(Cleveland,OH)之初始協同研究中，對具有結腸癌腫瘤外植物(explants)之SCID小鼠經尾靜脈或經腫瘤內(IT)注射投與經緊縮之DNA(圖7C)。雖然經靜脈內注射不導致基因轉移，但是經腫瘤內投藥後出現極高量之基因轉移，此說明該等DNA奈米顆粒局部遞送後在轉染之腫瘤中具高度活性。
新穎遞送系統：由於需要全身性基因轉移至原發腫瘤及轉移位點，可藉由將該等包含與30聚離胺酸縮合肽組合而緊縮DNA的奈米顆粒封裝入專有的BIV脂質體內，促進經緊縮之DNA遞送至腫瘤。這種經緊縮DNA與經遮蔽之隱形脂質體的新穎偶合為新穎之癌症基因療法。
如上文所見，於胰臟癌細胞株PANC-1中，藉由RNA干擾使PDX-1表現沉默，可於活體外抑制細胞增殖，且於活體內抑制腫瘤生長，且使腫瘤細胞之細胞凋亡增加。基於該策略，本發明人已發展出一種供臨床應用於治療胰島瘤、胰臟癌及神經內分泌腫瘤的雙功能shRNA(bi-shRNA-PDX-1)。更進一步，本發明人已利用胰島瘤/SCID模式及利用PANC-1/SCID胰島瘤模式證實活體外效力及活體內效力。
活體外基因減弱之評估法為藉由西方免疫墨點法及qRT-PCR法分析經PDX-1與bi-shRNA表現載體共同轉染之PDX-1陰性人類癌細胞細胞株(HCT116)中之PDX-1表現(圖3A、3B、4及8)。動物模式之產生法為：經腹膜內(IP)注射1×106 個β-TC-6細胞，產生活體內胰島瘤模式，或經腹膜內(IP)注射5×105 個PANC-1細胞，產生PC模式。於接種兩週後，將各模式中之小鼠隨機分成兩組；經尾部靜脈注射，對其中一組投與含有35 μg對照載體(沒有shRNA插入物之質體)之脂複合體(DOTAP：膽固醇脂質體質體複合物)，且對第二組投與含有35 μg小鼠特異性bi-msh-PDX-1(針對胰島瘤模式)或人類特異性bi-hsh-PDX-1(針對PC模式)之脂複合體。每隔兩週重複遞送兩次，共注射3次。依時間表定期監測血液胰島素及葡萄糖含量。於第三次注射後2週、10週、及18週，處死各組中之6隻小鼠，進行病理學評估及腫瘤評估。
HCT116人類癌症細胞係依1：1之比例與質體一起進行電穿孔。利用qRT-PCR，採用ΔΔCt方法，定量比較PDX-1 mRNA(圖3A及3B)。與空載體對照組比較mRNA含量，獲得如表1所概括之表現%。於轉染後24、48及72小時，分析PDX-1 mRNA。
於活體外，人類及小鼠特異性bi-shRNA-PDX-1顯示可有效且具物種特異性地減弱PDX-1 mRNA表現。
分別在第一段兩個治療週期後7天(第45天及第90天)，測定禁食小鼠之血液葡萄糖含量。利用mbi-shRNA-PDX-1治療小鼠胰島瘤模式可有效地救治罹患由β-TC-6細胞誘發之低血糖症之小鼠(圖9A)，但hbi-shRNA-PDX-1不影響胰臟癌模式之血液葡萄糖含量(圖9B)。於β-TC-6胰島瘤模式中，所有未接受治療之小鼠均在第90天進行測量之前死亡。PANC-1胰臟癌模式之結果係如圖9B所示。
Kaplan-Meier存活率分析進一步證實bi-shRNA-PDX-1治療對PANC-1(圖10A)及β-TC-6胰島瘤模式(圖10B)之效益。於胰島瘤模式中，監測10隻治療組小鼠(各以30 μg mbi-shRNA-PDX-1脂複合體治療三個週期)及10隻對照組小鼠(各以30 μg含有未插入bi-shRNA之pUMVC3載體的脂複合體治療三個週期)的存活率。於95天內監測存活率。於PC模式中，5隻經接種PANC-1之小鼠未接受治療，10隻小鼠各接受30 μg含有未插入bi-shRNA之pUMVC3載體的脂複合體治療三個週期，且15隻小鼠各接受30 μg hbi-shRNA-PDX-1脂複合體治療三個週期。於第60及90天，處死各組中之5隻小鼠，用於比較腫瘤體積。於治療後60天，100%未接受治療小鼠發展出平均大小為1330.75 mm3 之腫瘤，而僅有50%之接受治療之小鼠具有平均大小為50.5 mm3 之可見腫瘤。於治療後90天，37.5%之接受治療之小鼠無可見腫瘤，且其餘小鼠之腫瘤平均為36.7 mm3 。腫瘤體積比較研究之結果示於表2，亦示於圖14中。
於經靜脈內輸注經BIV脂質體遞送之shRNAPDX-1 (L-mu-shRNAPDX-1 )之後，亦加強SCID小鼠之存活率，且似乎與L-mu-shRNAPDX-1 注射量呈相關性(圖13)。胰島素含量減少且葡萄糖含量增加對應於L-mu-shRNAPDX-1 治療法抑制胰島瘤生長之結果。於接受L-mu-shPDX-1治療之後之動物腫瘤反應與胰島瘤細胞中，藉由流式細胞計檢測到之減弱PDX-1、及減弱細胞週期蛋白(週期素E、cdk4、cdk2)、及向上調節週期素依賴性激酶抑制劑(p27)具相關性。亦證實可發生細胞凋亡。該等結果支持於胰島瘤中進一步進行臨床發展之機會。本發明人已進一步證實，於經靜脈內輸注shRNAPDX-1 脂複合體之表現PDX-1之人類胰臟癌鼠科動物異種移植模式中，存在與劑量相關之存活率優勢。
新穎之bi-shRNAPDX-1 ：為採用雙功能shRNA策略，本發明人構築一種有效之鼠科動物(mu)-bi-shRNAPDX-1 。mu-bi-shRNAPDX-1 係由具有miR-30a骨架之兩個莖-環結構組成。第一個莖-環結構具有完全互補之引導股及過渡股，而第二個莖-環結構具有位於過渡股之第10位置及11位置上之兩個鹼基對錯誤配對。mu-bi-shRNAPDX-1 靶向小鼠PDX-1 mRNA(NM_008814)上之#723至#741核苷酸。
將mu-bi-shRNAPDX-1 表現單元與寡核苷酸組合物組裝在一起。將分別於5'及3'末端處具有Sal I及Not I位點之可組裝表現單元插入至pUMVC3之Sal I及Not I位點。證實所插入序列之方法係利用於插入物兩側之引子，自兩個方向定序。使用為檢測微小RNA而發展出之莖-環RT-PCR方法來檢測經轉染mu-bi-shRNAPDX-1 之細胞中之成熟shRNA。本發明人進一步利用5' RACE分析法檢測標靶位點裂解，以進一步證實mu-bi-shRNAPDX-1 之活性。
本發明bi-shRNA之序列係如下文所示：
pGBI-20：人類bi-shRNA-PDX-1(SEQ. ID NO：3)：
pGBI-21：人類bi-shRNA-PDX-1(SEQ. ID NO：4)：
pGBI-22：人類bi-shRNA-PDX-1(SEQ. ID NO：5)：
pGBI-23：人類bi-shRNA-PDX-1(SEQ. ID NO：6)：
pGBI-24：小鼠bi-shRNA-PDX-1(SEQ ID NO：7)：
pGBI-25：小鼠bi-shRNA-PDX-1(SEQ. ID NO：8)：
根據本發明之新穎bi-shRNA治療劑之構造代表使透過減弱轉錄後基因獲得有效治療成果所需之有效全身劑量減少之最新方法。有效且臨床上可應用之遞送方法將會很快用於全身靶向過度表現PDX-1之腫瘤。
本說明書中所論述之任一實施例可利用本發明之任一方法、套組、試劑、或組合物來實施，反之亦然。更進一步，本發明組合物可用於實現本發明方法。
咸瞭解，文中所述之特定實施例係以舉例方式出示，且並不限制本發明。於不脫離本發明範圍下，本發明之主要特徵可應用於許多實施例。彼等熟習此項技術者咸瞭解，或能夠確定採用常規實驗、許多文中所述之特定製程之等價物替代。認為該等等價物均屬於本發明範圍，且包括在專利申請範圍中。
本說明書中所提及之所有公開案及專利申請案代表熟習本發明相關領域之技術者的技術程度。所有公開案及專利申請案係以引用的方式併入文中，其程度就好像各公開案或專利申請案特定且個別地以引用的方式併入一般。
於專利申請範圍及/或說明書中，當與術語「包括」一起使用字「一」(「a」or「an」)時，「一」可意指「一個」，但亦等同於「一或多個」、「至少一個」、及「一個或一個以上」之含意。除非明確指出僅指替代物，或替代物相互排斥，否則於專利申請範圍中使用術語「或」時係用於意指「及/或」，但本揭示案亦支持僅指替代物及「及/或」之定義。於本申請案全文中，術語「約」係用於意指包括用於測定數值之裝置、方法的固有誤差、或存在於研究者之間之差異的數值。
如說明書及專利申請範圍中所用，字詞「包含(括)」(「comprising」)(包含其任一形式，諸如「comprise」及「comprises」)、「包括(含)」(「including」)(及包括其任一形式，諸如「includes」及「include」)、或「含有」(「containing」)(及含有其任一形式，諸如「contains」及「contain」)為包含性或開放性，且並不排除其他未說明之元件或方法步驟。
如文中所用，術語「或其組合」係指於該術語之前所列舉標的之所有排列及組合。例如「A、B、C、或其組合」意欲包括至少以下一者：A、B、C、AB、AC、BC、或ABC，且若順序對特定內容而言重要，則亦包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、或CAB。繼續使用該實例，該表述包括含有重複個一或多個標的或術語之組合，諸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。彼等熟習此項技術者咸瞭解，除非於其他內容中有所表述，否則通常並不限制任一組合中之標的或術語之數量。
如文中所用，諸如但不限於「約」、「大體上」、或「實質上」之約略之字詞係指其所修飾之條件應理解不一定為絕對或完美，但應理解為儘可能確保熟悉此相關技藝之人士在所示之條件內。闡述內容可能變化之程度將取決於能夠產生變化之幅度，且同時仍然使熟悉此相關技藝之人士認為經修飾之特徵仍然具有未經修飾之特徵的所需特徵及能力。通常，但以前述內容為條件，由諸如「約」之約略字詞修飾之文中數值可自所述數值變化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15%。
於本揭示案範圍內，無須過度實驗即可製造及進行所有於文中所揭示及所申請專利範圍之組合物及/或方法。雖然已依較佳實施例之形式闡述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者咸瞭解，在不脫離本發明概念、精神及範圍下，可改變組合物及/或方法、及方法之步驟或步驟順序。認為熟習此項技術者所瞭解之所有類似替代及修改屬於由隨附專利申請範圍所定義之本發明之精神、範圍及概念。
參考文獻
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圖1A及1B顯示bi-shRNASTMN1 載體於活體內之生長抑制活性。圖1A顯示當對CCL-247腫瘤異種移植物經腫瘤內注射單次投與bi-shRNASTMN1 脂複合體(pGBI2)或亂序對照脂複合體(pGBI5)或懸浮液(D5W)時所觀察到之抑制結果。數值表示平均值±SEM。圖1B顯示bi-shRNASTMN1 對SCID小鼠中之原發性骨肉瘤異種移植物的生長抑制活性。為期6天每天經腫瘤內注射bi-sh-RNASTMN1 脂複合體或對照物；
圖2比較bi-sh-STMN1及siRNASTMN1 之STMN1 mRNA標靶裂解與細胞生長抑制之間之關聯性。顯示bi-shRNASTMN1 (紅色)及siRNASTMN1 (黃色)與STMN1 mRNA裂解之間關聯性的組合劑量反應曲線。x軸為從左至右增加劑量之質體/siRNA濃度。y軸為處理24小時之後之存活細胞百分比。各數據點表示三重複樣本之平均值。bi-shRNASTMN1 之濃度範圍為自1.44×10-12 M至5.63×10-15 M。siRNASTMN1 之濃度範圍為自5×10-7 M至1×10-10 M。電泳圖分析插入物顯示，於轉染後之CCL-247細胞中檢測到5' RACE產物，其說明存在裂解產物；
圖3A及3B顯示，雙功能shRNA對過度表現之人類(圖3A)及小鼠(圖3B)PDX1 mRNA(SEQ. ID NO. 1及2)之效應。結腸癌CCL-247細胞僅經PDX-1 cDNA表現載體單獨轉染，或經PDX-1 cDNA與bi-shRNA表現載體共轉染。pUMVC3為不具有插入物對照之表現載體(SEQ. ID NO：9)。於轉染之後24、48、72及96小時，分離出總RNA，進行qRT-PCR。相對於GAPDH mRNA校正PDX-1 mRNA含量。相對於僅含介質之樣本(未轉染)，校正各樣本之相對PDX-1 mRNA含量；
圖4顯示雙功能shRNA對人類PDX-1(SEQ ID NO. 1)之沉默效應。結腸癌CCL-247細胞係僅經物種特異性PDX-1 cDNA表現載體單獨轉染，或經物種特異性PDX-1 cDNA與bisRNA表現載體共轉染。pUMVC3為不含有插入物之對照表現載體。於轉染後48、72及96小時，收集細胞，並利用特異性針對PDX-1及針對β-肌動蛋白之單株抗體進行免疫墨點分析；
圖5A及5B顯示藉由RACE-PCR鑑別之對人類(圖5A)及小鼠(圖5B)PDX1(SEQ. ID NO. 1及2)之標靶特異性裂解結果；結腸癌CCL-247細胞係僅經PDX-1 cDNA表現載體單獨轉染，或經PDX-1 cDNA與bi-shRNA表現載體共轉染。pUMVC3為不具有插入物對照之表現載體。於轉染後24及96小時，分離出總RNA進行5' RACE分析，以檢測標靶位點裂解產物。瓊脂糖凝膠電泳圖中顯示經RT-PCR擴增之裂解產物；
圖6A至6C顯示遮蔽劑對CAT受體基因產量之效應。圖6A顯示對肺之效應，圖6B顯示對心臟之效應，且圖6C顯示對肝臟之效應。於BALB/c小鼠中，在經靜脈內注射之後觀察到，隨著遮蔽增加，針對肺(圖6A)及心臟(圖6B)位置之非特異性影響降低。遮蔽係與定位於所計畫之標靶位點上之CAT報告基因增強相關(肝臟；圖6C)；
圖7A至7C顯示經緊縮之DNA奈米顆粒之結構及功能。圖7A顯示緊縮成橢球體或棒狀之DNA奈米顆粒的電子顯微鏡圖像。條形圖等於100 nm，圖7B顯示添加裸露或緊縮之DNA之脂質體混合物至處於對數期或生長停滯之神經母細胞瘤細胞。緊縮之DNA使有絲分裂後之細胞的基因表現改善1000倍以上，且使對數期細胞的基因表現改善6至8倍，且圖7C顯示，經靜脈內IV投藥或經腫瘤內(IT)注射投與，使緊縮之DNA基因轉移至負載結腸癌腹側外植體之SCID小鼠。腫瘤內注射產生高度之螢光素酶活性，而經靜脈內投與則不產生高度螢光素酶活性；
圖8顯示序列特異性對轉染後48小時之PDX-1蛋白質表現下降之影響；結腸癌CCL-247細胞係僅經物種專一性PDX-1 cDNA表現載體單獨轉染，或經物種特異性PDX-1 cDNA與bisRNA表現載體共轉染。pUMVC3為不具有插入物之對照表現載體。於轉染後48小時，收集細胞，並利用特異性針對PDX-1及針對β-肌動蛋白之單株抗體進行西方免疫墨點分析；
圖9A及9B顯示於活體內，在經bi-shRNA-PDX-1脂複合體治療之後，一段時間內之SCID小鼠異種移植模式之血糖含量：β-TC-6細胞胰瘤模式(圖9A)及PANC-1胰臟癌模式(圖9B)。對SCID小鼠植入腫瘤細胞，兩週後，以三週期之50 μg bi-shRNA-PDX-1脂複合體治療。定期監測經治療及未經治療之小鼠的空腹血糖含量，至多至治療後90天；
圖10A及10B顯示Kaplan-Meier存活率分析：PANC-1胰島腺癌模式(圖10A)及β-TC-6細胞胰島瘤模式(圖10B)；植入腫瘤細胞之SCID小鼠不接受治療，或以對照載體脂複合體(pUMVC3)治療，或以bi-shRNA-PDX-1脂複合體治療(依每週期30 μg治療三個週期)。監測小鼠之存活率，至多至治療後90天；
圖11顯示於人類胰島瘤腫瘤及小鼠TC-6胰島瘤細胞中過度表現之PDX-1；
圖12顯示於mPDX-1RNA沉默後之β TC-6細胞週期蛋白之表現量；
圖13顯示於鼠科動物胰島瘤SCID模式中，經靜脈內投與L-mPDX-1 shRNA之小鼠的存活率；
圖14為比較腫瘤體積數據之圖；且
圖15為用於製造本發明之新穎bi-shRNAPDX-1 之質體構築體。
(無元件符號說明)

Claims (28)

  1. 一種表現載體，其包含：啟動子；及可操作地連接於該啟動子之核酸插入物，其中該插入物編碼一或多種短髮夾RNA(shRNA)，該shRNA能夠與編碼PDX-1致癌基因之mRNA轉錄本之一區域雜交，且藉由RNA干擾而抑制PDX-1致癌基因表現，其中該shRNA同時為PDX-1致癌基因表現之裂解依賴性及非裂解依賴性抑制劑，且其中一或多個shRNA包含選自下列所組成之群之序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及其組合。
  2. 如請求項1之表現載體，其中該shRNA併有一或多個siRNA(裂解依賴性)及miRNA(非裂解依賴性)基元。
  3. 如請求項1之表現載體，其中該shRNA進一步定義為雙功能shRNA。
  4. 如請求項1之表現載體，其中所靶向區域為PDX-1致癌基因轉錄本之3' UTR區序列。
  5. 一種治療遞送系統，其包括：治療劑載體；及表現載體，其包含啟動子及可操作地連接於該啟動子之編碼一或多種短髮夾RNA(shRNA)之核酸插入物，該shRNA可與編碼PDX-1致癌基因之mRNA轉錄本之一區域雜交，且藉由RNA干擾而抑制PDX-1致癌基因表現，其 中該shRNA同時為PDX-1致癌基因表現之裂解依賴性及非裂解依賴性抑制劑，且其中一或多個shRNA包含選自下列所組成之群之序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及其組合。
  6. 如請求項5之遞送系統，其中該治療劑載體為經緊縮(compacted)之DNA奈米顆粒。
  7. 如請求項6之遞送系統，其中用一或多種聚陽離子緊縮該DNA奈米顆粒。
  8. 如請求項6之遞送系統，其中該一或多種聚陽離子為經10kDA聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸30聚(30-mer)肽(CK30 PEG10k)。
  9. 如請求項6之遞送系統，其中該經緊縮之DNA奈米顆粒進一步囊封於脂質體中。
  10. 如請求項9之遞送系統，其中該脂質體為雙層內陷式囊泡(vesicle)(BIV)。
  11. 如請求項9之遞送系統，其中該脂質體為可逆性遮蔽脂質體。
  12. 如請求項9之遞送系統，其中該脂質體經一或多個受體靶向部份修飾。
  13. 如請求項5之遞送系統，其中該治療劑載體為脂質體。
  14. 如請求項13之遞送系統，其中該脂質體為經一或多個受體靶向部份修飾的雙層內陷式囊泡(BIV)，其中該脂質體為可逆性遮蔽脂質體。
  15. 如請求項7至14中任一項之遞送系統，其係用於將一或多種shRNA遞送至表現PDX-1致癌基因之標靶組織，該遞送包含以下步驟：將治療有效量之該遞送系統之表現載體與治療劑載體複合物遞送至需要之病患。
  16. 一種於活體外使一或多種標靶細胞中之PDX-1致癌基因表現沉默之方法，其包含以下步驟：選出該一或多種標靶細胞；及以可表現一或多種短髮夾RNA(shRNA)之載體轉染該標靶細胞，該shRNA能夠與編碼PDX-1致癌基因之mRNA轉錄本之一區域雜交，其中以該載體轉染該一或多種標靶細胞係藉由RNA干擾而抑制PDX-1致癌基因表現，其中該shRNA同時為PDX-1致癌基因表現之裂解依賴性及非裂解依賴性抑制劑，且其中一或多個shRNA包含選自下列所組成之群之序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及其組合。
  17. 如請求項16之方法，其中該shRNA併有siRNA(裂解依賴性)及miRNA(非裂解依賴性)基元。
  18. 如請求項16之方法，其中該shRNA進一步定義為雙功能shRNA。
  19. 如請求項16之方法，其中該靶向之區域為PDX-1致癌基因轉錄本之3' UTR區序列。
  20. 一種於治療劑載體複合物中之表現載體之用途，其係用 於製造抑制腫瘤細胞生長、治療胰島增生性疾病、或兩者之藥物，其中該表現載體表現一或多種雙功能短髮夾RNA(shRNA)，其能夠與編碼PDX-1致癌基因之mRNA轉錄本之一區域雜交，其中該雜交造成腫瘤細胞之細胞凋亡、停止增殖、或減少侵襲，其中該shRNA同時為PDX-1致癌基因表現之裂解依賴性及非裂解依賴性抑制劑，且其中一或多個shRNA包含選自下列所組成之群之序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及其組合。
  21. 如請求項20之用途，其中該等胰島增生性疾病包含胰臟神經內分泌腫瘤(NET)、胰島瘤、及類癌。
  22. 如請求項20之用途，其中該雙功能shRNA併有siRNA(裂解依賴性)及miRNA(非裂解依賴性)基元。
  23. 如請求項20之用途，其中該靶向之區域為PDX-1轉錄本之3' UTR區序列。
  24. 如請求項20之用途，其中該胰島增生性疾病為胰臟神經內分泌腫瘤(NET)。
  25. 如請求項20之用途，其中該治療劑載體為經緊縮之DNA奈米顆粒或經一或多個「智慧型」受體靶向部份修飾的可逆性遮蔽脂質體。
  26. 如請求項25之用途，其中該DNA奈米顆粒係以一或多種聚陽離子緊縮，其中該一或多種聚陽離子為經10kDA聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸30聚肽(CK30 PEG10k)或30聚離胺酸縮合肽。
  27. 如請求項25之用途，其中該可逆性遮蔽脂質體為雙層內陷式囊泡(BIV)。
  28. 如請求項25之用途，其中該經緊縮之DNA奈米顆粒進一步囊封於脂質體中。
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