CN108530540B

CN108530540B - 抗亚精胺单克隆抗体杂交瘤细胞株4e4及其单克隆抗体和应用

Info

Publication number: CN108530540B
Application number: CN201810296481.3A
Authority: CN
Inventors: 王建和; 张炼辉
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2038-03-30
Also published as: CN108530540A

Abstract

本发明属于细胞免疫技术领域，具体公开了抗亚精胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E4及其单克隆抗体和应用。所述杂交瘤细胞株4E4于2018年3月2日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO:C201841。所述杂交瘤细胞株4E4分泌的抗亚精胺单克隆抗体4E4能够特异地识别亚精胺和精胺，通过阻断多胺的吸收和下调T3SS基因表达来保护A549细胞对抗绿脓杆菌感染。所述抗亚精胺单克隆抗体4E4能降低血清中亚精胺水平，减轻小鼠肺的损伤从而显著提高小鼠存活率，可用于制备治疗绿脓杆菌感染的药物或制剂，具有很好的推广应用前景。

Description

抗亚精胺单克隆抗体杂交瘤细胞株4E4及其单克隆抗体和应用

技术领域

本发明涉及细胞免疫技术领域，具体地，涉及抗亚精胺单克隆抗体杂交瘤细胞株4E4及其单克隆抗体和应用。

背景技术

绿脓杆菌(P.aeruginosa)是一种重要细菌病原体，可引起囊性纤维化患者和免疫力弱的个体严重感染，这种细菌病原体的感染往往伴随高的死亡率。绿脓杆菌能引起上皮损伤，并逃避宿主先天免疫反应的作用，主要是由于它可以经过III型分泌系统(T3SS)直接将其表达的毒性效应蛋白转运到真核细胞中。许多研究已经证明，T3SS是绿脓杆菌的关键毒力决定因素，它在通过操纵真核宿主细胞急性感染应答方面起重要作用。

T3SS系统可以由哺乳动物宿主的多胺信号亚精胺(Spermidine)和精胺(Spermine)激活。亚精胺由真核和原核生物产生，是诱导T3SS基因表达起关键作用的信号。相关研究表明，由spuDEFGH编码的亚精胺转运基因缺失，能显著降低T3SS基因表达，且减弱绿脓杆菌对Hela细胞系的感染毒性。因此，制备能特异性识别亚精胺的单克隆抗体将有利于治疗由绿脓杆菌感染引起的一系列疾病。但是，现有技术中尚未有能分泌特异性识别亚精胺的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的相关报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一株分泌抗亚精胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E4。

本发明的另一目的在于提供上述杂交瘤细胞株4E4分泌的抗亚精胺单克隆抗体4E4，能够特异地识别亚精胺和精胺，通过阻断多胺的吸收和下调T3SS基因表达来保护A549细胞对抗绿脓杆菌感染。

本发明的另一目的在于提供上述抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备降低血清中亚精胺水平的制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备抑制T3SS基因表达的制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备含T3SS系统的革兰氏阴性致病菌的治疗药物或制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备治疗绿脓杆菌感染的药物或制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备检测亚精胺和/或精胺的制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种治疗绿脓杆菌感染的药物或制剂。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一株分泌抗亚精胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E4，所述杂交瘤细胞株4E4于2018年3月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C201841，保藏地址为中国武汉。

上述杂交瘤细胞株的制备方法如下：先制备亚精胺载体蛋白藕合物HSA-亚精胺和OVA-亚精胺，用弗氏完全佐剂乳化的HSA-亚精胺藕合物皮下注射BALB/c小鼠，再用弗氏不完全佐剂乳化；最后一次加强免疫后取免疫鼠脾脏，悬浮脾脏组织成游离细胞后用常规技术与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，以产生杂交瘤细胞。用ELISA检测细胞上清液，经过多次有限稀释亚克隆筛选，最后获得稳定分泌、高效价、高特异性的抗亚精胺单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株4E4，然后进行保藏。

由上述杂交瘤细胞株4E4分泌得到的抗亚精胺单克隆抗体4E4，为IgG1亚类、包含轻链KAPA。

所述抗亚精胺单克隆抗体4E4的制备方法为：用上述保藏编号为CCTCC NO:C201841的杂交瘤细胞株注射用石蜡预处理过的BALB/c小鼠生产腹水，腹水经分离纯化后得到抗亚精胺单克隆抗体4E4。

体外研究表明，所述抗亚精胺单克隆抗体4E4通过阻断亚精胺的摄取和下调T3SS基因的表达，显著减少绿脓杆菌对A549细胞的细胞毒性。抗亚精胺单克隆抗体4E4的单次注射可以大大降低小鼠血清亚精胺含量，血清中低水平的亚精胺维持近一周，显著提高绿脓杆菌感染小鼠的存活率。

因此，本发明还请求保护所述的抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备降低血清中亚精胺水平的制剂中的应用。

本发明还请求保护所述的抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备抑制T3SS基因表达的制剂中的应用。

由于T3SS系统是许多革兰氏阴性致病菌的重要毒力因子，而本发明提供的抗亚精胺单克隆抗体4E4可通过阻断亚精胺的摄取和下调T3SS基因的表达，显著降低革兰氏阴性致病菌对宿主的毒性，提高宿主的存活率。所述革兰氏阴性致病菌包括但不限于耶尔森氏菌、肠炎沙门氏菌、志贺氏菌、埃希氏大肠杆菌等。

因此，所述抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备含T3SS系统的革兰氏阴性致病菌的治疗药物或制剂中的应用也在本发明保护范围内。

本发明还请求保护所述的抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备治疗绿脓杆菌感染的药物或制剂中的应用。

本发明还请求保护所述的抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备检测亚精胺和/或精胺的制剂中的应用。

本发明还请求保护一种治疗绿脓杆菌感染的药物或制剂，含有上述抗亚精胺单克隆抗体4E4。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株分泌抗亚精胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E4，所述杂交瘤细胞株4E4于2018年3月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C201841；所述杂交瘤细胞分泌的抗亚精胺单克隆抗体4E4能够特异地识别亚精胺和精胺，通过阻断亚精胺的摄取和下调T3SS基因表达，显著减少绿脓杆菌对A549细胞的细胞毒性。抗亚精胺单克隆抗体4E4的单次注射可以大大降低小鼠血清亚精胺含量，血清低水平的亚精胺维持近一周，显著提高绿脓杆菌感染小鼠的存活率。所述单克隆抗体4E4具有特异性强、灵敏度高的特点，亲和常数达7.3×10¹¹，能降低血清中亚精胺水平，减轻小鼠肺的损伤从而显著提高小鼠存活率，可用于制备治疗绿脓杆菌感染的药物或制剂，具有很好的推广应用前景。

附图说明

图1为实施例1中载体蛋白HSA与亚精胺耦合的示意图。

图2为实施例1中纯化的抗亚精胺单克隆抗体4E4的SDS-PAGE电泳图谱；其中左侧为分子标记。

图3为实施例1中使用杂交瘤细胞上清液检测到的单克隆抗体亚类和亚型。

图4为实施例1中聚胺的化学结构，即抗亚精胺单克隆抗体4E4识别的基本结构区域。

图5为实施例1中亚精胺与Mab 4E4作用的标准曲线。

图6为实施例2中Mab 4E4检测亚精胺、精胺、OVA和OVA-戊二醛的情况。

图7为实施例2中亚精胺在A549细胞中的分布情况。

图8为实施例3中外源性Mab 4E4抑制亚精胺诱导的T3SS表达情况；其中亚精胺和Mab 4E4的最终浓度分别为10和20μM，数据是三次重复的平均值。

图9为实施例3中免疫印迹检测T3SS的调节蛋白ExsA和效应蛋白EXOS的结果。

图10为实施例4中Mab 4E4减弱绿脓杆菌对宿主细胞的细胞毒性结果；A为A549细胞图(10×物镜)，其中CK1：无细菌感染，CK2：PAO1感染A549，4E4：PAO1感染A549并加入200μM的Mab 4E4，IgG：加入IgG，预4E4+4E4：PAO1感染A549细胞前、A549细胞与Mab 4E4预处理2h，预IgG+IgG抗体：PAO1感染A549细胞前、A549细胞与IgG预处理2h；B为A549细胞存活率。

图11为实施例5中注射Mab 4E4或IgG后小鼠血清亚精胺水平。

图12为实施例5中小鼠肺组织的切片图(20×物镜)。

图13为实施例5中不同剂量Mab 4E4对小鼠存活率的影响。

图14为实施例5中Mab 4E4的特异性。

图15为实施例5中不同时间点注射Mab 4E4对小鼠存活率的影响。

图16为实施例5中不同Mab 4E4注射方式对小鼠存活率的影响。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

材料：BALB/c小鼠无限制地使用食物和水(BRC，A-STAR，新加坡)，在无病原体条件下饲养。用于本发明的所有小鼠均为5～6周龄、体重22～25克。所有动物方案都经新加坡动物护理和使用委员会(IACUC)的同意和批准。

实施例1杂交瘤细胞株4E4及其分泌的单克隆抗体4E4的制备和鉴定

一株分泌抗亚精胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E4，所述杂交瘤细胞株4E4于2018年3月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C201841。

如上所述的杂交瘤细胞株4E4分泌的单克隆抗体4E4。所述单克隆抗体4E4是以亚精胺-蛋白质(HSA或OVA)藕合物作为免疫原所制备的高质量小鼠单克隆抗体(mAb 4E4，IgG1亚型)。

所述杂交瘤细胞株4E4及其分泌的单克隆抗体4E4的制备和鉴定如下：

1、HSA-亚精胺和OVA-亚精胺的制备

人血清白蛋白(HSA)和卵白蛋白(OVA)分别用缓冲液溶解(10mg/mL溶于0.1M碳酸盐缓冲液；质量分数为0.9％的NaCl溶液，pH＝9；质量分数为0.1％的十二烷基硫酸钠溶液)，再加入戊二醛(孵育20μL质量分数为25％的戊二醛水溶液)，闭光在室温下反应1h。然后混合物用碳酸盐缓冲液过Sephadex G-25柱，以除去过量戊二醛。上述产物中加入过量亚精胺(SPD)于闭光、室温反应16h。最后加入甘氨酸(1μM终浓度)作用6h以终止反应，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)充分透析。冻干所得反应物，即得HSA-亚精胺藕合物(如图1所示)和OVA-亚精胺藕合物，储存在-20℃备用。

2、单克隆抗体的制备和鉴定

用弗氏完全佐剂乳化的HSA-亚精胺藕合物，皮下注射BALB/c小鼠(200μg/只)。四周后连续3次加强免疫(100μg/只)，每次间隔两周，抗原用弗氏不完全佐剂乳化。在最后一次加强免疫3d后取免疫鼠脾脏，用组织培养基(含有4.5g/L葡萄糖、10％胎牛血清的DMEM培养基)悬浮脾脏组织成游离细胞。DMEM培养基和胎牛血清(FCS)购自GIBCO公司。将细胞悬浮于10mL DMEM培养基中，然后于800×g离心，弃去上清液，并且将细胞沉淀物重悬于10mLDMEM培养基中。用常规技术与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，以产生杂交瘤细胞。用ELISA检测细胞上清液，通过有限稀释法亚克隆，筛选后得到两株阳性杂交瘤细胞株(4E4和3H4)，用BALB/c小鼠生产腹水来大量制备抗体。用得到的单克隆抗体4E4和单克隆抗体3H4的细胞培养上清测定了抗体与亚精胺的相对亲和力。结果表明，单克隆抗体3H4和单克隆抗体4E4具有较高的亲和力(3H4的亲和常数为5.1×10⁹/M，4E4的亲和常数为7.3×10¹¹/M)。

为了进一步分析，用矩阵法来确定最佳抗原包被浓度。在检测细胞培养上清中的抗体时，用OVA-亚精胺包被96孔板。含有阳性单克隆细胞(4E4和3H4细胞)的上清用来测定抗体的效价、特异性和亲和力。阳性单克隆用150mL的细胞培养瓶培养，向用石蜡预处理过的小鼠腹腔(i.p.)注射阳性单克隆细胞。8～10d后采集腹水，并用硫酸铵沉淀和蛋白A偶联琼脂糖柱纯化免疫球蛋白，使用SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度分析(结果如图2所示)。纯化的免疫球蛋白用于建立标准曲线。

单克隆抗体的亚类和亚型用皮尔斯(Pierce)的ImmunoPure单克隆抗体亚类试剂盒(HRP/ABTS)测定。用商业小鼠IgG(购自Santa Cruz Biotechnology公司)作特异性分析的对照。单克隆抗体的亚类和亚型分析结果表明，这两种单克隆抗体是IgG1亚类的和包含轻链KAPA(如图3和表1所示)。

表1单克隆抗体4E4和3H4的特征

单克隆抗体	亚类	亚型	细胞培养上清效价	亲和常数(M<sup>-1</sup>)
					Mab 4E4	IgG1	kapa	1:40,000	7.3×10<sup>11</sup>
Mab 3H4	IgG1	kapa	1:80,000	5.1×10<sup>9</sup>

*实验重复3次，表中列出了一组有代表性的数据。

对于交叉反应研究，用适当稀释纯化的免疫球蛋白与亚精胺或其它多胺化合物(100μg/mL到10μg/mL)反应，并将该反应溶液转移到OVA-亚精胺藕合物包被的96孔板中再进行反应，洗涤，并加入到酶标抗体，于37℃反应30min。最后加入50μL的2M H₂SO₄溶液终止，然后读取OD值进行分析。亚精胺和其他四聚胺化合物(包括鸟氨酸、腐胺、尸胺和精胺)的抑制试验结果表明，只有精胺和亚精胺能特异性抑制单克隆抗体4E4与包被在96孔ELISA板上的OVA-亚精胺藕合物的结合(如表2所示)，这表明只有精胺和亚精胺包含的结构是单克隆抗体4E4识别必不可少的(如图4所示)。亚精胺的标准曲线的测定发现，单克隆抗体4E4检测亚精胺的灵敏度为20ng/mL(如图5所示)。

表2单克隆抗体4E4与亚精胺类似物的分子相互作用

*ID50指在竞争性ELISA测定50％抑制的剂量。实验重复3次，具有相似的结果。该表列出了一组有代表性的数据。

实施例2单克隆抗体4E4与亚精胺和精胺的相互作用

1、蛋白分离蛋白印迹分析

用Western印迹来分析单克隆抗体4E4与亚精胺和精胺的相互作用。在进行SDS-PAGE电泳时分别用10μg OVA-亚精胺、OVA-精胺、OVA、OVA-戊二醛上样。使用纯化的Mab 4E4按标准方案进行蛋白质印迹分析。对于T3SS基因表达的蛋白质印迹分析，隔夜培养的细菌以1：200接种于新鲜含NTA的LB培养基中，单克隆抗体4E4或对照IgG按上述步骤进行。于37℃下4h培养后，将细菌培养物在冰上冷却10min。对于每个细菌培养样本，取10mL并离心，上清液和细菌沉淀分别用于制备细胞外蛋白和细胞总蛋白。用0.2μm的针筒式过滤器将上清液过滤，用终浓度为10％的三氯乙酸(TCA)沉淀，沉淀物通过离心，用丙酮洗涤两次，干燥，并重悬于SDS样品缓冲液中。细胞总蛋白的分离用PBS缓冲液悬浮细菌颗粒再超声破碎细胞。离心后，其含有总细胞蛋白质的上清用于进一步分析。蛋白质样品通过煮沸5min变性，并通过10％SDS-PAGE分离。按照标准方案进行蛋白质印迹分析。

结果表明，单克隆抗体4E4可以检测包含亚精胺和精胺的蛋白质样品，但不识别OVA和OVA-戊二醛(如图6所示)。

2、在哺乳动物细胞中原位检测亚精胺

为了研究单克隆抗体4E4是否能够检测哺乳动物细胞系中的聚胺分子，将人肺癌细胞株A549接种在放有盖玻片的6孔培养板中，12h后用PBS缓冲液洗涤。然后将细胞用冰甲醇在-20℃固定10min。用PBS缓冲液洗涤后，将细胞用Mab 4E4或对照IgG孵育1h，之后用相同缓冲液洗涤3次。然后在室温下加入荧光标记的二抗(Alexa fluor 594，invitrogen)，并孵育1h。洗涤后，封片然后再在共聚焦显微镜下观察。

细胞免疫组织化学结果表明，Mab 4E4能检测到亚精胺和精胺分别均匀地分布在人A549细胞各个部位，而对照IgG无法检测这些聚胺分子(如图7所示)。

实施例3单克隆抗体4E4对T3SS基因表达的影响

1、外源性单抗4E4抑制亚精胺诱导的T3SS表达

为了确定单克隆抗体4E4对T3SS基因表达的抑制作用，将T3SS报告菌株PAO1pClacZ(通过将lacZ基因连到exsCEBA启动子后而得到)在含NTA 7.5mM的LB液体培养基中过夜生长，第二天用新鲜的MINIS培养基将细菌细胞按1：200稀释，并分别加入IgG、单克隆抗体4E4、IgG+亚精胺、单克隆抗体4E4+亚精胺，亚精胺的终浓度为10μM。细菌于37℃振荡生长4h，当OD₆₀₀达到约1.0时，开始测定T3SS在exsCEBA启动子控制下由lacZ启动编码的β半乳糖苷酶的活性。重复实验至少三次，显示的数据是三次重复实验的平均值，并设置空白对照，结果表示为100％exsA。

结果表明(如图8所示)，外源性单克隆抗体4E4能抑制由亚精胺(10μM)诱导的T3SS基因表达水平，即与没有亚精胺的对照CK相比，单克隆抗体4E4呈剂量依赖的方式抑制exsA的表达；与此相反，对照IgG不影响exsA表达水平，可能是由于非特异性结合多胺蛋白质，因此不能够完全逆转由亚精胺诱导的exsA表达。

2、免疫印迹检测T3SS的调节蛋白ExsA和效应蛋白EXOS

细菌培养基加有NTA和10μM或20μM亚精胺，然后分别加入20μM单克隆抗体4E4和对照IgG。细菌的蛋白质样品通过10％SDS-PAGE电泳分离。实验至少重复三次。

免疫印迹分析结果表明(如图9所示)，20μM单克隆抗体4E4与对照IgG比较，T3SS调节蛋白ExsA和效应分子EXOS的表达水平明显减少。

实施例4单克隆抗体4E4减弱绿脓杆菌对宿主细胞的细胞毒性

单克隆抗体4E4能逆转外源亚精胺活性，抑制T3SS的表达，本发明进一步研究外源性单克隆抗体4E4是否能减少细菌的细胞毒性和保护宿主细胞进而对抗绿脓杆菌的感染。为测定绿脓杆菌菌株PAO1的致毒作用，将A549细胞接种在含有100μL DMEM培养基的96孔组织培养板中，于37℃生长至18h以获得80～90％细胞丰度(约1.0×10⁴细胞/孔)。吸取培养上清液，用PBS缓冲液洗涤一次。把新鲜的细菌细胞重悬，用DMEM培养基稀释至浓度约1×10⁷CFU/mL。将100μL细菌稀释液与单克隆抗体4E4(终浓度为10μM或20μM)一起加入96孔板的A549细胞中，或者将100μL细菌稀释液加入到预先与单克隆抗体4E4(终浓度为10μM或20μM)作用2h的A549细胞中，感染的MOI(感染复数，感染时噬菌体与指示菌细胞的数量比值，即每个细胞感染噬菌体的数目)为50。于37℃感染4h后，通过WST-1测定法测定A549细胞的存活率。细胞接种后超过12h后用做该实验，测定每种细胞类型的百分比，并且是平均值±3次重复的SEM。重复三次实验。

结果表明(如图10所示)，相比于用对照IgG处理，当Mab 4E4在接种时加入到细菌稀释液中，该处理条件下细胞存活率增加了35％；当用Mab 4E4预处理2h后再用细菌感染，该处理条件下细胞存活率为85％。

实施例5单克隆抗体4E4降低小鼠血清亚精胺水平及对动物肺组织的保护作用

1、单克隆抗体4E4对小鼠血清亚精胺水平的影响

为确定Mab 4E4对小鼠体内亚精胺含量的影响，对照IgG和Mab 4E4分别通过小鼠的尾静脉注射，测定在不同注射时间点后小鼠血清中亚精胺的浓度。

结果如图11所示，Mab 4E4造成近一周小鼠血清中亚精胺含量显著下降，而对照IgG的注射没有明显改变小鼠血清中亚精胺的浓度，表明单克隆抗体4E4的单次注射可有效降低并维持血清亚精胺在低水平约一周。

2、单克隆抗体4E4对小鼠肺组织形态的影响

本发明比较了分别用Mab 4E4处理和用对照IgG处理(静脉内注射，2mg/小鼠)后小鼠的肺组织，处理之前均用绿脓杆菌感染2h。在感染绿脓杆菌24h后，用阿佛丁(avertin，500mg/kg)将小鼠安乐死，打开胸腔露出心脏和肺部。插入PE 90插管至气管，输入0.5mL的空气扩大肺部。然后分离肺并浸在10％福尔马林中，用苏木精和伊红(H&E)染色，石蜡包埋制片。嗜中性粒细胞在每个样品一式三份在显微镜视野下进行计数。最后进行肺损伤评分。

结果表明(如图12所示)，对照IgG组小鼠注入细菌后表现为严重的中性粒细胞聚集和肺泡结构破坏，而用Mab 4E4处理的小鼠在其空域几乎没有中性粒细胞并且保持着正常的肺泡结构。

3、单克隆抗体4E4剂量

单克隆抗体4E4有保护小鼠免受绿脓杆菌感染的作用，但Mab 4E4对小鼠的作用应保持在保护的适宜浓度。因此，进行了剂量依赖的生存分析试验(从10μg～2mg溶于100μL的PBS)。分别用PBS(对照)、对照IgG和Mab 4E4稀释液通过尾静脉注射至2h之前已接种绿脓杆菌PAO1(1.5×10⁶CFU)的小鼠体内，统计每个处理组的平均存活率。结果表明，用200μg剂量的Mab 4E4只有轻微的保护作用，而每只小鼠注射2mg Mab 4E4约有80％存活率，与PBS缓冲液对照相比差别明显(如图13所示)，与IgG对照相比差别也十分明显(如图14所示)。

在另一组实验中，单独的PBS(对照)和Mab 4E4(2mg)分别通过小鼠的尾静脉于2h前、2h后、同时与细菌接种注射。结果表明，相对其它两种处理，在细菌接种2h之前注射Mab4E4显示出较好的保护效率(如图15所示)。

另外，单独的PBS(对照)和Mab 4E4(2mg)也分别通过腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v.)或鞘内(i.t.)注射来比较不同注射途径时Mab 4E4的功效。结果表明，虽然三种注射方式之间的保护作用没有显著差异，但Mab 4E4的静脉注射效果更好(如图16所示)。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一株分泌抗亚精胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E4，其特征在于，所述杂交瘤细胞株4E4于2018年3月2日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO:C201841。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株4E4分泌的抗亚精胺单克隆抗体4E4。

3.权利要求2所述的抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备治疗绿脓杆菌感染的药物或制剂中的应用。

4.权利要求2所述的抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备治疗绿脓杆菌感染引发的肺损伤的药物或制剂中的应用。

5.权利要求2所述的抗亚精胺单克隆抗体4E4在制备检测亚精胺和/或精胺的制剂中的应用。

6.一种治疗绿脓杆菌感染的药物或制剂，其特征在于，含有权利要求2所述的抗亚精胺单克隆抗体4E4。