CN115137741A - 一种基于病毒载体的rna递送系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种基于病毒载体的RNA递送系统及其应用。其中，该RNA递送系统包括病毒载体，所述病毒载体携带有所需递送的RNA片段，所述病毒载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA片段的复合结构，所述复合结构能够进入并结合目标组织，将所述RNA片段送入目标组织。本申请提供的基于病毒载体的RNA递送系统安全性和可靠性已被充分验证，成药性非常好、通用性强，具有极好的经济效益和应用前景。

Description

一种基于病毒载体的RNA递送系统及其应用
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，特别涉及一种基于病毒载体的RNA递送系统及其应用。
背景技术
RNA干扰(RNAi)疗法自从被发明以来，一直被认为是治疗人类疾病的一种很有前途的策略，但在临床实践过程中遇到了许多问题，该疗法的发展进度远远落后于预期。
一般认为RNA无法在细胞外长期稳定存在，因为RNA会被细胞外富含的RNase降解成碎片，因此必须找到能够使RNA稳定存在于细胞外，并且能够靶向性地进入特定组织的方法，才能将RNAi疗法的效果凸显出来。
目前与siRNA相关的专利很多，主要聚焦在以下几个方面：1、设计具有医学效果的siRNA。2、对s iRNA进行化学修饰，提高siRNA在生物体内的稳定性，提高产率。3、提高设计各种人工载体(如脂质纳米粒子、阳离子聚合物和病毒)，以提高siRNA在体内传递的效率。其中第3方面的专利很多，其根本原因是研究人员们已经意识到目前缺乏合适的siRNA传递系统，将siRNA安全地、精确地、高效地输送到目标组织，该问题已经成为制约RNAi疗法的核心问题。
病毒(Biological virus)是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸(DNA或RNA)，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。病毒载体可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制，可发生于完整活体(in vivo)或是细胞培养(in vitro)中，主要应用于基础研究、基因疗法或疫苗。但是目前很少有针对将病毒作为载体利用特殊的自组装机制递送RNA，特别是siRNA的相关研究。
公开号为CN108624590A的中国专利公开了一种能够抑制DDR2基因表达的siRNA；公开号为CN108624591A的中国专利公开了一种能够沉默ARPC4基因的siRNA，并且对该siRNA进行了α-磷-硒修饰；公开号为CN108546702A的中国专利公开了一种靶向长链非编码RNA DDX11-AS1的siRNA。公开号为CN106177990A的中国专利公开了一种可以用于多种肿瘤治疗的siRNA前体。这些专利均设计了特定的s iRNA并且来针对某些由基因变化引起的疾病。
公开号为CN108250267A的中国专利公开了一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体，使用多肽作为si RNA的载体。公开号为CN108117585A的中国专利公开了一种靶向导入siRNA促进乳腺癌细胞凋亡的多肽，同样使用多肽作为siRNA的载体。公开号为CN108096583A的中国专利公开了一种纳米粒子载体，该载体在包含化疗药物的同时还可以装载具有乳腺癌疗效的siRNA。这些专利均为在siRNA载体方面的发明创造，但是其技术方案具有一个共同特征，那就是载体和siRNA均在体外预先组装，然后再引入宿主体内。事实上，目前绝大部分设计的传递技术均是如此。然而这类传递体系具有共同的问题，那就是这些人工合成的外源性传递体系很容易被宿主的循环系统清除，也有可能引起免疫原性反应，甚至可能对特定的细胞类型和组织有毒。
本发明的研究团队发现内源性细胞可以选择性地将miRNAs封装到外泌体(exosome)中，外泌体可以将miRNA传递到受体细胞中，其分泌的miRNA在相对较低的浓度下，即可有力阻断靶基因的表达。外泌体与宿主免疫系统生物相容，并具有在体内保护和运输miRNA跨越生物屏障的先天能力，因此成为克服与siRNA传递相关的问题的潜在解决方案。例如，公开号为CN110699382A的中国专利就公开了一种递送siRNA的外泌体的制备方法，公开了从血浆中分离外泌体，并将siRNA通过电穿孔的方式封装到外泌体中的技术。
但是这类在体外分离或制备外泌体的技术，往往需要通过细胞培养获取大量的外泌体，再加上siRNA封装的步骤，这使得大规模应用该产品的临床费用变得非常高，一般患者无法负担；更重要的是，外泌体复杂的生产/纯化过程，使其几乎不可能符合GMP标准。
到目前为止，以外泌体为有效成分的药物从未获得CFDA批准，其核心问题就是无法保证外泌体产品的一致性，而这一问题直接导致此类产品无法获得药品生产许可证。如果能解决这一问题，则对推动RNAi疗法意义非凡。
因此，开发一个安全、精确和高效的siRNA传递系统是对提高RNAi治疗效果，推进RNAi疗法至关重要的一环。
发明内容
有鉴于此，本申请实施例提供了一种基于病毒载体的RNA递送系统及其应用，以解决现有技术中存在的技术缺陷。
本申请提供一种基于病毒载体的RNA递送系统，该系统包括病毒载体，所述病毒载体携带有所需递送的RNA片段，所述病毒载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA片段的复合结构，所述复合结构能够进入并结合目标组织，将所述RNA片段送入目标组织。RNA片段送入目标组织后，能够抑制与其相匹配的基因的表达，进而抑制目标组织中疾病的发展。
通过图16-17表明了腺相关病毒载体和慢病毒载体构建的RNA递送系统具有体内富集和治疗效果。
可选地，所述病毒载体为腺病毒相关病毒。
可选地，所述腺病毒相关病毒为腺病毒相关病毒5型、腺病毒相关病毒8型或腺病毒相关病毒9型。
可选地，所述RNA片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列，所述RNA序列是具有医学意义的siRNA、shRNA或miRNA。
通过图18-19，表明了2种腺病毒载体与6种RNA序列单独或其中任意2种或其中任意3种RNA序列组成的RNA片段构建后均具有体内富集和治疗效果。
可选地，所述病毒载体包括启动子和靶向标签，所述靶向标签能够在宿主的器官组织中形成所述复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述RNA片段递送进入目标组织。
可选地，所述病毒载体中包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子-RNA片段、启动子-靶向标签、启动子-RNA片段-靶向标签；每一个所述病毒载体中至少包括一个RNA片段和一个靶向标签，所述RNA片段和靶向标签位于相同的线路中或位于不同的线路中。
通过图20-23表明了2种RNA片段和2种靶向标签单独使用或任意组合并构建进病毒载体均具有体内富集及治疗效果。
可选地，所述病毒载体还包括能够使所述线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列和loop序列，所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列；
所述病毒载体中包括以下任意一种线路或几种线路的组合：5'-启动子-5'侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列、5'-启动子-靶向标签、5'-启动子-靶向标签-5'侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列。
通过图24表明了5’-启动子-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列和5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼构建的递送载体均具有体内富集及治疗效果。
可选地，所述5’侧翼序列为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80％的序列；
所述loop序列为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80％的序列；
所述3’侧翼序列为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80％的序列；
所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-5位碱基，删除RNA反向互补序列的1-5位碱基的目的是使该序列不表达。
图25表明了5’侧翼序列/loop序列/3’侧翼序列及其同源序列构建的递送系统均具有体内富集及治疗效果。
优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-3位碱基。
更为优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-3位连续排列的碱基。
最为优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中的第9位和/或第10位碱基。
可选地，在病毒载体中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列1-3组成的序列(序列1-序列2-序列3)相连；
其中，序列1为CAGATC，序列2是由5-80个碱基组成的序列，序列3为TGGATC。
可选地，在病毒载体中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80％的序列相连；
其中，序列4为CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC。
通过图26表明了序列4及其同源序列构建的病毒载体递送系统，均具有体内富集及治疗效果。
可选地，所述器官组织为肝脏，所述复合结构为外泌体。
可选地，所述靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白。
可选地，所述靶向肽包括RVG靶向肽、GE11靶向肽、PTP靶向肽、TCP-1靶向肽、MSP靶向肽；
所述靶向蛋白包括RVG-LAMP2B融合蛋白、GE11-LAMP2B融合蛋白、PTP-LAMP2B融合蛋白、TCP-1-LAMP2B融合蛋白、MSP-LAMP2B融合蛋白。
可选地，所述RNA序列的长度为15-25个核苷酸。比如，所述RNA序列的长度可以为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个核苷酸。优选地，所述RNA序列的长度为18-22个核苷酸。
通过图27表明了不同长度的RNA序列构建的基因线路均具有体内富集及治疗效果。
可选地，所述RNA序列选自以下RNA中的任意一种或几种：EGFR基因的siRNA，KRAS基因的siRNA，VEGFR基因的siRNA，mTOR基因的siRNA，TNF-α基因的siRNA,integrin-α基因的siRNA，B7基因的siRNA，TGF-β1基因的siRNA，H2-K基因的siRNA，H2-D基因的siRNA，H2-L基因的siRNA，HLA基因的siRNA，GDF15基因的siRNA，miRNA-21的反义链，miRNA-214的反义链，TNC基因的siRNA，PTP1B基因的siRNA，mHTT基因的siRNA，Lrrk2基因的siRNA，α-synuclein基因的siRNA，或与上述序列同源性大于80％的RNA序列，或编码上述RNA的核酸分子。需要说明的是，此处“编码上述RNA序列的核酸分子”中的RNA序列也同时包括每种RNA的同源性大于80％的RNA序列。
其中，上述各基因的siRNA均为具有抑制该基因表达的功能的RNA序列，具有抑制各基因表达的功能的RNA序列数量繁多，在此无法一一列举，仅以下述部分效果较优的序列进行举例说明。
EGFR基因的siRNA包括UGUUGCUUCUCUUAAUUCCU、AAAUGAUCUUCAAAAGUGCCC、UCUUUAAGAAGGAAAGAUCAU、AAUAUUCGUAGCAUUUAUGGA、UAAAAAUCCUCACAUAUACUU、其他具有抑制EGFR基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
KRAS基因的siRNA包括UGAUUUAGUAUUAUUUAUGGC、AAUUUGUUCUCUAUAAUGGUG、UAAUUUGUUCUCUAUAAUGGU、UUAUGUUUUCGAAUUUCUCGA、UGUAUUUACAUAAUUACACAC、其他具有抑制KRAS基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
VEGFR基因的siRNA包括AUUUGAAGAGUUGUAUUAGCC、UAAUAGACUGGUAACUUUCAU、ACAACUAUGUACAUAAUAGAC、UUUAAGACAAGCUUUUCUCCA、AACAAAAGGUUUUUCAUGGAC、其他具有抑制VEGFR基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
mTOR基因的siRNA包括AGAUAGUUGGCAAAUCUGCCA、ACUAUUUCAUCCAUAUAAGGU、AAAAUGUUGUCAAAGAAGGGU、AAAAAUGUUGUCAAAGAAGGG、UGAUUUCUUCCAUUUCUUCUC、其他具有抑制mTOR基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
TNF-α基因的siRNA包括AAAACAUAAUCAAAAGAAGGC、UAAAAAACAUAAUCAAAAGAA、AAUAAUAAAUAAUCACAAGUG、UUUUCACGGAAAACAUGUCUG、AAACAUAAUCAAAAGAAGGCA、其他具有抑制TNF-α基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
integrin-α基因的siRNA包括AUAAUCAUCUCCAUUAAUGUC、AAACAAUUCCUUUUUUAUCUU、AUUAAAACAGGAAACUUUGAG、AUAAUGAAGGAUAUACAACAG、UUCUUUAUUCAUAAAAGUCUC、其他具有抑制integrin-α基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
B7基因的siRNA、UUUUCUUUGGGUAAUCUUCAG、AGAAAAAUUCCACUUUUUCUU、AUUUCAAAGUCAGAUAUACUA、ACAAAAAUUCCAUUUACUGAG、AUUAUUGAGUUAAGUAUUCCU、其他具有抑制B7基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
TGF-β1基因的siRNA包括ACGGAAAUAACCUAGAUGGGC、UGAACUUGUCAUAGAUUUCGU、UUGAAGAACAUAUAUAUGCUG、UCUAACUACAGUAGUGUUCCC、UCUCAGACUCUGGGGCCUCAG、其他具有抑制TGF-β1基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
H2-K基因的siRNA包括AAAAACAAAUCAAUCAAACAA、UCAAAAAAACAAAUCAAUCAA、UAUGAGAAGACAUUGUCUGUC、AACAAUCAAGGUUACAUUCAA、ACAAAACCUCUAAGCAUUCUC、其他具有抑制H2-K基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
H2-D基因的siRNA包括AAUCUCGGAGAGACAUUUCAG、AAUGUUGUGUAAAGAGAACUG、AACAUCAGACAAUGUUGUGUA、UGUUAACAAUCAAGGUCACUU、AACAAAAAAACCUCUAAGCAU、其他具有抑制H2-D基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
H2-L基因的siRNA包括GAUCCGCUCCCAAUACUCCGG、AUCUGCGUGAUCCGCUCCCAA、UCGGAGAGACAUUUCAGAGCU、UCUCGGAGAGACAUUUCAGAG、AAUCUCGGAGAGACAUUUCAG、其他具有抑制H2-L基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
HLA基因的siRNA、AUCUGGAUGGUGUGAGAACCG、UGUCACUGCUUGCAGCCUGAG、UCACAAAGGGAAGGGCAGGAA、UUGCAGAAACAAAGUCAGGGU、ACACGAACACAGACACAUGCA、其他具有抑制HLA基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
GDF15基因的siRNA包括UAUAAAUACAGCUGUUUGGGC、AGACUUAUAUAAAUACAGCUG、AAUUAAUAAUAAAUAACAGAC、AUCUGAGAGCCAUUCACCGUC、UGCAACUCCAGCUGGGGCCGU、其他具有抑制GDF15基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
TNC基因的siRNA包括UAUGAAAUGUAAAAAAAGGGA、AAUCAUAUCCUUAAAAUGGAA、UAAUCAUAUCCUUAAAAUGGA、UGAAAAAUCCUUAGUUUUCAU、AGAAGUAAAAAACUAUUGCGA、其他具有抑制TNC基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
PTP1B基因的siRNA包括UGAUAUAGUCAUUAUCUUCUU、UCCAUUUUUAUCAAACUAGCG、AUUGUUUAAAUAAAUAUGGAG、AAUUUUAAUACAUUAUUGGUU、UUUAUUAUUGUACUUUUUGAU、其他具有抑制PTP1B基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
mHTT基因的siRNA包括UAUGUUUUCACAUAUUGUCAG、AUUUAGUAGCCAACUAUAGAA、AUGUUUUUCAAUAAAUGUGCC、UAUGAAUAGCAUUCUUAUCUG、UAUUUGUUCCUCUUAAUACAA、其他具有抑制mHTT基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
Lrrk2基因的siRNA包括AUUAACAUGAAAAUAUCACUU、UUAACAAUAUCAUAUAAUCUU、AUCUUUAAAAUUUGUUAACGC、UUGAUUUAAGAAAAUAGUCUC、UUUGAUAACAGUAUUUUUCUG、其他具有抑制Lrrk2基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
α-synuclein基因的siRNA包括AUAUAUUAACAAAUUUCACAA、AAGUAUUAUAUAUAUUAACAA、AUAACUUUAUAUUUUUGUCCU、UAACUAAAAAAUUAUUUCGAG、UCGAAUAUUAUUUAUUGUCAG、其他具有抑制α-synuclein基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
miRNA-21的反义链为5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’。
需要说明的是，以上所述的“同源性大于80％的序列”可以为同源性为85％、88％、90％、95％、98％等。
可选地，所述RNA片段包括RNA序列本体和对RNA序列本体进行核糖修饰得到的修饰RNA序列。即RNA片段既可以仅由至少一个RNA序列本体组成，也可以仅由至少一个修饰RNA序列组成，还可以由RNA序列本体与修饰RNA序列组成。
在本发明中，所述分离的核酸还包括其变体和衍生物。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对所述核酸进行修饰。修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。在本发明的其中一种实施方式中，所述修饰为核苷酸间键合，例如选自：硫代磷酸酯、2'-O甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。在本发明的其中一种实施方式中，所述修饰为对核苷酸的修饰，例如选自：肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖-核酸(FANA)、类似物、衍生物及其组合。优选的，所述修饰为2’氟嘧啶修饰。2’氟嘧啶修饰是将RNA上嘧啶核苷酸的2’-OH用2’-F替代，2’-F能够使RNA不易被体内的RNA酶识别，由此增加RNA片段在体内传输的稳定性。
可选地，所述递送系统为用于包括人在内的哺乳动物中的递送系统。
本申请还提供一种如上任意一段所述的基于病毒载体的RNA递送系统在药物中的应用。
可选地，所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。优选静脉注射。
可选地，所述药物为治疗癌症、肺纤维化、结肠炎、肥胖症、由肥胖症引起的心血管疾病、二型糖尿病、亨廷顿病、帕金森病、重症肌无力、阿尔兹海默病或移植物抗宿主病的药物。
可选地，所述药物包括上述病毒载体，具体而言，此处的病毒载体表示携带有RNA片段、或携带有RNA片段及靶向标签的病毒载体，并且能够进入宿主体内能够在肝脏部位富集，自组装形成复合结构外泌体，该复合结构能够将RNA片段递送至目标组织，使RNA片段在目标组织中表达，进而抑制与其匹配的基因的表达，实现治疗疾病的目的。
所述药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂等。
本申请的技术效果为：
本申请提供的基于病毒载体的RNA递送系统以病毒作为载体，病毒作为成熟的注入物，其安全性和可靠性已被充分验证，具有良好的成药性。最终发挥效果的RNA序列由内源性外泌体包裹输送，不存在任何免疫反应，无需验证该外泌体的安全性。该递送系统可以递送各类小分子RNA，通用性强。并且病毒的制备要比外泌体或是蛋白质、多肽等物质的制备便宜地多，经济性好。本申请提供的基于病毒载体的RNA递送系统在体内自组装后能够与AGO2紧密结合并富集为复合结构(外泌体)，不仅能防止其过早降解，维持其在循环中的稳定性，而且有利于受体细胞吸收、胞浆内释放和溶酶体逃逸，所需剂量低。
本申请提供的基于病毒载体的RNA递送系统应用于药物中，即提供了一个药物递送平台，可以通过该平台形成更多RNA类药物的研发基础，对RNA类药物研发和使用具有极大的推动作用。
附图说明
图1是本申请一实施例提供的小鼠结肠炎治疗情况及RNA表达水平对比图；
图2是本申请一实施例提供的小鼠细胞因子浓度以及结肠HE染色对比图；
图3是本申请一实施例提供的小鼠结肠炎治疗情况对比图；
图4是本申请一实施例提供的小鼠疾病活动指数及多种siRNA水平对比图；
图5是本申请一实施例提供的小鼠多种siRNA、mRNA水平对比图；
图6是本申请一实施例提供的小鼠结肠HE染色情况对比图；
图7是本申请一实施例提供的基于KRAS siRNA的小鼠肺癌治疗情况图；
图8是本申请一实施例提供的基于EGFR siRNA的小鼠肺癌治疗情况图；
图9是本申请一实施例提供的小鼠多种酶含量对比图；
图10是本申请一实施例提供的小鼠羟脯氨酸含量、mRNA水平对比图；
图11是本申请一实施例提供的小鼠生存情况和肿瘤评估对比图；
图12是本申请一实施例提供的小鼠肥胖症治疗情况对比图；
图13是本申请一实施例提供的小鼠各项肥胖指标对比图；
图14是本申请一实施例提供的小鼠亨廷顿病治疗情况对比图；
图15是本申请一实施例提供的线路的构建与表征图。
图16是本申请一实施例提供的腺相关病毒载体在肝、肺、血浆、外泌体的富集效果以及EGFR基因表达量检测，图中A为携带有RNA序列的腺相关病毒载体在肝和肺中的富集效果，B为携带有RNA序列的腺相关病毒载体在血浆和外泌体中的富集效果，C和D分别为EGFR的蛋白表达量和mRNA表达量结果。
图17是本申请一实施例提供的慢病毒载体在肝、肺、血浆、外泌体的富集效果以及EGFR基因表达量检测，图中A为携带有RNA序列的慢病毒载体在肝和肺中的富集效果，B为携带有RNA序列的慢病毒载体在血浆和外泌体中的富集效果，C和D分别为EGFR的蛋白表达量和mRNA表达量结果。
图18是本申请一实施例提供的以2种不同的腺病毒载体构建的含有不同的6种RNA序列的基因环路，静脉注射后相应蛋白和mRNA的检测结果，图中A为EGFR蛋白表达量，B为TNC蛋白表达量，C为EGFR mRNA表达量，D为TNC mRNA表达量。
图19是本申请一实施例提供的2种腺病毒载体与6种RNA序列中的任意2种或任意3种RNA序列组成的RNA片段构建后，静脉注射后的蛋白表达量，图中A为2种腺病毒载体与6种RNA序列中的任意2种RNA序列组成的RNA片段构建后，检测的EGFR和TNC的蛋白含量，B为2种腺病毒载体与6种RNA序列中的任意2种RNA序列组成的RNA片段构建后，检测的EGFR和TNC的mRNA含量，C为2种腺病毒载体与6种RNA序列中的任意3种RNA序列组成的RNA片段构建后，检测的EGFR和TNC的蛋白含量，D为2种腺病毒载体与6种RNA序列中的任意4种RNA序列组成的RNA片段构建后，检测的EGFR和TNC的mRNA含量。
图20是本申请一实施例提供的将单独的RNA片段和单独的靶向标签组合并构建进病毒载体后，静脉注射后，检测得到的EGFR siRNA和TNC siRNA在胰腺、脑中的富集效果及EGFR和TNC的表达量，图中A-D分别为AD2/AD5+PTP/RVG+siREGFR/siRTNC的富集效果检测结果，E-H分别为AD2/AD5+PTP/RVG+siREGFR的EGFR蛋白含量和mRNA含量检测结果，I-L分别为AD2/AD5+PTP/RVG+siRTNC的TNC蛋白含量和mRNA含量检测结果。
图21是本申请一实施例提供的将2种RNA片段和2种靶向标签任意组合并构建进病毒载体后，静脉注射后，检测得到的EGFR siRNA和TNC siRNA在胰腺、脑中的富集效果，图中A-B分别为AD2/AD5+PTP/RVG+siREGFR+TNC的富集效果检测结果，C-D分别为AD2/AD5+(PTP-RVG)+siREGFR的富集效果检测结果，E为AD2/AD5+(PTP-RVG)+siREGFR+TNC的富集效果检测结果。
图22是本申请一实施例提供的将2种RNA片段和2种靶向标签任意组合并构建进病毒载体后，静脉注射后，检测得到的胰腺、脑中的EGFR和TNC的表达量，图中A-D分别为AD2/AD5+PTP/RVG+siREGFR+TNC的EGFR蛋白含量和mRNA含量检测结果，E-H分别为TNC蛋白含量和mRNA含量检测结果。
图23是本申请另一实施例提供的将2种RNA片段和2种靶向标签任意组合并构建进病毒载体后，静脉注射后，检测得到的胰腺、脑中的EGFR和TNC的表达量，图中A-B分别为AD2/AD5+(PTP-RVG)+siREGFR的EGFR蛋白含量和mRNA含量检测结果，C-D为AD2/AD5+(PTP-RVG)+siREGFR+TNC的EGFR蛋白含量和mRNA含量检测结果，E-F为AD2/AD5+(PTP-RVG)+siRTNC的TNC蛋白含量和mRNA含量检测结果，G-H为AD2/AD5+(PTP-RVG)+siREGFR+TNC的TNC蛋白含量和mRNA含量检测结果。
图24是本申请一实施例提供的以2种线路构建的递送系统静脉注射后siRNA在肝、肺、血浆、外泌体中的富集结果和EGFR蛋白及mRNA的表达量检测结果，图中A为递送系统AAV-siRE和AAV-GE11-siRE在肝、肺中的富集效果，B为递送系统AAV-siRE和AAV-GE11-siRE在血浆、外泌体中的富集效果，C为递送系统AAV-siRE和AAV-GE11-siRE的EGFR蛋白含量检测结果，D为递送系统AAV-siRE和AAV-GE11-siRE的EGFR mRNA含量检测结果。
图25是本申请一实施例提供的含有2条与5’侧翼序列/loop序列/3’侧翼序列同源性大于80％的明确序列的腺病毒载体在肺部的富集效果，图中A为不同的5’侧翼序列的富集效果，B为不同的loop序列的富集效果，C为不同的3’侧翼序列的富集效果。
图26是本申请一实施例提供的序列4以及2条与序列4同源性大于80％的序列4-1、4-2构建进AAV载体中，静脉注射9小时后肺部组织的序列富集效果，图中A为以序列4连接时，AAV-siRE和AAV-siRT的siRNA含量检测结果，图中B为以序列4-1连接时，AAV-siRE和AAV-siRT的siRNA含量检测结果，图中C为以序列4-2连接时，AAV-siRE和AAV-siRT的siRNA含量检测结果。
图27是本申请一实施例提供的含有不同长度序列的基因环路静脉注射后的EGFR表达量检测结果，图中A为EGFR蛋白含量检测结果，B为EGFR mRNA含量检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本申请的具体实施方式进行描述。
首先，对本发明涉及到的专业名词、试验方法等进行解释说明。
苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色。HE染色是组织学、病理学教学与科研中最基础、使用最广泛的技术方法之一。
苏木精染液为碱性，可以将组织的嗜碱性结构(如核糖体、细胞核及细胞质中的核糖核酸等)染成蓝紫色；伊红为酸性染料，可以将组织的嗜酸性结构(如细胞内及细胞间的蛋白质，包括路易体、酒精小体以及细胞质的大部分)染成粉红色，使整个细胞组织的形态清晰可见。
HE染色的具体步骤包括：样本组织固定与切片；组织样本脱蜡；组织样本水化；组织切片苏木素染色、分化与反蓝；组织切片伊红染色与脱水；组织样本切片风干封片；最后在显微镜下观察并拍照。
Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测，对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。其步骤主要包括：提取蛋白、蛋白定量、制胶和电泳、转膜、免疫标记及显影。
免疫组化，应用抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化的主要步骤包括：切片浸泡、过夜晾干、二甲苯脱蜡、梯度酒精脱蜡(100％、95％、90％、80％、75％、70％、50％，每次3min)、双蒸水、滴加3％过氧化氢溶液去除过氧化氢酶、水洗、抗原修复、滴加5％BSA、封闭1h、稀释一抗、PBS缓冲液清洗、孵二抗、PBS缓冲液清洗、显色液显色、水洗、苏木精染色、梯度乙醇脱水、中性树胶封片。
本发明中涉及到的siRNA水平、蛋白含量和mRNA含量的检测，均是通过向小鼠体内注射RNA递送系统，建立了小鼠干细胞体外模型。利用qRT-PCR检测细胞、组织中mRNA和siRNA表达水平。对于siRNA的绝对定量利用标准品绘制标准曲线的方式进行确定。每个siRNA或mRNA相对于内参的表达量可以用2-ΔCT表示，其中ΔCT＝C样品-C内参。扩增siRNA时内参基因为U6 snRNA(组织中)或miR-16(血清、外泌体中)分子，扩增mRNA时基因为GAPDH或18s RNA。利用Western blotting实验检测细胞、组织中蛋白质的表达水平，用ImageJ软件进行蛋白定量分析。
在本发明所提供的图示中，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01,“***”表示P<0.005。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。
实施例1
本实施例提供一种基于病毒载体的RNA递送系统，该系统包含病毒载体，所述病毒载体携带所需递送的RNA片段，所述病毒载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA片段的复合结构，所述复合结构能够进入并结合目标组织，将所述RNA片段送入目标组织。
图16-17显示了腺相关病毒载体和慢病毒载体构建的RNA递送系统具有体内富集和治疗效果，图16显示了腺相关病毒载体在肝、肺、血浆、外泌体的富集效果以及EGFR基因表达量检测，图17显示了慢病毒载体在肝、肺、血浆、外泌体的富集效果以及EGFR基因表达量检测。
在本实施例中，病毒载体还包括启动子和靶向标签。所述病毒载体包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子-RNA序列、启动子-靶向标签、启动子-RNA序列-靶向标签，每一个所述病毒载体中至少包括一个RNA片段和一个靶向标签，所述RNA片段和靶向标签位于相同的线路中或位于不同的线路中。换而言之，病毒载体中可以仅包括启动子-RNA序列-靶向标签，也可以包括启动子-RNA序列、启动子-靶向标签的组合，或是启动子-靶向标签、启动子-RNA序列-靶向标签的组合。
图20-23中，RNA片段1为siREGFR，RNA片段2为siRTNC，靶向标签1为PTP，靶向标签2为RVG，将2种RNA片段和2种靶向标签单独使用或任意组合并构建进病毒载体后，尾静脉注射进入小鼠体内，检测了EGFR siRNA和TNC siRNA在胰腺、脑、血浆和外泌体中的富集效果以及EGFR和TNC的表达量。
进一步地，所述病毒载体还可以包括能够使所述线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列和loop序列，所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列；所述病毒载体包括以下任意一种线路或几种线路的组合：5’-启动子-5’侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列、5’-启动子-靶向标签、5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列。
其中，所述5’侧翼序列优选为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80％的序列，包括与ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc同源性为85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列等。
所述loop序列优选为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80％的序列，包括与gttttggccactgactgac同源性为85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列等。
所述3’侧翼序列优选为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80％的序列，包括与accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag同源性为85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列等。
所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-5位碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时，所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中任意1-5位碱基的反向互补序列。
优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-3位碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时，所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中任意1-3位碱基的反向互补序列。
更为优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-3位连续排列的碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时，所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中任意1-3位连续排列的碱基的反向互补序列。
最为优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中的第9位和/或第10位碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时，所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中第9位和/或第10位的反向互补序列。删除第9位和第10位碱基效果最优。
需要说明的是，上述侧翼序列、补偿序列、loop序列均不是随意选择的，而是基于大量的理论研究和试验确定的，在上述特定侧翼序列、补偿序列、loop序列的配合下，能够最大程度的提高RNA片段的表达率。
图24中，5’-启动子-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列对应递送载体名称为AAV-siRE，5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼对应递送载体名称为AAV-GE11-siRE，图24为静脉注射后siRNA在肝、肺、血浆、外泌体种的富集结果和EGFR蛋白及mRNA的表达量检测结果。
图25中，显示了一组腺病毒载体在肺部的富集效果数据，腺病毒载体中的序列为：2条与5’侧翼序列/loop序列/3’侧翼序列同源性大于80％的明确序列。
上述各序列具体如下表1所示。
名称 序列
5′侧翼序列-1 CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAATTCG
5′侧翼序列-2 CTGGAGGCTTGCTCGGAGGCTGTATGCTGGCTTCG
loop-1 GTTTTGGCCACTGACTGAC
loop-2 GTGGCGGCCACTGACTGAC
3′侧翼序列-1 CACCGGTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCC
3′侧翼序列-2 CAGAGGTCAGGACACAAGGCCTACGACTAGCACTCACATGTCTCAAATGGCC
在病毒载体携带两个或多个线路的情况下，相邻的线路之间可以通过序列1-序列2-序列3相连；其中，序列1优选为CAGATC，序列2可以为由5-80个碱基组成的序列，比如10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个碱基组成的序列均可，优选为10-50个碱基组成的序列，更优选为20-40个碱基组成的序列，序列3优选为TGGATC。
序列2具体如下表2所示。
Figure BDA0003570238430000101
Figure BDA0003570238430000111
更为优选地，在病毒载体携带两个或多个线路的情况下，相邻的线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80％的序列相连；其中，序列4为CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC。
图26，是将序列4以及2条与序列4同源性大于80％的序列4-1、4-2构建进AAV载体中，静脉注射9小时后肺部组织的EGFR siRNA含量检测结果。
序列具体如下表3所示。
名称 序列
序列4 CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC
序列4-1 CAGATCTGCTCTAACTCGATTTAGTGAGTCGACCAGTGGATC
序列4-2 CAGATCTGGTTTCACTCATTCTAGTGAGTCGACCAGTGGATC
以上所述的RNA片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列，所述RNA序列能够在目标受体中被表达，所述补偿序列在目标受体中不能被表达。RNA序列可以为siRNA序列、shRNA序列或miRNA序列，优选为siRNA序列。
一个RNA序列的长度为15-25个核苷酸(nt)，优选为18-22nt，比如18nt、19nt、20nt、21nt、22nt均可。此序列长度的范围并不是随意选择的，而是经过反复的试验后确定的。大量试验证明，在RNA序列的长度小于18nt，特别是小于15nt的情况下，该RNA序列大多无效，不会发挥作用，而在RNA序列的长度大于22nt，特别是大于25nt的情况下，则不仅线路的成本大大提高，而且效果也并未优于长度为18-22nt的RNA序列，经济效益差。因此，在RNA序列的长度为15-25nt，特别是18-22nt时，能够兼顾成本与作用的发挥，效果最好。
图27分别显示了不同长度的RNA序列所构建的基因环路静脉注射后的EGFR表达量检测，其中，RNA序列长度分别为18、20、22的质粒分别对应AAV-siRE(18)、AAV-siRE(20)、AAV-siRE(22)。
不同长度的RNA序列如下表4所示。
名称 序列
siRE(18) ACCTATTCCGTTACACACT
siRE(20) ATACCTATTCCGTTACACAC
siRE(22) ATACCTATTCCGTTACACACTT
所述RNA序列选自：EGFR基因的siRNA，KRAS基因的siRNA，VEGFR基因的siRNA，mTOR基因的siRNA，TNF-α基因的siRNA，integrin-α基因的siRNA，B7基因的siRNA，TGF-β1基因的siRNA，H2-K基因的siRNA，H2-D基因的siRNA，H2-L基因的siRNA，HLA基因的siRNA，GDF15基因的siRNA，miRNA-21的反义链，miRNA-214的反义链，TNC基因的siRNA，PTP1B基因的siRNA，mHTT基因的siRNA，Lrrk2基因的siRNA，α-synuclein基因的siRNA，或与上述序列同源性大于80％的RNA序列，或编码上述RNA的核酸分子。
上述各种基因的siRNA以及miRNA的反义链均可以通过抑制该基因、miRNA的表达或突变，从而达到抑制疾病的效果。这些疾病包括但不限于：癌症、肺纤维化、结肠炎、肥胖症、由肥胖症引起的心血管疾病、二型糖尿病、亨廷顿病、帕金森病、重症肌无力、阿尔兹海默病、移植物抗宿主病及其相关疾病。这里的相关疾病指的是上述任意一种或几种疾病的形成或发展过程中出现的关联疾病或并发症、后遗症等，或与上述疾病具有一定相关性的其他疾病。其中，癌症包括但不限于：胃癌、肾癌、肺癌、肝癌、脑癌、血癌、肠癌、皮肤癌、淋巴癌、乳腺癌、膀胱癌、食管癌、头颈部鳞癌、血管瘤、胶质细胞瘤、黑色素瘤。
RNA片段中RNA序列的数量为1条、2条或多条。比如若需治疗脑胶质瘤，则可以在同一个病毒载体载体上联合使用EGFR基因的siRNA和TNC基因的siRNA；若需治疗肠炎，则可以同时使用TNF-α基因的siRNA、integrin-α基因的siRNA和B7基因的siRNA。
以在同一个病毒载体上联合使用“siRNA1”和“siRNA2”为例，该病毒载体的功能结构区可以表示为：(启动子-siRNA1)-连接序列-(启动子-siRNA2)-连接序列-(启动子-靶向标签)，或(启动子-靶向标签-siRNA1)-连接序列-(启动子-靶向标签-siRNA2)，或(启动子-siRNA1)-连接序列-(启动子-靶向标签-siRNA2)等。
更加具体地，该病毒载体的功能结构区可以表示为：(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签)，或(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)，或(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)、(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA1-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)等。其他情况均可以此类推，在此不再赘述。以上连接序列可以为“序列1-序列2-序列3”或“序列4”，一个括号表示一个完整的线路(circuit)。
优选地，上述RNA还可以通过对其中的RNA序列(siRNA、shRNA或miRNA)进行核糖修饰得到，优选2’氟嘧啶修饰。2’氟嘧啶修饰是将siRNA、shRNA或miRNA上嘧啶核苷酸的2’-OH用2’-F替代，2’-F能够使人体内的RNA酶不易识别siRNA、shRNA或miRNA，如此能够增加RNA在体内传输的稳定性。
优选地，上述RNA还可以通过对其中的RNA序列(siRNA、shRNA或miRNA)进行核糖修饰得到，优选2’氟嘧啶修饰。2’氟嘧啶修饰是将siRNA、shRNA或miRNA上嘧啶核苷酸的2’-OH用2’-F替代，2’-F能够使人体内的RNA酶不易识别siRNA、shRNA或miRNA，如此能够增加RNA在体内传输的稳定性。
本实施例中所述的宿主体内的器官，优选肝脏。肝脏是所有哺乳动物组织器官中最活跃的细胞开合组织。
通过特异性地选择感染肝脏后，病毒载体会释放出RNA片段(siRNA、shRNA或miRNA)，肝脏组织能够自发地将RNA片段包裹进外泌体内部，这些外泌体就变成了RNA输送机构(含有所需递送RNA的并具有靶向结构的复合结构)。
为了使该外泌体具有“精确制导”的能力，在注入体内的病毒中可以设计靶向标签，该靶向标签也会被肝脏组织组装到外泌体中，尤其是当选择某些特定的靶向标签时，靶向标签能够被插入外泌体表面，从而成为能够引导外泌体的靶向结构，如此能够大大提高本发明所述的RNA输送机构的精准性，大大提高了潜在药物递送的效率。
靶向标签的选择是需要创造性劳动的过程，一方面需要根据目标组织选取可用的靶向标签，另一方面还需要保证该靶向标签能够在稳定地出现在外泌体的表面，从而达到靶向功能。目前已经筛选出的靶向标签包括靶向肽、靶向蛋白、抗体。其中，靶向肽包括但不限于RVG靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No：1所示)、GE11靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No：2所示)、PTP靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No：3所示)、TCP-1靶向肽(核苷酸序列如SEQ IDNo：4所示)、MSP靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No：5所示)；靶向蛋白包括但不限于RVG-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No：6所示)、GE11-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No：7所示)、PTP-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No：8所示)、TCP-1-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No：9所示)、MSP-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ IDNo：10所示)。
其中，RVG靶向肽、RVG-LAMP2B融合蛋白可以精准靶向脑组织；GE11靶向肽、GE11-LAMP2B融合蛋白可以精准靶向EGFR高表达的器官组织，比如EGFR突变的肺癌组织；PTP靶向肽、PTP-LAMP2B融合蛋白可以精准靶向胰腺，特别是人源及鼠源胰腺癌组织中特异性表达的plectin-1蛋白；TCP-1靶向肽、TCP-1-LAMP2B融合蛋白可以精准靶向结肠；MSP靶向肽、MSP-LAMP2B融合蛋白可以精准靶向肌肉组织。
在实际应用中，靶向标签可以灵活搭配各种不同的RNA片段，不同的靶向标签搭配不同的RNA片段可以起到不同的作用。比如：RVG靶向肽、RVG-LAMP2B融合蛋白可以搭配EGFR基因的siRNA、TNC基因的siRNA或二者的组合治疗胶质母细胞瘤，还可以搭配PTP1B基因的siRNA治疗肥胖症，也可以搭配mHTT基因的siRNA治疗亨廷顿舞蹈症，以及搭配LRRK2基因的siRNA治疗帕金森；GE11靶向肽、GE11-LAMP2B融合蛋白可以搭配EGFR基因的siRNA治疗由EGFR基因高表达或突变诱导的肺癌等疾病；TCP-1靶向肽或TCP-1-LAMP2B融合蛋白可以搭配TNF-α基因的siRNA、integrin-α基因的siRNA、B7基因的siRNA或上述三者的任意组合治疗结肠炎或结肠癌等。
病毒载体的选取和结构设计是本发明所公开的技术的核心内容之一，经研究，病毒载体优选为腺病毒相关病毒(AAV)，更优选为腺病毒相关病毒5型(AAV-5)、腺病毒相关病毒8型(AAV-8)或腺病毒相关病毒9型(AAV-9)。
另外，为了达到精准递送的目的，我们实验了多种病毒载体搭载的方案，得出另一优化的方案：所述病毒载体还可以由具有不同结构的多种病毒构成，其中一种病毒包含启动子和靶向标签，其他病毒包含启动子和RNA片段。即将靶向标签与RNA片段装载到不同的病毒载体中，将两种病毒载体注入体内，其靶向效果不差于将相同的靶向标签与RNA片段装载在一个病毒载体中产生的靶向效果。
更优选地，两种不同的病毒载体注入宿主体内时，可以先将装有RNA序列的病毒载体注入，在1-2小时后再注入含有靶向标签的病毒载体，如此能够达到更优的靶向效果。
以上所述的递送系统均可用于包括人在内的哺乳动物。
为了验证递送系统的可行性，我们进行了如下试验：
首先，参见图15a，我们合理地设计了核心线路(genetic circuit)的基础结构，允许不同功能模块的自由组合。核心线路由启动子部分和siRNA表达部分组成，旨在产生和组织siRNA，作为外泌体(exoso mes)的有效载荷。其他可组合部件(插件)可以集成到核心线路的框架中，以实现即插即用功能。比如合了两种类型的可组合部分以优化siRNA的作用：一种修饰外显体的膜锚定蛋白以实现组织选择性；另一种能够共同表达第二个siRNA，以同时抑制两个分子靶标。
对于核心线路构建体，我们设计了在启动子部分的控制下编码优化的siRNA表达骨架部分的方案，以最大化引导链(guide strand)表达，同时最小化不希望的过客链(passenger strand)表达，参见图15a。表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)是一种在多种人类肿瘤(如肺癌和胶质母细胞瘤)中频繁突变和高表达的癌基因，将其选为siRNA靶点。并选择人胚肾293t细胞(HEK293T)和小鼠肝癌细胞(hep1-6)作为siRNA体外组装的底盘细胞(cell chassis)。为了优化siRNA产生效率，我们比较了两种设计方案：一种是使用CMV启动子表达miRNA前体(pre-miRNA)并用siRNA替换miRNA序列，另一种是使用U6启动子表达短发夹RNA(shRNA)，我们首先研究了一系列miRNA前体结构，并选择pre-miR-155作为产生siRNA的最佳骨架。然后，比较了编码EGFR siRNA(CMV-siRE)和U6定向EGFR shRNA(U6-siRE)的CMV定向(CMV-directed)的pre-miRNA的siRNA产生效率，参见图15b。两种方案在驱动EGFR siRNA导向链转录方面具有相似的效率；但是，与shRNA方法相比，pre-miRNA方法产生的乘客链更少或没有(在成熟的引导链的生物发生过程中，乘客链似乎被降解)，参见图15b。因此，决定选择CMV驱动的pre-miRNA设计来避免脱靶效应。
接下来，我们检查核心线路是否能够引导siRNA自主加载到外泌体。采用CMV-scrR或CMV-siRE基因转染HEK293T细胞，观察细胞培养液中的外泌体。纳米粒追踪分析(NTA)显示各组分泌的外泌体数量相似，大小分布相似，峰值在128-131nm之间。透射电子显微镜(TEM)证实纯化的外泌体呈现典型的圆形囊泡形态，大小正确。此外，特定外显子标记物(CD63、TSG101和CD9)的富集仅在纯化的外泌体中检测到，而在细胞培养基中未检测到。这些结果表明，线路转染并不影响HEK293T细胞产生的外泌体的大小、结构或数量。最后，在CMV-siRE线路转染的HEK293T和Hepa 1–6细胞衍生的外泌体中检测到大量的EGFR siRNA，参见图15c。当这些外泌体与小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞一起孵育时，EGFR表达的剂量依赖性降低，参见图15d、图15e，表明外泌体siRNA具有生物学功能。
为了设计线路的靶向标签，将编码Lamp2b蛋白(一种典型的外体膜蛋白)的N末端融合的靶向标签的序列插入CMV启动子的下游，参见图15a。这个标签通过Lamp2b锚定在外泌体表面，从而引导复合结构外泌体运送到所需的组织。具体而言，选择以RVG肽为靶点的中枢神经系统作为标记，将外泌体导入大脑(RVG已被证明有助于外泌体穿过血脑屏障进入神经细胞)，首先评估启动子启动RVG-Lamp2b融合蛋白表达的效率。经过试验证明，CMV启动子在HEK293T细胞中产生RVG-Lamp2b mRNA和标记蛋白eGFP方面有一定的效果，而U6启动子则没有效果，这证实了CMV启动子连接线路各部分的优势。然后使用免疫沉淀法验证引导靶向标签在外泌体表面正确表达。由于试验暂时缺乏抗RVG抗体，因此采用Flag标签暂时代替RVG。在用CMV引导的Flag-Lamp2b电路转染HEK293T和Hepa 1-6细胞后，用抗Flag珠成功地免疫沉淀完整的外泌体，参见图15f，证明了靶向标签的精确定位。为了设计额外的siRNA表达部分，使用与许多癌症特别是胶质母细胞瘤相关的关键癌基因tenascin-C(TNC)作为第二个siRNA靶点。TNC-siRNA也被嵌入前miR-155骨架中，并插入EGFR-siRNA的下游，参见图15。无论单个(CMV siRE或CMV siRT)或串联(CMV siRE)转录，均检测到了相差无几的EGFR和TNC siRNA，参见图15g。总之，这些结果表明，不论是siRNA还是靶向标签，其都可以在线路中发挥其各自的作用。
接下来，我们研究了线路是否能够自组装成外泌体。采用编码EGFR和TNC siRNAs的CMV导向电路以及RVG标记(CMV-RVG-siRE)转染HEK293T细胞。结果显示来自细胞培养基的外泌体显示出典型的形态和大小分布，表明用复合核心线路修饰不会改变外泌体的物理性质。此外，我们构建了一个完整的线路，包括EGFR和TNC-siRNAs和一个靶向标签(CMV-Flag-siRE)，用其转染的HEK293T和hep1-6细胞产生的外泌体成功地进行了免疫沉淀，EGFR和TNC siRNA都大量存在于免疫沉淀的外泌体中，参见图15h。
此外，AGO2在生物体内广泛表达，是RNA诱导沉默复合体的核心成分，其具有核糖核酸内切酶活性，可通过促进siRNA的成熟并调节其生物合成及功能，进而抑制靶基因的表达。
由于siRNA的加工依赖于Argonaute 2(AGO2)，并且将siRNA适当地装载到AGO2中有望增强siRNA的靶向作用，因此我们进行了另一项免疫沉淀实验以评估AGO2与外泌体中siRNA的关联。试验证明在用AGO2抗体(anti-AGO2)沉淀的外泌体中很容易检测到EGFR和TNC siRNA，这表明我们的设计可确保将siRNA加载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，并促进AGO2结合的siRNA高效转运到外泌体。最后，为了研究体外组装的siRNA是否具有功能，将用CMV-RVG-siRE+T线路转染的HEK293T细胞衍生的外泌体与U87MG胶质母细胞瘤细胞一起孵育。在U87MG细胞中实现了EGFR和TNC表达的剂量依赖性下调，参见图15i、图15j。此外，外泌体表面的RVG标签不影响EGFR和TNC siRNA对靶标的沉默效果。这些结果将线路确立为多个可组合部分的有机组合，正是这些部分的巧妙配合使得RNA能够自组装和释放。
因此，本实施例提供的基于病毒载体的RNA递送系统以病毒作为载体，病毒载体作为成熟的注入物，其安全性和可靠性已被充分验证，成药性非常好。最终发挥效果的RNA序列由内源性外泌体包裹输送，不存在任何免疫反应，无需验证该外泌体的安全性。该递送系统可以递送各类小分子RNA，通用性强。并且病毒载体的制备要比外泌体或是蛋白质、多肽等物质的制备便宜地多，经济性好。本实施例提供的基于病毒载体的RNA递送系统在体内自组装后能够与AGO2紧密结合并富集为复合结构(外泌体)，不仅能防止其过早降解，维持其在循环中的稳定性，而且有利于受体细胞吸收、胞浆内释放和溶酶体逃逸，所需剂量低。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例提供一种药物。该药物包括该系统包括病毒载体，所述病毒载体携带有所需递送的RNA片段，所述病毒载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA片段的复合结构，所述复合结构能够进入并结合目标组织，将所述RNA片段送入目标组织。RNA片段送入目标组织后，能够抑制与其相匹配的基因的表达，进而抑制目标组织中疾病的发展。
可选地，所述RNA片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列，所述RNA序列是具有医学意义的siRNA、shRNA或miRNA。
图18-19中，2种腺病毒分别表示为ADV1、ADV2，6种RNA分别为：siRE(靶基因为EGFR)、siRT(靶基因为TNC)、shRE(靶基因为EGFR)、siRT(靶基因为TNC)、miR-7(靶基因为EGFR)、miR-133b(靶基因为EGFR)。图18表示2种腺病毒载体构建的12种基因环路静脉注射后相应蛋白的表达量，图19表示2种腺病毒载体与6种RNA序列中的任意2种或任意3种RNA序列组成的RNA片段构建后，静脉注射后的蛋白表达量。
RNA序列具体如下表5所示。
Figure BDA0003570238430000151
Figure BDA0003570238430000161
可选地，所述病毒载体包括启动子和靶向标签，所述靶向标签能够在宿主的器官组织中形成所述复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述RNA片段递送进入目标组织。
关于本实施例中上述病毒载体、RNA片段、靶向标签等的解释说明均可以参考实施例1，在此不再赘述。
该药物可以通过口服、吸入、皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式进入人体后，通过实施例1所述的基于病毒载体的RNA递送系统递送至目标组织，发挥治疗作用。
该药物可以为治疗癌症、肺纤维化、结肠炎、肥胖症、由肥胖症引起的心血管疾病、二型糖尿病、亨廷顿病、帕金森病、重症肌无力、阿尔兹海默病或移植物抗宿主病的药物。
本实施例的药物还可以包括药学上可以接受的载体，该载体包括但不限于稀释剂、缓冲剂、乳剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、佐剂、干燥剂、吸附载体等。
本实施例提供的药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂等。
本实施例提供的药物以病毒作为载体，病毒载体作为成熟的注入物，其安全性和可靠性已被充分验证，成药性非常好。最终发挥效果的RNA序列由内源性外泌体包裹输送，不存在任何免疫反应，无需验证该外泌体的安全性。该药物可以递送各类小分子RNA，通用性强。并且病毒的制备要比外泌体或是蛋白质、多肽等物质的制备便宜地多，经济性好。本申请提供的药物在体内自组装后能够与AGO2紧密结合并富集为复合结构(外泌体)，不仅能防止其过早降解，维持其在循环中的稳定性，而且有利于受体细胞吸收、胞浆内释放和溶酶体逃逸，所需剂量低。
实施例3
在实施例1或2的基础上，本实施例提供一种基于病毒载体的RNA递送系统在药物中的应用，该药物为治疗结肠炎的药物，本实施例将通过以下两个试验对基于病毒载体的RNA递送系统在结肠炎治疗方面的效果进行具体说明。
在第一个试验中，我们设置三个试验组和两个对照组，三个试验组分别为AAV-CMV-siRTNF-α(low)组、AAV-CMV-siRTNF-α(medium)组、AAV-CMV-siRTNF-α(high)组；对照组分别为Normal组、AAV-CMV-scrR组。
试验过程如图1A所示，AAV-CMV-siRTNF-α(low)组、AAV-CMV-siRTNF-α(medium)组、AAV-CMV-siRTNF-α(high)组分别利用肝脏高亲和的AAV-5型腺相关病毒包裹TNF-αsiRNA系统(AAV-CMV-siRTNF-α)，通过尾静脉注射滴度为1012V.g/ml的AAV溶液，25μL、50μL、100μL至小鼠体内。
通过小动物活体监测AAV系统的体内表达情况，结果如图1B所示，3周后可见AAV系统在体内尤其是肝脏，稳定表达，其中AAV-CMV-siRTNF-α(high)组，平均辐亮度(AverageRadiance)达到8.42*105(p/sec/cm2/sr)，且表达部位在肝脏，这说明AAV系统的表达具有剂量依赖效应。
随即开始构建DSS诱导的慢性结肠炎模型，期间每两天进行称重记录，结果如图1C所示，可以看出AAV包裹的CMV-siR TNF-α系统能够减轻慢性结肠炎小鼠的体重下降情况，并且3个试验组的小鼠在炎症缓解期体重回复的速度也显著快于AAV-CMV-scrR组。
第十周模型构建结束，通过小动物活体监测AAV系统的体内表达情况而后处死小鼠进行结肠的观察，结果如图1D所示，可以看出AAV-CMV-siRTNF-α(low)组、AAV-CMV-siRTNF-α(medium)组、AAV-CMV-siRTNF-α(high)组小鼠结肠的红肿情况有不同程度的减轻，慢性炎症导致的结肠长度缩短也有不同程度的改善，其中AAV-CMV-siRTNF-α(high)组炎症情况的改善最为显著。
分别对各组小鼠的疾病指数进行评分统计，结果如图1E所示，可以看出AAV-CMV-siRTNF-α(high)组的小鼠疾病指数低于AAV-CMV-siRTNF-α(low)组、AAV-CMV-siRTNF-α(medium)组和AAV-CMV-scrR组。
分别检测各组小鼠体内的TNF-αsiRNA水平，结果如图1F所示，可以看出三个试验组小鼠体内TNF-αsiRNA水平均较高，而对照组AAV-CMV-scrR组小鼠体内几乎无TNF-αsiRNA的表达，这说明上述的AAV系统能够产生一定量的TNF-αsiRNA。
分别检测各组小鼠体内的TNF-αmRNA水平，结果如图1G所示，可以看出Normal组和三个试验组的小鼠体内TNF-αmRNA水平均比较低，而AAV-CMV-scrR组小鼠体内TNF-αmRNA水平则较高，这说明AAV系统能够降低结肠TNF-α的表达及分泌。
对小鼠结肠内的促炎细胞因子IL-6、IL-12、IL-23进行检测，结果如图2A所示，可见Normal组和AAV-CMV-siRTNF-α(high)组小鼠促炎细胞因子的分泌最少，AAV-CMV-scrR组小鼠促炎细胞因子的分泌最多。
对小鼠结肠切片进行HE染色以及病理评分统计，结果如图2B、图2C所示，可以看出试验组，尤其是AAV-CMV-siRTNF-α(high)组小鼠结肠黏膜完整性更高，且免疫细胞的浸润程度更浅，结肠隐窝脓肿以及结肠的充血和出血情况也显著轻于AAV-CMV-scrR组。
以上试验说明，利用亲和肝脏的AAV包裹CMV-siRTNF-α回路，能够实现长期的TNF-αsiRNA表达以及长期的TNF-α沉默，并且能够在一定程度上缓解结肠炎，具有极大的成药潜力以及临床研究价值。
在第二个试验中，我们设置三个试验组和两个对照组。其中，试验组分别为AAV-CMV-siRT+B+I(low)组、AAV-CMV-siRT+B+I(medium)组、AAV-CMV-siRT+B+I(high)组；对照组分别为Normal组、AAV-CMV-scrR组。
AAV-CMV-siRT+B+I(low)组、AAV-CMV-siRT+B+I(medium)组、AAV-CMV-siRT+B+I(high)组分别利用肝脏高亲和的AAV-5型腺相关病毒包裹TNF-αsiRNA，B7-siRNA以及Integrinα4siRNA元件串联递药系统(AAV-CMV-siRT+B+I)，通过尾静脉注射滴度为1012V.g/ml的AAV溶液25μL、50μL、100μL至小鼠体内。
通过小动物活体监测AAV系统的体内表达情况，结果如图3A所示，3周后可见AAV系统在体内尤其是肝脏，稳定表达，并且AAV系统的表达具有剂量依赖效应。
随即开始构建DSS诱导的慢性结肠炎模型，期间每两天进行称重记录，结果如图3B所示，可以看出AAV包裹的CMV-siRT+B+I系统能够减轻慢性结肠炎小鼠的体重下降情况，并且三个试验组的小鼠在炎症缓解期体重回复的速度也显著快于AAV-CMV-scrR组。
第十周模型构建结束，通过小动物活体监测AAV系统的体内表达情况而后处死小鼠进行结肠的观察，结果如图3C所示，可以看出AAV-CMV-siRT+B+I(low)组、AAV-CMV-siRT+B+I(medium)组、AAV-CMV-siRT+B+I(high)组小鼠结肠的红肿情况有不同程度的减轻，慢性炎症导致的结肠长度缩短也有不同程度的改善，其中AAV-CMV-siRT+B+I(high)组炎症情况的改善最为显著。
分别对各组小鼠的疾病指数进行评分统计，结果如图4A所示，可以看出AAV-CMV-siRT+B+I(high)组的小鼠疾病指数低于AAV-CMV-siRT+B+I(low)组、AAV-CMV-siRT+B+I(medium)组和AAV-CMV-scrR组。
对小鼠血浆中TNF-αsiRNA、B7 siRNA以及integrinα4 siRNA进行检测，结果如图4B、图4C、图4D所示，可见AAV包裹的CMV-siRT+B+I系统在小鼠血浆中生成了一定量的稳定表达的siRNA，并且呈现剂量依赖效应。
对小鼠肝脏中TNF-αsiRNA、B7 siRNA以及integrinα4 siRNA进行检测，结果如图4E、图4F、图4G所示，可见AAV包裹的CMV-siRT+B+I系统在小鼠肝脏中生成了一定量的稳定表达的siRNA，并且呈现剂量依赖效应。
对小鼠结肠中TNF-αsiRNA、B7 siRNA以及integrinα4 siRNA进行检测，结果如图5A、图5B、图5C所示，可见AAV包裹的CMV-siRT+B+I系统在小鼠结肠中生成了一定量的稳定表达的siRNA，并且呈现剂量依赖效应。
对小鼠结肠中TNF-αmRNA、B7 mRNA以及integriα4 mRNA进行检测，结果如图5D、图5E、图5F所示，可见AAV包裹的CMV-siRT+B+I系统显著降低了小鼠结肠中TNF-α、B7以及integrinα4 mRNA表达。
对小鼠结肠切片进行HE染色以及病理评分统计，结果如图6A和图6B所示。可见试验组，尤其是AAV-CMV-siRT+B+I(high)组小鼠结肠黏膜完整性更高，且免疫细胞的浸润程度更浅，结肠隐窝脓肿以及结肠的充血和出血情况也显著轻于AAV-CMV-scrR组。
以上试验说明，利用亲和肝脏的AAV包裹CMV-siRT+B+I回路，能够实现长期的TNF-αsiRNA、B7 siRNA以及integrinα4 siRNA表达以及多个靶基因沉默，并且显著缓解结肠炎症程度，具有极大的成药潜力以及临床研究价值。
实施例4
在实施例1或2的基础上，本实施例提供一种基于病毒载体的RNA递送系统在药物中的应用，该药物为治疗肺癌的药物，本实施例将通过以下四个试验对基于病毒载体的RNA递送系统在肺癌治疗方面的效果进行具体说明。
在第一个试验中，我们利用肝脏高亲和的AAV-5型腺相关病毒包裹EGFR siRNA系统(AAV-CMV-EGFR siRNA)和KRAS siRNA系统(AAV-CMV-KRAS siRNA)，尾静脉注射100μL滴度为1012V.g/ml的AAV溶液至小鼠体内。通过小动物活体监测AAV系统的体内表达情况，3周后可见AAV系统在体内尤其是肝脏，稳定表达。
在第二个试验中，设置1个试验组和2个对照组，其中，试验组为AAV-CMV-KRAS-siRNA组，对照组为PBS组和AAV-CMV-scrR组。
各组选取相同数量的小鼠，向小鼠体内注射小鼠肺癌细胞(LLC细胞),采用CT扫描技术观察小鼠模型构建进展。30天后对构建成功的小鼠进行给药，两天给药一次，即每两日向PBS组/AAV-CMV-scrR组/AAV-CMV-KRAS siRNA组小鼠注射一次PBS缓冲液/AAV-CMV-scrR/AAV-CMV-KRAS siRNA进行治疗，分别对小鼠进行生存分析和肿瘤评估，给药7次后停止治疗。
统计各组小鼠在治疗后的100天内的生存情况，结果如图7A所示，可以看出，PBS组和AAV-CMV-scrR组小鼠存活率相差无几，而AAV-CMV-KRAS siRNA组小鼠存活率最高。
给药前后分别对各组小鼠进行CT扫描，根据CT影像图对小鼠肺组织进行3D建模，并计算肿瘤体积大小，结果如图7B所示。在图7B中，“PBS pre”表示给药前的PBS组，“PBSpost”表示给药后的PBS组；“AAV-CMV-scrR pre”表示给药前的AAV-CMV-scrR组，“AAV-CMV-scrR post”表示给药后的AAV-CMV-scrR组；“AAV-CMV-KRAS-siRNA pre”表示给药前的AAV-CMV-KRAS siRNA组，“AAV-CMV-KRAS-siRNA post”表示给药后的AAV-CMV-KRAS siRNA组。可以看出，AAV-CMV-KRAS siRNA组的小鼠在给药后肿瘤体积显著减小，而PBS组和AAV-CMV-scrR组的小鼠在给药后肿瘤体积不仅没有减小，还呈现不同程度的增加。
分别通过RT-qPCR和Western blotting检测各组小鼠肺部KRAS蛋白和mRNA表达水平，结果如图7C、图7D所示。结果显示AAV-CMV-KRAS siRNA组的小鼠肺部KRAS蛋白和mRNA表达量相对于对照组有所降低。
以上试验说明，AAV-CMV-KRAS siRNA对小鼠肺癌肿瘤具有显著的治疗效果。
在第三个试验中，设置1个试验组和2个对照组，其中，试验组为AAV-CMV-EGFRsiRNA组，对照组为PBS组和AAV-CMV-scrR组。
构建EGFR-DEL19小鼠模型，饲喂强力霉素饲料诱导肿瘤产生，30天后对构建成功的小鼠进行给药，两天给药一次，即每两日向PBS组/AAV-CMV-scrR组/AAV-CMV-EGFR siRNA组小鼠注射一次PBS缓冲液/AAV-CMV-scrR/AAV-CMV-EGFR siRNA进行治疗，分别对小鼠进行生存分析和肿瘤评估，给药7次后停止治疗。
统计各组小鼠在治疗后的100天内的生存情况，结果如图8A所示，可以看出，PBS组和AAV-CMV-scrR组小鼠存活率相差无几，而AAV-CMV-EGFR siRNA组小鼠存活率最高。
给药前后分别对各组小鼠进行CT扫描，CT影像如图8E所示，根据图8E的CT影像图对小鼠肺组织进行3D建模，并计算肿瘤体积大小，结果如图8B所示。在图8B中，“PBS pre”表示给药前的PBS组，“PBS post”表示给药后的PBS组；“AAV-CMV-scrR pre”表示给药前的AAV-CMV-scrR组，“AAV-CMV-scrR post”表示给药后的AAV-CMV-scrR组；“AAV-CMV-EGFRsiRNA pre”表示给药前的AAV-CMV-EGFRsiRNA组，“AAV-CMV-EGFR siRNA post”表示给药后的AAV-CMV-EGFR siRNA组。可以看出，AAV-CMV-EGFR siRNA组的小鼠在给药后肿瘤体积显著减小，而PBS组和AAV-CMV-scrR组的小鼠在给药后肿瘤体积不仅没有减小，还呈现不同程度的增加。
分别通过RT-qPCR、Western blotting检测各组小鼠肺部EGFR蛋白和mRNA表达水平，结果如图8C、图8D所示。结果显示AAV-CMV-EGFR siRNA组的小鼠肺部EGFR蛋白和mRNA表达量相对于对照组有所降低。
以上试验说明，AAV-CMV-EGFR siRNA对EGFR突变型小鼠肺癌肿瘤具有显著的治疗效果。
在第四个试验中，设置2个试验组和2个对照组，其中，试验组为AAV-CMV-KRASsiRNA组、AAV-CMV-EGFR siRNA组，对照组为PBS组和AAV-CMV-scrR组。
构建EGFR-DEL19小鼠模型，饲喂强力霉素饲料诱导肿瘤产生，30天后对构建成功的小鼠进行给药，两天给药一次，即每两日向PBS组/AAV-CMV-scrR组/AAV-CMV-EGFR siRNA组/AAV-CMV-KRAS siRNA组小鼠注射一次PBS缓冲液/AAV-CMV-scrR/AAV-CMV-EGFR siRNA/AAV-CMV-KRAS siRNA进行治疗。
在治疗后分别检测各组小鼠中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、血清碱性磷酸酶(ALP)、肌酐(CREA)、血尿素氮(BUN)的含量，结果如图9A-图9F所示，可见，PBS组、AAV-CMV-scrR组、AAV-CMV-EGFR siRNA组、AAV-CMV-KRAS siRNA组小鼠中上述酶的含量均相差无几。
以上试验可以说明，用肝脏高亲和的AAV-5型腺相关病毒包裹EGFR siRNA系统(AAV-CMV-EGFR siRNA)和KRAS siRNA系统(AAV-CMV-KRAS siRNA)安全性好，可靠性高，不会产生负面作用，适于大规模推广和应用。
实施例5
在实施例1或2的基础上，本实施例提供一种基于病毒载体的RNA递送系统在药物中的应用，该药物为治疗肺纤维化的药物，本实施例将通过以下试验对基于病毒载体的RNA递送系统在肺纤维化治疗方面的效果进行具体说明。
在此试验中，利用肝脏高亲和的AAV-5型腺相关病毒包裹抗-miR-21/TGF-β1siRNA/抗-miR-21+TGF-β1siRNA系统，分别得到AAV-anti-miR21/AAV-TGF-β1siRNA/AAV-MIX，尾静脉注射100μL滴度为1012V.g/ml的AAV溶液至小鼠体内。通过小动物活体监测AAV系统的体内表达情况，3周后可见AAV系统在体内尤其是肝脏，稳定表达。
随即选取小鼠进行造模，造模成功后，分别向小鼠注射注射PBS缓冲液/AAV-scrR/AAV-anti-miR21/AAV-TGF-β1siRNA/AAV-MIX(10mg/kg)，形成PBS组/AAV-scrR组/AAV-anti-miR21组/AAV-TGF-β1siRNA组/AAV-MIX组。
分别检测正常小鼠、PBS组小鼠、AAV-scrR组小鼠、AAV-TGF-β1siRNA组小鼠相对TGF-β1 mRNA水平，结果如图10B所示，可见，AAV-TGF-β1siRNA组小鼠相对TGF-β1 mRNA水平相对较低。
分别检测正常小鼠、PBS组小鼠、AAV-scrR组小鼠、AAV-anti-miR21组小鼠相对miR21 mRNA水平，结果如图10C所示，可见，AAV-anti-miR21组小鼠相对miR21 mRNA水平相对较低。
羟脯氨酸是胶原的主要成分，其含量反映了肺纤维化的程度。分别检测各组小鼠羟脯氨酸含量，结果如图10A所示，可见PBS组、AAV-scrR组小鼠体内羟脯氨酸含量最高，AAV-anti-miR21组、AAV-TGF-β1siRNA组、AAV-MIX组小鼠体内羟脯氨酸含量均较低，说明AAV-anti-miR21组、AAV-TGF-β1siRNA组、AAV-MIX组小鼠的肺纤维化得到抑制。
实施例6
在实施例1或2的基础上，本实施例提供一种基于病毒载体的RNA递送系统在药物中的应用，该药物为治疗胶质母细胞瘤的药物，本实施例将通过以下试验对基于病毒载体的RNA递送系统在胶质母细胞瘤治疗方面的效果进行具体说明。
在此试验中，利用肝脏高亲和的AAV-5型腺相关病毒包裹EGFR siRNA系统(AAV-CMV-RVG-siRE)和EGFR siRNA和TNC siRNA系统(AAV-CMV-RVG-siRE+T)，尾静脉注射100μL滴度为1012V.g/ml的AAV溶液至小鼠体内。通过小动物活体监测AAV系统的体内表达情况，3周后可见AAV系统在体内尤其是肝脏，稳定表达。
随即选取小鼠，向小鼠体内注射胶质母细胞瘤细胞(U-87MG-Luc细胞)，自第7天开始至第21天，期间每两日向小鼠注射一次PBS缓冲液/AAV-CMV-scrR/AAV-CMV-RVG-siRE/AAV-CMV-RVG-siRE+T(5mg/kg)进行治疗，形成PBS组/AAV-scrR组/AAV-CMV-RVG-siRE组/AAV-CMV-RVG-siRE+T组。
分别对各组小鼠进行生存分析，统计各组小鼠在接受治疗后20天、40天、60天、80天的存活率，结果如图11A所示，可以看出AAV-CMV-RVG-siRE+T组小鼠的生存时间最长，AAV-CMV-RVG-siRE组次之。
分别对各组小鼠进行肿瘤评估，即在第7天、14天、28天、35天分别对小鼠进行BLI活体成像检测，结果如图11B所示，可以看出AAV-CMV-RVG-siRE+T组小鼠其胶质母细胞瘤的抑制效果最为显著。
实施例7
在实施例1或2的基础上，本实施例提供一种基于病毒载体的RNA递送系统在药物中的应用，该药物为治疗肥胖症的药物，本实施例将通过以下试验对基于病毒载体的RNA递送系统在肥胖症治疗方面的效果进行具体说明。
利用肝脏高亲和的AAV-5型腺相关病毒包裹PTP1B siRNA系统(AAV-CMV-siRP/AAV-CMV-RVG-siRP)，尾静脉注射100μL滴度为1012V.g/ml的AAV溶液至小鼠体内。通过小动物活体监测AAV系统的体内表达情况，3周后可见AAV系统在体内尤其是肝脏，稳定表达。
选取C57BL/6小鼠，12周后分别注射PBS缓冲液/AAV-CMV-scrR/AAV-CMV-siRP/AAV-CMV-RVG-siRP，形成PBS组/AAV-CMV-scrR组/AAV-CMV-siRP组/AAV-CMV-RVG-siRP组，并在24天内每两天注射一次。分别对各组小鼠进行体重变化、覆盖脂肪垫重量、初始食物摄入量、血清瘦素含量、血糖含量、基础葡萄糖含量、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、体长、食物摄入量的检测和统计，结果如下。
如图12A所示，该图为各组小鼠体重对比图，可以看出，AAV-CMV-RVG-siRP组的小鼠体重最为稳定。
如图12B所示，该图为各组小鼠的附睾脂肪垫重量对比图，可以看出，AAAV-CMV-RVG-siRP组的小鼠附睾脂肪垫重量最轻。
如图12C所示，该图为各组小鼠初始食物摄入量曲线对比图。可以看出，AAV-CMV-RVG-siRP组的小鼠食物摄入量最少。
如图12D所示，该图为各组小鼠血清瘦素含量对比图。可以看出，AAV-CMV-RVG-siRP组的小鼠血清瘦素含量最低。
如图12E所示，该图为各组小鼠血糖变化曲线对比图。可以看出，AAV-CMV-RVG-siRP组的小鼠血糖含量最低。
如图12F所示，该图为各组小鼠基础葡萄糖变化曲线对比图。可以看出，AAV-CMV-RVG-siRP组的小鼠基础葡萄糖含量最低。
如图13A-图13C所示，此三幅图分别为各组小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)对比图，可以看出，AAV-CMV-RVG-siRP组的小鼠TC、TG、LDL最低。
如图13D所示，该图为各组小鼠的体长对比图，可以看出，四组小鼠体长相差无几。
如图13E所示，该图为各组小鼠HFD食物摄入量对比图，可以看出，四组小鼠HFD食物摄入量同样相差无几。
以上试验可以说明，AAV-CMV-siRP、AAV-CMV-RVG-siRP对肥胖具有一定程度的抑制作用。
实施例8
在实施例1或2的基础上，本实施例提供一种基于病毒载体的RNA递送系统在药物中的应用，该药物为治疗亨廷顿病的药物，本实施例将通过以下试验对基于病毒载体的RNA递送系统在亨廷顿病治疗方面的效果进行具体说明。
在此试验中，利用肝脏高亲和的AAV-5型腺相关病毒包裹HTT siRNA系统(AAV-CMV-siRmHTT/AAV-CMV-RVG-siRmHTT)，尾静脉注射100μL滴度为1012V.g/ml的AAV溶液至小鼠体内。通过小动物活体监测AAV系统的体内表达情况，3周后可见AAV系统在体内尤其是肝脏，稳定表达。
随即选取小鼠进行造模，造模完成后向小鼠注射PBS缓冲液/AAV-CMV-scrR/AAV-CMV-siRmHTT/AAV-CMV-RVG-siRmHTT,形成PBS组/AAV-CMV-scrR组/AAV-CMV-siRmHTT组/AAV-CMV-RVG-siRmHTT组。尾静脉注射上述溶液后，分离血浆外泌体，用PKH26染料标记后与细胞进行共培，观察细胞对外泌体的吸收情况，结果如下。
如图14A所示，该图为各组小鼠血浆外泌体中siRNA水平对比图，可以看出，AAV-CMV-siRmHTT组和AAV-CMV-RVG-siRmHTT组小鼠血浆的外泌体中siRNA水平较高。
如图14B所示，该图为小鼠血浆外泌体与细胞共培后，各组小鼠的相对mHTT mRNA水平对比图，可以看出，AAV-CMV-siRmHTT组和AAV-CMV-RVG-siRmHTT组小鼠相对mHTT mRNA水平较低，这说明AAV-CMV-siRmHTT与AAV-CMV-RVG-siRmHTT可以降低HTT mRNA水平，即组装进入外泌体的siRNA仍然可以发挥基因沉默功能。
如图14C所示，该图为小鼠肝脏siRNA绝对水平对比图，可以看出，AAV-CMV-siRmHTT组和AAV-CMV-RVG-siRmHTT组的小鼠绝对siRNA水平较高。
如图14D所示，该图为小鼠血浆siRNA绝对水平对比图，可以看出，AAV-CMV-siRmHTT组和AAV-CMV-RVG-siRmHTT组的小鼠绝对siRNA水平较高。
如图14E所示，该图为野生型小鼠(WT)、AAV-CMV-scrR组、AAV-CMV-RVG-siRmHTT组的小鼠下降潜伏期对比图，可以看出在0周时，三组小鼠的下降潜伏期比较一致，在第4周和第8周时，CMV-scrR组的小鼠下降潜伏期最短。
如图14F所示，该图为AAV-CMV-scrR组、AAV-CMV-RVG-siRmHTT组小鼠的皮质和纹状体中相对mHTT mRNA水平对比图，可以看出，不论是在皮质还是在纹状体中，AAV-CMV-RVG-siRmHTT组小鼠的mHTT mRNA水平均低于AAV-CMV-scrR组。
以上试验可以说明，静脉注射AAV-CMV-RVG-siRmHTT有助于纹状体和皮层mHTT蛋白和毒性聚集体减少，从而发挥对亨廷顿舞蹈症的治疗作用。
在本文中，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等仅用于表示相关部分之间的相对位置关系，而非限定这些相关部分的绝对位置。
在本文中，“第一”、“第二”等仅用于彼此的区分，而非表示重要程度及顺序、以及互为存在的前提等。
在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。
除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。
上面结合附图对本申请优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本申请并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请构思的前提下做出各种变化。

Claims (19)

1.一种基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，该系统包括病毒载体，所述病毒载体携带有所需递送的RNA片段，所述病毒载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA片段的复合结构，所述复合结构能够进入并结合目标组织，将所述RNA片段送入目标组织。
2.如权利要求1所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述病毒载体为腺病毒相关病毒。
3.如权利要求2所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述腺病毒相关病毒为腺病毒相关病毒5型、腺病毒相关病毒8型或腺病毒相关病毒9型。
4.如权利要求1所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述RNA片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列，所述RNA序列是具有医学意义的siRNA、shRNA或miRNA。
5.如权利要求1所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述病毒载体包括启动子和靶向标签，所述靶向标签能够在宿主的器官组织中形成所述复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述RNA片段递送进入目标组织。
6.如权利要求5所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述病毒载体中包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子-RNA片段、启动子-靶向标签、启动子-RNA片段-靶向标签；每一个所述病毒载体中至少包括一个RNA片段和一个靶向标签，所述RNA片段和靶向标签位于相同的线路中或位于不同的线路中。
7.如权利要求6所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述病毒载体还包括能够使所述线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列和loop序列，所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列；
所述病毒载体中包括以下任意一种线路或几种线路的组合：5'-启动子-5'侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列、5'-启动子-靶向标签、5'-启动子-靶向标签-5'侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列。
8.如权利要求7所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述5’侧翼序列为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80％的序列；
所述loop序列为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80％的序列；
所述3’侧翼序列为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80％的序列；
所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-5位碱基。
9.如权利要求6所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，在病毒载体中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列1-3组成的序列相连；
其中，序列1为CAGATC，序列2是由5-80个碱基组成的序列，序列3为TGGATC。
10.如权利要求9所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，在病毒载体中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80％的序列相连；
其中，序列4为CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC。
11.如权利要求1所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述器官组织为肝脏，所述复合结构为外泌体。
12.如权利要求5所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白。
13.如权利要求12所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述靶向肽包括RVG靶向肽、GE11靶向肽、PTP靶向肽、TCP-1靶向肽、MSP靶向肽；
所述靶向蛋白包括RVG-LAMP2B融合蛋白、GE11-LAMP2B融合蛋白、PTP-LAMP2B融合蛋白、TCP-1-LAMP2B融合蛋白、MSP-LAMP2B融合蛋白。
14.如权利要求5所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述RNA序列的长度为15-25个核苷酸。
15.如权利要求14所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述RNA序列选自以下RNA中的任意一种或几种：EGFR基因的siRNA，KRAS基因的siRNA，VEGFR基因的siRNA，mTOR基因的siRNA，TNF-α基因的siRNA,integrin-α基因的siRNA，B7基因的siRNA，TGF-β1基因的siRNA，H2-K基因的siRNA，H2-D基因的siRNA，H2-L基因的siRNA，HLA基因的siRNA，GDF15基因的siRNA，miRNA-21的反义链，miRNA-214的反义链，TNC基因的siRNA，PTP1B基因的siRNA，mHTT基因的siRNA，Lrrk2基因的siRNA，α-synuclein基因的siRNA，或与上述序列同源性大于80％的RNA序列，或编码上述RNA的核酸分子。
16.如权利要求1所述的基于病毒载体的RNA递送系统，其特征在于，所述递送系统为用于包括人在内的哺乳动物中的递送系统。
17.一种权利要求1-16任意一项所述的基于病毒载体的RNA递送系统在药物中的应用。
18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。
19.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗癌症、肺纤维化、结肠炎、肥胖症、由肥胖症引起的心血管疾病、二型糖尿病、亨廷顿病、帕金森病、重症肌无力、阿尔兹海默病或移植物抗宿主病的药物。
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