CN108624590A - 一种抑制DDR2表达的siRNA及其应用 - Google Patents

一种抑制DDR2表达的siRNA及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种抑制DDR2表达的siRNA，依据siRNA的设计原理，针对DDR2基因的mRNA序列设计了一对siRNA，该对siRNA可以用于抑制DDR2基因的表达，由于DDR2基因的表达水平与病理状态下动脉粥样硬化的病变面积密切相关，抑制DDR2基因的表达可以有效的延缓动脉粥样硬化的病理进程，达到治疗动脉粥样硬化的目的，有很好的实用价值。

Description

一种抑制DDR2表达的siRNA及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抑制DDR2表达的siRNA，本发明还涉及一种抑制DDR2表达的siRNA的应用。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis)是严重危害人类健康的主要疾病之一，动脉粥样硬化也是心肌缺血、心肌梗死、脑中风等心脑血管病的主要病理基础，常与高血压、高血脂或糖尿病等共同存在。动脉粥样硬化导致的心血管疾病在发达国家死亡原因中居首位。近年来，在我国随着社会经济的发展，心血管病发病率与死亡率也逐渐增加，甚至成为主要疾病致死原因。
盘状结构域受体2(discoidin domain receptor tyrosine kinases 2，DDR2)是具有酪氨酸激酶活性的一种胶原受体，该受体在动脉粥样硬化病变中表达，并能够被动脉粥样硬化病变最主要的Ⅰ和Ⅲ型胶原纤维缓慢激活，DDR2被激活后能够促进平滑肌的迁徙和增生，也能使平滑肌分泌细胞外基质，增加动脉粥样硬化的病变面积。因此，下调或抑制DDR2的蛋白表达，减少动脉粥样硬化斑块的形成，是治疗心脑血管疾病的一种有效途径。
siRNA(小分子干扰RNA)是根据基因组序列设计的20多个核苷酸组成的短链RNA，用于启动转录后水平的基因沉默，从而特异性降解细胞内靶mRNA，以此降低目标蛋白的表达。siRNA在2001年就已经开始用于哺乳动物细胞中，目前，已有siRNA药物上市并取得良好的疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制DDR2表达的siRNA，能有效下调或抑制DDR2的蛋白表达，减少动脉粥样硬化斑块的形成。
本发明的第二个目的是提供一种抑制DDR2表达的siRNA的应用。
本发明所采用的技术方案是，一种抑制DDR2表达的siRNA，其中siRNA含有以下核酸序列：
正义序列：5’-GCCUCUGGUAUGAAGUACCUU-3’；
反义序列：5’-AAGGUACUUCAUACCAGAGGC-3’。
siRNA抑制DDR2的转录，减小动脉粥样硬化的病变面积。
siRNA抑制动脉粥样硬化的病变细胞的迁移和增殖。
本发明所采用的第二种技术方案是，一种抑制DDR2表达的siRNA作为治疗心脑血管病的生物制药中的应用。
心脑血管病主要为动脉粥样硬化性心肌缺血、动脉粥样硬化性心肌梗死、动脉粥样硬化性脑中风。
本发明的有益效果是：本发明一种抑制DDR2表达的siRNA，依据siRNA的设计原理，针对DDR2基因的mRNA序列设计了一对siRNA，该对siRNA可以用于抑制DDR2基因的表达，由于DDR2基因的表达水平与病理状态下动脉粥样硬化(atherosclerosis)的病变面积密切相关，抑制DDR2基因的表达可有效的延缓动脉粥样硬化的病理进程，达到治疗动脉粥样硬化的目的，有很好的实用价值。
附图说明
图1是本发明大鼠主动脉血管平滑肌细胞的鉴定图；
图2是本发明转染siRNA后，荧光定量PCR检测DDR2mRNA表达水平的柱状图；
图3是本发明转染siRNA后，western-blot检测DDR2表达图；
其中，图3A为对照组和200nmo1/L siRNA组、400nmo1/L siRNA组、800nmo1/LsiRNA组的蛋白量表达图；
图3B为对照组和200nmo1/L siRNA组、400nmo1/L siRNA组、800nmo1/L siRNA组的Western-blot鉴定结果图；
图4是本发明siRNA干扰后抑制平滑肌细胞增殖的结果；
其中，图4A为阴性对照组、200nmo1/L siRNA组、400nmo1/L siRNA组、800nmo1/LsiRNA组的增殖细胞显微图；
图4B为阴性对照组、200nmo1/L siRNA组、400nmo1/L siRNA组、800nmo1/L siRNA组的增殖细胞数量柱状图；
图5是本发明划痕实验表明抑制DDR2的表达可以抑制平滑肌细胞的迁移结果；
其中，图5A为平滑肌细胞划痕实验图；
图5B为划痕实验定量图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一、大鼠主动脉平滑肌细胞的原代培养
取成年SD大鼠，引颈处死后，常规消毒灭菌，超净工作台下剖开腹腔，取出大鼠主动脉，放置于6cm的培养皿中，灭菌PBS冲洗血管，灭菌手术器械去除主动脉外层脂肪和结缔组织，将血管纵向剪开呈片状，用镊子轻刮内皮，去除内皮层，只留下血管中膜，将血管剪为1mm2的小块，使血管碎片均匀的平铺在培养瓶中，倒置培养瓶，加入含20％血清和0.5％双抗的DMEM培养液4ml；放入37℃，5％CO2的培养箱中，血管碎片贴壁后，培养瓶放正，每天观察细胞及培养液，及时换液；当平滑肌细胞从血管组织块中爬出，到约90％的密度后，进行传代。
二、大鼠主动脉平滑肌细胞的鉴定
将细胞爬片置于6孔板中，倒去培养基，用0.01mol/L PBS(pH＝7.2-7.4)的溶液浸洗3次，每次间隔5min；然后用4％多聚甲醛固定30min，PBS清洗3次，5min/次；0.1％TritonX-100反应15min，PBS清洗3次，5min/次；3％H2O2-甲醇封闭15min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS漂洗3次，5min/次；加用PBS适当稀释的平滑肌α肌动蛋白(SM-α-actine)稀释比为1:500，每张切片加入约50μL稀释液覆盖，4℃过夜；PBS冲洗3次，5min/次。
弃去PBS液，每张切片加50-100μL的A液(DAKO REALEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE是标记有辣根过氧化物酶和抗兔及抗小鼠免疫球蛋白的多聚体分子，相当于二抗)，室温下孵育45min；PBS冲洗3次，5min/次；甩去PBS液，每张切片加50-100μL新鲜配制的DAB(Diaminobenzidine二氨基联苯胺缓冲液溶液)，显微镜控制显色。
显色完全后，使用蒸馏水或自来水冲洗、苏木素复染、1％盐酸乙醇分化、自来水冲洗、氨水返蓝、流水冲洗。爬片经过梯度乙醇(70％-100％)脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
将处理过的爬片正置于显微镜下观察，如图1所示，胞质内大量棕黄色、与细胞长轴平行的纤维细丝，即平滑肌α肌动蛋白丝，核卵圆形居中。
三、siRNA的转染方式
根据DDR2启动子转录序列，设计siRNA：
正义链：5’-GCCUCUGGUAUGAAGUACCUU-3’；
反义链：5’-AAGGUACUUCAUACCAGAGGC-3’。
将该序列在人类基因组数据库中比对，确定没有与它相同的其它序列。其中siRNA由上海吉玛生物科技有限公司合成。
将20-80 pmol siRNA双链用100μL的siRNA转染培养基(无血清无抗生素的培养基)稀释；将6μL的siRNA转染试剂(罗氏)，用100μL的siRNA转染培养基稀释。
用加样器将siRNA双股溶液直接加入稀释后的转染试剂中，轻轻混匀并在室温下孵育15-45min。用2ml的siRNA转染培养基漂洗细胞三次；吸去培养基并迅速进行下一步。每次转染，每管siRNA转染试剂混合液中加入0.8ml siRNA转染培养基，轻轻混匀并覆盖到漂洗过的细胞上。
四、siRNA抑制DDR2 mRNA的表达
大鼠主动脉平滑肌细胞培养于含20％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％C02培养箱培养。将大鼠主动脉平滑肌细胞以3.5x104个/孔接种到24孔培养板中，设置阴性对照组、400nmo1/L siRNA组、800nmo1/L siRNA组。
37℃、5％C02培养箱培养过夜，无双抗无血清的培养基中，按siRNA-Mate TM说明步骤，将合成的siRNA按相应的剂量转染细胞。
转染48h后收集细胞，Trizo1提取总RNA，TaKaRa Primer Script RT反转录试剂盒进行反转录。荧光定量PCR检测样本中DDR2mRNA表达水平，以GAPDH作为内参，采用2一ΔΔC'法计算每个基因的相对mRNA表达量，每组实验做3个平行，每个实验重复三次：
反应体系为10μ1；反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15sec，60℃退火20sec，72℃，20s循环40次。
结果表明：如图2所示，阴性对照组、400nmo1/L siRNA组、800nmo1/L siRNA组的DDR2转录水平的表达量依次明显下降，由上可知siRNA能够显著抑制平滑肌细胞中DDR2基因的mRNA表达。
五、WesternB1ot检测siRNA对DDR2蛋白表达的抑制情况
将大鼠主动脉平滑肌细胞以1.5x105个/孔接种到6孔细胞培养板中，在37℃、5％C02培养箱细胞培养24h，按siRNA-MateTM说明步骤转染，设阴性对照组和200nmo1/L siRNA组、400nmo1/L siRNA组、800nmo1/L siRNA组。转染48h后，吸除培养基，用PBS冲洗两遍，加入100μL细胞裂解液，在冰浴上裂解10min，用细胞刮板将细胞刮下，转移至1.5m1离心管中，10000rpm的速度离心5min后，取上清液测定蛋白浓度。
每组取20μg蛋白进行SDS-PAGE，电泳完成后转至PVDF膜上，封闭后进行DDR2一抗及羊抗免二抗孵育，然后进行化学发光反应，显影。
结果表明：如图3A和图3B所示，siRNA显著抑制平滑肌细胞中DDR2蛋白水平的表达量。
六、siRNA抑制大鼠主动脉平滑肌细胞増殖
将大鼠主动脉平滑肌细胞以5×103个/孔分别接种到96孔细胞培养板中。在37℃、5％CO2培养箱细胞培养24小时，然后按照siRNA-MateTM说明步骤转染siRNA，设阴性对照组、200nmo1/L siRNA组、400nmo1/L siRNA组、800nmo1/L siRNA组，转染48h后，每孔加入20μL MTT(mg/mL)，37℃继续孵育4h，吸除培养基，加入200μL DMS0，490nm波长测定吸光值。
结果表明：如图4A和图4B所示，siRNA达到一定浓度后，能够显著抑制大鼠主动脉平滑肌细胞的増殖。
七、siRNA抑制大鼠主动脉平滑肌细胞的迁移
用划痕法对大鼠主动脉平滑肌细胞的迁移活性进行研究。在6孔板底部均匀的用marker笔划三条横线(沿拍样板长轴，大概每隔0.5-1厘米划一条)。将大鼠主动脉平滑肌细胞以1.5x105个/孔接种到6孔细胞培养板中，设置对照组和siRNA组，每组两个复孔，加入含20％血清DMEM培养基，在37℃、5％CO2培养箱细胞培养24h，使用200μL枪头每孔三道垂直于marker笔划横线。吸掉旧培养基，用无菌PBS清洗细胞表面三次，设阴性对照组和siRNA组进行培养，拍照记录0h至48h镜下观察划痕两侧的距离变化，然后Image-pro plus 6.0计算各组划痕两侧的距离。
结果分析：如图5A和图5B所示，siRNA能抑制大鼠主动脉平滑肌细胞的迁移。
本发明靶向于DDR2基因转录序列，通过干扰转录起始复合物的组装，直接有力的抑制DDR2的转录，为制备抗动脉粥样硬化药物提供了一种新方法，促进抗动脉粥样硬化新药的开发。

Claims (5)

1.一种抑制DDR2表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA含有以下核酸序列：
正义序列：5’-GCCUCUGGUAUGAAGUACCUU-3’；
反义序列：5’-AAGGUACUUCAUACCAGAGGC-3’。
2.根据权利要求1所述的一种抑制DDR2表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA抑制DDR2的转录，减小动脉粥样硬化的病变面积。
3.根据权利要求1所述的一种抑制DDR2表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA抑制动脉粥样硬化的病变细胞的迁移和增殖。
4.如权利要求1所述的一种抑制DDR2表达的siRNA作为治疗心脑血管病的生物制药中的应用。
5.根据权利要求4的应用，所述心脑血管病主要为动脉粥样硬化性心肌缺血、动脉粥样硬化性心肌梗死、动脉粥样硬化性脑中风。
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