JP2024511839A - 少なくとも２つの異なる核酸を担持した細胞外小胞 - Google Patents

Abstract

少なくとも２つの異なる核酸を担持した細胞外小胞。カーゴを担持した細胞外小胞であって、カーゴが、少なくとも２つの異なる核酸を含む、細胞外小胞、ならびにそのような細胞外小胞を調製する方法および使用する方法。【選択図】図２－２

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年３月３１日に出願された米国特許仮出願第６３／１６９，１６１号の恩典を主張するものであり、なお、当該仮特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

核酸療法は、遺伝子のレベルでの治療介入を可能にする新規のモダリティーを代表するものである。そのようなものとして、これらに限定されるわけではないが、短鎖ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ＲＮＡ）、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など、長鎖ＲＮＡ（ｌｏｎｇ ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、さらには二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）などが挙げられる。これらのモダリティーは、通常、それらが疾患関連タンパク質の産生を阻害または促進するときに、疾患を変更すると考えられる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのゲノム編集ツールの発見により、現在、疾患は、ゲノムレベルで根本的に正すことができる。しかしながら、次世代薬としての核酸の臨床開発は、主に、送達における制限、それらが細胞膜に侵入できないことの結果、循環におけるヌクレアーゼへの免疫原性および易傷性によって妨げられている。

現在、ほとんどの核酸療法は、パチシラン（遺伝的トランスチレチン媒介性アミロイドーシスに対するｓｉＲＮＡ）、ボレチジーンネパルボベック（レーバー先天性黒内障に対するＡＡＶ遺伝子療法）、またはＰｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡワクチンなどの承認された薬物によって例証されるように、単一の標的を伴う。しかしながら、２つ以上の遺伝子産物の送達から恩恵を受けるいくつかの治療応用が存在する。そのような例の１つは、ベクター化抗体、または抗体遺伝子療法の概念であり、抗体は、抗体の重鎖および軽鎖をコードする２つの導入遺伝子の送達を伴う遺伝子療法治療の後に、肝臓などの患者の臓器から内因的に生産される。別の例は、複数の成分の共送達のための効率的なビヒクルを必要とするゲノム編集である。詳細には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムによって媒介される遺伝子挿入は、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡのための転写物、ならびに相同組換え修復のためのＤＮＡテンプレートを必要とする。プライム編集は、操作された逆転写酵素に融合させたＳｐＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする転写物、ならびにプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）の共送達を伴う。

広く探検された最先端の送達ビヒクルの２つは、すなわち、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。ＡＡＶは、分裂細胞および静止細胞の両方に感染することができる小さな（２０ｎｍ）複製欠損ウイルスである。これらのウイルスは、同じ用量の他のウイルスと比較して、疾患を引き起こして比較的軽度の免疫反応を誘発することはないと思われているため、遺伝子療法応用のために活発に用いられている。しかしながら、それらは、それらの小さい導入遺伝子容量（４．５ｋｂ）によって制限され、ならびにそれらは、再投薬に対する適応性免疫反応に起因して、再投薬することができない。ＬＮＰは、送達ビヒクルの次のクラスであり、肝細胞および樹状細胞へＲＮＡを送達するその能力は、臨床的に検証されている。しかしながら、ＬＮＰは、循環において比較的不安定であり、肝細胞以外の組織への核酸の全身送達は、非常に困難なままである。

細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞間での生体分子の移送を媒介する細胞由来脂質膜結合小胞である。ＥＶは、生体適合性であり、独特な天然指向性を有しており、ならびに、それらの細胞起源に応じて、それらの毒性または免疫原性の脅威は低い。発明者らは以前に、赤血球ＥＶ（ＲＢＣＥＶ）は、例えば、ＡＳＯ、ｍＲＮＡ、およびＤＮＡなど、様々なペイロードを外因的に担持することができることを実証した（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＳＧ２０２１／０５００２０を参照されたく、なお、当該文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。

本発明は、上記の検討の観点から工夫された。

カーゴを担持した細胞外小胞であって、カーゴが、少なくとも２つの異なる核酸分子を含む、細胞外小胞が、本明細書において提供される。いくつかの場合において、カーゴは、少なくとも３つの異なる核酸分子を含む。

核酸分子は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡプラスミド、環状ＤＮＡ、直鎖状二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡミニサークル、ダンベル型ＤＮＡ最小ベクター、ＲＮＡミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ－相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および発現ベクターからなる群から選択され得る。

当該少なくとも２つの異なる核酸分子または少なくとも３つの異なる核酸分子は、非同一配列を有し得る。追加的にまたは代替的に、当該少なくとも２つの異なる核酸分子または少なくとも３つの異なる核酸は、異なるタイプの核酸分子であってもよい。例えば、カーゴは、少なくとも２つの異なる分子を含み得、この場合、当該少なくとも２つの異なる分子のそれぞれは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ－相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ギャップマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、発現ベクター、ＤＮＡプラスミド、環状ＤＮＡ、直鎖状二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、ダンベル型ＤＮＡ最小ベクター、およびＲＮＡミニサークルからなる群から独立して選択される。好ましくは、当該少なくとも２つの異なる核酸分子または少なくとも３つの異なる核酸分子は、Ｃａｓ酵素およびｇＲＮＡをコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡプラスミドを含む。ｇＲＮＡは、好ましくは、ｐｅｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡである。いくつかの場合において、カーゴは、ＤＮＡとＲＮＡ、少なくとも２つの非同一分子、少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ、プラスミドとｇＲＮＡ、またはｍＲＮＡとｇＲＮＡを含み得る。いくつかの場合において、当該少なくとも２つの異なる核酸分子は、プラスミド、例えば、ＤＮＡプラスミドなど、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、当該少なくとも２つの異なる核酸分子は、プラスミド、例えば、ＤＮＡプラスミドなど、およびｓｉＲＮＡを含む。

ある特定の態様において、細胞外小胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムの構成要素を含む。いくつかの態様において、細胞外小胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムの少なくとも２つまたは少なくとも３つの構成要素を含む。例えば、細胞外小胞は、ｇＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡなど、およびヌクレアーゼをコードする核酸分子を含み得る。当該ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ヌクレアーゼであり得る。細胞外小胞は、ＤＮＡ修復テンプレートを含み得る。したがって、細胞外小胞は、ｇＲＮＡ、ヌクレアーゼをコードする核酸、およびＤＮＡ修復テンプレートからなる群から選択される１つ、２つ、または３つの構成要素を含み得る。

別の態様において、細胞外小胞は、抗原結合性分子または断片をコードする核酸あるいは抗原結合性分子を含む。抗原結合性分子またはその断片は、抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、ミニボディ、またはダイアボディであり得る。細胞外小胞は、抗原結合性分子またはその断片の第１のポリペプチドをコードする第１の核酸ならびに抗原結合性分子またはその断片のさらなるポリペプチドをコードする第２の核酸を含み得る。

好ましい態様において、細胞外小胞は、赤血球に由来する細胞外小胞である。
さらに、本明細書において開示される細胞外小胞を含む組成物も、本明細書において説明される。これらの組成物において、細胞外小胞のうちの少なくとも１つは、カーゴを含み、この場合、カーゴは、少なくとも２つの異なる核酸を含む。いくつかの場合において、組成物は、複数の細胞外小胞を含む。そのような組成物において、組成物中の細胞外小胞のうちの１つ、いくつか、または実質的に全ては、カーゴを含み得、この場合、カーゴは、少なくとも２つの異なる核酸分子または少なくとも３つの異なる核酸分子を含む。

さらに、カーゴを含む細胞外小胞を調製する方法であって、カーゴが、少なくとも２つの異なる核酸分子を含む、方法も、本明細書において説明される。いくつかの場合において、この方法は、ａ）細胞外小胞に担持される核酸分子を含む混合物を提供する工程；およびｂ）細胞外小胞に核酸分子を担持するのに十分な条件下において当該混合物を細胞外小胞と接触させる工程であって、核酸分子の混合物が、少なくとも２つの異なる核酸分子を含む、工程を含む。いくつかの態様において、当該混合物は、トランスフェクション試薬をさらに含む。他において、この方法は、混合物が細胞外小胞と接触させられた後に、エレクトポレーション処理する工程をさらに含む。いくつかの方法において、当該混合物は、約１：１の比において、少なくとも２つの異なるカーゴ分子を含む。好ましくは、担持済みの細胞外小胞は、赤血球由来の細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）である。

本明細書において説明されるいくつかの方法は、細胞外小胞に担持される核酸分子を含む混合物を調製する工程を伴う。この工程は、核酸分子の混合物を調製する工程であって、核酸分子の少なくとも１つが、混合物中の他の核酸分子とは異なっており、トランスフェクション試薬が、この混合物に加えられる、工程を伴い得る。あるいは、この工程は、２つ以上の副混合物（ｓｕｂ－ｍｉｘｔｕｒｅ）の調製であって、各副混合物が、細胞外小胞に担持される核酸分子およびトランスフェクション試薬を含む、調製を伴い得る。次いで、副混合物は、混合物を形成するために組み合わされる。

少なくとも２つの異なるカーゴ分子は、それぞれ核酸分子である。少なくとも２つの異なるカーゴ分子は、両方ともプラスミドであり得る。少なくとも２つの異なるカーゴ分子は、両方ともＲＮＡ分子であり得る。少なくとも２つの異なる核酸分子は、非同一配列を有し得、および／または、少なくとも２つの異なる核酸分子は、異なるタイプの核酸分子であり得る（例えば、本開示を読む当業者に明らかであるように、少なくとも１つのＤＮＡと少なくとも１つのＲＮＡ、少なくとも１つのプラスミドと少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのプラスミドと少なくとも１つのＲＮＡ、少なくとも１つの環状核酸と少なくとも１つの非環状核酸など）。

混合物の核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ－相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ギャップマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、発現ベクター、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、ダンベル型ＤＮＡ最小ベクター、およびＲＮＡミニサークルからなる群から選択され得る。カーゴは、ＤＮＡとＲＮＡ、少なくとも２つの非同一分子、少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ、プラスミドとｇＲＮＡ、またはｍＲＮＡとｇＲＮＡを含み得る。

本明細書において提供される本開示を検討することによって容易に理解されるように、同時封入された核酸は、およそ同じサイズであってもよく、または異なるサイズであってもよい。実際に、いくつかの実施形態において、同時封入された核酸は、一般的な構造的特徴全体を共有し得るか（例えば、プラスミドであるということ、例えば、いくつかの実施形態において同じであり得る発現制御エレメントなど、ならびに、例えば、異なって発現された［別名「ペイロード」］配列など）、または、特定の配列および／または他の構造的バリエーションを除いて、実質的に同じでさえあり得る。あるいは、本明細書において教示されるように（ならびに、例示によって確認されるように）、共担持された核酸は、非常に異なるサイズであってもよい（例えば、１つまたは複数のプラスミドおよび１つまたは複数のオリゴヌクレオチド）。

ある特定の方法は、核酸分子の担持を伴い、この場合、核酸分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムの構成要素を含むかまたはコードする。そのような方法において、混合物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムの構成要素を含み得るかまたはコードし得る。当該混合物は、ｇＲＮＡ分子とヌクレアーゼをコードする核酸分子とを含み得る。当該ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ１２ヌクレアーゼであり得る。

ある特定の方法は、カーゴ分子の担持を伴い、この場合、カーゴ分子は、抗原結合性分子をコードする２つ以上の核酸分子を含む。そのような方法において、当該混合物は、抗原結合性分子の第１のポリペプチドをコードする第１の核酸および抗原結合性分子の第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含み得る。

別の態様において、２つ以上の核酸分子を細胞に送達する方法であって、当該細胞を本発明による細胞外小胞と接触させる工程を含む方法が、本明細書において説明される。さらに、治療方法における使用のための細胞外小胞、治療法、ならびに疾患または障害の治療のための医薬品の製造における細胞外小胞の使用も、本明細書において説明される。これらの態様は、遺伝病、炎症性疾患、がん、自己免疫疾患、心血管疾患、または消化器系疾患を患う対象への本発明による細胞外小胞の投与を伴い得る。当該対象は、がんを有し得、当該がんは、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、肺がん、肝臓がん、結直腸がん、上咽頭癌、腎がん、または神経膠腫から選択されてもよい。これらの態様は、核酸によってコードされるタンパク質またはペプチドの発現による患者の疾患の治療を伴い得る。それらは、遺伝子編集または遺伝子療法による疾患の治療を伴い得る。

本発明は、明確に許容されないかまたは明確に回避される場合を除いて、説明される態様と好ましい特徴との組合せを包含する。
本発明の原則を例示する実施形態および実験が、以下において付随の図面を参照しながら説明されるであろう。

２つのプラスミドのＲＢＣＥＶ担持。ＲＢＣＥＶは、ｃｏｐＧＦＰ（ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰ）またはｔｄＴｏｍａｔｏ（ＣＭＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）をコードするプラスミドが別々に担持され、共トランスフェクトされるか、あるいは、同時に担持され（共担持され）、２９３Ｔ細胞およびＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされる。２９３Ｔ細胞は、０．０８４ｐｍｏｌのＤＮＡを用いてトランスフェクトされ、ならびにＨｅｐＧ２細胞は、０．１６８ｐｍｏｌのＤＮＡを用いてトランスフェクトされる。ＲＢＣＥＶのトランスフェクションの４８時間後に撮影された、２９３Ｔ細胞（Ａ）またはＨｅｐＧ２細胞（Ｂ）のエピ蛍光画像、ならびにフローサイトメトリー（ＰＥ対ＦＩＴＣ）によって解析された細胞の対応するドットプロット。共局在化シグナルの相関度を測定するためにピアソン相関係数を使用した、２９３Ｔ細胞またはＨｅｐＧ２細胞の２色チャネル画像の共局在化分析。ＦＩＴＣチャネルおよびＰＥチャネルにおいてゲートされたＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏ陽性２９３Ｔ細胞またはＨｅｐＧ２細胞の割合。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝３であり、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．００１を表す。 ２つのプラスミドのＲＢＣＥＶ担持。ＲＢＣＥＶは、ｃｏｐＧＦＰ（ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰ）またはｔｄＴｏｍａｔｏ（ＣＭＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）をコードするプラスミドが別々に担持され、共トランスフェクトされるか、あるいは、同時に担持され（共担持され）、２９３Ｔ細胞およびＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされる。２９３Ｔ細胞は、０．０８４ｐｍｏｌのＤＮＡを用いてトランスフェクトされ、ならびにＨｅｐＧ２細胞は、０．１６８ｐｍｏｌのＤＮＡを用いてトランスフェクトされる。ＲＢＣＥＶのトランスフェクションの４８時間後に撮影された、２９３Ｔ細胞（Ａ）またはＨｅｐＧ２細胞（Ｂ）のエピ蛍光画像、ならびにフローサイトメトリー（ＰＥ対ＦＩＴＣ）によって解析された細胞の対応するドットプロット。共局在化シグナルの相関度を測定するためにピアソン相関係数を使用した、２９３Ｔ細胞またはＨｅｐＧ２細胞の２色チャネル画像の共局在化分析。ＦＩＴＣチャネルおよびＰＥチャネルにおいてゲートされたＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏ陽性２９３Ｔ細胞またはＨｅｐＧ２細胞の割合。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝３であり、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．００１を表す。 トラスツズマブ軽鎖（ＣＡＧ－ＬＣ）および重鎖（ＣＡＧ－ＨＣ）プラスミドのＲＢＣＥＶ担持。ＲＢＣＥＶは、ＬＣおよびＨＣが共担持されるか、ＬＣおよびＨＣが別々に担持されるか、またはＩＲＥＳ（ＣＡＧ－ＬＣ－ＩＲＥＳ－ＨＣ）またはＰ２Ａ（ＣＡＧ－ＬＣ－Ｐ２Ａ－ＨＣ）を有する単一の２シストロン性ベクターが担持され、ならびに当モルＤＮＡ量において２９３Ｔ細胞およびＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクションの４８時間後、細胞培養上清中の可溶性トラスツズマブレベルを、ＥＬＩＳＡによって定量化した（Ａ）。プラスミドのＤＮＡ担持効率を、担持反応に加えたプラスミドの開始量および担持反応後に回収したプラスミドの最終的な量に基づいて計算した（Ｂ）。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝３であり、^＊はｐ＜０．０５を表す。ＬＣおよびＨＣを共担持したＲＢＣＥＶ（共担持）またはＬＣおよびＨＣを別々に担持し、１：１の比で混合したＲＢＣＥＶ（共トランスフェクト）を注射されたＳＣＩＤマウスからの、注射の７、１４、２１、および２８日後における血清トラスツズマブ発現（Ｃ）。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝５であり、^＊はｐ＜０．０５を表す。 トラスツズマブ軽鎖（ＣＡＧ－ＬＣ）および重鎖（ＣＡＧ－ＨＣ）プラスミドのＲＢＣＥＶ担持。ＲＢＣＥＶは、ＬＣおよびＨＣが共担持されるか、ＬＣおよびＨＣが別々に担持されるか、またはＩＲＥＳ（ＣＡＧ－ＬＣ－ＩＲＥＳ－ＨＣ）またはＰ２Ａ（ＣＡＧ－ＬＣ－Ｐ２Ａ－ＨＣ）を有する単一の２シストロン性ベクターが担持され、ならびに当モルＤＮＡ量において２９３Ｔ細胞およびＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクションの４８時間後、細胞培養上清中の可溶性トラスツズマブレベルを、ＥＬＩＳＡによって定量化した（Ａ）。プラスミドのＤＮＡ担持効率を、担持反応に加えたプラスミドの開始量および担持反応後に回収したプラスミドの最終的な量に基づいて計算した（Ｂ）。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝３であり、^＊はｐ＜０．０５を表す。ＬＣおよびＨＣを共担持したＲＢＣＥＶ（共担持）またはＬＣおよびＨＣを別々に担持し、１：１の比で混合したＲＢＣＥＶ（共トランスフェクト）を注射されたＳＣＩＤマウスからの、注射の７、１４、２１、および２８日後における血清トラスツズマブ発現（Ｃ）。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝５であり、^＊はｐ＜０．０５を表す。 トラスツズマブ軽鎖（ＣＡＧ－ＬＣ）および重鎖（ＣＡＧ－ＨＣ）プラスミドのＲＢＣＥＶ担持。ＲＢＣＥＶは、ＬＣおよびＨＣが共担持されるか、ＬＣおよびＨＣが別々に担持されるか、またはＩＲＥＳ（ＣＡＧ－ＬＣ－ＩＲＥＳ－ＨＣ）またはＰ２Ａ（ＣＡＧ－ＬＣ－Ｐ２Ａ－ＨＣ）を有する単一の２シストロン性ベクターが担持され、ならびに当モルＤＮＡ量において２９３Ｔ細胞およびＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクションの４８時間後、細胞培養上清中の可溶性トラスツズマブレベルを、ＥＬＩＳＡによって定量化した（Ａ）。プラスミドのＤＮＡ担持効率を、担持反応に加えたプラスミドの開始量および担持反応後に回収したプラスミドの最終的な量に基づいて計算した（Ｂ）。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝３であり、^＊はｐ＜０．０５を表す。ＬＣおよびＨＣを共担持したＲＢＣＥＶ（共担持）またはＬＣおよびＨＣを別々に担持し、１：１の比で混合したＲＢＣＥＶ（共トランスフェクト）を注射されたＳＣＩＤマウスからの、注射の７、１４、２１、および２８日後における血清トラスツズマブ発現（Ｃ）。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝５であり、^＊はｐ＜０．０５を表す。 ３つのプラスミドのＲＢＣＥＶ担持。ＲＢＣＥＶに、それぞれ一意の導入遺伝子をコードする３つの異なるプラスミドを担持した。担持済みのＲＢＣＥＶを、当モルＤＮＡ量において２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＲＮＡを抽出し、遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって特定した転写物レベルによって測定した。発現をＧＡＰＤＨへ正規化した。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝３であり、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．００１を表す。 ＤＮＡおよびｍＲＮＡのＲＢＣＥＶ担持。ＲＢＣＥＶに異なる核酸タイプを担持した。ＲＢＣＥＶに、ｃｏｐＧＦＰをコードするｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡまたはＤＮＡを別々に担持し（ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰ）、共トランスフェクトするか、あるいは、同時に担持し（共担持）、当モルのＤＮＡ量において２９３Ｔにトランスフェクトした。ＲＢＣＥＶのトランスフェクションの４８時間後に撮影した２９３Ｔ細胞のエピ蛍光画像（Ａ）、およびフローサイトメトリー（ＰＥ対ＦＩＴＣ）によって分析された細胞の対応するドットプロット。共局在化シグナルの相関度を測定するためにピアソン相関係数を使用した、２９３Ｔ細胞の２色チャネル画像の共局在分析。ＦＩＴＣチャネルおよびＰＥチャネルにおいてゲートされたＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏ陽性２９３Ｔ細胞の割合。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝３であり、^＊はｐ＜０．０１を表す。 ＤＮＡおよびｍＲＮＡのＲＢＣＥＶ担持。ＲＢＣＥＶに異なる核酸タイプを担持した。ＲＢＣＥＶに、ｃｏｐＧＦＰをコードするｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡまたはＤＮＡを別々に担持し（ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰ）、共トランスフェクトするか、あるいは、同時に担持し（共担持）、当モルのＤＮＡ量において２９３Ｔにトランスフェクトした。ＲＢＣＥＶのトランスフェクションの４８時間後に撮影した２９３Ｔ細胞のエピ蛍光画像（Ａ）、およびフローサイトメトリー（ＰＥ対ＦＩＴＣ）によって分析された細胞の対応するドットプロット。共局在化シグナルの相関度を測定するためにピアソン相関係数を使用した、２９３Ｔ細胞の２色チャネル画像の共局在分析。ＦＩＴＣチャネルおよびＰＥチャネルにおいてゲートされたＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏ陽性２９３Ｔ細胞の割合。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝３であり、^＊はｐ＜０．０１を表す。 ＤＮＡおよびｍＲＮＡのＲＢＣＥＶ担持。ＲＢＣＥＶに異なる核酸タイプを担持した。ＲＢＣＥＶに、ｃｏｐＧＦＰをコードするｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡまたはＤＮＡを別々に担持し（ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰ）、共トランスフェクトするか、あるいは、同時に担持し（共担持）、当モルのＤＮＡ量において２９３Ｔにトランスフェクトした。ＲＢＣＥＶのトランスフェクションの４８時間後に撮影した２９３Ｔ細胞のエピ蛍光画像（Ａ）、およびフローサイトメトリー（ＰＥ対ＦＩＴＣ）によって分析された細胞の対応するドットプロット。共局在化シグナルの相関度を測定するためにピアソン相関係数を使用した、２９３Ｔ細胞の２色チャネル画像の共局在分析。ＦＩＴＣチャネルおよびＰＥチャネルにおいてゲートされたＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏ陽性２９３Ｔ細胞の割合。エラーバーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝３であり、^＊はｐ＜０．０１を表す。 蛍光標識されたＤＮＡのＲＢＣＥＶ担持。Ｌａｂｅｌ ＩＴ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を使用して、ＤＮＡを蛍光発色団（ＭＦＰ４８８またはＣｙ５）によって標識した。ＲＢＣＥＶに、ＭＦＰ４８８またはＣｙ５標識したＤＮＡを担持するか、あるいは、ＭＦＰ４８８およびＣｙ５標識したＤＮＡの等量を同時に担持した。担持済みのＲＢＣＥＶを、フローサイトメトリーによって分析した。 二本鎖オリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶは、複数の細胞株において導入遺伝子発現を増加させることができる。Ｈｕｈ－７細胞（Ａ～Ｃ）、ＨｅｐＧ２細胞（Ｄ～Ｆ）、およびＴＨＰ－１細胞（Ｇ～Ｉ）を、ＤＮＡプラスミドのみを担持したＲＢＣＥＶ（ＥＶ－ＮＰ）、あるいは、ＤＮＡプラスミドと、１２．５～１００ｐｍｏｌの漸増投薬量において、ＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ）、スクランブル化（ＳＣＤ）、ホスホロチオエート修飾ＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ－ＰＳ）、またはホスホロチオエート修飾スクランブル化（ＳＣＤ－ＰＳ）オリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、遺伝子発現（Ａ、Ｄ、Ｇ）、平均蛍光強度（Ｂ、Ｅ、Ｈ）、およびフローサイトメトリーによる細胞生存率（Ｃ、Ｆ、Ｉ）について分析した。 二本鎖オリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶは、複数の細胞株において導入遺伝子発現を増加させることができる。Ｈｕｈ－７細胞（Ａ～Ｃ）、ＨｅｐＧ２細胞（Ｄ～Ｆ）、およびＴＨＰ－１細胞（Ｇ～Ｉ）を、ＤＮＡプラスミドのみを担持したＲＢＣＥＶ（ＥＶ－ＮＰ）、あるいは、ＤＮＡプラスミドと、１２．５～１００ｐｍｏｌの漸増投薬量において、ＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ）、スクランブル化（ＳＣＤ）、ホスホロチオエート修飾ＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ－ＰＳ）、またはホスホロチオエート修飾スクランブル化（ＳＣＤ－ＰＳ）オリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、遺伝子発現（Ａ、Ｄ、Ｇ）、平均蛍光強度（Ｂ、Ｅ、Ｈ）、およびフローサイトメトリーによる細胞生存率（Ｃ、Ｆ、Ｉ）について分析した。 二本鎖オリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶは、複数の細胞株において導入遺伝子発現を増加させることができる。Ｈｕｈ－７細胞（Ａ～Ｃ）、ＨｅｐＧ２細胞（Ｄ～Ｆ）、およびＴＨＰ－１細胞（Ｇ～Ｉ）を、ＤＮＡプラスミドのみを担持したＲＢＣＥＶ（ＥＶ－ＮＰ）、あるいは、ＤＮＡプラスミドと、１２．５～１００ｐｍｏｌの漸増投薬量において、ＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ）、スクランブル化（ＳＣＤ）、ホスホロチオエート修飾ＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ－ＰＳ）、またはホスホロチオエート修飾スクランブル化（ＳＣＤ－ＰＳ）オリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、遺伝子発現（Ａ、Ｄ、Ｇ）、平均蛍光強度（Ｂ、Ｅ、Ｈ）、およびフローサイトメトリーによる細胞生存率（Ｃ、Ｆ、Ｉ）について分析した。 ＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶは、ＢＬ／６マウスにおけるｈＦＩＸ－ＨｉＢｉｔ発現を増加させることができる。ＨｉＢｉＴタグ付けされたＦＩＸタンパク質のルミネセンスを、ＤＮＡプラスミドのみ（０）を担持したＲＢＣＥＶ、あるいはＤＮＡプラスミドと、２５ｐｍｏｌ（低用量；ＯＤＮ－２５およびＳＣＤ－２５）または１００ｐｍｏｌ（高用量；ＯＤＮ－１００およびＳＣＤ－１００）において、ＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ）またはスクランブル化（ＳＣＤ）オリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶの投与の１～４９日後に測定した。 ＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶは、ＳＣＩＤマウスでの抗体発現を増加させることができる。ＤＮＡプラスミドのみを担持したＲＢＣＥＶ（０）、あるいはＤＮＡプラスミドと、４ｍｇ／ｋｇ用量および６ｍｇ／ｋｇ用量において、ＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ）オリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶの投与の１～４９日後にマウスの血清においてトラスツズマブを測定した。 ＤＮＡベクターとＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶは、インビボにおいて全身性ＩＦＮａおよびＩＦＮｂを減少させることができる。ＢＬ／６マウスに、ＤＮＡプラスミドのみを担持したＲＢＣＥＶ（ＥＶ－ＮＰ）、または、ＤＮＡプラスミドと、１００ｐｍｏｌ（ＯＤＮ－１００およびＳＣＤ－１００）において、ＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ）またはスクランブル化（ＳＣＤ）オリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶを静脈内尾静脈注射によって注入した。裸のＤＮＡプラスミドを、水圧注入（ＨＤＩ）によって注入した。異なる時点において血液を採取し、ＥＬＩＳＡによってマウスインターフェロンα（ＩＦＮａ；Ａ）およびインターフェロンβ（ＩＦＮｂ；Ｂ）レベルを定量化した。 ＲＢＣＥＶに共担持したオリゴヌクレオチド設計のインビトロでの比較。ＨｅｐＧ２（Ａ～Ｃ）およびＨｕｈ７（Ｄ～Ｆ）細胞を、ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰプラスミドと、異なる設計のオリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ発現（Ａ、Ｄ）、平均蛍光強度（ＭＦＩ；Ｂ、Ｅ）、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用した細胞生存率（Ｃ、Ｆ）を、２４時間および４８時間の時点に測定した。 ＲＢＣＥＶに共担持したオリゴヌクレオチド設計のインビトロでの比較。ＨｅｐＧ２（Ａ～Ｃ）およびＨｕｈ７（Ｄ～Ｆ）細胞を、ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰプラスミドと、異なる設計のオリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ発現（Ａ、Ｄ）、平均蛍光強度（ＭＦＩ；Ｂ、Ｅ）、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用した細胞生存率（Ｃ、Ｆ）を、２４時間および４８時間の時点に測定した。 異なるベイトオリゴヌクレオチド設計によるＲＢＣＥＶ担持効率の試験。ＲＢＣＥＶに、プラスミドＤＮＡとＴａｂｌｅ２（表２）からのベイトオリゴヌクレオチドまたはＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドとを共担持した。プラスミドおよびオリゴヌクレオチドの担持効率を担持したＲＢＣＥＶから抽出したＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によって測定した。 ベイトオリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶは、インビトロでの導入遺伝子の発現を向上させることができる。Ｈｕｈ７細胞を、プラスミドとベイトオリゴヌクレオチドまたはＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした。ＦＩＸ－Ｈｉｂｉｔタンパク質発現（Ａ）およびＥＧＦＰ発現（Ｂ）をトランスフェクションの２４時間後に測定した。 二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶは、インビトロでの導入遺伝子の発現を増加させることができる。Ｈｕｈ７（Ａ）およびＨｅｐＧ２（Ｂ）細胞を、ｈＦＩＸ－ＨｉＢｉｔルシフェラーゼリポーターコンストラクトを発現するＤＮＡプラスミドと二本鎖オリゴヌクレオチド（スクランブル化、ＮＦ－κＢデコイ）または一本鎖オリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶＳを用いてトランスフェクトした。ルミネセンスを、ＮＡＮＯ－ＧＬＯ（登録商標）ＨｉＢｉＴアッセイによって２４時間後に測定した。 一本鎖オリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶは、インビトロでの免疫反応と相関する遺伝子発現を調整することができる。ＴＨＰ－１を、ｈＦＩＸ－ＨｉＢｉｔルシフェラーゼリポーターコンストラクトを発現するＤＮＡプラスミドと、二本鎖オリゴヌクレオチド（スクランブル化、ＮＦ－κＢデコイ）または一本鎖オリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした。遺伝子発現を、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって６時間後に測定した。ＩＦＮｂ１（Ａ）、ＩＬ６（Ｂ）、ＣＸＣＬ１０（Ｃ）、およびＣＣＬ２（Ｄ）のためのＴａｑＭａｎ標的特異的プローブを、標的遺伝子に対して使用した。ＧＡＰＤＨに対するＴａｑＭａｎ標的特異的プローブを、ｃＤＮＡインプットの正規化のために使用した。 一本鎖オリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶは、インビトロでの免疫反応と相関する遺伝子発現を調整することができる。ＴＨＰ－１を、ｈＦＩＸ－ＨｉＢｉｔルシフェラーゼリポーターコンストラクトを発現するＤＮＡプラスミドと、二本鎖オリゴヌクレオチド（スクランブル化、ＮＦ－κＢデコイ）または一本鎖オリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした。遺伝子発現を、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって６時間後に測定した。ＩＦＮｂ１（Ａ）、ＩＬ６（Ｂ）、ＣＸＣＬ１０（Ｃ）、およびＣＣＬ２（Ｄ）のためのＴａｑＭａｎ標的特異的プローブを、標的遺伝子に対して使用した。ＧＡＰＤＨに対するＴａｑＭａｎ標的特異的プローブを、ｃＤＮＡインプットの正規化のために使用した。

本発明の態様および実施形態について、付随の図面を参照しながら下記において説明されるであろう。さらなる態様および実施形態は、当業者に明らかであろう。この本文において言及される全ての文献は、参照により本明細書に組み入れられる。

細胞外小胞
用語「細胞外小胞」（ＥＶ）は、本明細書において使用される場合、細胞から細胞外環境へと放出された小さい小胞様構造体を意味する。本明細書において開示される特に好ましい態様において、細胞外小胞は、赤血球に由来する（ＲＢＣＥＶ）。

細胞外小胞（ＥＶ）は、５０～１０００ｎｍの直径の、原形質膜またはエンドソーム膜の実質的に球形の断片である。細胞外小胞は、病理学的および生理学的条件下において、様々な細胞タイプから放出される。細胞外小胞は、膜を有する。当該膜は、二重層膜（すなわち、脂質二重層）である。当該膜は、原形質膜が起源であり得る。したがって、細胞外小胞の膜は、それが由来する細胞と同様の組成を有し得る。本明細書において開示されるいくつかの態様において、細胞外小胞は、実質的に透明である。

細胞外小胞なる用語は、エクソソーム、微小胞、膜ミクロ粒子、エクトソーム、ブレブ、および、アポトーシス体を包含する。細胞外小胞は、外側に向かう細胞膜の出芽および分裂によって産生され得る。当該産生は、自然過程または化学的に誘発または促進された過程であり得る。本明細書において開示されるいくつかの態様において、細胞外小胞は、化学的誘導によって産生された微小胞である。

細胞外小胞は、それらの形成の起源に基づいて、エクソソーム、微小胞、またはアポトーシス体として分類され得る。微小胞は、本明細書において開示される本発明による細胞外小胞の特に好ましいクラスである。好ましくは、本発明の細胞外小胞は、原形質膜から放出されており、エンドソーム系を起源としない。本明細書において説明されるある特定の態様において、細胞外小胞は、エクソソームではない。いくつかの場合において、細胞外小胞は非エクソソームＥＶである。

本開示のいくつかの態様および実施形態において、細胞外小胞は、エクソソームではない。本開示のいくつかの態様および実施形態において、細胞外小胞は、エクトソームではない。本開示のいくつかの態様および実施形態において、細胞外小胞は、ブレブではない。本開示のいくつかの態様および実施形態において、細胞外小胞は、アポトーシス体ではない。

本開示のいくつかの態様および実施形態において、細胞外小胞は、微小胞または膜ミクロ粒子である。
本明細書において開示される細胞外小胞は、様々な細胞、例えば、赤血球、白血球、がん細胞、幹細胞、樹状細胞、マクロファージなどに由来し得る。好ましい実施形態において、細胞外小胞は、赤血球に由来するが、例えば、細胞株など、任意の源に由来する細胞外小胞を使用してもよい。本明細書において説明される好ましい態様において、細胞外小胞は、赤血球に由来する。

微小胞またはマイクロ粒子は、原形質膜の直接的な外側に向かう出芽および分裂によって生じる。微小胞は、典型的にはエクソソームより大きく、１００～５００ｎｍの範囲の直径を有する。いくつかの場合において、微小胞の組成物は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、または１００～２００ｎｍの範囲の直径を有する微小胞を含む。好ましくは、直径は、１００～３００ｎｍである。

例えば、組成物、医薬組成物、医薬品、または調製物などに存在する微小胞の集団は、様々な直径を有する微小胞を含むであろうし、微小胞試料内の微小胞の直径中央値は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの範囲であり得る。好ましくは、直径中央値は、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの範囲のうちの１つに位置する。平均直径（ｍｅａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ）は、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ、場合により±１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｍのうちの１つであり得る。

エクソソームの直径は、約３０～約１００ｎｍの範囲である。いくつかの場合において、組成物中に存在し得る、エクソソームの集団は、１０～２００ｎｍ、１０～１５０ｎｍ、１０～１２０ｎｍ、１０～１００ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２５～１１０ｎｍ、２５～１００ｎｍ、または３０～１００ｎｍの範囲の直径を有するエクソソームを含む。好ましくは、当該直径は、３０～１００ｎｍである。例えば、組成物、医薬組成物、医薬品、または調製物などに存在するエクソソームの集団は、様々な直径を有するエクソソームを含むであろうし、試料内のエクソソームの直径中央値は、１０～２００ｎｍ、１０～１５０ｎｍ、１０～１２０ｎｍ、１０～１００ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２５～１１０ｎｍ、２５～１００ｎｍ、または３０～１００ｎｍの範囲であり得る。好ましくは、直径中央値は、３０～１００ｎｍの間である。平均直径は、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または１２０ｎｍ、場合により±１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｍのうちの１つであり得る。

細胞外小胞の集団は、少なくとも１０、１００、１０００、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、または１０^１４の細胞外小胞のうちの１つ（場合により、キャリア１ｍｌあたりの）を含み得る。

エクソソームは、様々な培養細胞、例えば、リンパ球、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、肥満細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、および腸上皮細胞などにおいて観察される。エクソソームは、細胞質における大きな嚢である多胞体内に位置するエンドソームネットワークが起源である。これらの嚢は、原形質膜に融合し、その後に細胞外環境へと放出される。

アポトーシス体またはブレブは、１～５μｍの範囲の最も大きな細胞外小胞である。アポトーシスを受けている核形成細胞は、核クロマチンの縮合で始まり、膜ブレブ形成を経て、最後に、アポトーシス体を含むＥＶを放出する、いくつかのステージを経験する。

好ましくは、細胞外小胞は、ヒト細胞、またはヒト起源の細胞に由来する。本発明の細胞外小胞は、小胞誘導剤と接触させた細胞から生じ得た。小胞誘導剤は、カルシウムイオノホア、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、またはホルボル－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）であり得る。

本明細書において説明される多くの態様において、細胞は、修飾されない。特に、細胞外小胞が由来する細胞は、外因性の核酸またはタンパク質を含まない。いくつかの場合において、細胞は、エクスビボであり、例えば、採血からもたらされる。いくつかの場合において、細胞は、修飾、例えば、形質導入、トランスフェクト、感染、または他の方法での修飾などをされておらず、インビボの細胞と比較して実質的に変わりがない。当該細胞が赤血球である場合、その細胞は、ＤＮＡを全く含み得ないか、またはＤＮＡを実質的に含み得ない。赤血球は、無ＤＮＡであり得る。したがって、好ましい実施形態において、細胞外小胞は、形成され単離された後で、それらの核酸カートが担持される。好ましくは、細胞外小胞は、細胞外小胞が由来する細胞中に存在した核酸、特にＤＮＡを含まない。

赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）
本明細書において開示されるある特定の態様において、細胞外小胞は、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））に由来する。赤血球は、いくつかの理由からＥＶの好ましい供給源である。赤血球は除核されるため、ＲＢＣＥＶは、他の供給源由来のＥＶ以外の核酸をほとんど含まない。ＲＢＣＥＶは、内因性ＤＮＡを含まない。ＲＢＣＥＶは、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡを含み得る。ＲＢＣＥＶは、発癌性ＤＮＡまたはＤＮＡ変異などの発癌性物質を含まない。上記において説明されるように、エクソソームは、エンドソームおよび小胞体を含む、細胞のエンドソームネットワークに由来するため、ＲＢＣＥＶは、エクソソームではない。赤血球は、ほとんどの細胞オルガネラを欠いており、特に、エンドソームおよび小胞体を有せず、結果として、エクソソームを産生することができない。

いくつかの場合において、当該ＥＶは、赤血球、例えば、ヒト赤血球に由来する非エクソソームＥＶである。
いくつかの場合において、ＲＢＣＥＶは、ＲＢＣから単離される。ＲＢＣＥＶの単離およびキャラクタリゼーションの方法は、Ｕｓｍａｎら（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９，２３５９（２０１８）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０４７９１－８）に記載されており、なお、当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

ＲＢＣＥＶは、ヘモグロビンおよび／またはストマチンおよび／またはフロチリン－２を含み得る。それらは、赤色であり得る。典型的には、ＲＢＣＥＶは、透過電子顕微鏡下において、半球形（凹形）の表面または「カップ形」を示す。ＲＢＣＥＶは、細胞表面ＣＤ２３５ａを有することによって特徴付けられ得る。

本発明によるＲＢＣＥＶは、約１００ｎｍ～約３００ｎｍの直径であり得る。いくつかの場合において、ＲＢＣＥＶの組成物は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの範囲の直径を有するＲＢＣＥＶを含む。好ましくは、直径は、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍである。

例えば、組成物中に存在し得るような、ＲＢＣＥＶの集団は、異なる直径の範囲を有するＲＢＣＥＶを含むであろうし、ＲＢＣＥＶ試料内のＲＢＣＥＶの直径中央値は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの範囲であり得る。好ましくは、直径中央値は、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの間である。平均直径は、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ、場合により±１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｍのうちの１つであり得る。

好ましくは、ＲＢＣＥＶは、ヒトまたは動物の血液試料、あるいは一次細胞に由来する赤血球または固定された赤血細胞株に由来する。赤血球は、治療される患者に合うタイプであり得、したがって、赤血球は、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型、またはＯ型であり得る。好ましくは、血液は、Ｏ型である。血液は、Ｒｈ陽性またはＲｈ陰性であり得る。いくつかの場合において、血液は、Ｏ型および／またはＲｈ陰性、例えば、タイプＯ－など、である。血液は、疾患または障害を患っていない、例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、梅毒、鎌状赤血球貧血、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、および／またはマラリアを患っていないことが特定されていてもよい。しかしながら、いかなる血液型も使用してもよい。いくつかの場合において、ＲＢＣＥＶは、自家性であり、ならびに、治療される患者から得られた血液試料に由来する。いくつかの場合において、ＲＢＣＥＶは、同種異系であり、ならびに、治療される患者から得られた血液試料に由来していない。

ＲＢＣＥＶは、赤血球の試料から単離され得る。赤血球からＥＶを得るためのプロトコルは、例えば、Ｄａｎｅｓｈら（２０１４）Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ｊａｎ ３０；１２３（５）：６８７～６９６など、当技術分野において既知である。ＥＶを得るために有用な方法は、赤血球を含む試料を提供するまたは得る工程、赤血球に細胞外小胞を産生させる工程、および細胞外小胞を単離する工程を含み得る。試料は、全血試料であり得る。好ましくは、試料の細胞成分が赤血球であるように、赤血球以外の細胞は試料から除去されている。

試料の赤血球は、濃縮され得るか、または全血試料の他の成分、例えば、白血球および血漿などから分離され得る。赤血球は、遠心分離法によって濃縮され得る。試料は、白血球除去（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を施され得る。

赤血球を含む試料は、実質的に赤血球のみを含み得る。細胞外小胞は、赤血球を小胞誘導剤と接触させることによって、赤血球から誘導され得る。小胞誘導剤は、カルシウムイオノフォア、リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ）、またはホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）であり得る。

ＲＢＣＥＶは、遠心分離（超遠心分離の有無にかかわらない）、沈殿、濾過プロセス、例えば、タンジェンシャルフロー濾過またはクロマトグラフィーなどによって単離され得る（例えば、上記のＵｓｍａｎらを参照されたい）。このように、ＲＢＣＥＶは、ＲＢＣおよび混合物の他の成分から分離され得る。

細胞外小胞は、赤血球の試料を得る工程；赤血球を小胞誘導剤と接触させる工程；および誘導された細胞外小胞を単離する工程を含む方法によって赤血球から得られ得る。
赤血球は、低速遠心分離において白血球除去（ｌｅｕｋｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）フィルターを使用することによって、白血球および血漿を含む全血試料から分離され得る。いくつかの場合において、赤血球試料は、他の細胞タイプ、例えば、白血球などを全く含まない。換言すると、赤血球試料は、実質的に赤血球からなる。赤血球は、小胞誘導剤との接触の前に、ＰＢＳなど緩衝液において希釈され得る。小胞誘導剤は、カルシウムイオノホア、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、またはホルボル－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）であり得る。小胞誘導剤は、約１０ｎＭのカルシウムイオノフォアであり得る。赤血球は、一晩、または少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、または１２時間以上において、小胞誘導剤と接触させられ得る。赤血球は、複数の時点において、小胞誘導剤と接触させられ得る。混合物は、ＲＢＣ、細胞破片、または他の非ＲＢＣＥＶ物質を除去するために、低速遠心分離を施され得、および／または、上清を約０．４５μｍのシリンジフィルターを通過させ得る。ＲＢＣＥＶは、超遠心分離、例えば、約１００，０００ｘｇでの遠心分離などによって濃縮され得る。ＲＢＣＥＶは、１０，０００ｘｇ、１５，０００ｘｇ、２０，０００ｘｇ、２５，０００ｘｇ、３０，０００ｘｇ、４０，０００ｘｇ、５０，０００ｘｇ、６０，０００ｘｇ、７０，０００ｘｇ、８０，０００ｘｇ、９０，０００ｘｇ、または１００，０００ｘｇでの遠心分離によって濃縮され得る。本明細書において説明されるある特定の好ましい方法において、ＲＢＣＥＶは、１０，０００ｘｇと５０，０００ｘｇとの間、または約１５，０００ｘｇにおいて濃縮される。ＲＢＣＥＶは、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５０分、または少なくとも１時間の超遠心分離によって濃縮され得る。濃縮されたＲＢＣＥＶは、冷ＰＢＳに懸濁され得る。それらは、６０％のスクロースクッション上に層化され得る。スクロースクッションは、凍った６０％のスクロースを含み得る。スクロースクッション上に層化されたＲＢＣＥＶは、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、またはそれ以上の、１００，０００ｘｇでの超遠心分離を施され得る。好ましくは、スクロースクッション上に層化にされたＲＢＣＥＶは、約１６時間の１００、０００ｘｇでの超遠心分離を施され得る。次いで、スクロースクッション上の赤い層が収集され、それにより、ＲＢＣＥＶを得る。得られたＲＢＣＥＶは、さらなる処理、例えば、洗浄、タグ付け、および、場合により、担持などを施され得る。

表面タグ付け
細胞外小胞は、好ましくは小胞膜に結合されるかまたは小胞膜を通して挿入されたタグを含み得る。

細胞外小胞は、それらの表面にタグを有し得る。タグは、好ましくは、タンパク質またはペプチド配列である。タグは、ペプチドまたはタンパク質であり得る。それは、修飾されたペプチドまたはタンパク質、例えば、グリコシル化またはビオチニル化されたタンパク質またはペプチドなどであり得る。タグは、細胞外小胞に共有結合され得、例えば、細胞外小胞の膜タンパク質に共有結合され得る。タグは、細胞外小胞が形成された後に、
細胞外小胞に加えられてもよい。タグは、タンパク質リガーゼ認識配列またはそれに由来する配列を含むかまたはそれらからなる配列によって細胞外小胞に連結され得る。例えば、タグは、タンパク質リガーゼ認識配列に対して１００％の配列同一性、あるいはタンパク質リガーゼ認識配列に対して約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、または約４０％の配列同一性を有する配列によって細胞外小胞に連結され得る。当該アミノ酸配列は、ＬＰＸＴを含み得る。

タグは、小胞の外側表面上に存在し得、したがって、小胞外（ｅｘｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒ）環境に露出され得る。
タグは、外因性分子であり得る。換言すると、タグは、本来は小胞の外側表面上に存在しない分子である。いくつかの場合において、タグは、細胞外小胞が由来する細胞または赤血球に存在しない外因性分子である。

タグは、細胞外小胞の循環における安定性、取込み効率、および有用性を増加し得る。
いくつかの場合において、タグは、身体の循環および臓器において、細胞外小胞またはカーゴを含む細胞外小胞を示すように機能する。ペプチドおよびタンパク質は、例えば、標的細胞の機能の阻止／活性化またはワクチン接種のための抗原の提示など、治療用分子として機能することができる。それらは、例えば、毒素の診断などのバイオマーカー検出のためのプローブとしても機能することができる。

タグは、機能的ドメインおよびタンパク質リガーゼ認識配列を含み得る。機能的ドメインは、標的部分に結合することができ得るか、検出することができ得るか、または治療効果を引き起こすことができ得る。機能的ドメインは、標的分子に結合することができ得る。そのような機能的ドメインを含むタグは、本明細書において結合分子と呼ばれ得る。結合分子は、標的分子と特異的に相互作用することができる分子である。結合部分を含む細胞外小胞は、標的分子を有する細胞にカーゴまたは治療薬を送達するために特に有用であり得る。好適な結合分子としては、抗体および抗原結合性断片（時々、抗体断片として知られる）、リガンド分子、および受容体分子が挙げられる。結合分子は、目的の標的に結合するであろう。標的は、目的の細胞に関連する分子、例えば、その表面で発現される分子などであり得る。リガンドは、例えば、受容体分子など、標的細胞上の核酸と複合体を形成し得る。標的は、免疫細胞に関連する分子、例えば、細胞表面マーカーなど、であり得る。好適な結合分子としては、抗体および抗原結合性断片が挙げられる。

他の好適な結合分子としては、標的分子に対して親和性を有するリガンドおよび受容体が挙げられる。タグは、細胞表面受容体のリガンドであり得る。例としては、ストレプトアビジンとビオチン、アビジンとビオチン、または他の受容体のリガンド、例えば、フィブロネクチンとインテグリンなどが挙げられる。ビオチンの小さいサイズは、結果として、結合した分子の生物活性に対してわずかしか影響しないかまたは全く影響しない。ビオチンおよびストレプトアビジン、ビオチンおよびアビジン、ならびにフィブロネクチンおよびインテグリンは、高い親和性および特異性においてそれらの対を結合させるため、結合分子として非常に有用である。アビジン－ビオチン複合体は、タンパク質とリガンドの間における既知の最も強力な非共有相互作用（Ｋｄ＝１０^－１５Ｍ）である。結合の形成は急速であり、形成された後は、極端なｐＨ、温度、有機溶媒、および他の変性剤によって影響されない。ストレプトアビジンに対するビオチンの結合も強力であり、急速に形成され、バイオテクノロジー応用において有用である。

機能的ドメインは、治療薬を含み得るかまたはそれらからなり得る。当該治療薬は、酵素であり得る。それは、アポトーシス誘導物質または阻害剤であり得る。
機能的ドメインは、抗原または抗体認識配列を含み得る。タグは、１つまたは複数の抗原性ペプチドに由来する１つまたは複数の短いペプチドを含み得る。当該ペプチドは、抗原性ペプチドの断片であり得る。好適な抗原性ペプチドは、当業者に既知である。

機能的ドメインは、検出可能な部分を含み得るかまたはそれらからなり得る。検出可能な部分としては、蛍光標識、比色標識、フォトクロミック化合物、磁性粒子、または他の化学標識が挙げられる。検出可能な部分は、ビオチン、ＦＬＡＧタグ、またはＨｉｓタグであり得る。

タグは、スペーサーまたはリンカー部分を含み得る。スペーサーまたはリンカーは、タグとタンパク質リガーゼ認識配列の間に配置され得る。スペーサーまたはリンカーは、タグのＮ末端またはＣ末端に連結され得る。スペーサーまたはリンカーは、タグの機能、例えば、タグによる標的結合活性などに干渉しないようにまたは妨害しないように、配置され得る。スペーサーまたはリンカーは、ペプチド配列であり得る。いくつかの場合において、スペーサーまたはリンカーは、連続する少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアミノ酸、少なくとも１１のアミノ酸、少なくとも１２のアミノ酸、少なくとも１３のアミノ酸、少なくとも１４のアミノ酸、または少なくとも１５のアミノ酸である。スペーサーまたはリンカーは、フレキシブルであり得る。スペーサーは、複数のグリシンおよび／またはセリンアミノ酸を含み得る。

スペーサーおよびリンカー配列は、当業者に既知であり、ならびに、例えば、Ｃｈｅｎら，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３）６５（１０）：１３５７～１３６９に記載されており、なお、当該特許は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、フレキシブルなリンカー配列であり得る。フレキシブルなリンカー配列は、リンカー配列によって連結されるアミノ酸配列の相対運動を可能にする。フレキシブルなリンカーは、当業者に既知であり、ならびに、いくつかは、Ｃｈｅｎら，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３）６５（１０）：１３５７～１３６９において識別されている。フレキシブルなリンカー配列は、多くの場合、高い割合のグリシンおよび／またはセリン残基を含む。

いくつかの場合において、スペーサーまたはリンカー配列は、少なくとも１つのグリシン残基および／または少なくとも１つのセリン残基を含む。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、グリシン残基およびセリン残基からなる。いくつかの場合において、スペーサーまたはリンカー配列は、１～２、１～３、１～４、１～５、または１～１０のアミノ酸の長さを有する。

スペーサーまたはリンカー配列の包含は、細胞外小胞とタグ部分との間のタンパク質リガーゼ反応の効率を向上させ得る。用語「タグ」は、本明細書に使用される場合、タグを含むペプチド、スペーサー、およびタンパク質リガーゼ認識配列を包含し得る。

好適なタンパク質リガーゼ認識配列は、当技術分野において既知である。タンパク質リガーゼ認識配列は、細胞外小胞にタグ付けする方法において使用されるタンパク質リガーゼによって認識される。例えば、当該方法において使用されるタンパク質リガーゼが、ソルターゼである場合、タンパク質リガーゼ認識配列は、ソルターゼ結合部位である。それらの場合において、当該配列は、ＬＰＸＴＧ（この場合、Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸である）、好ましくはＬＰＥＴＧであり得る。あるいは、酵素がアスパラギンエンドペプチダーゼ１（ＡＥＰ１）である場合、タンパク質リガーゼ認識配列は、ＮＧＬであり得る。タンパク質リガーゼ結合部位は、ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に配置され得る。

タグは、さらに、タグ自体の作製の間、タグ付け方法の間、または後続の精製の際に、タグの精製または処理を支援するための１つまたは複数のさらなる配列を含み得る。当技術分野において既知の任意の好適な配列が使用され得る。例えば、当該配列は、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ（例えば、ポリＨｉｓタグ、または６ｘＨｉｓタグなど）であり得る。

タグは、集団または組成物中の実質的に全ての細胞外小胞に連結され得る。本明細書において開示される組成物は、細胞外小胞の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、または少なくとも９７％がタグを含むような細胞外小胞を含み得る。好ましくは、細胞外小胞の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、または少なくとも９７％がタグを含む。いくつかの場合において、組成物内の異なる細胞外小胞は、異なるタグを含む。いくつかの場合において、細胞外小胞は、同じまたは実質的に同じタグを含む。

タグを組み入れる方法は、国際出願ＰＣＴ／ＳＧ２０１９／０５０４８１、国際公開第２０１４／１８３０７１（Ａ２）号、国際公開第２０１４／１８３０６６（Ａ２）号、および米国特許出願公開第２０１４／００３０６９７（Ａ１）号に記載されており、なお、各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

カーゴ
本明細書において説明される細胞外小胞は、カーゴが担持されるかまたはカーゴを含む。本開示は、特に、複数の非同一核酸を含むカーゴに関する。核酸は、別の核酸が少なくとも１つの特性において異なる場合、その別の核酸と非同一非ある。そのような特性の例は、以下において説明される。用語「非同一」および「異なる」は、本明細書において相互互換的に使用される。

本明細書において実証されるように、細胞外小胞は、核酸の異種カーゴを担持することができる。換言すると、細胞外小胞は、少なくとも１つの第１の核酸および少なくとも１つの第２の核酸を含み得る。いくつかの場合において、細胞外小胞は、少なくとも１つの第１の核酸、少なくとも１つの第２の核酸、および少なくとも１つの第３の核酸を含み得る。第１と第２の核酸あるいは第１、第２、および第３の核酸のそれぞれは、非同一である。いくつかの場合において、細胞外小胞第１および第２の核酸あるいは第１、第２、および第３の核酸の少なくとも２つ以上のコピーを含み得る。しかしながら、重要なのは、ＥＶにおける核酸分子の少なくとも１つがＥＶにおける他の核酸のうちの少なくとも１つと異なっているか、あるいは３つの異なる核酸が担持されたＥＶの場合、３つの異なる核酸のそれぞれの少なくとも１つが存在することである。

核酸は、さらなる核酸が異なるクラスの核酸である場合、そのさらなる核酸と非同一非ある。核酸のクラスとしては、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ－相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ギャップマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、発現ベクター、環状ＤＮＡ、直鎖状二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、ダンベル型ＤＮＡ最小ベクター、およびＲＮＡミニサークルが挙げられる。

核酸は、ＤＮＡであり得る。核酸は、ＲＮＡであり得る。核酸は、ｓｓＤＮＡであり得る。核酸は、ｄｓＤＮＡであり得る。核酸は、ｓｓＲＮＡであり得る。核酸は、ｄｓＲＮＡであり得る。核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。核酸は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり得る。核酸は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり得る。核酸は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であり得る。核酸は、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）であり得る。核酸は、環状ＲＮＡであり得る。核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり得る。核酸は、プライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）であり得る。核酸は、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）であり得る。核酸は、ｐｉｗｉ－相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）であり得る。核酸は、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であり得る。核酸は、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）であり得る。核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり得る。核酸は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。核酸は、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）であり得る。核酸は、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）であり得る。核酸は、ギャップマーであり得る。核酸は、ロックド核酸（ＬＮＡ）であり得る。核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。核酸は、発現ベクターであり得る。核酸は、ＤＮＡプラスミドであり得る。核酸は、ＲＮＡプラスミドであり得る。核酸は、ＤＮＡミニサークルであり得る。核酸は、ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターであり得る。核酸は、ＲＮＡミニサークルであり得る。

カーゴは、２つ以上の核酸を含み得、この場合、当該核酸の２つ以上は、異なるタイプの核酸である。カーゴは、３つ以上の核酸を含み得、この場合、当該核酸の３つ以上は、異なるタイプである。カーゴは、同じタイプの２つ以上の核酸を含み得、この場合、当該核酸の２つ以上は、同一ではない。カーゴは、複数のＤＮＡ分子を含み得る。カーゴは、複数のＲＮＡ分子を含み得る。カーゴは、複数のプラスミドを含み得る。カーゴは、複数のミニサークルを含み得る。カーゴは、複数のダンベル型ＤＮＡ最小ベクターを含み得る。カーゴは、複数のｍＲＮＡ分子を含み得る。カーゴは、複数の発現ベクターを含み得る。カーゴは、複数の核酸を含み得、この場合、当該核酸の２つ以上は、それぞれ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ－相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ギャップマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、発現ベクター、環状ＤＮＡ、直鎖状二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、およびＲＮＡミニサークルからなる群から独立して選択される。例えば、カーゴは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み得る。カーゴは、プラスミドおよびｇＲＮＡを含み得る。カーゴは、ミニサークルおよびｇＲＮＡを含み得る。カーゴは、発現ベクターおよびｇＲＮＡを含み得る。カーゴは、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含み得る。カーゴは、ｄｓＤＮＡおよびｇＲＮＡを含み得る。カーゴは、プラスミドおよびｐｅｇＲＮＡを含み得る。カーゴは、ミニサークルおよびｐｅｇＲＮＡを含み得る。カーゴは、発現ベクターおよびｐｅｇＲＮＡを含み得る。カーゴは、ｍＲＮＡおよびｐｅｇＲＮＡを含み得る。カーゴは、ｄｓＤＮＡおよびｐｅｇＲＮＡを含み得る。カーゴは、プラスミドおよびミニサークルを含み得る。カーゴは、プラスミドおよび発現ベクターを含み得る。カーゴは、プラスミドおよびｍＲＮＡを含み得る。カーゴは、プラスミドおよびｄｓＤＮＡを含み得る。カーゴは、ミニサークルおよび発現ベクターを含み得る。カーゴは、ミニサークルおよびｍＲＮＡを含み得る。カーゴは、ミニサークルおよびｄｓＤＮＡを含み得る。カーゴは、発現ベクターおよびｍＲＮＡを含み得る。カーゴは、発現ベクターおよびｄｓＤＮＡを含み得る。カーゴは、ｍＲＮＡおよびｄｓＤＮＡを含み得る。カーゴは、プラスミドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。カーゴは、プラスミドおよびｓｉＲＮＡを含み得る。カーゴは、プラスミド、ｇＲＮＡ、およびｄｓＤＮＡを含み得る。カーゴは、ミニサークル、ｇＲＮＡ、およびプラスミドを含み得る。カーゴは、ミニサークル、ｇＲＮＡ、およびｄｓＤＮＡを含み得る。カーゴは、発現ベクター、ｇＲＮＡ、およびプラスミドを含み得る。カーゴは、発現ベクター、ｇＲＮＡ、およびｄｓＤＮＡを含み得る。カーゴは、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびプラスミドを含み得る。カーゴは、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびｄｓＤＮＡを含み得る。

本明細書において説明されるいくつかの態様において、カーゴは、少なくとも２つの非同一核酸を含む。さらなる核酸が異なるサイズ、長さである場合（すなわち、異なる数の塩基または塩基対を有する場合）、さらなる核酸が異なる配列を有する場合、またはさらなる核酸が当該さらなる核酸に対する配列における異なる位置に修飾された塩基を含む場合、核酸は、当該さらなる核酸と非同一非ある。当該核酸は、別々の分子である。少なくとも２つの核酸または少なくとも３つの核酸は、連続しないまたは連続した核酸配列であり、それらは、組み合わされてより大きな核酸を形成する。カーゴは、異なる長さ（すなわち、異なる数の塩基または塩基対）を有する少なくとも２つの核酸を含み得る。カーゴは、同じ長さを有する少なくとも２つの核酸を含み得る。カーゴは、少なくとも２つの核酸を含み得、この場合、当該核酸のうちの１つは、一本鎖分子であり、ならびに当該核酸のうちの１つは、二本鎖である。いくつかの場合において、両方の核酸は一本鎖であり、または両方の核酸は二本鎖であるが、サイズ、長さ、または配列など他の点において異なっている。核酸は、さらなる核酸が異なるヌクレオチド配列を含む場合、そのさらなる核酸と非同一であり得る。カーゴは、異なる配列を有する少なくとも２つの核酸を含み得る。カーゴは、同じ配列を有するが塩基修飾、核酸のタイプ、または二本鎖／一本鎖の鎖特性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）において異なる少なくとも２つの核酸を含み得る。さらなる核酸が異なる産物タイプ（例えば、目的のペプチド／ポリペプチド、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯ）または異なる配列を有する産物（例えば、異なるヌクレオチド配列を有するＲＮＡあるいは異なるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質）をコードする場合、核酸は、そのさらなる核酸と非同一であり得る。カーゴは、異なる産物をコードする少なくとも２つの核酸を含み得る。カーゴは、同じ産物をコードするが非同一配列を有する、少なくとも２つの核酸を含み得る。カーゴは、異なる配列を有する産物をコードする少なくとも２つの核酸を含み得る。カーゴは、同じ配列を有する産物をコードする少なくとも２つの核酸を含み得、この場合、当該核酸は、異なる配列を有する。さらなる核酸が当該核酸に存在しないかまたは当該核酸の異なる位置に存在する１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドまたは他の修飾を含む場合、核酸は、当該さらなる核酸と非同一非ある。カーゴは、異なる修飾を有する少なくとも２つの核酸を含み得る。カーゴは、同じ修飾を有する少なくとも２つの核酸を含み得る。

核酸
核酸カーゴは、細胞外小胞中またはその上に担持された核酸（例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）を意味する。核酸カーゴは、通常、オリゴヌクレオチド鎖（任意の形態、例えば、一本鎖、二本鎖、高次コイルまたは非高次コイル、染色体性または非染色体性であり得る）を意味する。当該核酸は、他の分子、例えば、キャリア、安定剤、ヒストン、親油性剤など、にコンジュゲートされ得るかまたはそれらと複合体化され得る。

本明細書において開示される方法は、任意の核酸カーゴのために使用され得る。核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る。核酸は、円形であり得る。
核酸カーゴは、ミニサークルであり得る。ミニサークルは、小さな（約４ｋｂｐ）円形のレプリコンである。ミニサークルは、通常、ＤＮＡ、通常は二本鎖ＤＮＡを含む。ミニサークルは、いくつかの真核性オルガネラゲノムにおいて天然に生じるが、本明細書において好ましいミニサークルは、合成により得られる。いくつかの場合において、ミニサークルは、複製起点を含まず、したがって、細胞内において複製しない。ミニサークルは、当業者に既知であり、例えば、Ｇａｓｐａｒら，Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１５ Ｍａｒ；１５（３）：３５３～７９．ｄｏｉ：１０．１５１７／１４７１２５９８．２０１５．９９６５４４．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｄｅｃ ２４を参照されたく、なお、当該文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。いくつかの場合において、ミニサークルは、レポーター遺伝子を含む。

核酸は、ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターであり得る。ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターは、Ｙｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１５：４３（１８）：ｅ１２０）、Ｊｉａｎｇら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１６：２４（９）：１５８１～１５９１）、およびＺａｎｔａら（ＰＮＡＳ １９９９：９６：９１～９６）に記載されており、それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターは、１つまたは複数のヘアピンを含む二次構造を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。

いくつかの場合において、核酸カーゴは、プラスミドである。プラスミドは、通常、細胞中において独自に複製することができる。当該プラスミドは、複製開始点配列を含み得る。

いくつかの場合において、当該核酸は、小胞の表面上のタンパク質に結合する配列を含むようには修飾されない。例えば、カーゴ核酸は、トランス活性化応答（ＴＡＲ）エレメントを含まない。いくつかの場合において、細胞外小胞は、修飾された表面タンパク質、例えば、外因性ＡＲＲＤＣ１タンパク質またはＡＲＲＤＣ１タンパク質に由来する配列などを含むようには修飾されない。

カーゴは、好ましくは外因性である。換言すると、当該核酸は、細胞外小胞が新たに生成されたときに当該細胞外小胞に存在せず、および／または、細胞外小胞が由来する細胞に存在しない。カーゴは、設計されたように、および／またはインビトロまたはインシリコにおいて構築されたように合成され得る。

カーゴは、治療用オリゴヌクレオチドまたは診断用オリゴヌクレオチドであり得る。カーゴは、標的細胞に送達された後に、標的細胞において治療効果を発揮し得る。当該核酸は、目的の遺伝子をコードし得る。例えば、カーゴは、欠損遺伝子（ａｂｓｅｎｔ ｇｅｎｅ）を置換する、欠陥遺伝子を修復する、または標的組織において治療効果を誘導するように機能的遺伝子をコードし得る。いくつかの場合において、カーゴは、レポーター遺伝子であるか、または容易に検出可能な分子をコードする。

いくつかの場合において、カーゴは、核酸であり得る。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。カーゴは、ＲＮＡであり得る。ＲＮＡは、治療用ＲＮＡであり得る。ＲＮＡは、化学的合成またはインビトロ転写によって産生された、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）環状ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、または長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）であり得る。いくつかの場合において、カーゴは、例えば、内因性核酸配列、例えば、転写因子、ｍｉＲＮＡ、または他の内因性ｍＲＮＡなど、に対して相補的である配列を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

カーゴは、目的の分子であり得るかまたはそれをコードし得る。例えば、カーゴは、Ｃａｓ９または別のヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡであり得る。カーゴは、目的の１つまたは複数のペプチド／ポリペプチドをコードし得る。カーゴは、抗原結合性分子またはその断片をコードし得る。

いくつかの場合において、カーゴは、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である核酸、またはそれをコードする核酸である。そのようなカーゴは、遺伝子サイレンシングの方法または遺伝子発現を下方制御する方法において有用であり得る。ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯは、標的細胞において発現される配列、例えば、ｍＲＮＡ配列に対応し得る。それは、特定の遺伝子または目的のタンパク質の発現を阻害または増強するように機能し得る。核酸は、標的細胞において発現されるｍｉＲＮＡに対応するｓｉＲＮＡまたはＡＳＯをコードし得る。

カーゴは、ｍＲＮＡを含み得るかまたはコードし得る。ｍＲＮＡは、導入遺伝子をコードし得る。
細胞において、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し得る。細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないため、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの翻訳を妨げ得る。遺伝子のインビトロ翻訳を阻害するためのアンチセンス方法の使用は、当技術分野において周知である（例えば、Ｍａｒｃｕｓ－Ｓａｋｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８８，１７２：２８９を参照されたい）。さらに、ＤＮＡに直接結合するアンチセンス分子が使用され得る。アンチセンス核酸は、一本鎖または二本鎖核酸であり得る。アンチセンス核酸の非限定的な例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；それらの誘導体または前駆体、例えば、ヌクレオチド類似物などを含む）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓａＲＮＡｓ（低分子活性化ＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）またはそれらの誘導体もしくは前駆体のいくつか、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、あるいは一本鎖分子、例えば、キメラＡＳＯまたはギャップマーなどが挙げられる。アンチセンス核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または他の細胞劣化メカニズム、例えば、ＲＮａｓｅ分解などを刺激し得る。

いくつかの好ましい実施形態において、カーゴは、ｍｉｃｒｏＲＮＡを標的にする、例えばハイブリダイズする、ＡＳＯを含むかまたはコードする。いくつかの場合において、ＡＳＯは、マイクロＲＮＡの機能を阻害し、ならびにｍｉＲＮＡによる転写後調節遺伝子発現を防ぐ。いくつかの場合において、ＡＳＯは、通常はｍｉＲＮＡによって下方制御される１つまたは複数の遺伝子の発現を上方制御するように機能する。したがって、アンチセンス核酸カーゴは、標的遺伝子の転写を妨げ得るか、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げ得るか、および／または、標的ｍＲＮＡの分解を促進し得る。いくつかの場合において、アンチセンス核酸は、標的遺伝子の発現の減少を引き起こすことができる。

本明細書において提供される、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「低分子ＲＮＡ」、または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を意味し、この場合、二本鎖ＲＮＡは、遺伝子または標的遺伝子が当該二本鎖ＲＮＡと同じ細胞において発現される場合にその発現を減少または阻害する能力を有する。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成する核酸の相補的部分は、典型的には、実質的または完全な同一性を有する。一実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉは、標的遺伝子と実質的または完全な同一性を有し、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する核酸である。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡは、相補的細胞ｍＲＮＡと相互作用し、それにより相補的ｍＲＮＡの発現を妨げることによって遺伝子発現を阻害する。典型的には、当該核酸は、少なくとも約１５～５０ヌクレオチド長である（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補的配列は、１５～５０ヌクレオチド長であり、ならびに、二本鎖領ｓｉＲＮＡは、約１５～５０塩基対長である）。いくつかの実施形態において、当該長さは、２０～３０塩基のヌクレオチド、好ましくは約２０～２５または約２４～２９ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。

ＲＮＡｉおよびｓｉＲＮＡは、例えば、Ｄａｎａら，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ．２０１７；１３（２）：４８～５７に記載されており、なお、当該文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。アンチセンス核酸分子は、標的核酸配列に対して相補的である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または部分的二本鎖ＲＮＡを含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子は、分子内の第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分との間における相補的対合によって形成される。ＲＮＡ配列（すなわち、一部分）の長さは、概して、３０ヌクレオチド長未満（例えば、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０ヌクレオチド、またはそれ以下）である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列の長さは、１８～２４ヌクレオチド長である。いくつかのｓｉＲＮＡ分子において、ＲＮＡ分子の相補的な第１および第２の部分は、ヘアピン構造の「ステム」を形成する。この２つの部分は、連結配列によって接合され得て、ヘアピン構造における「ループ」を形成し得る。連結配列は、長さが変わり得、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチド長であり得る。好適な連結配列は、当技術分野において既知である。

本発明の方法における使用にとって好適なｓｉＲＮＡ分子は、当技術分野において既知のスキームによって設計され得、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ，２００１ ４１１：４９４～８；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４ ３１６（４）：１０５０～８；およびＲｅｙｎｏｌｄｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００４，２２（３）：３２６～３０を参照されたい。ｓｉＲＮＡ分子の作製の詳細は、いくつかの商業的ベンダー、例えば、Ａｍｂｉｏｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅなどのウェブサイトにおいて見出すことができる。任意の潜在的ｓｉＲＮＡ候補の配列は、概して、ＢＬＡＳＴアラインメントプログラムを使用して他の核酸配列に対する任意の可能な一致または核酸配列の多型性に対してチェックすることができる（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅのインターネットウェブサイトを参照されたい）。典型的には、有効な薬物候補を得るために、多くのｓｉＲＮＡが作製され、ならびにスクリーニングにかけられており、それについては、米国特許第７，０７８，１９６号を参照されたい。ｓｉＲＮＡは、ベクターから発現され得るか、および／または化学的にもしくは合成により作製され得る。合成ＲＮＡｉは、商業的供給元、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カルフォルニア）などから入手することができる。ＲＮＡｉベクターも、商業的供給元、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどから入手することができる。

核酸分子は、ｍｉＲＮＡであり得るか、それを含み得るか、またはそれをコードし得る。用語「ｍｉＲＮＡ」は、その単純な普通の意味において使用され、転写後調節遺伝子発現が可能な低分子ノンコーディングＲＮＡ分子を意味する。一実施形態において、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子と実質的または完全な同一性を有する核酸である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、相補的細胞ｍＲＮＡと相互作用し、それにより、当該相補的ｍＲＮＡの発現を妨げることによって、遺伝子発現を阻害する。典型的には、ｍｉＲＮＡは、少なくとも約１５～５０ヌクレオチド長である（例えば、ｍｉＲＮＡのそれぞれの相補的配列は、１５～５０ヌクレオチド長であり、ならびに、ｍｉＲＮＡは、約１５～５０塩基対長である）。いくつかの場合において、当該核酸は、合成体または組換え体である。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－２９ａであり得る。いくつかの場合において、当該核酸は、ｍｉＲＮＡステムループである。

本発明の方法において有用な核酸としては、発癌性ｍｉＲＮＡ（ｏｎｃｏｍｉＲとしても知られる）または転写因子を標的にする、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡが挙げられる。カーゴは、リボザイムまたはアプタマーであり得る。いくつかの場合において、核酸は、プラスミドである。

本明細書において説明されるある特定の態様において、カーゴは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡに対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列に対する配列において相補的である少なくとも一部分を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列に結合し得、それにより当該標的配列を阻害し得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列の翻訳プロセスを阻害し得る。ｍｉＲＮＡは、がんに関連するｍｉＲＮＡ（Ｏｎｃｏｍｉｒ）であり得る。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２５ｂであり得る。

遺伝子編集
いくつかの態様において、カーゴは、遺伝子編集システムの１つまたは複数の構成要素である。いくつかの態様において、カーゴは、遺伝子編集システムの２つ以上の構成要素である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム。例えば、カーゴは、特定の標的配列を認識する核酸を含み得る。カーゴは、ｇＲＮＡを含み得る。カーゴは、ｐｅｇＲＮＡを含み得る。そのようなｇＲＮＡおよびｐｅｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集において有用であり得る。カーゴは、ＣａｓをコードするＣａｓ ｍＲＮＡまたはプラスミドを含み得る。カーゴは、ｇＲＮＡ、ならびにＣａｓをコードするＣａｓ ｍＲＮＡまたはプラスミドを含み得る。カーゴは、ｐｅｇＲＮＡ、ならびにＣａｓをコードするＣａｓ ｍＲＮＡまたはプラスミドを含み得る。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ヌクレアーゼであり得る。

例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）など、他の遺伝子編集分子をカーゴとして使用してもよい。カーゴは、標的細胞における特定の核酸配列を標的にするように操作された配列を含み得る。遺伝子編集分子は、ｍｉＲＮＡを特異的に標的にし得る。例えば、遺伝子編集分子は、ｍｉＲ－１２５ｂを標的にするｇＲＮＡであり得る。

いくつかの実施形態において、当該方法は、部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）を使用した標的遺伝子編集を用いる。ＳＳＮを使用した遺伝子編集は、例えば、ＥｉｄおよびＭａｈｆｏｕｚ，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６ Ｏｃｔ；４８（１０）：ｅ２６５において概説されており、なお、当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。部位特異的二本鎖破壊（ＤＳＢ）を作り出すことができる酵素は、目的の核酸配列を標的にするためにＤＳＢを導入するように操作することができる。ＤＳＢは、いずれかの修復ミスの多い非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復され得、その場合、切断の２つの末端は、多くの場合、ヌクレオチドの挿入または欠失によって再接合される。あるいは、ＤＳＢは、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復され得、その場合、切断部位に対して相同の末端を有するＤＮＡテンプレートが供給され、ＤＳＢの当該部位に導入される。

標的核酸配列特異的ＤＳＢを生成するように操作することができるＳＳＮとしては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムが挙げられる。

ＺＦＮシステムは、例えば、Ｕｍｏｖら，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．（２０１０）１１（９）：６３６～４６において概説されており、なお、当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。ＺＦＮは、プログラマブルジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメイン）を含む。ＤＮＡ結合ドメインは、標的核酸配列に結合することができるジンクフィンガーアレイをスクリーニングすることによって識別され得る。

エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）が二量体として機能するため、ＺＦＮは、対になって機能する。ＺＦＮシステムは、エンドヌクレアーゼが機能するように、適切な配向を有し（すなわち、対向するＤＮＡ鎖上にあり）離間している、標的ゲノムにおける独特のＤＮＡ認識部位を有する２つのモノマーを含む。

いくつかの態様において、ＥＶは、ＺＦＮシステム関連カーゴが担持される。これらの態様において、ＥＶは、遺伝子編集の方法において有用である。
カーゴは、ＺＦＮ遺伝子編集システムの構成要素をコードする核酸であり得る。ＺＦＮ遺伝子編集システムは、２つのポリペプチドモノマーを有するＺＦＮ対を含み得る。当該モノマーは、同じ核酸分子によってコードされ得る。当該モノマーは、別々の核酸分子によってコードされ得る。モノマーをコードする核酸は、ＤＮＡであり得る。モノマーをコードする核酸は、プラスミドであり得る。モノマーをコードする核酸は、発現ベクターであり得る。モノマーをコードする核酸は、ｍＲＮＡであり得る。モノマーをコードする核酸は、ミニサークルであり得る。モノマーをコードする核酸は、ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターであり得る。

本明細書において説明されるいくつかの態様において、カーゴは、ＺＦＮ対の第１のモノマーをコードする第１の核酸分子およびＺＦＮ対の第２のモノマーをコードするさらなる核酸分子を含む。当該核酸は、ＺＦＮモノマーが標的細胞内において発現されるような発現カセットを含み得る。次いで、発現されたＺＦＮモノマーは、エンドヌクレアーゼの二量体化を可能にするようにそれらのそれぞれのＤＮＡ認識部位に結合し得る。次いで、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡに二本鎖切断を導入するように機能することができる。

ＴＡＬＥＮシステムは、例えば、Ｍａｈｆｏｕｚら，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．（２０１４）１２（８）：１００６～１４において概説されており、なお、当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。ＴＡＬＥＮは、プログラマブルＤＮＡ結合型ＴＡＬＥドメインおよびＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメイン）を含む。ＴＡＬＥは、ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ（ＲＶＤ）である各リピートの位置１２および１３の２つの残基を除いて同一である、３３～３９のアミノ酸類のリピートからなるリピートドメインを含む。各ＲＶＤは、以下の関係による標的ＤＮＡ配列におけるヌクレオチドに対するリピートの結合を決定する：「ＨＤ」はＣに結合し、「ＮＩ」はＡに結合し、「ＮＧ」はＴに結合し、ならびに「ＮＮ」または「ＮＫ」はＧに結合する（Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６（５９５９）：１５０１）。

エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）が二量体として機能するため、ＴＡＬＥＮは対になって機能する。ＴＡＬＥＮシステムは、エンドヌクレアーゼが機能するように、適切な配向を有し（すなわち、対向するＤＮＡ鎖上にあり）離間している、標的ゲノムにおける独特のＤＮＡ認識部位を有する２つのモノマーを含む。

いくつかの態様において、ＥＶは、ＴＡＬＥＮシステム関連カーゴが担持される。これらの態様において、ＥＶは、遺伝子編集の方法において有用である。
カーゴは、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集システムの構成要素をコードする核酸であり得る。ＴＡＬＥＮ遺伝子編集システムは、２つのポリペプチドモノマーを有するＴＡＬＥＮ対を含み得る。当該モノマーは、同じ核酸分子によってコードされ得る。当該モノマーは、別々の核酸分子によってコードされ得る。モノマーをコードする核酸は、ＤＮＡであり得る。モノマーをコードする核酸は、プラスミドであり得る。モノマーをコードする核酸は、発現ベクターであり得る。モノマーをコードする核酸は、ｍＲＮＡであり得る。モノマーをコードする核酸は、ミニサークルであり得る。モノマーをコードする核酸は、ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターであり得る。

本明細書において説明されるいくつかの態様において、カーゴは、ＴＡＬＥＮ対の第１のモノマーをコードする第１の核酸分子およびＴＡＬＥＮ対の第２のモノマーをコードするさらなる核酸分子を含む。当該核酸は、ＴＡＬＥＮモノマーが標的細胞内において発現されるような発現カセットを含み得る。次いで、発現されたＴＡＬＥＮモノマーは、エンドヌクレアーゼの二量体化を可能にするようにそれらのそれぞれのＤＮＡ認識部位に結合し得る。次いで、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡに二本鎖切断を導入するように機能することができる。

ＣＲＩＳＰＲは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔの略語である。当該用語は、最初は、これらの配列の起源および機能が知られておらず、それらは起源において原核生物であると思われていたときに使用された。ＣＲＩＳＰＲは、Ｄ回帰性リピートにおける短くて反復性の塩基配列を含むＤＮＡのセグメントである（ヌクレオチドの当該配列は、両方向において同じである）。各反復は、ウイルスまたはプラスミドに由来する外来ＤＮＡにおける以前の組込みに由来するスペーサーＤＮＡの短いセグメントが後に続く。ＣＡＳ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子の小さいクラスターが、ＣＲＩＳＰＲ配列の横に位置される。スペーサー配列を有するＲＮＡは、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質が外来の病原性ＤＮＡを認識して切断するのを助ける。他のＲＮＡ誘導Ｃａｓタンパク質は、外来ＲＮＡを切断する。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのシンプルなバージョンであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ゲノムを編集するように変更されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を細胞内に送達することによって、当該細胞のゲノムを、所望の位置において切断することができ、それは、既存の遺伝子の除去および／または新たな遺伝子の追加を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、２つのクラスに分けられる。クラス１のシステムは、外来核酸を分解するために複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用する。クラス２のシステムは、同じ目的のためにシンプルで大きなＣａｓタンパク質を使用する。クラス１は、タイプＩ、ＩＩＩ、およびＩＶに分けられる。クラス２は、タイプＩＩ、Ｖ、およびＶＩに分けられる。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集は、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲシステムを使用する。

いくつかの態様において、ＥＶは、ＣＲＩＳＰＲ関連カーゴが担持される。換言すると、ＥＶは、治療用遺伝子編集など、遺伝子編集を伴う方法において有用である。いくつかの場合において、ＥＶは、インビトロ遺伝子編集にとって有用である。いくつかの場合において、ＥＶは、インビボ遺伝子編集にとって有用である。

カーゴは、ガイドＲＮＡを含み得る。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合して活性複合体を形成する領域と共に、宿主ＤＮＡの正しいセクションに位置するガイドＲＮＡを含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡに結合して、活性複合体を形成する。ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの両方を組み合わせ、その結果、活性複合体をコードする。ｇＲＮＡは、複数のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡは、目的の配列または遺伝子に結合するように設計され得る。ｇＲＮＡは、切断のために遺伝子を標的にし得る。場合により、ＤＮＡ修復テンプレートの随意のセクションが含められる。修復テンプレートは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）のどちらかにおいて用いられ得る。

カーゴは、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどであり得る。当該ヌクレアーゼは、その活性形態がＤＮＡを修飾することができるタンパク質である。ヌクレアーゼバリアントは、一本鎖ニック形成、二本鎖破壊、ＤＮＡ結合、または他の異なる機能が可能である。当該ヌクレアーゼは、ＤＮＡ部位を認識し、それは、部位特異的ＤＮＡ編集を可能にする。ヌクレアーゼは、修飾され得る。例えば、ヌクレアーゼは、逆トランスクリプターゼに融合され得る。そのようなヌクレアーゼは、プライム編集システムにおいて有用であり得る。別の実施例において、ヌクレアーゼは、触媒的に不活性であり得る。そのようなヌクレアーゼは、転写因子に融合され得、ならびに転写を調節するためにシステムにおいて役立ち得る。

ｇＲＮＡおよびヌクレアーゼは、プラスミド上においてコードされ得る。換言すると、ＥＶカーゴは、ｇＲＮＡおよびヌクレアーゼの両方をコードするプラスミドを含み得る。ｇＲＮＡおよびヌクレアーゼは、別々のプラスミド上においてコードされ得る。換言すると、ＥＶカーゴは、ｇＲＮＡコードする第１のプラスミドおよびヌクレアーゼをコードするさらなるプラスミドを含み得る。いくつかの場合において、ＥＶは、ｇＲＮＡを含み、ならびに、別のＥＶは、ヌクレアーゼを含むかまたはコードする。いくつかの場合において、ＥＶは、ｇＲＮＡをコードするプラスミドおよびヌクレアーゼをコードするプラスミドを含む。したがって、いくつかの態様において、ＥＶを含む組成物が提供され、この場合、ＥＶにおけるある一部分は、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼを含むかまたはコードし、ならびに、ＥＶにおけるある一部分は、ｇＲＮＡを含むかまたはコードする。いくつかの場合において、ｇＲＮＡを含むかまたはコードするＥＶを含む組成物ならびにヌクレアーゼをコードするかまたは含むＥＶを含む組成物が、同時投与される。いくつかの場合において、当該組成物は、ＥＶを含み、この場合、ＥＶは、ｇＲＮＡおよびヌクレアーゼの両方をコードするオリゴヌクレオチドを含む。

カーゴは、さらに、ＤＮＡ修復テンプレートを含み得る。ＤＮＡ修復テンプレートは、直鎖状ｄｓＤＮＡであり得る。ＤＮＡ修復テンプレートは、プラスミドであり得る。ＤＮＡ修復テンプレートは、ｇＲＮＡおよび／またはヌクレアーゼをコードするプラスミドと同じプラスミド上に存在し得る。ＤＮＡ修復テンプレートは、ｇＲＮＡおよび／またはヌクレアーゼをコードするプラスミドとは別々のプラスミド上に存在し得る。いくつかの場合において、ＥＶカーゴは、ｇＲＮＡおよびヌクレアーゼの両方をコードするプラスミドならびにＤＮＡ修復テンプレートを含む別々のプラスミドまたは直鎖状ｄｓＤＮＡを含み得る。いくつかの場合において、ＥＶカーゴは、ｇＲＮＡをコードする第１のプラスミド、ヌクレアーゼをコードする第２のプラスミド、およびＤＮＡ修復テンプレートを含むさらなるプラスミドまたはｄｓＤＮＡを含み得る。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９および関連システム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ１、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ２、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ３は、例えば、Ｎａｋａｄｅら，Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（２０１７）８（３）：２６５～２７３において概説されており、なお、当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。これらのシステムは、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）および単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子を含む。ｓｇＲＮＡは、目的の核酸配列に対するエンドヌクレアーゼ活性を標的にするように操作することができる。

修飾ＲＮＡ
いくつかの場合において、核酸カーゴは、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドまたは他の修飾を含む。化学修飾は、核酸の、糖位置、リン酸位置、および／または塩基位置での化学的置換、例えば、修飾ヌクレオチドの組込み、キャッピング部分の組込み（例えば、３’キャッピング）、高分子量へのコンジュゲーション、非免疫原性化合物（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、親油性化合物へのコンジュゲーション、リン酸骨格における置換などを包含し得る。例えば、当該核酸は、１つまたは複数の２’位糖修飾、例えば、２’－アミノ（２’－ＮＨ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、および２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）などを含み得る。塩基修飾は、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンでの修飾、４－チオウリジンの置換、５－ブロモ－または５－ヨード－ウラシルの置換、骨格修飾、メチル化、異常塩基対合の組合せ、例えば、イソ塩基イソシチジン、およびイソグアニジンなどを含み得る。修飾は、３’および５’の修飾、例えば、キャッピングなども含むことができる。他の修飾は、類似体を伴う天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の置換、インターヌクレオチド修飾、例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、インターカレーターを有するもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤を含むもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）、アルキル剤を含むもの、および修飾された結合を有するもの（例えば、αアノマー核酸など）を含むことができる。さらに、通常において糖に存在する任意の水酸基は、ホスホン酸基またはリン酸基によって置換され得るか、標準的な保護基によって保護され得るか、または追加のヌクレオチドまたは固体担持体への追加の結合を用意するために活性化され得る。５’および３’末端ＯＨ基は、リン酸化することができ、あるいは、アミン、約１個から約２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分、あるいは約１から約２０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーまたは他の親水性もしくは疎水性の生物学的合成ポリマーの有機キャッピング基部分によって置換することができる。核酸は、バリアントタイプ、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはギャップマーなどであり得る。

ＤＮＡ
核酸カーゴは、ＤＮＡ分子を含み得る。
カーゴは、発現ベクターまたは発現カセット配列を含み得る。好適な表現ベクターおよび発現カセットは、当技術分野において既知である。本明細書において説明される方法において有用な発現ベクターは、標的細胞における１つまたは複数の核酸配列の発現を促進するエレメントを含む。本開示において有用な発現ベクターは、導入遺伝子または他の核酸配列を含み得る。

発現ベクターは、外来遺伝物質を、細胞での／細胞による発現のために、当該細胞に移送するためのビヒクルとして使用されるオリゴヌクレオチド分子を意味する。そのようなベクターは、発現される遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含み得る。ベクターは、終止コドンおよび発現エンハンサーも含み得る。当技術分野において既知の任意の好適なプロモーター、エンハンサー、および収支コドンが使用され得る。

本明細書において、用語「作動可能に連結された」は、選択されたヌクレオチド配列および調節ヌクレオチド配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）が、ヌクレオチド配列の発現を調節配列の影響下または制御下に置くような方式において共有結合によって連結される（その結果、発現カセットを形成する）ような状況を包含し得る。したがって、調節配列がヌクレオチド配列の転写に作用することができる場合、調節配列は、選択されたヌクレオチド配列に作動可能に連結される。適切であれば、結果として得られる転写物は、次いで、所望のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドへと翻訳され得る。

カーゴは、異なるペプチドまたはタンパク質をコードする複数の発現ベクターを含み得る。当該異なるペプチドまたはタンパク質は、例えば、同じ分子のサブユニットまたは構成要素、あるいは連動した作動を有する分子、例えば、同じ生物学的経路の構成要素など、相互に関連し得るか、またはリガンド：受容体結合関係を示し得る。

カーゴは、タンパク質複合体の第１のタンパク質をコードする第１の発現ベクターおよびタンパク質複合体のさらなるタンパク質をコードするさらなる発現ベクターを含み得る。当該さらなるタンパク質は、第１のタンパク質と同一ではなくてもよい。カーゴは、タンパク質の第１のドメインをコードする第１の発現ベクターおよびタンパク質のさらなるドメインをコードするさらなる発現ベクターを含み得る。カーゴは、タンパク質の第１のセグメントをコードする第１の発現ベクターおよびタンパク質のさらなるセグメントをコードするさらなる発現ベクターを含み得る。例えば、発現ベクターは、スプリットタンパク質の異なるセグメントをコードし得る。

ベクター化抗体
いくつかの態様において、カーゴは、ベクター化抗体、または抗体遺伝子療法、システムの１つまたは複数の構成要素である。例えば、カーゴは、抗原結合性分子またはその断片をコードする核酸を含み得る。

抗原結合性分子は、標的抗原に結合することができる分子を意味する。抗原結合性分子のタイプとしては、関連する標的分子に対して結合性を示す限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクロナール抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片（例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ_２、ダイアボディ、トリアボディ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ミニボディ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶｈＨ）など）が挙げられる。本明細書において開示される任意の抗体または抗原結合性断片は、ベクター化抗体システムにおいて有用であり得る。

抗体遺伝子療法は、対象に目的の抗体をコードする核酸を投与することを目指す。対象自身の細胞は、次いで、コードされた抗体を産生および分泌するであろう。
いくつかの態様において、ＥＶは、ベクター化された抗体関連カーゴが担持される。これらの態様において、ＥＶは、抗体遺伝子療法の方法において有用である。

カーゴは、抗原結合性分子またはその断片をコードする核酸であり得る。抗原結合性分子またはその断片をコードする核酸は、ＤＮＡであり得る。抗原結合性分子またはその断片をコードする核酸は、プラスミドであり得る。抗原結合性分子またはその断片をコードする核酸は、発現ベクターであり得る。抗原結合性分子またはその断片をコードする核酸は、ｍＲＮＡであり得る。抗原結合性分子またはその断片をコードする核酸は、ミニサークルであり得る。抗原結合性分子またはその断片をコードする核酸は、ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターであり得る。

抗原結合性分子は、抗原結合性ポリペプチド、または抗原結合性ポリペプチド複合体であり得るかまたはそれを含み得る。抗原結合性分子は、一緒に抗原結合性ドメインを形成する２つ以上のポリペプチドを含み得る。当該ポリペプチドは、共有結合的または非共有結合的に会合し得る。例えば、１つのポリペプチドは、抗体の重鎖を含み得、ならびに、さらなるポリペプチドは、抗体の軽鎖を含み得る。別の実施例において、一方のポリペプチドは、抗体の重鎖可変領域を含み得、ならびにさらなるポリペプチドは抗体の軽鎖可変領域を含み得る。当該ポリペプチドは、別々の核酸分子によってコードされ得る。

本明細書において説明されるいくつかの態様において、カーゴは、抗体の重鎖をコードする第１の核酸分子および抗体の軽鎖をコードするさらなる核酸分子を含む。当該核酸は、重鎖および軽鎖が標的細胞内において発現されるような発現カセットを含み得る。発現されたタンパク質は、次いで、抗体を形成するために細胞内において会合し得る。

抗体
抗体および抗体の抗原結合性断片は、本発明に関連するいくつかの文脈において有用である。それらは、タグとして有用であり得る。それらは、カーゴとして有用であり得る。いくつかの場合において、それらは、カーゴによってコードされ得る。これらの態様において、様々な抗体および抗原結合性断片が関連する。

抗原結合性部分は、抗体の一部（例えば、Ｆａｂ断片）または合成抗体断片（例えば、一本鎖Ｆｖ断片［ＳｃＦｖ］）であり得る。選択された抗原に対する好適なモノクローナル抗体は、既知の技術、例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８２）において開示される技術によって調製され得る。キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８８，８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐａｒｔ２，７９２～７９９）によって議論されている。

抗体または抗原結合性断片は、ヒト化され得る。抗体をヒト化する方法は、当技術分野において既知であり、概して、結果としての抗体が齧歯動物が親となる抗体の抗原特異性保持するような、ヒト起源の定常ドメインへの齧歯動物起源の可変ドメインの融合を伴う（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８１，６８５１～６８５５）。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、本発明の方法において有用であり、ならびに、抗原上の単一のエピトープを特異的に標的にする抗体の同種の集団である。好適なモノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法を使用して調製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）．「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」．Ｎａｔｕｒｅ ２５６（５５１７）：４９５；Ｓｉｅｇｅｌ ＤＬ（２００２）．「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」．Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｕ，Ｖｅｒｓｍｏｌｄ Ａ，Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｐ，Ｆｒａｎｋ ＨＧ（２０００）；「Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－－ａ ｒｅｖｉｅｗ」．Ｐｌａｃｅｎｔａ．２１ Ｓｕｐｐｌ Ａ：Ｓ１０６～１２．Ｈｅｌｅｎ Ｅ．Ｃｈａｄｄ ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎ Ｍ．Ｃｈａｍｏｗ；「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，ｎｏ．２（Ａｐｒｉｌ １，２００１）：１８８～１９４；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．；Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．（１９９０）．「Ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ」．Ｎａｔｕｒｅ ３４８（６３０１）：５５２～５５４；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８２）を参照されたい。キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８８，８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐａｒｔ２，７９２～７９９）によって議論されている）。

ポリクロナール抗体は、本発明の方法において有用である。単一特異性ポリクロナール抗体は好ましい。好適なポリクロナール抗体は、当技術分野において周知の方法を使用して調製することができる。

抗体および抗体断片を遺伝子操作することができるため、断片、例えば、ＦａｂおよびＦａｂ２断片などが使用され得る。抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関与し、実際に、早期のプロテアーゼ消化実験において最初に認識されている。さらなる確認は、齧歯動物の抗体の「ヒト化」によって見出された。結果として得られる抗体が齧歯動物が親となる抗体の抗原特異性を保持するように、齧歯動物起源の可変ドメインがヒト起源の定常ドメインに融合され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８１，６８５１～６８５５）。本明細書において開示される細胞外小胞において有用な抗体または抗原結合性断片は、標的分子を認識し、および／またはそれに結合するであろう。

抗原特異性は、可変ドメインによって付与され、ならびに、全てが１つまたは複数の可変ドメインを含む、抗体断片の細菌発現を伴う実験から知られる定常ドメインとは無関係である。これらの分子は、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０４１）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０３８）；一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子、この場合、ＶＨおよびＶＬパートナードメインは、フレキシブルなオリゴペプチドを介して連結される（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８５，５８７９）、および単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４）を含む。それらの特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関与する技術の一般評論は、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９，２９３～２９９に見出される。本明細書において有用な抗体および断片は、ヒトまたはヒト化抗体、マウス抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体であり得るか、または任意の好適な源に由来する抗体であり得る。

発明者らは、「ＳｃＦｖ分子」によって、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが、例えば、直接的に、ペプチドによって、またはフレキシブルなオリゴペプチドによって、共有結合により連結された分子を意味する。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、およびｓｄＡｂ抗体断片は全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現および分泌されることが可能であり、したがって、大量の前記断片の容易な生産を可能にする。

全抗体、およびＦ（ａｂ’）２断片は、「二価」である。発明者らは「二価」によって、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が２つの抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、およびｓｄＡｂ断片は、一価であり、抗原結合部位を１つだけ有する。多価抗体断片は、その小さいサイズゆえに、タグとして特に有用である。

好ましい結合分子は、ｓｄＡｂであり得る。発明者らは「ｓｄＡｂ」によって、１つ、２つ、またはそれ以上の単一モノマー性可変抗体ドメインからなる単一ドメイン抗体を意味する。ｓｄＡｂ分子は、時としてｄＡｂとも呼ばれる。

いくつかの場合において、結合分子は、一本鎖抗体、すなわちｓｃＡｂである。ｓｃＡｂは、共有結合によって連結されたＶＨおよびＶＬパートナードメイン（例えば、直接的に、ペプチドによって、またはフレキシブルなオリゴペプチドによって）および場合により軽鎖定常ドメインからなる。

抗体は、３Ｆ８、８Ｈ９、アバゴボマブ、アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ）、アビツズマブ（Ａｂｉｔｕｚｕｍａｂ）、Ａｂｒｅｚｅｋｉｍａｂ、アブリルマブ（Ａｂｒｉｌｕｍａｂ）、アクトクスマブ（Ａｃｔｏｘｕｍａｂ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、アデカツムマブ、アデュカヌマブ、アファセビクマブ（Ａｆａｓｅｖｉｋｕｍａｂ）、アフェリモマブ、アラシズマブペゴル（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏ）、アレムツズマブ（Ｌｅｍｔｒａｄａ）、アリロクマブ（Ｐｒａｌｕｅｎｔ）、アルツモマブペンテテート（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）（Ｈｙｂｒｉ－ｃｅａｋｅｒ）、アマツキシマブ、アミバンタマブ、アナツモマブマフェナトキス、アンデカリキシマブ、アネツマブラブタンシン（Ａｎｅｔｕｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、アニフロルマブ（Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂ）、アンスビマブ（Ａｎｓｕｖｉｍａｂ）（Ｅｂａｎｇａ）、アンルキンズマブ（Ａｎｒｕｋｉｎｚｕｍａｂ）（＝ＩＭＡ－６３８）、アポリズマブ、アプルツマブイキサドチン（Ａｐｒｕｔｕｍａｂ ｉｘａｄｏｔｉｎ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ－Ｓｃａｎ）、アスクリンバクマブ（Ａｓｃｒｉｎｖａｃｕｍａｂ）、アセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アチドルトクスマブ（Ａｔｉｄｏｒｔｏｘｕｍａｂ）、アチヌマブ（Ａｔｉｎｕｍａｂ）、アトルティビマブ、アトルティビマブ／マフティビマブ／オデシビマブ（Ｉｎｍａｚｅｂ）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、アジンツキシズマブベドチン（Ａｚｉｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、バルスチリマブ、バムラニビマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、バビツキシマブ、ＢＣＤ－１００、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）（ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ）、ベゲロマブ（Ｂｅｇｅｌｏｍａｂ）、ベランタマブ マホドチン（Ｂｌｅｎｒｅｐ）、ベリムマブ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ）、ベマリツズマブ、ベンラリズマブ（Ｆａｓｅｎｒａ）、ベルリマトクスマブ（Ｂｅｒｌｉｍａｔｏｘｕｍａｂ）、ベルメキマブ（Ｘｉｌｏｎｉｘ）、ベルサンリマブ（ｂｅｒｓａｎｌｉｍａｂ）、ベルチリムマブ、ベシレソマブ（Ｓｃｉｎｔｉｍｕｎ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、ベズロトクスマブ（Ｚｉｎｐｌａｖａ）、ビシロマブ（ＦｉｂｒｉＳｃｉｎｔ）、ビマグルマブ、ビメキズマブ（ｂｉｍｅｋｉｚｕｍａｂ）、ビルタミマブ、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ブレセルマブ、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）、ブロンツベトマブ（ｂｌｏｎｔｕｖｅｔｍａｂ）（Ｂｌｏｎｔｒｅｓｓ）、ブロソズマブ、ボコシズマブ、ブラジクマブ、ブレンツキシマブ ベドチン（Ａｄｃｅｎｔｒｉｓ）、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ（Ｓｉｌｉｑ）、ブロルシズマブ（Ｂｅｏｖｕ）、ブロンチクツズマブ、ブロスマブ（Ｃｒｙｓｖｉｔａ）、カビラリズマブ、カミダンルマブ テシリン、カムレリズマブ、カナキヌマブ（Ｉｌａｒｉｓ）、カンツズマブ メルタンシン、カンツズマブ ラヴタンシン、カプラシズマブ（Ｃａｂｌｉｖｉ）、カシリビマブ、カプロマブ（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）、カルルマブ、カロツキシマブ、カツマキソマブ（Ｒｅｍｏｖａｂ）、ｃＢＲ９６－ドキソルビシン免疫抱合体、セデリズマブ、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ）、セルグツズマブアムナロイキン（Ｃｅｒｇｕｔｕｚｕｍａｂ ａｍｕｎａｌｅｕｋｉｎ）、セルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ）、セトレリマブ、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、シビサタマブ、シルムツズマブ（Ｃｉｒｍｔｕｚｕｍａｂ）、シタツズマブボガトックス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）（ｈＰＡＭ４－Ｃｉｄｅ）、コドリツズマブ（ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）、コフェツズマブペリドチン（Ｃｏｆｅｔｕｚｕｍａｂ ｐｅｌｉｄｏｔｉｎ）、コルツキシマブラブタンシン（ｃｏｌｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、コナツムマブ、コンシズマブ、コスフロビキシマブ（ＺＭａｐｐ）、クレネズマブ、クリザンリズマブ（Ａｄａｋｖｅｏ）、クロテデュマブ、ＣＲ６２６１、クサツズマブ（ｃｕｓａｔｕｚｕｍａｂ）、ダセツズマブ、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）、ダロツズマブ、ダピロリズマブペゴル（Ｄａｐｉｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ダラツムマブ（Ｄａｒｚａｌｅｘ）、デクトレクマブ（Ｄｅｃｔｒｅｋｕｍａｂ）、デムシズマブ（Ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、デニンツズマブマホドチン（Ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、デノスマブ（Ｐｒｏｌｉａ）、デパツキシズマブマホドチン（Ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、デルロツキシマブビオチン（Ｄｅｒｌｏｔｕｘｉｍａｂ ｂｉｏｔｉｎ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、デザミズマブ、ジヌツキシマブ（Ｕｎｉｔｕｘｉｎ）、ジヌツキシマブβ（Ｑａｒｚｉｂａ）、ディリダブマブ（Ｄｉｒｉｄａｖｕｍａｂ）、ドマグロズマブ（Ｄｏｍａｇｒｏｚｕｍａｂ）、ドルリモマブアリトクス（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、ドスタルリマブ、ドロジツマブ、ＤＳ－８２０１、デュリゴツマブ（Ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｘｅｎｔ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、デュシギツマブ（Ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、ドゥボルツキシズマブ、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ）、エドバコマブ（Ｅｄｏｂａｃｏｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ）、エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ）、エフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）（Ｍｙｃｏｇｒａｂ）、エルデルマブ（Ｅｌｄｅｌｕｍａｂ）、エレザヌマブ（Ｅｌｅｚａｎｕｍａｂ）、エルゲムツマブ（Ｅｌｇｅｍｔｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｍｐｌｉｃｉｔｉ）、エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、エマクツズマブ（Ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）、エマパルマブ（Ｇａｍｉｆａｎｔ）、エミベツズマブ（Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、エミシズマブ（Ｈｅｍｌｉｂｒａ）、エナポタマブベドチン（Ｅｎａｐｏｔａｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、エナバツズマブ（Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）、エンフォーツマブベドチン（Ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）（Ｐａｄｃｅｖ）、エンリモマブペゴル（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、エノビリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、エノキズマブ（Ｅｎｏｋｉｚｕｍａｂ）、エノチクマブ、エンシツキシマブ（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エプコリタマブ（Ｅｐｃｏｒｉｔａｍａｂ）、エピツモマブシツキセタン（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、エプラツズマブ、エプチネズマブ（Ｖｙｅｐｔｉ）、エレヌマブ（Ａｉｍｏｖｉｇ）、エルリズマブ、エルツマキソマブ（Ｒｅｘｏｍｕｎ）、エタラシズマブ（Ａｂｅｇｒｉｎ）、エテセビマブ（Ｅｔｅｓｅｖｉｍａｂ）、エチギリマブ、エトロリズマブ、エビナクマブ（Ｅｖｋｅｅｚａ）、エボロクマブ（Ｒｅｐａｔｈａ）、エクスビビルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ファノレソマブ（ＮｅｕｔｒｏＳｐｅｃ）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、ファリシマブ、ファーレツズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ０５（Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ）、フェルビズマブ、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フィバツズマブ（Ｆｉｂａｔｕｚｕｍａｂ）、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フィリブマブ（Ｆｉｒｉｖｕｍａｂ）、フランボツマブ、フレチクマブ、フロテツズマブ、フォントリズマブ（ＨｕＺＡＦ）、フォラルマブ（Ｆｏｒａｌｕｍａｂ）、フォラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、フレマネズマブ（Ａｊｏｖｙ）、フレソリムマブ、フロボキマブ、フルネベトマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガルカネズマブ（Ｅｍｇａｌｉｔｙ）、ガリキシマブ、ガンコタマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガチポツズマブ、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲジブマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（マイロターグ）、ゲボキズマブ、ギルベットマブ（Ｇｉｌｖｅｔｍａｂ）、ギムシルマブ、ギレンツキシマブ（Ｒｅｎｃａｒｅｘ）、グレムバツムマブベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ）、ゴミリキシマブ、ゴスラネマブ、グセルクマブ（Ｔｒｅｍｆｙａ）、イアナルマブ、イバリズマブ（Ｔｒｏｇａｒｚｏ）、ＩＢＩ３０８、イブリツモマブチウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａ）（Ｚｅｖａｌｉｎ）、イクルクマブ、イダルシズマブ（Ｐｒａｘｂｉｎｄ）、イファボツズマブ、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）（Ｉｎｄｉｍａｃｉｓ－１２５）、イラダツズマブベドチン（Ｉｌａｄａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ＩＭＡＢ３６２、イマルマブ、イマプレリマブ（Ｉｍａｐｒｅｌｉｍａｂ）、イムシロマブ（Ｍｙｏｓｃｉｎｔ）、イムデビマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、インデュサツマブベドチン（Ｉｎｄｕｓａｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、イネビリズマブ（Ｕｐｌｉｚｎａ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン（Ｂｅｓｐｏｎｓａ）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）、イオマブＢ（Ｉｏｍａｂ－Ｂ）、イラツムマブ、イサツキシマブ（Ｓａｒｃｌｉｓａ）、イスカリマブ、イスチラツマブ、イトリズマブ（Ａｌｚｕｍａｂ）、イキセキズマブ（Ｔａｌｔｚ）、ケリキシマブ、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＥＡ－Ｃｉｄｅ）、ラクノツズマブ（Ｌａｃｎｏｔｕｚｕｍａｂ）、ラディラツズマブベドチン（Ｌａｄｉｒａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ランパリズマブ、ラナデルマブ（Ｔａｋｈｚｙｒｏ）、ランドグロズマブ、ラプリツキシマブエムタンシン（Ｌａｐｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ラルカビキシマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レンダリズマブ（Ｌｅｎｄａｌｉｚｕｍａｂ）、レンベルビマブ（Ｌｅｎｖｅｒｖｉｍａｂ）、レンジルマブ、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レロンリマブ、レソファブマブ、レトリズマブ、レクサツムマブ、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、リファスツズマブベドチン（Ｌｉｆａｓｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、リゲリズマブ、ロンカスツキシマブテシリン（Ｌｏｎｃａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）、ロサツキシズマブベドチン（Ｌｏｓａｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、リロトマブサテトラキセタン（Ｌｉｌｏｔｏｍａｂ ｓａｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、リンツズマブ、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、ロデルシズマブ（Ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）、ロキベトマブ（Ｃｙｔｏｐｏｉｎｔ）、ロルボツズマブメルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ルカツムマブ、ルリズマブペゴル（Ｌｕｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ルミリキシマブ、ルムレツズマブ、ルパルツマブ（Ｌｕｐａｒｔｕｍａｂ）、ルパルツマブアマドチン（Ｌｕｐａｒｔｕｍａｂ ａｍａｄｏｔｉｎ）、ルチキズマブ（Ｌｕｔｉｋｉｚｕｍａｂ）、マフティビマブ、マパツムマブ、マルジェツキシマブ（Ｍａｒｇｅｎｚａ）、マルスタシマブ、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ（Ｂｏｓａｔｒｉａ）、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミリキズマブ、ミルベツキシマブソラブタンシン（Ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ ｓｏｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、ミツモマブ、モドツキシマブ、
モガムリズマブ（Ｐｏｔｅｌｉｇｅｏ）、モナリズマブ（ｍｏｎａｌｉｚｕｍａｂ）、モロリムマブ、モスネツズマブ、モタビズマブ（Ｎｕｍａｘ）、モキセツモマブパスドトクス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）（Ｌｕｍｏｘｉｔｉ）、ムロモナブ－ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３）、ナコロマブタフェナトックス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトックス（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナラツキシマブエムタンシン（Ｎａｒａｔｕｘｉｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナルソプリマブ（Ｎａｒｓｏｐｌｉｍａｂ）、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、ナビシキシズマブ（Ｎａｖｉｃｉｘｉｚｕｍａｂ）、ナビブマブ（Ｎａｖｉｖｕｍａｂ）、ナキシタマブ（Ｄａｎｙｅｌｚａ）、ネバクマブ、ネシツムマブ（Ｐｏｒｔｒａｚｚａ）、ネモリズマブ（Ｎｅｍｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＮＥＯＤ００１、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、Ｎｅｔａｋｉｍａｂ（Ｅｆｌｅｉｒａ）、ニモツズマブ（ＢｉｏＭａｂ－ＥＧＦＲ、Ｔｈｅｒａｃｉｍ、Ｔｈｅｒａｌｏｃ）、ニルセビマブ（Ｎｉｒｓｅｖｉｍａｂ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、ノフェツモマブメルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）（Ｖｅｒｌｕｍａ）、オビルトキサキシマブ（Ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ）（Ａｎｔｈｉｍ）、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）、オカラツズマブ、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｖｕｓ）、オデシビマブ、オデュリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ、Ｋｅｓｉｍｐｔａ）、オララツマブ（Ｌａｒｔｒｕｖｏ）、オレクルマブ、オレンダリズマブ、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ）、オンバータマブ（Ｏｍｂｕｒｔａｍａｂ）、ＯＭＳ７２１、オナルツズマブ、オンツキシズマブ（Ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、オンバチリマブ（Ｏｎｖａｔｉｌｉｍａｂ）、オピシヌマブ（Ｏｐｉｃｉｎｕｍａｂ）、オポルツズマブモナトクス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｍｏｎａｔｏｘ）（Ｖｉｃｉｎｉｕｍ）、オレゴボマブ（ＯｖａＲｅｘ）、オルチクマブ（Ｏｒｔｉｃｕｍａｂ）、オテリキシズマブ、オチリマブ、オトレルツズマブ（Ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、オキセルマブ（Ｏｘｅｌｕｍａｂ）、オザネズマブ（Ｏｚａｎｅｚｕｍａｂ）、オゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、パギバキシマブ、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ、Ａｂｂｏｓｙｎａｇｉｓ）、パムレブルマブ（Ｐａｍｒｅｖｌｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、パンコマブ（Ｐａｎｋｏｍａｂ）、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、パルサツズマブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パスコリズマブ（Ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、パソツキシズマブ（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、パテクリズマブ（Ｐａｔｅｃｌｉｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ＰＤＲ００１、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（Ｔｈｅｒａｇｙｎ）、ペラキズマブ（Ｐｅｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ）、パキセリズマブ、ピディリズマブ、ピナツズマブベドチン（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プラクルマブ（Ｐｌａｃｕｌｕｍａｂ）、プレザルマブ（Ｐｒｅｚａｌｕｍａｂ）、プロザリズマブ（Ｐｌｏｚａｌｉｚｕｍａｂ）、ポガリズマブ（Ｐｏｇａｌｉｚｕｍａｂ）、ポラツズマブベドチン（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）（Ｐｏｌｉｖｙ）、ポネズマブ、ポルガビキシマブ（Ｐｏｒｇａｖｉｘｉｍａｂ）、プラシネズマブ（Ｐｒａｓｉｎｅｚｕｍａｂ）、プレザリズマブ（Ｐｒｅｚａｌｉｚｕｍａｂ）、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、プリトキサキシマブ（Ｐｒｉｔｏｘａｘｉｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、Ｐｒｏ１４０、クイリズマブ（Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）（Ｖａｘｉｒａ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラルパンシズマブ（Ｒａｌｐａｎｃｉｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ）、ラネベトマブ（Ｒａｎｅｖｅｔｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、ラキシバクマブ、ラバガリマブ、ラブリズマブ（Ｕｌｔｏｍｉｒｉｓ）、レファネズマブ（Ｒｅｆａｎｅｚｕｍａｂ）、レガビルマブ、レグダンビマブ、ＲＥＧＮ－ＥＢ３、レラトリマブ（Ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ）、レムトルマブ（Ｒｅｍｔｏｌｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｃｉｎｑａｉｒ）、レチファンリマブ（Ｒｅｔｉｆａｎｌｉｍａｂ）、リロツムマブ、リヌクマブ（Ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）、リサンキズマブ（Ｓｋｙｒｉｚｉ）、リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ、Ｒｉｔｕｘａｎ）、リババズマブペゴル（Ｒｉｖａｂａｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、Ｒｍａｂ（ＲａｂｉＳｈｉｅｌｄ）、ロレデュマブ（Ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）、ロミルキマブ（Ｒｏｍｉｌｋｉｍａｂ）、ロモソズマブ（Ｅｖｅｎｉｔｙ）、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ロスマンツズマブ、ロバルピツズマブテシリン（Ｒｏｖａｌｐｉｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）（ＬｅｕｋＡｒｒｅｓｔ）、ロザノリキシズマブ、ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）（Ａｎｔｏｖａ）、ＳＡ２３７、サシツズマブゴビテカン（Ｓａｃｉｔｕｚｕｍａｂ ｇｏｖｉｔｅｃａｎ）（Ｔｒｏｄｅｌｖｙ）、サマリズマブ、サムロタマブベドチン（Ｓａｍｒｏｔａｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、サリルマブ（Ｋｅｖｚａｒａ）、サトラリズマブ（Ｅｎｓｐｒｙｎｇ）、サツモマブペンデチド（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セクキヌマブ（Ｃｏｓｅｎｔｙｘ）、セリクレルマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ（Ｓｅｔｏｘａｘｉｍａｂ）、セトルスマブ（Ｓｅｔｒｕｓｕｍａｂ）、セヴィルマブ、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＳＨＰ６４７、シファリムマブ、シルツキシマブ（Ｓｙｌｖａｎｔ）、シムツズマブ、シプリズマブ、シルトラツマブベドチン（Ｓｉｒｔｒａｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、シルクマブ、ソフィツズマブベドチン（Ｓｏｆｉｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ソラネズマブ、ソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、スパルタリズマブ、スタムルマブ、スレソマブ（ＬｅｕｋｏＳｃａｎ）、スプタブマブ、スチムリマブ、スビズマブ（Ｓｕｖｉｚｕｍａｂ）、スブラトクスマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）（ＡＦＰ－Ｃｉｄｅ）、タドシズマブ、タファシタマブ（Ｍｏｎｊｕｖｉ）、タラコツズマブ（Ｔａｌａｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、タリズマブ、タルケタマブ、タムツベトマブ（Ｔａｍｔｕｖｅｔｍａｂ）（Ｔａｃｔｒｅｓｓ）、タネズマブ、タプリツモマブパプトックス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）、タレクスツマブ、タボリマブ、テクリスタマブ（Ｔｅｃｌｉｓｔａｍａｂ）、テフィバズマブ（Ａｕｒｅｘｉｓ）、テリモマブアリトックス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、テリソツズマブ、テリソツズマブベドチン（Ｔｅｌｉｓｏｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テネリキシマブ、テプリズマブ、テポジタマブ（Ｔｅｐｏｄｉｔａｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｅｚｚａ）、テシドルマブ（Ｔｅｓｉｄｏｌｕｍａｂ）、テツロマブ（Ｔｅｔｕｌｏｍａｂ）、テゼペルマブ、ＴＧＮ１４１２、チブリズマブ、チルドラキズマブ（Ｉｌｕｍｙａ）、チガツズマブ、チミグツズマブ（Ｔｉｍｉｇｕｔｕｚｕｍａｂ）、チモルマブ（Ｔｉｍｏｌｕｍａｂ）、チラゴルマブ（Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ）、チラゴツマブ（Ｔｉｒａｇｏｔｕｍａｂ）、チスレリズマブ、チソツマブベドチン（Ｔｉｓｏｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ、ＲｏＡｃｔｅｍｒａ）、トムゾツキシマブ（Ｔｏｍｕｚｏｔｕｘｉｍａｂ）、トラリズマブ、トリパリマブ（Ｔｕｏｙｉ）、トサトクスマブ（Ｔｏｓａｔｏｘｕｍａｂ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）、トベツマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、［ｆａｍ］－トラスツズマブデルクステカン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ）（Ｅｎｈｅｒｔｕ）、トラスツズマブデュオカルマジン（［ｆａｍ］－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｕｏｃａｒｍａｚｉｎｅ）（Ｋａｄｃｙｌａ）、トラスツズマブエムタンシン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）（Ｋａｄｃｙｌａ）、ＴＲＢＳ０７（Ｅｋｔｏｍａｂ）、トレガリズマブ、トレメリムマブ、トレボグルマブ、ツコツズマブセルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウロクプルマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ）、ウトミルマブ、バダスツキシマブタリリン（Ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔａｌｉｒｉｎｅ）、バナリマブ（Ｖａｎａｌｉｍａｂ）、バンドルツズマブベドチン（Ｖａｎｄｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、バリサクマブ（Ｖａｒｉｓａｃｕｍａｂ）、バルリルマブ、バテリズマブ（Ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｅｎｔｙｖｉｏ）、ベルツズマブ、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、ベセンクマブ、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ボバリリズマブ、ボロシキシマブ、ボンレロリズマブ、ボプラテリマブ、ボルセツズマブマホドチン（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、ボツムマブ（ＨｕｍａＳＰＥＣＴ）、ブナキズマブ（Ｖｕｎａｋｉｚｕｍａｂ）、キセンツズマブ（Ｘｅｎｔｕｚｕｍａｂ）、ＸＭＡＢ－５５７４、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ（Ｚａｔｕｘｉｍａｂ）、ゼノクツズマブ（Ｚｅｎｏｃｕｔｕｚｕｍａｂ）、ジラリムマブ（Ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）、ゾルベツキシマブ（＝ＩＭＡＢ３６２、Ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ）、およびゾリモマブアリトックス（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）から選択され得る。抗原結合性分子は、上記において言及された抗体のいずれかの誘導体であり得る。

抗体がカーゴによってコードされる場合、当該抗体をコードするヌクレオチド配列は、修飾され得る。当該抗体のアミノ酸配列は、修飾され得る。例えば、当該ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、抗体のインビボ発現を可能にするかまたはインビボ発現を改善する修飾を含み得る。

担持される量およびサイズ
本開示による細胞外小胞は、少なくとも２つの核酸を含み得、この場合、それぞれの核酸は異なる。細胞外小胞は、２つ以上の核酸を含み得る。そのような場合、少なくとも２つの核酸は異なっているが、当該少なくとも２つの異なる核酸のうちの１つと同一である追加の核酸が存在し得る。そのような場合に重要なことは、カーゴが完全には同種ではないかまたは１００％同一ではないが、その代わりにカーゴの他の分子と異なるかまたは同一ではない少なくとも１つの分子を含むことである。

小胞あたりの核酸の数は、例えば、組成物中に存在する場合と同様の、ＥＶの集団における平均数、好ましくは平均であり得る。小胞あたりの核酸のコピーの数は、担持された核酸カーゴのコピーの総数をＥＶの総数で割ることによって特定され得る。換言すると、ＥＶあたりのコピー＝核酸の担持されたコピーの数／ＥＶ粒子の総数である。核酸のコピーの数は、ｑＰＣＲによって特定され得る。ＥＶの数は、ナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ、例えば、Ｗａｎｇら，ＡＲＭＭｓ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８ ９～９６０に記載される）によって特定され得る。ナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ）は、液体中の粒子を可視化および解析するための方法である。当該技術は、限外顕微鏡およびレーザー照明ユニットと共に使用され、それらは一緒に、液体懸濁液中の小さな粒子をブラウン運動下での動きにより可視化することを可能にする。粒子によって散乱される光は、複数のフレームにわたってＣＣＤまたはＥＭＣＣＤカメラを使用して捕捉される。次いで、コンピュータソフトウェアを使用して、フレームからフレームへの各粒子の運動を追跡する。

本明細書において使用される場合、且つ明記されない限り、用語「平均」は、算術平均を意味する。これは、試料中の小胞の総量で割った、その試料中の特定された核酸の総量を意味し得る。

本明細書において説明される組成物は、少なくとも２つの異なる核酸または少なくとも３つの異なる核酸が担持された少なくとも１つの細胞外小胞を含む。これらの細胞外小胞は、小胞あたり少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも３．５、少なくとも４、少なくとも５、またはそれ以上の核酸のコピーを含み得る。細胞外小胞は、小胞あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上の異なる核酸のそれぞれのコピーを含み得る（例えば、それが担持され得る）。細胞外小胞は、小胞あたり約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０の核酸を含み得（例えば、それが担持され得）、この場合、核酸のうちの少なくとも１つは、カーゴの他の核酸と異なるかまたは同一ではない。いくつかの場合において、細胞外小胞は、各核酸のおよそ平均数（すなわち、各核酸の約５０％、または各核酸の約４８％、または約４６％、または約４４％、または約４２％、または約４０％、または約３８％、または約３６％、または約３４％、または約３２％、または約３０％）を含み得る。いくつかの場合において、細胞外小胞は、異なる数の各核酸を含み得る（すなわち、細胞外小胞中の核酸の約２％、あるいは約４％、または約６％、または約８％、または約１０％、または約１２％、または約１４％、または約１６％、または約１８％、または約２０％、または約２２％、または約２４％、または約２５％、または約２６％、または約２８％、または約３０％は、カーゴの他の核酸と異なっている）。

組成物中の実質的に全ての細胞外小胞にカーゴが担持されることは、望ましくあり得るが、本明細書において開示される組成物は、細胞外小胞を含み得、この場合、細胞外小胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つがカーゴを含む。好ましくは、細胞外小胞の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくとも１つがカーゴを含む。好ましくは、細胞外小胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％がカーゴを含み、この場合、当該カーゴは、少なくとも２つの異なる核酸を含む。いくつかの場合において、組成物内の異なる細胞外小胞は、異なるカーゴを含む。例えば、組成物中のいくつかの細胞外小胞は、カーゴを含み得、この場合、細胞外小胞のカーゴは、実質的に同種であるか、または１つのバイオマーカーのみを含む。いくつかの組成物において、組成物中の他の細胞外小胞は、少なくとも２つの異なる核酸を含むカーゴを含む。いくつかの場合において、細胞外小胞は、同じまたは実質的に同じカーゴを含み、この場合、カーゴは、少なくとも２つの異なる核酸を含む。

核酸のサイズは、塩基（一本鎖核酸の場合）または塩基対（二本鎖核酸の場合）で表されるその長さにおいて定義され得る。本明細書において、核酸カーゴの一本鎖または二本鎖の性質が示されない場合、塩基において与えられる長さ（例えば、ｋｂ（キロベース）で表される）は、塩基対で表される同じ長さ（例えば、ｋｂｐで表される）の開示でもある。したがって、１ｋｂ（１０００塩基）の長さは、１ｋｂｐ（１０００塩基対）の開示でもある。用語「塩基」は、用語「ヌクレオチド」と相互互換的に使用される。核酸カーゴは、一本鎖または二本鎖であり得る。それは、直鎖状または環状であり得る。

カーゴの核酸が一本鎖である場合、各核酸は、少なくとも２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、または１１０００塩基のうちの１つの長さを有し得る。場合により、カーゴの核酸が一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である場合、それは、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、または１１０００塩基のうちの１つの最大長さを有し得る。好ましい実施形態において、カーゴの一本鎖核酸は、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、または５０００超の塩基のうちの１つの最大長さを有し得る。

カーゴの核酸が一本鎖である場合、それは、２５０～７５０、５００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、９０００～１００００、１００００～１１０００、２５０～１０００、１０００～３０００、１０００～４０００、１０００～５０００、１０００～６０００、１０００～７０００、１０００～８０００、１０００～９０００、１０００～１００００、１０００～１１０００、２０００～４０００、２０００～５０００、２０００～６０００、２０００～７０００、２０００～８０００、２０００～９０００、２０００～１００００、２０００～１１０００、３０００～５０００、３０００～６０００、３０００～７０００、３０００～８０００、３０００～９０００、３０００～１００００、３０００～１１０００、４０００～６０００、４０００～７０００、４０００～８０００、４０００～９０００、４０００～１００００、４０００～１１０００、５０００～７０００、５０００～８０００、５０００～９０００、５０００～１００００、５０００～１１０００、６０００～８０００、６０００～９０００、６０００～１００００、６０００～１１０００、７０００～９０００、７０００～１００００、または７０００～１１０００塩基のうちの１つの長さを有し得る。

カーゴの核酸が一本鎖であるいくつかの実施形態において、それは、最長で２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、または４００００塩基のうちの１つまでの長さを有し得る。カーゴの一本鎖核酸は、５０００～１００００、５０００～１５０００、５０００～２００００、５０００～２５０００、５０００～３００００、５０００～３５０００、５０００～４００００、１００００～１５０００、１００００～２００００、１００００～２５０００、１００００～３００００、１００００～３５０００、１００００～４００００、１５０００～２００００、１５０００～２５０００、１５０００～３００００、１５０００～３５０００、１５０００～４００００、２００００～２５０００、２００００～３００００、２００００～３５０００、２００００～４００００、２５０００～３００００、２５０００～３５０００、２５０００～４００００、３００００～３５０００、３００００～４００００、または３５０００～４００００塩基のうちの１つの長さを有し得る。

カーゴの核酸が二本鎖である場合、それは、少なくとも２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、または１１０００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。場合により、カーゴの核酸が二本鎖である場合、それは、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、または１１０００塩基対のうちの１つの最大長さを有し得る。好ましい実施形態において、カーゴの二本鎖核酸は、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、または５０００超の塩基対のうちの１つの最大長さを有し得る。

核酸カーゴが二本鎖である場合、それは、２５０～７５０、５００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、９０００～１００００、１００００～１１０００、２５０～１０００、１０００～３０００、１０００～４０００、１０００～５０００、１０００～６０００、１０００～７０００、１０００～８０００、１０００～９０００、１０００～１００００、１０００～１１０００、２０００～４０００、２０００～５０００、２０００～６０００、２０００～７０００、２０００～８０００、２０００～９０００、２０００～１００００、２０００～１１０００、３０００～５０００、３０００～６０００、３０００～７０００、３０００～８０００、３０００～９０００、３０００～１００００、３０００～１１０００、４０００～６０００、４０００～７０００、４０００～８０００、４０００～９０００、４０００～１００００、４０００～１１０００、５０００～７０００、５０００～８０００、５０００～９０００、５０００～１００００、５０００～１１０００、６０００～８０００、６０００～９０００、６０００～１００００、６０００～１１０００、７０００～９０００、７０００～１００００、または７０００～１１０００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。

カーゴの核酸が二本鎖であるいくつかの実施形態において、それは、最長で２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、または４００００塩基対のうちの１つまでの長さを有し得る。カーゴの二本鎖核酸は、５０００～１００００、５０００～１５０００、５０００～２００００、５０００～２５０００、５０００～３００００、５０００～３５０００、５０００～４００００、１００００～１５０００、１００００～２００００、１００００～２５０００、１００００～３００００、１００００～３５０００、１００００～４００００、１５０００～２００００、１５０００～２５０００、１５０００～３００００、１５０００～３５０００、１５０００～４００００、２００００～２５０００、２００００～３００００、２００００～３５０００、２００００～４００００、２５０００～３００００、２５０００～３５０００、２５０００～４００００、３００００～３５０００、３００００～４００００、または３５０００～４００００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。

カーゴの核酸、例えば、ＲＮＡは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基のうちの１つの長さを有し得る。カーゴの核酸は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００塩基のうちの１つの長さを有し得る。カーゴの核酸は、少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０塩基のうちの１つの長さを有し得る。

カーゴの核酸が一本鎖、例えば、一本鎖ＲＮＡである場合、それは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基；少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００塩基；あるいは少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０塩基のうちの１つの長さを有し得る。

カーゴの核酸が、二本鎖、例えば、ｓｉＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡである場合、それは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基対のうちの１つの長さを有し得る。カーゴの核酸は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００塩基対のうちの１つの長さを有し得る。カーゴの核酸は、少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０塩基対のうちの１つの長さを有し得る。

カーゴの各核酸は、約０．５ｋｂから約４ｋｂの間、約０．５ｋｂから約３ｋｂの間、約０．５ｋｂから約２．５ｋｂの間、約１ｋｂから約３ｋｂの間、約１．５ｋｂから約２．５ｋｂの間、または約２ｋｂであり得る。各核酸カーゴは、少なくとも０．５ｋｂ、少なくとも１．０ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２．０ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１１ｋｂ、少なくとも１２ｋｂ、少なくとも１３ｋｂ、少なくとも１４ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも１６ｋｂ、少なくとも１７ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ、少なくとも１９ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２１ｋｂ、少なくとも２２ｋｂ、少なくとも２３ｋｂ、少なくとも２４ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも２６ｋｂ、少なくとも２７ｋｂ、少なくとも２８ｋｂ、少なくとも２９ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３１ｋｂ、少なくとも３２ｋｂ、少なくとも３３ｋｂ、少なくとも３４ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも３６ｋｂ、少なくとも３７ｋｂ、少なくとも３８ｋｂ、少なくとも３９ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４１ｋｂ、少なくとも４２ｋｂ、少なくとも４３ｋｂ、少なくとも４４ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも４６ｋｂ、少なくとも４７ｋｂ、少なくとも４８ｋｂ、少なくとも４９ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、またはそれ以上であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、カーゴの各核酸は、少なくとも２ｋｂである。

いくつかの場合において、総核酸カーゴは、約０．５ｋｂから約４ｋｂの間、約０．５ｋｂから約３ｋｂの間、約０．５ｋｂから約２．５ｋｂの間、約１ｋｂから約３ｋｂの間、約１．５ｋｂから約２．５ｋｂの間、または約２ｋｂであり得る。各核酸カーゴは、少なくとも０．５ｋｂ、少なくとも１．０ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２．０ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１１ｋｂ、少なくとも１２ｋｂ、またはそれ以上であり得る。換言すると、カーゴは、複数の核酸を含み、ならびに、各小胞でのこれらの核酸の長さの合計は、平均して、約０．５ｋｂから約４ｋｂの間、約０．５ｋｂから約３ｋｂの間、約０．５ｋｂから約２．５ｋｂの間、約１ｋｂから約３ｋｂの間、約１．５ｋｂから約２．５ｋｂの間、または約２ｋｂである。各核酸カーゴは、少なくとも０．５ｋｂ、少なくとも１．０ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２．０ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１１ｋｂ、少なくとも１２ｋｂ、少なくとも１３ｋｂ、少なくとも１４ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも１６ｋｂ、少なくとも１７ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ、少なくとも１９ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２１ｋｂ、少なくとも２２ｋｂ、少なくとも２３ｋｂ、少なくとも２４ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも２６ｋｂ、少なくとも２７ｋｂ、少なくとも２８ｋｂ、少なくとも２９ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３１ｋｂ、少なくとも３２ｋｂ、少なくとも３３ｋｂ、少なくとも３４ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも３６ｋｂ、少なくとも３７ｋｂ、少なくとも３８ｋｂ、少なくとも３９ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４１ｋｂ、少なくとも４２ｋｂ、少なくとも４３ｋｂ、少なくとも４４ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも４６ｋｂ、少なくとも４７ｋｂ、少なくとも４８ｋｂ、少なくとも４８ｋｂ、少なくとも４９ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、またはそれ以上であり得る。

カーゴは、少なくとも２つの非同一核酸を含み得る。カーゴの第１の核酸およびカーゴのさらなる非同一核酸の長さの合計は、０．５ｋｂ、少なくとも１．０ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２．０ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１１ｋｂ、少なくとも１２ｋｂ、少なくとも１３ｋｂ、少なくとも１４ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも１６ｋｂ、少なくとも１７ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ、少なくとも１９ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２１ｋｂ、少なくとも２２ｋｂ、少なくとも２３ｋｂ、少なくとも２４ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも２６ｋｂ、少なくとも２７ｋｂ、少なくとも２８ｋｂ、少なくとも２９ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３１ｋｂ、少なくとも３２ｋｂ、少なくとも３３ｋｂ、少なくとも３４ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも３６ｋｂ、少なくとも３７ｋｂ、少なくとも３８ｋｂ、少なくとも３９ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４１ｋｂ、少なくとも４２ｋｂ、少なくとも４３ｋｂ、少なくとも４４ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも４６ｋｂ、少なくとも４７ｋｂ、少なくとも４８ｋｂ、少なくとも４９ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、またはそれ以上であり得る。カーゴの第１の核酸およびカーゴのさらなる非同一核酸の長さの合計は、約０．５ｋｂから約４ｋｂの間、約０．５ｋｂから約３ｋｂの間、約０．５ｋｂから約２．５ｋｂの間、約１ｋｂから約３ｋｂの間、約１．５ｋｂから約２．５ｋｂの間、または約２ｋｂであり得る。

発明者らは、長さに関して、塩基または塩基対において核酸のサイズを定義した。しかしながら、核酸のサイズは、核酸の構造によっても影響を受け得る。例えば、高次コイルＤＮＡプラスミドは、同じ数の塩基対を有する直鎖状ＤＮＡよりコンパクトな構造を有するであろう。

いくつかの場合において、カーゴの核酸は、同種である（すなわち、ＥＶの組成物中の各核酸は、同様であるかまたは実質的に同一である）。いくつかの場合において、カーゴの核酸は、異種である（すなわち、ＥＶの組成物中の核酸は、お互いに同様でないかまたは実質的に同一ではない）。

好適な小分子は、細胞傷害性試薬およびキナーゼ阻害剤を含む。当該小分子は、蛍光プローブおよび／または金属を含み得る。例えば、カーゴは、超常磁性粒子、例えば、酸化鉄粒子などを含み得る。カーゴは、超微小超常磁性酸化鉄粒子、例えば、酸化鉄ナノ粒子などであり得る。

いくつかの場合において、カーゴは、検出可能な部分、例えば、蛍光デキストランなどである。カーゴは、放射能標識され得る。
細胞外小胞に担持する方法
本明細書において、細胞外小胞へのカーゴの担持は、細胞外小胞がカーゴのキャリアとして有用であるような、例えば、細胞へのその送達を可能にするような安定または準安定な形態において、細胞外小胞とカーゴを会合させることを意味する。カーゴ分子は、少なくとも２つの方式において担持され得る。１つは、細胞外小胞の管腔にカーゴを存在させることである（管腔担持）。もう１つは、カーゴを外部表面、例えば、細胞外小胞の膜に、結合させる、付着させる、通過して挿入する、または複合体化させることである（外部表面担持）。細胞外小胞の外部表面上に担持されたカーゴ分子は、通常、小胞をヌクレアーゼ、例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅと接触させることによって除去され得る。

２つ以上の非同一核酸を細胞外小胞に担持するための方法が、本明細書において開示される。当該方法は、担持される複数の非同一核酸を含む混合物に細胞外小胞を接触させる工程を含み得る。当該方法は、担持される第１の核酸を細胞外小胞に接触させる工程と、その後の、第１の核酸と非同一である担持される第２またはさらなる核酸を細胞外小胞に接触させる工程とを伴い得る。

トランスフェクション試薬
いくつかの場合において、担持される核酸が核酸である場合、細胞外小胞、核酸、およびトランスフェクション試薬が、好適な条件下において、および担持が生じるのを可能にするのに十分な時間において、一緒にされる。

担持方法は、担持する核酸をトランスフェクション試薬に接触させる工程を含み得る。好適なトランスフェクション試薬としては、カチオン性試薬、例えば、カチオン性脂質試薬などが挙げられる。例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｅｘｏｆｅｃｔ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびに直鎖状ポリエチレンイミン塩酸塩、例えば、２５，０００Ｄａまたは４０，０００Ｄａの平均分子量を有するもの、例えば、ＰＥＩＭａｘ（商標）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）およびｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）など、いくつかのトランスフェクション試薬が当技術分野において既知である。

本明細書において開示されるいくつかの方法は、担持される核酸分子を調製する工程を伴う。担持される核酸は、複数の非同一核酸を含み得る。調製工程において、細胞外小胞内へと担持される核酸は、トランスフェクション試薬と核酸との間での複合体の形成に好適な条件下においてトランスフェクション試薬と接触させられる。核酸およびトランスフェクション試薬は、複合体形成が生じるに十分な時間において接触する。好ましくは、核酸およびトランスフェクション試薬は、複合体、例えば、ＤＮＡ：ＰＥＩＭａｘ複合体などを形成する。担持のための核酸の調製は、さらなる工程、例えば、核酸の濃縮または希釈、あるいは緩衝液または他の試薬または媒体、例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ）などの追加を含み得る。核酸およびトランスフェクション試薬は、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも４分間、少なくとも５分間、少なくとも６分間、少なくとも７分間、少なくとも８分間、少なくとも９分間、少なくとも１０分間、少なくとも１１分間、少なくとも１２分間、少なくとも１３分間、少なくとも１４分間、少なくとも１５分間、少なくとも１６分間、少なくとも１７分間、少なくとも１８分間、少なくとも１９分間、少なくとも２０分間、または２０分間以上接触させられ得る。担持のための核酸の調製は、核酸：トランスフェクション試薬複合体をさらなる核酸：トランスフェクション試薬複合体と組み合わせる工程を含み得、この場合、核酸は非同一である。

本明細書において開示される方法は、核酸：トランスフェクション試薬複合体を細胞外小胞に担持する工程を伴い得る。調製された核酸：トランスフェクション試薬複合体は、担持済みの細胞外小胞と接触させられる。好ましい方法では、細胞外小胞が、調製された核酸：トランスフェクション試薬複合体に加えられる。換言すると、細胞外小胞と接触させる工程は、担持される核酸をトランスフェクション試薬と接触させた後に実施される。通常、核酸：トランスフェクション試薬複合体は、複数の細胞外小胞を含む組成物と接触させられる。核酸：トランスフェクション試薬複合体および細胞外小胞は、核酸：トランスフェクション試薬複合体の１つまたは複数が細胞外小胞に担持されるのを可能にするのに十分な時間および適切な条件下においてインキュベートされ得る。複合体は、細胞外小胞内に取り込まれ得るか、さもなければ、細胞外小胞上、例えば、細胞外小胞の表面上などに担持され得る。好ましくは、複合体は、細胞外小胞内に取り込まれる。

担持工程の後、細胞外小胞は、単離され、洗浄され、および／または濃縮され得る。好ましい方法では、洗浄工程は、担持工程の後に行われる。担持工程の後、混合物は、ＰＢＳで洗浄され得る。好ましくは、洗浄工程は、混合物を遠心処理することによって細胞外小胞をペレット化して、当該ペレットを適切な緩衝液（例えば、ＰＢＳ）に再懸濁させる工程を含む。洗浄工程は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上において反復され得る。

核酸：トランスフェクション試薬複合体を細胞外小胞に担持する工程は、反復され得る。換言すると、核酸：トランスフェクション試薬複合体を細胞外小胞に担持する工程の後に、場合により、細胞外小胞は洗浄され得、ならびに、さらなる核酸：トランスフェクション試薬複合体と接触させられ得る。さらなる核酸：トランスフェクション試薬複合体は、前の担持工程において担持された核酸とは同一でない核酸を含み得る。そのような方法において、核酸：トランスフェクション試薬複合体が担持される細胞外小胞は、担持済みの細胞外小胞であり得、したがって、既に核酸カーゴを含み得る。あるいは、細胞外小胞は、担持工程を施されているがカーゴは担持されていないか、あるいは低レベルのカーゴが担持されている。第２のまたはさらなる担持工程が必要な場合、細胞外小胞は、先行の担持工程において使用されたのと同じまたは異なる条件下において、ならびに同じまたは異なる時点において、さらなる核酸：トランスフェクション試薬複合体を用いてインキュベートされ得る。第２のまたはさらなる担持工程に続いて、さらなる洗浄工程が使用され得る。

好ましくは、当該方法は、核酸：トランスフェクション試薬複合体を用いて細胞外小胞をインキュベートする工程を伴い、ならびに、核酸：トランスフェクション試薬複合体を用いて細胞をインキュベートする工程と、それに続いて、そのような細胞からの細胞外小胞の形成を誘導する工程とを伴わない。

いくつかの場合において、細胞外小胞にカーゴを担持するための好適な方法は、細胞外小胞の膜の透過性の一時的または半永久的な増加を必要とし得る。好適な方法は、国際出願ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０５９６に記載されており、ならびに、例えば、エレクトロポレーション、音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）、リポフェクションまたは低張性透析を含む。本明細書において開示される方法において、細胞外小胞は、カーゴと接触されられることにより混合物を形成し、当該混合物は、細胞外小胞の膜の透過性を増加させるように処理される。混合物は、治療の前に冷却され得る。それは、１種または複数種の緩衝液、例えば、ＰＢＳなどをさらに伴い得る。

細胞外小胞に担持する工程は、反復され得る。換言すると、第１の処理工程に続いて、細胞外小胞は、場合により洗浄され得、ならびにさらなるカーゴと接触させられて混合物を形成し得る。当該混合物は、次いで、細胞外小胞の膜の透過性を増加させるために処理される。さらなるカーゴは、複数の非同一核酸を含み得る。あるいは、さらなるカーゴは、前の担持工程の核酸と非同一の核酸の集団を含み得る。

カーゴは、エレクトロポレーションによって細胞外小胞内へと担持され得る。エレクトロポレーション、またはエレクトロパーミアビリゼーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は、電界を細胞に適用することによって細胞膜の透過性を増加させ、それにより化学物質、薬物、またはＤＮＡが細胞内に導入されることを可能にする微生物学的技術である。換言すると、細胞外小胞は、エレクトロポレーションによってカーゴを封入するように誘導または強制され得る。エレクトロポレーションは、エレクトロポレーションキュベットにおいて懸濁された細胞の１～２ミリメートルの距離を越えて数千ボルトを流す（１．０～１．５ｋＶ、２５０～７５０Ｖ／ｃｍ）ことによって作用する。概して、エレクトロポレーションは、いくつかの異なる段階を有する多段階プロセスである。最初に、短い電気パルスが印加される。典型的なパラメータは、膜に対し、＜１ｍｓにおいて３００～４００ｍＶであろう。この電位の印加において、膜は、周囲の溶液からのイオンの移動によって、コンデンサーのように荷電される。臨界場が達成されると、脂質モルフォロジーにおいて急速な局所的再編が生じる。結果として生じる構造は、導電性ではないが急速な伝導性孔の形成を生じるため、「プレポア（ｐｒｅ－ｐｏｒｅ）」であると考えられる。そのようなプレポアの存在の証拠は、そのほとんどが、導電状態と絶縁状態との間の移行を示唆している孔の「ちらつき」によってもたらされる。これらのプレポアは小さい（約３Å）の疎水性欠陥であることが示唆されている。この理論が正しい場合、導電状態への移行は、ポア端部での再編によって説明することができ、その部分では、脂質頭部は、親水性界面を形成するように折り重なる。最後に、これらの導電性孔は、回復して二分子膜を再封止し得るか、または広がって最終的に膜を破壊させ得る。結果の運命は、印加された電場に依存する臨界欠陥サイズが、局所的な機械的応力および二分子膜末端エネルギーを超えるか否かによって決まる。インビボエレクトロポレーションの成功は、電位、反復、パルス、および持続時間に大いに依存する。本明細書において開示される方法は、細胞外小胞に、約２５Ｖから３００Ｖの間または約５０Ｖから２５０Ｖの間のエレクトロポレーションを施す工程を伴い得る。

あるいは、カーゴは、音波処理によって細胞外小胞に担持され得る。音波処理は、様々な目的、例えば、植物、微細藻類、および海草からの多数の化合物の抽出などのため、試料中の粒子を揺り動かすために音のエネルギーを適用する行為である。通常、超音波周波数（＞２０ｋＨｚ）が使用され、超音波処理としても知られているプロセスを生じる。音波処理は、超音波浴または口語的にソニケーターとして知られる超音波プローブを使用して適用され得る。

別の方法において、カーゴは、超音波を用いて担持される。超音波は、細胞膜を崩壊させることが知られており、それにより、分子を細胞に担持する。２０ｋＨｚから数ギガヘルツまでの周波数の音波が、細胞外小胞に適用され得る。

さらなる別の方法において、カーゴは、リポフェクションによって細胞外小胞内に担持され得る。リポフェクション（またはリポソームトランスフェクション）は、リポソームによって細胞内に遺伝物質を注入するために使用される技術であり、リポソームと細胞膜は、両方ともリン脂質二分子膜で構成されているために、リポソームは、容易に細胞膜と合体することができる小胞である。

担持される混合物
本明細書において説明される方法は、担持される核酸の混合物の調製または提供を伴い得る。当該混合物は、核酸の混合物である。当該混合物は、追加的に、トランスフェクション試薬を含む場合もある。当該混合物は、核酸：トランスフェクション試薬複合体を含み得る。当該混合物は、特定の比率において存在する核酸を含み得る。特定の比率の混合物において核酸を提供することにより、細胞外小胞に、核酸のうちの少なくとも１種は他の核酸と異なる核酸が担持される可能性は増加する。

いくつかの場合において、混合物は、２つ以上の副混合物（ｓｕｂ－ｍｉｘｔｕｒｅ）から調製され、その場合、各副混合物は、担持される核酸およびトランスフェクション試薬のうちの一方を含む。次いで、副混合物は、組み合わされて混合物を形成する。例えば、それぞれが担持される核酸およびトランスフェクション試薬を含んだ２つ以上の副混合物が、組み合わされて、混合物を形成し得る。これらの例において、副混合物のそれぞれは、核酸：トランスフェクション試薬複合体を含む。

混合物において、担持される第１の核酸およびさらなる生物分子は、等モル量において、すなわち、等モル比において存在し得る。担持される第１の核酸および担持されるさらなる核酸は、異なるモル量において、すなわち、等モル比ではない比において存在してもよい。当該比は、細胞外小胞との同時接触を可能にするような、混合物中に存在するさらなる核酸に対する第１の核酸の量を意味し得る。あるいは、当該比は、さらなる核酸に対する第１の核酸の量を意味し得、この場合、第１の核酸およびさらなる核酸は、別々の工程において細胞外小胞と接触させられる。

担持される第１の核酸および担持されるさらなる核酸は、約１００：１、７５：１、５０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：５０、１：７５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：４００、１：５００の比において存在し得る。場合により、担持される第１の核酸およびさらなる核酸は、約１００：１、７５：１、５０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：５０、１：７５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：４００、１：５００の比において存在する。好ましくは、当該比は、約１：１である。当該比は、第１の核酸およびさらなる核酸のそれぞれのモル量の比を意味する。

担持される第１の核酸および担持されるさらなる核酸は、１００：１～１：１００の間、７５：１～１：７５の間、５０：１～１：５０の間、２５：１～１：２５の間、２０：１～１：２０の間、１５：１～１：１５の間、１０：１～１：１０の間、９：１～１：９の間、８：１～１：８の間、７：１～１：７の間、６：１～１：６の間、５：１～１：５の間、４：１～１：４の間、３：１～１：３の間、２：１～１：２の間、または約１：１の比において存在し得る。好ましくは、担持される第１の核酸および担持されるさらなる核酸は、１：３～３：１の間、１：２～２：１の間、または約１：１の比において存在する。当該比は、第１の核酸およびさらなる核酸のそれぞれのモル量の比を意味する。

３つの異なる核酸が細胞外小胞に担持される場合、第１、第２、および第３のバイオマーカーは、およそ等モル比において、すなわち、１：１：１において混合物中に存在し得る。担持される第１、第２、および第３の核酸は、約１：１：２、１：１：３、１：１：４、１：１：５、１：１：６、１：１：７、１：１：８、１：１：９、１：１：１０、１：２：１、１：３：１、１：４：１、１：５：１、１：６：１、１：７：１、１：８：１、１：９：１、１：１０：１、２：１：１、３：１：１、４：１：１、５：１：１、６：１：１、７：１：１、８：１：１、９：１：１、１０：１：１、１：２：２、１：３：３、１：４：４、１：５：５、１：６：６、１：７：７、１：８：８、１：９：９、１：１０：１０、１：２：３、１：２：４、１：３：６、１：４：８、１：５：１０、２：４：６、２：８：４の比、または他の比において存在し得る。

いくつかの実施形態において、担持される核酸は、複数の核酸である。担持される第１の核酸および担持されるさらなる核酸は、等モル量において、すなわち、等モル比において存在し得る。担持される第１の核酸および担持されるさらなる核酸は、異なるモル量において、すなわち、等モル比ではない比において存在してもよい。

担持される核酸の相対長さは、当該比に影響を及ぼし得る。例えば、より大きい核酸は、より低い担持効率を有し得る。したがって、担持される第１の核酸が、担持されるさらなる核酸より著しく大きい場合、より大きい核酸は、より多い量において存在し得る。担持される核酸の相対構造は、当該比に影響を及ぼし得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、同じ長さの直鎖状ＤＮＡと比べてよりコンパクトな構造を有し得る。よりコンパクトな構造を有する核酸は、より高い担持効率を有し得る。したがって、よりコンパクトな構造を有する核酸は、より低い量において存在し得る。同様に、担持される核酸の一方が一本鎖であり、担持されるさらなる核酸が二本鎖である場合、当該比は調節され得る。そのような場合、鎖の数を補うように当該比を調節することは、適切であり得る。例えば、一本鎖成分の割合は、二本鎖成分の割合と比較した場合、増加され得る。いくつかの場合において、一本鎖成分の割合は、二本鎖成分の割合と比較した場合、二倍であり得る。したがって、第１の核酸が一本鎖核酸であり、さらなる核酸が二本鎖核酸である場合、当該比は、１：１から２：１において調節され得る。

核酸は、４００：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１５０：１、１００：１、７５：１、５０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：５０、１：７５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：４００、１：５００の比において存在し得る。場合により、担持される第１の核酸およびさらなる核酸は、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５の比において存在する。いくつかの場合において、担持される第１の核酸および担持されるさらなる核酸は、１００：１～１：１００の間、７５：１～１：７５の間、５０：１～１：５０の間、２５：１～１：２５の間、２０：１～１：２０の間、１５：１～１：１５の間、１０：１～１：１０の間、９：１～１：９の間、８：１～１：８の間、７：１～１：７の間、６：１～１：６の間、５：１～１：５の間、４：１～１：４の間、３：１～１：３の間、２：１～１：２の間、または約１：１の比において存在し得る。好ましくは、担持される第１の核酸および担持されるさらなる核酸は、１：３～３：１の間、１：２～２：１の間、または約１：１の比において存在し得る。当該比は、第１の核酸およびさらなる核酸のそれぞれのモル量の比を意味する。

３つの異なる核酸が担持される場合、それらは、およそ等モル比（すなわち、１：１：１）、あるいは、約１：１：２、１：１：３、１：１：４、１：１：５、１：１：６、１：１：７、１：１：８、１：１：９、１：１：１０、１：２：１、１：３：１、１：４：１、１：５：１、１：６：１、１：７：１、１：８：１、１：９：１、１：１０：１、２：１：１、３：１：１、４：１：１、５：１：１、６：１：１、７：１：１、８：１：１、９：１：１、１０：１：１、１：２：２、１：３：３、１：４：４、１：５：５、１：６：６、１：７：７、１：８：８、１：９：９、１：１０：１０、１：２：３、１：２：４、１：３：６、１：４：８、１：５：１０、２：４：６、２：８：４、または他の比において存在し得る。

担持される核酸が同様のサイズであるいくつかの実施形態において、核酸は、等モル比において存在し得る。担持される核酸がプラスミドであるいくつかの実施形態において、当該プラスミドは、等モル比において存在し得る。

細胞外小胞は、管腔担持および外側表面担持の組合せによって担持され得、ならびに、そのような細胞外小胞は、カーゴ核酸を標的細胞に効率的に送達し得る。
場合により、いくつかの実施形態において、担持に対する言及は、管腔担持に対してのみであり得る。場合により、いくつかの他の実施形態において、担持に対する言及は、外側表面担持に対してのみであり得る。

いくつかの実施形態において、本明細書において説明される細胞外小胞内へのカーゴの担持は、ウイルス送達方法を含まず、例えば、当該担持方法は、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターなどを伴わない。

当該方法は、細胞外小胞の管腔内に含まれない核酸カーゴを除去する工程を伴い得る。そのような工程は、担持済みの細胞外小胞をＤＮＡｓｅと接触させる工程を含み得る。担持済みの細胞外小胞は、核酸または核酸：トランスフェクション試薬複合体を解離させるために、ＤＮＡｓｅとの接触の前にヘパリンと接触させられ得る。

組成物
細胞外小胞を含む組成物が、本明細書において開示される。
当該組成物は、１ｍｌあたり１０^６～１０^１５の間の粒子を含み得る。当該組成物は、１ｍｌあたり少なくとも１０^５の粒子、１ｍｌあたり少なくとも１０^６の粒子、１ｍｌあたり少なくとも１０^７の粒子、１ｍｌあたり少なくとも１０^８の粒子、１ｍｌあたり少なくとも１０^９の粒子、１ｍｌあたり少なくとも１０^１０の粒子、１ｍｌあたり少なくとも１０^１１の粒子、１ｍｌあたり少なくとも１０^１２の粒子、１ｍｌあたり少なくとも１０^１３の粒子、１ｍｌあたり少なくとも１０^１４の粒子、１ｍｌあたり少なくとも１０^１５の粒子を含み得る。

組成物は、実質的に相同な寸法を有する細胞外小胞を含み得る。例えば、細胞外小胞は、１００～５００ｎｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの場合において、微小胞の組成物は、５０～１０００ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、または１００～３００ｎｍ、または１０１～３００ｎｍの範囲の直径を有する微小胞を含む。好ましくは、直径は、１００～３００ｎｍである。いくつかの組成物において、微小胞の平均直径は、１００～３００ｎｍ、好ましくは１５０～２５０ｎｍ、好ましくは約２００ｎｍである。

細胞外小胞は、カーゴを含む。そのような組成物において、カーゴが組成物中の実質的に全ての細胞外小胞内に封入されることが望ましいが、本明細書において開示される組成物は、細胞外小胞の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％がカーゴを含むような場合の細胞外小胞を含み得る。好ましくは、細胞外小胞の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％が、カーゴを含む。いくつかの場合において、組成物内の異なる細胞外小胞は、異なるカーゴを含む。いくつかの場合において、細胞外小胞は、同じかまたは実質的に同じカーゴを含む。

組成物は、医薬組成物であり得る。組成物は、１つまたは複数の細胞外小胞と、場合により、薬学的に許容されるキャリアとを含み得る。医薬組成物は、特定の投与経路による投与のために製剤化され得る。例えば、医薬組成物は、静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮内、皮下、鼻腔内投与経路または他の投与経路用に製剤化され得る。

組成物は、緩衝液を含み得る。組成物は、防腐性化合物を含み得る。組成物は、薬学的に許容されるキャリアを含み得る。
２つ以上の核酸の送達
本明細書において説明されるＥＶは、２つ以上の核酸を細胞に送達する方法において使用され得る。換言すると、本明細書において説明されるＥＶは、カーゴの核酸のための送達システムとして使用され得る。ＥＶのカーゴは、標的細胞に送達される。したがって、ＥＶに、少なくとも２つの異なる核酸を含むカーゴが担持される場合、前記核酸は、標的細胞に同時に送達されるであろう。これは、標的細胞が、カーゴのそれぞれの異なる核酸の全てを受け取ることを確実とする。ＥＶは、上記において説明されるカーゴが担持され得る。

標的細胞への２つ以上の核酸の送達は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムなど、システムが複数の構成要素を含み、当該システムが機能するために、構成要素のそれぞれが単一の細胞に存在することを必要とするような場合に有用であり得る。この場合、ｇＲＮＡ、ヌクレアーゼをコードする核酸分子、およびＤＮＡ修復テンプレートのうちの２つ以上を、同時に標的細胞に送達することができる。次いで、ヌクレアーゼは、標的細胞によって発現され得て、標的細胞の遺伝子を編集するために、ｇＲＮＡおよび場合によりＤＮＡ修復テンプレートと協力して機能し得る。

２つ以上の核酸を標的細胞に送達する方法は、当該核酸が、例えば同じ分子のサブユニットまたは構成要素など、相互に関連する異なるペプチドまたはタンパク質をコードする核酸、あるいは、例えば同じ生物学的経路の構成要素など、関連し合う操作を有するかまたはリガンド：受容体結合関係を示す分子である場合に有用であり得る。本明細書において示されるように、別々の核酸上の異なる成分であるペプチドをコードするカーゴが担持されたＥＶは、単一の核酸上のペプチドをコードする場合（例えば、２シストロン性ベクター）、ならびに異なるＥＶにおいて別々にこれらのカーゴを送達する場合と比較して、優れた発現を提供する。いくつかの場合において、標的細胞は、カーゴの核酸によってコードされるペプチドを産生するであろう。いくつかの場合において、標的細胞は、カーゴの核酸によってコードされるペプチドを産生し分泌するであろう。いくつかの場合において、標的細胞は、分子の異なるポリペプチド成分を生じるであろうし、それらは、標的細胞内において組み立てられた完全な分子を形成する。

当該方法は、どの標的細胞がカーゴを取り込んだかを理解することが重要である場合にも有用である。そのような場合、カーゴは、レポーター遺伝子を含み得るか、または容易に検出可能な分子をコードする。いくつかの場合において、カーゴは、レポーター遺伝子または検出可能な分子と、目的の少なくとも１つの核酸（例えば、プラスミド、ＡＳＯ、ｓｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムの構成要素）とを含み得る。レポーター遺伝子または検出可能な分子は、目的の核酸と共に標的細胞に送達されるであろうし、ならびに、カーゴを取り込み、したがって目的の核酸を含むような細胞の検出を容易にする。

いくつかの場合において、２つ以上の核酸を細胞に送達する当該方法は、インビトロまたはエクスビボにおいて実施される。いくつかの場合において、２つ以上の核酸を細胞に送達する当該方法は、インビボにおいて実施される。いくつかの場合において、標的細胞は、対象、例えば、ヒト対象から単離されたものである。いくつかの場合において、標的細胞は、対象、例えば、ヒト対象に存在する。いくつかの場合において、当該対象は、がんを患う。いくつかの場合において、当該対象は、単一遺伝子性疾患を患う。いくつかの場合において、対象は、多遺伝子性疾患を患う。

いくつかの場合において、標的細胞は、がん細胞または腫瘍細胞である。いくつかの場合において、標的細胞は、免疫細胞である。いくつかの場合において、標的細胞は、遺伝子変異を含む。いくつかの場合において、標的細胞は、欠陥遺伝子を含む。いくつかの場合において、標的細胞は、機能喪失型変異を含む。いくつかの場合において、標的細胞は、機能獲得型変異を含む。いくつかの場合において、標的細胞は、タンパク質の過剰発現または過少発現を引き起こす変異を有する。

細胞に２つ以上の核酸を送達する方法は、標的細胞をＥＶと接触させる工程を含み、この場合、ＥＶは、少なくとも２つの異なる核酸を含んだカーゴが担持される。標的細胞およびＥＶは、標的細胞にＥＶを取り込ませるのに十分な時間およびそれにとって好適な条件下において、接触させられる。

ＥＶは、標的細胞を用いてインキュベートされ得る。用語「インキュベートすること（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）」／「インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）」／「インキュベートする（ｉｎｃｕｂａｔｅ）」は、標的細胞とカーゴが担持されたＥＶとを、ＥＶが標的細胞によって取り込まれる、すなわち、同化されるか、組み込まれるか、または取り入れられるような好適な温度および好適な時間において一緒にする工程を意味するために本明細書において使用される。これらの用語は、標的細胞と担持済みのＥＶとを、標的細胞が、例えば、インキュベーションの間またはその後に、ＥＶおよび／またはカーゴ、例えば、外因性核酸を取り込む、すなわち、同化するか、組み込むか、または取り入れるように十分に接触させる工程を意味するためにも本明細書において使用される。インキュベーションは、少なくとも１つのＥＶおよび／またはカーゴを含む本明細書において説明される標的細胞を生じ得る。標的細胞は、インキュベーションの間またはその後に生成され得る。インキュベーションは、カーゴを担持したＥＶを含む細胞培地において標的細胞またはその集団をインビトロ／エクスビボにおいて培養する工程を伴い得る。インキュベーションは、哺乳動物の体温に近い温度、例えば、少なくとも３５．０℃、少なくとも３５．５℃、少なくとも３６．０℃、少なくとも３６．１℃、少なくとも３６．２℃、少なくとも３６．３℃、少なくとも３６．４℃、少なくとも３６．５℃、少なくとも３６．６℃、少なくとも３６．７℃、少なくとも３６．８℃、少なくとも３６．９℃、少なくとも３７．０℃、少なくとも３７．１℃、少なくとも３７．２℃、少なくとも３７．３℃、少なくとも３７．４℃、および／または少なくとも３７．５℃のうちの１つまたは複数の温度において実施され得る。いくつかの場合において、インキュベーションは、２つ以上の温度、例えば、上記のような温度において実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、単一の温度において実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、ヒトの体温において実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、少なくとも３７．０℃において実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、３７．０℃において実施される。インキュベーションは、同じ細胞において反復され得る。

インキュベーションは、細胞培養のＣＯ_２レベルを制御する工程を含み得る。制御されたＣＯ_２を伴うインキュベーションは、インキュベートされる混合物のｐＨを制御することができる。いくつかの場合において、混合物をインキュベートする工程のＣＯ_２レベルは、血液、例えば、哺乳動物の血液のＣＯ_２レベルまたはそれに近いレベルに維持される。いくつかの場合において、インキュベーションは、少なくとも４．０％、少なくとも４．１％、少なくとも４．２％、少なくとも４．３％、少なくとも４．４％、少なくとも４．５％、少なくとも４．６％、少なくとも４．７％、少なくとも４．８％、少なくとも４．９％、少なくとも５．０％、少なくとも５．１％、少なくとも５．２％、少なくとも５．３％、少なくとも５．４％、少なくとも５．５％、少なくとも５．６％、少なくとも５．７％、少なくとも５．８％、少なくとも５．９％および／または少なくとも６．０％のＣＯ_２のうちの１つまたは複数において実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、少なくとも３０ｍｍＨｇ、少なくとも３１ｍｍＨｇ、少なくとも３２ｍｍＨｇ、少なくとも３３ｍｍＨｇ、少なくとも３４ｍｍＨｇ、少なくとも３５ｍｍＨｇ、少なくとも３６ｍｍＨｇ、少なくとも３７ｍｍＨｇ、少なくとも３８ｍｍＨｇ、少なくとも３９ｍｍＨｇ、少なくとも４０ｍｍＨｇ、少なくとも４１ｍｍＨｇ、少なくとも４２ｍｍＨｇ、少なくとも４３ｍｍＨｇ、少なくとも４４ｍｍＨｇ、および／または少なくとも４５ｍｍＨｇのＣＯ_２のうちの１つまたは複数において実施される。

いくつかの場合において、インキュベーションは、少なくとも５％のＣＯ_２において実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、約５％のＣＯ_２において実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、５％のＣＯ_２において実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、少なくとも３８ｍｍＨｇのＣＯ_２において実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、約３８ｍｍＨｇのＣＯ_２において実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、３８ｍｍＨｇのＣＯ_２において実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、加湿された環境、例えば、加湿されたインキュベーターにおいて実施される。

インキュベーションは、ＥＶが標的細胞によって取り込まれるような長さの時間において実施され得る。インキュベーションは、例えば、温度と、例えば上記のようなＣＯ_２レベルの組合せにおいて、１２、２４、３６、４８、６０、または７２時間のうちの１つにおいて実施され得る。いくつかの場合において、インキュベーションは、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、または少なくとも７２時間実施される。

いくつかの場合において、インキュベーションは、少なくとも３６時間または少なくとも４８時間実施される。いくつかの場合において、インキュベーションは、４８時間実施される。本明細書において説明される方法は、例えば、全ての非同化ＥＶを除去するために、インキュベーションの後に標的細胞を洗浄する１つまたは複数の工程を含み得る。洗浄工程は、ＰＢＳおよび遠心分離を用いて、例えば、４℃において実施され得る。

本明細書において説明される方法は、例えば、上記において説明されるような、温度、ＣＯ_２レベル、および／または時間の任意の組合せを含むインキュベーション工程を含み得る。いくつかの場合において、インキュベーションは、３７℃および５％のＣＯ_２において４８時間実施される。

インキュベーションは、任意の好適な培地、例えば、細胞培養培地において実施され得る。
いくつかの場合において、インキュベーションは、インキュベーション時間のいくらかまたは全てにおいて混合物を攪拌する工程を含む。

当該方法は、核酸カーゴ、例えば、本明細書に説明されるような核酸カーゴをＥＶに担持する工程を含み得る。この工程は、標的細胞を用いてＥＶをインキュベートする工程の前に実施され得る。この工程は、標的細胞を用いてＥＶをインキュベートする工程とは別々に実施され得る。

いくつかの場合において、当該方法は、ＥＶに核酸カーゴを担持する工程を含まず、例えば、標的細胞は、核酸カーゴが事前担持されているＥＶを用いてインキュベートされる。

いくつかの場合において、本明細書において説明される外因性核酸を標的細胞に送達する／トランスフェクトする方法は、標的細胞をトランスフェクション試薬と接触させる工程を含まない（ＥＶ自体は、例えば、トランスフェクション試薬を使用して、核酸カーゴが担持され得る／担持されているが）。

治療方法および細胞外小胞の使用
本明細書において開示される細胞外小胞は、治療方法において有用である。本明細書において実証されるように、２つ以上の核酸が共担持されたＲＢＣＥＶ（共担持）を用いてトランスフェクトされた細胞は、結果として、より高いレベルの発現不均一性を示す、それぞれのカーゴが個別に担持され、その後に均等に混合されたＲＢＣＥＶ（共トランスフェクト）を用いてトランスフェクトされた細胞と比較して、はるかに高いレベルでの全てのカーゴからの発現を生じた。両方の導入遺伝子からの共発現に対する共担持の効果は、２シストロン性ベクターの使用によって達成することができるものより明白であった。したがって、本発明による、少なくとも２つの異なる核酸を含むカーゴを担持した細胞外小胞は、治療方法において特に有用である。

細胞外小胞は、複数の核酸成分の投与から恩恵を受けることが知られている治療方法、例えば、遺伝子編集（遺伝子編集システムの複数の構成要素の投与を必要とする）またはベクター化された抗体（抗体またはその抗原結合性断片の複数の成分の投与を必要とする）による治療方法などにおいて特に有用である。いくつかの方法は、内因性核酸の抑制および外因性核酸の同時発現を伴う。例えば、そのような方法は、例えば機能獲得型変異などの「不完全な」外因性核酸の抑制およびその核酸の外因性の機能的なコピーの発現を伴い得る。治療は、例えば、多遺伝子性疾患の治療などにおける、２つ以上の内因性核酸を標的にする核酸の投与を伴い得る。

特に、当該方法は、標的遺伝子に関連する障害を患う対象の治療にとって有用であり、当該方法は、変更された細胞外小胞の有効量を前記対象に投与する工程を含み、この場合、変更された細胞外小胞は、その表面上に結合性分子を含み、標的細胞における標的遺伝子と相互作用するための非内因性物質を封入する。当該非内因性物質は、前記治療のための核酸であり得る。

本明細書において開示される細胞外小胞は、遺伝病、炎症性疾患、がん、自己免疫異常、心血管疾患、または消化器系疾患の治療にとって特に有用である。いくつかの場合において、当該障害は、サラセミア、鎌状赤血球貧血、または遺伝性代謝障害から選択される遺伝病である。いくつかの場合において、細胞外小胞は、肝臓、骨髄、肺、脾臓、脳、膵臓、胃、または腸管の障害の治療にとって有用である。

ある特定の態様において、細胞外小胞は、がんの治療にとって有用である。本明細書において開示される細胞外小胞は、がん細胞の成長または増殖の阻害にとって有用であり得る。当該がんは、液性または血液がん、例えば、白血病、リンパ腫、または骨髄腫などであり得る。他の場合において、がんは、固形がん、例えば、乳がん、肺がん、肝臓がん、結直腸がん、上咽頭がん、腎がん、または神経膠腫などである。いくつかの場合において、がんは、肝臓、骨髄、肺、脾臓、脳、膵臓、胃、または腸管に位置される。

標的細胞は、治療される障害に依存する。例えば、標的細胞は、乳房がん細胞、結直腸がん細胞、肺がん細胞、腎臓がん細胞などであり得る。カーゴは、標的遺伝子の発現を阻害または増強するための、または特定の遺伝子を発現停止させるために遺伝子編集を実施するための核酸を含み得る。

本明細書において説明される細胞外小胞および組成物は、多くの経路、例えば、これらに限定されるわけではないが、全身性、腫瘍内、腹腔内腸管外、静脈内動脈内、皮内、皮下、筋肉内、経口、および経鼻などによって投与され得るか、またはそのような投与のために製剤化され得る。好ましくは、細胞外小胞は、腫瘍内、腹腔内、または静脈内から選択される経路によって投与される。当該医薬品および組成物は、液体形態または固体形態において製剤化され得る。液体製剤は、ヒトまたは動物の身体における選択された領域への注入による投与のために製剤化され得る。

細胞外小胞は、治療用カーゴを含み得る。治療用カーゴは、標的細胞における標的遺伝子と相互作用するための非内因性物質であり得る。治療用カーゴは、ベクター化された抗原結合性分子であり得る。

「治療有効量」での投与が好ましく、この量は、個人に対して恩恵を示すのに十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の経路および時間－コースは、治療される疾患の性質および重症度に依存するであろう。治療の処方箋、例えば、投薬量などの決定は、一般医師および他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法、および医師に既知の他の要因を考慮する。上記において言及される技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎに見出すことができる。

細胞外小胞は、単独において、または、他の治療と組み合わせて、治療される状態に応じて同時にまたは連続して投与され得る。
本明細書において説明されるカーゴが担持された細胞外小胞は、標的細胞にそのカーゴを送達するために使用され得る。いくつかの場合において、当該方法は、インビトロ法である。特に好ましいインビトロ法において、カーゴは、標識分子またはプラスミドである。

治療される対象は、任意の動物またはヒトであり得る。対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。対象は、非ヒト哺乳動物であり得るが、より好ましくはヒトである。対象は、雄または雌であり得る。対象は、患者であり得る。治療使用は、ヒトまたは動物（家畜への使用）においてであり得る。

その特定の形態においてまたは開示される機能を実施するための手段に関連して表現される、先述の説明において、または下記の特許請求の範囲において、または添付の図面において開示される特徴、あるいは開示された結果を得るための方法またはプロセスは、適切であれば、そのような特徴とは別々に、またはそれらと組み合わせて、本発明をその様々な形態において実現するために利用され得る。

本発明は、上記において説明される例示的実施形態に関連して説明されるが、多くの同等な修飾および変形例は、この開示を与えられた当業者には明らかであろう。したがって、上記において説明された本発明の例示的実施形態は、説明目的と見なされ、制限とは見なされない。説明された実施形態への様々な変更は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくされ得る。

あらゆる疑問の回避のために、本明細書において提供される全ての論理的説明は、読み手の理解を向上させる目的のために提供される。本発明者らは、これらの論理的説明のいずれかによって縛られることを望まない。

本明細書において使用される全てのセクションの見出しは、組織的な目的のみのためのものであり、説明される主題の限定として解釈されるべきではない。
下記の特許請求の範囲を含め、本明細書を通じて、文脈がそうでないことを必要とする場合を除いて、言葉「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、および変形例、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、言及された整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を含むが他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を除外しないことを意味するものと理解される。

本明細書においてまたは添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈において特に明記されない限り、複数形を包含することに留意しなければならない。範囲は、本明細書において、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表現され得る。そのような範囲が表現されるとき、別の実施形態は、一方の特定値から、および／または他方の特定値までを含む。同様に、値が近似値で表される場合、「約」という先行詞を用いることで、この特定値が、別の実施形態を形成することが理解されるであろう。数値との関連においける用語「約」は随意的であり、例えば、±１０％を意味する。

実施例１
ＲＢＣＥＶは、２つ以上の核酸カーゴを同時に担持することができ、ならびに、これらの共担持済みのＥＶは、標的細胞へのそれらのペイロードの送達において非常に効率的である。これは、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリー分析によって蛍光レポーター遺伝子の発現パターンおよび発現レベル、ｑＲＴ－ＰＣＲによって遺伝子転写レベル、ならびに治療抗体の発現レベルを評価することによって実証された。２つ以上の核酸を共担持したＲＢＣＥＶ（共担持）を用いてトランスフェクトされた細胞は、結果として、それぞれのカーゴを個別に担持してその後に均等に混合（共トランスフェクト）したＲＢＣＥＶ（高いレベルの発現不均一性を示した）と比較して、全てのカーゴからの非常に高い発現レベルを生じた。両方の導入遺伝子からの共発現に対する共担持の効果は、２シストロン性ベクターの使用によって達成可能なものよりも、さらに明確であった。これらの研究結果は、共担持済みのＲＢＣＥＶは、複数のカーゴの送達にとって有望なビヒクルであり、ベクター化抗体およびゲノム編集の分野における重要な意義を有することを示唆している。

方法
材料および試薬
プラスミド（ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰ、ＣＭＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＣＡＧ－Ｃｒｅ、ＣＡＧ－ｈＦＩＸ、ＣＡＧ－ルシフェラーゼ、ＣＡＧ－ＬＣ、ＣＡＧ－ＨＣ、ＣＡＧ－ＬＣ－ＩＲＥＳ－ＨＣ、ＣＡＧ－ＬＣ－Ｐ２Ａ－ＨＣ）をカスタム合成した。トラスツズマブの完全長重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を、ドラッグバンクデータベースから入手した（受託番号：ＤＢ０００７２）。ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡを、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにおいてカスタム合成した。２９３Ｔ細胞およびＨｅｐＧ２細胞をＡＴＣＣから購入し、３７℃の５％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて、１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ変法イーグル培地において培養した。

ヒトＲＢＣに由来するＥＶの精製および定量化
全血試料を、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃを通じて、告知同意において健康なドナーから入手した。遠心沈殿法および白血球除去（ｌｅｕｋｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）フィルター（Ｔｅｒｕｍｏ Ｊａｐａｎ）を使用することによって、ＲＢＣを血漿および白血球から分離した。単離されたＲＢＣを、ＰＢＳにおいて希釈し、１０ｍＭのカルシウムイオノホア（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって一晩処理した。ＥＶを精製するために、ＲＢＣおよび細胞破片を、６００×ｇで６０分間、１，６００×ｇで３０分間、および４，０００×ｇで３０分間の、４℃での遠心分離によって除去した。ＥＶを、４℃において１８０分かけて、１５，０００×ｇでペレット化し、ＰＢＳに再懸濁させて、０．４５μｍフィルターを通過させた。ＥＶを４ダイア容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）のＰＢＳで洗浄し、タンジェンシャルフロー濾過（Ｐａｌｌ Ｍｉｎｉｍａｔｅ）によって濃縮した。精製されたＥＶを－８０℃で貯蔵した。ＥＶを、Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を使用してそれらのヘモグロビン含量を評価することによって定量化した。

ＲＢＣＥＶの核酸担持およびインビトロトランスフェクション
１μｇのｍＲＮＡまたはＤＮＡを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において７μｌの化学的トランスフェクション試薬に加え、複合体形成を促進するために室温で１０分間インキュベートした。混合物を５０μｇの洗浄したＲＢＣＥＶに加え、穏やかに混合した。反応物を、室温において、穏やかに回転させながら１時間インキュベートした。その後、担持済みのＲＢＣＥＶを１５、０００×ｇでペレット化し、ＰＢＳで洗浄した。

複数の核酸の共担持のために、プラスミドおよび／またはｍＲＮＡを、最初に等モル比において混合し、その後、化学的トランスフェクション試薬を加えた。複合体形成の後に、混合物をＲＮＣＥＶに加え、穏やかに回転させながら室温１時間でインキュベートした。担持済みのＲＢＣＥＶを１５，０００×ｇにおいてペレット化し、ＰＢＳで洗浄した。

ＲＢＣＥＶの共トランスフェクションのために、２つ以上のプラスミドまたはｍＲＮＡを別々の管においてＲＢＣＥＶに担持し、ＰＢＳで洗浄した後、これらの担持済みのＲＢＣＥＶの核酸を定量化した。担持済みのＲＢＣＥＶを、それらのそれぞれの核酸の等モル比において混合し、その後に細胞のトランスフェクションを行った。

トランスフェクションの前日に、５０，０００の２９３Ｔ細胞またはＨｅｐＧ２細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルに播種した。トランスフェクションの当日に、担持済みのＲＢＣＥＶを核酸の等モル量において細胞へと処理した。粒子をウェルにおいて均等に分配するために、２４ウェルプレートを穏やかに旋回させた。

遺伝子発現の評価
蛍光レポーター遺伝子のために、顕微鏡撮像およびフローサイトメトリーによって遺伝子発現を評価した。顕微鏡撮像のために、２９３Ｔ細胞またはＨｅｐＧ２細胞のエピ蛍光画像を、トランスフェクションの４８時間後に、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｓ２倒立顕微鏡を使用して撮影した。画像を、生物学的画像解析のためのオープンソースプラットフォームのＦｉｊｉを使用して解析した（Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ９（７）：６７６～６８２，ＰＭＩＤ ２２７４３７７２）。ＦｉｊｉプラグインＣｏｌｏｃ ２を使用して、２色チャネル画像の共局在化分析を実施した。共局在化シグナルの相関度を測定するために、ピアソン相関係数を選択し、結果は、完全な相関の場合は１．０であり、相関がない場合は０．０である。

フローサイトメトリー分析のために、２９３Ｔ細胞およびＨｅｐＧ２細胞を、トランスフェクションの４８時間後に、０．０５％のトリプシンによって回収した。回収した細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％のＦＢＳを含むＰＢＳ）に再懸濁させた。ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、細胞のフローサイトメトリーを実施し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、米国）を使用して分析した。デブリおよび死んだ細胞を排除するために、細胞を最初に、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａに基づいてゲートした（低ＦＳＣ－Ａ）。ダブレットおよび凝集物を排除するために、細胞をさらに、ＦＳＣ幅対ＦＳＣ高さに基づいてゲートした。コントロールとして未処理の細胞を使用することにより、ＧＦＰ陽性細胞を、ＦＩＴＣチャネルにおいてゲートし、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を、ＰＥチャネルにおいてゲートした。ＧＦＰおよび／またはｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞の割合を評価した。

他のプラスミド（非蛍光）に対しては、ｑＲＴ－ＰＣＲによって特定した転写レベルによって、遺伝子発現を測定した。核酸を担持したＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした細胞からの総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して抽出し、ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し、製造元のプロトコルに従って、ｃＤＮＡに変換した。細胞に送達された導入遺伝子の転写レベルを特定するために、ｃＤＮＡ試料においてｑＰＣＲを実施した。発現をＧＡＰＤＨへ正規化した。

トラスツズマブの定量化
細胞培養上清中のトラスツズマブのレベルを、製造元のプロトコルに従って、抗ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡキット（ａｂ２３７６４５、Ａｂｃａｍ）によって特定した。重鎖および軽鎖の両方を含む完全な全抗体の存在下では陽性シグナルのみが生じるという理由から、この検出方法を選択した。

担持効率
ＤＮＡまたはＲＮＡを、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎまたはＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイによって定量化した。担持反応に加えた核酸の開始量と担持反応の後に回収した核酸の最終量とに基づいて、担持効率を計算した。

ＤＮＡのラベリングおよびＲＢＣＥＶのフローサイトメトリー分析
Ｌａｂｅｌ ＩＴ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を使用し、製造元のプロトコルに従って、フルオロホア（ＭＦＰ４８８またはＣｙ５）によってＤＮＡを標識した。ＲＢＣＥＶにＭＦＰ４８８またはＣｙ５を標識したＤＮＡを担持し、ＰＢＳで洗浄した。担持済みのＲＢＣＥＶを、ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用したフローサイトメトリーによって分析し、ならびに、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、米国）を使用して分析した。分粒レファレンスとして１００ｎｍおよび２００ｎｍ分粒ラテックスビーズを使用して、ＶＳＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ａに基づいてＲＢＣＥＶをゲートした。コントロールとして非標識ＤＮＡを担持したＲＢＣＥＶを使用して、ＭＦＰ４８８陽性ＲＢＣＥＶをＦＩＴＣチャネルにおいてゲートし、ならびにＣｙ５陽性ＲＢＣＥＶをＡＰＣチャネルにおいてゲートした。

統計分析
結果は、平均±標準偏差（ＤＳ）として表現される。データは、スチューデントｔ－検定、一元配置分散分析、またはピアソンの相関関係によって解析した。平均の間の違いは、ｐ＜０．０５において統計的に有意であると見なした。

結果
ＲＢＣＥＶに２つ以上のプラスミドを同時に担持することができる
ＲＢＣＥＶによる２つのプラスミドのトランスフェクション効率を評価するために、同じＣＭＶプロモーター下の異なる蛍光レポーター遺伝子を有するプラスミドコンストラクトを設計した（ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰおよびＣＭＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）。ＲＢＣＥＶに単一のプラスミドを担持して共トランスフェクトするか、または両方のプラスミドを等モル比において同時に担持した。担持済みのＲＢＣＥＶを、等モルＤＮＡ量において２９３Ｔ細胞およびＨｅｐＧ２細胞へトランスフェクトした。０．０８４ｐｍｏｌのＤＮＡを、５０，０００の細胞を含む２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を蛍光顕微鏡によって撮像し、フローサイトメトリーによって分析した（図１Ａおよび１Ｂ）。

共局在化シグナルの相関度を測定するために、ピアソン相関係数を使用して、２９３Ｔ細胞およびＨｅｐＧ２細胞の２色チャネル画像の共局在化解析を実施した。両方のプラスミドを共担持したＲＢＣＥＶによって処理した細胞は、２色チャネルの共局在化シグナルの著しく高い相関性を示した。共担持したグループにおける相関係数の増加は、細胞での両方のプラスミドの転写効率および発現の増加を示唆している。

細胞を回収し、フローサイトメトリーによって分析した。コントロールとして未処理の細胞を使用して、ＧＦＰ陽性細胞をＦＩＴＣチャネルにおいてゲートし、ならびにｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞をＰＥチャネルにおいてゲートし、ならびにＧＦＰおよび／またはｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞の割合を評価した。共担持済みのＥＶを用いてトランスフェクトした細胞において、ＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏの両方の導入遺伝子の共発現の増加が観察された。共トランスフェクトしたグループの細胞のドットプロットは、ＧＦＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏの細胞発現の不均一な集団を示したが、その一方で、共担持したグループでは、より直線的なパターンが観察された。これらの結果は、両方のプラスミドをＲＢＣＥＶに同時担持することによる細胞への両方のプラスミドの送達との高い相関を示唆している。

ＲＢＣＥＶにおいて共担持されたプラスミドは、別々に担持され共トランスフェクトされたものまたは２シストロン性ベクターと比較して、より効率的に共発現された
発明者らは、治療抗体、例えば、ＤＮＡ誘導ヒト化モノクローナル抗体のトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などをコードするプラスミドのＲＢＣＥＶ担持を評価した。抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）の特定のために設計された非常に特異的なＥＬＩＳＡキット（ａｂ２３７６４５、Ａｂｃａｍ）を、全抗体分子の発現の検出および定量化のために使用した。このアッセイにおいて、抗原、組換えヒトＨＥＲ２断片でＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ）は、抗原に結合し、ＨＲＰプローブをコンジュゲートさせた抗ヒトＦｃ抗体によって検出された。この検出方法を使用することにより、発明者らは、軽鎖および重鎖成分から組み立てられた全抗体分子を検出することができる。

ＩＲＥＳ（ＣＡＧ－ＬＣ－ＩＲＥＳ－ＨＣ）またはＰ２Ａ（ＣＡＧ－ＬＣ－Ｐ２Ａ－ＨＣ）配列を有する２シストロン性ベクターにおけるトラスツズマブ軽鎖（ＣＡＧ－ＬＣ）または重鎖（ＣＡＧ－ＨＣ）のどちらか、あるいは軽鎖および重鎖配列の両方を含むように、プラスミドコンストラクトを設計した。ＲＢＣＥＶの送達およびトランスフェクション効率を評価するために、トラスツズマブ軽鎖、重鎖をコードする単一のプラスミド、またはＩＲＥＳもしくはＰ２Ａ配列を有する単一の２シストロン性ベクターをＲＢＣＥＶに担持した。共担持グループでは、トラスツズマブ軽鎖および重鎖をコードするプラスミドを等モル比において同時にＲＢＣＥＶに担持した。

担持済みのＲＢＣＥＶを、等モルＤＮＡ量において２９３Ｔ細胞およびＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトした。０．０８４ｐｍｏｌのＤＮＡを、５０，０００の細胞を含む２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。トランスフェクションの４８時間後に、細胞培養上清におけるトラスツズマブの発現を、抗ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡによって定量化した。トラスツズマブの発現は、トラスツズマブ軽鎖および重鎖プラスミドを等モル比において共担持したＲＢＣＥＶで処理した細胞において最も高く、次は、単一の２シストロン性ベクターを担持したＲＢＣＥＶで処理した細胞であった（図２Ａ）。トラスツズマブ軽鎖または重鎖をコードする単一のプラスミドを担持したＲＢＣＥＶを用いて共トランスフェクトされた細胞は、抗体全分子の最も低い発現を示した。これらの結果は、プラスミドがＲＢＣＥＶに共担持された場合に２つのプラスミドのトランスフェクション効率が著しく向上することを示唆している。抗体全分子の発現における違いは、軽鎖成分および重鎖成分の両方のアセンブリとして、どちらかのプラスミドの発現における違いが、抗ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡ法によって検出されるために必要であることを実証している。関与した異なるプラスミドの担持効率において、有意な差は観察されなかった（図２Ｂ）。

別の実験において、トラスツズマブ軽鎖および重鎖をコードするプラスミドを同時に担持したＲＢＣＥＶあるいはトラスツズマブ軽鎖または重鎖をコードする単一のプラスミドを別々に担持したＲＢＣＥＶを、４ｍｇ／ｋｇのプラスミド用量において、静脈内尾静脈注射によってＳＣＩＤマウスに投与した。血清試料を、注射後の７日目から週１回採取し、全抗体分子の発現を、抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）ＥＬＩＳＡ（ａｂ２３７４６５、Ａｂｃａｍ）を使用して定量化した。トラスツズマブの発現は、軽鎖および重鎖プラスミドを別々に担持したＲＢＣＥＶを注射した動物と比較して、軽鎖および重鎖プラスミドの両方が共担持されたＲＢＣＥＶを注射した動物において最も高かった（図２Ｃ）。これらの結果は、ＲＢＣＥＶにおいて共担持されたプラスミドは、別々に担持され混合物として注射されたＲＢＣＥＶと比較して、インビボにおいてより効率的に共発現することを実証している。

したがって、とりわけ、本実施例は、少なくとも２つの異なる核酸カーゴによる効率的な共担持（この場合、少なくとも２つの異なるプラスミド）を実証し、その上、そのような共担持に起因する驚異的な結果を記録する（例えば、同じ核酸カーゴのそれぞれを別々に担持したＲＢＣＥＶの同時投与と比較して）。

ＲＢＣＥＶは３つのプラスミドを共担持することができる
ＲＢＣＥＶによる３つのプラスミドのトランスフェクション効率を評価するために、同じＣＡＧプロモーター下の、独特な導入遺伝子、すなわち、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ヒト第ＩＸ因子、およびホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドコンストラクトを設計した。ＲＢＣＥＶに、３つの異なるプラスミドを異なる担持反応において別々に担持するか、または混合物において等モル比でプラスミドを共担持することによって担持した。合計で、０．０６ｐｍｏｌのＤＮＡを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、総ＲＮＡを細胞から抽出し、遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって特定した転写レベルによって測定した。結果は、共トランスフェクションと比較したときに、共担持済みのＲＢＣＥＶを細胞にトランスフェクトした場合に３つ全てのプラスミドからの転写物のレベルの増加を示した（図３）。

ＲＢＣＥＶに異なるタイプの核酸を共担持することができる
異なる核酸タイプがＲＢＣＥＶに共担持される能力を評価するために、ＲＢＣＥＶに、ｃｏｐＧＦＰをコードするＤＮＡ（ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰ）およびｔｄＴｏｍａｔｏをコードするｍＲＮＡを１：１または１：２（ＤＮＡ：ＲＮＡ）の等モル比において共担持するか、あるいは、化学的な方法を使用して別々に担持した。０．１１４ｐｍｏｌの核酸を、５０，０００の２９３Ｔ細胞を含む２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。トランスフェクションの４８時間後に、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリー分析によって細胞を撮像した。

ｃｏｐＧＦＰ ＤＮＡおよびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡの両方を共担持したＲＢＣＥＶによって処理した細胞は、１：１および１：２のモル比のグループの両方において、２色チャネルの共局在化シグナルの著しく高い相関性を示した（図４）。共担持したグループにおける相関係数の増加は、単一の細胞における両方の核酸の転写効率および発現の増加を示唆している。フローサイトメトリー分析は、同様のパターンを示し、ＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏ陽性２９３Ｔ細胞の割合の増加が、共担持したグループにおいて観察された。ＲＢＣＥＶにおける共担持したＤＮＡおよびｍＲＮＡの発現は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを別々に担持したＲＢＣＥＶの共トランスフェクションよりも効率的であった。

蛍光標識したＤＮＡのＲＢＣＥＶ担持
ＤＮＡを、Ｌａｂｅｌ ＩＴ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を使用し、製造元のプロトコルに従って、蛍光発色団（ＭＦＰ４８８またはＣｙ５）によって標識した。ＲＢＣＥＶにＭＦＰ４８８またはＣｙ５で標識したＤＮＡを担持するか、またはＭＦＰ４８８およびＣｙ５標識したＤＮＡの等量を同時に担持した。担持済みのＲＢＣＥＶを、ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用したフローサイトメトリーによって分析し、ならびに、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、米国）を使用して分析した。分粒レファレンスとしてラテックスビーズ標準物質を使用して、１００ｎｍから２００ｎｍの範囲のサイズを有する集団としてＲＢＣＥＶをゲートした。コントロールとして非標識ＤＮＡを担持したＲＢＣＥＶを使用して、ＭＦＰ４８８陽性ＲＢＣＥＶをＦＩＴＣチャネルにおいてゲートし、ならびに、Ｃｙ５陽性ＲＢＣＥＶをＡＰＣチャネルにおいてゲートした。ＭＦＰ４８８標識ＤＮＡまたはＣｙ５標識ＤＮＡを別々に担持したＲＢＣＥＶの混合集団と比較して、等量のＭＦＰ４８８およびＣｙ５標識ＤＮＡが同時に担持されたＲＢＣＥＶにおいて、両方の蛍光標識の共発現の増加が観察された（図５）。これらの結果は、単一のＲＢＣＥＶは、本明細書において説明されるような共担持方法を使用して、少なくとも２つの異なる蛍光標識されたＤＮＡ分子を同時に担持することができることを実証している。

標準的分子生物学的技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ ｅｄ．２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。

実施例２
本実施例は、二本鎖オリゴヌクレオチドによるＲＢＣＥＶへの共担持は、インビトロまたはインビボにおいて送達された場合に、導入遺伝子に対する免疫反応を抑制しつつも、導入遺伝子の発現を増加させることができることを実証している。詳細には、共担持済みのＲＢＣＥＶが、異なる組織器官の複数のマウス株および複数のヒト細胞株に送達された後で、導入遺伝子発現および炎症性サイトカインを評価した。

細胞質において見出される外因性ＤＮＡは、ＤＮＡ活性化シグナル伝達経路、例えば、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路などによって本来の免疫反応を活性化することができ、その結果として、炎症促進性サイトカインの産生を引き起こす。本発明は、オリゴヌクレオチド（具体的には、外来性核酸の感知に関連する細胞機構のいくつかの態様を模倣または「デコイ」することができるオリゴヌクレオチド）による赤血球由来の細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）への共担持は、ペイロードのみが担持された対応するＲＢＣＥＶと比較して、共担持される核酸ペイロードの活性を増強することができることを提案する。本実施例は、インビボおよびインビトロ両方でのそのような増強を記録する。本実施例は、さらに、導入遺伝子発現の増強に加えて、そのようなオリゴヌクレオチド（例えば、デコイオリゴヌクレオチド）によるＲＢＣＥＶの共担持は、インビボにおいてタイプＩインターフェロンの誘導を減少させることによって、細胞の本来の免疫反応を軽減するように作用することができることを実証する。

本開示において、用語「デコイオリゴヌクレオチド」（「ＯＤＮ」として省略）は、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路の監視を無効にする有効な戦略として、免疫反応およびシグナル伝達関連転写因子、例えば、ＮＦ－κＢなどの転写活性を阻止することができるオリゴヌクレオチドのクラスを表す。例えば、ＮＦ－κＢコンセンサス配列を含むオリゴヌクレオチドは、その標的遺伝子のプロモーター領域におけるその部位へのＮＦ－κＢ結合を阻止または減少することができる（例えば、競合によって）。そのような阻止は、それらの標的遺伝子を活性化するＮＦ－κＢの能力を減少させ、それにより、それらの遺伝子（および／または、１つまたは複数の他の下流遺伝子）の発現が減少し、炎症性サイトカインの放出も減少する。

材料および方法
ヒトＲＢＣ由来のＥＶの精製および定量化
全血試料を、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃを通じて、告知同意において健康なドナーから入手した。遠心沈殿法および白血球除去（ｌｅｕｋｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）フィルター（Ｔｅｒｕｍｏ Ｊａｐａｎ）を使用することによって、ＲＢＣを血漿および白血球から分離した。単離されたＲＢＣを、ＰＢＳにおいて希釈し、１０ｍＭのカルシウムイオノホア（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって一晩処理した。ＥＶを精製するために、ＲＢＣおよび細胞破片を、６００×ｇで６０分間、１，６００×ｇで３０分間、および４，０００×ｇで３０分間の４℃での遠心分離によって除去した。ＥＶを、４℃において１８０分かけて、１５，０００×ｇでペレット化し、ＰＢＳに再懸濁させて、０．４５μｍフィルターを通過させた。ＥＶを４ダイア容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）のＰＢＳで洗浄し、タンジェンシャルフロー濾過（Ｐａｌｌ Ｍｉｎｉｍａｔｅ）によって濃縮した。精製されたＥＶを－８０℃で貯蔵した。ＥＶを、Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を使用してそれらのヘモグロビン含量を評価することによって定量化した。

プラスミド
ＤＮＡプラスミド（ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰ、ＬＳＰ－ＦＩＸ－ＨｉＢｉｔ、ＣＡＧ－ＬＣ、ＣＡＧ－ＨＣ）をカスタム合成した。トラスツズマブの完全長重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を、ドラッグバンクデータベースから入手した（受託番号：ＤＢ０００７２）。

オリゴヌクレオチド
全てのオリゴヌクレオチド設計は、ＩＤＴによって合成し、標準的脱塩またはＨＰＬＣによって精製した。

ＮＦ－κＢコンセンサス配列に対するデコイ（ＯＤＮ）－１１ｂｐのＮＦ－κＢ結合配列：ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＴＣＣを含む２２ｂｐの合成オリゴヌクレオチド（Ｄｅ Ｓｔｅｆａｎｏら，「Ａ ｄｅｃｏｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ＮＦ－κＢ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｈａｌａｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＬＰＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒａｔ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．」Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４９．２（２０１３））。
５’～ＧＡＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＧＣ～３’
３’～ＣＴＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＣＧ～５’

スクランブル化ＮＦ－κＢコンセンサス配列（ＳＣＤ）－Ｓｔｏｔｈａｒｄ Ｐ（２０００）Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ：ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２８：１１０２～１１０４からのプログラムを使用して生成された２２ｂｐのＯＤＮをベースとするスクランブル配列。スクランブル配列は、本明細書において説明されるように、同じ残基だが参照配列と比較して順序が異なる残基を含む（例えば、ＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチド）。いくつかの場合において、スクランブル配列は、オリゴヌクレオチドの機能および／または構造を変化させる。いくつかの場合において、スクランブル配列は、オリゴヌクレオチドの機能および／または構造を変化させない。
５’～ＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣ～３’
３’～ＴＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＣＴＣＧＧ～５’

ＲＢＣＥＶの核酸担持
１μｇのＤＮＡを、２０μｇの洗浄したＲＢＣＥＶおよび７μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）における化学的トランスフェクション試薬に加え、穏やかに混合した。反応物を、室温において、穏やかに回転させながら１時間インキュベートした。その後、担持済みのＲＢＣＥＶを１５，０００×ｇでペレット化し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡプラスミドおよびオリゴヌクレオチドによるＲＢＣＥＶの共担持のために、最初に、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドをＲＢＣＥＶと混合し、その後、化学的トランスフェクション試薬を加えた。化学的トランスフェクション試薬を加えた後に、反応物を、室温において、穏やかに回転させながら１時間インキュベートした。担持済みのＲＢＣＥＶを１５，０００×ｇでペレット化し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡをゲル濃度測定によって定量化した。担持反応に加えた核酸の開始量および担持反応の後に回収した核酸の最終量に基づいて、担持効率を計算した。

細胞株およびインビトロトランスフェクション
ＨｅｐＧ２細胞をＡＴＣＣから購入し、ならびにＨｕｈ－７細胞をＥｌａｂｓｃｉｅｎｃｅから購入した。細胞を、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭにおいて培養した。ＴＨＰ－１細胞をＡＴＣＣから購入して、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン－ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地において培養した。全ての細胞株を、５％のＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃に維持した。

インビトロトランスフェクションのために、５０，０００の細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、一晩インキュベートした。トランスフェクションの当日に、担持済みのＲＢＣＥＶを、ＤＮＡプラスミドの定量化に基づいて細胞に送達した。細胞を、２４時間または４８時間インキュベートし、導入遺伝子の発現を分析した。

遺伝子発現の評価
蛍光レポーター遺伝子のために、顕微鏡撮像およびフローサイトメトリーによって遺伝子発現を評価した。顕微鏡撮像のために、ＨｅｐＧ２細胞のＥｐｉ蛍光画像をトランスフェクションの２４時間後または４８時間後にＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｓ２倒立顕微鏡を使用して撮影した。フローサイトメトリー分析のために、ＨｅｐＧ２細胞を、トランスフェクションの２４時間後または４８時間後に、０．０５％のトリプシンによって回収した。回収した細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％のＦＢＳを含むＰＢＳ）に再懸濁させた。ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用した細胞のフローサイトメトリーを実施し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、米国）を使用して分析した。デブリおよび死んだ細胞を排除するために、細胞を最初に、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａに基づいてゲートした（低ＦＳＣ－Ａ）。ダブレットおよび凝集物を排除するために、細胞をさらに、ＦＳＣ幅対ＦＳＣ高さに基づいてゲートした。コントロールとして未処理の細胞を使用して、ＧＦＰ陽性細胞をＦＩＴＣチャネルにおいてゲートし、ならびに、ＰＩ染色細胞をＰＥチャネルにおいてゲートした。ＧＦＰおよび／またはＰＩ染色細胞の割合を評価した。

ＨｉＢｉＴタグ付けされたタンパク質の発現を定量化するためのＮａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ Ｌｙｔｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ－ＨｉＢｉＴタグ付けされたタンパク質の定量化のために、ＰＢＳを使用して試料を１００倍に希釈した。１００μｌの希釈試料を、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ Ｌｙｔｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ Ｌｙｔｉｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、およびＬｇＢｉＴタンパク質からなる同量のＮａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ Ｌｙｔｉｃ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。この混合物を、暗所において室温で１０分間インキュベートした。Ｔｅｃａｎ Ｍ２００マイクロプレートリーダーを使用して、１０００ｍｓの積分時間において、ルミネセンスを測定した。

トラスツズマブの定量化（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）
細胞培養上清におけるトラスツズマブのレベルを、製造元のプロトコルに従って、抗ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡキット（ａｂ２３７６４５，Ａｂｃａｍ）によって特定した。重鎖および軽鎖の両方を含む完全な全抗体の存在下では陽性シグナルのみが生じるという理由から、この検出方法を選択した。

統計分析
結果は、平均±標準偏差（ＤＳ）として表現される。データは、スチューデントｔ－検定、一元配置分散分析／二元配置分散分析、またはピアソンの相関関係によって解析した。平均の間の違いは、ｐ＜０．０５において統計的に有意であると見なした。

結果
二本鎖デコイオリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶはＨｕｈ－７、ＨｅｐＧ２、ＴＨＰ－１細胞株での導入遺伝子の発現を増加させる
ＲＢＣＥＶに、ＤＮＡプラスミドを担持するか（ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰ）、あるいは、ＤＮＡプラスミドと、１２．５～１００ｐｍｏｌの漸増投薬量における、ＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ）オリゴヌクレオチド、スクランブル化（ＳＣＤ）オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ－ＰＳ）オリゴヌクレオチド、またはホスホロチオエート修飾スクランブル化（ＳＣＤ－ＰＳ）オリゴヌクレオチドとを同時に担持した。ＲＢＣＥＶの担持効率を、担持後に測定した。担持済みのＲＢＣＥＶを、それぞれ２００ｎｇ、４００ｎｇ、および５００ｎｇでのＤＮＡプラスミドの等質量（ｅｑｕｉｍａｓｓ ａｍｏｕｎｔ）において、２４ウェルプレート形式で、５０，０００のＨｕｈ－７、ＨｅｐＧ２、またはＴＨＰ－１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を回収し、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによって、ならびに細胞生存率をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用して分析した。コントロールとして未処理の細胞を使用して、ＧＦＰ陽性細胞をＦＩＴＣチャネルにおいてゲートし、ならびにＰＩ陽性細胞をＰＥチャネルにおいてゲートした。

得られた結果は図６に示される。ＤＮＡプラスミドとＯＤＮまたはＳＣＤオリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした細胞において、ＧＦＰの発現の増加が観察された。共担持済みのＲＢＣＥＶは、いくつかの場合において、導入遺伝子の発現をおよそ２、３、４、５、または６倍増加させた。単一のＤＮＡプラスミドおよびＯＤＮを共担持したＲＢＣＥＶによって処理した細胞は、細胞でのＤＮＡペイロードのトランスフェクション効率および発現の増加を示した。トランスフェクション効率および導入遺伝子の発現における増加は、用量依存性であることが観察された。詳細には、各場合において、導入遺伝子の発現は、より多いオリゴヌクレオチド用量の投与の後により大きな増加を示した。オリゴヌクレオチドによる予備処理は、細胞生存率に負の影響を及ぼさなかった。

二本鎖デコイオリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶの投与はＢＬ／６およびＳＣＩＤマウスでの導入遺伝子の発現を増強する
ＲＢＣＥＶに、ＬＳＰプロモーターの下でｈＦＩＸ－ＨｉＢｉｔを発現するＤＮＡプラスミドを担持し（ｈＦＩＸ－ＨｉＢｉｔ）、またはＤＮＡプラスミドとＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ）またはスクランブル化（ＳＣＤ）オリゴヌクレオチドとを共担持した。ＲＢＣＥＶに、２つの異なる投薬量のオリゴヌクレオチドを２５ｐｍｏｌ（低用量；ＯＤＮ－２５およびＳＣＤ－２５）または１００ｐｍｏｌ（高用量；ＯＤＮ－１００およびＳＣＤ－１００）において共担持した。この特定の実験では、担持済みのＲＢＣＥＶを、４ｍｇ／ｋｇの固定されたＤＮＡプラスミド用量において、静脈内尾静脈注射によってＢＬ／６マウスに投与した。投与後の１日目、３日目、および７日目からは週１回、血清を採取して、当該動物におけるＨｉＢｉＴタグ付けされたタンパク質の発現を定量化するために、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ Ｌｙｔｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、導入遺伝子の発現を４９日目まで測定した。

得られた結果は、図７に示される。図から分かるように、１００ｐｍｏｌにおいて高用量のＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶ（ＯＤＮ－１００）は、ルミネセンスによって測定した場合、ＨｉＢｉｔの発現を高めた。高用量のＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチド治療は、結果として、ＤＮＡプラスミドのみを担持したＲＢＣＥＶと比較した場合、１日目から４９日目まで測定した全ての時点でのＨｉＢｉｔの発現を増加させた。

さらに、ＲＢＣＥＶに、３つの成分：モノクローン抗体トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の軽鎖を発現するＤＮＡプラスミド、トラスツズマブ重鎖を発現するＤＮＡプラスミド、およびＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドを共担持した。この特定の実験では、担持済みのＲＢＣＥＶを、４ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇのＤＮＡプラスミド用量において、静脈内尾静脈注射によってＳＣＩＤマウスに投与した。７日目から週１回、血清を採取し、抗体の発現を、抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）ＥＬＩＳＡａｂ２３７６４５、Ａｂｃａｍ）を使用して４９日目まで測定した。

得られた結果は図８に示される。トラスツズマブの発現は、単一の２シストロン性ベクターを担持したＲＢＣＥＶと比較して、トラスツズマブ軽鎖および重鎖プラスミドを等モル比において共担持したＲＢＣＥＶで処置したマウスの血清において増加した。共担持済みのＲＢＣＥＶは、いくつかの場合において、トラスツズマブの発現をおよそ２、３、４、５、または６倍増加させた。

二本鎖デコイオリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶは、ＩＶ注射の後にタイプＩインターフェロン（ＩＦＮ）の放出を抑制する
この特定の実験では、ＲＢＣＥＶに共担持したデコイオリゴヌクレオチドまたはスクランブル化オリゴヌクレオチドの免疫学的効果を評価するために、免疫反応の測定として、タイプＩ ＩＦＮ放出をアッセイした。ＤＮＡプラスミドとＮＦ－κＢデコイ（ＯＤＮ）オリゴヌクレオチドまたはスクランブル化（ＳＣＤ）オリゴヌクレオチドとを共担持したＲＢＣＥＶの静脈内尾静脈注射の後に、タイプＩ ＩＦＮの分泌を定量化した。担持済みのＲＢＣＥＶの注射後０、６、および２４時間において、血液を採取した。ＩｎｖｉｖｏＧｅｎマウスＩＦＮ－β生物発光ＥＬＩＳＡキットおよびマウスＩＦＮα生物発光ＥＬＩＳＡキットを使用して、タイプＩ ＩＦＮ誘発をマウス血清から定量化した。

得られた結果は図９に示される。プラスミドペイロードのみを担持したＲＢＣＥＶの投与は、インビボにおいてタイプＩ ＩＦＮを誘発した。ＤＮＡプラスミドのみを担持したＲＢＣＥＶ（ＥＶ－ＮＰ）を受けたマウスにおいて、ＩＦＮαおよびβのレベルにおけるスパイクを、注射後６時間において検出した。しかしながら、Ｆ－κＢデコイの追加により共担持したＲＢＣＥＶを注射した動物は、注射後６時間においてＩＦＮαおよびβのレベルの著しい低下を示した。いくつかの場合において、タイプＩ ＩＦＮの放出は、共担持済みのＲＢＣＥＶによっておよそ２または３倍抑制された。ＲＢＣＥＶへのＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドの共担持は、ＮＦ－κＢデコイを担持していないＲＢＣＥＶと比較して、インビボでのタイプＩ ＩＦＮの誘発を減少させた。

異なる二本鎖デコイオリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶも、Ｈｕｈ－７およびＨｅｐＧ２細胞株での導入遺伝子の発現を増加させる
ＲＢＣＥＶによるインビトロでの導入遺伝子の発現に対する効果を評価するために、異なる二本鎖オリゴヌクレオチドを用いた。表１は、設計されＲＢＣＥＶを用いて試験された二本鎖ＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドの配列を示している。ＲＢＣＥＶは、ＣＭＶプロモーターの下でｃｏｐＧＦＰを発現するＤＮＡプラスミドを担持するか（ＣＭＶ－ｃｏｐＧＦＰ）、または、１００ｐｍｏｌのアニール処理されたＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドと共に、ＤＮＡプラスミドを共担持した。担持済みのＲＢＣＥＶを、それぞれ４００ｎｇおよび２００ｎｇでのＤＮＡプラスミドの等質量において、２４ウェルプレート形式で５０，０００のＨｅｐＧ２およびＨｕｈ－７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間および４８時間後に細胞を回収し、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによって、ならびに細胞生存率をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用して分析した。

得られた結果は図１０に示される。ＤＮＡプラスミドおよびオリゴヌクレオチド設計を共担持したＲＢＣＥＶで処理した細胞は、ＤＮＡプラスミドのみを担持したＲＢＣＥＶと比較して、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７細胞でのトランスフェクション効率およびＤＮＡペイロードの発現の増加を示した。全てのオリゴヌクレオチド設計は、細胞生存率を減少させることなく、オリゴヌクレオチドを欠く対応するグループよりある程度のレベルの増進の増加を達成した。共担持済みのＲＢＣＥＶは、いくつかの場合において、導入遺伝子の発現をおよそ２、３、４、５、または６倍増加させた。共担持済みのＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした細胞での導入遺伝子の発現は、設計の組成、長さ、および構造に依存して、各オリゴヌクレオチド設計によって変わった。例えば、末端修飾から全長修飾までのオリゴヌクレオチドにおけるホスホロチオエート結合の増加は、トランスフェクション効率を減少させた。２２塩基対から１１塩基対へのｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの長さの減少は、ＤＮＡプラスミドのトランスフェクション効率を減少させた。リボン形オリゴヌクレオチド設計は、他の全ての設計より優れており、それは、オープンエンドのオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解の減少によるより長い間の半減期に起因し得る。

二本鎖ベイトオリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶはＨｕｈ－７、ＨｅｐＧ２、ＴＨＰ－１細胞株での導入遺伝子の発現を増加させる
ＲＢＣＥＶに、２つのＤＮＡプラスミド（一方はｅＧＦＰをコードし、もう一方はＦＩＸ－ＨｉＢｉｔルシフェラーゼリポーターコンストラクトをコードする）を担持し、あるいは、当該２つのプラスミドと、表２に記載される自己相補性の一本鎖（例えば、１つまたは複数の二本鎖部分とステムループ構造とを含む）ベイトオリゴヌクレオチドとを、化学的トランスフェクション試薬による１～２μｇの漸増投薬量において、同時に担持した。表２のベイトオリゴヌクレオチドは、二本鎖破壊（Ｄｂａｉｔ）または一本鎖破壊（Ｐｂａｉｔ）を模倣する短鎖干渉ＤＮＡ分子（ｓｉＤＮＡ）である。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）および／またはポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）活性化を促進することが知られている（例えば、Ｃｒｏｓｅｔら，「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｐａｉｒ ｂｙ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＡＲＰ ｗｉｔｈ ｓｉＤＮＡ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４１．１５（２０１３）を参照されたい）。ＲＢＣＥＶの担持効率を、担持後に測定した（図１１）。担持済みのＲＢＣＥＶを、２００ｎｇの担持済みのＲＢＣＥＶの等質量において、１００，０００のＨｕｈ－７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、上清を回収し、導入遺伝子の発現を推定するために、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴアッセイを実施し、ならびに、細胞を回収し、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによって分析した。

得られた結果は図１２に示される。図から分かるように、ベイトオリゴヌクレオチドを担持したいくつかのＲＢＣＥＶ組成物は、両方の導入遺伝子の発現を増加させた。詳細には、Ｐｂａｉｔ３２、Ｐｂａｉｔ３２Ｌ、Ｄｂａｉｔ８Ｈ、およびＤｂａｉｔ３２Ｈｃは、様々な投薬量において、ｅＧＦＰおよびＦＩＸ－ＨｉＢｉｔ発現の両方を増加させた。これらの結果は、とりわけ、ＲＢＣＥＶに共担持された場合に、ペイロード核酸のレベル、発現、および／または活性を増加させる、二本鎖促進オリゴヌクレオチドの効果を強調している。

実施例３
本実施例は、一本鎖オリゴヌクレオチドによるＲＢＣＥＶへの共担持が、インビトロにおいて送達された場合に、導入遺伝子に対する免疫反応も抑制しつつ、導入遺伝子の発現を増加させることができることを実証する。詳細には、共担持済みのＲＢＣＥＶが異なる組織器官の複数のヒト細胞株に送達された後に、導入遺伝子の発現および炎症性サイトカインの発現を評価した。

ＲＢＣＥＶに、ｈＦＩＸ－ＨｉＢｉｔルシフェラーゼリポーターコンストラクトを発現するＤＮＡプラスミドを担持するか、あるいは、ｈＦＩＸ－ＨｉＢｉｔルシフェラーゼリポーターコンストラクトを発現するＤＮＡプラスミドと、二本鎖オリゴヌクレオチド（スクランブル化、ＮＦ－κＢデコイ）または一本鎖オリゴヌクレオチドとを共担持した。表３は、設計されＲＢＣＥＶによって試験された一本鎖のＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドの配列を示している。１００，０００のＨｕｈ７およびＨｅｐＧ２細胞を、２００ｎｇのＤＮＡプラスミドを含む担持済みのＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後の１日目に、細胞培養培地を採取し、導入遺伝子の発現を推定するために、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴアッセイを実施した。

得られた結果は図１３に示される。一本鎖オリゴヌクレオチドの複数の異なる設計は、オリゴヌクレオチドを担持していないＲＢＣＥＶと比較して、導入遺伝子の発現を増加させた。詳細には、一本鎖オリゴヌクレオチドを担持したＲＢＣＥＶは、ＦＩＸ－ＨｉＢｉｔコンストラクトを共担持した場合、複数の細胞株においてＦＩＸ－Ｈｉｂｉｔ発現および／または活性を増加させた。

さらに、ＲＢＣＥＶに、ｈＦＩＸ－ＨｉＢｉｔルシフェラーゼリポーターコンストラクトを発現するＤＮＡプラスミドを担持するか、あるいは、ｈＦＩＸ－ＨｉＢｉｔルシフェラーゼリポーターを発現するＤＮＡプラスミドと、二本鎖オリゴヌクレオチド（スクランブル化、ＮＦ－κＢデコイ）または一本鎖オリゴヌクレオチドとを共担持した。表３は、設計されＲＢＣＥＶを用いて試験された一本鎖ＮＦ－κＢデコイオリゴヌクレオチドの配列を示している。５００，０００のＴＨＰ－１細胞株に、２０００ｎｇのＤＮＡプラスミドを含む担持済みのＲＢＣＥＶを用いてトランスフェクトし、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による遺伝子発現分析のために、トランスフェクションの６時間後に細胞を回収した。

得られた結果は図１４に示される。図から分かるように、ある特定の一本鎖オリゴヌクレオチドを共担持したＲＢＣＥＶは、細胞に送達されたとき、サイトカインの発現を抑制することができる。詳細には、一本鎖オリゴヌクレオチドの複数の異なる設計は、ＩＦＮｂ１、ＩＬ６、ＣＸＣＬ１０、および／またはＣＣＬ２の遺伝子発現を減少させた。これらの結果は、ペイロード核酸の送達に関連する炎症および／またはそれ以外の望ましくない効果もしくは反応（例えば、サイトカイン発現）を減少させる一本鎖促進オリゴヌクレオチドの効果を例示している。

Claims (40)

1. カーゴを担持した細胞外小胞の集団であって、カーゴが、少なくとも２つの異なる核酸分子を含み、集団が、トランスフェクション試薬の存在下において、細胞外小胞をカーゴと接触させることによって調製される、集団。
2. トランスフェクション試薬が、カチオン性脂質試薬である、請求項１に記載の集団。
3. トランスフェクション試薬が、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｅｘｏｆｅｃｔ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および直鎖状ポリエチレンイミン塩酸塩からなる群から選択される、請求項２に記載の集団。
4. トランスフェクション試薬が、２５，０００Ｄａまたは４０，０００Ｄａの平均分子量を有する直鎖状ポリエチレンイミン塩酸塩である、請求項３に記載の集団。
5. トランスフェクション試薬が、ＰＥＩＭａｘ（商標）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）またはｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）である、請求項４に記載の集団。
6. カーゴを担持した細胞外小胞であって、カーゴが、少なくとも２つの異なる核酸分子を含む、細胞外小胞。
7. 少なくとも２つの異なる核酸分子が、非同一配列を有する、請求項６に記載の細胞外小胞。
8. 少なくとも２つの異なる核酸分子が、異なるタイプの核酸分子である、請求項６または７に記載の細胞外小胞。
9. 核酸分子が、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、ダンベル型ＤＮＡ最小ベクター、ＲＮＡミニサークル、環状ＤＮＡ、直鎖状二本鎖ＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ－相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ギャップマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および発現ベクターからなる群から選択される、請求項６～８のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
10. カーゴが、ＤＮＡおよびＲＮＡ、少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ分子、プラスミドおよびｇＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ、プラスミドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミドおよびｓｉＲＮＡを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
11. カーゴが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムの構成要素を含む、請求項６に記載の細胞外小胞。
12. カーゴが、ｇＲＮＡ分子、およびヌクレアーゼをコードする核酸分子を含み、好ましくは、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ１２ヌクレアーゼである、請求項１１に記載の細胞外小胞。
13. ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡまたはｐｅｇＲＮＡである、請求項１２に記載の細胞外小胞。
14. カーゴが、ＤＮＡ修復テンプレートをさらに含む、請求項１２または１３に記載の細胞外小胞。
15. 抗原結合性分子またはその断片をコードするｍＲＮＡまたはプラスミドを含む細胞外小胞。
16. 抗原結合性分子の第１のポリペプチドをコードする第１の核酸および抗原結合性分子の第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む、請求項１５に記載の細胞外小胞。
17. 抗原結合性分子が、抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１５または１６に記載の細胞外小胞。
18. 抗原結合性分子が、抗体またはｓｃＦｖである、請求項１７に記載の細胞外小胞。
19. 赤血球に由来する、請求項６～１８のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
20. 細胞外小胞を含む組成物であって、組成物中の細胞外小胞の少なくとも１つが、請求項６～１９のいずれか一項に記載の細胞外小胞である、組成物。
21. カーゴを細胞外小胞に担持する方法であって、
    ａ．細胞外小胞に担持されるカーゴ分子を含む混合物を提供する工程；および
    ｂ．細胞外小胞にカーゴ分子を担持するのに十分な条件下において細胞外小胞を接触させる工程；
    を含み、カーゴ分子の記混合物が、少なくとも２つの異なる核酸分子を含む、方法。
22. 混合物が、トランスフェクション試薬をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 混合物が、少なくとも２つの異なる核酸分子を、約１：１または２：１～１：２の間または３：１～１：３の間の比において含む、請求項２１または２２に記載の方法。
24. 少なくとも２つの核酸分子を組み合わせて核酸分子の混合物を提供する工程、およびその後の、カーゴ分子の混合物をトランスフェクション試薬と接触させる工程によって混合物が調製される、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 少なくとも２つの異なる核酸分子が、非同一配列を有する、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 少なくとも異なる２つの核酸分子が、異なるタイプの核酸分子である、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 核酸分子が、ＤＮＡプラスミド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ－相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ギャップマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、発現ベクター、環状ＤＮＡ、直鎖状二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、ダンベル型ＤＮＡ最小ベクター、およびＲＮＡミニサークルからなる群から選択される、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. カーゴが、ＤＮＡおよびＲＮＡ、少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ分子、プラスミドおよびｇＲＮＡ、またはｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ、プラスミドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミドおよびｓｉＲＮＡを含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. カーゴが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムの構成要素を含む、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. カーゴが、ｇＲＮＡ分子、およびヌクレアーゼをコードする核酸分子を含み、好ましくは、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ヌクレアーゼである、請求項２９に記載の方法。
31. カーゴが、抗原結合性分子をコードする２つ以上の核酸分子を含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
32. 細胞外小胞が、抗原結合性分子の第１のポリペプチドをコードする第１の核酸および抗原結合性分子の第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む、請求項３１に記載の方法。
33. 細胞外小胞が、赤血球に由来する、請求項２１～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. ２つ以上の核酸を細胞に送達する方法であって、細胞を１つまたは複数の請求項６～２０のいずれか一項に記載の細胞外小胞と接触させる工程を含む方法。
35. 治療方法における使用のための、請求項６～２０のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
36. 請求項６に記載の細胞外小胞を、治療と必要とする対象に投与する工程を含む治療方法。
37. 疾患または障害の治療のための医薬品の製造における、請求項６～２０のいずれか一項に記載の細胞外小胞の使用。
38. 請求項３５～３７に記載の、使用のための細胞外小胞、治療方法、または使用であって、治療方法が、遺伝病、炎症性疾患、がん、自己免疫疾患、心血管疾患、または消化器系疾患を患う対象への請求項６～２０のいずれか一項に記載の細胞外小胞の投与を伴う、使用のための細胞外小胞、治療方法、または使用。
39. 対象ががんを有し、がんが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、肺がん、肝臓がん、結直腸がん、上咽頭がん、腎がん、または神経膠腫から選択されてもよい、請求項３８に記載の、使用のための細胞外小胞、治療方法、または使用。
40. 方法が、核酸カーゴによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現による患者における疾患の治療を伴う、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の、使用のための細胞外小胞、治療方法、または使用。