JP2002543810A - 外来性核酸を細胞に送達するための核酸−抗体複合体 - Google Patents
外来性核酸を細胞に送達するための核酸−抗体複合体Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、外来性核酸の細胞中への挿入に関連する技術に関する。より詳細には、本発明は、標的細胞中でタンパク質形態で外来性 DNAをin vivo およびin vitroにおいて効果的に発現させることを可能にする、DNA/抗体複合体に関する。
Description
【０００１】
遺伝子治療の目的は、 DNAへの介入を行うことにより、遺伝子の欠陥を補正す
ることである。これは２つのアプローチにより行うことができる：遺伝子異常を
修復することによる遺伝子型の訂正として行うか、あるいは正常型の遺伝子を移
植（導入）して、依然として存在する欠陥遺伝子の補償を可能にすることにより
、表現型を訂正して行うかのいずれかである。遺伝子治療は構成的および後天的
遺伝子疾患の両方の治療に適用される。従って、いくつかの構成的 (体質性) 遺
伝子病は遺伝子治療の候補である；特に、嚢胞性繊維症、デュシェンヌ型筋疾患
またはアデノシンデアミナーゼ欠損症が挙げられる (Cournoyer et al., 1991「
初期のヒト造血前駆細胞へのアデノシンデアミナーゼの遺伝子導入」 Human Gen
e Therapie, 2: 203) 。また、遺伝子治療は、後天的疾患との戦いにも適応され
、その候補の疾患はがんおよび感染性およびウイルス性疾患 (AIDS、肝炎) であ
る。
ることである。これは２つのアプローチにより行うことができる：遺伝子異常を
修復することによる遺伝子型の訂正として行うか、あるいは正常型の遺伝子を移
植（導入）して、依然として存在する欠陥遺伝子の補償を可能にすることにより
、表現型を訂正して行うかのいずれかである。遺伝子治療は構成的および後天的
遺伝子疾患の両方の治療に適用される。従って、いくつかの構成的 (体質性) 遺
伝子病は遺伝子治療の候補である；特に、嚢胞性繊維症、デュシェンヌ型筋疾患
またはアデノシンデアミナーゼ欠損症が挙げられる (Cournoyer et al., 1991「
初期のヒト造血前駆細胞へのアデノシンデアミナーゼの遺伝子導入」 Human Gen
e Therapie, 2: 203) 。また、遺伝子治療は、後天的疾患との戦いにも適応され
、その候補の疾患はがんおよび感染性およびウイルス性疾患 (AIDS、肝炎) であ
る。
【０００２】 がん治療において、腫瘍浸潤性リンパ球 (TIL: tumor infiltrating lymphocy
tes)を用いて行われた最初の実験は、細胞は細胞障害性因子 (TNF,腫瘍壊死因子
、tumor necrosis factor)で武装しうること (Rosenberg et al., 1990「ヒトへ
の遺伝子導入：レトロウイルス遺伝子導入により改変された浸潤性リンパ球を用
いた進行した黒色腫患者の免疫治療」 N.Eng.J.Med. 323: 570-578) 、またはサ
イトカインでドープされるうることを実証した；そこで、Golumbekと同僚は、イ
ンターロイキン４を産生する細胞で処理したマウス腎臓がんにおいて治療の成功
をおさめた (Golumbet al., 1991, Science 254; 713-716) 。
tes)を用いて行われた最初の実験は、細胞は細胞障害性因子 (TNF,腫瘍壊死因子
、tumor necrosis factor)で武装しうること (Rosenberg et al., 1990「ヒトへ
の遺伝子導入：レトロウイルス遺伝子導入により改変された浸潤性リンパ球を用
いた進行した黒色腫患者の免疫治療」 N.Eng.J.Med. 323: 570-578) 、またはサ
イトカインでドープされるうることを実証した；そこで、Golumbekと同僚は、イ
ンターロイキン４を産生する細胞で処理したマウス腎臓がんにおいて治療の成功
をおさめた (Golumbet al., 1991, Science 254; 713-716) 。
【０００３】 遺伝子の欠陥を有する個人の体細胞に対してなされた遺伝子治療は、複数の方
法論的問題を提起した。修復または移植（導入）された遺伝子は、正規の方法で
正常に、すなわち正しい位置で正しい時期に、そして要求に合った正常な量で発
現されなければならない；修正および移植は無限に安定でなければならない。
法論的問題を提起した。修復または移植（導入）された遺伝子は、正規の方法で
正常に、すなわち正しい位置で正しい時期に、そして要求に合った正常な量で発
現されなければならない；修正および移植は無限に安定でなければならない。
【０００４】 関心対象の細胞の特異的および効率的標的化を試みるために開発されたex viv
o 体細胞遺伝子導入方策の中では、次のものに言及すべきである：(i) リン酸カ
ルシウムでの共沈法、電気穿孔法、微量注入、プロトプラスト融合、バイオリス
ティックス(biolistics)もしくは人工的ビヒクル (例、リポソームおよび受容体
リガンド) ；(ii)ウイルスベクター (レトロウイルス、アデノウイルス、AAV 、
HSV)を用いる方法 (Ragot et al., 1993, Nature 361: 647-650)。in vivo の体
細胞遺伝子導入の開発された方策の中では、予めex vivo で遺伝子を受け取った
細胞ビヒクル (造血幹細胞、リンパ球、肝実質細胞、内皮細胞、上皮細胞) 、ウ
イルスベクター、裸の DNAと人工的ビヒクルの筋肉内注射が挙げられる。
o 体細胞遺伝子導入方策の中では、次のものに言及すべきである：(i) リン酸カ
ルシウムでの共沈法、電気穿孔法、微量注入、プロトプラスト融合、バイオリス
ティックス(biolistics)もしくは人工的ビヒクル (例、リポソームおよび受容体
リガンド) ；(ii)ウイルスベクター (レトロウイルス、アデノウイルス、AAV 、
HSV)を用いる方法 (Ragot et al., 1993, Nature 361: 647-650)。in vivo の体
細胞遺伝子導入の開発された方策の中では、予めex vivo で遺伝子を受け取った
細胞ビヒクル (造血幹細胞、リンパ球、肝実質細胞、内皮細胞、上皮細胞) 、ウ
イルスベクター、裸の DNAと人工的ビヒクルの筋肉内注射が挙げられる。
【０００５】 遺伝子治療の現在の問題点の１つは、改変すべき細胞のin vivo での標的化に
関する。現在、わずかな数のウイルス法または合成法しか開発されていない；実
質的にリガンド−受容体相互作用が利用されている (Michael and Curiel, 1994
, " 受容体媒介エンドサイトーシス経路を介する完成された標的化遺伝子送達へ
の方策", Gene Therapy 1: 223) 。
関する。現在、わずかな数のウイルス法または合成法しか開発されていない；実
質的にリガンド−受容体相互作用が利用されている (Michael and Curiel, 1994
, " 受容体媒介エンドサイトーシス経路を介する完成された標的化遺伝子送達へ
の方策", Gene Therapy 1: 223) 。
【０００６】 従って、ウイルスベクターを用いる種々の方法が実験されている。第一の方法
は、標的細胞構造に対するビオチニル化抗体を、レトロウイルスエンベロープ構
造に対するビオチニル化抗体に、ストレプトアビジンを介して架橋させ、そのよ
うにしてレトロウイルスに結合させることからなる (Roux et al., 1989, Pro.N
atl.Aca.Sci.USA 86: 9079-9083)。一旦細胞に結合すると、レトロウイルスベク
ターはエンドサイトーシスにより取り込まれ、そしてエンドソームを細胞質に移
動させる機構を介したリソソーム−エンドソーム系を避けることができ、従って
、トランスフェクされた DNAの分解を避け、この DNAを細胞核に入れることを可
能にする。この方法は、細胞表面へ非特異的に結合するレトロウイルスベクター
であるため、in vivo 標的化の特異性の欠如が明らかになった。その表面にキメ
ラエンベロープリガンド−タンパク質を有するように改変された異所性ウイルス
を使用する第二のウイルス法が開発された (Kasahara et al., 1987, "可溶性 D
NAキャリア系による受容体媒介in vitro遺伝子形質転換" J.Biol.Chem. 262: 44
29) 。最後に、Neda等により開発された方法を挙げるべきである (1991 "異所性
マウス白血病ウイルスの化学的修飾はその標的細胞特異性のリダイレクション（
redirection)を生じる" J.Biol.Chem. 226: 14143)。
は、標的細胞構造に対するビオチニル化抗体を、レトロウイルスエンベロープ構
造に対するビオチニル化抗体に、ストレプトアビジンを介して架橋させ、そのよ
うにしてレトロウイルスに結合させることからなる (Roux et al., 1989, Pro.N
atl.Aca.Sci.USA 86: 9079-9083)。一旦細胞に結合すると、レトロウイルスベク
ターはエンドサイトーシスにより取り込まれ、そしてエンドソームを細胞質に移
動させる機構を介したリソソーム−エンドソーム系を避けることができ、従って
、トランスフェクされた DNAの分解を避け、この DNAを細胞核に入れることを可
能にする。この方法は、細胞表面へ非特異的に結合するレトロウイルスベクター
であるため、in vivo 標的化の特異性の欠如が明らかになった。その表面にキメ
ラエンベロープリガンド−タンパク質を有するように改変された異所性ウイルス
を使用する第二のウイルス法が開発された (Kasahara et al., 1987, "可溶性 D
NAキャリア系による受容体媒介in vitro遺伝子形質転換" J.Biol.Chem. 262: 44
29) 。最後に、Neda等により開発された方法を挙げるべきである (1991 "異所性
マウス白血病ウイルスの化学的修飾はその標的細胞特異性のリダイレクション（
redirection)を生じる" J.Biol.Chem. 226: 14143)。
【０００７】 非ウイルス性合成法もまた実験されてきた。それらは、標的細胞の表面に結合
しうるリガンドと、導入されるべき DNAとの複合体を形成することによって行わ
れる。まず、抗体被覆リポソーム (イムノリポソーム) などの人工的ビヒクルを
使用する方法が挙げられる；このタイプの方法は、おそらく細胞膜へのリポソー
ムの非特異的結合の結果、イムノリポソームが非特異的活性を示すので、現時点
では満足しうるものではないことが判明している。エンドソームに関連する分解
はリポソームを用いることにより避けられると推定されるにもかかわらず、リポ
ソーム中に含まれる遺伝子の導入の有効性はあまり大きくないことも明らかとな
った。細胞表面受容体と特異的に相互作用する能力を保持する化合物を用いる別
の方法が開発された。具体的には、天然に細胞表面に存在する各種受容体は、そ
のリガンドに結合した後、細胞内に取り込む能力を有する；従って、偏在的組織
分布を有する受容体であるトランスフェリンは、多くの実験の主題であった (ト
ランフェリンフェクション, transferrinfection)(Zenke et al., 1990, Pro.Na
tl.Acad.Sci.USA, 87: 3655-3659) 。さらに別の方法は、肝実質細胞の表面に存
在するアシアロ糖タンパク質を標的化することからなる (Wu et al., 1991, J.B
iol.Chem. 266: 14338-14342) 。最後に、本発明の発明者の一人により開発され
た「アンチフェクション (antifection)」と称される別の技術 (Hirsh et al.,
" アンチフェクション: 標的化遺伝子トランスフェクションへの新規な方法" 19
93, Transpl.Proc. 25:138) が報告された；この技術は、選択された細胞集団へ
供給される抗体-DNAベクターを製造することからなる (米国特許第5,428,132 号
) 。
しうるリガンドと、導入されるべき DNAとの複合体を形成することによって行わ
れる。まず、抗体被覆リポソーム (イムノリポソーム) などの人工的ビヒクルを
使用する方法が挙げられる；このタイプの方法は、おそらく細胞膜へのリポソー
ムの非特異的結合の結果、イムノリポソームが非特異的活性を示すので、現時点
では満足しうるものではないことが判明している。エンドソームに関連する分解
はリポソームを用いることにより避けられると推定されるにもかかわらず、リポ
ソーム中に含まれる遺伝子の導入の有効性はあまり大きくないことも明らかとな
った。細胞表面受容体と特異的に相互作用する能力を保持する化合物を用いる別
の方法が開発された。具体的には、天然に細胞表面に存在する各種受容体は、そ
のリガンドに結合した後、細胞内に取り込む能力を有する；従って、偏在的組織
分布を有する受容体であるトランスフェリンは、多くの実験の主題であった (ト
ランフェリンフェクション, transferrinfection)(Zenke et al., 1990, Pro.Na
tl.Acad.Sci.USA, 87: 3655-3659) 。さらに別の方法は、肝実質細胞の表面に存
在するアシアロ糖タンパク質を標的化することからなる (Wu et al., 1991, J.B
iol.Chem. 266: 14338-14342) 。最後に、本発明の発明者の一人により開発され
た「アンチフェクション (antifection)」と称される別の技術 (Hirsh et al.,
" アンチフェクション: 標的化遺伝子トランスフェクションへの新規な方法" 19
93, Transpl.Proc. 25:138) が報告された；この技術は、選択された細胞集団へ
供給される抗体-DNAベクターを製造することからなる (米国特許第5,428,132 号
) 。
【０００８】 ベクターの標的化の問題以外に、遺伝子治療実験において克服されるべき別の
問題が存在し、この問題は、導入遺伝子の高い発現を得るための、トランスフェ
クされるべき DNAの細胞内部への導入、およびこの DNAのリソソーム細胞分画の
ヌクレアーゼ活性からの防御にある。
問題が存在し、この問題は、導入遺伝子の高い発現を得るための、トランスフェ
クされるべき DNAの細胞内部への導入、およびこの DNAのリソソーム細胞分画の
ヌクレアーゼ活性からの防御にある。
【０００９】 この問題に対応するために各種方法が開発された；従って、クロロキンなどの
向リソソーム性 (lysosomotropic) 剤を用いることにより導入遺伝子の発現の効
率を向上させることが可能となった (Zenke et al., 1990, Pro.Natl.Acad.Sci.
USA 87: 3655-3659; Luthmam et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11: 1295) ；
これらの薬剤は、エンドソームのpHを上げ、取り込んだ物質のリソソームへの移
動を阻害することによって DNAのリソソームによる破壊を減少させる。別の方法
は、細胞のトランスロケーション (輸送) 活性を有するタンパク質ドメインを使
用することからなる。核酸の核への移行の効率を上げるために、これらのドメイ
ンの性質を利用して、トランスフェクトされた核酸をエンドソーム小胞から逃す
のを助ける (Fomiyama and Wels, 1995, J.Biol.Chem. 271: 10560) 。国際出願
WO 94/04696 号は、シュードモナス・アエルギノーザ (Pseudomonas aeruginosa ) の外毒素Ａ由来のトランスロケーション (輸送) ドメインからなる核酸の導入
システムを記載している；この導入システムのトランスフェクションの効率およ
び特異性は非常に低いようである。別の国際特許出願WO 96/13599 号もまた、毒
素、好ましくは細菌の毒素 (例、外毒素Ａ) 、由来のトランスロケーションドメ
インなどの各種機能性ドメインを含む組換え単量体タンパク質からなる、核酸の
導入システムを記載している。
向リソソーム性 (lysosomotropic) 剤を用いることにより導入遺伝子の発現の効
率を向上させることが可能となった (Zenke et al., 1990, Pro.Natl.Acad.Sci.
USA 87: 3655-3659; Luthmam et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11: 1295) ；
これらの薬剤は、エンドソームのpHを上げ、取り込んだ物質のリソソームへの移
動を阻害することによって DNAのリソソームによる破壊を減少させる。別の方法
は、細胞のトランスロケーション (輸送) 活性を有するタンパク質ドメインを使
用することからなる。核酸の核への移行の効率を上げるために、これらのドメイ
ンの性質を利用して、トランスフェクトされた核酸をエンドソーム小胞から逃す
のを助ける (Fomiyama and Wels, 1995, J.Biol.Chem. 271: 10560) 。国際出願
WO 94/04696 号は、シュードモナス・アエルギノーザ (Pseudomonas aeruginosa ) の外毒素Ａ由来のトランスロケーション (輸送) ドメインからなる核酸の導入
システムを記載している；この導入システムのトランスフェクションの効率およ
び特異性は非常に低いようである。別の国際特許出願WO 96/13599 号もまた、毒
素、好ましくは細菌の毒素 (例、外毒素Ａ) 、由来のトランスロケーションドメ
インなどの各種機能性ドメインを含む組換え単量体タンパク質からなる、核酸の
導入システムを記載している。
【００１０】 前述した遺伝子治療方策は、面倒な調製や複雑な材料を必要とし、ある種の生
物学的危険をもたらす。現在、効率的に発現された核酸を標的細胞に特異的に導
入することを可能にする、簡便で有効な核酸の導入システムを開発するという要
望がある。これに関し、関心対象のDNA 配列を標的細胞に標的化するために、抗
体を使用することに基づく、アンチフェクション (antifection)技術 (米国特許
第5,428,132 号) が極めて有望である。というのは、抗体は、その高い親和性お
よび高い特異性のために、導入ベクターを特定の細胞種に向かわせるための非常
に有効な手段を構成するからである；さらに、多くの腫瘍もしくは正常細胞構造
に対する、多数の利用可能なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体がこ
の技術に実質的な利益をもたらす。しかし、米国特許第5,428,132 号に記載のア
ンチフェクション技術では、効果的標的化は可能になるが、トランスフェクトさ
れた導入遺伝子の高い発現を得ることはできない。
物学的危険をもたらす。現在、効率的に発現された核酸を標的細胞に特異的に導
入することを可能にする、簡便で有効な核酸の導入システムを開発するという要
望がある。これに関し、関心対象のDNA 配列を標的細胞に標的化するために、抗
体を使用することに基づく、アンチフェクション (antifection)技術 (米国特許
第5,428,132 号) が極めて有望である。というのは、抗体は、その高い親和性お
よび高い特異性のために、導入ベクターを特定の細胞種に向かわせるための非常
に有効な手段を構成するからである；さらに、多くの腫瘍もしくは正常細胞構造
に対する、多数の利用可能なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体がこ
の技術に実質的な利益をもたらす。しかし、米国特許第5,428,132 号に記載のア
ンチフェクション技術では、効果的標的化は可能になるが、トランスフェクトさ
れた導入遺伝子の高い発現を得ることはできない。
【００１１】
従って、本発明の目的は、アンチフェクション技術を用いて、標的細胞中にト
ランスフェクトされた導入遺伝子の発現のレベルを改善することである。これら
の改善は、 DNAを非共有結合的に複合体へ結合させるための、及び／又は導入の
効率を向上させるための、 DNA−抗体複合体へのトランスロケーションドメイン
の付加、及び／又は DNA結合タンパク質の使用、及び／又は切断可能なペプチド
の付加に関する。これらの改善は、めざましくそして予想外に、標的細胞中の導
入遺伝子の発現レベルを２倍から10倍上昇させることを可能にする。
ランスフェクトされた導入遺伝子の発現のレベルを改善することである。これら
の改善は、 DNAを非共有結合的に複合体へ結合させるための、及び／又は導入の
効率を向上させるための、 DNA−抗体複合体へのトランスロケーションドメイン
の付加、及び／又は DNA結合タンパク質の使用、及び／又は切断可能なペプチド
の付加に関する。これらの改善は、めざましくそして予想外に、標的細胞中の導
入遺伝子の発現レベルを２倍から10倍上昇させることを可能にする。
【００１２】
従って、本発明は、核酸分子を細胞に導入するための複合体であり、この複合
体がこの細胞に効率的にトランスフェクトされるように、核酸分子、トランスロ
ケーション (輸送) ドメインおよびこの細胞の表面抗原に対して特異的な抗体を
含むことを特徴とする、複合体に関する。
体がこの細胞に効率的にトランスフェクトされるように、核酸分子、トランスロ
ケーション (輸送) ドメインおよびこの細胞の表面抗原に対して特異的な抗体を
含むことを特徴とする、複合体に関する。
【００１３】 本発明の第１の態様(A) によれば、本発明の複合体は、この核酸分子、トラン
スロケーションドメインおよび抗体が少なくとも１種の架橋剤により連結されて
いることを特徴とする。
スロケーションドメインおよび抗体が少なくとも１種の架橋剤により連結されて
いることを特徴とする。
【００１４】 好ましい態様(A) によれば、この複合体は、少なくとも１種の糖分解及び／又
はタンパク質分解酵素により切断されうるペプチドをさらに含み、前記抗体はこ
の切断可能なペプチドを介して前記トランスロケーションドメインに連結されて
いることを特徴とする。この複合体において、抗体および切断可能なペプチドは
、(i) 好ましくはベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋
剤を介して共有結合により、または(ii)同じでも異なっていてもよい、好ましく
はビオチン、ベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋剤に
よってアビジン型の分子へ、連結されていてよい。この化合物のトランスロケー
ションドメインは、共有化学結合を介してこの切断可能なペプチドに連結されて
いる。「共有化学結合」なる用語は、好ましくはペプチド型の結合を意味する；
具体的態様によれば、切断可能なペプチドに連結したトランスロケーションドメ
インに対応するペプチドは化学合成により得られる。
はタンパク質分解酵素により切断されうるペプチドをさらに含み、前記抗体はこ
の切断可能なペプチドを介して前記トランスロケーションドメインに連結されて
いることを特徴とする。この複合体において、抗体および切断可能なペプチドは
、(i) 好ましくはベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋
剤を介して共有結合により、または(ii)同じでも異なっていてもよい、好ましく
はビオチン、ベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋剤に
よってアビジン型の分子へ、連結されていてよい。この化合物のトランスロケー
ションドメインは、共有化学結合を介してこの切断可能なペプチドに連結されて
いる。「共有化学結合」なる用語は、好ましくはペプチド型の結合を意味する；
具体的態様によれば、切断可能なペプチドに連結したトランスロケーションドメ
インに対応するペプチドは化学合成により得られる。
【００１５】 この態様では、トランスロケーションドメインは以下のいずれかにより核酸分
子に連結していてよい： i)好ましくはAPDPである架橋剤により；この態様によれば、本発明の複合体のさ
らにより好ましい態様は、上記抗体が上記架橋剤EDC により共有結合を介して上
記切断可能なペプチドに連結されていることを特徴とし、この切断可能なペプチ
ドは化学的連結により共有結合を介して上記トランスロケーションドメインに連
結されており、このトランスロケーションドメインは上記架橋剤APDPにより共有
結合を介して上記核酸に連結している。 ii) 核酸結合分子を介して；この核酸結合分子は、好ましくはAPDPである架橋剤
により共有結合を介して上記トランスロケーションドメインに連結している。こ
の態様によれば、さらにより好ましい態様は、上記抗体が架橋剤EDC により共有
結合を介して上記切断可能なペプチドに連結し、この切断可能なペプチドは化学
的連結により共有結合を介して上記トランスロケーションドメインに連結され、
このトランスロケーションドメインはこの架橋剤APDPにより共有結合を介してこ
の核酸結合分子に連結され、この核酸結合分子は非共有結合を介して上記核酸を
結合している。
子に連結していてよい： i)好ましくはAPDPである架橋剤により；この態様によれば、本発明の複合体のさ
らにより好ましい態様は、上記抗体が上記架橋剤EDC により共有結合を介して上
記切断可能なペプチドに連結されていることを特徴とし、この切断可能なペプチ
ドは化学的連結により共有結合を介して上記トランスロケーションドメインに連
結されており、このトランスロケーションドメインは上記架橋剤APDPにより共有
結合を介して上記核酸に連結している。 ii) 核酸結合分子を介して；この核酸結合分子は、好ましくはAPDPである架橋剤
により共有結合を介して上記トランスロケーションドメインに連結している。こ
の態様によれば、さらにより好ましい態様は、上記抗体が架橋剤EDC により共有
結合を介して上記切断可能なペプチドに連結し、この切断可能なペプチドは化学
的連結により共有結合を介して上記トランスロケーションドメインに連結され、
このトランスロケーションドメインはこの架橋剤APDPにより共有結合を介してこ
の核酸結合分子に連結され、この核酸結合分子は非共有結合を介して上記核酸を
結合している。
【００１６】 第２の態様(B) によれば、本発明は、上記トランスロケーションドメイン、上
記抗体および核酸結合分子が、同じでも異なっていてもよい架橋剤によりアビジ
ン型の分子に連結するように、さらに核酸結合分子を含むことを特徴とする複合
体に関し、この核酸結合分子は上記核酸分子に結合される。
記抗体および核酸結合分子が、同じでも異なっていてもよい架橋剤によりアビジ
ン型の分子に連結するように、さらに核酸結合分子を含むことを特徴とする複合
体に関し、この核酸結合分子は上記核酸分子に結合される。
【００１７】 別の態様(B) によれば、本発明は、上記トランスロケーションドメイン、上記
抗体および切断可能なペプチドが、同じでも異なっていてもよい架橋剤によりア
ビジン型の分子に連結するように、さらに核酸結合分子および少なくとも１種の
糖分解及び／又はタンパク質分解酵素により切断可能なペプチドを含むことを特
徴とする複合体に関し、この核酸結合分子は上記核酸分子に結合され、この核酸
結合分子はこの切断可能なペプチドに連結され、かつこの核酸分子に結合されて
いる。
抗体および切断可能なペプチドが、同じでも異なっていてもよい架橋剤によりア
ビジン型の分子に連結するように、さらに核酸結合分子および少なくとも１種の
糖分解及び／又はタンパク質分解酵素により切断可能なペプチドを含むことを特
徴とする複合体に関し、この核酸結合分子は上記核酸分子に結合され、この核酸
結合分子はこの切断可能なペプチドに連結され、かつこの核酸分子に結合されて
いる。
【００１８】 別の態様(C) によれば、本発明は、核酸分子を細胞に導入するための複合体で
あり、この複合体がこの細胞に効率的にトランスフェクトされるように、核酸分
子、細胞表面抗原に対して特異的な抗体、および核酸結合分子を含むことを特徴
とする、複合体に関する；この複合体は、この核酸分子、抗体および核酸結合分
子が、同じでも異なっていてもよい架橋剤によりアビジン型の分子に連結され、
この核酸結合分子はこの核酸分子に結合されていることを特徴とする。
あり、この複合体がこの細胞に効率的にトランスフェクトされるように、核酸分
子、細胞表面抗原に対して特異的な抗体、および核酸結合分子を含むことを特徴
とする、複合体に関する；この複合体は、この核酸分子、抗体および核酸結合分
子が、同じでも異なっていてもよい架橋剤によりアビジン型の分子に連結され、
この核酸結合分子はこの核酸分子に結合されていることを特徴とする。
【００１９】 好ましい態様(C) によれば、上記複合体は、少なくとも１種の糖分解及び／又
はタンパク質分解酵素により切断されうるペプチドをさらに含み、上記抗体はこ
の切断可能なペプチドを介して上記核酸結合分子に連結されていることを特徴と
する；この複合体において、この抗体および切断可能なペプチドは、(i) 好まし
くはベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋剤を介して共
有結合により、または(ii)同じでも異なっていてもよい、好ましくはビオチン、
ベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋剤によってアビジ
ン型の分子を介して、連結されている。この複合体において、この切断可能なペ
プチドは、好ましくはAPDPである架橋剤により核酸結合分子に連結され、この核
酸結合分子は、非共有結合性の連結を介して核酸を結合している。
はタンパク質分解酵素により切断されうるペプチドをさらに含み、上記抗体はこ
の切断可能なペプチドを介して上記核酸結合分子に連結されていることを特徴と
する；この複合体において、この抗体および切断可能なペプチドは、(i) 好まし
くはベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋剤を介して共
有結合により、または(ii)同じでも異なっていてもよい、好ましくはビオチン、
ベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋剤によってアビジ
ン型の分子を介して、連結されている。この複合体において、この切断可能なペ
プチドは、好ましくはAPDPである架橋剤により核酸結合分子に連結され、この核
酸結合分子は、非共有結合性の連結を介して核酸を結合している。
【００２０】 １態様(D) によれば、本発明は、核酸分子を細胞に導入するための複合体であ
り、この複合体がこの細胞に効率的にトランスフェクトされるように、核酸分子
、細胞表面抗原に対して特異的な抗体、および少なくとも１種の糖分解及び／又
はタンパク質分解酵素により切断されうるペプチドをを含むことを特徴とする、
複合体に関する。この複合体において、この抗体および切断可能なペプチドは、
(i) 好ましくはベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋剤
を介して共有結合により、または(ii)同じでも異なっていてもよい、好ましくは
ビオチン、ベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋剤によ
ってアビジン型の分子に、連結されている。この複合体において、この切断可能
なペプチドは、(i) 好ましくはAPDPである架橋剤により共有結合を介してまたは
(ii)核酸結合分子を介して核酸に連結し、この核酸結合分子は、好ましくはAPDP
である架橋剤により共有結合を介して切断可能なペプチドに連結されている。本
発明の特に好ましい態様によれば、この複合体は、場合により、核酸分子及び／
又は核酸結合分子に架橋剤により共有結合的に連結されているトランスロケーシ
ョンドメインをさらに含有する。別の態様によれば、このトランスロケーション
ドメインは、複合体に共有結合的に連結することなく、複合体内に存在する。
り、この複合体がこの細胞に効率的にトランスフェクトされるように、核酸分子
、細胞表面抗原に対して特異的な抗体、および少なくとも１種の糖分解及び／又
はタンパク質分解酵素により切断されうるペプチドをを含むことを特徴とする、
複合体に関する。この複合体において、この抗体および切断可能なペプチドは、
(i) 好ましくはベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋剤
を介して共有結合により、または(ii)同じでも異なっていてもよい、好ましくは
ビオチン、ベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋剤によ
ってアビジン型の分子に、連結されている。この複合体において、この切断可能
なペプチドは、(i) 好ましくはAPDPである架橋剤により共有結合を介してまたは
(ii)核酸結合分子を介して核酸に連結し、この核酸結合分子は、好ましくはAPDP
である架橋剤により共有結合を介して切断可能なペプチドに連結されている。本
発明の特に好ましい態様によれば、この複合体は、場合により、核酸分子及び／
又は核酸結合分子に架橋剤により共有結合的に連結されているトランスロケーシ
ョンドメインをさらに含有する。別の態様によれば、このトランスロケーション
ドメインは、複合体に共有結合的に連結することなく、複合体内に存在する。
【００２１】 「切断可能なペプチド」なる用語は、糖分解及び／又はタンパク質分解酵素、
好ましくはエンドソーム及び／又はリソソームの酵素 (例、カテプシンおよびト
リプシン) 、で切断されうる１または２以上の配列を含むペプチドを意味する。
具体的態様によれば、本発明の切断可能なペプチドは、少なくとも１つのカテプ
シンＢ部位及び／又は１つのカテプシンＤ部位を含む。好ましくは、切断可能な
ペプチドは、例えばグリシンなどの、少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは少
なくとも２つのアミノ酸で隔てられた、１つのカテプシンＢ部位及び１つのカテ
プシンＤ部位を含む；本発明の切断可能なペプチドは、配列：X1-X2-F-Y-G-G-F-
R(式中、Ｇはグリシンを表し、X1およびX2は、例えば２つのリシン(K) などの、
抗体の化学的結合または連結を可能にするアミノ酸を表す) 。F-Y は、カテプシ
ンＤで切断可能な、アミノ酸、フェニルアラニン−チロシンからなるジペプチド
を表す；この配列は、場合によりL-Y(ロイシン−チロシン) 、Y-L(チロシン−ロ
イシン) またはF-F(フェニルアラニン−フェニルアラニン) で置換されていても
よい。FRは、カテプシンＢで切断可能な、アミノ酸、フェニルアラニン−アルギ
ニンからなるジペプチドを表す。
好ましくはエンドソーム及び／又はリソソームの酵素 (例、カテプシンおよびト
リプシン) 、で切断されうる１または２以上の配列を含むペプチドを意味する。
具体的態様によれば、本発明の切断可能なペプチドは、少なくとも１つのカテプ
シンＢ部位及び／又は１つのカテプシンＤ部位を含む。好ましくは、切断可能な
ペプチドは、例えばグリシンなどの、少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは少
なくとも２つのアミノ酸で隔てられた、１つのカテプシンＢ部位及び１つのカテ
プシンＤ部位を含む；本発明の切断可能なペプチドは、配列：X1-X2-F-Y-G-G-F-
R(式中、Ｇはグリシンを表し、X1およびX2は、例えば２つのリシン(K) などの、
抗体の化学的結合または連結を可能にするアミノ酸を表す) 。F-Y は、カテプシ
ンＤで切断可能な、アミノ酸、フェニルアラニン−チロシンからなるジペプチド
を表す；この配列は、場合によりL-Y(ロイシン−チロシン) 、Y-L(チロシン−ロ
イシン) またはF-F(フェニルアラニン−フェニルアラニン) で置換されていても
よい。FRは、カテプシンＢで切断可能な、アミノ酸、フェニルアラニン−アルギ
ニンからなるジペプチドを表す。
【００２２】 架橋剤は、複合体の全部または一部の成分を化学的 (共有結合的) に、静電気
的にまたは非共有結合的に連結することを可能にする。本発明において使用でき
る架橋剤には、ベンゾキノン、カルボジイミド、およびより具体的には、EDC (1
- エチル-3[3- ジメチルアミノプロピル] カルボジイミド塩酸塩) 、ジマレイミ
ド、ジチオビスニトロ安息香酸 (DTNB) 、N-スクシンイミジル-S- アセチルチオ
アセテート (SATA) 、紫外線と反応する１または２以上のフェニルアジド基を有
する架橋剤、好ましくはN-[-4-( アジドサリシルアミノ) ブチル]-3'-(2-ピリジ
ルジチオ) プロピオンアミド(APDP)、N-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)
プロピオネート(SPDP)、6-ヒドラジノニコチミド(HYNIC) 、およびビオチンが挙
げられる；ベンゾキノン、EDC 、APDPおよびビオチンが好ましく使用される架橋
剤である。「アビジン型の分子」なる表現は、ビオチンに高い親和性で結合する
すべての分子を意味し、好ましくは４価の分子、アビジン、ストレプトアビジン
、ニュートラビジン (neutravidin)である。
的にまたは非共有結合的に連結することを可能にする。本発明において使用でき
る架橋剤には、ベンゾキノン、カルボジイミド、およびより具体的には、EDC (1
- エチル-3[3- ジメチルアミノプロピル] カルボジイミド塩酸塩) 、ジマレイミ
ド、ジチオビスニトロ安息香酸 (DTNB) 、N-スクシンイミジル-S- アセチルチオ
アセテート (SATA) 、紫外線と反応する１または２以上のフェニルアジド基を有
する架橋剤、好ましくはN-[-4-( アジドサリシルアミノ) ブチル]-3'-(2-ピリジ
ルジチオ) プロピオンアミド(APDP)、N-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)
プロピオネート(SPDP)、6-ヒドラジノニコチミド(HYNIC) 、およびビオチンが挙
げられる；ベンゾキノン、EDC 、APDPおよびビオチンが好ましく使用される架橋
剤である。「アビジン型の分子」なる表現は、ビオチンに高い親和性で結合する
すべての分子を意味し、好ましくは４価の分子、アビジン、ストレプトアビジン
、ニュートラビジン (neutravidin)である。
【００２３】 本発明の好ましい態様によれば、本発明の各種態様の上記複合体は、架橋剤が
、ベンゾキノン、ビオチン、カルボジイミド類および紫外線u 反応するフェニル
アジド基を少なくとも１つの有する架橋剤からなる群よりされることを特徴とす
る。好ましい態様では、架橋剤はベンゾキノン、ビオチン、EDC およびADPDから
なる群より選択される。
、ベンゾキノン、ビオチン、カルボジイミド類および紫外線u 反応するフェニル
アジド基を少なくとも１つの有する架橋剤からなる群よりされることを特徴とす
る。好ましい態様では、架橋剤はベンゾキノン、ビオチン、EDC およびADPDから
なる群より選択される。
【００２４】 本発明の別の好ましい態様によれば、第二の態様(B) の上記複合体は、上記ト
ランスロケーションドメインおよび上記抗体をアビジン型の分子に連結する架橋
剤がビオチンであり、上記核酸結合分子をアビジン型の分子に連結する架橋剤が
ベンゾキノンであることを特徴とする。本発明の別の好ましい態様によれば、第
二の態様(B) の上記複合体は、上記トランスロケーションドメイン、上記抗体お
よび上記核酸結合分子を連結する架橋剤がビオチンであることを特徴とする。本
発明の特に好ましい態様によれば、第二の態様(B) の上記複合体は、上記トラン
スロケーションドメインおよび上記核酸結合分子が融合タンパク質を形成するこ
とを特徴とする。「融合タンパク質」なる用語は、異なるタンパク質由来の複数
のタンパク質ドメインを含み、組換え DNA技術により得られる同じ DNA分子によ
りコードされるタンパク質を意味する。この融合タンパク質および抗体は、同じ
でも異なっていてもよい架橋剤によりアビジン型の分子に連結され、この融合タ
ンパク質はその核酸結合ドメインを介して核酸分子に結合される。
ランスロケーションドメインおよび上記抗体をアビジン型の分子に連結する架橋
剤がビオチンであり、上記核酸結合分子をアビジン型の分子に連結する架橋剤が
ベンゾキノンであることを特徴とする。本発明の別の好ましい態様によれば、第
二の態様(B) の上記複合体は、上記トランスロケーションドメイン、上記抗体お
よび上記核酸結合分子を連結する架橋剤がビオチンであることを特徴とする。本
発明の特に好ましい態様によれば、第二の態様(B) の上記複合体は、上記トラン
スロケーションドメインおよび上記核酸結合分子が融合タンパク質を形成するこ
とを特徴とする。「融合タンパク質」なる用語は、異なるタンパク質由来の複数
のタンパク質ドメインを含み、組換え DNA技術により得られる同じ DNA分子によ
りコードされるタンパク質を意味する。この融合タンパク質および抗体は、同じ
でも異なっていてもよい架橋剤によりアビジン型の分子に連結され、この融合タ
ンパク質はその核酸結合ドメインを介して核酸分子に結合される。
【００２５】 本発明の別の好ましい態様によれば、第二の態様(B) に記載の切断可能なペプ
チドを含む複合体は、上記トランスロケーションドメインおよび上記抗体をアビ
ジン型の分子に連結する架橋剤がビオチンであり、上記切断可能なペプチドをア
ビジン型の分子に連結する架橋剤がベンゾキノンであることを特徴とする。本発
明の別の好ましい態様によれば、第二の態様(B) の上記複合体は、上記トランス
ロケーションドメイン、上記抗体および上記切断可能なペプチドを連結する架橋
剤がビオチンであることを特徴とする。
チドを含む複合体は、上記トランスロケーションドメインおよび上記抗体をアビ
ジン型の分子に連結する架橋剤がビオチンであり、上記切断可能なペプチドをア
ビジン型の分子に連結する架橋剤がベンゾキノンであることを特徴とする。本発
明の別の好ましい態様によれば、第二の態様(B) の上記複合体は、上記トランス
ロケーションドメイン、上記抗体および上記切断可能なペプチドを連結する架橋
剤がビオチンであることを特徴とする。
【００２６】 本発明の別の好ましい態様によれば、本発明の別の態様(C) の上記複合体は、
上記抗体をアビジン型の分子に連結する架橋剤がビオチンであり、上記核酸結合
分子をアビジン型の分子に連結する架橋剤がベンゾキノンであることを特徴とす
る。本発明の別の好ましい態様によれば、上記複合体は、架橋剤がビオチンであ
ることを特徴とする。
上記抗体をアビジン型の分子に連結する架橋剤がビオチンであり、上記核酸結合
分子をアビジン型の分子に連結する架橋剤がベンゾキノンであることを特徴とす
る。本発明の別の好ましい態様によれば、上記複合体は、架橋剤がビオチンであ
ることを特徴とする。
【００２７】 本発明の複合体は、この複合体の核酸分子が一本鎖 DNA、二本鎖 DNA、一本鎖
RNA、二本鎖 RNAおよびRNA/DNA ハイブリッドから選択されることを特徴とする
。好ましい態様によれば、この核酸分子は、上記細胞において効率的に発現され
る、関心対象のタンパク質産物をコードする一本鎖 DNAまたは一本鎖 RNA であ
る。関心対象のタンパク質産物は、インターロイキン類、サイトカイン類、リン
ホカイン類、ケモカイン類、増殖因子類、キラータンパク質類、化学的抵抗性を
向上させることが可能なタンパク質類および制限酵素類から選択される；インタ
ーロイキン類、サイトカイン類およびリンホカイン類は、インターロイキンIl-1
、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、Il-8、Il-9、Il-10 、Il-11 、Il-12
、Il-13 、Il-14 、Il-15 、Il-16 、Il-17 およびIl-18 、ならびにインターフ
ェロンα-IFN、β-IFNおよびγ-IFNからなる群より選択される；好ましくは、関
心対象のタンパク質産物は、インターロイキン２である。増殖因子は好ましくは
、コロニー刺激因子 (G-CSF 、GM-CSF、M-CSF)およびエリトロポエチンである；
また、NF-KB などの核転写因子を阻害することにより、それらと相互作用する増
殖因子も挙げられる；これらの増殖因子は特許出願FR 981 14858号の主題である
。キラータンパク質は、キナーゼからなる群より選ばれ、好ましくはチミジンキ
ナーゼおよびプロアポトーシス性タンパク質である；「プロアポトーシス性タン
パク質」なる用語は、アポトーシスに関与するか、アポトーシスを促進するタン
パク質を意味する。プロアポトーシス性タンパク質の中では、Bc12ファミリー、
より詳しくはBIK (Bc12-相互作用性タンパク質) 、BAX (Oltvai et al., 1993,
Cell 74:609-619)、BAK (Chittenden et al., 1995, Nature 374:733-736; Kief
er et al., 1995, Nature 374:736-739)およびBID (BH3- 相互作用性ドメイン死
アゴニスト)(Wang et al., 1996, Genes Dev. 10:2859-2869) タンパク質が挙げ
られる；好ましくは、関心対象のタンパク質産物はBAX タンパク質である。プロ
アポトーシス性タンパク質には、カスパーゼ、AIF(アポトーシス誘導因子、apop
tosi-inducing factor) タンパク質 (Susin et al., 1999, Nature 397:441-446
) および腫瘍壊死因子 (TNF)ファミリーのタンパク質、およびより詳細にはTNF
それ自身 (Old 1985, Science 230:630-632)およびFASL (FAS-リガンド) タンパ
ク質 (Takahashi et al., 1994, Int.Immun. 6:1567-1574) が挙げられる。
RNA、二本鎖 RNAおよびRNA/DNA ハイブリッドから選択されることを特徴とする
。好ましい態様によれば、この核酸分子は、上記細胞において効率的に発現され
る、関心対象のタンパク質産物をコードする一本鎖 DNAまたは一本鎖 RNA であ
る。関心対象のタンパク質産物は、インターロイキン類、サイトカイン類、リン
ホカイン類、ケモカイン類、増殖因子類、キラータンパク質類、化学的抵抗性を
向上させることが可能なタンパク質類および制限酵素類から選択される；インタ
ーロイキン類、サイトカイン類およびリンホカイン類は、インターロイキンIl-1
、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、Il-8、Il-9、Il-10 、Il-11 、Il-12
、Il-13 、Il-14 、Il-15 、Il-16 、Il-17 およびIl-18 、ならびにインターフ
ェロンα-IFN、β-IFNおよびγ-IFNからなる群より選択される；好ましくは、関
心対象のタンパク質産物は、インターロイキン２である。増殖因子は好ましくは
、コロニー刺激因子 (G-CSF 、GM-CSF、M-CSF)およびエリトロポエチンである；
また、NF-KB などの核転写因子を阻害することにより、それらと相互作用する増
殖因子も挙げられる；これらの増殖因子は特許出願FR 981 14858号の主題である
。キラータンパク質は、キナーゼからなる群より選ばれ、好ましくはチミジンキ
ナーゼおよびプロアポトーシス性タンパク質である；「プロアポトーシス性タン
パク質」なる用語は、アポトーシスに関与するか、アポトーシスを促進するタン
パク質を意味する。プロアポトーシス性タンパク質の中では、Bc12ファミリー、
より詳しくはBIK (Bc12-相互作用性タンパク質) 、BAX (Oltvai et al., 1993,
Cell 74:609-619)、BAK (Chittenden et al., 1995, Nature 374:733-736; Kief
er et al., 1995, Nature 374:736-739)およびBID (BH3- 相互作用性ドメイン死
アゴニスト)(Wang et al., 1996, Genes Dev. 10:2859-2869) タンパク質が挙げ
られる；好ましくは、関心対象のタンパク質産物はBAX タンパク質である。プロ
アポトーシス性タンパク質には、カスパーゼ、AIF(アポトーシス誘導因子、apop
tosi-inducing factor) タンパク質 (Susin et al., 1999, Nature 397:441-446
) および腫瘍壊死因子 (TNF)ファミリーのタンパク質、およびより詳細にはTNF
それ自身 (Old 1985, Science 230:630-632)およびFASL (FAS-リガンド) タンパ
ク質 (Takahashi et al., 1994, Int.Immun. 6:1567-1574) が挙げられる。
【００２８】 本発明の別の態様によれば、核酸分子はアンチセンスRNA である。 本発明によれば、本発明の複合体は、核酸結合分子が非共有結合性の連結を介
して核酸分子を結合することを特徴とする。核酸結合分子はポリカチオン性 (多
カチオン性) ポリマーまたは核酸結合タンパク質のいずれかである：(i) ポリカ
チオン性ポリマーはポリ-L- リシン、ポリ-D- リシン、ポリエチレンイミン、ポ
リアミドアミン、ポリアミンおよび化学的起源の遊離ポリカチオンから選択され
；好ましくはポリカチオン性ポリマーはポリ-L- リシンである；(ii)核酸結合タ
ンパク質は、ヒストン、プロタミン、オルニチン、プトレッシン、スペルミジン
、スペルミン、転写因子およびホメオボックスタンパク質から選択される；好ま
しくは核酸結合タンパク質は、プロタミン及び／又はヒストンである。
して核酸分子を結合することを特徴とする。核酸結合分子はポリカチオン性 (多
カチオン性) ポリマーまたは核酸結合タンパク質のいずれかである：(i) ポリカ
チオン性ポリマーはポリ-L- リシン、ポリ-D- リシン、ポリエチレンイミン、ポ
リアミドアミン、ポリアミンおよび化学的起源の遊離ポリカチオンから選択され
；好ましくはポリカチオン性ポリマーはポリ-L- リシンである；(ii)核酸結合タ
ンパク質は、ヒストン、プロタミン、オルニチン、プトレッシン、スペルミジン
、スペルミン、転写因子およびホメオボックスタンパク質から選択される；好ま
しくは核酸結合タンパク質は、プロタミン及び／又はヒストンである。
【００２９】 プロタミン及び／又はヒストンなどの核酸結合ドメインを含む、本発明の複合
体の作製において、結合ドメインは過剰に加えるのが好ましい。従って、この結
合ドメインは複合体において過剰に存在する。「過剰に」なる用語は、核酸結合
ドメインと複合体のその他の成分とが化学量論的量で存在しないことを意味する
。
体の作製において、結合ドメインは過剰に加えるのが好ましい。従って、この結
合ドメインは複合体において過剰に存在する。「過剰に」なる用語は、核酸結合
ドメインと複合体のその他の成分とが化学量論的量で存在しないことを意味する
。
【００３０】 プロタミンやヒストンなどの核酸結合分子の大過剰量での存在は、核酸分子の
詰め込みを可能にし、そして促進し、従って核酸分子の細胞への有効なトランス
フェクション、より詳しくは、核酸の細胞核へのトランスロケーション (輸送)
および標的化を可能にする。さらに、プロタミンやヒストンなどの核酸結合分子
による本発明の核酸分子の詰め込みは、細胞内および細胞外のヌクレアーゼによ
る分解から核酸分子を防御することを可能にする。核酸分子のトランスフェクシ
ョンおよび発現の促進のための、プロタミンおよびヒストンの使用は、当分野の
技術者にかなり前から知られていた [Wienhues et al., (1987) およびDubes an
d Wegrzyn (1978)] 。
詰め込みを可能にし、そして促進し、従って核酸分子の細胞への有効なトランス
フェクション、より詳しくは、核酸の細胞核へのトランスロケーション (輸送)
および標的化を可能にする。さらに、プロタミンやヒストンなどの核酸結合分子
による本発明の核酸分子の詰め込みは、細胞内および細胞外のヌクレアーゼによ
る分解から核酸分子を防御することを可能にする。核酸分子のトランスフェクシ
ョンおよび発現の促進のための、プロタミンおよびヒストンの使用は、当分野の
技術者にかなり前から知られていた [Wienhues et al., (1987) およびDubes an
d Wegrzyn (1978)] 。
【００３１】 本発明の複合体は、トランスロケーションドメインが細菌またはウイルスの毒
素由来であるが、毒性を与える毒素の部分は含まないことを特徴とする。細菌ま
たはウイルスの毒素は、シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、コレラ毒素
、バチラス・アンスロックス (Bacillus anthrox) 毒素、ペルツシス (Pertussi
s)毒素、シゲラ・シガ (Shigella Shiga) 毒素、シガ毒素関連毒素、大腸菌毒素
、コリシンＡ、d-内毒素、ハエモフィラス (Haemophilus)Ａ赤血球凝集素から選
択される。好ましい態様では、トランスロケーションドメインがシュードモナス
・アエルギノーザの外毒素Ａである。別の好ましい態様では、トランスロケーシ
ョンドメインはシゲラ・シガ毒素の非毒性Ｂフラグメントである。
素由来であるが、毒性を与える毒素の部分は含まないことを特徴とする。細菌ま
たはウイルスの毒素は、シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、コレラ毒素
、バチラス・アンスロックス (Bacillus anthrox) 毒素、ペルツシス (Pertussi
s)毒素、シゲラ・シガ (Shigella Shiga) 毒素、シガ毒素関連毒素、大腸菌毒素
、コリシンＡ、d-内毒素、ハエモフィラス (Haemophilus)Ａ赤血球凝集素から選
択される。好ましい態様では、トランスロケーションドメインがシュードモナス
・アエルギノーザの外毒素Ａである。別の好ましい態様では、トランスロケーシ
ョンドメインはシゲラ・シガ毒素の非毒性Ｂフラグメントである。
【００３２】 別の好ましい態様において、トランスロケーションドメインはハエモフィラス
Ａ赤血球凝集素のフラグメントである。インフルエンザＡ赤血球凝集素(HA)のこ
のフラグメントは、システインを、好ましくはAPDPである架橋剤と反応させるた
めに、システインを付加することにより、またはシステイン末端を有する短いペ
プチド配列を付加することにより、そのＣ末端で修飾されていてもよい。
Ａ赤血球凝集素のフラグメントである。インフルエンザＡ赤血球凝集素(HA)のこ
のフラグメントは、システインを、好ましくはAPDPである架橋剤と反応させるた
めに、システインを付加することにより、またはシステイン末端を有する短いペ
プチド配列を付加することにより、そのＣ末端で修飾されていてもよい。
【００３３】 本発明の複合体は、抗体が、膜結合表面抗原に特異的なモノクローナル抗体ま
たはポリクローナル抗体であることを特徴とする。本発明の好ましい１態様によ
れば、抗体は、ヒト腎細胞がん (human renal cell caicinoma,RCC) に特有のG2
50抗原に特異的に結合する。本発明の好ましい態様によれば、本発明の抗体は、
Oosterwijk et al., (1986, Int.J.Cancer. 38: 489-494)に記載のG250抗体であ
り、これは国際出願WO 88/08854 の主題であった。別の好ましい態様によれば、
本発明の抗体は、受託番号I-2184としてCNCMに寄託された5C5 ハイブリドーマを
用いて得られる5C5 モノクローナル抗体である。本発明の抗体は、単鎖抗体の形
態であるか、キメラ抗体もしくはヒト化抗体の形態である。具体的態様によれば
、抗体は抗体フラグメントであり、好ましくはF(ab')2 、Fab'またはFvフラグメ
ントである。
たはポリクローナル抗体であることを特徴とする。本発明の好ましい１態様によ
れば、抗体は、ヒト腎細胞がん (human renal cell caicinoma,RCC) に特有のG2
50抗原に特異的に結合する。本発明の好ましい態様によれば、本発明の抗体は、
Oosterwijk et al., (1986, Int.J.Cancer. 38: 489-494)に記載のG250抗体であ
り、これは国際出願WO 88/08854 の主題であった。別の好ましい態様によれば、
本発明の抗体は、受託番号I-2184としてCNCMに寄託された5C5 ハイブリドーマを
用いて得られる5C5 モノクローナル抗体である。本発明の抗体は、単鎖抗体の形
態であるか、キメラ抗体もしくはヒト化抗体の形態である。具体的態様によれば
、抗体は抗体フラグメントであり、好ましくはF(ab')2 、Fab'またはFvフラグメ
ントである。
【００３４】 本発明のDNA-抗体複合体は、当分野の技術者に既知の各種経路により投与する
ことができる。例えば、これは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腫瘍内、肛門
または直腸内で投与することができる。
ことができる。例えば、これは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腫瘍内、肛門
または直腸内で投与することができる。
【００３５】 最後に、本発明は医薬品としての上記複合体に関する。より詳しくは、本発明
は、遺伝子治療用の医薬品としての、より正確には、後天的もしくは構成的 (体
質性) 遺伝子疾患の治療のための、上記複合体に関する。本発明によれば、後天
的疾患は、がんおよび感染症からなる群より選択される。本発明によるがんの中
では、腎細胞がん (RCC)、黒色腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、パー
キットリンパ腫、小細胞肺がん、神経芽腫、網膜芽腫、グリア芽腫、肝がん、横
紋筋肉腫、胃の腺がん、結腸がん、卵巣がん、乳がん、子宮がんおよび睾丸がん
が挙げられる。好ましくは、本発明は、腎細胞ガン腫 (RCC)の治療のための医薬
品としての上記複合体に関する。感染症には、AIDSおよび肝炎が挙げられる。
は、遺伝子治療用の医薬品としての、より正確には、後天的もしくは構成的 (体
質性) 遺伝子疾患の治療のための、上記複合体に関する。本発明によれば、後天
的疾患は、がんおよび感染症からなる群より選択される。本発明によるがんの中
では、腎細胞がん (RCC)、黒色腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、パー
キットリンパ腫、小細胞肺がん、神経芽腫、網膜芽腫、グリア芽腫、肝がん、横
紋筋肉腫、胃の腺がん、結腸がん、卵巣がん、乳がん、子宮がんおよび睾丸がん
が挙げられる。好ましくは、本発明は、腎細胞ガン腫 (RCC)の治療のための医薬
品としての上記複合体に関する。感染症には、AIDSおよび肝炎が挙げられる。
【００３６】 本発明によれば、構成的疾患は、好ましくは、筋障害、より詳しくは、デュッ
センヌ型筋障害 (DM) 、スタイナート筋障害および棘筋萎縮症 (SMA)、嚢胞性線
維症、筋萎縮側索硬化症 (ALS)、血友病、ヘモグロビン異常症、神経変性疾患 (
例、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病) 、ゴーシェ
病、レッシュ−ナイハン症候群、アデノシンデアミナーゼもしくはプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼにおける欠損に関連する免疫不全、肺気腫および高コレス
テロール血症からなる群より選択される。
センヌ型筋障害 (DM) 、スタイナート筋障害および棘筋萎縮症 (SMA)、嚢胞性線
維症、筋萎縮側索硬化症 (ALS)、血友病、ヘモグロビン異常症、神経変性疾患 (
例、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病) 、ゴーシェ
病、レッシュ−ナイハン症候群、アデノシンデアミナーゼもしくはプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼにおける欠損に関連する免疫不全、肺気腫および高コレス
テロール血症からなる群より選択される。
【００３７】 本発明の化合物は、選択した DNA配列の性質および選択した抗体の性質により
多数の用途を有することは明らかである。これらの多数の用途は、当分野の技術
者により容易に考えられるものであり、網羅的に述べることはできない。
多数の用途を有することは明らかである。これらの多数の用途は、当分野の技術
者により容易に考えられるものであり、網羅的に述べることはできない。
【００３８】 本発明は、治療有効量の本発明の複合体および薬剤に許容されるビヒクルを含
む薬剤組成物、特に、遺伝子治療による疾患の治療のための薬剤組成物にも関す
る。
む薬剤組成物、特に、遺伝子治療による疾患の治療のための薬剤組成物にも関す
る。
【００３９】 本発明はまた、本発明の複合体を、この複合体で細胞をトランスフェクトする
ようにこの細胞に接触させることを特徴とする、核酸分子を細胞に導入する方法
に関する。好ましくは、核酸分子は、このトランスフェクトされた細胞において
効果的に発現される関心対象のタンパク質産物をコードする。
ようにこの細胞に接触させることを特徴とする、核酸分子を細胞に導入する方法
に関する。好ましくは、核酸分子は、このトランスフェクトされた細胞において
効果的に発現される関心対象のタンパク質産物をコードする。
【００４０】 本発明の好ましい態様によれば、核酸分子は、関心対象のタンパク質をコード
する二本鎖 DNAである。従って、本発明は、細胞質細胞膜を通る二本鎖 DNA分子
の輸送、核への輸送、核への導入、および核における機能的状態でのこの分子の
維持を可能にする効果的なシステムを提供する。 DNA分子によりコードされるタ
ンパク質産物の発現の持続は、 DNA分子を標的細胞の染色体 DNAへ安定に組み込
むか、または DNA分子を染色体外レプリコンの形態に維持するかのいずれかによ
り得られる。従って、本発明の目的の１つは、核酸分子をこの細胞の染色体外レ
プリコンの形態に維持することを特徴とする方法を提供することである。別の具
体例によれば、本発明は、この核酸分子が、トランスフェクトされた細胞のゲノ
ム及び／又はミトコンドリア DNAに組み込まれることを特徴とする方法を提供す
る。
する二本鎖 DNAである。従って、本発明は、細胞質細胞膜を通る二本鎖 DNA分子
の輸送、核への輸送、核への導入、および核における機能的状態でのこの分子の
維持を可能にする効果的なシステムを提供する。 DNA分子によりコードされるタ
ンパク質産物の発現の持続は、 DNA分子を標的細胞の染色体 DNAへ安定に組み込
むか、または DNA分子を染色体外レプリコンの形態に維持するかのいずれかによ
り得られる。従って、本発明の目的の１つは、核酸分子をこの細胞の染色体外レ
プリコンの形態に維持することを特徴とする方法を提供することである。別の具
体例によれば、本発明は、この核酸分子が、トランスフェクトされた細胞のゲノ
ム及び／又はミトコンドリア DNAに組み込まれることを特徴とする方法を提供す
る。
【００４１】 本発明の化合物により標的とされる細胞は、原核もしくは真核の、動物もしく
は植物細胞である。好ましい具体例によれば、本発明は、細胞が真核細胞、好ま
しくは哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞であることを特徴とする方法に関する
。
は植物細胞である。好ましい具体例によれば、本発明は、細胞が真核細胞、好ま
しくは哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞であることを特徴とする方法に関する
。
【００４２】 最後に、本発明は、本発明の複合体でトランスフェクトされた細胞に関し、こ
の細胞は好ましくは真核細胞、より具体的には哺乳動物細胞、好ましくはヒト細
胞である。
の細胞は好ましくは真核細胞、より具体的には哺乳動物細胞、好ましくはヒト細
胞である。
【００４３】 本発明のその他の特徴および利点は、以下に示す実施例によりはっきりと実証
されるであろう。これらの実施例においては図面が参照される。
されるであろう。これらの実施例においては図面が参照される。
【００４４】
【００４５】
【実施例１】材料および方法 (Durrbach et al., G250 腫瘍関連抗原の抗体媒介
エンドサイトーシスは in vitro でのヒト腎細胞がんへの標的化遺伝子導入を可
能にする、Cancer Gene Therapy,印刷中、参照) 1.１細胞 使用する腎がん細胞系：IGR/RCC-17、(HIEG)、IGR/RCC-40(ROB) 、IGR/RCC-47
(FRAP)、IGR/RCC-58(MOJ) 。これらは、転移段階のRCC に罹患している４人の患
者からの、３種類の原発腫瘍(-17、-40 および-47)および副腎転移物 (-58)由来
である。組織学的基準によれば、RCC-17,-40および-58 は明細胞がんに、RCC-47
はSCIDマウスにおいて高度に腫瘍形成性である典型的な乳頭の病巣を有する明細
胞がんの特定の形態に相当する(Angevin et al. (1997) Process. Am.Asso.Canc
er Res. 38: 238; Goulkhova et al. (1998) Genes Chrom. Cancer 22: 171-178
) 。in vitroでの培養の確立と、RCC 細胞系の特性決定は既報のように行った(A
ngevin et al. 1997 Int. J. Cancer 72: 434-440)。細胞は37℃において、５％
CO2 を含む雰囲気中、10％ウシ胎仔血清 (Seromed 、独、ベルリン) 、５％非必
須アミノ酸、10mMピルビン酸ナトリウム(Gibco BRL) およびペニシリン/ ストレ
プトマイシン(10mg/ml)(Seromed)を加えたGlutamax-1(Gibco BRL、スコットラン
ド、ペイスリー) を有するダルベッコ修飾MEM 培地中で培養する。 1.２.G250 抗原の免疫表現型決定 RCC 腫瘍関連のＧ250 抗原の発現を、既報(Oosterwijk et al., 1986, Int. J
. Cancer 38 ： 489-494) のマウスIgG1モノクローナル抗体Ｇ250(Ｇ250mAb) を
用いて間接免疫標識により直接試験した。トリプシン処理により得られた５×10 5 細胞の懸濁液をRCC 培地で２回洗浄し、次いで、細胞をＧ250mAbと共にインキ
ュベートレ、PBS(リン酸塩緩衝化食塩水) 中で３回洗浄し、次いでヤギ抗マウス
IgG 抗体のFITC標識F (ab')2 断片と共にインキュベートした。同じアイソタイ
プを有するNKTAモノクローナル抗体(TCRα/ βのクロノタイプ決定基に対するIg
Ｇ1)(Dr. Thierry Hercend (仏) より好意により提供) を陰性対照として用いた
。フローサイトメトリーをCellguest プログラムを用いてFACScan サイトメータ
ー(Becton-Dickinson 、米国. CA. ニーベイル) を用いて行った。 1.３. エンドサイトーシス実験 Ｇ250 抗体および鉄添加ヒトアポトランスフェリン(Sigma、米国、MO、セント
ルイス) をそれぞれ、フルオレセインイソチオシアネート(Sigma) およびリッサ
ミン・ローダミンＢスルホニルクロライドと、既報(Maxfield et al., 1978、Ce
ll 14: 805-810; Brandzaeg, 1973, Scan. J. Immunol. 2: 273-290)のようにし
て結合させた。セファデックスＧ50カラム(Pharmacia, スウェーデン、ウプサラ
) 上のゲル濾過により、複合タンパク質を遊離蛍光色素から分離する。結合タン
パク質の細胞表面受容体との特異的結合を100 倍高濃度の非結合タンパク質を用
いる競合実験により測定した。メタロチオネイン遺伝子の誘導性プロモーターの
制御下にマウスインターロイキン２ (IL-2)CDNA を含むプラスミドDNA BMGneo-m
IL2(Karasuyama and Melchers 、1988、Eur. J. Immunol. 18: 97-104) (１mg/m
l)を、エタノール中に再生させたEZ-link-Biotin-LC-ASA (２mg/ml)(Pierce 、
米国 IL 、ロックフォード) と共にインキュベート(Vol./Vol.) し、４℃で15分
間、紫外線 (365nm)照射した。次に、プラスミドDNA を−20℃で30分間、エタノ
ール (最終濃度70％) で沈殿させる。標識効率を、ストレプトアビジン結合アル
カリホスファターゼを用いて、poly-L- リシンで被覆したマイクロプレート上で
ELISA アッセイを用いて測定する。
エンドサイトーシスは in vitro でのヒト腎細胞がんへの標的化遺伝子導入を可
能にする、Cancer Gene Therapy,印刷中、参照) 1.１細胞 使用する腎がん細胞系：IGR/RCC-17、(HIEG)、IGR/RCC-40(ROB) 、IGR/RCC-47
(FRAP)、IGR/RCC-58(MOJ) 。これらは、転移段階のRCC に罹患している４人の患
者からの、３種類の原発腫瘍(-17、-40 および-47)および副腎転移物 (-58)由来
である。組織学的基準によれば、RCC-17,-40および-58 は明細胞がんに、RCC-47
はSCIDマウスにおいて高度に腫瘍形成性である典型的な乳頭の病巣を有する明細
胞がんの特定の形態に相当する(Angevin et al. (1997) Process. Am.Asso.Canc
er Res. 38: 238; Goulkhova et al. (1998) Genes Chrom. Cancer 22: 171-178
) 。in vitroでの培養の確立と、RCC 細胞系の特性決定は既報のように行った(A
ngevin et al. 1997 Int. J. Cancer 72: 434-440)。細胞は37℃において、５％
CO2 を含む雰囲気中、10％ウシ胎仔血清 (Seromed 、独、ベルリン) 、５％非必
須アミノ酸、10mMピルビン酸ナトリウム(Gibco BRL) およびペニシリン/ ストレ
プトマイシン(10mg/ml)(Seromed)を加えたGlutamax-1(Gibco BRL、スコットラン
ド、ペイスリー) を有するダルベッコ修飾MEM 培地中で培養する。 1.２.G250 抗原の免疫表現型決定 RCC 腫瘍関連のＧ250 抗原の発現を、既報(Oosterwijk et al., 1986, Int. J
. Cancer 38 ： 489-494) のマウスIgG1モノクローナル抗体Ｇ250(Ｇ250mAb) を
用いて間接免疫標識により直接試験した。トリプシン処理により得られた５×10 5 細胞の懸濁液をRCC 培地で２回洗浄し、次いで、細胞をＧ250mAbと共にインキ
ュベートレ、PBS(リン酸塩緩衝化食塩水) 中で３回洗浄し、次いでヤギ抗マウス
IgG 抗体のFITC標識F (ab')2 断片と共にインキュベートした。同じアイソタイ
プを有するNKTAモノクローナル抗体(TCRα/ βのクロノタイプ決定基に対するIg
Ｇ1)(Dr. Thierry Hercend (仏) より好意により提供) を陰性対照として用いた
。フローサイトメトリーをCellguest プログラムを用いてFACScan サイトメータ
ー(Becton-Dickinson 、米国. CA. ニーベイル) を用いて行った。 1.３. エンドサイトーシス実験 Ｇ250 抗体および鉄添加ヒトアポトランスフェリン(Sigma、米国、MO、セント
ルイス) をそれぞれ、フルオレセインイソチオシアネート(Sigma) およびリッサ
ミン・ローダミンＢスルホニルクロライドと、既報(Maxfield et al., 1978、Ce
ll 14: 805-810; Brandzaeg, 1973, Scan. J. Immunol. 2: 273-290)のようにし
て結合させた。セファデックスＧ50カラム(Pharmacia, スウェーデン、ウプサラ
) 上のゲル濾過により、複合タンパク質を遊離蛍光色素から分離する。結合タン
パク質の細胞表面受容体との特異的結合を100 倍高濃度の非結合タンパク質を用
いる競合実験により測定した。メタロチオネイン遺伝子の誘導性プロモーターの
制御下にマウスインターロイキン２ (IL-2)CDNA を含むプラスミドDNA BMGneo-m
IL2(Karasuyama and Melchers 、1988、Eur. J. Immunol. 18: 97-104) (１mg/m
l)を、エタノール中に再生させたEZ-link-Biotin-LC-ASA (２mg/ml)(Pierce 、
米国 IL 、ロックフォード) と共にインキュベート(Vol./Vol.) し、４℃で15分
間、紫外線 (365nm)照射した。次に、プラスミドDNA を−20℃で30分間、エタノ
ール (最終濃度70％) で沈殿させる。標識効率を、ストレプトアビジン結合アル
カリホスファターゼを用いて、poly-L- リシンで被覆したマイクロプレート上で
ELISA アッセイを用いて測定する。
【００４６】 エンドサイトーシスを試験するために、カバーグラス上で２日間培養した細胞
を、ウシ血清アルブミン(BSA) を１mg/ml 含むRPMI-1640(Gibco BRL)で３回洗浄
し、次いで、サイトカラシンＤ (５□M)(Sigma) を添加、または無添加で、37℃
のBSA を１mg/ml 含むRPMI-1640 中で15分間、２回インキュベートする。次いで
、細胞をサイトカラシンＤ (５□M)を添加または無添加で、１mg/ml BSA 含有RP
MI-1640 中で、ローダミン結合トランスフェリン、(50nM)およびFITC標識Ｇ250
モノクローナル抗体と共に４℃で１時間インキュベートし、次に、ローダミン-
トランスフェリンのみ (パルス) と、またはFITC標識Ｇ250mAbと共に、各種時間
の間37℃に移す。
を、ウシ血清アルブミン(BSA) を１mg/ml 含むRPMI-1640(Gibco BRL)で３回洗浄
し、次いで、サイトカラシンＤ (５□M)(Sigma) を添加、または無添加で、37℃
のBSA を１mg/ml 含むRPMI-1640 中で15分間、２回インキュベートする。次いで
、細胞をサイトカラシンＤ (５□M)を添加または無添加で、１mg/ml BSA 含有RP
MI-1640 中で、ローダミン結合トランスフェリン、(50nM)およびFITC標識Ｇ250
モノクローナル抗体と共に４℃で１時間インキュベートし、次に、ローダミン-
トランスフェリンのみ (パルス) と、またはFITC標識Ｇ250mAbと共に、各種時間
の間37℃に移す。
【００４７】 細胞を、冷PBS で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液、４℃PBS 中0.
025 ％のグルタルアルデヒドで20分間固定し、エピ蛍光分析の用意をする。二重
標識によりＧ250mAb- プラスミド複合体の分布を分析するために、細胞を上述の
ようにして、ビオチニル化プラスミドDNA と結合したFITC標識Ｇ250mAb、または
対照としてFITC標識Ｇ250mAbとビオチニル化プラスミドDNA との混合物、のいず
れかと共に連続的にインキュべートする。
025 ％のグルタルアルデヒドで20分間固定し、エピ蛍光分析の用意をする。二重
標識によりＧ250mAb- プラスミド複合体の分布を分析するために、細胞を上述の
ようにして、ビオチニル化プラスミドDNA と結合したFITC標識Ｇ250mAb、または
対照としてFITC標識Ｇ250mAbとビオチニル化プラスミドDNA との混合物、のいず
れかと共に連続的にインキュべートする。
【００４８】 固定後、細胞をPBS 中で２回洗浄し、PBS 中の0.1 ％水素化ホウ素ナトリウム
(ICN、米国、CA、コスタメサ) と共に10分間、次に塩化アンモニウム(50mM 、PB
S 中)(Sigma)と共に10分間インキュベートした。実験条件により、細胞を、FITC
標識Ｇ250mAbを検出するために免疫蛍光により直接分析するか、または0.05％サ
ポニンもしくは0.1 ％TritonＸ100(ICN)を含むPBS で透過性にし、次いで、デキ
サスレッド結合ストレプトアビジン (20mg/ml)(Pierce)で標識する。アクチンフ
ィラメントを、製造者の推奨(Sigma) に従い、ローダミン- ファロイジンで標識
する。
(ICN、米国、CA、コスタメサ) と共に10分間、次に塩化アンモニウム(50mM 、PB
S 中)(Sigma)と共に10分間インキュベートした。実験条件により、細胞を、FITC
標識Ｇ250mAbを検出するために免疫蛍光により直接分析するか、または0.05％サ
ポニンもしくは0.1 ％TritonＸ100(ICN)を含むPBS で透過性にし、次いで、デキ
サスレッド結合ストレプトアビジン (20mg/ml)(Pierce)で標識する。アクチンフ
ィラメントを、製造者の推奨(Sigma) に従い、ローダミン- ファロイジンで標識
する。
【００４９】 次に、細胞をAxiophot顕微鏡 (Zeiss 、独、オーバーコッヘン) で視覚化する
。 1.４. アンチフェクションおよび異種発現の分析 トランスフェクションのために、新たにトリプシン処理したRCC 細胞３×105 個を、無血清のRPMI-1640 １ml中で、各種濃度の本発明のmAb-DNA 複合体と共に
、４℃で30分間インキュベートする。次に細胞を、４×105 Ｍのクロロキン(Sig
ma) を含む無血清RPMI-1640 １ml中で37℃で４時間インキュベートし、最終的に
、glutamax- １(Gibco BRL) と10％ウシ胎仔血清を加えたDMEM２ml中に再懸濁す
る。別の実験において、RCC 細胞を、サイトカラシンＤの存在下、Ｇ250mAbに結
合したマウスIL-2 cDNA と共に、４℃で１時間、および37℃で４時間インキュベ
ートする。
。 1.４. アンチフェクションおよび異種発現の分析 トランスフェクションのために、新たにトリプシン処理したRCC 細胞３×105 個を、無血清のRPMI-1640 １ml中で、各種濃度の本発明のmAb-DNA 複合体と共に
、４℃で30分間インキュベートする。次に細胞を、４×105 Ｍのクロロキン(Sig
ma) を含む無血清RPMI-1640 １ml中で37℃で４時間インキュベートし、最終的に
、glutamax- １(Gibco BRL) と10％ウシ胎仔血清を加えたDMEM２ml中に再懸濁す
る。別の実験において、RCC 細胞を、サイトカラシンＤの存在下、Ｇ250mAbに結
合したマウスIL-2 cDNA と共に、４℃で１時間、および37℃で４時間インキュベ
ートする。
【００５０】 まだ細胞表面に結合している複合体を、0.1 Ｍグリシンを含むRPMI-1640 溶液
(pH 2.2) を用いて４℃で２分間、分離させた。次いで２容量のRPMI-1640 (pH
9.0)を３分間かけて加え、細胞を通常の培地中でインキュベートする。マウスイ
ンターロイキン２の産生を測定するために、100 μl 細胞培養上清をトランスフ
ェクションから種々の日数後に除去した。培地中のサイトカイン産生は、マウス
IL-2特異的DuoSeT ELISAキット (参照番号80-3573-00)(15pg/ml 検出限定)(Genz
yme Diagnostics 、米国、MA、ケンブリッジ) を用いて測定した。
(pH 2.2) を用いて４℃で２分間、分離させた。次いで２容量のRPMI-1640 (pH
9.0)を３分間かけて加え、細胞を通常の培地中でインキュベートする。マウスイ
ンターロイキン２の産生を測定するために、100 μl 細胞培養上清をトランスフ
ェクションから種々の日数後に除去した。培地中のサイトカイン産生は、マウス
IL-2特異的DuoSeT ELISAキット (参照番号80-3573-00)(15pg/ml 検出限定)(Genz
yme Diagnostics 、米国、MA、ケンブリッジ) を用いて測定した。
【００５１】
【実施例２】複合体Ｇ250/BZQ/I12 およびＧ250/BZQ/I12 ＋ExoT 2.１. 複合体Ｇ250/BZQ/I12 の調製 複合体Ｇ250/BZQ/I12 を、Poncet等(1996 、Gene Therapy３：731-738)により
既報の結合方法により、ベンゾキノン(BZQ) を用いる、Ｇ250 モノクローナル抗
体とマウスインターロイキン２(mIl-2) をコードするプラスミドの間の結合によ
り製造する。
既報の結合方法により、ベンゾキノン(BZQ) を用いる、Ｇ250 モノクローナル抗
体とマウスインターロイキン２(mIl-2) をコードするプラスミドの間の結合によ
り製造する。
【００５２】 30mg/ml の濃度で無水エタノールに溶解したBZQ を３mg/ml のBZQ を含む最終
溶液を得るように、少なくとも２mg/ml の濃度でPBS 中に溶解した精製モノクロ
ーナル抗体溶液に加える。次いで、最終容量の1/10を、１M リン酸カリウム緩衝
液 (pH6.0)の形で加える。室温の暗中で90分後、活性化モノクローナル抗体を、
0.15M NaCl中の１％BSA で予め飽和させたＧ25Ｍカラム (Pharmacia)上のクロマ
トグラフィーにより過剰BZA から分離し、集め、そして精製プラスミドDNA ( 抗
体量の10倍) と混合する。溶液を0.1 M 炭酸塩緩衝液 (pH8.7)と混合し、４℃で
48時間インキュベートする。mAb-DNA 複合体を、DNA-抗体複合体と競合すると思
われる過剰な遊離抗体を除去するために、Superose６HR FPLC カラム (Pharmac
ia) 上のゲル濾過により濃縮する。集めた画分をPBS で透析し、Centricon 10カ
ートリッジ(Amicon.米国. MA) を用いて濃縮する。精製した可溶性複合体の量を
、反応に最初に用いたプラスミドDNA 量として表す。 2.２. 複合体Ｇ250/BZQ/I12 およびＧ250/BZQ/I12 ＋ExoTを用いたRCC 系のアン
チフェクション 我々は、培地にシュードモナス・アエルギノーサの外毒素Ａ(ExoT)を添加後、
または添加せずに、この複合体をRCC 系に導入した後、I1-2測定値を比較した。
Sigma より市販されている外毒素Ａを複合体Ｇ250/BZQ/I12 に加える。
溶液を得るように、少なくとも２mg/ml の濃度でPBS 中に溶解した精製モノクロ
ーナル抗体溶液に加える。次いで、最終容量の1/10を、１M リン酸カリウム緩衝
液 (pH6.0)の形で加える。室温の暗中で90分後、活性化モノクローナル抗体を、
0.15M NaCl中の１％BSA で予め飽和させたＧ25Ｍカラム (Pharmacia)上のクロマ
トグラフィーにより過剰BZA から分離し、集め、そして精製プラスミドDNA ( 抗
体量の10倍) と混合する。溶液を0.1 M 炭酸塩緩衝液 (pH8.7)と混合し、４℃で
48時間インキュベートする。mAb-DNA 複合体を、DNA-抗体複合体と競合すると思
われる過剰な遊離抗体を除去するために、Superose６HR FPLC カラム (Pharmac
ia) 上のゲル濾過により濃縮する。集めた画分をPBS で透析し、Centricon 10カ
ートリッジ(Amicon.米国. MA) を用いて濃縮する。精製した可溶性複合体の量を
、反応に最初に用いたプラスミドDNA 量として表す。 2.２. 複合体Ｇ250/BZQ/I12 およびＧ250/BZQ/I12 ＋ExoTを用いたRCC 系のアン
チフェクション 我々は、培地にシュードモナス・アエルギノーサの外毒素Ａ(ExoT)を添加後、
または添加せずに、この複合体をRCC 系に導入した後、I1-2測定値を比較した。
Sigma より市販されている外毒素Ａを複合体Ｇ250/BZQ/I12 に加える。
【００５３】 複合体Ｇ250/BZQ/I12 およびＧ250/BZQ/I12 ＋ExoTを、既報のプロトコルによ
り、37℃で４時間、無血清培地中で培養したRCC 系細胞105 個と接触させる。細
胞を洗浄後、通常の培地中での培養にもどす。I1-2の産生を、DuoSeT ELISAキッ
ト (参照番号80-3573-00 Genzyme Diagnostics) を用いて10日後に測定する。
り、37℃で４時間、無血清培地中で培養したRCC 系細胞105 個と接触させる。細
胞を洗浄後、通常の培地中での培養にもどす。I1-2の産生を、DuoSeT ELISAキッ
ト (参照番号80-3573-00 Genzyme Diagnostics) を用いて10日後に測定する。
【００５４】 複合体Ｇ250/BZQ/I12 ＋ExoTを用いてアンチフエクトした細胞は、複合体Ｇ25
0/BZQ/I12 でアンチフェクトした細胞(165pg/106細胞) よりも約３倍多いマウス
I1-2(371 pg/106 細胞) を産生する。
0/BZQ/I12 でアンチフェクトした細胞(165pg/106細胞) よりも約３倍多いマウス
I1-2(371 pg/106 細胞) を産生する。
【００５５】
【実施例３】複合体ビオチニル化Ｇ250/アビジン/-BZQ/PL/I12およびビオチニ
ル化( Ｇ250 ＋ExoT)/アビジン/BZQ/PL/112 3.１. 複合体の製造 複合体ビオチニル化Ｇ250/- アビジン/BZQ/PL/Il2 およびビオチニル化 (Ｇ25
0 ＋ExoT)/アビジン/-BZQ/PL/Il2の中心部は、４価のアビジン(Av)分子からなり
、これはまず上述のプロトコルによりベンゾキノンで活性化される。活性化アビ
ジンは、DNA に対して高親和性を有する分子であるポリ-L-リシンを結合する。
アビジン/BZQ/PL 複合体をマウスインターロイキン２(Il-2)をコードするプラス
ミドと接触させる。次に、この複合体をＧ250 モノクローナル抗体および／また
は外毒素Ａ(ExoT) (両者とも予めビオチニル化する) と結合させる。 3.２. 複合体ビオチニル化Ｇ250/アビジン/BZQ/ PL/Il2およびビオチニル化( Ｇ
250 ＋ExoT)/アビジン/BZQ/ PL/I2 によるRCC 系のアンチフェクション 各種複合体を、上記のプロトコルによって、37℃で４時間、無血清培地で培養
したRCC 系細胞105 個と接触させる。細胞を洗浄後、通常の培地での培養にもど
す。10日後にDuoSet ELISAキット (参照番号80-3573-00、Genzyme Diagnostics)
を用いて、Il-2産生を測定する。
ル化( Ｇ250 ＋ExoT)/アビジン/BZQ/PL/112 3.１. 複合体の製造 複合体ビオチニル化Ｇ250/- アビジン/BZQ/PL/Il2 およびビオチニル化 (Ｇ25
0 ＋ExoT)/アビジン/-BZQ/PL/Il2の中心部は、４価のアビジン(Av)分子からなり
、これはまず上述のプロトコルによりベンゾキノンで活性化される。活性化アビ
ジンは、DNA に対して高親和性を有する分子であるポリ-L-リシンを結合する。
アビジン/BZQ/PL 複合体をマウスインターロイキン２(Il-2)をコードするプラス
ミドと接触させる。次に、この複合体をＧ250 モノクローナル抗体および／また
は外毒素Ａ(ExoT) (両者とも予めビオチニル化する) と結合させる。 3.２. 複合体ビオチニル化Ｇ250/アビジン/BZQ/ PL/Il2およびビオチニル化( Ｇ
250 ＋ExoT)/アビジン/BZQ/ PL/I2 によるRCC 系のアンチフェクション 各種複合体を、上記のプロトコルによって、37℃で４時間、無血清培地で培養
したRCC 系細胞105 個と接触させる。細胞を洗浄後、通常の培地での培養にもど
す。10日後にDuoSet ELISAキット (参照番号80-3573-00、Genzyme Diagnostics)
を用いて、Il-2産生を測定する。
【００５６】 結果を図２に示す。Ｇ250 モノクローナル抗体を省いた対照実験では、mIl-2
の産生がいくらか測定され(127pg/106細胞、AvPL) 、これは確かに細胞表面への
ポリ-L- リシンの、および／またはアビジン分子の非特異的連結による。
の産生がいくらか測定され(127pg/106細胞、AvPL) 、これは確かに細胞表面への
ポリ-L- リシンの、および／またはアビジン分子の非特異的連結による。
【００５７】 Ｇ250mAbをアビジン/BZQ/ PL/Il2複合体に付加すると、マウスインターロイキ
ン２の産生を２倍向上させ(127pg/106細胞の代わりに261pg/106 細胞);外毒素Ａ
(ExoT)をさらに存在させると、mIl-2 の産生を10倍に向上させる(1347pg/106 細
胞)(図２) ことができる。
ン２の産生を２倍向上させ(127pg/106細胞の代わりに261pg/106 細胞);外毒素Ａ
(ExoT)をさらに存在させると、mIl-2 の産生を10倍に向上させる(1347pg/106 細
胞)(図２) ことができる。
【００５８】
【実施例４】複合体ビオチニル化Ｇ250/ニュートラビジン/-ビオチニル化ヒス
トンH1/ ビオチニル化インフルエンザ赤血球凝集素(HA)融合誘導性ペプチド/CD4 図に示す各種複合体を、実施例３の3.2 節に記載のようにして、 RCCと接触さ
せる。
トンH1/ ビオチニル化インフルエンザ赤血球凝集素(HA)融合誘導性ペプチド/CD4 図に示す各種複合体を、実施例３の3.2 節に記載のようにして、 RCCと接触さ
せる。
【００５９】 図３は、ヒトCD4 分子をコードするcDNAのアンチフェクション後７日目に集め
た、G250Agを有し、ヒト抗CD4mAbで標識したヒト RCC細胞のフローサイトメトリ
ーの解析を示す。この方法では、約20％の細胞がこの分子を発現する。用いるベ
クターはG250、H1、Ha、cDNAの分子すべてを含む。使用するHAペプチドの配列は
以下の通りである： GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGCGSGSYTDIEMNRLGKG
た、G250Agを有し、ヒト抗CD4mAbで標識したヒト RCC細胞のフローサイトメトリ
ーの解析を示す。この方法では、約20％の細胞がこの分子を発現する。用いるベ
クターはG250、H1、Ha、cDNAの分子すべてを含む。使用するHAペプチドの配列は
以下の通りである： GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGCGSGSYTDIEMNRLGKG
【００６０】
【実施例５】複合体ビオチニル化Ｇ250/ニュートラビジン/-ビオチニル化ヒスト
ンH1/Il2および複合体ビオチニル化Ｇ250/ニュートラビジン/ ビオチニル化ヒス
トンH1/ ビオチニル化HA融合誘導性ペプチド/Il2 図４は、マウスインターロイキン-2をコードするcDNAのアンチフェクション後
11日目に集めた、G250 Ag を有するヒト RCC細胞のアンチフェクションの結果を
示す。それ自身で、またはニュートラビジンに結合してcDNAに接触させた RCCに
より分泌されるIL-2の量は80pg/106細胞であり、G250/H1/cDNAを含む複合体と接
触させた RCCにより分泌されるIL-2の量は1200pg/106細胞であり、G250/H1/HA/c
DNA を含む複合体と接触させた RCCにより分泌されるIL-2の量は3100pg/106細胞
である。
ンH1/Il2および複合体ビオチニル化Ｇ250/ニュートラビジン/ ビオチニル化ヒス
トンH1/ ビオチニル化HA融合誘導性ペプチド/Il2 図４は、マウスインターロイキン-2をコードするcDNAのアンチフェクション後
11日目に集めた、G250 Ag を有するヒト RCC細胞のアンチフェクションの結果を
示す。それ自身で、またはニュートラビジンに結合してcDNAに接触させた RCCに
より分泌されるIL-2の量は80pg/106細胞であり、G250/H1/cDNAを含む複合体と接
触させた RCCにより分泌されるIL-2の量は1200pg/106細胞であり、G250/H1/HA/c
DNA を含む複合体と接触させた RCCにより分泌されるIL-2の量は3100pg/106細胞
である。
【００６１】
【実施例６】ビオチニル化Ｇ250/ニュートラビジン/ ビオチニル化ヒストンH1/B
AXおよびビオチニル化Ｇ250/ニュートラビジン/-ビオチニル化H1ヒストン/ ビオ
チニル化HA融合誘導性ペプチド/BAX 図５は、ヒトBAX プロアポトーシス分子をコードするcDNAのアンチフェクショ
ン後11日目に集めた、G250 Ag を有するヒト RCC細胞のアンチフェクションの結
果を示す。細胞死をトリパンブルー染色により評価した。使用する対照cDNAは、
グリーン蛍光タンパク質(GFP) 遺伝子に相当する。G250 mAb、「HAを含有しない
ベクターBAX 」の連結に関連して生存率の減少においてかなりの増加が認められ
、これはHA融合誘導性ペプチド、「HAを含有するベクターBAX 」を連結すること
により増加する。
AXおよびビオチニル化Ｇ250/ニュートラビジン/-ビオチニル化H1ヒストン/ ビオ
チニル化HA融合誘導性ペプチド/BAX 図５は、ヒトBAX プロアポトーシス分子をコードするcDNAのアンチフェクショ
ン後11日目に集めた、G250 Ag を有するヒト RCC細胞のアンチフェクションの結
果を示す。細胞死をトリパンブルー染色により評価した。使用する対照cDNAは、
グリーン蛍光タンパク質(GFP) 遺伝子に相当する。G250 mAb、「HAを含有しない
ベクターBAX 」の連結に関連して生存率の減少においてかなりの増加が認められ
、これはHA融合誘導性ペプチド、「HAを含有するベクターBAX 」を連結すること
により増加する。
【００６２】
【実施例７】複合体ビオチニル化5C5/ニュートラビジン/ ビオチニル化ヒストン
H1/ ビオチニル化HA融合誘導性ペプチド/ マウスBAX でのin vivo アンチフェク
ション 7.1 プロトコル 以下を用いて各種の複合体を調製する： −10μｇ5C5 抗体 −30μｇマウスBAX DNA −15μｇヒストンH1 −0.5 μｇHAペプチド −４μｇニュートラビジン ０日目(D＝0)に、対照として働く９匹の照射ヌードマウスに RCC腫瘍を皮下移
植した。
H1/ ビオチニル化HA融合誘導性ペプチド/ マウスBAX でのin vivo アンチフェク
ション 7.1 プロトコル 以下を用いて各種の複合体を調製する： −10μｇ5C5 抗体 −30μｇマウスBAX DNA −15μｇヒストンH1 −0.5 μｇHAペプチド −４μｇニュートラビジン ０日目(D＝0)に、対照として働く９匹の照射ヌードマウスに RCC腫瘍を皮下移
植した。
【００６３】 D＝0 および D＝７において10匹の照射ヌードマウスに RCC腫瘍を皮下移植し
た；これらのマウスに１回の注射により静脈内に複合体ニュートラビジン/HA/H1
/Baxを投与した。
た；これらのマウスに１回の注射により静脈内に複合体ニュートラビジン/HA/H1
/Baxを投与した。
【００６４】 D＝0 および D＝７において10匹の照射ヌードマウスに RCC腫瘍を皮下移植し
た；これらマウスに１回の注射により静脈内に複合体5C5/ニュートラビジン/HA/
H1/Baxを投与した。
た；これらマウスに１回の注射により静脈内に複合体5C5/ニュートラビジン/HA/
H1/Baxを投与した。
【００６５】 次いで、腫瘍の大きさを、注射後D5,D8,D12 およびD19 において評価した。マ
ウスをD19 において致死させた。 7.2 結果 腫瘍増殖は、対照群にみられる増殖より小さく、第１回目の注射後19日目に、
完全複合体を投与された10匹のマウス中６匹に、抗体非含有複合体で処置した群
の10匹中１匹に、その減少がみられる (図６) 。
ウスをD19 において致死させた。 7.2 結果 腫瘍増殖は、対照群にみられる増殖より小さく、第１回目の注射後19日目に、
完全複合体を投与された10匹のマウス中６匹に、抗体非含有複合体で処置した群
の10匹中１匹に、その減少がみられる (図６) 。
【００６６】 興味深いことに、ナチュラルキラー細胞 (NK細胞) 、マクロファージおよび顆
粒球上に存在するマウスCD16分子に対する蛍光mAb を用いた、Bax でアンチフェ
クションした腫瘍に見られる標識は、抗腫瘍応答に十分に寄与しうるエフェクタ
ー細胞を補充する可能性を明らかに示している。
粒球上に存在するマウスCD16分子に対する蛍光mAb を用いた、Bax でアンチフェ
クションした腫瘍に見られる標識は、抗腫瘍応答に十分に寄与しうるエフェクタ
ー細胞を補充する可能性を明らかに示している。
【００６７】
【図１】 図１は、外毒素Ａの存在下または不在下で、複合体G250/BZQ/Il2 (G250＝ DNA
) を用いてアンチフェクションされたRCC 系によるマウスインターロイキン２の
産生を示す図である。
) を用いてアンチフェクションされたRCC 系によるマウスインターロイキン２の
産生を示す図である。
【図２】 図２は、複合体ビオチニル化G250/ アビジン/BZQ/PL/Il2 (G250AvPL) および
ビオチニル化(G250+ExoT)/アビジン/BZQ/PL/Il2 (G250AvPLTox)を用いてアンチ
フェクションされたRCC 系によるマウスインターロイキン２の産生を示す図であ
る；陰性対照：アビジン/BZQ/PL/Il2 (AvPL)。
ビオチニル化(G250+ExoT)/アビジン/BZQ/PL/Il2 (G250AvPLTox)を用いてアンチ
フェクションされたRCC 系によるマウスインターロイキン２の産生を示す図であ
る；陰性対照：アビジン/BZQ/PL/Il2 (AvPL)。
【図３】 図３は、in vitroアンチフェクション後のヒト腎がん細胞表面でのCD4 分子の
発現 (陽性細胞％) を示す図である。
発現 (陽性細胞％) を示す図である。
【図４】 図４は、in vitroでのヒト腎がん細胞のアンチフェクション後11日目のマウス
IL-2分泌の測定を示す図である。
IL-2分泌の測定を示す図である。
【図５】 図５は、ヒトBax cDNAでのin vitroアンチフェクション後のヒト腎（ラクナ）
細胞死の誘導を示す図である。
細胞死の誘導を示す図である。
【図６】 図６は、７日目での注射 (DNA 30μｇ) による、マウスBax cDNAでのin vivo
アンチフェクション後の、腫瘍移植後７日目および19日目で得られる腫瘍体積の
測定を示す図である。
アンチフェクション後の、腫瘍移植後７日目および19日目で得られる腫瘍体積の
測定を示す図である。
【図７】 図７は、マウスBax cDNAでのアンチフェクション後の、CD16+ 細胞での腫瘍の
浸潤を示す図である。
浸潤を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/42 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｈ０４５ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 3/06 21/00 21/00 25/14 25/14 25/16 25/16 25/28 25/28 31/04 31/04 35/00 35/00 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デュラバック、アントワーヌ フランス国、94170ル・ペルー、リュー・ デ・シャン、１ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA44 BA80 CA01 CA11 DA03 GA11 HA01 HA17 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 4C076 AA95 CC01 CC07 CC21 CC27 CC31 DD66 EE13 EE41 FF02 4C084 AA02 AA13 DA01 DB52 DC01 NA14 ZA152 ZA162 ZA942 ZB082 ZB262 ZB352 4C086 AA01 AA02 EA16 FA03 MA01 MA06 NA14 ZA15 ZA16 ZA51 ZA94 ZB08 ZB26 ZB35 4H045 AA11 AA20 AA30 BA41 BA54 CA40 DA00 DA76 EA20 FA72 FA74
Claims (63)
- 【請求項１】 核酸分子を細胞に導入するための複合体であり、該複合体が
効率的に該細胞にトランスフェクトされるように、該複合体が、核酸分子、トラ
ンスロケーション (輸送) ドメインおよび該細胞の表面抗原に対して特異的な抗
体を含み、該核酸分子、該トランスロケーションドメインおよび該抗体が少なく
とも１種の架橋剤により連結していることを特徴とする、前記複合体。 - 【請求項２】 前記複合体が、少なくとも１種の糖分解及び／又はタンパク
質分解酵素により切断されうるペプチドをさらに含み、前記抗体が該切断可能な
ペプチドを介して前記トランスロケーションドメインに連結されていることを特
徴とする、請求項１記載の複合体。 - 【請求項３】 前記抗体および前記切断可能なペプチドが、好ましくはベン
ゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択された架橋剤を介して共有結合に
より連結されている、請求項２記載の複合体。 - 【請求項４】 前記抗体および前記切断可能なペプチドが、同じでも異なっ
ていてもよい、好ましくはビオチン、ベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群
より選択された架橋剤によってアビジン型の分子へ、連結されている、請求項２
記載の複合体。 - 【請求項５】 前記トランスロケーションドメインが、共有化学結合を介し
て前記切断可能なペプチドに連結されている、請求項３または４記載の複合体。 - 【請求項６】 前記トランスロケーションドメインが、架橋剤により核酸分
子に連結されている、請求項５記載の複合体。 - 【請求項７】 架橋剤がAPDPである、請求項６記載の複合体。
- 【請求項８】 前記抗体が、前記架橋剤EDC により共有結合を介して、前記
切断可能なペプチドに連結され、該切断可能なペプチドが化学的連結により共有
結合を介して前記トランスロケーションドメインに連結され、該トランスロケー
ションドメインが前記架橋剤APDPにより共有結合を介して前記核酸に連結されて
いる、請求項６または７記載の複合体。 - 【請求項９】 前記トランスロケーションドメインと前記核酸分子間の連結
が、核酸結合分子により生成し、該核酸結合分子が、架橋剤により共有結合を介
して該トランスロケーションドメインに連結されている、請求項５記載の複合体
。 - 【請求項10】 前記架橋剤がAPDPである請求項９記載の複合体。
- 【請求項11】 前記抗体が前記架橋剤EDC により共有結合を介して前記切断
可能なペプチドに連結され、該切断可能なペプチドは化学的連結により共有結合
を介して前記トランスロケーションドメインに連結され、該トランスロケーショ
ンドメインが前記架橋剤APDPにより共有結合を介して前記核酸結合分子に連結さ
れ、該核酸結合分子が非共有結合を介して前記核酸を結合している、請求項９ま
たは10記載の複合体。 - 【請求項12】 前記複合体が、さらに核酸結合分子を含むことを特徴とし、
前記トランスロケーションドメイン、前記抗体および前記核酸結合分子が、同じ
でも異なっていてもよい架橋剤によりアビジン型の分子に連結され、該核酸結合
分子は前記核酸分子を結合している、請求項１記載の複合体。 - 【請求項13】 複合体がさらに核酸結合分子および少なくとも１種の糖分解
及び／又はタンパク質分解酵素により切断されうるペプチドを含むことを特徴と
し、前記トランスロケーションドメイン、前記抗体および前記切断可能なペプチ
ドが、同じでも異なっていてもよい架橋剤によりアビジン型の分子に連結され、
該核酸結合分子が前記核酸分子に結合され、該核酸結合分子が該切断可能なペプ
チドに連結され、かつ該核酸分子に結合されている、請求項１記載の複合体。 - 【請求項14】 核酸分子を細胞に導入するための複合体であり、該複合体が
該細胞に効率的にトランスフェクトされるように、核酸分子、細胞表面抗原に対
して特異的な抗体、および核酸結合分子を含むことを特徴とする、前記複合体。 - 【請求項15】 前記複合体が、少なくとも１種の糖分解及び／又はタンパク
質分解酵素により切断されうるペプチドをさらに含み、前記抗体がこの切断可能
なペプチドを介して前記核酸結合分子に連結されている、請求項14記載の複合体
。 - 【請求項16】 前記抗体および前記切断可能なペプチドが、好ましくはベン
ゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択される架橋剤を介して共有結合に
より連結されている、請求項15記載の複合体。 - 【請求項17】、前記抗体および前記切断可能なペプチドが、同じでも異なっ
ていてもよい、好ましくはビオチン、ベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群
より選択される架橋剤によってアビジン型の分子に連結されている請求項15記載
の複合体。 - 【請求項18】 前記切断可能なペプチドが、架橋剤により前記核酸結合分子
に連結され、該核酸結合分子が、非共有結合性の連結を介して前記核酸を結合し
ている、請求項16または17記載の複合体。 - 【請求項19】 前記架橋剤が、APDPである、請求項18記載の複合体。
- 【請求項20】 核酸分子を細胞に導入するための複合体であり、該複合体が
該細胞に効率的にトランスフェクトされるように、核酸分子、細胞表面抗原に対
して特異的な抗体、および少なくとも１種の糖分解及び／又はタンパク質分解酵
素により切断されうるペプチドを含むことを特徴とする、前記複合体。 - 【請求項21】 前記抗体および前記切断可能なペプチドが、好ましくはベン
ゾキノン、EDC およびAPDPからなる群より選択される架橋剤を介して共有結合に
より、連結されている、請求項20記載の複合体。 - 【請求項22】 前記抗体および前記切断可能なペプチドが、同じでも異なっ
ていてもよい、好ましくはビオチン、ベンゾキノン、EDC およびAPDPからなる群
より選択される架橋剤によってアビジン型の分子に連結されている、請求項20記
載の複合体。 - 【請求項23】 前記切断可能なペプチドが、架橋剤により共有結合を介して
前記核酸に連結されている、請求項21または22記載の複合体。 - 【請求項24】 前記切断可能なペプチドと前記核酸分子間の連結が、核酸結
合分子により形成され、該核酸結合分子が、架橋剤により共有結合を介して該切
断可能なペプチドに連結されている、請求項21または22記載の複合体。 - 【請求項25】 前記架橋剤がAPDPである、請求項23または24記載の複合体。
- 【請求項26】 さらにトランスロケーションドメインを含む、請求項20ない
し25のいずれかに記載の複合体。 - 【請求項27】 前記トランスロケーションドメインが、前記核酸分子及び／
又は前記核酸結合分子に架橋剤により共有結合的に連結されている、請求項26記
載の複合体。 - 【請求項28】 前記架橋剤が、ベンゾキノン、ビオチン、カルボジイミド類
および紫外線と反応するフェニルアジド基を少なくとも１つ有する架橋剤からな
る群より選択される、請求項１、６、８、13、14、17および22のいずれかに記載
の複合体。 - 【請求項29】 前記架橋剤がベンゾキノン、ビオチン、EDC およびADPDから
なる群より選択される、請求項１記載の複合体。 - 【請求項30】 前記トランスロケーションドメインおよび前記抗体をアビジ
ン型の分子に連結する架橋剤がビオチンであり、前記核酸結合分子をアビジン型
の分子に連結する架橋剤がベンゾキノンである、請求項12記載の複合体。 - 【請求項31】 前記トランスロケーションドメインおよび前記抗体をアビジ
ン型の分子に連結する架橋剤がビオチンであり、前記切断可能なペプチドをアビ
ジン型の分子に連結する架橋剤がベンゾキノンである、請求項13記載の複合体。 - 【請求項32】 前トランスロケーションドメイン、前記抗体および前記核酸
結合分子を連結する架橋剤がビオチンである、請求項12記載の複合体。 - 【請求項33】 前記トランスロケーションドメイン、前記抗体および前記切
断可能なペプチドを連結する架橋剤がビオチンである、請求項13記載の複合体。 - 【請求項34】 前記抗体をアビジン型の分子に連結する架橋剤がビオチンで
あり、前記核酸結合分子をアビジン型の分子に連結する架橋剤がベンゾキノンで
ある、請求項17記載の複合体。 - 【請求項35】 前記架橋剤がビオチンである、請求項17記載の複合体。
- 【請求項36】 前記核酸分子が一本鎖 DNA、二本鎖 DNA、一本鎖 RNA、二本
鎖 RNAおよびRNA/DNA ハイブリッドから選択される、請求項１ないし35のいずれ
かに記載の複合体。 - 【請求項37】 前記核酸分子が、前記細胞において効率的に発現される、関
心対象のタンパク質産物をコードする二本鎖 DNAまたは一本鎖 RNA である、請
求項36記載の複合体。 - 【請求項38】 前記関心対象のタンパク質産物が、サイトカイン類、リンホ
カイン類、ケモカイン類、増殖因子類、キラー遺伝子、化学的抵抗性を向上させ
ることが可能な遺伝子および制限酵素類から選択される、請求項35記載の複合体
。 - 【請求項39】 関心対象のタンパク質産物がBax タンパク質である、請求項
38記載の複合体。 - 【請求項40】 前記核酸分子がアンチセンスRNA である、請求項36記載の複
合体。 - 【請求項41】 核酸結合分子が非共有結合性の連結を介して核酸分子を結合
する、請求項８ないし10、12ないし19、24、30、32および34のいずれかに記載の
複合体。 - 【請求項42】 核酸結合分子がポリカチオン性ポリマーまたは核酸結合タン
パク質である請求項８ないし10、12ないし19、24、30、32、34および41のいずれ
かに記載の複合体。 - 【請求項43】 前記ポリカチオン性ポリマーがポリ-L- リシン、ポリ-D- リ
シン、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン、ポリアミンおよび遊離ポリカチ
オンから選択される請求項42記載の複合体。 - 【請求項44】 前記ポリカチオン性ポリマーがポリ-L- リシンである、請求
項43記載の複合体。 - 【請求項45】 前記核酸結合タンパク質が、ヒストン、プロタミン、オルニ
チン、プトレッシン、スペルミジン、スペルミン、転写因子およびホメオボック
スタンパク質から選択される、請求項42記載の複合体。 - 【請求項46】 前記核酸結合タンパク質がプロタミン及びヒストンからなる
群より選択される、請求項45記載の複合体。 - 【請求項47】 前記トランスロケーションドメインが、ウイルス毒素由来で
あるが、その毒性を及ぼす毒素の部分を含まない、請求項１ないし13、26、27お
よび30ないし33のいずれかに記載の複合体。 - 【請求項48】 前記トランスロケーションドメインがハエモフィラス (Haem
ophilus)Ａ赤血球凝集素のフラグメントである、請求項47記載の複合体。 - 【請求項49】 前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
である請求項１ないし48のいずれかに記載の複合体。 - 【請求項50】 前記抗体が、膜結合表面抗原に特異的である請求項49記載の
複合体。 - 【請求項51】 前記抗原がG250抗原である請求項50記載の複合体。
- 【請求項52】 前記抗体が、受託番号I-2184としてCNCMに寄託された5C5 ハ
イブリドーマを用いて得られる5C5 モノクローナル抗体である、請求項50記載の
複合体。 - 【請求項53】 医薬品として請求項１ないし52のいずれかに記載の複合体。
- 【請求項54】 遺伝子治療用の医薬品としての、請求項１ないし52のいずれ
かに記載の複合体。 - 【請求項55】 後天的もしくは構成的遺伝子疾患の治療のための医薬品とし
ての請求項53または54記載の複合体。 - 【請求項56】 がんおよび感染症から選択される後天的遺伝子疾患の治療用
の医薬品としての、請求項55記載の複合体。 - 【請求項57】 腎細胞がん (RCC)の治療用医薬品としての請求項56記載の複
合体。 - 【請求項58】 前記細胞を前記複合体でトランスフェクトするように、該細
胞を該複合体に接触させることを特徴とする、核酸分子を細胞に導入するための
医薬品としての、請求項１ないし52のいずれかに記載の複合体。 - 【請求項59】 前記核酸分子が、前記トランスフェクトされた細胞において
効率的に発現される関心対象のタンパク質産物をコードする、請求項58記載の複
合体。 - 【請求項60】 前記核酸分子が、前記細胞の染色体外レプリコンの形態に維
持される、請求項58記載の複合体。 - 【請求項61】 前記核酸分子が、前記トランスフェクトされた細胞のゲノム
及び／又はミトコンドリア DNAに組み込まれる、請求項58記載の複合体。 - 【請求項62】 前記細胞が真核細胞である請求項58ないし61のいずれかに記
載の複合体。 - 【請求項63】 請求項１ないし52のいずれかに記載の複合体の治療有効量お
よび薬剤に許容されるビヒクルを含む、特に、遺伝子治療により疾患を治療する
ための薬剤組成物。
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