KR20190016934A - 응집체-비함유 단량체성 디프테리아 독소 융합 단백질의 제조 방법 및 치료적 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, toxO; 유전자 발현의 Fe-매개된 조절을 차단하는 돌연변이체 toxO; 및 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 발현 벡터로서, 상기 toxP 및 돌연변이체 toxO가 단백질을 코딩하는 DNA 세그먼트의 발현을 조절하는, DNA 발현 벡터이다. 본 발명의 DNA 발현 벡터는 발현된 단백질이 프로세싱 전에 시그널 펩티드에 부착되도록 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 신규한 단백질은 본 발명의 DNA 발현 벡터로부터 생성된다.
Description
관련 출원에 대한 언급
본 출원은, 2016년 3월 10일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/306,281호의 이익을 주장하며, 이는 본원에서 완전히 기재되어 있는 것과 같이 모든 목적을 위해 참조로서 원용된다.
전자공학적으로 제출된 물질의 참조에 의한 도입
본 출원은, EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하고, 참조에 의해 이의 전체가 본원에 도입된다. 2017년 3월 2일자로 작성된 상기 ASCII 카피는 P13869-02_SL.txt로 명명되고, 크기는 134,966 바이트이다.
정부 관심사항의 진술
본 발명은, 국립 위생 연구소(National Institutes of Health)로부터 수여된, 허여 번호 A137856, A136973, A1097138, UC7A1095321-01하에 정부 보조금으로 수행되었다. 정부는 본 발명에서 일정의 권리를 갖는다.
Ontak®(데니류킨 디프티톡스(denileukin diftitox))는, 디프테리아 독소 단편 A 및 단편 B의 일부(Met1-His388)를 위한 아미노산 서열 및 인간 인터류킨-2를 위한 서열(IL-2; Ala1-Thr133)로 구성된 521 아미노산, 재조합, DNA-유래 세포독성 단백질이다. 이는 현재 이. 콜라이 발현 시스템에서 생성되고, 58kD의 분자량을 갖는다. 네오마이신은 발효 프로세스에 사용되지만, 최종 생성물에서는 검출할 수 없다. 정맥내(IV) 투여를 위해 의도된 멸균 동결 용액으로 단일 사용 바이알에 공급되는 Ontak®은 피부 T 세포 림프종(CTCL)의 치료를 위해 1999년에 FDA에 의해 승인되었다. FDA는, 최종 제형 중의 이종성 분자량, 과다한 잔류 DNA 및 과량의 잔류 세정제의 단백질 응집체의 존재에 관한 개념으로부터 2011년 6월에 Ontak®을 임상 유보에 위치시켰다. Ontak®의 생성은 재조합 단백질을 이. 콜라이 세포질에서 발현시킴으로써 달성되었고, 이러한 발현 시스템은, 거대 불용성 응집체 또는 Ontak® 폴리펩티드로 구성된 소위 봉입체를 형성하는 재조합체 단백질을 제공했다. 봉입체 형태의 변성 및 재폴딩을 포함하는 현재의 제조 프로세스에서, 이종성 분자량의 단백질 응집체는 여전히 최종 제형 중에 존재한다. 정제된 형태의 이들 응집체의 존재는 폴리펩티드의 공급원으로서 이. 콜라이-유래된 세포질 봉입체를 사용한 결과이고, 트윈 20의 존재하에서도 독소의 막관통 도메인의 고유한 소수성 성질 때문이다. 이러한 방법을 사용하여 생성된 Ontak®은 이하 고전적-Ontak® 또는 c-Ontak®으로서 지칭될 것이다.
또한, 모든 세균 및 식물 독소와 같이, c-Ontak®은, 혈관 누출 증후군(VLS)을 유도하는 아미노산 모티프를 함유한다. c-Ontak®으로 치료된 환자 중의 대략 30%는, 급속한 체중 증가를 갖는 말초 부종으로부터 저알부민혈증 내지 폐 부종에 이르는 VLS 증후군을 발증한다.
필요한 것은, 1) 고수율 및 순도로 Ontak-유사 단백질의 생성을 가능하게 하고 최종 상업적 생성물에서 응집체를 제거하는 프로세스, 및 2) 환자에 대해 보다 안전한 약물을 제공하기 위해 최소 VLS 부작용을 갖는 변형된 Ontak-유사 단백질이다.
본 발명의 한 가지 실시형태는, toxP; 유전자 발현의 Fe-매개된 조절을 차단하는 돌연변이체 toxO; 및 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 발현 벡터로서, 상기 toxP 및 돌연변이체 toxO가 단백질을 코딩하는 DNA 세그먼트(segment)의 발현을 조절하는, DNA 발현 벡터이다. 본 발명의 DNA 발현 벡터는, DNA 발현 벡터로부터 발현된 단백질이 성숙 단백질을 형성하기 위해 전형적으로 절단되는 시그널 펩티드(signal peptide)에 부착되도록 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 돌연변이체 toxO는 서열번호 1이고, 바람직한 시그널 펩티드는 서열번호 5이다. 본 발명의 DNA 발현 벡터는 다양한 종류의 단백질, 예를 들면, CRM 197 및 CRM 107 또는 이의 조합을 생성하기 위해 사용될 수 있다. CRM 단백질 서열은 서열번호 18 내지 21에 제시되어 있다. 본 발명의 DNA 발현 벡터는, 수용체 결합 단백질 또는 이의 기능적 부분에 부착되어 디프테리아 독소 수용체 융합 단백질을 형성하는, 디프테리아 독소 또는 이의 기능적 부분을 코딩한다. 이러한 융합 단백질의 수용체 결합 단백질 부분은 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, EGF, FGF, 물질 P, CD4, αMSH, GRP, TT 단편 C, GCSF, 헤레귤린 β1, 이의 기능적 부분 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 디프테리아 독소 융합 단백질의 예는 서열번호 11 내지 15에 제시된 단백질을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, toxP; 유전자 발현의 Fe-매개된 조절을 차단하는 돌연변이체 toxO; 시그널 서열; 디프테리아 수용체 결합 도메인을 포함하지 않거나 비-기능적 디프테리아 독소 수용체 결합 도메인을 갖는 디프테리아 독소 또는 이의 기능적 부분, 및 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, EGF, FGF, 물질 P, CD4, αMSH, GRP, TT 단편 C, GCSF, 헤레귤린 β1, 이의 기능적 부분 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적 수용체 결합 도메인을 포함하는, 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 발현 벡터로서, 상기 toxP 및 돌연변이체 toxO가 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 발현을 조절하는, DNA 발현 벡터이다. 전형적으로, 본 발명의 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균은, 시그널 펩티드에 의해 세포주변질, 배양 배지 또는 이들 두 위치로 지향되는 시그널 펩티드에 부착된 디프테리아 독소 수용체 결합 융합 단백질을 생성한다. 세균이 이. 콜라이인 경우, 시그널 펩티드는 전형적으로 디프테리아 독소 수용체 결합 융합 단백질을 세포주변질로 지향시킨다. 세균이 코리네박테리움 디프테리아인 경우, 시그널 펩티드는 디프테리아 독소 수용체 결합 융합 단백질을 배양 배지로 지향시킨다. 본 발명의 DNA 발현 벡터는 서열번호 3을 포함하고, 절단가능한 단백질 태그를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있는 것이 바람직하고, 여기서 상기 절단가능한 단백질 태그는 디프테리아 독소 수용체 결합 융합 단백질에 부착된다. 본 발명의 DNA 발현 벡터로부터 생성된 디프테리아 독소 수용체 결합 융합 단백질의 예는 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 하기 단계를 포함하는 응집체-비함유 단량체성 디프테리아 독소 융합 단백질의 제조 방법을 포함한다: 세균을 본 발명의 DNA 발현 벡터로 형질전환시키는 단게; 형질전환체를 형성하는 단계; 상기 형질전환체를 배양 배지에서 배양하여, 배양 배지 중으로 분비되는 단백질의 발현을 가능하게 하는 단계; 및 상기 단백질을 배양 배지로부터 정제하는 단계. 이러한 방법에 사용된 바람직한 세균은 코리네박테리움 디프테리아이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 하기 단계를 포함하는 응집체-비함유 단량체성 디프테리아 독소 융합 단백질의 제조 방법을 포함한다: 1) 코리네박테리움 디프테리아 균주를, toxP; 유전자 발현의 Fe-매개된 조절을 차단하는 돌연변이체 toxO; 시그널 펩티드, 디프테리아 수용체 결합 도메인을 포함하지 않거나 비-기능적 디프테리아 독소 수용체 결합 도메인을 갖는 디프테리아 독소 또는 이의 기능적 부분, 및 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, EGF, FGF, 물질 P, CD4, αMSH, GRP, TT 단편 C, GCSF, 헤레귤린 β1, 이의 기능적 부분 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적 수용체 결합 도메인을 포함하는, 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 벡터로 형질전환시키는 단계로서, 상기 toxP 및 돌연변이체 toxO가 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 발현을 조절하는, 단계; 2) 형질전환체를 형성하는 단계; 3) 상기 형질전환체를 배양 배지에서 배양하여, 상기 배양 배지 중으로 분비되는 단백질의 발현을 가능하게 하는 단계; 및 4) 상기 디프테리아 독소 융합 단백질을 상기 배양 배지로부터 정제하는 단계. 본 발명의 방법에 의해 생성된 디프테리아 독소 수용체 융합 단백질의 예는 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용된 바람직한 코리네박테리움 디프테리아 균주는 코리네박테리움 C7 베타 (-), tox (-)이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 하기 단계를 포함하는 결핵 환자의 치료 방법을 포함한다: 본원에 제공된 디프테리아 독소 융합 단백질을 제조하는 단계; 상기 디프테리아 독소 융합 단백질을 결핵 환자에게 투여하는 단계.
본 발명의 또 다른 실시형태는 돌연변이체 toxO 프로모터를 포함하는 DNA 발현 벡터를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 발명의 DNA 발현 벡터를 함유하는 코리네박테리움 디프테리아 균주를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 하기 단계를 포함하는 단백질의 제조 방법이다: toxP, 유전자 발현의 Fe-매개된 조절을 차단하는 돌연변이체 toxO, 시그널 서열, 및 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는, DNA 발현 벡터를 제공하는 단계; 세균 균주를 상기 DNA 벡터로 형질전환시켜 형질전환체를 형성하는 단계; 상기 형질전환체를 배양 배지에서 소정 시간 동안 배양하여, 배양 배지 중으로 분비되는 단백질의 발현을 가능하게 하는 단계; 및 단백질을 배양 배지로부터 정제하는 단계.
본 발명의 또 다른 실시형태는 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나로부터 선택된 융합 단백질이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 상기 기재된 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 상기 기재된 융합 단백질 및 적어도 하나 이상의 기타 화학요법제를 포함하는 약제학적 조성물이다. 화학요법제의 예는 이소니아지드(isoniazid), 리팜핀(rifampin), 리파부틴(rifabutin), 리파펜틴(rifapentine), 피라진아미드(pyrazinamide), 에탐부톨(ethambutol), 스트렙토마이신(streptomycin), 아미카신(amikacin), 카나마이신(kanamycin), 에티온아미드(ethionamide), 프로티온아미드(protionamide), 테리지돈(terizidone), 티아세타존(thiacetazone), 사이클로세린(cycloserine), 카프레오마이신(capreomycin), 파라-아미노살리실산(PAS), 비오마이신(viomycin), 오플록사신(ofloxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 레보플록사신(levofloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 베다퀼린(bedaquiline), 또는 델라마니드(delamanid), 리네졸리드(linezolid), 테데졸리드(tedezolid), 아목실린-클라불란산(amoxicillin-clavulanic acid), 메로페넴(meropenem), 이미페넴(imipenem), 클라리트로마이신(clarithromycin) 또는 클로파지민(clofazimine)을 포함한다.
상기 기재된 융합 단백질 및 적어도 하나 이상의 기타 항균제를 포함하는 약제학적 조성물. 항균제의 예는 이소니아지드(isoniazid), 리팜핀(rifampin), 리파부틴(rifabutin), 리파펜틴(rifapentine), 피라진아미드(pyrazinamide), 에탐부톨(ethambutol), 스트렙토마이신(streptomycin), 아미카신(amikacin), 카나마이신(kanamycin), 에티온아미드(ethionamide), 프로티온아미드(protionamide), 테리지돈(terizidone), 티아세타존(thiacetazone), 사이클로세린(cycloserine), 카프레오마이신(capreomycin), 파라-아미노살리실산(PAS), 비오마이신(viomycin), 오플록사신(ofloxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 레보플록사신(levofloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 베다퀼린(bedaquiline), 또는 델라마니드(delamanid), 리네졸리드(linezolid), 테데졸리드(tedezolid), 아목실린-클라불란산(amoxicillin-clavulanic acid), 메로페넴(meropenem), 이미페넴(imipenem), 클라리트로마이신(clarithromycin) 또는 클로파지민(clofazimine)을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나로부터 선택된 융합 단백질을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나로부터 선택된 융합 단백질을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 결핵을 치료 또는 예방하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 발명의 DNA 발현 벡터를 포함하는 원핵생물 세포주이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 발명의 DNA 발현 벡터를 포함하는 키트(kit)이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 서열번호 2를 포함하는 toxP이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나의 단백질이다.
도 1a 내지 1b는 a) 본 발명의 돌연변이체 toxO(서열번호 1), b) 야생형 toxO(서열번호 25) 및 DtxR 컨센서스 결합 서열을 설명한다.
도 2a 내지 2b는 a) Ontak®의 제조에 사용된 고전적 데니류킨 디프티톡스(c-데니류킨 디피톡스) 발현 벡터를 설명하고, b) tox 프로모터(toxP) 및 본 발명의 돌연변이체 toxO를 포함하는 분비된 데니류킨 디프티톡스(s-데니류킨 디프티톡스) 발현 벡터를 설명한다. 도 2a는 서열번호 26을 개시하며 도 2b는 서열번호 27을 개시한다.
도 3은 c-데니류킨 디프티톡스-VLM으로 불리우는 혈관 누출 돌연변이체(VLM)이 IL2-수용체-담지 세포의 사멸에서 c-데니류킨 디프티톡스와 동등한 효력을 갖는 것을 설명한다.
도 4는 c-데니류킨 디프티톡스-VLM이 시험관내에서 혈관 누출을 유발하지 않음을 설명한다.
도 5는 마우스 생존 모델을 사용하여 c-데니류킨 디프티톡스-VLM이 c-Ontak®보다 생체내에서 현저히 적은 급성 독성을 갖는 것을 설명한다.
도 6은 본 발명의 디프테리아 독소-기반 융합 단백질 독소 플랫폼 기술을 설명한다.
도 7은 tox 프로모터(서열번호 2의 toxP) 및 돌연변이체 tox 작동인자(toxO)(DNA 서열번호 1), c-데니류킨 디프티톡스 DNA 서열(DNA 서열번호 6)에 부착된 시그널 펩티드(DNA 서열번호 4)를 갖는 플라스미드 pKN2.6Z-LC127을 설명한다.
도 8a 내지 8b는 a) 이. 콜라이에서 세포질 봉입체로서 Ontak®을 제조하는 통상의 프로세스의 문제를 설명하고, b) Ontak® 단백질보다 1종 미만의 아미노산을 갖는 분비된-데니류킨 디프티톡스를 생성하는 용이한 및 청결한 제조 프로세스를 설명한다. 도 8a는 "fMGADD"를 서열번호 28로서 개시하고, 도 8b는 "GADD"를 서열번호 29로서 개시한다.
도 9는, s-데니류킨 디프티톡스가 코리네박테리움 디프테리아 균주 C7 베타(-), tox(-) 내에서 발현되고 배양 배지 중으로 분비되는, 본 발명의 프로세스에 의해 제조된 s-데니류킨 디프티톡스의 면역블롯을 설명한다.
도 10은 본 발명의 데니류킨 디프티톡스가 결핵성 육아종 내에서 IL-2R(CD25+) 담지 T 세포(Treg)를 고갈시킬 것으로 기대되는 것을 설명한다. Treg는 Teff 세포의 억제에 의해 면역억제성이다.
도 11은 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)를 갖는 대상체의 생체내 치료에서 사용된 디프테리아 융합 단백질을 설명한다.
도 12는 디프테리아 독소-기반 융합 단백질을 사용하여 엠. 투베르쿨로시스로 감염된 대상체(마우스)를 치료한 결과를 설명한다.
도 13은 엠. 투베르쿨로시스로 감염된 대상체(마우스)를 치료하기 위한 디프테리아 독소-기반 융합 단백질 섭생을 설명한다.
도 14는 악성 흑색종을 갖는 대상체(인간)를 치료하기 위한 디프테리아 독소-기반 융합 단백질의 용도를 설명한다.
도 15는 His(히스티딘 태그)(각각 서열번호 23 및 48에 개시된 "His6/6x His" 및 "His9/9x His")를 사용하여 VLM s-Ontak 및 관련 단백질의 신속한 생성을 위한 3개 작제물을 설명한다.
도 16은 C-말단 His6 VLM s-Ontak 작제물(서열번호 23으로 개시된 "His6")을 사용하여 생성된 순도 97% 초과로 정제된 VLM s-Ontak을 설명한다.
도 2a 내지 2b는 a) Ontak®의 제조에 사용된 고전적 데니류킨 디프티톡스(c-데니류킨 디피톡스) 발현 벡터를 설명하고, b) tox 프로모터(toxP) 및 본 발명의 돌연변이체 toxO를 포함하는 분비된 데니류킨 디프티톡스(s-데니류킨 디프티톡스) 발현 벡터를 설명한다. 도 2a는 서열번호 26을 개시하며 도 2b는 서열번호 27을 개시한다.
도 3은 c-데니류킨 디프티톡스-VLM으로 불리우는 혈관 누출 돌연변이체(VLM)이 IL2-수용체-담지 세포의 사멸에서 c-데니류킨 디프티톡스와 동등한 효력을 갖는 것을 설명한다.
도 4는 c-데니류킨 디프티톡스-VLM이 시험관내에서 혈관 누출을 유발하지 않음을 설명한다.
도 5는 마우스 생존 모델을 사용하여 c-데니류킨 디프티톡스-VLM이 c-Ontak®보다 생체내에서 현저히 적은 급성 독성을 갖는 것을 설명한다.
도 6은 본 발명의 디프테리아 독소-기반 융합 단백질 독소 플랫폼 기술을 설명한다.
도 7은 tox 프로모터(서열번호 2의 toxP) 및 돌연변이체 tox 작동인자(toxO)(DNA 서열번호 1), c-데니류킨 디프티톡스 DNA 서열(DNA 서열번호 6)에 부착된 시그널 펩티드(DNA 서열번호 4)를 갖는 플라스미드 pKN2.6Z-LC127을 설명한다.
도 8a 내지 8b는 a) 이. 콜라이에서 세포질 봉입체로서 Ontak®을 제조하는 통상의 프로세스의 문제를 설명하고, b) Ontak® 단백질보다 1종 미만의 아미노산을 갖는 분비된-데니류킨 디프티톡스를 생성하는 용이한 및 청결한 제조 프로세스를 설명한다. 도 8a는 "fMGADD"를 서열번호 28로서 개시하고, 도 8b는 "GADD"를 서열번호 29로서 개시한다.
도 9는, s-데니류킨 디프티톡스가 코리네박테리움 디프테리아 균주 C7 베타(-), tox(-) 내에서 발현되고 배양 배지 중으로 분비되는, 본 발명의 프로세스에 의해 제조된 s-데니류킨 디프티톡스의 면역블롯을 설명한다.
도 10은 본 발명의 데니류킨 디프티톡스가 결핵성 육아종 내에서 IL-2R(CD25+) 담지 T 세포(Treg)를 고갈시킬 것으로 기대되는 것을 설명한다. Treg는 Teff 세포의 억제에 의해 면역억제성이다.
도 11은 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)를 갖는 대상체의 생체내 치료에서 사용된 디프테리아 융합 단백질을 설명한다.
도 12는 디프테리아 독소-기반 융합 단백질을 사용하여 엠. 투베르쿨로시스로 감염된 대상체(마우스)를 치료한 결과를 설명한다.
도 13은 엠. 투베르쿨로시스로 감염된 대상체(마우스)를 치료하기 위한 디프테리아 독소-기반 융합 단백질 섭생을 설명한다.
도 14는 악성 흑색종을 갖는 대상체(인간)를 치료하기 위한 디프테리아 독소-기반 융합 단백질의 용도를 설명한다.
도 15는 His(히스티딘 태그)(각각 서열번호 23 및 48에 개시된 "His6/6x His" 및 "His9/9x His")를 사용하여 VLM s-Ontak 및 관련 단백질의 신속한 생성을 위한 3개 작제물을 설명한다.
도 16은 C-말단 His6 VLM s-Ontak 작제물(서열번호 23으로 개시된 "His6")을 사용하여 생성된 순도 97% 초과로 정제된 VLM s-Ontak을 설명한다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 본 발명에 사용된 다수의 용어의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어는, 달리 특정하지 않는 한, 이들에 귀속하는 의미를 갖는다.
용어 "활성"은 필수 아미노산 트립토판(trp)의 N-포르밀-키누레닌으로의 분해를 촉매하는 인돌아민 2,3-디옥시게나제(옥시도리덕타제) 등의 이의 기능을 수행하는 유전자의 능력을 지칭한다.
"제제"는 임의의 소분자 화학적 화합물, 항체, 핵산 분자 또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 의미한다.
"개선한다"는 질환의 발증 또는 진행을 경감, 억제, 약화, 감소, 정지 또는 안정화시키는 것을 의미한다.
"개선"은 본원에 기재된 것과 같은 공지된 표준 기술 방법에 의해 검출되는 유전자 또는 폴리펩티드의 발현 수준 또는 활성의 변화(증가 또는 감소)를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 변화는 발현 수준의 10% 변화, 바람직하게는 발현 수준의 25% 변화, 보다 바람직하게는 40% 변화 및 가장 바람직하게는 50% 이상의 변화를 포함한다.
"유사체"는 동일하지 않지만 유사한 기능적 또는 구조적 특징을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들면, 폴리펩티드 유사체는 상응하는 천연-존재 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하지만, 천연 존재 폴리펩티드와 비교하여 유사체 기능을 증강시키는 특정 생화학적 변형을 갖는다. 이러한 생화학적 변형은, 예를 들면, 리간드 결합을 변화시키지 않고서, 유사체의 프로테아제 내성, 막 투과능 또는 반감기를 증가시킬 수 있다. 유사체는 비천연 아미노산을 포함할 수 있다.
c-는 용어에 부착될 때에 "고전적"을 의미하고, 예를 들면, c-데니류킨 디프티톡스는 Ontak® 또는 상업적으로 이용가능한 단백질을 의미한다.
"질환"은 세포, 조직 또는 기관의 정상 기능을 손상시키거나 방해하는 임의의 상태 또는 장해를 의미한다. 질환의 예는 암 및 결핵을 포함한다.
"유효량"은 무처리 환자와 비교하여 질환의 증상을 개선하는데 필요한 양을 의미한다. 질환의 치료학적 치료를 위해 본 발명의 실시에 사용된 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중 및 일반 건강에 의존하여 변화한다. 최종적으로, 주치의 또는 수의사는 적절한 양 및 용량 섭생을 결정할 것이다. 이러한 양은 "유효" 양으로 지칭된다.
용어 "발현한다"는, 예를 들면, 이의 상응하는 mRNA 또는 단백질 서열(들)을 포함하는 유전자 생성물을 발현하는 유전자의 능력을 지칭한다.
"단편"은 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 일부를 의미한다. 이러한 부분은 바람직하게는 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 함유한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 뉴클레오티드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.
is-는 용어에 부착되는 경우에 "미성숙 분비된"을 의미하고, 예를 들면, is-데니류킨 디프티톡스는 시그널 펩티드를 함유하는 미성숙 분비된 데니류킨 디프티톡스를 의미한다.
ms-는 용어에 부착되는 경우에 "성숙 분비된"을 의미하고, 예를 들면, ms-데니류킨 디프티톡스는 프로세싱되어 더이상 시그널 펩티드를 함유하지 않는 성숙 분비된 데니류킨 디프티톡스를 의미한다.
n-은 용어에 부착되는 경우에 "신규한"을 의미하고, 예를 들면, n-데니류킨 디프티톡스는 신규한 데니류킨 디프티톡스를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방한다", "예방하는", "예방", "예방적 치료" 등은, 장애 또는 상태를 갖지 않지만 질환 또는 상태를 발증할 위험에 있거나 감수성인 대상체에서 장애 또는 상태의 발증 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다. 해당 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 존재 아미노산 폴리머 뿐만 아니라 상응하는 자연 존재 아미노산의 유사체 또는 모방체인 아미노산 폴리머에 적용한다. 폴리펩티드는, 예를 들면, 당단백질을 형성하기 위해 탄수화물 잔기의 부가에 의해 변형시킬 수 있다. 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 비-당단백질 뿐만 아니라 당단백질을 포함한다.
"감소하다"는 적어도 10%, 25%, 50%, 75% 또는 100%의 음의 변화를 의미한다.
"참조"는, 서열번호 11 내지 15 등의 핵산 또는 단백질 서열 또는 이의 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물 등의 제제를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 샘플(인간 세포) 또는 대상체 등의 표준 또는 대조군 상태를 지칭한다.
"참조 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로 사용되는 정의된 서열이다. 참조 서열은 특정 서열의 서브세트 또는 전체: 예를 들면, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 세그먼트, 또는 완전 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다. 폴리펩티드에 있어서, 참조 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 16개 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 20개 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 25개 아미노산 및 보다 더 바람직하게는 약 35개 아미노산, 약 50개 아미노산 또는 약 100개 아미노산일 수 있다. 핵산에 있어서, 참조 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 60개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 약 75개 뉴클레오티드, 및 보다 더 바람직하게는 약 100개 뉴클레오티드 또는 약 300개 뉴클레오티드, 또는 이들 사이 또는 이들 사이의 임의의 정수일 수 있다.
s-는 용어에 부착되는 경우에 "분비된"을 의미하고, 예를 들면, s-데니류킨 디프티톡스는 분비된 데니류킨 디프티톡스를 의미한다. 분비된 데니류킨 디프티톡스는 is- 및 m- 형태를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는, 본원에 기재된 방법이 수행되는 임의의 개체 또는 환자를 지칭하는 것으로 의도된다. 일반적으로, 대상체는 인간이고, 당해 기술분야의 숙련가에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 대상체는 동물일 수도 있다. 따라서, 포유동물, 예를 들면, 설치류(마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아 피그 포함), 고양이, 개, 래빗, 소, 말, 염소, 양, 돼지 등을 포함하는 농장 동물 및 영장류(원숭이, 침팬지, 오랑우탄 및 고릴라 포함)를 포함하는 기타 동물은 대상체의 정의에 포함된다.
"실질적으로 동일한"은, 참조 아미노산 서열(예를 들면, 본원에 기재된 아미노산 서열 중의 어느 하나) 또는 핵산 서열(예를 들면, 본원에 기재된 핵산 서열 중의 어느 하나)에 대해 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 비교에 사용된 서열에 대해 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 60%, 보다 바람직하게는 80% 또는 85%, 및 보다 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다.
서열 동일성은 통상 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다(예를 들면, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램). 이러한 소프트웨어는 상동성의 정도를 다양한 치환, 결실 및/또는 기타 변형에 정렬시킴으로써 동일하거나 유사한 서열을 정합시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 그룹 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 측정하는 예시적 접근법에서, BLAST 프로그램을 사용할 수 있고, e-3 및 e-100 사이의 확률 스코어는 밀접하게 관련된 서열을 나타낸다.
본원에 정의된 범위는 해당 범위 내의 모든 값의 약어인 것으로 이해된다. 예를 들면, 1 내지 50의 범위는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50으로 이루어지는 그룹으로부터의 임의의 수, 수의 조합 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 이와 연관된 장애 및/또는 증상을 감소시키거나 경감시키는 것을 지칭한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 상태의 치료는 이와 연관된 장애, 상태 또는 증상이 완전히 제거되는 것을 필요로 하지 않는 것으로 이해된다.
특별히 명시되거나 문맥으로부터 자명하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 특별히 명시되거나 문맥으로부터 자명하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "a", "an" 및 "the"는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
특별히 명시되거나 문맥으로부터 자명하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 당해 기술분야에서 통상의 허용 범위 이내, 예를 들면, 평균의 2 표준 편차 이내로서 이해된다. 약은 언급된 수치의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내인 것으로 이해된다. 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치 값은 용어 약에 의해 변형된다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 화학적 그룹의 목록의 열거는 임의의 단일 그룹 또는 수록된 그룹의 조합으로서 해당 변수의 정의를 포함한다. 본원에서 변수 또는 양태에 대한 실시형태의 열거는 임의의 단일 실시형태로서 또는 임의의 다른 실시형태 또는 이의 일부와 조합하여 해당 실시형태를 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에 제공된 기타 조성물 및 방법의 하나 이상과 조합시킬 수 있다.
VLM-은 용어에 부착되는 경우에 "혈관 누출 돌연변이체"를 의미하고, 예를 들면, 데니류킨 디프티톡스-VLM은 데니류킨 디프티톡스 혈관 누출 돌연변이체를 의미한다.
w-는 용어에 부착되는 경우에 "야생형"을 의미하고, 예를 들면, w-디프테리아 독소는 야생형-디프테리아 독소를 의미한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 한 가지 실시형태는 증강된 순도 및 품질을 갖는 응집체-비함유, 단량체성, 디프테리아 독소 융합 단백질을 생성하는 프로세스의 발견이다. 이러한 프로세스는, 바람직하게는 코리네박테리움 디프테리아 균주를 포함하는 세균을 본 발명의 DNA 발현 벡터로 형질전환시키는 것을 포함한다. 본 발명의 DNA 발현 벡터는, tox 프로모터(toxP) 및 중첩하는 신규의 돌연변이된 tox 작동인자(toxO), 바람직하게는 시그널 서열, 및 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 특정의 유전자 요소를 포함하도록 설계된다. 단백질은 바람직하게는 디프테리아 독소 또는 이의 기능적 부분, 및 표적 수용체 결합 도메인 또는 이의 기능적 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 용어 "이의 기능적 부분"은 독소, 또는 이의 수용체에 결합하는 표적 수용체 결합 도메인의 일부로서 작용하는 디프테리아 독소 단백질의 일부를 의미한다. 본 발명의 DNA 발현 벡터는 단백질이 tox 프로모터(toxP) 및 돌연변이체 tox 작동인자(toxO)로부터 발현되도록 설계된다.
돌연변이체
toxO
toxO는 중앙 시토신(C) 염기에 의해 중단된 2개의 9bp 불완전 팔린드롬 암으로 구성되는 19-bp 작동인자 영역이다. 본 발명자들에 의해 발견된 야생형 toxO(도 1b) 및 돌연변이체 toxO(도 1a) 작동인자는 도 1에 제시되어 있다. 서열번호 1은 본 발명의 돌연변이체 toxO의 DNA 서열의 한 가지 실시형태를 설명한다. toxP는 서열번호 2의 DNA 서열을 갖는 프로모터이다. 서열번호 2는 toxP DNA 서열이 toxO DNA 서열을 포함하는 것을 설명한다. 서열번호 3은, toxP, tox0, 시그널 펩티드, 및 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는, DNA 서열이다. 서열번호 3 중의 별표는 돌연변이체 toxO를 생성하기 위해 도입된 변화를 나타낸다.
서열번호 1(돌연변이체 toxO DNA 서열)
서열번호 2(돌연변이체 toxO 서열이 밑줄되어 있는 돌연변이체 toxO DNA 서열을 포함하는 toxP)
toxO DNA 작동인자 서열은 디프테리아 독소 억제인자, DtxR로서 공지된 단백질에 의해 결합된다. DtxR은, 유전자 발현을 조절할 수 있는 전체적 철-불활성화된 조절 단백질이다. 철-풍부한 상태에서, Fe2+ 및 Fe3+ 철은, tox 작동인자(toxO) DNA 서열에 결합하고 tox 유전자 발현을 억제하는, DtxR 억제인자의 호모이량체의 형성을 가능하게 하는 형태적 변화를 유발하는 아포-DtxR에 결합한다. 낮은 철 환경에서, Fe2+ 및 Fe3+ 이온은 이의 DNA 결합 능력을 소실하고 작동인자로부터 해리하는 것을 유발하는 DtxR로부터 해리하고; 이러한 사상은 이에 의해 tox 유전자 생성물의 발현을 가능하게 한다. 도 1b는 야생형 toxO DNA 서열을 설명한다.
tox 발현에 대한 Fe2+ 및 Fe3+ 이온의 억제 효과를 극복하기 위해, 야생형(WT) toxO를 돌연변이체 toxO DNA 서열로 치환하는 DNA 발현 벡터가 생성되었다. 이러한 변화는 tox 유전자 발현의 Fe 이온-매개된 조절을 차단한다. 도 1a, 서열번호 1 및 서열번호 3은 본 발명의 돌연변이체 toxO DNA 서열을 설명한다. 본 발명하에서, toxP 및 돌연변이체 toxO의 조절하에 디프테리아 독소 융합 단백질을 코딩하는 재조합 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 및 씨. 디프테리아 등의 세균은 Fe-충족 배지에서 성장시키고, 고밀도로 성장하는 것을 가능하게 했고, 발현을 유도하기 위해 Fe-비함유 배지로의 이행을 필요로 하지 않을 것이다. 철 충족 배지 중의 tox 유전자 생성물의 구성적 발현은 당해 분야에서 현저한 진보를 나타낸다. 씨. 디프테리아, 구체적으로 C7 베타(-), tox(-) 균주는 본 발명의 DNA 발현 벡터를 사용하여 모든 디프테리아-독소 관련된 재조합 단백질의 생성을 위한 바람직한 숙주 세균이다. 본 발명의 DNA 발현 벡터는 이. 콜라이 등의 다른 세균에 사용될 수 있다.
DNA 발현 벡터
본 발명의 DNA 발현 벡터는 toxP, 돌연변이체 toxO, 단백질을 코딩하는 DNA 서열, 및 바람직하게는 시그널 서열을 포함한다. 서열번호 3은 본 발명의 DNA 발현 벡터의 일부일 수 있는 이들 유전자 요소를 함유하는 DNA 서열의 한 가지 예이다. 언급한 바와 같이, 서열번호 3에서 관찰된 별표는 돌연변이체와 야생형 toxO 사이의 염기 쌍 변화 위에 위치된다. 서열번호 3은 toxP가 염기 1로부터 30까지 연장하고 toxO가 염기 24로부터 개시하여 염기 42(밑줄된 DNA 서열 전)에서 종결되도록 넘버링된다. 밑줄된 DNA 서열은 염기 74 내지 염기 148을 나타내고, 25개 아미노산 시그널 서열을 코딩하는 DNA의 영역(또한 서열번호 4, 서열번호 5 및 도 2에서 관찰됨)이다. 본 발명의 DNA 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 단백질이 toxP, 돌연변이체 toxO로부터 발현되고 N-말단 시그널 서열로 번역되도록 작제된다. N-말단 시그널 서열은 분비를 위한 하나 이상의 단백질(벡터로부터 발현됨)을 표적화하고, N-말단 시그널 펩티드는 이후에 절단되어 성숙 활성 단백질을 생성한다. 서열번호 3은 분비된-데니류킨 디프티톡스 또는 s-데니류킨 디프티톡스로 불리우는 신규한 데니류킨 디프티톡스 등의 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. s-데니류킨 디프티톡스는 미성숙 분비된-데니류킨 디프티톡스(is-데니류킨 디프티톡스) 및 성숙 분비된-데니류킨 디프티톡스(ms-데니류킨 디프티톡스)로 불리우는 2개 형태를 갖는다. 서열번호 12는 본 발명의 is-데니류킨 디프티톡스의 것이고, 서열번호 13은 본 발명의 ms-데니류킨 디프티톡스의 것이다. is-데니류킨 디프티톡스는, 프로세싱 동안 절단되어 ms-데니류킨 디프티톡스를 형성하는 시그널 서열을 함유한다. 또한, 서열번호 3은 단백질, 구체적으로 디프테리아 독소의 기능적 부분 및 IL2의 기능적 부분을 함유하는 융합 단백질을 코딩하는 서열번호의 1171까지 염기 149에서 개시하는 DNA 서열을 포함한다. 520개 아미노산 폴리펩티드이고 디프테리아 독소 단편 A 및 단편 B의 일부를 위한 아미노산 서열(Gly1-His387) 및 인간 인터류킨-2를 위한 서열(IL-2; Ala1-Thr133)로 구성되는 신규한 데니류킨 디프티톡스 융합 단백질 서열이 형성된다. 시그널 서열의 절단 결과, 본 발명의 ms-데니류킨 디프티톡스는 고전적-데니류킨 디프티톡스(c-데니류킨 디프티톡스)에 존재하는 제1 메티오닌을 결여하고, 이에 의해 Ontak®로서 공지된 고전적-데니류킨 디프티톡스 단백질의 아미노산 서열보다 1개 아미노산이 더 짧다. 서열번호 13은, Ontak®로서 공지된 고전적-데니류킨 디프티톡스(c-데니류킨 디프티톡스)의 단백질 서열을 함유하는 서열번호 10과 비교될 수 있는 신규한 디프티톡스 단백질 서열 ms-데니류킨 디프티톡스의 단백질 서열이다.
본 발명의 DNA 발현 벡터는 하나 이상의 단백질(들)을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 디프테리아 독소(또는 이의 기능적 부분) 및 표적 수용체 결합 단백질(또는 이의 기능적 부분)을 포함하는 융합 단백질이다. DNA 발현으로부터 생성될 수 있는 디프테리아 독소의 예는 디프테리아 독소의 임의의 기능적 부분 또는 디프테리아 독소 혈관 누출 돌연변이체의 임의의 기능적 부분이다. 본 발명의 DNA 발현 벡터로부터 생성된 표적 수용체 결합 도메인의 단백질의 예는 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, EGF, FGF, 물질 P, CD4, αMSH, GRP, TT 단편 C, GCSF, 헤레귤린 β1, TNFα, TGFβ 또는 이의 조합을 포함한다. 기타 표적 수용체 결합 도메인은 치료학적 적용에 의존하여 사용될 수 있고; 그러나, 서열번호 9가 IL2 수용체 결합 도메인의 기능적 부분을 코딩하는 바람직한 DNA 서열이다. 본 발명의 목적을 위해, 일부 DNA 플라스미드 및 이의 유전자 요소는 도 1, 도 2, 도 6 및 도 7에 설명되어 있다. 본 발명의 DNA 발현 벡터에 의해 코딩된 융합 단백질의 예는 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 19 및 21을 포함한다.
서열번호 3 (분비된-데니류킨 디프티톡스 또는 s-데니류킨 디프티톡스를 코딩하는 DNA 서열. 서열은 toxP, 돌연변이체 toxO, 시그널 서열, 디프테리아 독소의 기능적 부분 및 IL2의 기능적 부분을 포함한다. 볼드체 및 별표는 변화가 돌연변이체 toxO를 생성하기 위해 도입되는 것을 나타낸다)
서열번호 4(시그널 DNA 서열)
서열번호 5(시그널 단백질 서열)
서열번호 6(고전적-데니류킨 디프티톡스 DNA 서열)
최소 혈관 누출을 갖거나 혈관 누출을 갖지 않는 디프테리아 독소 융합 단백질의 형성(데니류킨 디프티톡스-VLM)
모든 세균 및 식물 독소와 유사하게, 데니류킨 디프티톡스는 혈관 누출 증후군(VLS)을 유도할 수 있는 아미노산 모티프를 갖는다. Ontak®로 치료한 환자의 대략 30%는 말초 부종에 의한 급속한 체중 증가로부터 저알부민혈증 내지 폐 부종에 이르는 VLS를 발증한다. 돌연변이체는 미국 특허 제8,865,866호에 기재된 바와 같이 Ontak®의 DNA 서열에 대해 이루어졌다. 서열번호 10의 제7 잔기에서 발린(GTT)이 서열번호 16에 제시된 알라닌으로 치환되도록 DNA 서열에 대해 이루어진 DNA 돌연변이체는 혈관 누츨 증후군 부작용을 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않는 융합 독소를 생성했다. 이들 돌연변이체는 "혈관 누출 돌연변이체"(VLM)로서 지칭된다. 혈관 누출 돌연변이체 또는 데니류킨 디프티톡스-VLMS는 도 3에서 c-데니류킨 디프티톡스와 동일한 효력을 갖고 도 4에서 혈관 누출을 유발하지 않으며 도 5에서 c-데니류킨 디프티톡스보다 생체내에서 현저히 적은 급성 독성을 갖는 것으로 밝혀졌다. s-데니류킨 디프티톡스-VLM은 서열번호 14 및 15에 제시된 제6 잔기에 발린을 치환하는 알라닌을 갖는다. s-데니류킨 디프티톡스-VLM 단백질은 c-데니류킨 디프티톡스-VLM 단백질을 사용하여 발견된 것과 유사한 독성의 감소를 갖는다.
또한, 서열번호 10에 제시된 서열 V29D30S31 및 I290D291S292(c-데니류킨 디프티톡스의 아미노산 서열)은, 돌연변이되는 경우, VLS를 또한 감소시킬 것이다. 이러한 발견에서의 주장은 V29A 또는 I290A 등의 V29D30S31 및/또는 I290D291S292 중에 치환체의 도입이 디프테리아 독소 융합 단백질의 상응하는 위치에 도입될 수 있고 이들 치환체가 또한 혈관 누출 증후군의 추가 감소에 유용할 수 있다는 것이다.
서열번호 7(데니류킨 디프티톡스-VLM 밑줄된 코돈은 본원에서 GCT로서 제시되고 미국 특허 제8,865,866호에 기재된 알라닌을 코딩한다.)
서열번호 7[미국 특허 제8,865,866호에 기재된 데니류킨 디프티톡스-VLM]을 서열번호 8[본 발명의 is-데니류킨 디프티톡스-VLM]과 비교하는 DNA 서열의 정렬은 서열번호 8이 라인 1381-1437에서 코돈(3개 염기)을 결여하고 있음을 입증한다.
유사성: 1563/1638 (95.42%)
서열번호 9(데니류킨 디프티톡스의 DNA 서열 IL-2 부분)
본 발명의 DNA 발현 벡터를 사용하여 생성한 단백질
본 발명의 성숙 활성 디프테리아 독소 관련된 융합 단백질의 제1 아미노산은 서열번호 13 및 15에서 볼드체로 제시된 글리신(아미노산 1)이다. 서열번호 4 중의 시그널 서열은 성숙 융합 단백질의 제1 글리신으로부터 역으로 계수하는 음수로 표지되고, 하기 아미노산 서열 MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHA(서열번호 22)를 갖는다. 시그널 서열은 서열번호 11 및 12에 제시되어 있고, 밑줄되어 있다. 성숙 분비된 디프테리아 독소 융합 단백질은 디프테리아 독소 부분, 예를 들면, Gly1-His387, 및 표적 수용체 결합 도메인, 예를 들면, 서열번호 3에서 Ala388-Thr520으로부터의 IL-2 단백질을 포함한다. 디프테리아 독소 단백질(또는 이의 기능적 부분)에 융합될 수 있는 본 발명에 사용된 기타 표적 수용체 결합 도메인은 그 중에서도 IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, EGF, FGF, 물질 P, CD4, αMSH, GRP, TT 단편 C, GCSF, 헤레귤린 β1, TNFα, TGFβ, 또는 이의 조합을 포함한다. 서열번호 10은, 분비되지 않고 이. 콜라이에서 봉입체로부터의 정제를 필요로 하는 c-데니류킨 디프티톡스를 기재한다. 서열번호 12는 시그널 서열을 갖는 미성숙 분비된 is-데니류킨 디프티톡스를 기재한다. 서열번호 13은 시그널 서열이 세포외 공간으로 분비 프로세스 동안 절단된 MS-데니류킨 디프티톡스를 기재한다.
서열번호 10(Ontak®로서 공지된 c-데니류킨 디프티톡스의 단백질 서열)
서열번호 11(w-디프테리아 독소)
서열번호 12(is-데니류킨 디프티톡스)
서열번호 13(ms-데니류킨 디프티톡스)
서열번호 14(is-데니류킨 디프티톡스-VLM의 단백질 서열)
서열번호 15(ms-데니류킨 디프티톡스-VLM의 단백질 서열)
서열번호 16(미국 특허 제8,865,866호에 기재된 데니류킨 디프티톡스-VLM의 단백질 서열)
서열번호 16의 단백질 정렬은, 본 발명의 서열번호 14 is-데니류킨 디프티톡스-VLM과 비교할 때 위치 445에 여분의 아미노산(L)을 갖는 미국 특허 제8,865,866호에 기재된 데니류킨 디프티톡스-VLM이다.
유사성: 521/522 (99.81%)
단백질을 제조하기 위한 DNA 발현 벡터의 사용.
상기 기재된 디프테리아 독소와 관련된 단백질의 Fe-독립적 분비된 발현을 사용하는 방법은 s-데니류킨 디프티톡스를 발현하는 방법의 사용에 추가하여 몇가지 상업적 적용을 갖는다. 해당 방법은 하기의 발현(수율)을 개선시키기 위해 사용될 수 있다:
WT 디프테리아 독소:
디프테리아 톡소이드의 제조에 사용된 야생형 디프테리아 독소(서열번호 11), DTP, TDaP 및 기타 조합 백신에 존재하는 디프테리아를 위한 백신은 본 발명의 DNA 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있다. 서열번호 11을 코딩하는 DNA 세그먼트를 본 발명의 DNA 발현 벡터에 위치시키고, ToxP/돌연변이체 ToxO의 하류에 위치시킬 수 있다.
교차-반응 물질-197(CRM197) 및 교차-반응 물질-107(CRM107):
CRM197 및 CR107은, 고도로 면역원성이지만 독소 활성을 완전히 결여하는 전장 디프테리아 독소의 돌연변이체 단백질이다. 이들은 몇몇 다당류 접합체 백신을 위한 담체로서 사용된다. 예를 들면, 와이어쓰(Wyeth) 및 화이자(Pfizer)는 1990년대에 스트렙토콕쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)의 7개 다당류를 CRM197에 접합시켜, 2000년 2월에 FDA가 승인한 오리지날 프레브나르(Prevnar) 백신을 생성할 때에 이러한 면역원성의 잇점을 취했다. 13-다당류 프레브나르는 2010년에 FDA 승인되었다. 노바티스(Novartis)로부터의 수막염 백신 멘베오(Menveo)는 4개 수막염균 다당류 + CRM197이다. 이 백신은 2010년에 FDA 승인을 획득했다. 암 면역요법 회사 이뮤진(Imugene)(ASX: IMU)은, 담체 단백질로서 CRM197을 사용하는 경우, HER2를 표적화하는 이의 B 세포 펩티드 암 면역요법으로부터 항체 역가의 현저한 개선을 보고했다. CRM197은 또한 잠재적 약물 전달 단백질로서 평가되고 있다. 스위스-기반 튜링 파마슈티칼즈(Turing Pharmaceuticals)는 최대 1,000개 아미노산 길이의 치료적 단백질을 갖는 CRM197 융합 작제물에 대해 연구하고 있다. 본 발명의 DNA 발현 벡터는 CRM 197 및 CRM 107을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 서열번호 18 내지 21을 코딩하는 하나 이상의 DNA 세그먼트(들)은 본 발명의 DNA 발현 벡터에 위치시킬 수 있고 ToxP/돌연변이체 ToxO의 하류에 위치시킬 수 있다.
정제를 증강시키기 위해 사용된 절단가능한 펩티드 또는 단백질 태그를 갖는 디프테리아 독소 기반 융합 단백질.
절단가능한 펩티드 태그(예를 들면, His6(서열번호 23) 또는 FLAG [DYKDDDDK](서열번호 24)) 또는 단백질 태그(예를 들면, GST[글루타티온 S-트랜스퍼라제] 또는 SUMO[소형 유비퀴틴-유사 변형제 단백질])을 디프테리아 독소 기반 융합 단백질에 대한 특이적 프로테아제 절단가능한 부위와 융합시킬 수 있다. 태그에 결합하는 항체 또는 리간드를 사용하는 친화성 크로마토그래피 방법을 태그된 단백질의 신속한 정제에 사용할 수 있다. 정제 후, 특이적 절단 부위는 목적하는 디프테리아 독소 관련된 단백질로부터 태그의 분리를 가능하게 한다. 이러한 융합물은 본 발명의 디프테리아 독소 기반 융합 단백질의 정제를 증강시킬 수 있다.
서열번호 17(ms-CRM197의 단백질 서열)
서열번호 18(is-CRM197의 단백질 서열)
서열번호 19(ms-CRM107의 단백질 서열)
서열번호 20(is-CRM107의 단백질 서열)
서열 번호 | 설명 |
서열번호 38 | VLM s-Ontak에 대한 N 말단 His 태그의 단백질 서열 |
서열번호 39 | 시그널 서열이 절단된 후에 VLM s-Ontak에 대한 N-말단 His 태그의 단백질 서열 |
서열번호 40 | 시그널 서열이 절단되고 TEV 부위가 절단된 후에 VLM s-Ontak에 대한 N-말단 His 태그의 단백질 서열 |
서열번호 41 | VLM s-Ontak에 대한 N-말단 His 태그의 DNA 서열 |
서열번호 42 | VLM s-Ontak에 대한 C-말단 His 태그의 단백질 서열 |
서열번호 43 | 시그널 서열이 절단된 후에 VLM s-Ontak에 대한 C-말단 His 태그의 단백질 서열 |
서열번호 44 | VLM s-Ontak에 대한 C-말단 His 태그의 DNA 서열 |
서열번호 45 | VLM s-Ontak에 대한 C-말단 TEV His9 태그의 단백질 서열("His9""는 서열번호 48로서 개시됨) |
서열번호 46 | 시그널 서열이 절단된 후에 VLM s-Ontak에 대한 C-말단 TEV His9 태그의 단백질 서열("His9"는 서열번호 48로서 개시됨) |
서열번호 30 | 시그널 서열 및 Tev 프로테아제 부위가 절단된 후에 C-말단 TEV His9 태그의 단백질 서열("His9"는 서열번호 48로서 개시됨) |
서열번호 31 | VLM s-Ontak에 대한 C-말단 His 태그의 DNA 서열 |
서열번호 32 | 분비된 씨. 디프테리아(C. diphtheriae) 프로테아제 1 아미노산 서열 |
서열번호 33 | 분비된 씨. 디프테리아(C. diphtheriae) 프로테아제 1 DNA 서열 |
서열번호 34 | 분비된 씨. 디프테리아(C. diphtheriae) 프로테아제 1을 녹 아웃시키기 위한 대립인자 교환 기질[AES]의 DNA 서열 |
서열번호 35 | 분비된 씨. 디프테리아(C. diphtheriae) 프로테아제 2 아미노산 서열 |
서열번호 36 | 분비된 씨. 디프테리아(C. diphtheriae) 프로테아제 2 DNA 서열 프로테아제 2 DNA 서열 |
서열번호 37 | 분비된 씨. 디프테리아(C. diphtheriae) 프로테아제 2를 녹 아웃시키기 위한 대립인자 교환 기질[AES]의 DNA 서열 |
폴리펩티드의 His-태그된 버젼을 사용한 VLM s-Ontak의 정제
코리네박테리움 디프테리아 C7에서 생성된 VLM s-Ontak의 일부 제제에서, 성숙 520 아미노산 폴리펩티드의 느린 단백질분해성 절단이 발생한다. 이는 아마도 코리네박테리움 디프테리아 C7에 의해 제조되는 분비된 프로테아제에 기인하는 것 같다. 이러한 단백질분해성 절단은 성숙 520 아미노산 VLM s-Ontak의 대략 아미노산 390에서 발생한다.
VLM s-Ontak의 히스티딘-태그된(His-태그된) 버젼은 배양 상청액에 존재하는 분비된 프로테아제로부터 단리된 목적하는 단백질의 정제를 촉진시키기 위해 작제했다. 타바코 에취 바이러스(TEV) 핵-봉입-a 엔도펩티다제(EC 3.4.22.44) 인식 부위를 VLM s-Ontak의 이들 His-태그된 버젼으로 또한 조작했다. TEV 절단 부위의 목적은 VLM s-Ontak의 최종 제조에서 폴리-His 서열의 제거를 가능하게 하기 위한 것이다. TEV는 아미노산 서열 ENLYFQ\X를 인식하는 고특이적 엔도펩티다제이고, 여기서 "W"는 절단된 펩티드 결합을 나타내고, X는 글리신(G) 등의 임의의 소형 소수성 또는 극성 아미노산을 나타낸다.
TEV 절단 부위를 갖는 N-말단 His-태그된 VLM s-Ontak. 서열번호 38(VLM s-Ontak에 대한 N-말단 His 태그의 단백질 서열)에 제시된 바와 같이, 아미노 서열 HHHHHHENLYFQ를 이의 N-말단 부근에 VLM s-Ontak의 미성숙 단백질 서열에 부가할 수 있다. 이러한 버젼에서, 서열 HHHHHHENLYFQ는 26 아미노산 시그널 서열 직후 및 VLM s-Ontak의 성숙 서열(GADDVA...) 직전에 나타난다. VLM s-Ontak의 제1 글리신은 ENLYFQ\X를 인식하는 TEV 프로테아제에 대한 최종 인식 잔기를 포함하고, X는 임의의 소형 아미노산이다. 이러한 N-말단 His-태그된 VLM s-Ontak의 성숙 분비된 단백질 서열은 서열번호 39에 제시되어 있고(시그널 서열이 절단된 후에 VLM s-Ontak에 대한 N-말단 His 태그의 단백질 서열), 이는 이의 His6 태그를 사용한 니켈-컬럼 친화성 정제를 위한 우수한 후보이다. 이어서, 친화성 정제된 VLM s-Ontak을 소량의 순수한 TEV 프로테아제에 노출시켜, 서열번호 40(시그널 서열이 절단되고 TEV 부위가 절단되는 VLM s-Ontak에 대한 N-말단 His 태그의 단백질 서열)에 제시된 바와 같이, 13 N-말단 잔기 MHHHHHHENLYFQ를 제거하고 성숙 비태그된 VLM s-Ontak을 방출하는 효소적 단백질분해를 유도한다.
코리네박테리움 디프테리아 C7의 분비된 프로테아제(들)가 대략 아미노산 390에서 절단하기 때문에, N-말단 His-태깅은 2개 종을 유도할 수 있다: 전장 목적하는 VLM s-Ontak(520 아미노산) 및 390-아미노산 N-말단 분해 단편. 크기(분자 조성 뿐만 아니라)가 비교적 근접하는 이들 2개 폴리펩티드는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리하는 것이 곤란하다. 따라서, 본 발명자들은 또한 VLM s-Ontak의 C-말단 His-태그된 버젼을 개발했다.
TEV 절단 부위를 갖지 않는 C-말단 His-태그된 VLM s-Ontak. 서열번호 42(VLM s-Ontak에 대한 C-말단 His 태그의 단백질 서열)에 제시된 바와 같이, 이의 C-말단에서 VLM s-Ontak의 미성숙 단백질 서열에 아미노 서열 HHHHHH를 부가할 수 있다. 이러한 버젼에서, 서열 HHHHHH는 VLM s-Ontak의 C-말단 트레오닌(….IISTLT) 직후에 나타난다. 이러한 C-말단 His-태그된 VLM s-Ontak의 성숙 분비된 단백질 서열은 서열번호 43(시그널 서열이 절단된 후에 VLM s-Ontak에 대한 C-말단 His 태그의 단백질 서열)에 제시되어 있고, 이는 His6 태그에 의한 니켈-컬럼 친화성 정제를 위한 우수한 후보이다.
TEV 절단 부위를 갖는 C-말단 His-태그된 VLM s-Ontak. C-말단 His-태깅(서열번호 43)에 의해 제조된 VLM s-Ontak의 상기 버젼의 최종 폴리펩티드 서열 중에 His6 서열을 갖는 것을 회피하기 위해, His-태그 서열의 제거를 가능하게 하는 C-말단에 TEV 인식 서열을 삽입할 수 있다. 이러한 버젼에서, 서열 ENLYFQGHHHHHHHHH는 VLM s-Ontak의 C-말단 트레오닌(…IISTLT) 직후에 나타난다. 니켈 친화성 결합은 6개 이상의 아미노산에서도 폴리-His 서열에 의해 증강되기 때문에, 9개 His 잔기를 포함시킬 수 있다. TEV 절단 부위를 갖는 이러한 C-말단 His-태그된 VLM s-Ontak의 아미노산 서열은 서열번호 45(LVM s-Ontak에 대한 C-말단 TEV His9 태그의 아미노산 서열)에 제시되어 있다. TEV 절단 부위를 갖는 이러한 C-말단 His-태그된 VLM s-Ontak의 분비된 단백질 서열은 서열번호 46(시그널 서열이 절단된 후에 VLM s-Ontak에 대한 C-말단 TEV His9 태그의 단백질 서열)에 제시되어 있고, 이의 His9 태그를 사용한 니켈-컬럼 친화성 정제를 위한 우수한 후보이다. 이어서, 친화성 정제된 VLM s-Ontak을 소량의 순수한 TEV 프로테아제에 노출시켜, 서열번호 30에 제시된 바와 같이, 10 C-말단 잔기 GHHHHHHHHH를 제거하고 성숙 비태그된 VLM s-Ontak을 방출하는 효소적 단백질분해를 유도한다. 주목하게는, 이러한 버젼의 정제된 VLM s-Ontak(서열번호 30)은, 이것이 VLM s-Ontak(…IISTLT)의 통상의 C-말단 트레오인에 융합된 TEV 프로테아제 인식 서열(ENLYFQ)의 6개 추가 아미노산을 함유하기 때문에, 520 아미노산(서열번호 15)이 아닌 526 아미노산 길이이다. TEV 절단 부위(서열번호 30)를 갖는 이러한 버젼의 C-말단 His-태그 VLM s-Ontak의 최종 결과는 C-말단 서열 …IISTLTENLYFQ이다.
His-태그 및 TEV 프로테아제 부위를 포함하는 VLM s-Ontak의 제조 방법. VLM s-Ontak의 상기 3개 His-태그 버젼(TEV 프로테아제 부위를 갖는 N-말단 His6 태그, TEV 프로테아제 부위를 갖지 않는 C-말단 His6 태그, 및 TEV 프로테아제 부위를 갖는 C-말단 His9 태그)는 VLM s-Ontak의 제조 방법에서 His-태그/니켈 컬럼 친화성 크로마토그래피를 사용하는 방법의 예이다. 배양 상청액에 존재하는 코리네박테리움 디프테리아 C7로부터의 분비된 프로테아제 때문에, 목적하는 생성물의 현저한 소실을 회피하기 위해 배양 상청액 중의 다른 단백질로부터 VLM s-Ontak을 신속하게 정제하는 것이 중요하다. His-태그 및 TEV 프로테아제 부위의 포함은 현저한 개선을 나타내고, VLM s-Ontak의 신속하고 합리적인 제조 프로세스를 가능하게 할 수 있다.
VLM s-Ontak의 개선된 제조를 위한 주요 분비된 프로테아제를 결여하는 코리네박테리움 디프테리아 C7의 생성. 코리네박테리움 디프테리아 C7의 게놈 서열은 2개 분비된 프로테아제를 나타낸다: 프로테아제 1은 NCBI 참조 서열 WP_014318592.1 (서열번호 32, 33)이고, 프로테아제 2는 NCBI 참조 서열 WP_014318898.1(서열번호 35, 36)이다. 이들 프로테아제는 톤-댓 및 쉐윈드(Ton-That and Scheewind)의 방법[참조: Ton-That H, Schneewind O. Assembly of pili on the surface of Corynebacterium diphtheriae. Mol Microbiol. 2003 Nov;50(4):1429-38. PubMed PMID: 14622427] 및 또한 알렌 및 슈미트(Allen and Schmitt)의 방법[참조: Allen CE, Schmitt MP. HtaA is an iron-regulated hemin binding protein involved in the utilization of heme iron in Corynebacterium diphtheriae. J Bacteriol. 2009 Apr;191(8):2638-48. PubMed PMID: 19201805]을 사용하여 유전적으로 결실시킬 수 있다. 프로테아제 1 및 프로테아제 2를 녹 아웃시키는 대립인자 교환 기질은 각각 서열번호 34 및 서열번호 37에 제시되어 있다. 이들 서열은, pk18mobsacB, sacB 역선택으로 접합성 교배 플라스미드에 삽입하는 경우[참조: Schafer A, Tauch A, Jager W, Kalinowski J, Thierbach G, Puhler A (1994) Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene 145:69-73. PMID: 8045426], 각 프로테아제를 녹아웃시키는 작제물을 유도한다. 프로테아제 1 및 프로테아제 2 둘 다를 결여하는 재조합 코리네박테리움 디프테리아 균주는 VLM s-Ontak을 생성하는 추가의 제조 방법을 위한 유용한 생산 균주일 것이다.
디프테리아 독소-기반 융합 단백질의 단백질 제조 프로세스
본 발명의 DNA 플라스미드 및 발현 벡터를 사용하여, 신규한 프로세스는 Ontak®의 통상의 제조 방법과 연관된 문제를 제거하는 것을 발견했다. Ontak®은 이. 콜라이 발현 시스템에서 DNA 벡터를 사용하여 현재 발현된다. c-데니류킨 디프티톡스 또는 Ontak®은 521 아미노산 길이이고, 58kD의 분자량을 갖는다. 종래의 Ontak® 제조 프로세스는, 이종성 분자량의 Ontak® 응집체, 잔류 DNA, 및 2011년 6월에 보류된 임상에서 FDA 배치 고전적-Ontak®을 제공하는 최종 제형 중에 과다한 잔류 세정제의 형성을 제공한다. 도 8a에서 관찰된 바와 같이, Ontak®은 이. 콜라이 중의 플라스미드로부터 발현되고, 봉입체 형태로서 공지된 불용성의 세포질 Ontak® 축적물을 제공한다. 본 발명의 프로세스를 사용하여, 도 8b는, 도 9에 설명된 바와 같이 용이하게 정제되고 보다 높은 단백질 수율을 제공할 수 있는 세포 비함유 상청액 중의 세포외 성숙 분비된 단백질로서 s-데니류킨 디프티톡스의 발현을 설명한다. 도 9는 항-IL-2로 프로빙된 본 발명의 프로세스를 사용하여 생성한 전체 단백질의 쿠마시에 블루 염색 및 s-데니류킨 디프티톡스의 항-IL2 면역블롯 둘 다를 나타낸다.
본 발명의 신규한 프로세스는 1) 세균, 바람직하게는 코리네박테리움 디프테리아 균주를 본 발명의 DNA 발현 벡터로 형질전환시키는 단계; 2) 형질전환체를 형성하는 단계; 3) 형질전환체를 단백질(예를 들면, 디프테리아 독소-기반 융합 단백질 및 시그널 펩티드를 통상 함유하는 CRM)의 성장 및 발현을 가능하게 하는 소정 시간 동안 배양 배지에서 배양하는 단계; 4) 단백질을 배양 배지로 분비시키는 단계(단백질에 부착된 시그널 펩티드에 기인하여); 및 (8) 배양 배지로부터 디프테리아 독소-기반 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. DNA 발현 벡터는, 적어도 하나의 단백질, 예를 들면, 디프테리아 독소 융합 단백질, CRM 단백질, 또는 본 발명의 시그널 펩티드에 부착할 수 있는 기타 단백질을 조절하는 ToxP 및 돌연변이체 ToxO를 포함한다.
본 발명의 디프테리아 독소-기반 융합 단백질의 치료 용도
Ontak®의 임상 효과는 피부 T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 스테로이드-내성 이식 대 숙주 질환, 메토트렉세이트-내성 건선, 및 메토트렉세이트-내성 류마티스성 관절염에서 입증되었다. 또한, 임상 효과는, 도 14에 제시된 바와 같이, 악성 흑색종 및 난소암에서 입증되었다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 본 발명의 디프테리아 독소-기반 융합 단백질(s-데시류킨 디프티톡스, ms-데니류킨 디프티톡스, is-데니류킨 디프티톡스-VLM, ms-데니류킨 디프티톡스-VLM 포함)은 질환을 치료 또는 예방하는 임상 유효성과 관련하여 상업적으로 시판되는 Ontak®과 유사하거나 보다 우수하게 실행할 것이다.
결핵의 치료
도 10에 설명된 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 본 발명의 디프테리아 독소 융합 단백질이 결핵에 대해 활성적일 것으로 생각한다. 데니류킨 디프티톡스는 T 조절 (Treg) 세포를 포함하는 IL-2-수용체 (CD25+)-담지 세포를 고갈시키는 것으로 공지되어 있다. Treg 세포는 FoxP3 뿐만 아니라 CD25를 발현하고, Teffector(Teff) 세포의 이들의 억제에 의해 면역억제성이다. Teff 세포, 예를 들면, CD4+ Thelper(Th) 세포 및 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)는 엠. 투베르쿨로시스 세균 감염을 함유하기 위해 결핵 육아종 내에 요구된다. 결핵 감염 동안, 육아종으로 불리우는 세포 병변은 감염을 함유하도록 형성되지만, 간균을 완전히 근절할 수는 없다. 조절 T 세포(Treg)는 육아종으로 동원되어, 이펙터 T 세포 기능의 억제를 유도하고 잠재적으로 엠. 투베르쿨로시스 영속성 및 성장을 위한 허용되는 환경에 기여한다. 본 발명의 디프테리아 독소 융합 단백질은, TB 감염 동안 이들 세포에 의한 면역 억제를 개선하기 위해, IL-2 수용체를 발현하는 Treg를 고갈시키는데 사용된다. 도 11은 엠. 투베르쿨로시스를 갖는 대상체(마우스)의 생체내 치료에 사용된 디프테리아 융합 단백질을 설명한다. 마우스는, 0일차에 약 2.8 log10 CFU 계수의 초기 이식을 제공하는 에어로졸 감염에 의해 M. tb. 균주 H37Rv로 감염시켰다. 마우스 그룹은 1개 처리 사이클(1×, 감염후 2주에서 투약) 또는 2개 처리 사이클(2×, 감염후 약 3일 및 감염후 2주에서 투약)로 750ng의 c-Ontak®을 복강내(IP) 또는 정맥내(IV)로 처리했다. 데니류킨 디프티톡스의 처리 사이클은 2일 간격으로 2회 제공된 35mg/kg(전형적 마우스에 대해 750ng)으로 정의된다. 경구 강제사육에 의한 RHZ 1일 처리는 2주에서 개시했다. R은 리팜핀이고, 10mg/kg으로 마우스에게 제공한다. H는 이소니아지드이고, 10mg/kg으로 마우스에게 제공한다. Z는 피라진아미드이고, 150mg/kg으로 마우스에게 제공했다. 이 연구의 결과는 도 12 및 13에 설명되어 있다.
암의 치료
Treg는 또한 항-종양 면역성을 억제하는 것으로 밝혀졌고, 종양에서 Treg의 세포 확장은 일반적으로 환자에서 불량한 예후와 상관한다. 흑색종 환자에서 데니류킨 디프티톡스 치료는 Treg의 일시적 고갈을 제공했고, 1년 평균 생존 기간을 증가시켰다. 본 발명의 s-데니류킨 디프티톡스 및 s-데니류킨 디프티톡스-VLM을 사용하여, 암 면역요법으로서 Treg로 심각하게 침윤된 종양을 갖는 환자에서 Treg를 고갈시킬 수 있다.
본원에서 인용된 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참조에 의해 도입되고 이의 전체가 본원에 기재되어 있는 것과 동일한 정도로 참조로서 본원에 도입된다.
본 발명(특히 하기 특허청구범위의 문맥에서)을 기재하는 문맥에서 용어 "a", "an" 및 "the" 및 유사한 지시대상의 사용은, 본원에 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘다를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "이루어진", "갖는", "포함하는" 및 "함유하는"은, 달리 기재하지 않는 한, 제한 없는 용어(즉, "포함하지만 이로 제한되지 않는"을 의미한다)로서 해석되어야 한다. 본원에서 수치 범위의 열거는, 본원에서 달리 지시하지 않는 한, 범위 내의 각 개별 수치를 개별적으로 지칭하는 단축 방법으로서 사용되는 것을 의도하고, 각각의 개별 수치는 본원에서 개별적으로 인용되는 것과 같이 본 명세서 중에 도입된다. 본원에 기재된 모든 방법은, 본원에서 달리 지시하지 않거나 문맥에 의해 달리 명백하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행할 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적 용어(예를 들면, "~ 등")의 사용은 단순히 본 발명을 보다 잘 설명하는 것을 의도하고, 달리 주장하지 않는 한, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 명세서의 어떠한 어구도, 본 발명의 실시에 불가결한 임의의 비-청구된 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 않된다.
본 발명을 실시하는 최선의 형태를 포함하는 본 발명의 바람직한 실시형태가 본원에 기재되어 있다. 이들 바람직한 실시형태의 변형태는, 전술한 기재를 읽음으로써 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명자들은 당업자가 이러한 변형을 적절히 사용하는 것을 예상하고, 본 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과는 별개의 방법으로 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은, 적용법에 의해 허용되는 바와 같이, 첨부의 특허청구범위에 기재된 주제의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 더욱이, 이의 모든 가능한 변형태에서 본 발명의 기재된 요소의 임의의 조합은, 본원에 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 본 발명에 포함된다.
본 개시의 실시형태는, 암 및 결핵 등의 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법 및/또는 조성물에 관한 것이고, 여기서 대상체는 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 조성물을 투여한다.
암 및/또는 결핵 등의 질환을 갖는 것으로 공지되어 있거나 이러한 질환을 갖는 것으로 의심되거나 이러한 질환을 가질 위험성이 있는 개체는 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 유효량의 본 발명의 조성물을 제공할 수 있다. 암 또는 결핵의 위험성이 있는 자는 하나 이상의 유전적 요인을 갖는 개체이고, 연령이 진행될 가능성이 있고/있거나, 예를 들면, 가족력을 가질 수 있다.
본 개시의 특정 실시형태에서, 개체는, 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 조성물에 추가하여 암 및/또는 결핵 치료제가 제공된다. 이러한 추가 요법은, 예를 들면, 화학요법제 또는 항균제를 포함할 수 있다. 병용 요법이 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 조성물과 함께 사용되는 경우, 추가 요법은 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 조성물의 투여 전, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 제공될 수 있다.
약제학적 제제
본 발명의 약제학적 조성물은, 약제학적으로 허용되는 담체에 용해 또는 분산된, 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 유효량의 본 발명의 하나 이상의 조성물을 포함한다. 문구 "약제학적 또는 약리학적으로 허용되는"은 동물, 예들 들면, 인간에게 적절하게 투여되는 경우, 유해한, 알러지성 또는 기타 부정적 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열 또는 추가의 활성 성분을 포함하는 적어도 하나의 본 발명의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물의 제조는, 본원에서 참조로서 도입된 문헌[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed. Lippincott Williams and Wilkins, 2005]에 예시된 바와 같이, 본 명세서에 비추어 당업자에게 공지되어 있다. 더욱이, 동물(예: 인간) 투여의 경우, 생물학적 기준의 FDA 사무국의 요구에 따라, 제제는 무균성, 발열원성, 일반 안전성 및 순도 기준을 만족해야 하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는, 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, 본원에서 참조로서 도입됨], 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 방부제(예: 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 유사한 물질 및 이의 조합을 포함한다. 임의의 종래의 담체가 활성 성분과 부적합한 경우를 제외하고, 약제학적 조성물에서 이의 사용이 의도된다.
서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물은, 이들이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지 및 이들이 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균시킬 필요가 있는지에 따라 상이한 타입의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 정맥내, 피내, 경피, 척수내, 동맥내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 국소, 근육내, 피하, 점막, 경구, 국소, 국지, 흡입(예: 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 직접 표적 세포를 배싱(bathing)하는 국지화 관류, 카테터를 통해, 세정을 통해, 크림, 액체 조성물(예: 리포좀), 또는 당업자에게 공지된 기타 방법 또는 상기의 임의의 조합으로 투여할 수 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, 본원에서 참조로서 도입됨].
서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물은 유리 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산 부가 염, 예를 들면, 단백질성 조성물의 유리 아미노 그룹으로 형성되거나, 무기 산, 예를 들면, 염산 또는 인산, 또는 유기 산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산으로 형성되는 것들을 포함한다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철; 또는 유기 염기, 예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유래할 수 있다. 제형화하면, 용액은 용량 제형에 적합한 방식, 및 치료학적으로 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 제형은, 비경구 투여용으로 제형화된 것, 예를 들면, 주사가능한 용액, 또는 폐로의 전달을 위한 에어로졸, 또는 소화 투여용으로 제형화된 것, 예를 들면, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 용량 형태로 용이하게 투여할 수 있다.
추가로, 본 개시에 따라서, 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 불활성 희석제의 존재 또는 부재하에 약제학적으로 허용되는 담체에 제공된다. 담체는 동화가능하고, 액체, 반고체, 즉 페이스트, 또는 고체 담체를 포함한다. 임의의 종래의 매체, 제제, 희석제 또는 담체가 수용자에게 유해하거나 그 속에 함유된 조성물의 치료학적 유효성에 유해한 경우를 제외하고, 본 발명의 방법을 실시하는데 사용하기 위한 투여가능한 조성물에서 이의 사용이 적절하다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 식염수, 지질, 리포좀, 수지, 결합제, 충전제 등 또는 이의 조합을 포함한다. 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키는 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가로, 미생물의 작용의 예방은 방부제, 예를 들면, 파라벤(예: 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이의 조합을 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명에 따르면, 조성물은 임의의 편리한 및 실용적 방식, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합된다. 이러한 절차는 당업자에게 일상적이다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 완전히 조합 또는 혼합된다. 혼합은 분쇄 등의 임의의 편리한 방법으로 수행할 수 있다. 안정화제는 또한 조성물을 치료학적 활성의 소실, 즉 위에서의 변성으로부터 보호하기 위해 혼합 프로세스에서 첨가될 수 있다. 조성물에 사용하기 위한 안정화제의 예는 완충제, 아미노산, 예를 들면, 글리신 및 리신, 탄수화물, 예를 들면, 덱스트로즈, 만노즈, 갈락토즈, 프럭토즈, 락토즈, 수크로즈, 말토즈, 솔비톨, 만니톨 등을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물, 하나 이상의 지질 및 수성 용매를 포함하는 약제학적 지질 비히클 조성물의 사용에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지질"은, 특징적으로 물에 불용성이고 유기 용매로 추출가능한 광범위한 물질 중의 어느 하나를 포함하는 것으로 정의된다. 이러한 광범위한 부류의 화합물은 당업자에게 공지되어 있고, 용어 "지질"이 본원에서 사용되는 바와 같이, 이는 임의의 특정 구조로 한정되지 않는다. 예는 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 화합물을 포함한다. 지질은 천연 존재 또는 합성적(즉, 인간에 의해 설계되거나 생성됨)일 수 있다. 그러나, 지질은 통상 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 터펜, 리소지질, 글리코스핑고지질, 당지질, 설파티드, 에테르 및 에스테르-결합 지방산을 갖는 지질 및 중합성 지질, 및 이의 조합을 포함한다. 물론, 지질로서 당업자에 의해 이해되는 본원에 구체적으로 기재된 것들 이외의 화합물도 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 포함된다.
당업자는 조성물을 지질 비히클에 분산시키기 위해 사용할 수 있는 다양한 기술에 친숙할 것이다. 예를 들면, 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물은, 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해, 지질을 함유하는 용액에 분산시키거나, 지질로 용해시키거나, 지질로 유화시키거나, 지질과 혼합하거나, 지질과 조합하거나, 지질과 공유 결합시키거나, 지질 중의 현탁액으로 함유시키거나, 미셀 또는 리포좀에 함유시키거나 이와 복합체화시키거나, 달리는 지질 또는 지질 구조와 회합시킬 수 있다. 분산액은 리포좀의 형성을 제공하거나 제공하지 않을 수 있다.
동물 환자에게 투여된 본 발명의 조성물의 실제 투여량은 체중, 상태의 중증도, 치료되는 질환의 타입, 이전 또는 동시 치료적 개입, 환자의 특발성 및 투여 경로 등의 물리적 및 생리학적 요인에 의해 결정될 수 있다. 용량형 및 투여 경로에 의존하여, 바람직한 용량 및/또는 유효량의 투여 회수는 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 어느 경우에도, 투여를 담당하는 시술자는 조성물 중의 활성 성분(들)의 농도 및 개개 대상체를 위한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들면, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 활성 화합물은, 예를 들면, 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 및 그 중의 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 당연하게는, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물(들)의 양은, 적합한 용량이 화합물의 임의의 소정 단위 용량으로 수득되도록 하는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생물이용성, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 저장 수명, 뿐만 아니라 기타 약리학적 고려사항 등의 인자는 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려될 것이고, 따라서 다양한 용량 및 치료 섭생이 바람직할 수 있다.
다른 비-제한적 예에서, 용량은 투여당 약 1㎍/kg/체중, 약 5㎍/kg/체중, 약 10㎍/kg/체중, 약 50㎍/kg/체중, 약 100㎍/kg/체중, 약 200㎍/kg/체중, 약 350㎍/kg/체중, 약 500㎍/kg/체중, 약 1mg/kg/체중, 약 5mg/kg/체중, 약 10mg/kg/체중, 약 50mg/kg/체중, 약 100mg/kg/체중, 약 200mg/kg/체중, 약 350mg/kg/체중, 약 500mg/kg/체중, 약 1000mg/kg/체중 또는 그 이상, 및 그 속의 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 수록된 수치로부터 유도가능한 범위의 비제한적 예에서, 상기 기재된 수치에 기초하여, 약 5mg/kg/체중 내지 약 100mg/kg/체중, 약 5㎍/kg/체중 내지 약 500mg/kg/체중의 범위 등이 투여될 수 있다.
소화 조성물 및 제형
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물은 소화 경로를 통해 투여되도록 제형화된다. 소화 경로는 조성물이 소화관과 직접 접촉하는 모든 가능한 투여 경로를 포함한다. 구체적으로, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 경구, 구강, 직장 또는 설하에 의해 투여할 수 있다. 이와 같이, 이들 조성물은 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체로 제형화할 수 있거나, 이들은 경질- 또는 연질-쉘 젤라틴 캡슐에 봉입할 수 있거나, 이들은 타정할 수 있거나, 이들은 식사의 음식물로 직접 도입할 수 있다.
특정 실시형태에서, 활성 화합물은 부형제와 함께 도입되고 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭시르, 현탁제, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용할 수 있다[참조: Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; 미국 특허 제5,641,515호; 제5,580,579호 및 제5,792, 451호, 각각은 이의 전체가 참조로서 구체적으로 도입됨]. 정제, 트로키제, 환제, 캡슐제 등은 또한 하기를 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들면, 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수전분, 젤라틴 또는 이의 조합; 부형제, 예를 들면, 인산이칼슘, 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카라이드, 셀룰로즈, 탄산마그네슘 또는 이의 조합; 붕해제, 예를 들면, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 또는 이의 조합; 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트; 감미제, 예를 들면, 수크로즈, 락토즈, 사카린 또는 이의 조합; 향미제, 예를 들면, 페퍼민트, 윈터그린 오일, 체리향, 오렌지향 등. 용량 단위 형태가 캡슐인 경우, 이는, 상기 타입의 물질에 추가하여, 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 기타 물질은 코팅으로서 존재하거나, 용량 단위의 물리적 형태를 달리 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐제는 쉘락, 당 또는 이들 둘 다로 코팅할 수 있다. 용량 형태가 캡슐인 경우, 이는, 상기 타입의 물질에 추가하여, 액체 담체 등의 담체를 함유할 수 있다. 젤라틴 캡슐, 정제 또는 환제는 장용적으로 코팅할 수 있다. 장용 코팅은 pH가 산성인 위장 또는 상부 장에서 조성물의 변성을 방지한다[참조: 미국 특허 제5,629,001호]. 소장에 도달하면, 그 중의 염기성 pH는 코팅을 분해하고 조성물이 특수 세포, 예를 들면, 상피 장세포 및 페이어 패치 M 세포에 의해 방출 및 흡수되는 것을 가능하게 한다. 엘릭시르의 시럽은 감미제로서 활성 화합물 수크로즈, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 향미, 예를 들면, 체리향 또는 오렌지향을 함유할 수 있다. 물론, 임의의 용량 단위 형태의 제조에 사용된 임의의 물질은 사용된 양에서 약제학적으로 순수하고 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 지속-방출 제제 및 제형으로 도입될 수 있다.
경구 투여를 위해, 본 발명의 조성물은 달리는 구강세정제, 치약, 구강 정제, 경구 스프레이 또는 설하 경구-투여된 제형의 형태로 하나 이상의 부형제와 함께 도입할 수 있다. 예를 들면, 구강세정제는 활성 성분을 필요한 양으로 적절한 용매, 예를 들면, 붕산나트륨 용액(Dobell 용액)에 도입하여 제조할 수 있다. 또는, 활성 성분은 경구 용액, 예를 들면, 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산나트륨을 함유하는 것에 도입하거나, 치약에 분산시키거나, 물, 결합제, 마모제, 향미제, 발포제 및 습윤제를 포함하는 조성물에 치료학적 유효량으로 첨가할 수 있다. 또는, 조성물은, 혀 하부에 위치시키거나 달리는 입에서 용해될 수 있는 정제 또는 용액 형태로 형성할 수 있다.
소화 투여의 다른 방식에 적합한 추가의 제형은 좌제를 포함한다. 좌제는 직장으로 삽입하기 위한, 통상 약용의, 다양한 중량 및 형상의 고체 용량 형태이다. 삽입 후, 좌제는 연화하고, 용융하거나 공동 유체에서 용해한다. 일반적으로, 좌제의 경우, 종래의 담체는, 예를 들면, 폴리알킬렌 글리콜, 트리글리세라이드 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 좌제는, 예를 들면, 활성 성분을 약 0.5% 내지 약 10% 및 바람직하게는 약 1% 내지 약 2%의 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
비경구 조성물 및 제형
추가의 실시형태에서, 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물은 비경구 경로를 통해 투여할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비경구"는 소화관을 우회하는 경로를 포함한다. 구체적으로, 본원에 개시된 약제학적 조성물은, 예를 들면, 이들로 한정되지 않지만, 정맥내, 피내, 근육내, 동맥내, 척수내, 피하 또는 복강내로 투여할 수 있다[참조: 미국 특허 제6,7537,514호, 제6,613,308호, 제5,466,468호, 제5,543,158호; 제5,641,515호; 및 제5,399,363호(각각은 이의 전체가 본원에서 참조로서 구체적으로 도입된다)].
유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예를 들면, 하이드록시프로필셀룰로즈와 적합하게 혼합된 물에서 제조할 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일에서 제조할 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다. 주사가능한 용도에 적합한 약제 형태는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다(미국 특허 제5,466,468호, 본원에서 이의 전체가 참조로서 구체적으로 도입됨). 모든 경우에, 해당 형태는 멸균성이어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하고, 세균 및 진균 등의 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(즉, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들면, 코팅, 예를 들면, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구된 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 다수의 경우에, 등장제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는, 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 이루어질 수 있다.
수용액 중에서의 비경구 투여를 위해, 예를 들면, 용액은 필요에 따라 적합하게 완충시킬 수 있고, 액체 희석제를 충분한 염수 또는 글루코즈로 먼저 등장성으로 되게 한다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시에 비추어 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 하나의 용량은 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 피하주사 유체를 첨가하거나, 제안된 주입 부위에서 주사할 수 있다[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580]. 용량에서의 일부 변화는 치료되는 대상체의 상태에 따라 필연적으로 발생한다. 투여를 담당하는 자는, 어떤 경우에도, 개개 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간 투여를 위해, 제제는 생물학 기준의 FDA 사무국에 의해 요구된 멸균성, 발연원성, 일반 안전성 및 순도 기준을 만족시켜야 한다.
멸균 주사가능한 용액은 활성 화합물을 요구된 양으로, 필요한 경우, 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적합한 용매에 도입하고, 이어서 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 요구된 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 도입함으로써 제조한다. 멸균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은, 이의 선행 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가 목적하는 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다. 분말화된 조성물은 멸균제의 존재 또는 부재하에, 액체 담체, 예를 들면, 물 또는 염수 용액과 조합한다.
기타 약제학적 조성물 및 제형
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물은 다양한 기타 경로, 예를 들면, 국소(경피) 투여, 점막 투여(비강내, 질내 등) 및/또는 흡입을 통한 투여를 위해 제형화할 수 있다.
국소 투여를 위한 약제학적 조성물은 의약 적용, 예를 들면, 연고, 페이스트, 크림 또는 분말용으로 제형화된 활성 화합물을 포함할 수 있다. 연고는 국소 적용을 위한 모든 유성, 흡수, 에멀젼 및 수용성 기반 조성물을 포함하고, 크림 및 로션은 단지 에멀젼 기재만을 포함하는 조성물이다. 국소 투여된 의약은 피부를 통한 활성 성분의 흡수를 촉진시키기 위한 침투 증가제를 함유할 수 있다. 적합한 침투 증강제는 글리세린, 알콜, 알킬 메틸 설폭사이드, 피롤리돈 및 라우로카프람을 포함한다. 국소 적용을 위한 조성물의 가능한 염기는 폴리에틸렌 글리콜, 라놀린, 콜드 크림 및 석유, 뿐만 아니라 임의의 기타 적합한 흡수, 에멀젼 또는 수용성 연구 기재를 포함한다. 국소 제제는 또한 필요에 따라 유화제, 겔화제 및 항균성 방부제를 포함하여 활성 성분을 보존하고 균질한 혼합물을 제공할 수 있다. 본 발명의 경피 투여는 또한 "패치"의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들면, 패치는 고정된 시간 기간에 걸쳐 하나 이상의 활성 물질을 소정 속도로 및 연속 방식으로 공급할 수 있다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 점안액, 비강내 스프레이, 흡입 및/또는 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달할 수 있다. 비강내 에어로졸 스프레이를 통해 조성물을 직접 폐로 전달하는 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제5,756,353호 및 제5,804,212호(각각은 이의 전체가 본원에서 구체적으로 도입된다)에 기재되어 있다. 마찬가지로, 비강내 미립자 수지(Takenaga et al., 1998) 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물(미국 특허 제5,725, 871호, 이의 전체가 본원에서 참조로서 구체적으로 도입됨)을 사용한 약물의 전달은 또한 약제 기술분야에 공지되어 있다. 또한, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스의 형태로 점막내 약물 전달은 미국 특허 제5,780,045호(이의 전체가 본원에서 참조로서 구체적으로 도입된다)에 기재되어 있다.
용어 에어로졸은 액화 또는 가압된 가스 분사제 중에 분산된 액체 입자의 미분된 고체의 콜로이드 시스템을 지칭한다. 흡입을 위한 본 발명의 전형적 에어로졸은 액체 분사제 또는 액체 분사제와 적합한 용매의 혼합물 중의 활성 성분의 현탁액으로 이루어진다. 적합한 분사제는 탄화수소 및 탄화수소 에테르를 포함한다. 적합한 용기는 분사제의 압력 요구에 따라 달라진다. 에어로졸의 투여는 대상체의 연령, 중량 및 증상의 중증도 및 반응에 따라 달라진다.
본 발명의 키트
본원에 기재된 임의의 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 비제한적 예에서, 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물은 키트에 포함될 수 있다.
키트는 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물의 적합한 분취량, 및 일부 경우에, 하나 이상의 추가 제제를 포함할 수 있다. 키트의 성분(들)은 수성 매체 또는 동결건조된 형태로 팩키징될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 시린지 또는 기타 용기 수단을 포함하고, 그 중으로 성분이 배치되고 바람직하게는 적합하게 분주된다. 키트 중에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우, 키트는 또한 일반적으로 제2, 제3 또는 기타 추가의 용기를 함유하고, 그 중으로 추가의 성분이 별도로 배치될 수 있다. 그러나, 성분들의 다양한 조합이 바이알 내에 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 전형적으로 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물을 함유하는 수단, 및 상업적 판매를 위해 밀폐된 임의의 기타 시약 용기를 포함한다. 이러한 용기는 목적하는 바이알이 보유되어 있는 주사 또는 중공-성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
키트의 성분이 하나 및/또는 그 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액이고, 멸균 수용액이 특히 바람직하다. 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나 또는 이의 융합 단백질 등의 핵산 또는 단백질 서열을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물은 주사가능한 조성물로 제형화할 수 있다. 어느 경우에, 용기 수단 자체는 시린지, 피펫 및/또는 기타 이와 유사한 장치일 수 있고, 이로부터 제형은 신체의 감염된 부분에 적용하거나, 동물에게 주사하고/하거나, 심지어 키트의 다른 성분에 적용 및/또는 이와 혼합할 수 있다.
그러나, 키트의 성분은 건조 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 및/또는 성분이 건조 분말로서 제공되는 경우, 분말은 적합한 용매의 첨가에 의해 재구성할 수 있다. 용매는 또한 또 다른 용기 수단에 제공될 수 있는 것으로 상정된다.
SEQUENCE LISTING
<110> THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY
TRUSTEES OF BOSTON UNIVERSITY
<120> METHODS OF PRODUCING AGGREGATE-FREE MONOMERIC DIPHTHERIA TOXIN
FUSION PROTEINS AND THERAPEUTIC USES
<130> IPA181138-US
<140> PCT/US2017/021715
<141> 2017-03-10
<150> 62/306,281
<151> 2016-03-10
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1
ttaggatagc taagtccat 19
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 2
ttgatttcag agcaccctta taattaggat agctaagtcc at 42
<210> 3
<211> 1711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 3
ttgatttcag agcaccctta taattaggat agctaagtcc attattttat gagtcctggt 60
aaggggatac gttgtgagca gaaaactgtt tgcgtcaatc ttaatagggg cgctactggg 120
gataggggcc ccaccttcag cccatgcagg cgctgatgat gttgttgatt cttctaaatc 180
ttttgtgatg gaaaactttt cttcgtacca cgggactaaa cctggttatg tagattccat 240
tcaaaaaggt atacaaaagc caaaatctgg tacacaagga aattatgacg atgattggaa 300
agggttttat agtaccgaca ataaatacga cgctgcggga tactctgtag ataatgaaaa 360
cccgctctct ggaaaagctg gaggcgtggt caaagtgacg tatccaggac tgacgaaggt 420
tctcgcacta aaagtggata atgccgaaac tattaagaaa gagttaggtt taagtctcac 480
tgaaccgttg atggagcaag tcggaacgga agagtttatc aaaaggttcg gtgatggtgc 540
ttcgcgtgta gtgctcagcc ttcccttcgc tgaggggagt tctagcgttg aatatattaa 600
taactgggaa caggcgaaag cgttaagcgt agaacttgag attaattttg aaacccgtgg 660
aaaacgtggc caagatgcga tgtatgagta tatggctcaa gcctgtgcag gaaatcgtgt 720
caggcgatca gtaggtagct cattgtcatg catcaacctg gattgggatg ttatccgtga 780
taaaactaaa actaagatcg aatctctgaa agaacacggt ccgatcaaaa acaaaatgag 840
cgaaagcccg aacaaaactg tatctgaaga aaaagctaaa cagtacctgg aagaattcca 900
ccagactgca ctggaacacc cggaactgtc tgaacttaag accgttactg gtaccaaccc 960
ggtattcgct ggtgctaact acgctgcttg ggcagtaaac gttgctcagg ttatcgatag 1020
cgaaactgct gataacctgg aaaaaactac cgcggctctg tctatcctgc cgggtatcgg 1080
tagcgtaatg ggcatcgcag acggcgccgt tcaccacaac actgaagaaa tcgttgcaca 1140
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tgatatcggt ttcgctgcat acaacttcgt tgaaagcatc atcaacctgt tccaggttgt 1260
tcacaactct tacaaccgcc cggcttactc tccgggtcac aagacgcatg cacctacttc 1320
tagctctacc aagaaaaccc agctgcagct cgagcacctg ctgctggatt tgcagatgat 1380
cctgaacggt atcaacaatt acaagaaccc gaaactgacg cgtatgctga ccttcaagtt 1440
ctacatgccg aagaaggcca ccgaactgaa acacctgcag tgtctagaag aagaactgaa 1500
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<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 4
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<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 5
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala
20 25
<210> 6
<211> 1566
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 6
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acctga 1566
<210> 7
<211> 1566
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 7
atgggcgctg atgatgttgc tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60
taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120
tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa 180
tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240
gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300
gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360
acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420
ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480
agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540
gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600
tcatgcatca acctggattg ggatgttatc cgtgataaaa ctaaaactaa gatcgaatct 660
ctgaaagaac acggtccgat caaaaacaaa atgagcgaaa gcccgaacaa aactgtatct 720
gaagaaaaag ctaaacagta cctggaagaa ttccaccaga ctgcactgga acacccggaa 780
ctgtctgaac ttaagaccgt tactggtacc aacccggtat tcgctggtgc taactacgct 840
gcttgggcag taaacgttgc tcaggttatc gatagcgaaa ctgctgataa cctggaaaaa 900
actaccgcgg ctctgtctat cctgccgggt atcggtagcg taatgggcat cgcagacggc 960
gccgttcacc acaacactga agaaatcgtt gcacagtcta tcgctctgag ctctctgatg 1020
gttgctcagg ccatcccgct ggtaggtgaa ctggttgata tcggtttcgc tgcatacaac 1080
ttcgttgaaa gcatcatcaa cctgttccag gttgttcaca actcttacaa ccgcccggct 1140
tactctccgg gtcacaagac gcatgcacct acttctagct ctaccaagaa aacccagctg 1200
cagctcgagc acctgctgct ggatttgcag atgatcctga acggtatcaa caattacaag 1260
aacccgaaac tgacgcgtat gctgaccttc aagttctaca tgccgaagaa ggccaccgaa 1320
ctgaaacacc tgctgcagtg tctagaagaa gaactgaaac cgctggagga agttctgaac 1380
ctggctcagt ctaaaaactt ccacctgcgg ccgcgtgacc tgatctctaa catcaacgta 1440
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gcaaccatcg tagaattcct gaaccgttgg atcaccttct gtcagtctat catctctacc 1560
ctgacc 1566
<210> 8
<211> 1638
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 8
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gctgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120
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caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 240
accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 300
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gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa 600
gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta 660
ggtagctcat tgtcatgcat caacctggat tgggatgtta tccgtgataa aactaaaact 720
aagatcgaat ctctgaaaga acacggtccg atcaaaaaca aaatgagcga aagcccgaac 780
aaaactgtat ctgaagaaaa agctaaacag tacctggaag aattccacca gactgcactg 840
gaacacccgg aactgtctga acttaagacc gttactggta ccaacccggt attcgctggt 900
gctaactacg ctgcttgggc agtaaacgtt gctcaggtta tcgatagcga aactgctgat 960
aacctggaaa aaactaccgc ggctctgtct atcctgccgg gtatcggtag cgtaatgggc 1020
atcgcagacg gcgccgttca ccacaacact gaagaaatcg ttgcacagtc tatcgctctg 1080
agctctctga tggttgctca ggccatcccg ctggtaggtg aactggttga tatcggtttc 1140
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aacaattaca agaacccgaa actgacgcgt atgctgacct tcaagttcta catgccgaag 1380
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gttctgaacc tggctcagtc taaaaacttc cacctgcggc cgcgtgacct gatctctaac 1500
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atctctaccc tgacctga 1638
<210> 9
<211> 402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 9
gcacctactt ctagctctac caagaaaacc cagctgcagc tcgagcacct gctgctggat 60
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tggatcacct tctgtcagtc tatcatctct accctgacct ga 402
<210> 10
<211> 521
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 10
Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
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Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp
35 40 45
Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys
85 90 95
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100 105 110
Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe
115 120 125
Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu
145 150 155 160
Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln
165 170 175
Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val
180 185 190
Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp
195 200 205
Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His
210 215 220
Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser
225 230 235 240
Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu
245 250 255
Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro
260 265 270
Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln
275 280 285
Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala
290 295 300
Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly
305 310 315 320
Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu
325 330 335
Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val
340 345 350
Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu
355 360 365
Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly
370 375 380
His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
385 390 395 400
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
405 410 415
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420 425 430
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
435 440 445
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
450 455 460
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
465 470 475 480
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
485 490 495
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500 505 510
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
515 520
<210> 11
<211> 560
<212> PRT
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 11
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His
405 410 415
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420 425 430
Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
435 440 445
Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly
450 455 460
Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
465 470 475 480
Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
485 490 495
Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu
500 505 510
His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu
515 520 525
Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
530 535 540
His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560
<210> 12
<211> 545
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 12
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
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Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
435 440 445
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
450 455 460
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
465 470 475 480
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
500 505 510
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
515 520 525
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
530 535 540
Thr
545
<210> 13
<211> 520
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
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100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
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485 490 495
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500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
515 520
<210> 14
<211> 545
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 14
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp
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Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
435 440 445
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
450 455 460
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
465 470 475 480
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
500 505 510
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
515 520 525
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530 535 540
Thr
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<210> 15
<211> 520
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 15
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
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Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
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Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
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Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
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260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
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290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
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325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
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Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
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485 490 495
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500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
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<211> 522
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
Met Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
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Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys
85 90 95
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100 105 110
Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe
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130 135 140
Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu
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Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln
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325 330 335
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 17
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
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Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 18
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
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Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
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195 200 205
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Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
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405 410 415
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Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
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Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
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Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
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His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560
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<211> 535
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 19
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
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130 135 140
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Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr
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Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly
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Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser
485 490 495
Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu
500 505 510
Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Phe Lys Leu Ser
515 520 525
Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
530 535
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<211> 560
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 20
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
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165 170 175
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Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
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Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Phe His
405 410 415
Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg
420 425 430
Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
435 440 445
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450 455 460
Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
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Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
485 490 495
Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu
500 505 510
His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu
515 520 525
Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
530 535 540
His Thr Lys Val Asn Phe Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560
<210> 21
<211> 6402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 21
ggcgagtgct ttgaatgctt gggcttcttc acggcgggtc ttgaccgcgt tgataagttc 60
gcggccagag ctgaattgct ggcgtggggt ggggttgaac tggtcgtgtc ctgccatatc 120
ccttacctgc tttatcaagt ctccaaggcg catcacccgg ttgtgctgcc tataccaacg 180
ataagcggta ggggctttgc ctgtgtagaa cgggttgcgg ctaaagcggt gggaaaagtg 240
cgggtcatgg tctaaaagct cacccagcac acgcgtggtt gctgcaagaa gcttcatctg 300
cgcagattta ccgttacggt cagcgtagac agggtcaata agccatatga actgggcttt 360
gccgttagtt gggttaatac ccacccaggc tggcccgacg ctatgagtaa tcagtgagcg 420
caccacgtcg cggacgtacg ggtttaagtc tgcggggtca ccgcctgcgg tacctacttg 480
gtcaacgtct acgaccagga cggcggcgta ctgcttggtg gtgagcatgg cgtactcgca 540
ccgtcctaaa gcatcagtct cgaagcgata catacgcggc gagttcgtgc cgtcagcgtt 600
gcgtcgatag gcctttttaa agtctcgtgt gactgaaccg tggagtacat cgcggcctag 660
atgatcgcgt aaaaggtcgc ggtcactggc agatgctggg gtgttgtcca gtccaccacg 720
gtcgcgctcg acgcgggtag gtgttttagt gtgcgcattc tgcgcatgag tctgtaaact 780
catgaccgtg ctttctccca ggtgtgtgct gggtgataag cgaaagtcat cgggttgccg 840
cccggtggct ttcttcgttt ttcattgtct ttccctgact ctaaatgaca ccggtgttat 900
ttactagcca tgacacgcga aaaatatgcc ttttacctgc ggttacgtat ggctagacat 960
atggcaagct atacgtaacc gcgtttcagc tgcacagggc tgtctgcgca gatttaccat 1020
cacgggactt ttcccagttc aggctgcgca tatttacgca tacaacgaaa gcggttgcgc 1080
agatttacca cacactctgc gctgatttac cgatacgcag aaaaagcgtg cgcagattta 1140
cccatacggt ggcgaattat ccagagcaat aggtatacag caatacagta atacaggtgc 1200
cataaacctg tattactgta ttgctgtatg cctgtaaacc tttatttatt gttgtggacg 1260
tattcttcga ggtaggtgct aacaatctcg cggatggtca cgcctttttg ggcggcgatg 1320
actttaagtt ctgcgtgaag gtcgcggtcg atttcaatcg tcatcttctt gacgtagtcg 1380
cggcctgtgg gttggtggaa tgcgcttcgc actgttttct tctcggctgc tggagttagc 1440
ttcgtggctt ttttcattga ggttcgcggg ccttgctgcg ccctggcgcg ttctttactg 1500
gtgctcattt catcatctcc atgagttcgt cggcgacgtg gtcgtagccg tgcatgtcgg 1560
ggcctgggca gtatccaaac gctaggtgca tatcttcgcg tagcgggatt tcggttttaa 1620
agtgcggcat gtgttccgcg tcgagcgctt ctcgtgccgc gtcaagggcg ctggtgcctt 1680
tcctggcgaa cgtcagtaag actgcatgag gtgttccgtt gactgcgtcg cgcagctccc 1740
atactcggga gaggtcggca gcagcagaac gggtcggaag aatgatgaag tcgctgactg 1800
cgattgctgc ttcgatagcg ttctcgtctc ctggcggcac atcgataccg actgggcgat 1860
ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca 1920
ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac 1980
gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta 2040
gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgct 2100
cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc 2160
tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag 2220
ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attgtaatac gactcactat 2280
agggcgaatt ggagctccac cgcggtggcg gccgctctag aactagtgga tccagggcat 2340
tgatttcaga gcacccttat aattaggata gctaagtcca ttattttatg agtcctggta 2400
aggggatacg ttgtgagcag aaaactgttt gcgtcaatct taataggggc gctactgggg 2460
ataggggccc caccttcagc ccatgcaggc gctgatgatg ttgttgattc ttctaaatct 2520
tttgtgatgg aaaacttttc ttcgtaccac gggactaaac ctggttatgt agattccatt 2580
caaaaaggta tacaaaagcc aaaatctggt acacaaggaa attatgacga tgattggaaa 2640
gggttttata gtaccgacaa taaatacgac gctgcgggat actctgtaga taatgaaaac 2700
ccgctctctg gaaaagctgg aggcgtggtc aaagtgacgt atccaggact gacgaaggtt 2760
ctcgcactaa aagtggataa tgccgaaact attaagaaag agttaggttt aagtctcact 2820
gaaccgttga tggagcaagt cggaacggaa gagtttatca aaaggttcgg tgatggtgct 2880
tcgcgtgtag tgctcagcct tcccttcgct gaggggagtt ctagcgttga atatattaat 2940
aactgggaac aggcgaaagc gttaagcgta gaacttgaga ttaattttga aacccgtgga 3000
aaacgtggcc aagatgcgat gtatgagtat atggctcaag cctgtgcagg aaatcgtgtc 3060
aggcgatcag taggtagctc attgtcatgc atcaacctgg attgggatgt tatccgtgat 3120
aaaactaaaa ctaagatcga atctctgaaa gaacacggtc cgatcaaaaa caaaatgagc 3180
gaaagcccga acaaaactgt atctgaagaa aaagctaaac agtacctgga agaattccac 3240
cagactgcac tggaacaccc ggaactgtct gaacttaaga ccgttactgg taccaacccg 3300
gtattcgctg gtgctaacta cgctgcttgg gcagtaaacg ttgctcaggt tatcgatagc 3360
gaaactgctg ataacctgga aaaaactacc gcggctctgt ctatcctgcc gggtatcggt 3420
agcgtaatgg gcatcgcaga cggcgccgtt caccacaaca ctgaagaaat cgttgcacag 3480
tctatcgctc tgagctctct gatggttgct caggccatcc cgctggtagg tgaactggtt 3540
gatatcggtt tcgctgcata caacttcgtt gaaagcatca tcaacctgtt ccaggttgtt 3600
cacaactctt acaaccgccc ggcttactct ccgggtcaca agacgcatgc acctacttct 3660
agctctacca agaaaaccca gctgcagctc gagcacctgc tgctggattt gcagatgatc 3720
ctgaacggta tcaacaatta caagaacccg aaactgacgc gtatgctgac cttcaagttc 3780
tacatgccga agaaggccac cgaactgaaa cacctgcagt gtctagaaga agaactgaaa 3840
ccgctggagg aagttctgaa cctggctcag tctaaaaact tccacctgcg gccgcgtgac 3900
ctgatctcta acatcaacgt aatcgttctg gaactgaagg gctctgaaac caccttcatg 3960
tgtgaatacg ctgatgagac cgcaaccatc gtagaattcc tgaaccgttg gatcaccttc 4020
tgtcagtcta tcatctctac cctgacctga ggatcccccg ggctgcagga attcgatatc 4080
aagcttatcg ataccgtcga cctcgagggg gggcccggta ccagcttttg ttccctttag 4140
tgagggttaa tttcgagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 4200
tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 4260
gcctaatgag tgagtccccg atccgtcgag ctcgacctgc aggggggggg gggcgctgag 4320
gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca 4380
gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga 4440
ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat 4500
ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt 4560
aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact catcgagcat 4620
caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg 4680
tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta 4740
tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa 4800
aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa 4860
aagcttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa 4920
atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac 4980
gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac 5040
tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc 5100
tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg 5160
cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt 5220
aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt 5280
cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata 5340
cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg 5400
ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt 5460
tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag acacaacgtg 5520
gctttccccc ccccccctgc aggtcgagct cgacggatcg ggctgcagga attcggtgag 5580
gttatggcgg agggttgcga ggtctaggag aacagaggaa gtcatgcttt gaagcatata 5640
agctgccctg cccctcaagg ttttcttcaa gtgaggtttt atctaactgc ctaacggcag 5700
gggaaccgta tattgcttac ggtatgagac cccttaaacg tccggatagt caccgctctt 5760
ctttagctcc gcgacatgcc tagcaaccgt ggcgcgagag actcctacct ctgcccctat 5820
ttcagcccac gtgggaactg tccctgtctg gaaatactga tcgttcacca tttggctaat 5880
acgggacttc gtagatcgtc cttgagcctt tttcttacgg tgcgtctttt caagcttcga 5940
cctttgtgct tgcgcatatt tgccctcggg gtctgttttc cagcgttgtg cggctttttg 6000
tccgcctctg cgtcccatcg tggccaaggc tttccgctcg ctgctggtgg ctttacctgg 6060
tgcgttagag ccgctgtagg tctcgctctt ggattgggcg acatacccgc gcacgcgcct 6120
tgccatggtt tggcggtcgc gcatgggtgg catctcgttg tcgcggcctg caccgccgtg 6180
ggtgtgtgcg acgttgtagg cgtgctcata ggcgtcgatg attgctgcgt ctgtcaggcg 6240
ttggccttgc tggcgcaagc ggtggccagt cttaagcgca tgtctaaagg ctgtttcgtc 6300
gcgtgctgcg gttccttgga caatccagag cacacgcaca ccgtcgataa gttccgggtc 6360
atactggtcg agaccaccgg cgatttccgc gtctacgtcc tg 6402
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 22
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala
20 25
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 23
His His His His His His
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 24
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
wild-type toxO sequence
<400> 25
ttaggatagc tttacctaa 19
<210> 26
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 26
Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
20 25 30
<210> 27
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 27
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val
20 25 30
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 28
Met Gly Ala Asp Asp
1 5
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 29
Gly Ala Asp Asp
1
<210> 30
<211> 526
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 30
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
515 520 525
<210> 31
<211> 1686
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 31
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gctgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120
aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 180
caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 240
accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 300
aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa 360
gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg 420
gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg 480
ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgttgaat atattaataa ctgggaacag 540
gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa 600
gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta 660
ggtagctcat tgtcatgcat caacctggat tgggatgtta tccgtgataa aactaaaact 720
aagatcgaat ctctgaaaga acacggtccg atcaaaaaca aaatgagcga aagcccgaac 780
aaaactgtat ctgaagaaaa agctaaacag tacctggaag aattccacca gactgcactg 840
gaacacccgg aactgtctga acttaagacc gttactggta ccaacccggt attcgctggt 900
gctaactacg ctgcttgggc agtaaacgtt gctcaggtta tcgatagcga aactgctgat 960
aacctggaaa aaactaccgc ggctctgtct atcctgccgg gtatcggtag cgtaatgggc 1020
atcgcagacg gcgccgttca ccacaacact gaagaaatcg ttgcacagtc tatcgctctg 1080
agctctctga tggttgctca ggccatcccg ctggtaggtg aactggttga tatcggtttc 1140
gctgcataca acttcgttga aagcatcatc aacctgttcc aggttgttca caactcttac 1200
aaccgcccgg cttactctcc gggtcacaag acgcatgcac ctacttctag ctctaccaag 1260
aaaacccagc tgcagctcga gcacctgctg ctggatttgc agatgatcct gaacggtatc 1320
aacaattaca agaacccgaa actgacgcgt atgctgacct tcaagttcta catgccgaag 1380
aaggccaccg aactgaaaca cctgcagtgt ctagaagaag aactgaaacc gctggaggaa 1440
gttctgaacc tggctcagtc taaaaacttc cacctgcggc cgcgtgacct gatctctaac 1500
atcaacgtaa tcgttctgga actgaagggc tctgaaacca ccttcatgtg tgaatacgct 1560
gatgagaccg caaccatcgt agaattcctg aaccgttgga tcaccttctg tcagtctatc 1620
atctctaccc tgaccgagaa cctgtacttc cagggccatc accaccacca ccaccatcat 1680
cactag 1686
<210> 32
<211> 250
<212> PRT
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 32
Met Arg Lys Ile Val Thr Leu Ala Ala Ala Ser Leu Leu Gly Ile Ala
1 5 10 15
Gly Thr Ser Gly Val Leu Gly Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Thr Asn
20 25 30
Gly Thr Pro Val Ser Pro Glu Asp Asp Thr Ala Ala Glu Gly Val Val
35 40 45
Gln Val Ala Ser Cys Thr Gly Thr Val Val Ala Ser Gln Trp Val Leu
50 55 60
Thr Ala Gln His Cys Val Glu Val Pro Asn Leu Gln Arg Pro Val Tyr
65 70 75 80
Val Gly Thr Thr Arg Glu Gln Gln Gln Arg Glu Glu Asn Thr Phe Thr
85 90 95
Ser Asp Tyr Ala Val Trp Ala Pro His Gly Asp Val Ala Leu Val His
100 105 110
Val Thr Asp Ala Leu Pro Gln Arg Leu Val Arg Ala Val Arg Arg Ala
115 120 125
Pro Val Ser Phe Gly Glu Gln Gly Arg Val Tyr Gly Trp Gly Ala Gly
130 135 140
Thr Gly Glu Thr Leu Gln Tyr Ala Arg Ala Ala Val Gly Lys Thr Ser
145 150 155 160
Ser Gly Val Arg Pro Gln Gly Asn Gln His Gly Ala Phe Ile Val Gln
165 170 175
Tyr Leu Asp Glu Ala Lys Ala Gly Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
180 185 190
Phe Val Asn Gly Glu Val Ala Gly Val Thr Ser Phe Lys Ala Pro Gln
195 200 205
Gly Gly Gly Arg Phe Ser Leu Phe Ala Ser Leu His Gly Leu Gly Asp
210 215 220
Trp Ile Ala Gln Thr Thr Ala Ala Lys Pro Glu Asn Pro Asn Ser Lys
225 230 235 240
Asn Gln Gln Ser Gln Gln Pro Arg Arg Pro
245 250
<210> 33
<211> 753
<212> DNA
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 33
atgcggaaaa ttgttactct tgctgcagca agcttgctgg gtattgcggg taccagcggt 60
gttcttggtg cggcaacagc caccgcactg acaaatggca cgcccgtctc ccctgaggac 120
gataccgctg ccgaaggcgt ggttcaagtg gctagttgta ctggcaccgt ggttgcttct 180
cagtgggtgc tgaccgccca gcattgcgtc gaggtgccca atttgcagcg gccggtctat 240
gttggcacca cccgcgagca gcaacaacgg gaagaaaata cgttcacctc ggattacgca 300
gtgtgggcac cgcacggcga tgtggcgttg gtgcatgtca ccgatgcgct gccgcagcgt 360
ctggtccgcg cggttcgccg cgcaccggtg agctttggtg agcagggacg cgtgtacggc 420
tggggtgctg gcaccggcga gacgctgcag tatgcccgcg ctgcggttgg taaaacttct 480
tccggagttc ggccgcaggg caaccagcat ggtgcattca tcgtgcagta tttggacgag 540
gctaaagccg ggcgtggcga ttccggcggg ccgctttttg tcaacggtga ggttgctggg 600
gtgacctcgt ttaaggctcc tcaaggtggt gggcgtttct cgctgtttgc ttcgctgcat 660
gggctaggcg attggattgc gcagaccacc gccgccaagc ccgagaaccc gaattccaag 720
aatcaacagt cccagcaacc acgtagaccg tag 753
<210> 34
<211> 1012
<212> DNA
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 34
ggatccgcaa ttgcgggaat cgtcgtgctt tttagccgaa attttcttgc agccagcgct 60
atgcttatcg cctcagggtt agccgctgac atttaccgct tgaggaataa tatgagtgga 120
aatcaacggt aatttcagaa gacttgccta cacctttagc tagcgaccac cattggtggt 180
cgctagcttt ttgatggctt aagggacatt tgggcatccg tgtatcgcac attagtcata 240
caggaaatcc tccaagattt cgtccgcatg cccgaccaga cactacagca cccacatagc 300
ttctcgattg tcttgcggag cgggagtagg tagctcacgt gctaccgcac ggggaaccgt 360
atattgctta tggtgtgccc attacccacc gttggtgcta tgatccgaac ggaaaaagtc 420
agtcgtatta gtgaatcacc gttccgccgc gcgagaacgc agggctccaa caagcgtgtg 480
gttccacaag attgcaagga tgtgtacggt gctggtggcg gtggctccag cctgggtctg 540
tcgtcttctt agcaagtctg cattcacggt tccctaggca atctttgagc aaatccctgt 600
ttaacgcccc tgtacgttcg gcgccgcaga aacctgccgg atcgtgatgt taatcctgcc 660
ttgttccagc ccgcagccgt cgggaagcgt ggcatcattc acgcgcacca ccccgtgata 720
agcaaaacgc ttcggcccac cgaaaaccac caagtcgccg gagcacagag tcacatcgtc 780
ccagggttgg gtgcgtgatt cggtgtgtcc catccgaaac agtgcttcgt cgccaatcga 840
tactgaaatg accggcgccc gcgattcctc aaattcatcg acgtgcatgc ccatcccgga 900
acccggcgga tagtagttga ccagcaccat ctctgtcacg aaggcctcta cccacggggc 960
tagttcttcg gcaacctccg ctgctgcgcg caacgctgcc ggcgccggat cc 1012
<210> 35
<211> 242
<212> PRT
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 35
Met Lys Lys Leu Arg Thr Leu Ala Val Thr Leu Thr Ala Ile Ala Ala
1 5 10 15
Ser Thr Met Ala Thr Met Pro Ala Gln Ala Val Ile Ser Pro Thr Pro
20 25 30
Ser His Gln Val Ser Leu Ala Tyr Val Ser Phe Asp Asn Met Gln Cys
35 40 45
Thr Gly Thr Leu Val Ser Pro Thr Ala Val Leu Thr Ala Arg His Cys
50 55 60
Leu Asn Gly Gly Leu Gly His Val Arg Leu Gly Ala Asp His Phe Thr
65 70 75 80
Ala Val Arg Ala Val Ala His Pro Gln Ala Asp Leu Ala Val Leu His
85 90 95
Leu Asp Arg Pro Ala Pro Ile Ala Pro Ser Ala Ile Ser Gly Arg His
100 105 110
Thr Gln Pro Gly Asn Arg Phe Gly Val Ala Gly Tyr Gly Ser Thr Phe
115 120 125
Thr Gly Ile Pro Met Ala Ala Ala Ala Thr Met Gln Arg Arg Val Thr
130 135 140
Asp Val Pro Ser Pro Asp Arg Gln Ala Val Met Ile Glu Asn His Ile
145 150 155 160
Ser Gln Gly Val Leu Arg Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Leu Glu
165 170 175
Gly Asn His Val Ile Gly Val Leu Ser Met Ser Ser Ala Ser Gly Arg
180 185 190
Val Gly Trp Tyr Ile Pro Thr Ala Glu His Ala Asp Trp Ile Ala Ala
195 200 205
Ala Ala Gly Ile Pro Ala Pro Gly Ser Val Asp Lys Pro Ala Pro Leu
210 215 220
Val Asp Ala Thr Ala Phe Pro Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ala Ser Leu
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 36
<211> 729
<212> DNA
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 36
atgaagaaac ttcgtaccct agccgtaacc ctgaccgcaa tcgcagcatc aaccatggcg 60
accatgccag cacaagcagt gattagtccg acaccgtcac atcaagtttc gctagcgtac 120
gtcagttttg acaacatgca gtgcaccggc acactcgtca gccccaccgc cgtgctcaca 180
gcacgacact gcctcaacgg cggcctcggc cacgtccgac tcggcgccga tcacttcacc 240
gccgtacgtg ccgtggcaca cccccaagca gaccttgccg tcctccacct cgatcgccca 300
gcgccaatag cgccatccgc aatctctgga cgtcacaccc aaccaggtaa ccgcttcgga 360
gttgccggct acggaagcac cttcaccggc atccccatgg cagcagctgc aaccatgcaa 420
cgccgcgtca ccgacgtccc cagccccgac cgccaagcag tcatgatcga aaaccacatc 480
agccaaggtg tactacgccc aggcgactct ggcggccccc tcctagaggg caatcacgtc 540
ataggagtac tcagcatgag cagtgcatcc ggccgcgtcg gctggtacat ccccaccgca 600
gaacacgccg actggatcgc ggcggcagcc ggaatccccg caccgggaag cgtcgacaag 660
cccgctccgc tcgtcgacgc cacagccttc ccgacgcaag agccaagcct cgctagccta 720
tcctcctag 729
<210> 37
<211> 1012
<212> DNA
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 37
ggatccgggc ttatcaccgc agaagacgcc gaaaaagcca tcgatgccac cctcctagcc 60
gtcgacggca tcacacgcca taacgacgac cccatggcat ggctcgccgc tatgggatac 120
ccactaacat gggcaaaaaa catcacgctt aaggaggccg aatgattacc gtctatcaca 180
acccccgctg ctccacctcg cgcaaagcct tggagtacat agaacaacac agcgacgacg 240
aggtgaccat catccgctac ctcgacgccc ctcctagtga acaagagctg cgcactttgc 300
ttgccgacgc ccacctcagc ccgcacgacg caatccgcac caaagaagcc gaatacaaag 360
aactcggact cagctccacc acccccgaat cagagctaat caaggccatg gtcacccacc 420
cacgcctcat tcagcgccca attgtggcaa catgcaaggg aacgcggatc gcccgaccaa 480
ccgaaattct gaaagaaatt ctctagccga atcgccagcg atctcggaag ccaaggaatc 540
cttcggcatg ttaaaaaatg taaaagttta atgcgggcac aaacgcgttg aaagagcaac 600
acaccaccat cgttgaacat acttgattat ttcccacttt ccagaatttt aatgagcatg 660
cccagctcga catcaagaac gcagggaaga tctcactagc aatcgacgat aggcccttct 720
tcgacaaccc ggaacatctt gccacgtacg acggaactac actggcagga tcgtcaatat 780
gtggtgaatt ccctgttaaa gtaggaagaa cagagggtgt cagtccgttt gtgtacgggg 840
actgacaccc tctgttcaaa tgattcatcg aagacggttt cacttttcta gcaaaacagc 900
aagacccgca agatttcata tattggtcaa gcgcagccac aaactatcac tcatagctat 960
gtagccccct attaattcat atctcaaaga gtatccaagc actttgggat cc 1012
<210> 38
<211> 558
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 38
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Met His His His His His His
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys
35 40 45
Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly
50 55 60
Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr
65 70 75 80
Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn
85 90 95
Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser
100 105 110
Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys
115 120 125
Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu
130 135 140
Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu
145 150 155 160
Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu
165 170 175
Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu
180 185 190
Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg
195 200 205
Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys
210 215 220
Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile
225 230 235 240
Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu
245 250 255
Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe
275 280 285
His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val
290 295 300
Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala
305 310 315 320
Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu
325 330 335
Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met
340 345 350
Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala
355 360 365
Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu
370 375 380
Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu
385 390 395 400
Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro
405 410 415
Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr
420 425 430
Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met
435 440 445
Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met
450 455 460
Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His
465 470 475 480
Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn
485 490 495
Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser
500 505 510
Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe
515 520 525
Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn
530 535 540
Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
545 550 555
<210> 39
<211> 533
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 39
Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Asp
1 5 10 15
Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile
35 40 45
Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys
50 55 60
Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val
65 70 75 80
Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val
85 90 95
Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala
100 105 110
Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met
115 120 125
Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala
130 135 140
Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val
145 150 155 160
Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu
165 170 175
Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr
180 185 190
Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val
195 200 205
Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp
210 215 220
Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys
225 230 235 240
Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala
245 250 255
Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu
260 265 270
Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly
275 280 285
Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser
290 295 300
Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu
305 310 315 320
Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His
325 330 335
Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met
340 345 350
Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe
355 360 365
Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val
370 375 380
His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His
385 390 395 400
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
405 410 415
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
435 440 445
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
450 455 460
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
465 470 475 480
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
485 490 495
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
500 505 510
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
515 520 525
Ile Ser Thr Leu Thr
530
<210> 40
<211> 520
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 40
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
515 520
<210> 41
<211> 1677
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 41
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaatgca tcaccaccac caccacgaga acctgtactt ccagggcgct 120
gatgatgttg ctgattcttc taaatctttt gtgatggaaa acttttcttc gtaccacggg 180
actaaacctg gttatgtaga ttccattcaa aaaggtatac aaaagccaaa atctggtaca 240
caaggaaatt atgacgatga ttggaaaggg ttttatagta ccgacaataa atacgacgct 300
gcgggatact ctgtagataa tgaaaacccg ctctctggaa aagctggagg cgtggtcaaa 360
gtgacgtatc caggactgac gaaggttctc gcactaaaag tggataatgc cgaaactatt 420
aagaaagagt taggtttaag tctcactgaa ccgttgatgg agcaagtcgg aacggaagag 480
tttatcaaaa ggttcggtga tggtgcttcg cgtgtagtgc tcagccttcc cttcgctgag 540
gggagttcta gcgttgaata tattaataac tgggaacagg cgaaagcgtt aagcgtagaa 600
cttgagatta attttgaaac ccgtggaaaa cgtggccaag atgcgatgta tgagtatatg 660
gctcaagcct gtgcaggaaa tcgtgtcagg cgatcagtag gtagctcatt gtcatgcatc 720
aacctggatt gggatgttat ccgtgataaa actaaaacta agatcgaatc tctgaaagaa 780
cacggtccga tcaaaaacaa aatgagcgaa agcccgaaca aaactgtatc tgaagaaaaa 840
gctaaacagt acctggaaga attccaccag actgcactgg aacacccgga actgtctgaa 900
cttaagaccg ttactggtac caacccggta ttcgctggtg ctaactacgc tgcttgggca 960
gtaaacgttg ctcaggttat cgatagcgaa actgctgata acctggaaaa aactaccgcg 1020
gctctgtcta tcctgccggg tatcggtagc gtaatgggca tcgcagacgg cgccgttcac 1080
cacaacactg aagaaatcgt tgcacagtct atcgctctga gctctctgat ggttgctcag 1140
gccatcccgc tggtaggtga actggttgat atcggtttcg ctgcatacaa cttcgttgaa 1200
agcatcatca acctgttcca ggttgttcac aactcttaca accgcccggc ttactctccg 1260
ggtcacaaga cgcatgcacc tacttctagc tctaccaaga aaacccagct gcagctcgag 1320
cacctgctgc tggatttgca gatgatcctg aacggtatca acaattacaa gaacccgaaa 1380
ctgacgcgta tgctgacctt caagttctac atgccgaaga aggccaccga actgaaacac 1440
ctgcagtgtc tagaagaaga actgaaaccg ctggaggaag ttctgaacct ggctcagtct 1500
aaaaacttcc acctgcggcc gcgtgacctg atctctaaca tcaacgtaat cgttctggaa 1560
ctgaagggct ctgaaaccac cttcatgtgt gaatacgctg atgagaccgc aaccatcgta 1620
gaattcctga accgttggat caccttctgt cagtctatca tctctaccct gacctga 1677
<210> 42
<211> 551
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 42
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
435 440 445
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
450 455 460
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
465 470 475 480
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
500 505 510
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
515 520 525
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
530 535 540
Thr His His His His His His
545 550
<210> 43
<211> 526
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 43
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr His His His His His His
515 520 525
<210> 44
<211> 1656
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 44
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gctgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120
aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 180
caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 240
accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 300
aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa 360
gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg 420
gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg 480
ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgttgaat atattaataa ctgggaacag 540
gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa 600
gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta 660
ggtagctcat tgtcatgcat caacctggat tgggatgtta tccgtgataa aactaaaact 720
aagatcgaat ctctgaaaga acacggtccg atcaaaaaca aaatgagcga aagcccgaac 780
aaaactgtat ctgaagaaaa agctaaacag tacctggaag aattccacca gactgcactg 840
gaacacccgg aactgtctga acttaagacc gttactggta ccaacccggt attcgctggt 900
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aacctggaaa aaactaccgc ggctctgtct atcctgccgg gtatcggtag cgtaatgggc 1020
atcgcagacg gcgccgttca ccacaacact gaagaaatcg ttgcacagtc tatcgctctg 1080
agctctctga tggttgctca ggccatcccg ctggtaggtg aactggttga tatcggtttc 1140
gctgcataca acttcgttga aagcatcatc aacctgttcc aggttgttca caactcttac 1200
aaccgcccgg cttactctcc gggtcacaag acgcatgcac ctacttctag ctctaccaag 1260
aaaacccagc tgcagctcga gcacctgctg ctggatttgc agatgatcct gaacggtatc 1320
aacaattaca agaacccgaa actgacgcgt atgctgacct tcaagttcta catgccgaag 1380
aaggccaccg aactgaaaca cctgcagtgt ctagaagaag aactgaaacc gctggaggaa 1440
gttctgaacc tggctcagtc taaaaacttc cacctgcggc cgcgtgacct gatctctaac 1500
atcaacgtaa tcgttctgga actgaagggc tctgaaacca ccttcatgtg tgaatacgct 1560
gatgagaccg caaccatcgt agaattcctg aaccgttgga tcaccttctg tcagtctatc 1620
atctctaccc tgacccacca tcaccatcat cactga 1656
<210> 45
<211> 561
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 45
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
435 440 445
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
450 455 460
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
465 470 475 480
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
500 505 510
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
515 520 525
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
530 535 540
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His His His His His
545 550 555 560
His
<210> 46
<211> 536
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 46
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His
515 520 525
His His His His His His His His
530 535
<210> 47
<211> 4679
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 47
ggatcccccg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg ataccgtcga cctcgagggg 60
gggcccggta ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa tttcgagctt ggcgtaatca 120
tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 180
gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagtccccg atccgtcgag 240
ctcgacctgc aggggggggg gggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact 300
cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga 360
gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt 420
ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc 480
aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac 540
caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 600
attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 660
gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 720
aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg 780
agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagcttatgc atttctttcc agacttgttc 840
aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 900
tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 960
aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 1020
atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa 1080
ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 1140
cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 1200
tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga 1260
ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 1320
taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt 1380
actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat 1440
gtaacatcag agattttgag acacaacgtg gctttccccc ccccccctgc aggtcgagct 1500
cgacggatcg ggctgcagga attcggtgag gttatggcgg agggttgcga ggtctaggag 1560
aacagaggaa gtcatgcttt gaagcatata agctgccctg cccctcaagg ttttcttcaa 1620
gtgaggtttt atctaactgc ctaacggcag gggaaccgta tattgcttac ggtatgagac 1680
cccttaaacg tccggatagt caccgctctt ctttagctcc gcgacatgcc tagcaaccgt 1740
ggcgcgagag actcctacct ctgcccctat ttcagcccac gtgggaactg tccctgtctg 1800
gaaatactga tcgttcacca tttggctaat acgggacttc gtagatcgtc cttgagcctt 1860
tttcttacgg tgcgtctttt caagcttcga cctttgtgct tgcgcatatt tgccctcggg 1920
gtctgttttc cagcgttgtg cggctttttg tccgcctctg cgtcccatcg tggccaaggc 1980
tttccgctcg ctgctggtgg ctttacctgg tgcgttagag ccgctgtagg tctcgctctt 2040
ggattgggcg acatacccgc gcacgcgcct tgccatggtt tggcggtcgc gcatgggtgg 2100
catctcgttg tcgcggcctg caccgccgtg ggtgtgtgcg acgttgtagg cgtgctcata 2160
ggcgtcgatg attgctgcgt ctgtcaggcg ttggccttgc tggcgcaagc ggtggccagt 2220
cttaagcgca tgtctaaagg ctgtttcgtc gcgtgctgcg gttccttgga caatccagag 2280
cacacgcaca ccgtcgataa gttccgggtc atactggtcg agaccaccgg cgatttccgc 2340
gtctacgtcc tgggcgagtg ctttgaatgc ttgggcttct tcacggcggg tcttgaccgc 2400
gttgataagt tcgcggccag agctgaattg ctggcgtggg gtggggttga actggtcgtg 2460
tcctgccata tcccttacct gctttatcaa gtctccaagg cgcatcaccc ggttgtgctg 2520
cctataccaa cgataagcgg taggggcttt gcctgtgtag aacgggttgc ggctaaagcg 2580
gtgggaaaag tgcgggtcat ggtctaaaag ctcacccagc acacgcgtgg ttgctgcaag 2640
aagcttcatc tgcgcagatt taccgttacg gtcagcgtag acagggtcaa taagccatat 2700
gaactgggct ttgccgttag ttgggttaat acccacccag gctggcccga cgctatgagt 2760
aatcagtgag cgcaccacgt cgcggacgta cgggtttaag tctgcggggt caccgcctgc 2820
ggtacctact tggtcaacgt ctacgaccag gacggcggcg tactgcttgg tggtgagcat 2880
ggcgtactcg caccgtccta aagcatcagt ctcgaagcga tacatacgcg gcgagttcgt 2940
gccgtcagcg ttgcgtcgat aggccttttt aaagtctcgt gtgactgaac cgtggagtac 3000
atcgcggcct agatgatcgc gtaaaaggtc gcggtcactg gcagatgctg gggtgttgtc 3060
cagtccacca cggtcgcgct cgacgcgggt aggtgtttta gtgtgcgcat tctgcgcatg 3120
agtctgtaaa ctcatgaccg tgctttctcc caggtgtgtg ctgggtgata agcgaaagtc 3180
atcgggttgc cgcccggtgg ctttcttcgt ttttcattgt ctttccctga ctctaaatga 3240
caccggtgtt atttactagc catgacacgc gaaaaatatg ccttttacct gcggttacgt 3300
atggctagac atatggcaag ctatacgtaa ccgcgtttca gctgcacagg gctgtctgcg 3360
cagatttacc atcacgggac ttttcccagt tcaggctgcg catatttacg catacaacga 3420
aagcggttgc gcagatttac cacacactct gcgctgattt accgatacgc agaaaaagcg 3480
tgcgcagatt tacccatacg gtggcgaatt atccagagca ataggtatac agcaatacag 3540
taatacaggt gccataaacc tgtattactg tattgctgta tgcctgtaaa cctttattta 3600
ttgttgtgga cgtattcttc gaggtaggtg ctaacaatct cgcggatggt cacgcctttt 3660
tgggcggcga tgactttaag ttctgcgtga aggtcgcggt cgatttcaat cgtcatcttc 3720
ttgacgtagt cgcggcctgt gggttggtgg aatgcgcttc gcactgtttt cttctcggct 3780
gctggagtta gcttcgtggc ttttttcatt gaggttcgcg ggccttgctg cgccctggcg 3840
cgttctttac tggtgctcat ttcatcatct ccatgagttc gtcggcgacg tggtcgtagc 3900
cgtgcatgtc ggggcctggg cagtatccaa acgctaggtg catatcttcg cgtagcggga 3960
tttcggtttt aaagtgcggc atgtgttccg cgtcgagcgc ttctcgtgcc gcgtcaaggg 4020
cgctggtgcc tttcctggcg aacgtcagta agactgcatg aggtgttccg ttgactgcgt 4080
cgcgcagctc ccatactcgg gagaggtcgg cagcagcaga acgggtcgga agaatgatga 4140
agtcgctgac tgcgattgct gcttcgatag cgttctcgtc tcctggcggc acatcgatac 4200
cgactgggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg 4260
tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga 4320
aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg 4380
ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg 4440
ctacagggcg ctcccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc 4500
gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt 4560
gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat 4620
acgactcact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg cggccgctct agaactagt 4679
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
9xHis tag
<400> 48
His His His His His His His His His
1 5
Claims (39)
- toxP;
유전자 발현의 Fe-매개된 조절을 차단하는 돌연변이체 toxO; 및
단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 발현 벡터로서,
상기 toxP 및 돌연변이체 toxO가 상기 단백질을 코딩하는 DNA 세그먼트(segment)의 발현을 조절하는, DNA 발현 벡터. - 제1항에 있어서, 시그널 펩티드(signal peptide)를 코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함하는, DNA 발현 벡터.
- 제2항에 있어서, 상기 단백질이 시그널 펩티드에 부착되어 있는, DNA 발현 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 돌연변이체 toxO가 서열번호 1인, DNA 발현 벡터.
- 제2항에 있어서, 상기 시그널 펩티드가 서열번호 5인, DNA 발현 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질이 CRM 197, CRM 107 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, DNA 발현 벡터.
- 제6항에 있어서, 상기 단백질이 서열번호 11 및 7 내지 20 중의 어느 하나로부터 선택되는, DNA 발현 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질이, 수용체 결합 단백질 또는 이의 기능적 부분에 부착된, 디프테리아 독소 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, DNA 발현 벡터.
- 제8항에 있어서, 상기 수용체 결합 단백질이 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, EGF, FGF, 물질 P, CD4, αMSH, GRP, TT 단편 C, GCSF, 헤레귤린 β1, 이의 기능적 부분 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, DNA 발현 벡터.
- 제8항에 있어서, 상기 단백질이 서열번호 12 내지 15 중의 어느 하나로부터 선택되는, DNA 발현 벡터.
- a. toxP;
b. 유전자 발현의 Fe-매개된 조절을 차단하는 돌연변이체 toxO; 및
c. i. 시그널 서열;
ii. 디프테리아 수용체 결합 도메인을 포함하지 않거나 비-기능적 디프테리아 독소 수용체 결합 도메인을 갖는 디프테리아 독소 또는 이의 기능적 부분 및
iii. IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, EGF, FGF, 물질 P, CD4, αMSH, GRP, TT 단편 C, GCSF, 헤레귤린 β1, 이의 기능적 부분 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적 수용체 결합 도메인을 포함하는, 단백질을 코딩하는 DNA 서열
을 포함하는 DNA 발현 벡터로서,
상기 toxP 및 돌연변이체 toxO가 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 발현을 조절하는, DNA 발현 벡터. - 제11항에 있어서, 상기 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균이, 시그널 펩티드에 의해 세포주변질, 배양 배지 또는 이들 두 위치로 지향되는 시그널 펩티드에 부착된 디프테리아 독소 수용체 결합 융합 단백질을 생성하는, DNA 발현 벡터.
- 제12항에 있어서, 상기 세균이 이. 콜라이(E. coli)이고, 상기 시그널 펩티드가 디프테리아 독소 수용체 결합 융합 단백질을 세포주변질로 지향시키는, DNA 발현 벡터.
- 제12항에 있어서, 상기 세균이 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)이고, 상기 시그널 펩티드가 디프테리아 독소 수용체 결합 융합 단백질을 배양 배지로 지향시키는, DNA 발현 벡터.
- 제11항에 있어서, 서열번호 3을 포함하는, DNA 발현 벡터.
- 제12항에 있어서, 절단가능한 단백질 태그를 코딩하는 DNA를 추가로 포함하는, DNA 발현 벡터.
- 제12항에 있어서, 상기 절단가능한 단백질 태그가 디프테리아 독소 수용체 결합 융합 단백질에 부착되어 있는, DNA 발현 벡터.
- 제11항에 있어서, 상기 디프테리아 독소 수용체 결합 융합 단백질이 서열번호 12 내지 15 중의 어느 하나로부터 선택되는, DNA 벡터.
- 하기 단계를 포함하는, 응집체-비함유 단량체성 디프테리아 독소 융합 단백질의 제조 방법:
a. 세균을 제1항 내지 제18항의 DNA 발현 벡터로 형질전환시키는 단게;
b. 형질전환체를 형성하는 단계;
c. 상기 형질전환체를 배양 배지에서 배양하여, 배양 배지 중으로 분비되는 단백질의 발현을 가능하게 하는 단계; 및
d. 상기 단백질을 배양 배지로부터 정제하는 단계. - 제19항에 있어서, 상기 세균이 코리네박테리움 디프테리아인, 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 응집체-비함유 단량체성 디프테리아 독소 융합 단백질의 제조 방법:
a. 코리네박테리움 디프테리아 균주를,
i. toxP;
ii. 유전자 발현의 Fe-매개된 조절을 차단하는 돌연변이체 toxO;
a. 시그널 펩티드;
b. 디프테리아 수용체 결합 도메인을 포함하지 않거나 비-기능적 디프테리아 독소 수용체 결합 도메인을 갖는 디프테리아 독소 또는 이의 기능적 부분 및
c. IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, EGF, FGF, 물질 P, CD4, αMSH, GRP, TT 단편 C, GCSF, 헤레귤린 β1, 이의 기능적 부분 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적 수용체 결합 도메인을 포함하는, 단백질을 코딩하는 DNA 서열
을 포함하는 DNA 벡터로 형질전환시키는 단계로서, 상기 toxP 및 돌연변이체 toxO가 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 발현을 조절하는, 단계;
b. 형질전환체를 형성하는 단계;
c. 상기 형질전환체를 배양 배지에서 배양하여, 상기 배양 배지 중으로 분비되는 단백질의 발현을 가능하게 하는 단계; 및
d. 상기 디프테리아 독소 융합 단백질을 상기 배양 배지로부터 정제하는 단계. - 제21항에 있어서, 상기 디프테리아 독소 수용체 융합 단백질이 서열번호 12 내지 15 중의 어느 하나로부터 선택되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 코리네박테리움 디프테리아 균주가 코리네박테리움 C7 베타(-), tox(-)인, 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 결핵 환자의 치료 방법:
a. 제21항에 제공된 디프테리아 독소 융합 단백질을 제조하는 단계;
b. 상기 디프테리아 독소 융합 단백질을 결핵 환자에게 투여하는 단계. - 돌연변이체 toxO 프로모터를 포함하는 DNA 발현 벡터.
- 제1항 내지 제18항의 DNA 발현 벡터를 함유하는 코리네박테리움 디프테리아 균주.
- 하기 단계를 포함하는, 단백질의 제조 방법:
a. toxP, 유전자 발현의 Fe-매개된 조절을 차단하는 돌연변이체 toxO, 시그널 서열, 및 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는, DNA 발현 벡터를 제공하는 단계;
b. 세균 균주를 상기 DNA 벡터로 형질전환시켜 형질전환체를 형성하는 단계;
c. 상기 형질전환체를 배양 배지에서 소정 시간 동안 배양하여, 배양 배지 중으로 분비되는 단백질의 발현을 가능하게 하는 단계; 및
d. 상기 단백질을 배양 배지로부터 정제하는 단계. - 서열번호 12 내지 15 중의 어느 하나로부터 선택된 융합 단백질.
- 제28항의 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제28항의 융합 단백질 및 적어도 하나 이상의 기타 화학요법제를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제30항에 있어서, 상기 기타 화학요법제가 이소니아지드(isoniazid), 리팜핀(rifampin), 리파부틴(rifabutin), 리파펜틴(rifapentine), 피라진아미드(pyrazinamide), 에탐부톨(ethambutol), 스트렙토마이신(streptomycin), 아미카신(amikacin), 카나마이신(kanamycin), 에티온아미드(ethionamide), 프로티온아미드(protionamide), 테리지돈(terizidone), 티아세타존(thiacetazone), 사이클로세린(cycloserine), 카프레오마이신(capreomycin), 파라-아미노살리실산(PAS), 비오마이신(viomycin), 오플록사신(ofloxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 레보플록사신(levofloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 베다퀼린(bedaquiline), 또는 델라마니드(delamanid), 리네졸리드(linezolid), 테데졸리드(tedezolid), 아목실린-클라불란산(amoxicillin-clavulanic acid), 메로페넴(meropenem), 이미페넴(imipenem), 클라리트로마이신(clarithromycin) 또는 클로파지민(clofazimine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
- 제28항의 약제학적 조성물, 및 적어도 하나의 기타 항균제.
- 제33항에 있어서, 상기 항균제가 이소니아지드(isoniazid), 리팜핀(rifampin), 리파부틴(rifabutin), 리파펜틴(rifapentine), 피라진아미드(pyrazinamide), 에탐부톨(ethambutol), 스트렙토마이신(streptomycin), 아미카신(amikacin), 카나마이신(kanamycin), 에티온아미드(ethionamide), 프로티온아미드(protionamide), 테리지돈(terizidone), 티아세타존(thiacetazone), 사이클로세린(cycloserine), 카프레오마이신(capreomycin), 파라-아미노살리실산(PAS), 비오마이신(viomycin), 오플록사신(ofloxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 레보플록사신(levofloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 베다퀼린(bedaquiline), 또는 델라마니드(delamanid), 리네졸리드(linezolid), 테데졸리드(tedezolid), 아목실린-클라불란산(amoxicillin-clavulanic acid), 메로페넴(meropenem), 이미페넴(imipenem), 클라리트로마이신(clarithromycin) 또는 클로파지민(clofazimine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
- 서열번호 12 내지 15 중의 어느 하나로부터 선택된 융합 단백질을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법.
- 서열번호 11 내지 15 중의 어느 하나로부터 선택된 융합 단백질을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 결핵을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항의 DNA 발현 벡터를 포함하는 원핵생물 세포주.
- 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항의 DNA 발현 벡터를 포함하는 키트(kit).
- 서열번호 2를 포함하는 toxP.
- 서열번호 12 내지 15 중의 어느 하나의 단백질.
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