JP5567466B2 - 全身性遺伝子送達のための抗体フラグメント標的化イムノリポソーム - Google Patents
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Description
本発明は、リピドタグ抗体フラグメント標的化リポソームを含む抗体フラグメント標的化リポソーム(「イムノリポソーム」)を調製するための方法、イムノリポソームを使用するインビトロトランスフェクションのための方法、およびインビボにおける全身性遺伝子送達のための方法を提供するものである。本発明のリポソームは、標的化遺伝子送達を行うのに有用であり、全身投与後の効率的な遺伝子発現のために効果的である。送達系の特異性は、標的化抗体フラグメントから誘導される。
生物工学における発展は、Mabからの特異的な認識ドメインの誘導を可能にした(Poon RY, (1997) Biotechnology International: International Developments in the Biotechnology Industry.pp.113-128)。重鎖および軽鎖の多様な領域の組換えと、そのシングルポリペプチド内への組込みは、標的化の目的のために単鎖抗体誘導体(scFvを設計)を使用することの可能性を提供する。癌胎児性抗原に対して指向したscFv、HER-2、CD34、黒色腫関連抗原およびトランスフェリン受容体を提示するように作製したレトロウイルスベクターが開発された(Jiang A, et al.,J. Virol(1998)72:10148-10156, Konishi H. et al., Hum Gene Ther.(1994)9:235-248:Martin F, et al., Hum. Gene Ther.(1998)9:737-746)。ウイルスを指向したこれらのscFvは、特別な抗原を発現する細胞のタイプに特異的に結合および感染する標的を示している。さらに、少なくとも癌胎児性抗原の場合、scFvは、親の抗体と同じ細胞特異性を持つことが示されている(Nicholson IC, Mol. Immunol.(1997)34:1157-1165)。
我々は、ヒト遺伝子治療の際に使用するための、核酸の腫瘍を標的化した全身送達を可能にする多様なイムノリポソームを構築した。下記の実施態様に示したデータに基に、これらのTfRscFvを組込んだイムノリポソームDNA複合体は、完全なTf分子を持つ同じリポソームDNA複合体より高いレベルのトランスフェクション効率をもたらし得る。そのため、本発明の一態様において、本発明のイムノリポソームは、トランスフェリン受容体を発現する多様な哺乳動物細胞型の高いトランスフェクション効率のためのキットを作製するために使用することが可能である。本発明の一態様において、我々は、リピドが細菌細胞によって自然に加えられ、scFvを不活性化させ得る化学反応を回避しながらリポソームへのscFvの組込みを容易にするように、リピドタグを有するscFvタンパク質を構築した。
本発明は、イムノリポソームを目的とし、該イムノリポソームを作製および使用する方法を目指すものである。様々なタグをつけたイムノリポソームおよびscFvをリポソームに結合する多様な方法を含む多様な態様を開示する。イムノリポソームは、リピドタグを含むか、または還元基、好ましい態様においては遊離メルカプト基を介して結合してもよい。
本発明を次の実施例で説明する。
生合成的リピドタグscFvの構築および発現
TfRscFvに関する発現ベクターの構築
I.発現ベクターを構築するために、E.coliリポプロテインシグナルペプチド(ssLPP)と該scFvクローニング部位との間のアミノ酸リンカー配列を含むベクターpLP1を使用した(de Kruif et al. FEBS Lett. (1996)399:232-236)。このベクターは、発現したscFvの精製および検出のために使用し得るc−mycとHis6タグ配列の両方を含む(図1)。
我々は、E.coli発現宿主SF110F’を上記構築した発現ベクターを用いて形質転換した。宿主細胞は不安定ではないが、発現したlac受容体を含むのが好ましい。多くのクローンを選別し、最良の収率でscFvを生成する一つのクローンが選択された。リピド修飾scFv(lpp-scFv)を、Kruif ら(de Kruif et al., FEBS Lett.(1996)399:232-236)によって記載されたようにTriton X-100を使用する細菌膜から単離した。精製するために、単一コロニーを5%グルコースと適当な抗菌剤を含むLB(200μl)中で再懸濁した。該混合物を、5%グルコースと適当な抗菌剤を含む2枚のLB寒天プレート(90mm)上に塗布し、一晩増殖した。翌日、該細胞を、プレートから洗浄し、0.1%グルコースと適当な抗菌剤を含むLB(全量5リットル)の播種に使用した。該培養物を、OD600が0.5〜0.7に達するまで、6時間、25℃、200rpmで増殖した。IPTGを、1mMの終濃度まで添加し、該培養物をさらに一晩インキュベートした。翌日、該細菌培養物を、遠心分離で回収し、200mlの溶解緩衝液で、室温で30分間溶解した。該試料を、氷上で冷やしながら28ワットで5分間音波処理を行った。該分解緩衝液は、20mM HEPES(pH7.4〜7.9)、0.5mM NaCl、10%グリセロール、および0.1mM PMSFを含む。引用したプロトコールからの逸脱は、各々20および200mM イミダゾールを含む、20mM HEPES(pH7.4〜7.9)、0.5M NaCl、10%グリセロール、0.1mM PMSF、1%n−オクチルβ−D−グルコシド(OG)、そして10%グリセロールを含む緩衝液でメタル・アフィニティーカラムの洗浄および溶出を行うことのみである。lpp−scFvの溶出試料を、SDS−PAGEおよび抗c−myc抗体9E10を用いてウエスタン・ブロットで分析し、精製scFvが約30kDaのバンドを示すことを確認した。
脂質膜可溶化法によるリピドタグscFvイムノリポソームの調製
この実施例は、リピドタグscFvイムノリポソームを調製するために脂質膜可溶化法に関する詳細な方法を開示する。クロロホルム中のリピド(5μmol、DOTAP/DOPE、1:1モル比)を、減圧下で蒸発させ、丸底ガラスフラスコ中で乾燥リピド膜を得た。リピド膜に、0.5mlの、リピド修飾scFvを含む1%OG、20mM HEPES、150mM NaCl(pH7.4)を添加した。これを、室温で、10〜20分間インキュベーションし、次いでリピド膜を撹拌で混合し、溶解した。次いで、滅菌水(2ml)を添加し、scFvリピド混合物を希釈した。該溶液を、20℃で、バス型ソニケーターにより短時間音波処理し、透明にした。該scFv−リポソームは限られた量の残存界面活性剤OGを有する透明な溶液である。該OGおよび非複合体scFvを、SepharoseCL-4BもしくはSephacrylS500を使用するクロマトグラフィーによって除去し得るが、それらは後の使用において干渉しない。
ダイレクト・アンカー法によるリピドタグscFvイムノリポソームの調製
この実施例は、リピドタグscFvイムノリポソームを調製するためにダイレクト・アンカー法を提示する。丸底ガラスフラスコ内の乾燥リピド膜として調製したリピド(20μmol、リピドA−H、組成および比は以下を参照)を、純水(10ml)に添加し、バス型ソニケーターで、室温(リピドA、B、C)もしくは65℃(リピドD、E、G、Hもしくは全てのコレステロール(Chol)との任意の組成物)で、10〜30分間音波処理した。調製した該カチオンリポソームは、透明な溶液であり、その組成および比は以下である。
ELISA、FACSおよび免疫蛍光法によって示したリピドタグscFvイムノリポソームの免疫活性
この実施例は、TfR(+)細胞への結合能に関する抗TfRscFvイムノリポソームの特徴を提供するものである。該ヒト前立腺癌細胞系DU145および頭部および頚部のヒト扁平上皮細胞癌細胞系JSQ−3は、これらの研究に対するTfR+標的細胞として機能する。
表1:JSQ−3への抗TfRscFvリポソームの結合
表2:JSQ−3およびDU145へのTfRscFvリポソーム結合のFACS分析
インビボでの標的細胞のscFvイムノリポソーム介在遺伝子トランスフェクションの至適化
我々は、レポーター遺伝子としてβガラクトシダーゼを用いるJSQ−3細胞における抗TfRscFvLip(A)複合体のトランスフェクション効率を測定した。これらの研究において、使用したレポーター遺伝子構築物は、CMVプロモーター(pCMVb)制御下でβガラクトシダーゼ遺伝子を含み、その同じプロモーターをpCMVp53に使用した(図3)。トランスフェクションした細胞におけるβGla発現レベル(トランスフェクション効率と相関する)は、βGal酵素アッセイで評価した(XuL, et al.,Hum. Gene Ther.(1997)8:467-475)。表3に示したように、抗TfRscFvのLipAへの結合は、非標的化リポソーム複合体と比較すると、scFv-Lip(A)-pCMVbトランスフェクションした細胞における酵素活性が2倍であった。この発現レベルは、トランスフェリン自身を標的化リガンド(Tf-Lip(A)-pCMVb)として使用した場合に観察される発現レベルと視覚的に実際に同一であった。さらに、遺伝子発現における増加は、レポーター遺伝子DNA用量依存性であることが示された。表4は、JSQ-3細胞におけるscFvリポソーム介在トランスフェクションの至適化を示す。
表3:抗TfR−リポソームによるJSQ−3細胞のトランスフェクション
化学療法薬への感受性を生じる腫瘍細胞を標的とするscFvイムノリポソーム介在p53遺伝子トランスフェクション
1.インビボにおけるリポソーム介在wtp53遺伝子トランスフェクションを促進した抗−TfRscFv
抗TfR−scFv標的化Lip(A)−p53−3’Adによって遺伝子移入したJSQ−3腫瘍細胞における外来性wtp53の発現を、p53応答性プロモーターの制御の下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む発現プラスミド(pBP100)のトランスフェクションによって評価した(Chen L.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1998)95:195-200)。結果として、外来性wtp53の発現レベルが高くなると、ルシフェラーゼ活性のレベルも高かった。このルシフェラーゼ酵素活性は、相対的光単位(RUL)として表現した。上記に示したように、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子と、Lip(A)−p53−3’Ad複合体への標的化剤としての抗TfRscFvの添加は、非標的化Lip(A)−p53−3’Ad複合体を超えるトランスフェクション効率とwtp53タンパク質の発現の大きな増加をもたらした(ルシフェラーゼ活性のRLUによって表現される)。再び、scFv−Lip(A)−p53−3’Adトランスフェクション細胞におけるp53発現レベルは、トランスフェリンそれ自身を、標的化リガンド(Lip(A)−p53−3’Ad)として使用した場合に観察されたレベルと非常に類似する。そのため、これらの知見は、抗TfR単鎖抗体方法が、腫瘍細胞への標的化カチオンリポソーム複合体を標的化し、生物学的に活性なwtp53遺伝子を送達する有用な方法であることを示す。
表5:JSQ−3細胞での異なるリポソームによって仲介されたインビトロでのp53発現
p53誘導アポトーシスの研究に対して、マウス黒色腫細胞系B16を、2セットの6ウェルプレートに、5μgのDNA/2×105細胞の用量で、p53−3’Ad(図4)またはpCMVpRoプラスミド(図3)DNA(それぞれ、scFv−Lip(A)−p53およびscFv−Lip(A)−pRo)との抗TfRscFvイムノリポソーム複合体でトランスフェクションを行った。比較のために、トランスフェリン−リポソーム−DNA(LipT−p53もしくはLIpT−pRo)も、5μgDNA/2×105細胞の用量で遺伝子移入した。24時間後、CDDPを、一組のプレートに、終濃度10μlまで添加した。薬物添加後の24および48時間、付着および浮遊細胞の両方を、アポトーシスの染色のために回収した。細胞を、製造元プロトコールに従って、アネキシン(Annexin)V−FITCキットで染色した(Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD)。アネキシンVは、リポコルチンであり、天然に存在する血液タンパク質と抗凝固薬ある。染色細胞は、FACStarサイトメーター上で測定した(Becton and Dickinson)。表6は、アポトーシス分析の結果のまとめである。
表6:リポソームp53遺伝子修復およびCDDPによって誘導されたB16細胞のアポトーシス
全身投与による、インビボにおけるscFvイムノリポソーム標的化wtp53遺伝子の送達および発現
リポソームを含有する抗TfRscFvの能力を試験するために、wtp53をインビボにおいて腫瘍細胞へ特異的に送達するために、scFv−Lip(A)p53−3’Ad(図4)または非標的化Lip(A)−p53−3’Ad(図4)を、JSQ−3皮下異種移植片の腫瘍細胞を有するヌード・マウスに静脈注射した。注射2日後、腫瘍細胞を摘出し、ウエスタン・ブロット分析のために肝臓および皮膚に加えて該腫瘍細胞からタンパク質を単離した(Xu L, et al., Hum. Gene Ther.(1997)8:467-475)。等量のタンパク質(100μg、濃度によって決定する場合)を、各々のレーンに流した。図2に示したように、scFv−Lip(A)p53−3’Ad複合体で全身的に処置したマウス由来の腫瘍(図2の標識scFv−Lip(A)−p53)は、非常に強いp53シグナルを示し、外来性のwtp53の高い発現レベルに関するさらに追加の低いバンド表示を示し、一方で、外来性マウスp53の非常に低い発現が、皮膚おび肝臓の双方においてのみであることが明らかとなった。対照的に、我々の初期段階の結果を基に期待していたように、非常低いレベルの外来性p53発現が非標的化Lip(A)p53−3’Ad注入マウス、図2中の標識化Lip(A)−p53から単離した腫瘍細胞において明らかである。すなわち、我々の新規でかつ独創的な抗TfRlpp−scFvリガンドによって標的化したリポソーム複合体は、外来性遺伝子を、インビボで腫瘍細胞に選択的に送達することができることは明らかである。これらの結果は、効率よく標的化する新規の方法の潜在性が、全身に、インビボで腫瘍に特異的にカチオンリポソーム複合体を送達したことを示すものである。
接合(コンジュゲーション)法で使用するための3’システインを用いるTfRscFvの構築および精製
リピドタグの非存在下、別の方法を考案し、リポプレックスに精製TfRscFvタンパク質を結合した。このアプローチは、還元基、例えばメルカプト基によるカチオンリポソームへの単鎖タンパク質の接合を目的とする。好ましい態様において、システイン残基を、TfRscFvタンパク質の3’末端に付加する。このシステインの還元は、カチオンリポソームに接合し得る遊離のメルカプト基において生じ、すなわちトランスフェリン受容体を発現する細胞にリポプレックスを標的化するものである。一方、以下の実施例は、還元基としてシステインを用い、他の類似の還元基はこの方法で機能することもまた明らかである。
A.TfRscFvイムノリポソームを製造する接合法において使用するためにヒスチジンタグを有する3’システインを含む発現ベクターの構築
実施例1のように、TfRのためのVH−リンカー−VκscFvを、プラスミド発現ベクター、pDFH2T−vecOKから得た(実施例1に記載)。PCR増幅のための5’プライマー
システイン残基に対するヌクレオチド配列に加えてNotl制限部位を、3’プライマー
ヒトが治療用送達ビヒクルとして使用するためには、ヒスチジンタグなしにTfRscFvが製造されることが好ましい。故に、実施例8、セクション1.A.において記載した該構築を、最終タンパク質生成物においてこのタグを排除するために修飾した。これを達成するために、上記(実施例8、セクション1.A)に記載した同じ5’プライマーを使用した。しかし、異なる3’プライマーを用いた。システイン残基およびNotl制限部位に対するヌクレオチド配列に加えて、このプライマー
接合法を用いるカチオンリポプレックスと結合するためにシステイン残基を含む3つの選択的構築物も作製した。この構築物のために、実施例8、セクション1.Bにおいて上記記載の2つの同じプライマーを使用した(図7)。即ち、ヒスチジンタグは、タンパク質生成物中には存在しなかった。しかし、これらの反応のPCR産物を、異なるベクター、pET37b(+)(Novagen)中にクローン化した。このベクターは、セルロース結合ドメインタグ(CBDTMタグ)とSタグ(両方とも、ベクター中のNcol部位の5’)を含む。該CBDTMタグ配列は、ミクロバイアルセルロースから誘導されたセルロース結合ドメインをコードする。そのため、このタグの存在は、高い特異性、タンパク質生成物の低コストアフィニティー精製のためのセルロースベースの支持体の使用を可能にする。この構築物中に存在するSタグの存在は、ウスタン・ブロットでのタンパク質生成物の簡単な検出、およびタンパク質量の簡単な酵素的定量を可能にする。
発現したlacリプレッサーを含む市販入手し得るE.coli発現宿主BL21(DE3)を、実施例8、セクション1に記載した発現ベクター(3つ全てを個々に用いた)で形質転換した。多くのクローンを選択し、最も収率よくTfRscFv産生するものを選抜した。ヒスチジンタグを有する実施例8、セクション1.Aにおいて、上記の構築物由来のタンパク質の精製は、実施例に詳細に記載するが、同じ方法を、実施例8、セクション1で記載した3つ全ての構築物由来のTfRscFvタンパク質を含有するシステインの精製に使用した。主要なTfRsタンパク質(約90%)は、可溶性で存在するのではなく、封入体中に存在することが明らかとなった。そのため、システインリンカーを含有するTfRscFvを、以下のように封入体から精製した。単一クローンを、50μg/mlのカナマイシン含有LB培地(5〜10ml)で培種し、37℃、250rpmで、0.5〜0.7のOD600になるまで(4〜5時間)増殖させた。この少量の培養物の30mlを沈殿させ、LB培地(ブロス)で懸濁し、50μg/mlのカナマイシン含有LB培地(1L)に添加し、37℃、250rpmで、OD600が0.5〜0.7になるまで(4〜5時間)増殖させた。TfRscFvタンパク質の発現を誘導するために、終濃度1mMのIPTGをこの時点で添加し、さらに4時間インキュベーションを継続した。この時点がタンパク質発現の最高レベルをもたらすことを決定した。次いで、バクテリア培養物を遠心分離で回収し、15分間、30℃で、リゾチーム(100μg/ml)を含有する20mMの冷Tris−HCl(pH7.5、100ml)で溶解した。試料を、氷上、10ワットで5分間(30秒のバースト)音波処理した。この封入体を、遠心分離(13000g、15分間)で単離した。得られた沈殿物を、20mMの冷Tris−HCl緩衝液(pH7.5)で3回洗浄した。封入体の精製度と量を、可溶化前にSDSポリアミドゲル電気泳動によって決定した。
接合法によるscFvリポソームの調製
1.scFvの還元
精製したTfRscFvを、DTTにより還元し、モノマーscFv-SHを以下のように得た:HBS(10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4)中のscFvに、1M DTTを、1〜50mM の終濃度になるまで添加した。室温で、5〜10分間の回転後、該タンパク質を、10−DGカラム(Bio-Read)で脱塩した。遊離SH基を5,5’ジチオビス−(2−ニトロベンゼン酸)(DTNB、Ellman's 試薬)によって測定し(G.L. Ellman (1959)Arch. Biochem. Biophys. 82:70-77. P.W.Riddles, R.L.Blakely, B.Zeruer(1993)Methods Enzymol. 91:49-60)、SH/タンパク質モル比もしくは遊離SH/scFv分子の数として計算した(表7)。この結果は、1〜10mMDTTが、scFv還元に供されたことを示す。
表7:TfRscFvの還元
4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート−DOPE(MPB−DOPE)(Avanti Polar Lipids)は、リピド総量の5〜8%モルまで、実施例3に記載した7つのリポソーム製剤中に包含される。MPBリポソームを、実施例3に記載したのと同じ方法で調製した。他のリポソーム調製方法を、カチオンリポソームを調製するために使用することができる。例えば、Campbell MJ (Biotechniques 1995 Jun; 18(6):1027-32)によって記載された方法から改良されたエタノール注射法は、本発明において上手く使用された。簡単に言うと、全てのリピドを、エタノール中に可溶化し、混合し、ハミルトン(Hamilton)シリンジを用いて、50〜60℃の純水中に撹拌しながら注入した。該溶液を、さらに10〜15分間、撹拌した。この溶液の終濃度は、1〜2mMの全リピドであった。エタノール注入方法は、敏速かつ容易で確実である。終濃度10〜20mMになるまで、1M HEPES、pH7.5(pH7.0〜8.0)を添加した。我々は、マレイミド基が水溶液中(pH7.0以上)で不安定であるとわかったので、該リポソームを、水(pH5〜6.5)中で調製した。pHは、後の被覆反応を容易にするために、scFv−SHに結合する前に、1M HEPES緩衝液(pH7.0〜8.0)を用いて7.0〜8.0に調整されるはずである。
scFv−SHを、1/5〜1/40のタンパク質/リピド(w/w)比、好ましくは1/10〜1/20の比で、MPB−リポソームに添加した。該溶液をゆっくりと、30分間、室温で回転して混合し、scFv−Lipを生成した。scFv−Lipを精製せずに使用したが、Sepharose CL-4Bカラムクロマトグラフィーで精製することが可能である。プラスミドDNAを水で希釈し、1/6〜1/20、好ましくは1/10〜1/14のDNA/リピド(μg/nmol)比でscFv−Lipに添加した。該溶液を、数回反転させて、5−15分間充分に混合し、scFv−Lip−DNA複合体を生成した。scFv−Lip−DNAは精製せずに使用したが、Sepharose CL-4Bカラムクロマトグラフィーで精製することが可能である。80〜100%のscFvがリポソームに接合していたことが分かった。
プラスミドDNAを水で希釈し、1/6〜1/20、好ましくは1/10〜1/14のDNA/リピド(μg/nmol)比で、MPBリポソームに添加した。該溶液を、数回反転させて、5〜15分間充分に混合し、MPB−Lip−DNA複合体を生成した。次いで、scFv−SHを、該複合体に1/5〜1/40、好ましくは1/10〜1/20のタンパク質/リピド(w/w)比で添加した。該溶液を、ゆっくりと、30分間、室温で回転させて混合し、最終的なscFv−Lip−DNA複合体を生成した。該scFv−Lip−DNAは精製せずに使用したが、Sepharose CL-4Bカラムクロマトグラフィーで精製することが可能である。80〜100%のscFvがリポソームに接合していたことが分かった。
4.静脈注射のために、50%のデキストロース溶液を、終濃度5%までscFv−Lip−DNAに添加した。
ELISAアッセイによるシステイン含有TfRscFvイムノリポソームの免疫反応活性
この実施例は、インビトロでのTfR(+)細胞への結合能に関して、本発明の接合法によって生成した抗TfRscFv−イムノリポソームの特性化を提供する。ヒト扁平上皮細胞の頭頚部癌細胞系JSQ−3は、これらの研究に関してTfR(+)標的細胞として機能する。
表8:インビトロでの接合法によるJSQ−3へのTfRscFvイムノリポソームの結合
インビボにおける標的細胞の接合TfRscFvイムノリポソーム介在遺伝子トランスフェクション
我々は、プラスミドpLuc(これは、レポーター遺伝子として、CMVプロモータの制御の下、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む)を用いる細胞における接合法によって調製したTfRscFvイムノリポソーム複合体のインビトロでのトランスフェクション効率を決定した。標的リガンドとしてTfRscFvの万能性を示すために、ここでもまた実施例10のように、2つの異なるリポソーム複合体(LIp(A)とLip(B))を、TfRscFvタンパク質に接合した。ヒト乳癌細胞系MDA−MB−435および頭および頚部のヒト扁平上皮瘍細胞を、これらの研究で使用した。インビボでのトランスフェクションを、24ウェルプレートで行った(Xu L, et al., Hum. Gene Yher.(1999)10:2941-2952)。トランスフェクション溶液を、10%の血清存在下、細胞に添加した。24時間後、細胞を洗浄し、ルシフェラーゼ活性およびタンパク質濃度を測定した。該結果は、表9Aおよび9Bに示したように、溶解物中のμgタンパク質あたりの相対的光単位(RLU)として表した。
ヌード・マウス異種移植片モデルにおける全身送達後の野生型p53の接合TfRscFvイムノリポソーム介在発現
この実施例において、本発明の接合法によって生じた全身送達後にインビボで腫瘍細胞に優先的に野生型p53(wtp53)遺伝子を持つリポプレックスを指向するTfRscFvの能力を示す。標的リガンドとしてTfRscFvの万能性を示すために、明細書中の実施例10に示したように、2つの別のリポソーム組成物(Lip(A)およびLip(B))を、接合法によってシステイン含有TfRscFvタンパク質と複合体化した。実施例9において詳細に説明したような前接合法だけを、この研究で用いた。2.5×106MDA−MB−435ヒト乳癌細胞を、4−6週令のメス無胸腺ヌード・マウスに皮下注射した。Martrigel(登録商標)コラーゲン基部膜[Collaborative Biomedical Produsts]中に懸濁した1.1×107DU145ヒト前立腺癌細胞も、4−6週令のメス無胸腺ヌード・マウスに皮下注射し、腫瘍を発生させた。50−200mm3の腫瘍を持つ動物を本実験で使用した(1個体/1試験試料)。wtp53遺伝子を持つ接合TfRscFvイムノリポソーム、さらに非標的化Lip(B)およびwtp53本来の(naked)DNAを動物の尾血管中に静脈注射した。追加対照として、p53含有ベクターの代わりに空ベクターを保持する接合TfRscFv−Lip(A)を、マウスに注入した。実施例7に示したように、注射の約60時間後、該動物を殺し、腫瘍、および肝臓を採取した。タンパク質を組織から単離し、各々の試料(100μg)(タンパク質濃度アッセイにより決定した)を、抗53モノクローナル抗体を用いるウエスタン・ブロット分析のために10%ポリアクリルアミドゲルに流した。これら両方の腫瘍細胞のタイプでは、外来性マウスと外来性ヒトp53は、同じ位置で移動する。明細書においてこの結果は、実施例7における記載を反映するものであった。図9に示したように、接合法によって調製したTfRscFv−Lip(A)−pCMVp53リポプレクッスまたはTfRscFv−Lip(B)−pCMVp53リポプレックスによって静脈注射した動物由来のDU145およびMDA−MB−435腫瘍細胞の両方は、DU145腫瘍細胞において最良の発現と共に、強いp53シグナルとさらに低いバンドによって示されるような、外来性wtp53の高い発現レベルを示した。一方、両方の腫瘍細胞型において、Lip(A)組成物はいくらかLip(B)よりも良好であり、両方のリポソーム組成物はこの方法の万能性を示す。外来性マウスp53タンパク質のみが、これらの動物の肝臓に顕性であった。対照的に、外来性マウスp53タンパク質のみは、空のベクターを有する接合TfRscFv−Lip(B)または本来のwtp53DNAを用いて注入したマウスから取り出した腫瘍に顕性であった。また、p53の発現における若干の増加を、非標的化Lip(B)−p53と共にDU145腫瘍において観察した。即ち、接合TfRscFvイムノリポソームは、優先的に腫瘍細胞へwtp53遺伝子を送達した。この腫瘍標的化は、2つの異なる腫瘍細胞において顕性であり、この発明の方法の広い有用性を示すことも重要である。そのため、実施例において記載した本発明の方法は、カチオンリポソームへの結合能を保持するだけでなく、インビボおよびインビトロにおいてもトランスフェリン受容体への結合能を保持するTfRscFvタンパク質を産生し、即ち、遺伝子治療用に、腫瘍特異性の、標的化イムノリポソームを作製する我々の目的を満たすものであった。
Claims (17)
- 5’から3’の順に
(a)Ad5のマップ単位0から1に存在するヒトアデノウイルス5(Ad5)エンハンサー配列;
(b)サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター;
(c)マルチクローニング部位;
(d)核酸;および、
(e)SV40ポリA配列
を含み、アデノウイルスマップ単位9から16が除去されるように3’末端が切断されている、哺乳動物細胞における遺伝子発現を増強させるための構築物。 - 該哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項1記載の構築物。
- 該核酸が、野生型p53をコードする、請求項1記載の構築物。
- (i)カチオンリポソーム、(ii)細胞標的化リガンド、および(iii)請求項1記載の構築物を含むリポソーム複合体。
- 該核酸が、野生型p53をコードする、請求項4記載のリポソーム複合体。
- 細胞標的化リガンドが抗体または抗体フラグメントである、請求項4記載のリポソーム複合体。
- 抗体フラグメントが単鎖である、請求項6記載のリポソーム複合体。
- 抗体または抗体フラグメントが、リピドタグまたは末端システイン分子を含む、請求項6記載のリポソーム複合体。
- 抗体または抗体フラグメントが、トランスフェリン受容体に結合し得る、請求項6記載のリポソーム複合体。
- 請求項4記載のリポソーム複合体を哺乳動物細胞と接触させることを含む、インビトロで該細胞において遺伝子を発現させる方法。
- 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項10記載の方法。
- 医薬としての使用のための、請求項4記載のリポソーム複合体。
- 治療分子を必要とする動物にそれを提供するための医薬の製造のための、請求項4記載のリポソーム複合体の使用。
- リポソーム複合体が全身投与され得るものである、請求項13記載の使用。
- リポソーム複合体が静脈内投与され得るものである、請求項13記載の使用。
- リポソーム複合体が単鎖抗体フラグメントを含む、請求項13記載の使用。
- 該動物が癌を有する、請求項13記載の使用。
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