JP2023011857A - 凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質の生成方法及び治療的使用法 - Google Patents

Abstract

【課題】コリネバクテリアや大腸菌等の原核細胞株に適したＤＮＡ発現ベクターと、本ベクターを用いた凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質の生成方法を提供する。【解決手段】ＤＮＡ発現ベクターは、ｔｏｘＰと、Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、タンパク質をコードするＤＮＡ配列とを含み、ｔｏｘＰ及び変異体ｔｏｘＯは、該タンパク質をコードするＤＮＡセグメントの発現を調節する。好ましくは、本発明のＤＮＡ発現ベクターは、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、発現したタンパク質がプロセシングの前にシグナルペプチドに結合するようにする。本発明のＤＮＡ発現ベクターからは新規のタンパク質が生成される。【選択図】なし

Description

関連出願の参照
本出願は、２０１６年３月１０日出願の米国仮特許出願第６２／３０６，２８１号の利益を主張し、当該仮特許出願は、参照によりあらゆる目的において本明細書に完全に記載されているかのように組み込まれる。

電子提出された資料の参照による組込み
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してアスキー形式で提出された配列表を含み、この配列表は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。前述のＡＳＣＩＩコピーは２０１７年３月２日に作成され、名称はＰ１３８６９－０２＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズは１３４，９６６バイトである。

政府所有についての記載
本発明は、国立衛生研究所の認可を受けたＡＩ０３７８５６、ＡＩ０３６９７３、ＡＩ０９７１３８、およびＡＩ０９５３２１の下、政府支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

発明の背景
Ｏｎｔａｋ（登録商標）（デニロイキンジフチトクス）は５２１アミノ酸の、組換え型の、ＤＮＡ由来の細胞傷害性タンパク質であり、ジフテリア毒素断片Ａと断片Ｂの一部分とのアミノ酸配列（Ｍｅｔ_１－Ｈｉｓ_３８８）及びヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２、Ａｌａ_１－Ｔｈｒ_１３３）の配列から構成される。現状、Ｏｎｔａｋは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系で生成され、５８ｋＤの分子量を有する。ネオマイシンが発酵プロセスで使用されるが、最終生成物中では検出不可能である。Ｏｎｔａｋ（登録商標）は、静脈内（ＩＶ）投与を意図した無菌凍結溶液として単回使用バイアルで供給され、１９９９年に皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の処置用としてＦＤＡの認可を受けた。ＦＤＡは２０１１年６月、Ｏｎｔａｋ（登録商標）の最終製剤中に不均一な分子量のタンパク質凝集体、過剰な残留ＤＮＡ、及び過剰な残留界面活性剤が存在する懸念により、Ｏｎｔａｋ（登録商標）の臨床試験を差し止めた。Ｏｎｔａｋ（登録商標）の生産は大腸菌の細胞質内で組換えタンパク質を発現させることによって達成されるが、この発現系によって、組換えタンパク質が、Ｏｎｔａｋ（登録商標）ポリペプチドから構成される高分子量の不溶性の凝集体、いわゆる封入体を形成するという結果につながる。封入体形態の変性及びリフォールディングを伴う現状の生産プロセスでは、最終製剤中に不均一な分子量のタンパク質凝集体が依然存在した。精製形態にこのような凝集体が存在するのは、大腸菌由来の細胞質封入体をポリペプチド供給源として使用した結果であり、また毒素の膜貫通ドメインがＴｗｅｅｎ２０の存在下でも固有の疎水性を有するためでもある。この方法を用いて生成するＯｎｔａｋ（登録商標）を、以下古典的Ｏｎｔａｋ（登録商標）またはｃ－Ｏｎｔａｋ（登録商標）と呼ぶ。

加えて、ｃ－Ｏｎｔａｋ（登録商標）は、全ての細菌毒素及び植物毒素と同様、血管漏出症候群（ＶＬＳ）を誘発するアミノ酸モチーフを保有する。ｃ－Ｏｎｔａｋ（登録商標）による処置を受けた患者のおよそ３０％が、急激な体重増加を伴う末梢性浮腫から低アルブミン血症、肺浮腫に及ぶＶＬＳの症状を示す。必要なものは、１）Ｏｎｔａｋ様タンパク質を高い収量及び純度で生成することを可能にし、最終市販製品における凝集体を除去するプロセス、及び２）患者に安全な薬物を提供するための、ＶＬＳ副作用が最小限の修飾されたＯｎｔａｋ様タンパク質である。

本発明の一実施形態は、ＤＮＡ発現ベクターであって、ｔｏｘＰと、Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、タンパク質をコードするＤＮＡ配列とを含み、ｔｏｘＰ及び変異体ｔｏｘＯが、タンパク質をコードするＤＮＡセグメントの発現を調節する、ＤＮＡ発現ベクターである。好ましくは、本発明のＤＮＡ発現ベクターはシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、ＤＮＡ発現ベクターから発現したタンパク質が、典型的には成熟タンパク質を形成するために切断されるシグナルペプチドに結合するようにする。好ましい変異体ｔｏｘＯは配列番号１であり、好ましいシグナルペプチドは配列番号５である。本発明のＤＮＡ発現ベクターは、多くの種類のタンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７及びＣＲＭ１０７、またはこれらの組合せ）の生成に使用することができる。ＣＲＭタンパク質の配列は、配列番号１８～２１に示されている。好ましくは、本発明のＤＮＡ発現ベクターは、受容体結合タンパク質またはその機能部分に結合しているジフテリア毒素またはその機能部分をコードして、ジフテリア毒素受容体融合タンパク質を形成する。このような融合タンパク質の受容体結合タンパク質部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＥＧＦ、ＦＧＦ、サブスタンスＰ、ＣＤ４、αＭＳＨ、ＧＲＰ、ＴＴ断片Ｃ、ＧＣＳＦ、ヘレグリンβ１、これらの機能部分、またはこれらの組合せを含む群から選択され得る。ジフテリア毒素融合タンパク質の例としては、配列番号１１～１５のいずれか１つに示すタンパク質が挙げられる。

本発明の別の実施形態は、ＤＮＡ発現ベクターであって、ｔｏｘＰと、Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、シグナル配列；ジフテリア受容体結合ドメインを含まない、または機能しないジフテリア毒素受容体結合ドメインを有する、ジフテリア毒素またはその機能部分；ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＥＧＦ、ＦＧＦ、サブスタンスＰ、ＣＤ４、αＭＳＨ、ＧＲＰ、ＴＴ断片Ｃ、ＧＣＳＦ、ヘレグリンβ１、これらの機能部分、またはこれらの組合せを含む群から選択されるターゲット受容体結合ドメイン、を含むタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、を含み、ｔｏｘＰ及び変異体ｔｏｘＯが、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現を調節する、ＤＮＡ発現ベクターである。典型的には、本発明のＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌は、シグナルペプチドに結合しているジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質を生成し、当該シグナルペプチドにより、ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質はペリプラズム、培地、または両方の位置に向けられている。細菌が大腸菌である場合、典型的には、シグナルペプチドはジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質をペリプラズムに向ける。細菌がコリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）である場合、シグナルペプチドはジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質を培地に向ける。好ましくは、本発明のＤＮＡ発現ベクターは配列番号３を含み、また切断可能なタンパク質タグをコードするＤＮＡを含んでもよく、当該切断可能なタンパク質タグは、ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質に結合している。本発明のＤＮＡ発現ベクターから生成されるジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質の例としては、配列番号１１～１５のいずれか１つが挙げられる。

本発明の別の実施形態は、凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質を生成する方法であって、以下のステップ：細菌を本発明のＤＮＡ発現ベクターにより形質転換すること；形質転換体を形成すること；形質転換体を培地内でインキュベートして培地内に分泌されるタンパク質の発現を可能にすること；及び培地からタンパク質を精製すること、を含む方法を含む。この方法で使用する好ましい細菌は、コリネバクテリウム・ジフテリエである。

本発明の別の実施形態は、凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質を生成する方法であって、以下のステップ：１）コリネバクテリウム・ジフテリエ株をＤＮＡベクターにより形質転換することであって、前記ＤＮＡベクターが、ｔｏｘＰと；Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと；タンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、前記タンパク質が、シグナルペプチド；ジフテリア受容体結合ドメインを含まない、または機能しないジフテリア毒素受容体結合ドメインを有する、ジフテリア毒素またはその機能部分；及びＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＥＧＦ、ＦＧＦ、サブスタンスＰ、ＣＤ４、αＭＳＨ、ＧＲＰ、ＴＴ断片Ｃ、ＧＣＳＦ、ヘレグリンβ１、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、これらの機能断片、またはこれらの組合せを含む群から選択されるターゲット受容体結合ドメインを含む、ＤＮＡ配列とを含み、ｔｏｘＰ及び変異体ｔｏｘＯが、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現を調節する、形質転換すること；２）形質転換体を形成すること；３）形質転換体を培地内でインキュベートして、培地内に分泌されるタンパク質の発現を可能にすること；ならびに４）培地からジフテリア毒素融合タンパク質を精製すること、を含む方法を含む。本発明の方法によって生成されるジフテリア毒素受容体融合タンパク質の例としては、配列番号１１～１５のいずれか１つが挙げられる。本発明の方法で使用する好ましいコリネバクテリウム・ジフテリエ株は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ） Ｃ７ベータ（－）、ｔｏｘ（－）である。

本発明の別の実施形態は、結核患者を処置する方法であって、以下のステップ：本出願で提供されるジフテリア毒素融合タンパク質を調製すること；ジフテリア毒素融合タンパク質を結核患者に投与すること、を含む方法を含む。

本発明の別の実施形態は、変異体ｔｏｘＯプロモーターを含むＤＮＡ発現ベクターを含む。

本発明の別の実施形態は、本発明のＤＮＡ発現ベクターを含有するコリネバクテリウム・ジフテリエ株を含む。

本発明の別の実施形態は、タンパク質を作製する方法であって、以下のステップ：ｔｏｘＰと、Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、シグナル配列と、タンパク質をコードするＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ発現ベクターを提供すること；細菌株をＤＮＡベクターにより形質転換して形質転換体を形成すること；形質転換体を培地内である期間の間インキュベートして、培地内に分泌されるタンパク質の発現を可能にすること；及び培地からタンパク質を精製すること、を含む方法である。

本発明の別の実施形態は、配列番号１１～１５のいずれか１つから選択される融合タンパク質である。

本発明の別の実施形態は、上述の融合タンパク質を含む医薬組成物である。

本発明の別の実施形態は、上述の融合タンパク質と、少なくとも１種以上の他の化学療法剤とを含む医薬組成物である。化学療法剤の例としては、イソニアジド、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、エチオナミド、プロチオナミド、テリジドン、チアセタゾン、シクロセリン、カプレオマイシン、パラ－アミノサリチル酸（ＰＡＳ）、ビオマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ベダキリン、またはデラマニド、リネゾリド、テデゾリド、アモキシシリン・クラブラン酸、メロペネム、イミペネム、クラリスロマイシン、またはクロファジミンが挙げられる。

上述の融合タンパク質と、少なくとも１種以上の他の抗微生物剤とを含む、医薬組成物。抗微生物剤の例としては、イソニアジド、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、エチオナミド、プロチオナミド、テリジドン、チアセタゾン、シクロセリン、カプレオマイシン、パラ－アミノサリチル酸（ＰＡＳ）、ビオマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ベダキリン、またはデラマニド、リネゾリド、テデゾリド、アモキシシリン・クラブラン酸、メロペネム、イミペネム、クラリスロマイシン、またはクロファジミンが挙げられる。

本発明の別の実施形態は、対象におけるがんを処置または予防する方法であって、対象に、有効量の、配列番号１１～１５のいずれか１つから選択される融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む方法である。

本発明の別の実施形態は、対象における結核を処置または予防する方法であって、対象に、有効量の、配列番号１１～１５のいずれか１つから選択される融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む方法である。

本発明の別の実施形態は、本発明のＤＮＡ発現ベクターを含む原核細胞株である。

本発明の別の実施形態は、本発明のＤＮＡ発現ベクターを含むキットである。

本発明の別の実施形態は、配列番号２を含むｔｏｘＰである。

本発明の別の実施形態は、配列番号１１～１５のいずれか１つのタンパク質である。
[本発明1001]
ＤＮＡ発現ベクターであって、
ａ． ｔｏｘＰと、
ｂ． Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、
ｃ． タンパク質をコードするＤＮＡ配列と
を含み、
前記ｔｏｘＰ及び前記変異体ｔｏｘＯが、前記タンパク質をコードするＤＮＡセグメントの発現を調節する、前記ＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1002]
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列をさらに含む、本発明1001のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1003]
前記タンパク質が前記シグナルペプチドに結合している、本発明1002のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1004]
前記変異体ｔｏｘＯが配列番号1である、本発明1001のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1005]
前記シグナルペプチドが配列番号5である、本発明1002のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1006]
前記タンパク質が、ＣＲＭ197、ＣＲＭ107、またはこれらの組合せからなる群から選択される、本発明1001のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1007]
前記タンパク質が、配列番号11、7～20のいずれか1つから選択される、本発明1006のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1008]
前記タンパク質が、受容体結合タンパク質またはその機能部分に結合しているジフテリア毒素またはその機能部分を含む、本発明1001のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1009]
前記受容体結合タンパク質が、ＩＬ－2、ＩＬ－3、ＩＬ－4、ＩＬ－6、ＩＬ－7、ＩＬ－15、ＥＧＦ、ＦＧＦ、サブスタンスＰ、ＣＤ4、αＭＳＨ、ＧＲＰ、ＴＴ断片Ｃ、ＧＣＳＦ、ヘレグリンβ1、これらの機能部分、またはこれらの組合せを含む群から選択される、本発明1008のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1010]
前記タンパク質が、配列番号12～15のいずれか1つから選択される、本発明1008のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1011]
ＤＮＡ発現ベクターであって、
ａ． ｔｏｘＰと、
ｂ． Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、
ｃ． タンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、前記タンパク質が、
ｉ． シグナル配列、
ｉｉ． ジフテリア受容体結合ドメインを含まない、または機能しないジフテリア毒素受容体結合ドメインを有する、ジフテリア毒素またはその機能部分、及び
ｉｉｉ． ＩＬ－2、ＩＬ－3、ＩＬ－4、ＩＬ－6、ＩＬ－7、ＩＬ－15、ＥＧＦ、ＦＧＦ、サブスタンスＰ、ＣＤ4、αＭＳＨ、ＧＲＰ、ＴＴ断片Ｃ、ＧＣＳＦ、ヘレグリンβ1、これらの機能部分、またはこれらの組合せを含む群から選択されるターゲット受容体結合ドメイン
を含む、前記ＤＮＡ配列と
を含み、
前記ｔｏｘＰ及び前記変異体ｔｏｘＯが、前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列の発現を調節する、前記ＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1012]
前記ＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌が、シグナルペプチドに結合しているジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質を生成し、前記シグナルペプチドにより、前記ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質がペリプラズム、培地、または両方の位置に向けられる、本発明1011のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1013]
前記細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、前記シグナルペプチドが前記ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質を前記ペリプラズムに向ける、本発明1012のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1014]
前記細菌がコリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）であり、前記シグナルペプチドが前記ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質を前記培地に向ける、本発明1012のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1015]
配列番号3を含む、本発明1011のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1016]
切断可能なタンパク質タグをコードするＤＮＡをさらに含む、本発明1012のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1017]
前記切断可能なタンパク質タグが前記ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質に結合している、本発明1012のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1018]
前記ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質が、配列番号12～15のいずれか1つから選択される、本発明1011のＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1019]
凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質を生成するための方法であって、以下のステップ：
ａ． 細菌を、本発明1001～1018のベクターのＤＮＡ発現により形質転換すること、
ｂ． 形質転換体を形成すること、
ｃ． 前記形質転換体を培地内でインキュベートして、前記培地内に分泌されるタンパク質の発現を可能にすること、及び
ｄ． 前記培地から前記タンパク質を精製すること
を含む、前記方法。
[本発明1020]
前記細菌がコリネバクテリウム・ジフテリエである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質を生成するための方法であって、以下のステップ：
ａ． コリネバクテリウム・ジフテリエ株をＤＮＡベクターにより形質転換することであって、前記ＤＮＡベクターが、
ｉ． ｔｏｘＰと、
ｉｉ． Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、
ｉｉｉ． タンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、前記タンパク質が、
ａ． シグナルペプチド、
ｂ． ジフテリア受容体結合ドメインを含まない、または機能しないジフテリア毒素受容体結合ドメインを有する、ジフテリア毒素またはその機能部分、及び
ｃ． ＩＬ－2、ＩＬ－3、ＩＬ－4、ＩＬ－6、ＩＬ－7、ＩＬ－15、ＥＧＦ、ＦＧＦ、サブスタンスＰ、ＣＤ4、αＭＳＨ、ＧＲＰ、ＴＴ断片Ｃ、ＧＣＳＦ、ヘレグリンβ1、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、これらの機能断片、またはこれらの組合せを含む群から選択されるターゲット受容体結合ドメイン
を含む、前記ＤＮＡ配列と
を含み、前記ｔｏｘＰ及び前記変異体ｔｏｘＯが、前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列の発現を調節する、前記形質転換すること、
ｂ． 形質転換体を形成すること、
ｃ． 前記形質転換体を培地内でインキュベートして、前記培地内に分泌される前記タンパク質の発現を可能にすること、ならびに
ｄ． 前記培地から前記ジフテリア毒素融合タンパク質を精製すること
を含む、前記方法。
[本発明1022]
前記ジフテリア毒素受容体融合タンパク質が、配列番号12～15のいずれか1つから選択される、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記コリネバクテリウム・ジフテリエ株がコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ） Ｃ7ベータ（－）、ｔｏｘ（－）である、本発明1021の方法。
[本発明1024]
結核患者を処置する方法であって、以下のステップ：
ａ． 本発明1021に示されるようにジフテリア毒素融合タンパク質を調製すること、
ｂ． 前記ジフテリア毒素融合タンパク質を結核患者に投与すること
を含む、前記方法。
[本発明1025]
変異体ｔｏｘＯプロモーターを含む、ＤＮＡ発現ベクター。
[本発明1026]
本発明1001～1018のＤＮＡ発現ベクターを含有する、コリネバクテリウム・ジフテリエ株。
[本発明1027]
タンパク質を作製する方法であって、以下のステップ：
ａ． ｔｏｘＰと、Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、シグナル配列と、タンパク質をコードするＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ発現ベクターを提供すること、
ｂ． 細菌株を前記ＤＮＡベクターにより形質転換して、形質転換体を形成すること、
ｃ． 前記形質転換体を培地内である期間の間インキュベートして、前記培地内に分泌されるタンパク質の発現を可能にすること、及び
ｄ． 前記培地から前記タンパク質を精製すること
を含む、前記方法。
[本発明1028]
配列番号12～15のいずれか1つから選択される、融合タンパク質。
[本発明1029]
本発明1028の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
[本発明1030]
本発明1028の融合タンパク質と、少なくとも1種以上の他の化学療法剤とを含む、医薬組成物。
[本発明1031]
前記他の化学療法剤が、イソニアジド、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、エチオナミド、プロチオナミド、テリジドン、チアセタゾン、シクロセリン、カプレオマイシン、パラ－アミノサリチル酸（ＰＡＳ）、ビオマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ベダキリン、またはデラマニド、リネゾリド、テデゾリド、アモキシシリン・クラブラン酸、メロペネム、イミペネム、クラリスロマイシン、またはクロファジミンからなる群から選択される、本発明1030の医薬組成物。
[本発明1032]
本発明1028の医薬組成物及び少なくとも1種以上の他の抗微生物剤。
[本発明1033]
前記抗微生物剤が、イソニアジド、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、エチオナミド、プロチオナミド、テリジドン、チアセタゾン、シクロセリン、カプレオマイシン、パラ－アミノサリチル酸（ＰＡＳ）、ビオマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ベダキリン、またはデラマニド、リネゾリド、テデゾリド、アモキシシリン・クラブラン酸、メロペネム、イミペネム、クラリスロマイシン、またはクロファジミンからなる群から選択される、本発明1033の医薬組成物。
[本発明1034]
対象におけるがんを処置または予防する方法であって、前記対象に、有効量の、配列番号12～15のいずれか1つから選択される融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1035]
対象における結核を処置または予防する方法であって、前記対象に、有効量の、配列番号11～15のいずれか1つから選択される融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1036]
本発明1001～1018のいずれかのＤＮＡ発現ベクターを含む、原核細胞株。
[本発明1037]
本発明1001～1018のいずれかのＤＮＡ発現ベクターを含む、キット。
[本発明1038]
配列番号2を含むｔｏｘＰ。
[本発明1039]
配列番号12～15のいずれか1つのタンパク質。

図１ａ～１ｂは以下のことを示している：ａ）本発明の変異体ｔｏｘＯ（配列番号１）、ｂ）野生型ｔｏｘＯ（配列番号２５）。 図２ａ～２ｂは以下のことを示している：ａ）Ｏｎｔａｋ（登録商標）の製造に使用される古典的デニロイキンジフチトクス（ｃ－デニロイキンジフチトクス）発現ベクターを示している、ｂ）ｔｏｘプロモーター（ｔｏｘＰ）と、本発明の変異体ｔｏｘＯとを含む分泌デニロイキンジフチトクス（ｓ－デニロイキンジフチトクス）発現ベクターを示している。図２ａは配列番号２６を開示し、図２ｂは配列番号２７を開示している。 血管漏出変異体（ＶＬＭ）を示している。これはｃ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭと呼ばれ、ＩＬ－２受容体保有細胞の殺滅においてｃ－デニロイキンジフチトクスと同等の効力を有する。 ｉｎ ｖｉｔｒｏで血管漏出を生じないｃ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭを示している。 マウス生存モデルを用いたときに、ｃ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭがｃ－Ｏｎｔａｋ（登録商標）よりも顕著に少ない急性毒性をｉｎ ｖｉｖｏで有することを示している。 本発明におけるジフテリア毒素ベース融合タンパク質毒素プラットフォーム技術を示している。 ｃ－デニロイキンジフチトクスのＤＮＡ配列（ＤＮＡ配列番号６）に結合したｔｏｘプロモーター（配列番号２のｔｏｘＰ）及び変異体ｔｏｘオペレーター（ｔｏｘＯ）（ＤＮＡ配列番号１）、シグナルペプチド（ＤＮＡ配列番号４）を有するプラスミドｐＫＮ２．６Ｚ－ＬＣ１２７を示している。 図８ａ～８ｂは以下のことを示している：ａ）大腸菌内の細胞質封入体としてのＯｎｔａｋ（登録商標）の従来の製造プロセスにおける問題、ｂ）Ｏｎｔａｋ（登録商標）タンパク質より１つアミノ酸が少ない分泌デニロイキンジフチトクスを生成するための容易かつクリーンな製造プロセスを示している。図８ａは配列番号２８としての「ｆＭＧＡＤＤ」を開示し、図８ｂは配列番号２９としての「ＧＡＤＤ」を開示している。 本発明のプロセスによって調製されたｓ－デニロイキンジフチトクスの免疫ブロットを示しており、ｓ－デニロイキンジフチトクスはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｃ７ベータ（－）、ｔｏｘ（－）株内で発現し、培地内に分泌されている。 本発明のデニロイキンジフチトクスが結核性肉芽腫内のＩＬ－２Ｒ（ＣＤ２５＋）保有Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）を枯渇させることが予想される方法を示している。Ｔ_ｒｅｇは、Ｔ_ｅｆｆ細胞を阻害することにより免疫抑制的である。 結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を有する対象（マウス）のｉｎ ｖｉｖｏ処置で使用されるジフテリア融合タンパク質を示している。 ジフテリア毒素ベース融合タンパク質によって結核菌に感染した対象（マウス）を処置した結果を示している。 結核菌に感染した対象（マウス）を処置するためのジフテリア毒素ベース融合タンパク質のレジメンを示している。 悪性黒色腫を有する対象（ヒト）を処置するためのジフテリア毒素ベース融合タンパク質の用法を示している。 Ｈｉｓ（ヒスチジンタグ）を用いてＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋ及び関連するタンパク質を迅速に生成するための３つのコンストラクトを示している（「Ｈｉｓ_６／６ｘ Ｈｉｓ」及び「Ｈｉｓ_９／９ｘ Ｈｉｓ」はそれぞれ配列番号２３及び４８として開示されている）。 Ｃ末端側Ｈｉｓ_６ ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋコンストラクトを用いて生成した純度が９７％超の精製されたＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋを示している（「Ｈｉｓ_６」は配列番号２３として開示されている）。

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語の全てが、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。以下の文献は、本発明で使用する用語の多くについての一般的定義を当業者に提供するものである：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書において以下の用語は、別段の指定がない限り、これらの用語に認められる以下の意味を有する。

「活性」という用語は、遺伝子が自らの機能を実行する能力、例えば、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（オキシドレダクターゼの１種）が必須アミノ酸トリプトファン（ｔｒｐ）のＮ－ホルミル－キヌレニンへの分解を触媒する能力を指す。

「作用物質」とは、任意の低分子化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはこれらの断片を意味する。

「緩和する」とは、疾患の発症または進行を減少させる、抑制する、減弱する、減じる、抑止する、または安定化することを意味する。

「改変」とは、標準的な技術分野の公知の方法（例えば、本明細書に記載の方法）によって検出される、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性における変化（増加または減少）を意味する。本明細書において、改変は、発現レベルにおける１０％の変化、好ましくは２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、最も好ましくは発現レベルにおける５０％またはそれ以上の変化を含む。

「類似体」とは、同一ではないが、類似の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然ポリペプチドの生物学的活性を保持する一方で、類似体の機能を天然ポリペプチドよりも強化する一定の生化学的修飾を有する。このような生化学的修飾は、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を、例えばリガンド結合を改変せずに、増加することができると考えられる。類似体は、非天然アミノ酸を含んでもよい。

ｃ－は、ある用語と結びついたときに「古典的」であることを意味し、例えばｃ－デニロイキンジフチトクスは、Ｏｎｔａｋ（登録商標）または当該市販タンパク質を意味する。

「疾患」とは、細胞、組織、または臓器の正常な機能を損傷または妨害する任意の状態または障害を意味する。疾患の例としては、がん及び結核が挙げられる。

「有効量」とは、未処置の患者との比較で疾患の症状を緩和するのに要する量を意味する。疾患の治療処置のために本発明の実施に使用する活性化合物（複数可）における有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、及び全体的健康状態に応じて変動する。最終的には、主治医または獣医師が適切な量及び投与レジメンを決定することになる。このような量は「有効」量と呼ばれる。

「発現する」という用語は、遺伝子が遺伝子産物（例えば、遺伝子の対応ｍＲＮＡまたはタンパク質配列（複数可）を含む）を発現する能力を指す。

「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含有する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。

ｉｓ－とは、ある用語と結びついたときに「未成熟分泌」であることを意味し、例えばｉｓ－デニロイキンジフチトクスは、シグナルペプチドを含有する未成熟分泌デニロイキンジフチトクスを意味する。

ｍｓ－とは、ある用語と結びついたときに「成熟分泌」であることを意味し、例えばｍｓ－デニロイキンジフチトクスは、プロセシング済みでシグナルペプチドをもはや含有しない成熟分泌デニロイキンジフチトクスを意味する。

ｎ－とは、ある用語と結びついたときに「新規」であることを意味し、例えばｎ－デニロイキンジフチトクスは、新規のデニロイキンジフチトクスを意味する。

本明細書において「予防する」「予防する（こと）」「予防」「予防的処置」などという用語は、ある障害または状態を有していないがそれを発生する危険がある、またはそれを発生しやすい対象において、障害または状態が生じる可能性を低減することを指す。

「ポリペプチド」「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、天然アミノ酸ポリマーに適用されるだけでなく、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の類似体または模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。ポリペプチドは、例えば炭水化物残基の付加によって修飾して、糖タンパク質を形成することができる。「ポリペプチド」「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、糖タンパク質も非糖タンパク質も含む。

「低減する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の負の改変を意味する。

「参照」とは、基準または対照条件、例えば、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列またはその融合タンパク質を含む本発明の１種以上の組成物のような作用物質を含まないかまたは実質的に含まない試料（ヒト細胞）または対象を指す。

「参照配列」とは、配列比較の基礎として使用される定義された配列のことである。参照配列は、指定の配列のサブセットまたは全体とすることができ、例えば、全長のｃＤＮＡまたは遺伝子配列の１セグメント、あるいは完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列とすることができる。ポリペプチドに関しては、概して参照ポリペプチド配列の長さは、少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、さらにより好ましくは約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、または約１００アミノ酸になると考えられる。核酸に関しては、概して参照核酸配列の長さは、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、さらにより好ましくは約１００ヌクレオチドまたは約３００ヌクレオチド、あるいはこれらの前後の整数またはこれらの間の整数になると考えられる。

ｓ－とは、ある用語と結びついたときに「分泌される」ことを意味し、例えばｓ－デニロイキンジフチトクスは、分泌されたデニロイキンジフチトクスを意味する。分泌されたデニロイキンジフチトクスには、ｉｓ－形態及びｍ－形態が含まれる。

本明細書において「対象」という用語は、本明細書に記載の方法を実施する任意の個体または患者を指すように意図されている。概して対象とはヒトのことであるが、当業者が認識することになるように、対象が動物である場合もある。したがって、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む）、及び霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、及びゴリラを含む）のような哺乳類を含む他の動物は、対象の定義内に含まれる。

「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか１つ）に対し、少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、アミノ酸レベルまたは核酸において、比較に用いる配列に対し少なくとも６０％、より好ましくは８０％または８５％、より好ましくは９０％、９５％、またはさらに９９％同一である。

典型的には、配列同一性は、配列解析ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）の配列解析ソフトウェアパッケージ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定される。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び／または他の修飾に相同性の程度を割り当てることにより、同一または類似の配列をマッチさせる。典型的には、保存的置換は以下の基内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチではＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ^－３からｅ^－１００の間の確率スコアは密接に関連した配列を示す。

本明細書で示される範囲は、範囲内の全ての値の省略表現と理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数字、数字の組合せ、またはサブ範囲を含むものと理解される。

本明細書において「処置する」「処置する（こと）」「処置」などという用語は、障害及び／または障害に付随する症状を低減または緩和することを指す。排除するものではないが、障害または状態の処置は、障害、状態、またはこれらに付随する症状の完全な除去を必要としないことを理解されたい。

特に明記されていないまたは文脈から明白でない限り、本明細書において「または」という用語は包括的であるものと理解される。特に明記されていないまたは文脈から明白でない限り、本明細書において「一つの（ａ）」「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語は単数または複数であるものと理解される。

特に明記されていないまたは文脈から明白でない限り、本明細書において「約」という用語は、当技術分野で正常な許容範囲内、例えば平均の２標準偏差以内であるものと理解される。約は、記載値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解され得る。文脈から別のことが明らかでない限り、本明細書で示される全ての数値は、約という用語によって修飾される。

本明細書では、ある変数の何らかの定義で化学基の一覧を挙げる場合、挙げた基のうちの任意の単一の基または組合せとしての当該変数の定義も含まれる。本明細書では、ある変数または態様についての実施形態を挙げる場合、任意の単一の実施形態または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せとしての当該実施形態も含まれる。

本明細書で示される任意の組成物または方法は、本明細書で示される他の組成物及び方法のいずれか１つ以上と組み合わせてもよい。

ＶＬＭ－とは、ある用語と結びついたときに「血管漏出変異体」を意味し、例えばデニロイキンジフチトクス－ＶＬＭは、デニロイキンジフチトクスの血管漏出変異体を意味する。

ｗ－とは、ある用語と結びついたときに「野生型」を意味し、例えばｗ－ジフテリア毒素は、野生型ジフテリア毒素を意味する。

本発明の詳細な説明
本発明の一実施形態は、純度及び品質が高められた、凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質を生成するプロセスの発見である。このプロセスは、好ましくはコリネバクテリウム・ジフテリエ株を含む細菌を、本発明のＤＮＡ発現ベクターにより形質転換することを含む。本発明のＤＮＡ発現ベクターは特定の遺伝子要素を含むように設計されており、当該遺伝子要素は、ｔｏｘプロモーター（ｔｏｘＰ）と、重複する新規の変異したｔｏｘオペレーター（ｔｏｘＯ）、好ましくはシグナル配列と、タンパク質をコードするＤＮＡ配列とを含む。当該タンパク質は、好ましくは、ジフテリア毒素またはその機能部分と、ターゲット受容体結合ドメインまたはその機能部分とを含む、融合タンパク質である。「その機能部分」という用語は、毒素として作用するジフテリア毒素タンパク質の一部分、または受容体に結合するターゲット受容体結合ドメインの一部分を意味する。本発明のＤＮＡ発現ベクターは、タンパク質がｔｏｘプロモーター（ｔｏｘＰ）及び変異体ｔｏｘオペレーター（ｔｏｘＯ）から発現するように設計されている。

変異体ｔｏｘＯ
ｔｏｘＯは、中央のシトシン（Ｃ）塩基によって中断された９ｂｐの不完全なパリンドローム構造のアーム２つから構成されている１９ｂｐのオペレーター領域である。野生型ｔｏｘＯ（図１ｂ）及び発明者らが発見した変異体ｔｏｘＯ（図１ａ）オペレーターが図１に示されている。配列番号１は、本発明の変異体ｔｏｘＯのＤＮＡ配列における一実施形態を示している。ｔｏｘＰは、配列番号２のＤＮＡ配列を有するプロモーターである。配列番号２は、ｔｏｘＯ ＤＮＡ配列を含むｔｏｘＰ ＤＮＡ配列を示している。配列番号３は、ｔｏｘＰと、ｔｏｘ０と、シグナルペプチドと、タンパク質をコードするＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ配列である。配列番号３内のアスタリスクは、変異体ｔｏｘＯを創出するために導入された変化を示す。
配列番号１（変異体ｔｏｘＯ ＤＮＡ配列）

配列番号２（変異体ｔｏｘＯ ＤＮＡ配列を含むｔｏｘＰ；変異体ｔｏｘＯ配列は下線部）

ｔｏｘＯ ＤＮＡオペレーター配列には、ジフテリア毒素受容体として知られるタンパク質ＤｔｘＲが結合する。ＤｔｘＲは、全般的な鉄によって活性化される調節タンパク質であり、遺伝子発現を制御することができる。鉄豊富条件では、Ｆｅ^２＋及びＦｅ^３＋イオンがアポ－ＤｔｘＲに結合して立体構造の変化がもたらされ、この変化によって、ｔｏｘオペレーター（ｔｏｘＯ）ＤＮＡ配列に結合しｔｏｘ遺伝子発現を抑制するＤｔｘＲリプレッサーのホモ二量体の形成が可能になる。鉄が不十分な環境では、Ｆｅ^２＋及びＦｅ^３＋イオンがＤｔｘＲから解離することでＤｔｘＲのＤＮＡ結合能が喪失し、オペレーターからも解離する。そのため、この事象によってｔｏｘ遺伝子産物の発現が可能になる。図１ｂは、野生型ｔｏｘＯ ＤＮＡ配列を示している。

Ｆｅ^２＋及びＦｅ^３＋イオンがｔｏｘ発現に及ぼす阻害効果を克服するため、野生型（ＷＴ）ｔｏｘＯを変異体ｔｏｘＯ ＤＮＡ配列で置き換えるＤＮＡ発現ベクターを創出した。この変化は、Ｆｅイオンが媒介するｔｏｘ遺伝発現調節をブロックする。図１ａの配列番号１及び配列番号３は、本発明における変異体ｔｏｘＯのＤＮＡ配列を示している。本発明において、ｔｏｘＰ及び変異体ｔｏｘＯの制御下でジフテリア毒素融合タンパク質をコードする組換えプラスミドを有する大腸菌及びＣ．ジフテリエ（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）のような細菌は、Ｆｅ豊富培地で成長することができ、高密度に至るまで増殖することができ、発現を誘導するのにＦｅフリーの培地に切り替える必要がない。鉄豊富培地内でのｔｏｘ遺伝子産物の構成的発現は、当技術分野において顕著な進歩に相当するものである。Ｃ．ジフテリエ、具体的にはＣ７ベータ（－）、ｔｏｘ（－）株は、本発明のＤＮＡ発現ベクターを用いた全てのジフテリア毒素関連組換えタンパク質の生成に好ましい宿主細菌である。本発明のＤＮＡ発現ベクターは、大腸菌のような他の細菌で使用することもできる。

ＤＮＡ発現ベクター
本発明のＤＮＡ発現ベクターは、ｔｏｘＰ、変異体ｔｏｘＯ、タンパク質をコードするＤＮＡ配列、及び好ましくはシグナル配列を含む。配列番号３は、本発明のＤＮＡ発現ベクターの一部になり得るこれらの遺伝子要素を含有するＤＮＡ配列の一例である。言及したように、配列番号３に見られるアスタリスクは、変異体と野生型ｔｏｘＯとの間の塩基対変化の上方に置かれている。配列番号３は、ｔｏｘＰが塩基１から３０に及び、ｔｏｘＯが塩基２４から開始して塩基４２（下線が引かれたＤＮＡ配列より前）で終了するように番号付けされている。下線が引かれたＤＮＡ配列は塩基７４から塩基１４８に該当し、２５アミノ酸のシグナル配列をコードするＤＮＡ領域である（配列番号４、配列番号５、及び図２にも見られる）。本発明のＤＮＡ発現ベクターは、好ましくは、１種以上のタンパク質がｔｏｘＰ、変異体ｔｏｘＯから発現し、Ｎ末端側シグナル配列により翻訳されるように構築される。Ｎ末端側シグナル配列は、（当該ベクターから発現する）当該１種以上のタンパク質を分泌のターゲットとし、Ｎ末端側シグナルペプチドはその後切断されて、成熟した活性タンパク質をもたらす。配列番号３は、分泌デニロイキンジフチトクス、またはｓ－デニロイキンジフチトクスと呼ばれる新規のデニロイキンジフチトクスのようなタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。ｓ－デニロイキンジフチトクスは、未成熟分泌デニロイキンジフチトクス（ｉｓ－デニロイキンジフチトクス）及び成熟分泌デニロイキンジフチトクス（ｍｓ－デニロイキンジフチトクス）と呼ばれる２つの形態を有する。配列番号１２は本発明のｉｓ－デニロイキンジフチトクスのものであり、配列番号１３は本発明のｍｓ－デニロイキンジフチトクスのものである。ｉｓ－デニロイキンジフチトクスは、ｍｓ－デニロイキンジフチトクス形成のためにプロセシング中に切断されるシグナル配列を含有する。加えて、配列番号３は、タンパク質、具体的にはジフテリア毒素の機能部分及びＩＬ２の機能部分を含有する融合タンパク質をコードする、配列番号の塩基１４９から開始し１７１１までのＤＮＡ配列を含む。新規のデニロイキンジフチトクス融合タンパク質の配列はｍｓ－デニロイキンジフチトクスと呼ばれるものに形成され、これは５２０アミノ酸のポリペプチドであり、ジフテリア毒素断片Ａと断片Ｂの一部分とのアミノ酸配列（Ｇｌｙ_１－Ｈｉｓ_３８７）及びヒトインターロイキン－２（ＩＬ２、Ａｌａ_１－Ｔｈｒ_１３３）の配列から構成される。シグナル配列が切断された結果として、本発明のｍｓ－デニロイキンジフチトクスは古典的デニロイキンジフチトクス（ｃ－デニロイキンジフチトクス）に存在する最初のメチオニンを欠いているため、Ｏｎｔａｋ（登録商標）として知られる古典的デニロイキンジフチトクスタンパク質のアミノ酸配列よりも１アミノ酸短い。配列番号１３は、新規のジフチトクスタンパク質配列のｍｓ－デニロイキンジフチトクスのタンパク質配列であり、Ｏｎｔａｋ（登録商標）として知られる古典的デニロイキンジフチトクス（ｃ－デニロイキンジフチトクス）のタンパク質配列を含有する配列番号１０と比較することができる。

本発明のＤＮＡ発現ベクターは、１種以上のタンパク質（複数可）をコードするＤＮＡ配列を含む。本発明における好ましいタンパク質は、ジフテリア毒素（またはその機能部分）と、ターゲット受容体結合タンパク質（またはその機能部分）とを含む、融合タンパク質である。ＤＮＡ発現から生成され得るジフテリア毒素の一例は、ジフテリア毒素の任意の機能部分またはジフテリア毒素血管漏出変異体の任意の機能部分である。本発明のＤＮＡ発現ベクターから生成されるターゲット受容体結合ドメインのタンパク質の例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＥＧＦ、ＦＧＦ、サブスタンスＰ、ＣＤ４、αＭＳＨ、ＧＲＰ、ＴＴ断片Ｃ、ＧＣＳＦ、ヘレグリンβ１、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、またはこれらの組合せが挙げられる。治療用途に応じて他のターゲット受容体結合ドメインを使用してもよいが、ＩＬ２受容体結合ドメインの機能部分をコードする好ましいＤＮＡ配列は配列番号９である。本発明の目的のため、一部のＤＮＡプラスミド及びその遺伝子要素が図１、図２、図６、及び図７に示されている。本発明のＤＮＡ発現ベクターによってコードされる融合タンパク質の例としては、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１９、及び２１が挙げられる。

配列番号３（分泌デニロイキンジフチトクス、すなわちｓ－デニロイキンジフチトクスをコードするＤＮＡ配列。配列は、ｔｏｘＰ、変異体ｔｏｘＯ、シグナル配列、ジフテリア毒素の機能部分、及びＩＬ２の機能部分を含む。太字及びアスタリスクは、変異体ｔｏｘＯを創出するために導入された変化を示す。）

配列番号４（シグナルＤＮＡ配列）

配列番号５（シグナルタンパク質配列）

配列番号６（古典的デニロイキンジフチトクスＤＮＡ配列）

血管漏出が最小限の、または血管漏出が無いジフテリア毒素融合タンパク質（デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭ）の形成
全ての細菌毒素及び植物毒素と同様に、デニロイキンジフチトクスは、血管漏出症候群（ＶＬＳ）を誘発し得るアミノ酸モチーフを保有する。Ｏｎｔａｋ（登録商標）による処置を受けた患者のおよそ３０％が、末梢性浮腫を伴う急激な体重増加から低アルブミン血症、肺浮腫に及ぶＶＬＳを示した。米国特許第８，８６５，８６６号に記載のように、Ｏｎｔａｋ（登録商標）のＤＮＡ配列に対する変異が施された。ＤＮＡ配列に対し、配列番号１０の７番目の残基におけるバリン（ＧＴＴ）が配列番号１６に示されるようにアラニンで置き換えられるＤＮＡ変異を施すことで、血管漏出症候群の副作用がわずかな、または無い融合毒素がもたらされることが発見された。このような変異体は「血管漏出変異体」（ＶＬＭ）と呼ばれる。血管漏出変異体、すなわちデニロイキンジフチトクス－ＶＬＭは、ｃ－デニロイキンジフチトクスと同じ効力を有し（図３）、血管漏出を生じず（図４）、ｉｎ ｖｉｖｏの急性毒性がｃ－デニロイキンジフチトクスよりも顕著に少ない（図５）ことが示されている。ｓ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭは６番目の残基のバリンを置き換えるアラニンを有し、これは配列番号１４及び１５に示されている。ｓ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭタンパク質は、ｃ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭタンパク質で見いだされたことと同様に毒性を減少させるはずである。

また、配列番号１０（ｃ－デニロイキンジフチトクスのアミノ酸配列）に示される配列Ｖ_２９Ｄ_３０Ｓ_３１及びＩ_２９０Ｄ_２９１Ｓ_２９２も、変異させるとＶＬＳを低減すると考えられる。この発見における主張は、Ｖ_２９Ｄ_３０Ｓ_３１及び／またはＩ_２９０Ｄ_２９１Ｓ_２９２、例えばＶ２９ＡまたはＩ２９０Ａにおける置換の導入がジフテリア毒素融合タンパク質の対応する位置に導入され得ること、そしてこれらの置換が血管漏出症候群をさらに低減するという価値も有することである。

配列番号７（デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭ、下線が引かれているコドンはアラニン（ここではＧＣＴとして示されている）をコードする（米国特許第８，８６５，８６６号に記載）。）

配列番号７［米国特許第８，８６５，８６６号に記載のデニロイキンジフチトクス－ＶＬＭ］を配列番号８［本発明のｉｓ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭ］と比較するＤＮＡ配列アラインメントから、配列番号８のライン１３８１～１４３７でコドン（３塩基）が欠落していることが示されている。
類似性：１５６３／１６３８（９５．４２％）

配列番号９（デニロイキンジフチトクスのＤＮＡ配列のＩＬ－２部分）

本発明のＤＮＡ発現ベクターを用いて生成されるタンパク質
成熟した活性ジフテリア毒素に関連する本発明の融合タンパク質における最初のアミノ酸は、配列番号１３及び１５において太字で示されるグリシン（アミノ酸１）である。配列番号４内にあるシグナル配列は、成熟融合タンパク質の１番目のグリシンから逆に数えて負数で表示され、以下のアミノ酸配列

を有する。シグナル配列は配列番号１１及び１２に示され、下線が引かれている。成熟分泌ジフテリア毒素融合タンパク質は、ジフテリア毒素部分（例えば、Ｇｌｙ_１－Ｈｉｓ_３８７）、及びターゲット受容体結合ドメイン（例えば、配列番号３におけるＡｌａ_３８８－Ｔｈｒ_５２０からのＩＬ－２タンパク質）を含む。ジフテリア毒素タンパク質（またはその機能部分）に融合することができる、本発明で使用される他のターゲット受容体結合ドメインとしては、中でも、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＥＧＦ、ＦＧＦ、サブスタンスＰ、ＣＤ４、αＭＳＨ、ＧＲＰ、ＴＴ断片Ｃ、ＧＣＳＦ、ヘレグリンβ１、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、またはこれらの組合せが挙げられる。配列番号１０は、分泌されず、大腸菌内の封入体からの精製を要するｃ－デニロイキンジフチトクスを説明するものである。配列番号１２は、シグナル配列を有する未成熟分泌ｉｓ－デニロイキンジフチトクスを説明するものである。配列番号１３は、細胞外空間への分泌プロセス中にシグナル配列が切断されたＭＳ－デニロイキンジフチトクスを説明するものである。

配列番号１０（Ｏｎｔａｋ（登録商標）として知られるｃ－デニロイキンジフチトクスのタンパク質配列）

配列番号１１（ｗ－ジフテリア毒素）

配列番号１２（ｉｓ－デニロイキンジフチトクス）

配列番号１３（ｍｓ－デニロイキンジフチトクス）

配列番号１４（ｉｓ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭのタンパク質配列）

配列番号１５（ｍｓ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭのタンパク質配列）

配列番号１６（米国特許第８，８６５，８６６号に記載のデニロイキンジフチトクス－ＶＬＭのタンパク質配列）

配列番号１６のタンパク質アラインメントは、米国特許第８，８６５，８６６号に記載のデニロイキンジフチトクス－ＶＬＭであり、これは、本発明の配列番号１４のｉｓ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭと比較すると、位置４４５に余分なアミノ酸（Ｌ）を有する
類似性：５２１／５２２（９９．８１％）

タンパク質を製造するためのＤＮＡ発現ベクターの使用
上述のジフテリア毒素に関連するタンパク質のＦｅ非依存的分泌発現を用いた方法は、ｓ－デニロイキンジフチトクスを発現する方法の使用に加えていくつかの商業的用途を有する。当該方法は、以下の発現（収率）を改善する（向上させる）ために使用することができる。

ＷＴジフテリア毒素：
野生型ジフテリア毒素（配列番号１１）は、ＤＴＰ、ＴＤａＰ、及び他のワクチンの組合せに存在するジフテリアワクチンであるジフテリアトキソイドの作製に使用するが、これを本発明のＤＮＡ発現ベクターを用いて作製することができる。配列番号１１をコードするＤＮＡセグメントを、本発明のＤＮＡ発現ベクター内に配置し、ＴｏｘＰ／変異体ＴｏｘＯの下流に位置付けてもよい。

交差反応材料－１９７（ＣＲＭ１９７）及び交差反応材料－１０７（ＣＲＭ１０７）：
ＣＲＭ１９７及びＣＲ１０７は全長ジフテリア毒素の変異体タンパク質であり、これらは高い免疫原性を有するが、毒素活性を完全に欠いている。これらはいくつかの多糖結合型ワクチンの担体として使用されている。例えば、Ｗｙｅｔｈ及びＰｆｉｚｅｒは１９９０年代にこの免疫原性を利用し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の７つの多糖体をＣＲＭ１９７に結合させて最初のプレブナーワクチンを創出し、２０００年２月にＦＤＡ承認を受けた。１３多糖体プレブナーは２０１０年にＦＤＡ承認を受けた。髄膜炎菌ワクチンのメンベオ（Ｍｅｎｖｅｏ）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ製）は、４つのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ多糖体にＣＲＭ１９７を加えたものである。このワクチンは２０１０年にＦＤＡ承認を得た。がん免疫療法の企業Ｉｍｕｇｅｎｅ（ＡＳＸ：ＩＭＵ）は、ＣＲＭ１９７を担体タンパク質として使用すると、ＨＥＲ２をターゲットとするＢ細胞ペプチドがん免疫療法からの抗体力価が劇的に改善すると報告した。ＣＲＭ１９７は、潜在的な薬物送達タンパク質としての評価も行われている。スイスを本拠地とするＴｕｒｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、最大１，０００アミノ酸長の治療用タンパク質とのＣＲＭ１９７融合コンストラクトについて取り組んでいる。本発明のＤＮＡ発現ベクターは、ＣＲＭ１９７及びＣＲＭ１０７の生成に使用することができる。配列番号１８～２１をコードする１つ以上のＤＮＡセグメント（複数可）を、本発明のＤＮＡ発現ベクター内に配置し、ＴｏｘＰ／変異体ＴｏｘＯの下流に位置付けてもよい。

精製向上に用いる切断可能なペプチドタグまたはタンパク質タグを有するジフテリア毒素ベース融合タンパク質
切断可能なペプチドタグ（例えば、Ｈｉｓ_６（配列番号２３）またはＦＬＡＧ［ＤＹＫＤＤＤＤＫ］（配列番号２４））またはタンパク質タグ（例えばＧＳＴ［グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ］またはＳＵＭＯ［低分子ユビキチン様修飾因子タンパク質］）は、特定のプロテアーゼ切断部位を用いてジフテリア毒素ベース融合タンパク質と融合させることができる。タグに結合する抗体またはリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィー法が、タグ化タンパク質の高速精製に使用され得る。精製の後、特定の切断部位により、タグを所望のジフテリア毒素関連タンパク質から分離することが可能になる。このような融合によって、本発明のジフテリア毒素ベース融合タンパク質の精製を向上させることができる。
配列番号１７（ｍｓ－ＣＲＭ１９７のタンパク質配列）

配列番号１８（ｉｓ－ＣＲＭ１９７のタンパク質配列）

配列番号１９（ｍｓ－ＣＲＭ１０７のタンパク質配列）

配列番号２０（ｉｓ－ＣＲＭ１０７のタンパク質配列）

（表１）

Ｈｉｓタグ化バージョンのポリペプチドを用いたＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋの精製
コリネバクテリウム・ジフテリエ Ｃ７内で生成された一部のＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋ調製物では、成熟５２０アミノ酸ポリペプチドにおけるタンパク質切断の遅延が生じる。これは、おそらくはコリネバクテリウム・ジフテリエ Ｃ７がもたらす分泌プロテアーゼに起因するものである。このタンパク質切断は、成熟５２０アミノ酸ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋのおよそアミノ酸３９０で生じる。

培養液の上清中に存在する分泌プロテアーゼを避けて所望タンパク質の精製を促進する目的で、ヒスチジンタグ化（Ｈｉｓ－タグ化）バージョンのＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋを構築した。タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）核封入体－ａエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２２．４４）識別部位も、このようなＨｉｓタグ化バージョンのＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋに遺伝子操作で組み込んだ。ＴＥＶ切断部位の目的は、ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋの最終調製物内のポリＨｉｓ配列を除去できるようにするためである。ＴＥＶは、アミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱ＼Ｘを識別する高度に特異的なエンドペプチダーゼである（「＼」は、切断されたペプチド結合を示し、Ｘは、任意の低分子の疎水性アミノ酸または極性アミノ酸（例えば、グリシン（Ｇ））を表す）。

ＴＥＶ切断部位を有するＮ末端側Ｈｉｓタグ化ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋ。配列番号３８（ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋに対するＮ末端側Ｈｉｓタグのタンパク質配列）に示されるように、Ｎ末端付近にあるＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋの未成熟タンパク質配列にアミノ配列ＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱを付加することが可能である。このバージョンでは、配列ＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱは、２６アミノ酸のシグナル配列の直後かつＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋの成熟配列（ＧＡＤＤＶＡ．．．）の直前に出現する。ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋの最初のグリシンは、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｘ（Ｘは任意の低分子アミノ酸である）を識別するＴＥＶプロテアーゼ用の最終的識別残基を含む。このＮ末端側Ｈｉｓタグ化ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋにおける成熟分泌タンパク質配列は、配列番号３９（シグナル配列切断後のＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋに対するＮ末端側Ｈｉｓタグのタンパク質配列）に示されているが、これはＨｉｓ_６タグによるニッケルカラムアフィニティー精製に良好な候補である。アフィニティー精製されたＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋは、次に少量の純粋なＴＥＶプロテアーゼの曝露を受けて酵素的タンパク質分解に至ることができ、この酵素的タンパク質分解で１３個のＮ末端残基ＭＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱが除去され、配列番号４０（シグナル配列切断及びＴＥＶ部位切断の後のＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋに対するＮ末端側Ｈｉｓタグのタンパク質配列）に示される成熟したタグなしのＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋが放出される。

コリネバクテリウム・ジフテリエ Ｃ７の分泌プロテアーゼ（複数可）がおよそアミノ酸３９０で切断するため、Ｎ末端側のＨｉｓタグ化によって２つの種：全長の所望ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋ（５２０アミノ酸）及び３９０アミノ酸のＮ末端側分解断片がもたらされ得る。この２つのポリペプチドは、比較的サイズが近く（さらに分子組成も近い）、サイズ排除クロマトグラフィーによる分離が困難である。したがって、発明者らはＣ末端側Ｈｉｓタグ化バージョンのＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋも開発した。

ＴＥＶ切断部位を有しないＣ末端側Ｈｉｓタグ化ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋ。配列番号４２（ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋに対するＣ末端側Ｈｉｓタグのタンパク質配列）に示されるように、ＶＬＭ ｓ－ＯｎｔａｋのＣ末端にある未成熟タンパク質配列にアミノ配列ＨＨＨＨＨＨを付加することが可能である。このバージョンでは、配列ＨＨＨＨＨＨは、ＶＬＭ ｓ－ＯｎｔａｋのＣ末端側スレオニン（．．．．ＩＩＳＴＬＴ）の直後に出現する。このＣ末端側Ｈｉｓタグ化ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋにおける成熟分泌タンパク質配列は、配列番号４３（シグナル配列切断後のＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋに対するＣ末端側Ｈｉｓタグのタンパク質配列）に示されており、これはＨｉｓ_６タグによるニッケルカラムアフィニティー精製に良好な候補となる。

ＴＥＶ切断部位を有するＣ末端側Ｈｉｓタグ化ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋ。Ｃ末端側Ｈｉｓタグ化がもたらす上記バージョンのＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋの最終ポリペプチド配列（配列番号４３）内にＨｉｓ_６配列がないようにするため、Ｈｉｓタグ配列を除去できるようにＣ末端にＴＥＶ識別配列を挿入することが可能である。このバージョンでは、配列ＥＮＬＹＦＱＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨは、ＶＬＭ ｓ－ＯｎｔａｋのＣ末端側スレオニン（．．．．ＩＩＳＴＬＴ）の直後に出現する。ニッケルアフィニティー結合は６アミノ酸よりさらに長いポリＨｉｓ配列によって増強されるため、９個のＨｉｓ残基を含むことが可能である。このＴＥＶ切断部位を有するＣ末端側Ｈｉｓタグ化ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋのアミノ酸配列は、配列番号４５（ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋに対するＣ末端側ＴＥＶ Ｈｉｓ９タグのタンパク質配列）に示されている。このＴＥＶ切断部位を有するＣ末端側Ｈｉｓタグ化ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋにおける成熟分泌タンパク質配列は、配列番号４６（シグナル配列切断後のＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋに対するＣ末端側ＴＥＶ Ｈｉｓ９タグのタンパク質配列）に示されており、これはＨｉｓ_９タグによるニッケルカラムアフィニティー精製に良好な候補となる。アフィニティー精製されたＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋは、次に少量の純粋なＴＥＶプロテアーゼの曝露を受けて酵素的タンパク質分解に至ることができ、この酵素的タンパク質分解で１０個のＣ末端残基ＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨが除去され、配列番号３０に示される成熟したタグなしのＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋが放出される。注目すべきことに、このバージョンの精製されたＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋ（配列番号３０）は、ＴＥＶプロテアーゼ識別配列の６つの追加的アミノ酸（ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋの通常のＣ末端スレオニン（．．．．ＩＩＳＴＬＴ）に融合したＥＮＬＹＦＱ）を含有するため、長さが５２０アミノ酸（配列番号１５）ではなく５２６アミノ酸である。ＴＥＶ切断部位を有するこのバージョンのＣ末端側Ｈｉｓタグ化ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋ（配列番号３０）の最終結果は、Ｃ末端配列．．．．ＩＩＳＴＬＴＥＮＬＹＦＱである。

Ｈｉｓタグ及びＴＥＶプロテアーゼ部位を含むＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋの製造方法。上記のＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋにおける３つのＨｉｓタグバージョン（ＴＥＶプロテアーゼ部位を有するＮ末端側Ｈｉｓ_６タグ、ＴＥＶプロテアーゼ部位を有しないＣ末端側Ｈｉｓ_６タグ、及びＴＥＶプロテアーゼ部位を有するＣ末端側Ｈｉｓ_９タグ）は、ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋの製造方法におけるＨｉｓタグ／ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーの使用方法例である。コリネバクテリウム・ジフテリエ Ｃ７からの分泌プロテアーゼが培地上清中に存在することにより、所望生成物の顕著な損失を防ぐため、ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋを培地上清中の他のタンパク質から迅速に切り離して精製することが重要となる。Ｈｉｓタグ及びＴＥＶプロテアーゼ部位を含めることが顕著な改善となり、また迅速で合理的なＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋの製造プロセスを可能にし得る。

ＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋの製造を改善するための、主要分泌プロテアーゼを欠いたコリネバクテリウム・ジフテリエ Ｃ７の産生。コリネバクテリウム・ジフテリエ Ｃ７のゲノム配列から、２つの分泌プロテアーゼが明らかになった。プロテアーゼ１はＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０１４３１８５９２．１（配列番号３２、３３）であり、プロテアーゼ２はＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０１４３１８８９８．１（配列番号３５、３６）である。これらのプロテアーゼは、Ｔｏｎ－Ｔｈａｔ及びＳｃｈｅｅｗｉｎｄの方法（Ｔｏｎ－Ｔｈａｔ Ｈ，Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ Ｏ．Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｐｉｌｉ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３ Ｎｏｖ；５０（４）：１４２９－３８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１４６２２４２７）を用いて遺伝子的に欠失させることができ、またＡｌｌｅｎ及びＳｃｈｍｉｔｔの方法（Ａｌｌｅｎ ＣＥ，Ｓｃｈｍｉｔｔ ＭＰ．ＨｔａＡ ｉｓ ａｎ ｉｒｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｈｅｍｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｅ ｉｒｏｎ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００９ Ａｐｒ；１９１（８）：２６３８－４８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１９２０１８０５）でも可能である。プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２をノックアウトするためのアレル交換基質は、それぞれ配列番号３４及び配列番号３７に示されている。これらの配列は、ｓａｃＢカウンターセレクション（Ｓｃｈａｆｅｒ Ａ，Ｔａｕｃｈ Ａ，Ｊａｇｅｒ Ｗ，Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ Ｊ，Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ Ｇ，Ｐｕｈｌｅｒ Ａ（１９９４）Ｓｍａｌｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ ｍｕｌｔｉ－ｐｕｒｐｏｓｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｐＫ１８ ａｎｄ ｐＫ１９：ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔｕｍｉｃｕｍ．Ｇｅｎｅ １４５：６９－７３．ＰＭＩＤ：８０４５４２６）を用いて接合性交配プラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入すると、各プロテアーゼをノックアウトするコンストラクトをもたらす。プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２の両方を欠いた組換えコリネバクテリウム・ジフテリエ株は、この後のＶＬＭ ｓ－Ｏｎｔａｋを産生する製造方法にとって有益な生成株になる。

ジフテリア毒素ベース融合タンパク質のタンパク質製造プロセス
当該ＤＮＡプラスミド及び本発明の発現ベクターを使用することで、従来のＯｎｔａｋ（登録商標）製造方法に付随する問題を除去する新規のプロセスが発見された。現状、Ｏｎｔａｋ（登録商標）は大腸菌発現系内でＤＮＡベクターを用いて発現させている。ｃ－デニロイキンジフチトクス、すなわちＯｎｔａｋ（登録商標）は、５２１アミノ酸長であり５８ｋＤの分子量を有する。従来のＯｎｔａｋ（登録商標）製造プロセスでは、最終製剤中に不均一な分子量のＯｎｔａｋ（登録商標）の凝集体、残留ＤＮＡ、及び過剰な残留界面活性剤が形成され、２０１１年６月にＦＤＡによって古典的Ｏｎｔａｋ（登録商標）の臨床試験が差し止められる結果となった。図８ａに見られるように、Ｏｎｔａｋ（登録商標）は大腸菌内でプラスミドから発現させ、封入体形態として知られる不溶性の細胞質性Ｏｎｔａｋ（登録商標）（タンパク質）蓄積物がもたらされる。本発明のプロセスを使用して、図８ｂではセルフリー上清中での細胞外成熟分泌タンパク質としてのｓ－デニロイキンジフチトクスの発現が示されているが、これは容易に精製することができ、図９に示されるようにさらに高いタンパク質収率をもたらす。図９は、全体のタンパク質に対するクーマシーブルー染色と、抗ＩＬ－２で探索した本発明のプロセスを用いて産生したｓ－デニロイキンジフチトクスの抗ＩＬ－２免疫ブロットとの両方を示している。

本発明における新規のプロセスは、１）細菌、好ましくはコリネバクテリウム・ジフテリエ株を、本発明のＤＮＡ発現ベクターにより形質転換すること、２）形質転換体を形成すること、３）形質転換体を培地内である期間の間インキュベートして、タンパク質（例えば、ジフテリア毒素ベース融合タンパク質や、典型的にはシグナルペプチドを含有するＣＲＭ）の増殖及び発現を可能にすること、４）（タンパク質に結合しているシグナルペプチドによる）培地内へのタンパク質の分泌、ならびに８）培地からジフテリア毒素ベース融合タンパク質を精製すること、を含む。当該ＤＮＡ発現ベクターは、少なくとも１種のタンパク質（例えばジフテリア毒素融合タンパク質、ＣＲＭタンパク質、または本発明のシグナルペプチドに結合し得る他のタンパク質）の発現を調節するＴｏｘＰ及び変異体ＴｏｘＯを含む。

本発明のジフテリア毒素ベース融合タンパク質の治療用途
Ｏｎｔａｋ（登録商標）の臨床有効性は、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、ステロイド抵抗性移植片対宿主病、メトトレキサート抵抗性乾癬、及びメトトレキサート抵抗性関節リウマチで実証されている。また、図１４に示されるように、悪性黒色腫及び卵巣癌でも臨床有効性が実証されている。本発明の方法によって生成される本発明のジフテリア毒素ベース融合タンパク質（ｓ－デニロイキンジフチトクス、ｍｓ－デニロイキンジフチトクス、ｉｓ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭ、ｍｓ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭを含む）は、疾患の処置または予防の臨床有効性に関して、市販されているＯｎｔａｋ（登録商標）と同様に、またはそれよりも良好に機能する。

結核の処置
図１０に示されるように、本発明の発明者らは、本発明のジフテリア毒素融合タンパク質が結核に対し活性を有するであろうと考えている。デニロイキンジフチトクスは、制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞を含めたＩＬ－２受容体（ＣＤ２５＋）保有細胞を枯渇させることが知られている。Ｔ_ｒｅｇ細胞はＣＤ２５及びＦｏｘＰ３を発現し、これらがＴエフェクター（Ｔ_ｅｆｆ）細胞を阻害することによって免疫抑制的である。ＣＤ４＋ Ｔヘルパー（Ｔ_ｈ）細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）のようなＴ_ｅｆｆ細胞は、結核菌細菌病原体を包むために結核性肉芽腫内で必要とされる。結核感染中、病原体を包むために肉芽腫と呼ばれる細胞病変が形成されるが、当該桿菌を完全に根絶することはできない。肉芽腫に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が動員されることでエフェクターＴ細胞機能の抑制につながり、これが潜在的に結核菌の残存及び増殖に許容的な環境をもたらす一助となる。本発明のジフテリア毒素融合タンパク質は、ＴＢ感染中のＴｒｅｇ細胞による免疫抑制を緩和する目的で、ＩＬ－２受容体を発現するＴｒｅｇを枯渇させるために使用する。図１１は、結核菌を有する対象（マウス）のｉｎ ｖｉｖｏ処置で使用されるジフテリア融合タンパク質を示している。マウスをエアロゾル感染（０日目に約２．８ｌｏｇ_１０ ＣＦＵカウントの初期注入を肺内にもたらす）によってＭ．ｔｂ．株Ｈ３７Ｒｖに感染させた。マウス群に対し、１回の処置サイクル（１回、感染から２週間後に投与）または２回の処置サイクル（２回、感染の約３日前及び感染から２週間後に投与）として、７５０ｎｇのｃ－Ｏｎｔａｋ（登録商標）により腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）で処置した。デニロイキンジフチトクスの処置サイクルは、３５ｍｇ／ｋｇ（典型的なマウスに対し７５０ｎｇ）を２回、２日間隔で投与するものとして定義される。強制経口投与によるＲＨＺの連日処置を２週間時に開始した。Ｒとはリファンピンのことであり、マウスに１０ｍｇ／ｋｇ投与した。Ｈとはイソニアジドのことであり、マウスに１０ｍｇ／ｋｇ投与した。Ｚとはピラジナミドのことであり、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇ投与した。本研究の結果を図１２及び１３に示す。

がんの処置
Ｔｒｅｇは抗がん免疫を阻害することも示されており、腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞の増大は概して患者の予後不良と相関する。黒色腫患者にデニロイキンジフチトクス処置を行った結果、Ｔｒｅｇが一時的に枯渇し、全体的な生存期間中央値が１年増加した。本発明のｓ－デニロイキンジフチトクス及びｓ－デニロイキンジフチトクス－ＶＬＭは、がん免疫療法として、Ｔｒｅｇが重度に浸潤した腫瘍を有する患者においてＴｒｅｇを枯渇させるために使用されるであろう。

刊行物、特許出願、及び特許を含めて、本明細書で引用されている全ての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれその全体が本明細書に記載されているということが個別にかつ詳細に示されている場合と同じ程度で、参照により組み込まれる。

本明細書において、「一つの（ａ）」及び「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語、ならびに本発明を説明する文脈における（特に、以下の請求項の文脈における）同様の指示語は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「有する」「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する」という用語は、別段の記載がない限り、制限のない用語（すなわち、「以下に限定されないが～を含む」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で別段の指示がない限り、単に範囲内の各々の別々の値を個別に言及する省略方法として機能するように意図されており、各々の別々の値は、本明細書で個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の順で実施することができる。任意かつ全ての例、または例示のための言葉（例えば、「～のような」）は、単に本発明を十分に明らかにする意図で使用されており、別段の特許請求がない限り本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中のいずれの文言も、任意の特許請求されていない要素に対し本発明の実施に必須であるとして示すものと解釈されるべきではない。

発明を実施するための最良の形態を含めて、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。好ましい実施形態の変形形態は、先述の説明を読めば当業者には明らかになり得るものである。発明者らは、当業者がこのような変形形態を適宜用いることを予想しており、また発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されているものとは別のやり方で実施されることを意図している。したがって本発明は、適用法令の許容に応じて、本明細書に付属の請求項で挙げられる主題における全ての変更及び等価物を含む。さらに、全ての可能な変形形態において本発明の記載要素の任意の組合せは、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、本明細書に含まれる。

本開示の実施形態は、がん及び結核のような障害を処置及び／または予防するための方法及び／または組成物であって、対象が、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む本発明の組成物を投与される、方法及び／または組成物に関係する。

がん及び／または結核のような疾患を有するか、このような疾患を有する疑いがあるか、またはこのような疾患を有するリスクがあることが知られている個体は、有効量の、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む本発明の組成物を投与され得る。がんまたは結核のリスクがある個体は、例えば、１つ以上の遺伝的要因を有する個体であるか、高齢であるか、かつ／または家族歴を有する可能性がある。

本開示の特定の実施形態では、個体は、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む本発明の組成物に加えて、がん及び／または結核療法のための作用物質を投与される。このような追加的療法としては、例えば化学療法または抗微生物剤が挙げられ得る。併用療法が、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む本発明の組成物と共に用いられる場合、追加的療法は、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む本発明の組成物より前、それと同時、及び／またはその後に投与され得る。

医薬調製物
本発明の医薬組成物は、有効量の、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む１種以上の本発明の組成物を、医薬的に許容される担体中で溶解または分散した状態で含む。「医薬的または薬理学的に許容される」という表現は、必要に応じて動物、例えばヒトに投与したときに、有害反応、アレルギー反応または他の不利な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む少なくとも１種の本発明の組成物、あるいは追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１^ｓｔ Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に組み込まれる）に例示されるように、本開示に照らして当業者に知られることになる。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与に関しては、調製物は、ＦＤＡのＯｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓが求めている無菌性、発熱原性、一般的安全性及び純度の基準を満たすべきであることが理解されることになる。

本明細書において「医薬的に許容される担体」には、当業者に知られているであろうあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば、抗微生物剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存料、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、このような材料及びこれらの組合せが含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照）。任意の従来的な担体は、活性成分に不適合である場合を除いて、医薬組成物での使用が想定されている。

配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む本発明の１種以上の組成物は、固体、液体、またはエアロゾル形態で投与するか、そして注射のような投与経路用に無菌である必要があるかに応じて、異なるタイプの担体を含んでもよい。本発明の組成物は、静脈内に、皮内に、経皮的に、くも膜下腔内に、動脈内に、腹腔内に、鼻内に、膣内に、直腸内に、局所的に、筋肉内に、皮下に、粘膜に、経口的に、局所的に、局部的に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、持続的注入、ターゲット細胞を直接浸す局在化灌流、カテーテル経由で、洗浄経由で、クリーム内で、脂質組成物（例えば、リポソーム）内で、または当業者に知られているであろう他の方法もしくは前述のいずれかの組合せによって投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０を参照）。

配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む本発明の１種以上の組成物は、遊離塩基、中性、または塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩には酸付加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基で形成された酸付加塩、または無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）で形成された酸付加塩、または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸）で形成された酸付加塩が含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成された塩も、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化鉄）、または有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカイン）から誘導され得る。製剤化の際、溶液は、投薬製剤に適合した方法で、かつ治療的に有効であるような量で投与されることになる。製剤は、例えば注射用液または肺送達用のエアロゾルのような非経口投与用に製剤化され、あるいは薬物放出カプセルのような消化性投与用に製剤化され、様々な剤形で容易に投与される。

さらに本開示に従えば、投与に好適な本発明の組成物は、不活性希釈剤を含むまたは含まない医薬的に許容される担体中に提供される。担体は同化可能なものであるべきであり、これには液体、半固体（すなわち、ペースト）、または固体の担体が含まれる。従来の任意の媒体、作用物質、希釈剤、または担体が投与を受ける側または含有する組成物の治療有効性に有害である場合を除き、本発明の方法の実施用に投与可能な組成物で使用することは適切である。担体または希釈剤の例としては、脂肪、油、水、食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤など、またはこれらの組合せが挙げられる。当該組成物は、１種以上の構成成分の酸化を遅らせるために様々な抗酸化剤を含むこともできる。加えて、微生物作用は様々な抗微生物剤及び抗真菌剤のような保存料によって防止することができ、保存料としては、以下に限定されないがパラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはこれらの組合せが挙げられる。

本発明に従えば、当該組成物は任意の好都合かつ実用的な方法で担体と組み合わされ、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混和、カプセル化、吸収などによって組み合わされる。このような手順は当業者にとっては通例のことである。

本発明の特定の実施形態では、当該組成物は半固体または固体担体と組み合わせるか、または十分に混合する。混合は、粉砕のような任意の好都合な方法で行うことができる。当該組成物の治療活性損失（すなわち、胃内での変性）を防ぐ目的で、混合プロセスで安定剤を添加することもできる。当該組成物に使用する安定剤の例としては、緩衝液、アミノ酸（例えば、グリシン及びリジン）、炭水化物（例えば、ブドウ糖、マンノース、ガラクトース、果糖、乳糖、ショ糖、麦芽糖、ソルビトール、マンニトールなど）が挙げられる。

さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む１種以上の本発明の組成物と、１種以上の脂質と、水性溶媒とを含む医薬用脂質ビヒクル組成物の使用に関係し得る。本明細書において「脂質」という用語は、特徴的に水に不溶性であり有機溶媒で抽出可能な幅広い範囲の物質のいずれかを含むように定義されることになる。この幅広いクラスの化合物は当業者に周知であり、本明細書で使用する「脂質」という用語はいかなる特定の構造にも限定されない。例としては、長鎖の脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然であっても合成（すなわち、人間によって設計または生成されたもの）であってもよい。ただし、脂質とは通常は生物学的物質のことである。生物学的脂質は当技術分野において周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル及びエステル結合脂肪酸ならびに重合性脂質を含む脂質、ならびにこれらの組合せが挙げられる。当然ながら、本明細書で具体的に記載された化合物以外の当業者が脂質として理解している化合物も、本発明の組成物及び方法に含まれる。

当業者であれば、脂質ビヒクル中で組成物を分散させるのに用いられ得る技法の範囲について精通していると思われる。例えば、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む、本発明の１種以上の組成物は、脂質を含有する溶液に分散させる、脂質で溶解する、脂質で乳化する、脂質と混合する、脂質と組み合わせる、脂質に共有結合させる、脂質中の懸濁液として含有させる、ミセルもしくはリポソームと共に含有させるもしくは複合体化する、または当業者に公知の任意の手段により、別の形で脂質もしくは脂質構造に関連付けることができる。分散によってリポソームの形成がもたらされてももたらされなくてもよい。

動物患者に投与する本発明の組成物の実際の投薬量は、物理的要因及び生理学的要因によって、例えば体重、状態の重症度、処置対象となる疾患のタイプ、事前または同時の治療的介入、患者の特発症、及び投与経路によって決定され得る。投薬量及び投与経路に応じて、好ましい投薬量及び／または有効量の投与回数は、対象の反応によって変動し得る。投与を担当する実施者は、いずれの場合においても、組成物中の活性成分（複数可）の濃度及び個々の対象に適切な用量（複数可）を決定することになる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば少なくとも約０．１％の活性化合物を含むことができる。他の実施形態では、活性化合物は、当該単位の重量の約２％から約７５％の間、または約２５％から約６０％の間、例えば、この中で導き出せる任意の範囲を含むことができる。当然、各々の治療上有用な組成物における活性化合物（複数可）の量は、活性化合物の任意の所与の単位用量において好適な投薬量が得られるように調製することができる。可溶性、生物学的利用性、生物学的半減期、投与経路、生成物の貯蔵寿命、及び他の薬理学的考慮事項のような要因は、このような医薬製剤を調製する当業者によって考慮されることになり、そのため様々な投薬量及び処置レジメンが望ましいものとなり得る。

他の非限定的な例では、１回用量は、約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重～約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはそれ以上、及びその中で導き出せる任意の範囲を含むことができる。本明細書に挙げられている数字から導き出せる範囲の非限定的な例としては、上述の数字に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重～約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が投与され得る。

消化性組成物及び製剤
本開示の一実施形態では、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む１種以上の本発明の組成物は、消化経路を介して投与されるように製剤化される。消化経路には、当該組成物が消化管と直接接触する全ての可能な投与経路が含まれる。具体的には、本明細書で開示される医薬組成物は、経口的に、頬側的に、直腸的に、または舌下的に投与することができる。そのため、このような組成物は、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に製剤化することができ、あるいは硬質シェルまたは軟質シェルのゼラチンカプセルに封入することができ、あるいは圧縮して錠剤にすることができ、あるいは食品に直接組み込むことができる。

ある特定の実施形態では、当該活性化合物は賦形剤に組み込み、経口摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの形態で使用することができる（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８；米国特許第５，６４１，５１５号；同第５，５８０，５７９号；同第５，７９２，４５１号、各々が参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる）。錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは、以下のものを含有することもできる：結合剤（例えば、トラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチン、またはこれらの組合せ）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはこれらの組合せ）；崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、またはこれらの組合せ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；甘味剤（例えば、ショ糖、乳糖、サッカリン、またはこれらの組合せ）；香味剤（例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーフレーバリング、オレンジフレーバリングなど）。投薬単位の形態がカプセルである場合、上記タイプの材料に加えて液体担体を含有してもよい。様々な他の材料がコーティングとして存在してもよく、あるいは投薬単位の物理的形態を別の形に改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルは、セラック、糖、またはこの両方でコーティングされてもよい。剤形がカプセルである場合、上記タイプの材料に加えて液体担体のような担体を含有してもよい。ゼラチンカプセル、錠剤、またはピルは腸管用にコーティングされてもよい。腸溶コーティングは、胃内または酸性ｐＨの腸上部内での組成物の変性を防止する。例えば、米国特許第５，６２９，００１号を参照。小腸に到達すると、小腸内の塩基性ｐＨによってコーティングが溶解し、組成物は放出され特化細胞（例えば、腸上皮細胞及びパイエル板Ｍ細胞）によって吸収される。エリキシルのシロップは、活性化合物、甘味剤としてショ糖、保存料としてメチル及びプロピルパラベン、色素、及び香味料（例えば、チェリー味またはオレンジ味）を含有することができる。当然ながら、任意の投薬単位形態の調製で使用する任意の材料は、医薬的に純粋であり、かつ用いる量において実質的に無毒であるべきである。加えて、当該活性化合物を徐放性の調製物及び製剤に組み込んでもよい。

経口投与に関しては、代替方法として、本開示の組成物を１種以上の賦形剤と共に洗口剤、歯磨き剤、バッカル錠、口内スプレー、または舌下用経口投与製剤の形態に組み込んでもよい。例えば、洗口剤は、必要な量の活性成分を適切な溶媒（例えば、ホウ酸ナトリウム（ドーベル液））中に組み込んで調製することができる。代替方法として、活性成分を経口用溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、及び重炭酸カリウムを含有する溶液）に組み込むことや、歯磨き剤中に分散させることや、治療有効量で、水、結合剤、研磨材、香味料、発泡剤、及び湿潤剤を含み得る組成物に添加することもできる。代替方法として、当該組成物を、舌の下に設置するまたは別の形で口内で溶解させることができる錠剤または溶液の形態に作ることもできる。

他の様式の消化性投与に好適な追加的製剤としては、座薬が挙げられる。座薬は、通常は薬用の、重量及び形状が様々な固体剤形であり、直腸内に挿入して用いる。挿入後、座薬は体腔液中で軟化、溶融、または溶解する。概して座薬に関しては、従来の担体は、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリド、またはこれらの組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、座薬は、例えば約０．５％～約１０％の範囲、好ましくは約１％～約２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成することができる。

非経口用組成物及び製剤
さらなる実施形態では、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む１種以上の本発明の組成物は、非経口経路を介して投与され得る。本明細書において「非経口」という用語は、消化管を迂回する経路を含む。具体的には、本明細書で開示される医薬組成物は、例えば以下に限定されないが、静脈内に、皮内に、筋肉内に、動脈内に、くも膜下腔内に、皮下、または腹腔内に投与することができる（米国特許第６，７５３７，５１４号、同第６，６１３，３０８号、同第５，４６６，４６８号、同第５，５４３，１５８号、同第５，６４１，５１５号、及び同第５，３９９，３６３号、各々の全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）。

遊離塩基としての活性化合物または薬理学的に許容される塩の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と好適に混合した水中で調製することができる。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中ならびに油中で分散体を調製することもできる。通常の貯蔵条件及び使用条件下では、このような調製物は微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。注射用途に好適な医薬品形態としては、無菌水性溶液または分散体、及び無菌注射溶液または分散体を即時調製するための無菌粉末が挙げられる（その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる米国特許第５，４６６，４６８号）。全ての場合において、当該形態は、注射が容易である限りにおいて無菌でなければならず、かつ流体でなければならない。当該形態は、製造条件及び貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ細菌及び真菌のような微生物の汚染作用から守られなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（すなわち、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、及び／または植物油を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適正な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用により、分散させる場合は必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって防止することができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましいことになる。注射用組成物は、吸収を遅らせる作用物質の組成物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によって持続的に吸収させることができる。

水溶液における非経口投与に関しては、例えば、溶液は必要に応じて好適に緩衝されるべきであり、液体希釈剤はまず十分な生理的食塩水またはグルコースで等張にする。このような特定の水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内の投与に特に好適である。これに関連し、用いられ得る無菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知であると考えられる。例えば、１投薬量を等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、これを皮下注入液に添加するか、または提案された注入部位に注射することができる（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５－１０３８ページ及び１５７０－１５８０ページを参照）。ある程度の投薬量の変動は、処置を受けている対象の状態に応じて必然的に生じることになる。投与の担当者は、いずれの場合においても、個々の対象に適切な用量を決定することになる。さらに、ヒトへの投与に関しては、調製物は、ＦＤＡのＯｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄｓが求めている無菌性、発熱原性、一般的安全性及び純度の基準を満たすべきである。

無菌注射溶液は、必要とされる量の活性化合物を、必要に応じて上に挙げた様々な他の成分と共に適切な溶媒中に組み込み、次に濾過滅菌することによって調製される。概して、分散体は、様々な無菌化された活性成分を、塩基性分散媒と上に挙げた他の成分のうち必要とされる成分とを含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び冷凍乾燥の技法であり、これらを用いることで事前に滅菌濾過した溶液から活性成分及び任意の追加的な所望成分を含む粉末がもたらされる。粉末化した組成物は、安定剤ありまたはなしで液体担体（例えば、水または食塩水）と合わせる。

種々の医薬組成物及び製剤
本発明の他の好ましい実施形態では、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む１種以上の本発明の組成物は、様々な種々の経路、例えば、局所的（すなわち、経皮的）投与、粘膜的投与（鼻腔内、膣など）、及び／または吸入を介した投与用に製剤化することができる。

局所的投与用の医薬組成物としては、薬用用途のために製剤化された活性化合物、例えば、軟膏、ペースト、クリーム、または粉末が挙げられ得る。軟膏には、局所的用途のための全ての油性、吸着、エマルジョン、及び水溶性に基づいた組成物が含まれ、一方クリーム及びローションはエマルジョンベースのみを含む組成物である。局所的に投与される薬剤は、皮膚を通じた活性成分の吸着を容易にするために浸透促進剤を含有してもよい。好適な浸透促進剤としては、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、及びラウロカプラムが挙げられる。局所的投与用の組成物に用いられ得る基剤としては、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム、及びワセリン、さらに他の任意の好適な吸収、エマルジョン、または水溶性の軟膏基剤が挙げられる。また、局所的調製物としては、必要に応じて活性成分を保存し均質な混合物をもたらすための乳化剤、ゲル化剤、及び抗微生物性保存料も挙げられ得る。本発明における経皮的投与は、「パッチ」の使用も含み得る。例えば、パッチは、所定の速度でかつ固定された期間にわたって継続的に、１種以上の活性物質を供給することができる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、点眼薬、鼻腔内スプレー、吸入、及び／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達することができる。組成物を経鼻エアロゾルスプレーを介し肺に直接送達させる方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号及び同第５，８０４，２１２号で説明されている（各々の全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）。同様に、鼻腔内の微粒子樹脂を用いた薬物送達（Ｔａｋｅｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）及びリゾホスファチジル－グリセロール化合物を用いた薬物送達（米国特許第５，７２５，８７１号、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）も医薬品分野でよく知られている。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜的薬物送達が米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）で説明されている。

エアロゾルという用語は、液化または加圧ガスの噴射剤中に分散した液体粒子の微粉固体のコロイド系を指す。本発明における典型的な吸入用エアロゾルは、液体噴射剤中の活性成分の懸濁液、または液体噴射剤と好適な溶媒との混合物からなることになる。好適な噴射剤としては、炭化水素及び炭化水素エーテルが挙げられる。好適な容器は、噴射剤の圧力要件に応じて様々となる。エアロゾルの投与は、対象の年齢、体重、ならびに症状の重症度及び反応に応じて様々となる。

本開示のキット
本明細書に記載の任意の組成物は、キットに含まれてもよい。非限定的な例において、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む１種以上の本発明の組成物は、キットに含まれてもよい。

キットは、好適な分割量の、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む１種以上の本発明の組成物と、場合によっては１種以上の追加的作用物質とを含むことができる。キットの構成成分（複数可）は、水性媒体で、または凍結乾燥形態でパッケージ化することができる。キットの容器手段には、概して少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、または他の容器手段が含まれることになり、その中に構成成分を入れ、好ましくは好適に分割することができる。キット中に２つ以上の構成成分が存在する場合、当該キットは概して第２の、第３の、または他の追加的な容器を収容することになり、その中に追加的な構成成分を別々に入れることができる。ただし、様々な組合せの構成成分が１つのバイアルに含まれてもよい。本発明のキットは、典型的には、配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む１種以上の本発明の組成物を収容するための手段、及び商業的販売用に厳重に密閉された他の任意の試薬容器も含むことになる。このような容器は、所望のバイアルを保持する射出成形またはブロー成形のプラスチック容器を含み得る。

キットの構成成分が１種及び／またはそれ以上の溶液で提供される場合、当該溶液は水性溶液であり、無菌の水性溶液が特に好ましい。配列番号１１～１５のいずれか１つのような核酸もしくはタンパク質配列、またはその融合タンパク質を含む１種以上の本発明の組成物は、注射可能な組成物に製剤化することができる。この場合、容器手段はそれ自体がシリンジ、ピペット、及び／または他のそのような器具であってよく、このような容器手段から製剤を身体の感染領域に適用し、動物に注射し、及び／またはキットの他の構成成分にさらに適用及び／または他の構成成分と混合することができる。

ただし、キットの構成成分は、乾燥粉末（複数可）として提供されてもよい。試薬及び／または構成成分が乾燥粉末として提供される場合、当該粉末は好適な溶媒の添加によって再構成されてもよい。このような溶媒も別の容器手段で提供され得ることが想定される。

配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY
TRUSTEES OF BOSTON UNIVERSITY
<120> METHODS OF PRODUCING AGGREGATE-FREE MONOMERIC DIPHTHERIA TOXIN
FUSION PROTEINS AND THERAPEUTIC USES
<150> US 62/306,281
<151> 2016-03-10
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1
ttaggatagc taagtccat 19

<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 2
ttgatttcag agcaccctta taattaggat agctaagtcc at 42

<210> 3
<211> 1711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 3
ttgatttcag agcaccctta taattaggat agctaagtcc attattttat gagtcctggt 60
aaggggatac gttgtgagca gaaaactgtt tgcgtcaatc ttaatagggg cgctactggg 120
gataggggcc ccaccttcag cccatgcagg cgctgatgat gttgttgatt cttctaaatc 180
ttttgtgatg gaaaactttt cttcgtacca cgggactaaa cctggttatg tagattccat 240
tcaaaaaggt atacaaaagc caaaatctgg tacacaagga aattatgacg atgattggaa 300
agggttttat agtaccgaca ataaatacga cgctgcggga tactctgtag ataatgaaaa 360
cccgctctct ggaaaagctg gaggcgtggt caaagtgacg tatccaggac tgacgaaggt 420
tctcgcacta aaagtggata atgccgaaac tattaagaaa gagttaggtt taagtctcac 480
tgaaccgttg atggagcaag tcggaacgga agagtttatc aaaaggttcg gtgatggtgc 540
ttcgcgtgta gtgctcagcc ttcccttcgc tgaggggagt tctagcgttg aatatattaa 600
taactgggaa caggcgaaag cgttaagcgt agaacttgag attaattttg aaacccgtgg 660
aaaacgtggc caagatgcga tgtatgagta tatggctcaa gcctgtgcag gaaatcgtgt 720
caggcgatca gtaggtagct cattgtcatg catcaacctg gattgggatg ttatccgtga 780
taaaactaaa actaagatcg aatctctgaa agaacacggt ccgatcaaaa acaaaatgag 840
cgaaagcccg aacaaaactg tatctgaaga aaaagctaaa cagtacctgg aagaattcca 900
ccagactgca ctggaacacc cggaactgtc tgaacttaag accgttactg gtaccaaccc 960
ggtattcgct ggtgctaact acgctgcttg ggcagtaaac gttgctcagg ttatcgatag 1020
cgaaactgct gataacctgg aaaaaactac cgcggctctg tctatcctgc cgggtatcgg 1080
tagcgtaatg ggcatcgcag acggcgccgt tcaccacaac actgaagaaa tcgttgcaca 1140
gtctatcgct ctgagctctc tgatggttgc tcaggccatc ccgctggtag gtgaactggt 1200
tgatatcggt ttcgctgcat acaacttcgt tgaaagcatc atcaacctgt tccaggttgt 1260
tcacaactct tacaaccgcc cggcttactc tccgggtcac aagacgcatg cacctacttc 1320
tagctctacc aagaaaaccc agctgcagct cgagcacctg ctgctggatt tgcagatgat 1380
cctgaacggt atcaacaatt acaagaaccc gaaactgacg cgtatgctga ccttcaagtt 1440
ctacatgccg aagaaggcca ccgaactgaa acacctgcag tgtctagaag aagaactgaa 1500
accgctggag gaagttctga acctggctca gtctaaaaac ttccacctgc ggccgcgtga 1560
cctgatctct aacatcaacg taatcgttct ggaactgaag ggctctgaaa ccaccttcat 1620
gtgtgaatac gctgatgaga ccgcaaccat cgtagaattc ctgaaccgtt ggatcacctt 1680
ctgtcagtct atcatctcta ccctgacctg a 1711

<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 4
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgca 75

<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 5
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala
20 25

<210> 6
<211> 1566
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 6
atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60
taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120
tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa 180
tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240
gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300
gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360
acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420
ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480
agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540
gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600
tcatgcatca acctggattg ggatgttatc cgtgataaaa ctaaaactaa gatcgaatct 660
ctgaaagaac acggtccgat caaaaacaaa atgagcgaaa gcccgaacaa aactgtatct 720
gaagaaaaag ctaaacagta cctggaagaa ttccaccaga ctgcactgga acacccggaa 780
ctgtctgaac ttaagaccgt tactggtacc aacccggtat tcgctggtgc taactacgct 840
gcttgggcag taaacgttgc tcaggttatc gatagcgaaa ctgctgataa cctggaaaaa 900
actaccgcgg ctctgtctat cctgccgggt atcggtagcg taatgggcat cgcagacggc 960
gccgttcacc acaacactga agaaatcgtt gcacagtcta tcgctctgag ctctctgatg 1020
gttgctcagg ccatcccgct ggtaggtgaa ctggttgata tcggtttcgc tgcatacaac 1080
ttcgttgaaa gcatcatcaa cctgttccag gttgttcaca actcttacaa ccgcccggct 1140
tactctccgg gtcacaagac gcatgcacct acttctagct ctaccaagaa aacccagctg 1200
cagctcgagc acctgctgct ggatttgcag atgatcctga acggtatcaa caattacaag 1260
aacccgaaac tgacgcgtat gctgaccttc aagttctaca tgccgaagaa ggccaccgaa 1320
ctgaaacacc tgcagtgtct agaagaagaa ctgaaaccgc tggaggaagt tctgaacctg 1380
gctcagtcta aaaacttcca cctgcggccg cgtgacctga tctctaacat caacgtaatc 1440
gttctggaac tgaagggctc tgaaaccacc ttcatgtgtg aatacgctga tgagaccgca 1500
accatcgtag aattcctgaa ccgttggatc accttctgtc agtctatcat ctctaccctg 1560
acctga 1566

<210> 7
<211> 1566
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 7
atgggcgctg atgatgttgc tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60
taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120
tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa 180
tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240
gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300
gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360
acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420
ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480
agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540
gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600
tcatgcatca acctggattg ggatgttatc cgtgataaaa ctaaaactaa gatcgaatct 660
ctgaaagaac acggtccgat caaaaacaaa atgagcgaaa gcccgaacaa aactgtatct 720
gaagaaaaag ctaaacagta cctggaagaa ttccaccaga ctgcactgga acacccggaa 780
ctgtctgaac ttaagaccgt tactggtacc aacccggtat tcgctggtgc taactacgct 840
gcttgggcag taaacgttgc tcaggttatc gatagcgaaa ctgctgataa cctggaaaaa 900
actaccgcgg ctctgtctat cctgccgggt atcggtagcg taatgggcat cgcagacggc 960
gccgttcacc acaacactga agaaatcgtt gcacagtcta tcgctctgag ctctctgatg 1020
gttgctcagg ccatcccgct ggtaggtgaa ctggttgata tcggtttcgc tgcatacaac 1080
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cagctcgagc acctgctgct ggatttgcag atgatcctga acggtatcaa caattacaag 1260
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ctgaaacacc tgctgcagtg tctagaagaa gaactgaaac cgctggagga agttctgaac 1380
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ctgacc 1566

<210> 8
<211> 1638
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 8
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gctgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120
aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 180
caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 240
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atctctaccc tgacctga 1638

<210> 9
<211> 402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 9
gcacctactt ctagctctac caagaaaacc cagctgcagc tcgagcacct gctgctggat 60
ttgcagatga tcctgaacgg tatcaacaat tacaagaacc cgaaactgac gcgtatgctg 120
accttcaagt tctacatgcc gaagaaggcc accgaactga aacacctgca gtgtctagaa 180
gaagaactga aaccgctgga ggaagttctg aacctggctc agtctaaaaa cttccacctg 240
cggccgcgtg acctgatctc taacatcaac gtaatcgttc tggaactgaa gggctctgaa 300
accaccttca tgtgtgaata cgctgatgag accgcaacca tcgtagaatt cctgaaccgt 360
tggatcacct tctgtcagtc tatcatctct accctgacct ga 402

<210> 10
<211> 521
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 10
Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
20 25 30
Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp
35 40 45
Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala
50 55 60
Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys
85 90 95
Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr
100 105 110
Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe
115 120 125
Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu
145 150 155 160
Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln
165 170 175
Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val
180 185 190
Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp
195 200 205
Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His
210 215 220
Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser
225 230 235 240
Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu
245 250 255
Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro
260 265 270
Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln
275 280 285
Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala
290 295 300
Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly
305 310 315 320
Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu
325 330 335
Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val
340 345 350
Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu
355 360 365
Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly
370 375 380
His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
385 390 395 400
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
420 425 430
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
435 440 445
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
450 455 460
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
465 470 475 480
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
485 490 495
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
500 505 510
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
515 520

<210> 11
<211> 560
<212> PRT
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 11
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His
405 410 415
Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg
420 425 430
Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
435 440 445
Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly
450 455 460
Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
465 470 475 480
Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
485 490 495
Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu
500 505 510
His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu
515 520 525
Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
530 535 540
His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560

<210> 12
<211> 545
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 12
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
435 440 445
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
450 455 460
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
465 470 475 480
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
500 505 510
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
515 520 525
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
530 535 540
Thr
545

<210> 13
<211> 520
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
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370 375 380
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 19
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Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg
420 425 430
Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
435 440 445
Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly
450 455 460
Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
465 470 475 480
Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
485 490 495
Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu
500 505 510
His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu
515 520 525
Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
530 535 540
His Thr Lys Val Asn Phe Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560

<210> 21
<211> 6402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 21
ggcgagtgct ttgaatgctt gggcttcttc acggcgggtc ttgaccgcgt tgataagttc 60
gcggccagag ctgaattgct ggcgtggggt ggggttgaac tggtcgtgtc ctgccatatc 120
ccttacctgc tttatcaagt ctccaaggcg catcacccgg ttgtgctgcc tataccaacg 180
ataagcggta ggggctttgc ctgtgtagaa cgggttgcgg ctaaagcggt gggaaaagtg 240
cgggtcatgg tctaaaagct cacccagcac acgcgtggtt gctgcaagaa gcttcatctg 300
cgcagattta ccgttacggt cagcgtagac agggtcaata agccatatga actgggcttt 360
gccgttagtt gggttaatac ccacccaggc tggcccgacg ctatgagtaa tcagtgagcg 420
caccacgtcg cggacgtacg ggtttaagtc tgcggggtca ccgcctgcgg tacctacttg 480
gtcaacgtct acgaccagga cggcggcgta ctgcttggtg gtgagcatgg cgtactcgca 540
ccgtcctaaa gcatcagtct cgaagcgata catacgcggc gagttcgtgc cgtcagcgtt 600
gcgtcgatag gcctttttaa agtctcgtgt gactgaaccg tggagtacat cgcggcctag 660
atgatcgcgt aaaaggtcgc ggtcactggc agatgctggg gtgttgtcca gtccaccacg 720
gtcgcgctcg acgcgggtag gtgttttagt gtgcgcattc tgcgcatgag tctgtaaact 780
catgaccgtg ctttctccca ggtgtgtgct gggtgataag cgaaagtcat cgggttgccg 840
cccggtggct ttcttcgttt ttcattgtct ttccctgact ctaaatgaca ccggtgttat 900
ttactagcca tgacacgcga aaaatatgcc ttttacctgc ggttacgtat ggctagacat 960
atggcaagct atacgtaacc gcgtttcagc tgcacagggc tgtctgcgca gatttaccat 1020
cacgggactt ttcccagttc aggctgcgca tatttacgca tacaacgaaa gcggttgcgc 1080
agatttacca cacactctgc gctgatttac cgatacgcag aaaaagcgtg cgcagattta 1140
cccatacggt ggcgaattat ccagagcaat aggtatacag caatacagta atacaggtgc 1200
cataaacctg tattactgta ttgctgtatg cctgtaaacc tttatttatt gttgtggacg 1260
tattcttcga ggtaggtgct aacaatctcg cggatggtca cgcctttttg ggcggcgatg 1320
actttaagtt ctgcgtgaag gtcgcggtcg atttcaatcg tcatcttctt gacgtagtcg 1380
cggcctgtgg gttggtggaa tgcgcttcgc actgttttct tctcggctgc tggagttagc 1440
ttcgtggctt ttttcattga ggttcgcggg ccttgctgcg ccctggcgcg ttctttactg 1500
gtgctcattt catcatctcc atgagttcgt cggcgacgtg gtcgtagccg tgcatgtcgg 1560
ggcctgggca gtatccaaac gctaggtgca tatcttcgcg tagcgggatt tcggttttaa 1620
agtgcggcat gtgttccgcg tcgagcgctt ctcgtgccgc gtcaagggcg ctggtgcctt 1680
tcctggcgaa cgtcagtaag actgcatgag gtgttccgtt gactgcgtcg cgcagctccc 1740
atactcggga gaggtcggca gcagcagaac gggtcggaag aatgatgaag tcgctgactg 1800
cgattgctgc ttcgatagcg ttctcgtctc ctggcggcac atcgataccg actgggcgat 1860
ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca 1920
ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac 1980
gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta 2040
gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgct 2100
cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc 2160
tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag 2220
ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attgtaatac gactcactat 2280
agggcgaatt ggagctccac cgcggtggcg gccgctctag aactagtgga tccagggcat 2340
tgatttcaga gcacccttat aattaggata gctaagtcca ttattttatg agtcctggta 2400
aggggatacg ttgtgagcag aaaactgttt gcgtcaatct taataggggc gctactgggg 2460
ataggggccc caccttcagc ccatgcaggc gctgatgatg ttgttgattc ttctaaatct 2520
tttgtgatgg aaaacttttc ttcgtaccac gggactaaac ctggttatgt agattccatt 2580
caaaaaggta tacaaaagcc aaaatctggt acacaaggaa attatgacga tgattggaaa 2640
gggttttata gtaccgacaa taaatacgac gctgcgggat actctgtaga taatgaaaac 2700
ccgctctctg gaaaagctgg aggcgtggtc aaagtgacgt atccaggact gacgaaggtt 2760
ctcgcactaa aagtggataa tgccgaaact attaagaaag agttaggttt aagtctcact 2820
gaaccgttga tggagcaagt cggaacggaa gagtttatca aaaggttcgg tgatggtgct 2880
tcgcgtgtag tgctcagcct tcccttcgct gaggggagtt ctagcgttga atatattaat 2940
aactgggaac aggcgaaagc gttaagcgta gaacttgaga ttaattttga aacccgtgga 3000
aaacgtggcc aagatgcgat gtatgagtat atggctcaag cctgtgcagg aaatcgtgtc 3060
aggcgatcag taggtagctc attgtcatgc atcaacctgg attgggatgt tatccgtgat 3120
aaaactaaaa ctaagatcga atctctgaaa gaacacggtc cgatcaaaaa caaaatgagc 3180
gaaagcccga acaaaactgt atctgaagaa aaagctaaac agtacctgga agaattccac 3240
cagactgcac tggaacaccc ggaactgtct gaacttaaga ccgttactgg taccaacccg 3300
gtattcgctg gtgctaacta cgctgcttgg gcagtaaacg ttgctcaggt tatcgatagc 3360
gaaactgctg ataacctgga aaaaactacc gcggctctgt ctatcctgcc gggtatcggt 3420
agcgtaatgg gcatcgcaga cggcgccgtt caccacaaca ctgaagaaat cgttgcacag 3480
tctatcgctc tgagctctct gatggttgct caggccatcc cgctggtagg tgaactggtt 3540
gatatcggtt tcgctgcata caacttcgtt gaaagcatca tcaacctgtt ccaggttgtt 3600
cacaactctt acaaccgccc ggcttactct ccgggtcaca agacgcatgc acctacttct 3660
agctctacca agaaaaccca gctgcagctc gagcacctgc tgctggattt gcagatgatc 3720
ctgaacggta tcaacaatta caagaacccg aaactgacgc gtatgctgac cttcaagttc 3780
tacatgccga agaaggccac cgaactgaaa cacctgcagt gtctagaaga agaactgaaa 3840
ccgctggagg aagttctgaa cctggctcag tctaaaaact tccacctgcg gccgcgtgac 3900
ctgatctcta acatcaacgt aatcgttctg gaactgaagg gctctgaaac caccttcatg 3960
tgtgaatacg ctgatgagac cgcaaccatc gtagaattcc tgaaccgttg gatcaccttc 4020
tgtcagtcta tcatctctac cctgacctga ggatcccccg ggctgcagga attcgatatc 4080
aagcttatcg ataccgtcga cctcgagggg gggcccggta ccagcttttg ttccctttag 4140
tgagggttaa tttcgagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 4200
tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 4260
gcctaatgag tgagtccccg atccgtcgag ctcgacctgc aggggggggg gggcgctgag 4320
gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca 4380
gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga 4440
ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat 4500
ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt 4560
aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact catcgagcat 4620
caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg 4680
tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta 4740
tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa 4800
aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa 4860
aagcttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa 4920
atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac 4980
gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac 5040
tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc 5100
tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg 5160
cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt 5220
aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt 5280
cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata 5340
cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg 5400
ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt 5460
tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag acacaacgtg 5520
gctttccccc ccccccctgc aggtcgagct cgacggatcg ggctgcagga attcggtgag 5580
gttatggcgg agggttgcga ggtctaggag aacagaggaa gtcatgcttt gaagcatata 5640
agctgccctg cccctcaagg ttttcttcaa gtgaggtttt atctaactgc ctaacggcag 5700
gggaaccgta tattgcttac ggtatgagac cccttaaacg tccggatagt caccgctctt 5760
ctttagctcc gcgacatgcc tagcaaccgt ggcgcgagag actcctacct ctgcccctat 5820
ttcagcccac gtgggaactg tccctgtctg gaaatactga tcgttcacca tttggctaat 5880
acgggacttc gtagatcgtc cttgagcctt tttcttacgg tgcgtctttt caagcttcga 5940
cctttgtgct tgcgcatatt tgccctcggg gtctgttttc cagcgttgtg cggctttttg 6000
tccgcctctg cgtcccatcg tggccaaggc tttccgctcg ctgctggtgg ctttacctgg 6060
tgcgttagag ccgctgtagg tctcgctctt ggattgggcg acatacccgc gcacgcgcct 6120
tgccatggtt tggcggtcgc gcatgggtgg catctcgttg tcgcggcctg caccgccgtg 6180
ggtgtgtgcg acgttgtagg cgtgctcata ggcgtcgatg attgctgcgt ctgtcaggcg 6240
ttggccttgc tggcgcaagc ggtggccagt cttaagcgca tgtctaaagg ctgtttcgtc 6300
gcgtgctgcg gttccttgga caatccagag cacacgcaca ccgtcgataa gttccgggtc 6360
atactggtcg agaccaccgg cgatttccgc gtctacgtcc tg 6402

<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 22
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala
20 25

<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 23
His His His His His His
1 5

<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 24
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5

<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
wild-type toxO sequence
<400> 25
ttaggatagc tttacctaa 19

<210> 26
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 26
Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
20 25 30

<210> 27
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 27
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val
20 25 30

<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 28
Met Gly Ala Asp Asp
1 5

<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 29
Gly Ala Asp Asp
1

<210> 30
<211> 526
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 30
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
515 520 525

<210> 31
<211> 1686
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 31
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gctgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120
aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 180
caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 240
accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 300
aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa 360
gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg 420
gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg 480
ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgttgaat atattaataa ctgggaacag 540
gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa 600
gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta 660
ggtagctcat tgtcatgcat caacctggat tgggatgtta tccgtgataa aactaaaact 720
aagatcgaat ctctgaaaga acacggtccg atcaaaaaca aaatgagcga aagcccgaac 780
aaaactgtat ctgaagaaaa agctaaacag tacctggaag aattccacca gactgcactg 840
gaacacccgg aactgtctga acttaagacc gttactggta ccaacccggt attcgctggt 900
gctaactacg ctgcttgggc agtaaacgtt gctcaggtta tcgatagcga aactgctgat 960
aacctggaaa aaactaccgc ggctctgtct atcctgccgg gtatcggtag cgtaatgggc 1020
atcgcagacg gcgccgttca ccacaacact gaagaaatcg ttgcacagtc tatcgctctg 1080
agctctctga tggttgctca ggccatcccg ctggtaggtg aactggttga tatcggtttc 1140
gctgcataca acttcgttga aagcatcatc aacctgttcc aggttgttca caactcttac 1200
aaccgcccgg cttactctcc gggtcacaag acgcatgcac ctacttctag ctctaccaag 1260
aaaacccagc tgcagctcga gcacctgctg ctggatttgc agatgatcct gaacggtatc 1320
aacaattaca agaacccgaa actgacgcgt atgctgacct tcaagttcta catgccgaag 1380
aaggccaccg aactgaaaca cctgcagtgt ctagaagaag aactgaaacc gctggaggaa 1440
gttctgaacc tggctcagtc taaaaacttc cacctgcggc cgcgtgacct gatctctaac 1500
atcaacgtaa tcgttctgga actgaagggc tctgaaacca ccttcatgtg tgaatacgct 1560
gatgagaccg caaccatcgt agaattcctg aaccgttgga tcaccttctg tcagtctatc 1620
atctctaccc tgaccgagaa cctgtacttc cagggccatc accaccacca ccaccatcat 1680
cactag 1686

<210> 32
<211> 250
<212> PRT
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 32
Met Arg Lys Ile Val Thr Leu Ala Ala Ala Ser Leu Leu Gly Ile Ala
1 5 10 15
Gly Thr Ser Gly Val Leu Gly Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Thr Asn
20 25 30
Gly Thr Pro Val Ser Pro Glu Asp Asp Thr Ala Ala Glu Gly Val Val
35 40 45
Gln Val Ala Ser Cys Thr Gly Thr Val Val Ala Ser Gln Trp Val Leu
50 55 60
Thr Ala Gln His Cys Val Glu Val Pro Asn Leu Gln Arg Pro Val Tyr
65 70 75 80
Val Gly Thr Thr Arg Glu Gln Gln Gln Arg Glu Glu Asn Thr Phe Thr
85 90 95
Ser Asp Tyr Ala Val Trp Ala Pro His Gly Asp Val Ala Leu Val His
100 105 110
Val Thr Asp Ala Leu Pro Gln Arg Leu Val Arg Ala Val Arg Arg Ala
115 120 125
Pro Val Ser Phe Gly Glu Gln Gly Arg Val Tyr Gly Trp Gly Ala Gly
130 135 140
Thr Gly Glu Thr Leu Gln Tyr Ala Arg Ala Ala Val Gly Lys Thr Ser
145 150 155 160
Ser Gly Val Arg Pro Gln Gly Asn Gln His Gly Ala Phe Ile Val Gln
165 170 175
Tyr Leu Asp Glu Ala Lys Ala Gly Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
180 185 190
Phe Val Asn Gly Glu Val Ala Gly Val Thr Ser Phe Lys Ala Pro Gln
195 200 205
Gly Gly Gly Arg Phe Ser Leu Phe Ala Ser Leu His Gly Leu Gly Asp
210 215 220
Trp Ile Ala Gln Thr Thr Ala Ala Lys Pro Glu Asn Pro Asn Ser Lys
225 230 235 240
Asn Gln Gln Ser Gln Gln Pro Arg Arg Pro
245 250

<210> 33
<211> 753
<212> DNA
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 33
atgcggaaaa ttgttactct tgctgcagca agcttgctgg gtattgcggg taccagcggt 60
gttcttggtg cggcaacagc caccgcactg acaaatggca cgcccgtctc ccctgaggac 120
gataccgctg ccgaaggcgt ggttcaagtg gctagttgta ctggcaccgt ggttgcttct 180
cagtgggtgc tgaccgccca gcattgcgtc gaggtgccca atttgcagcg gccggtctat 240
gttggcacca cccgcgagca gcaacaacgg gaagaaaata cgttcacctc ggattacgca 300
gtgtgggcac cgcacggcga tgtggcgttg gtgcatgtca ccgatgcgct gccgcagcgt 360
ctggtccgcg cggttcgccg cgcaccggtg agctttggtg agcagggacg cgtgtacggc 420
tggggtgctg gcaccggcga gacgctgcag tatgcccgcg ctgcggttgg taaaacttct 480
tccggagttc ggccgcaggg caaccagcat ggtgcattca tcgtgcagta tttggacgag 540
gctaaagccg ggcgtggcga ttccggcggg ccgctttttg tcaacggtga ggttgctggg 600
gtgacctcgt ttaaggctcc tcaaggtggt gggcgtttct cgctgtttgc ttcgctgcat 660
gggctaggcg attggattgc gcagaccacc gccgccaagc ccgagaaccc gaattccaag 720
aatcaacagt cccagcaacc acgtagaccg tag 753

<210> 34
<211> 1012
<212> DNA
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 34
ggatccgcaa ttgcgggaat cgtcgtgctt tttagccgaa attttcttgc agccagcgct 60
atgcttatcg cctcagggtt agccgctgac atttaccgct tgaggaataa tatgagtgga 120
aatcaacggt aatttcagaa gacttgccta cacctttagc tagcgaccac cattggtggt 180
cgctagcttt ttgatggctt aagggacatt tgggcatccg tgtatcgcac attagtcata 240
caggaaatcc tccaagattt cgtccgcatg cccgaccaga cactacagca cccacatagc 300
ttctcgattg tcttgcggag cgggagtagg tagctcacgt gctaccgcac ggggaaccgt 360
atattgctta tggtgtgccc attacccacc gttggtgcta tgatccgaac ggaaaaagtc 420
agtcgtatta gtgaatcacc gttccgccgc gcgagaacgc agggctccaa caagcgtgtg 480
gttccacaag attgcaagga tgtgtacggt gctggtggcg gtggctccag cctgggtctg 540
tcgtcttctt agcaagtctg cattcacggt tccctaggca atctttgagc aaatccctgt 600
ttaacgcccc tgtacgttcg gcgccgcaga aacctgccgg atcgtgatgt taatcctgcc 660
ttgttccagc ccgcagccgt cgggaagcgt ggcatcattc acgcgcacca ccccgtgata 720
agcaaaacgc ttcggcccac cgaaaaccac caagtcgccg gagcacagag tcacatcgtc 780
ccagggttgg gtgcgtgatt cggtgtgtcc catccgaaac agtgcttcgt cgccaatcga 840
tactgaaatg accggcgccc gcgattcctc aaattcatcg acgtgcatgc ccatcccgga 900
acccggcgga tagtagttga ccagcaccat ctctgtcacg aaggcctcta cccacggggc 960
tagttcttcg gcaacctccg ctgctgcgcg caacgctgcc ggcgccggat cc 1012

<210> 35
<211> 242
<212> PRT
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 35
Met Lys Lys Leu Arg Thr Leu Ala Val Thr Leu Thr Ala Ile Ala Ala
1 5 10 15
Ser Thr Met Ala Thr Met Pro Ala Gln Ala Val Ile Ser Pro Thr Pro
20 25 30
Ser His Gln Val Ser Leu Ala Tyr Val Ser Phe Asp Asn Met Gln Cys
35 40 45
Thr Gly Thr Leu Val Ser Pro Thr Ala Val Leu Thr Ala Arg His Cys
50 55 60
Leu Asn Gly Gly Leu Gly His Val Arg Leu Gly Ala Asp His Phe Thr
65 70 75 80
Ala Val Arg Ala Val Ala His Pro Gln Ala Asp Leu Ala Val Leu His
85 90 95
Leu Asp Arg Pro Ala Pro Ile Ala Pro Ser Ala Ile Ser Gly Arg His
100 105 110
Thr Gln Pro Gly Asn Arg Phe Gly Val Ala Gly Tyr Gly Ser Thr Phe
115 120 125
Thr Gly Ile Pro Met Ala Ala Ala Ala Thr Met Gln Arg Arg Val Thr
130 135 140
Asp Val Pro Ser Pro Asp Arg Gln Ala Val Met Ile Glu Asn His Ile
145 150 155 160
Ser Gln Gly Val Leu Arg Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Leu Glu
165 170 175
Gly Asn His Val Ile Gly Val Leu Ser Met Ser Ser Ala Ser Gly Arg
180 185 190
Val Gly Trp Tyr Ile Pro Thr Ala Glu His Ala Asp Trp Ile Ala Ala
195 200 205
Ala Ala Gly Ile Pro Ala Pro Gly Ser Val Asp Lys Pro Ala Pro Leu
210 215 220
Val Asp Ala Thr Ala Phe Pro Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ala Ser Leu
225 230 235 240
Ser Ser

<210> 36
<211> 729
<212> DNA
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 36
atgaagaaac ttcgtaccct agccgtaacc ctgaccgcaa tcgcagcatc aaccatggcg 60
accatgccag cacaagcagt gattagtccg acaccgtcac atcaagtttc gctagcgtac 120
gtcagttttg acaacatgca gtgcaccggc acactcgtca gccccaccgc cgtgctcaca 180
gcacgacact gcctcaacgg cggcctcggc cacgtccgac tcggcgccga tcacttcacc 240
gccgtacgtg ccgtggcaca cccccaagca gaccttgccg tcctccacct cgatcgccca 300
gcgccaatag cgccatccgc aatctctgga cgtcacaccc aaccaggtaa ccgcttcgga 360
gttgccggct acggaagcac cttcaccggc atccccatgg cagcagctgc aaccatgcaa 420
cgccgcgtca ccgacgtccc cagccccgac cgccaagcag tcatgatcga aaaccacatc 480
agccaaggtg tactacgccc aggcgactct ggcggccccc tcctagaggg caatcacgtc 540
ataggagtac tcagcatgag cagtgcatcc ggccgcgtcg gctggtacat ccccaccgca 600
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cccgctccgc tcgtcgacgc cacagccttc ccgacgcaag agccaagcct cgctagccta 720
tcctcctag 729

<210> 37
<211> 1012
<212> DNA
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 37
ggatccgggc ttatcaccgc agaagacgcc gaaaaagcca tcgatgccac cctcctagcc 60
gtcgacggca tcacacgcca taacgacgac cccatggcat ggctcgccgc tatgggatac 120
ccactaacat gggcaaaaaa catcacgctt aaggaggccg aatgattacc gtctatcaca 180
acccccgctg ctccacctcg cgcaaagcct tggagtacat agaacaacac agcgacgacg 240
aggtgaccat catccgctac ctcgacgccc ctcctagtga acaagagctg cgcactttgc 300
ttgccgacgc ccacctcagc ccgcacgacg caatccgcac caaagaagcc gaatacaaag 360
aactcggact cagctccacc acccccgaat cagagctaat caaggccatg gtcacccacc 420
cacgcctcat tcagcgccca attgtggcaa catgcaaggg aacgcggatc gcccgaccaa 480
ccgaaattct gaaagaaatt ctctagccga atcgccagcg atctcggaag ccaaggaatc 540
cttcggcatg ttaaaaaatg taaaagttta atgcgggcac aaacgcgttg aaagagcaac 600
acaccaccat cgttgaacat acttgattat ttcccacttt ccagaatttt aatgagcatg 660
cccagctcga catcaagaac gcagggaaga tctcactagc aatcgacgat aggcccttct 720
tcgacaaccc ggaacatctt gccacgtacg acggaactac actggcagga tcgtcaatat 780
gtggtgaatt ccctgttaaa gtaggaagaa cagagggtgt cagtccgttt gtgtacgggg 840
actgacaccc tctgttcaaa tgattcatcg aagacggttt cacttttcta gcaaaacagc 900
aagacccgca agatttcata tattggtcaa gcgcagccac aaactatcac tcatagctat 960
gtagccccct attaattcat atctcaaaga gtatccaagc actttgggat cc 1012

<210> 38
<211> 558
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 38
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Met His His His His His His
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys
35 40 45
Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly
50 55 60
Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr
65 70 75 80
Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn
85 90 95
Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser
100 105 110
Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys
115 120 125
Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu
130 135 140
Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu
145 150 155 160
Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu
165 170 175
Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu
180 185 190
Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg
195 200 205
Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys
210 215 220
Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile
225 230 235 240
Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu
245 250 255
Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe
275 280 285
His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val
290 295 300
Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala
305 310 315 320
Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu
325 330 335
Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met
340 345 350
Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala
355 360 365
Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu
370 375 380
Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu
385 390 395 400
Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro
405 410 415
Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr
420 425 430
Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met
435 440 445
Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met
450 455 460
Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His
465 470 475 480
Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn
485 490 495
Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser
500 505 510
Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe
515 520 525
Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn
530 535 540
Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
545 550 555

<210> 39
<211> 533
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 39
Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Asp
1 5 10 15
Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile
35 40 45
Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys
50 55 60
Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val
65 70 75 80
Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val
85 90 95
Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala
100 105 110
Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met
115 120 125
Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala
130 135 140
Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val
145 150 155 160
Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu
165 170 175
Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr
180 185 190
Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val
195 200 205
Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp
210 215 220
Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys
225 230 235 240
Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala
245 250 255
Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu
260 265 270
Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly
275 280 285
Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser
290 295 300
Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu
305 310 315 320
Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His
325 330 335
Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met
340 345 350
Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe
355 360 365
Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val
370 375 380
His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His
385 390 395 400
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
405 410 415
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
435 440 445
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
450 455 460
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
465 470 475 480
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
485 490 495
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
500 505 510
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
515 520 525
Ile Ser Thr Leu Thr
530

<210> 40
<211> 520
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 40
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
515 520

<210> 41
<211> 1677
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 41
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaatgca tcaccaccac caccacgaga acctgtactt ccagggcgct 120
gatgatgttg ctgattcttc taaatctttt gtgatggaaa acttttcttc gtaccacggg 180
actaaacctg gttatgtaga ttccattcaa aaaggtatac aaaagccaaa atctggtaca 240
caaggaaatt atgacgatga ttggaaaggg ttttatagta ccgacaataa atacgacgct 300
gcgggatact ctgtagataa tgaaaacccg ctctctggaa aagctggagg cgtggtcaaa 360
gtgacgtatc caggactgac gaaggttctc gcactaaaag tggataatgc cgaaactatt 420
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tttatcaaaa ggttcggtga tggtgcttcg cgtgtagtgc tcagccttcc cttcgctgag 540
gggagttcta gcgttgaata tattaataac tgggaacagg cgaaagcgtt aagcgtagaa 600
cttgagatta attttgaaac ccgtggaaaa cgtggccaag atgcgatgta tgagtatatg 660
gctcaagcct gtgcaggaaa tcgtgtcagg cgatcagtag gtagctcatt gtcatgcatc 720
aacctggatt gggatgttat ccgtgataaa actaaaacta agatcgaatc tctgaaagaa 780
cacggtccga tcaaaaacaa aatgagcgaa agcccgaaca aaactgtatc tgaagaaaaa 840
gctaaacagt acctggaaga attccaccag actgcactgg aacacccgga actgtctgaa 900
cttaagaccg ttactggtac caacccggta ttcgctggtg ctaactacgc tgcttgggca 960
gtaaacgttg ctcaggttat cgatagcgaa actgctgata acctggaaaa aactaccgcg 1020
gctctgtcta tcctgccggg tatcggtagc gtaatgggca tcgcagacgg cgccgttcac 1080
cacaacactg aagaaatcgt tgcacagtct atcgctctga gctctctgat ggttgctcag 1140
gccatcccgc tggtaggtga actggttgat atcggtttcg ctgcatacaa cttcgttgaa 1200
agcatcatca acctgttcca ggttgttcac aactcttaca accgcccggc ttactctccg 1260
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cacctgctgc tggatttgca gatgatcctg aacggtatca acaattacaa gaacccgaaa 1380
ctgacgcgta tgctgacctt caagttctac atgccgaaga aggccaccga actgaaacac 1440
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ctgaagggct ctgaaaccac cttcatgtgt gaatacgctg atgagaccgc aaccatcgta 1620
gaattcctga accgttggat caccttctgt cagtctatca tctctaccct gacctga 1677

<210> 42
<211> 551
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 42
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
435 440 445
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
450 455 460
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
465 470 475 480
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
500 505 510
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
515 520 525
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
530 535 540
Thr His His His His His His
545 550

<210> 43
<211> 526
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 43
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr His His His His His His
515 520 525

<210> 44
<211> 1656
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 44
gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gctgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120
aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 180
caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 240
accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 300
aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa 360
gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg 420
gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg 480
ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgttgaat atattaataa ctgggaacag 540
gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa 600
gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta 660
ggtagctcat tgtcatgcat caacctggat tgggatgtta tccgtgataa aactaaaact 720
aagatcgaat ctctgaaaga acacggtccg atcaaaaaca aaatgagcga aagcccgaac 780
aaaactgtat ctgaagaaaa agctaaacag tacctggaag aattccacca gactgcactg 840
gaacacccgg aactgtctga acttaagacc gttactggta ccaacccggt attcgctggt 900
gctaactacg ctgcttgggc agtaaacgtt gctcaggtta tcgatagcga aactgctgat 960
aacctggaaa aaactaccgc ggctctgtct atcctgccgg gtatcggtag cgtaatgggc 1020
atcgcagacg gcgccgttca ccacaacact gaagaaatcg ttgcacagtc tatcgctctg 1080
agctctctga tggttgctca ggccatcccg ctggtaggtg aactggttga tatcggtttc 1140
gctgcataca acttcgttga aagcatcatc aacctgttcc aggttgttca caactcttac 1200
aaccgcccgg cttactctcc gggtcacaag acgcatgcac ctacttctag ctctaccaag 1260
aaaacccagc tgcagctcga gcacctgctg ctggatttgc agatgatcct gaacggtatc 1320
aacaattaca agaacccgaa actgacgcgt atgctgacct tcaagttcta catgccgaag 1380
aaggccaccg aactgaaaca cctgcagtgt ctagaagaag aactgaaacc gctggaggaa 1440
gttctgaacc tggctcagtc taaaaacttc cacctgcggc cgcgtgacct gatctctaac 1500
atcaacgtaa tcgttctgga actgaagggc tctgaaacca ccttcatgtg tgaatacgct 1560
gatgagaccg caaccatcgt agaattcctg aaccgttgga tcaccttctg tcagtctatc 1620
atctctaccc tgacccacca tcaccatcat cactga 1656

<210> 45
<211> 561
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 45
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Thr Ser
405 410 415
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
435 440 445
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
450 455 460
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
465 470 475 480
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
500 505 510
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
515 520 525
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
530 535 540
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His His His His His
545 550 555 560
His

<210> 46
<211> 536
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 46
Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
420 425 430
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
450 455 460
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
485 490 495
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
500 505 510
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His
515 520 525
His His His His His His His His
530 535

<210> 47
<211> 4679
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 47
ggatcccccg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg ataccgtcga cctcgagggg 60
gggcccggta ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa tttcgagctt ggcgtaatca 120
tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 180
gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagtccccg atccgtcgag 240
ctcgacctgc aggggggggg gggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact 300
cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga 360
gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt 420
ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc 480
aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac 540
caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 600
attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 660
gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 720
aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg 780
agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagcttatgc atttctttcc agacttgttc 840
aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 900
tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 960
aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 1020
atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa 1080
ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 1140
cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 1200
tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga 1260
ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 1320
taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt 1380
actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat 1440
gtaacatcag agattttgag acacaacgtg gctttccccc ccccccctgc aggtcgagct 1500
cgacggatcg ggctgcagga attcggtgag gttatggcgg agggttgcga ggtctaggag 1560
aacagaggaa gtcatgcttt gaagcatata agctgccctg cccctcaagg ttttcttcaa 1620
gtgaggtttt atctaactgc ctaacggcag gggaaccgta tattgcttac ggtatgagac 1680
cccttaaacg tccggatagt caccgctctt ctttagctcc gcgacatgcc tagcaaccgt 1740
ggcgcgagag actcctacct ctgcccctat ttcagcccac gtgggaactg tccctgtctg 1800
gaaatactga tcgttcacca tttggctaat acgggacttc gtagatcgtc cttgagcctt 1860
tttcttacgg tgcgtctttt caagcttcga cctttgtgct tgcgcatatt tgccctcggg 1920
gtctgttttc cagcgttgtg cggctttttg tccgcctctg cgtcccatcg tggccaaggc 1980
tttccgctcg ctgctggtgg ctttacctgg tgcgttagag ccgctgtagg tctcgctctt 2040
ggattgggcg acatacccgc gcacgcgcct tgccatggtt tggcggtcgc gcatgggtgg 2100
catctcgttg tcgcggcctg caccgccgtg ggtgtgtgcg acgttgtagg cgtgctcata 2160
ggcgtcgatg attgctgcgt ctgtcaggcg ttggccttgc tggcgcaagc ggtggccagt 2220
cttaagcgca tgtctaaagg ctgtttcgtc gcgtgctgcg gttccttgga caatccagag 2280
cacacgcaca ccgtcgataa gttccgggtc atactggtcg agaccaccgg cgatttccgc 2340
gtctacgtcc tgggcgagtg ctttgaatgc ttgggcttct tcacggcggg tcttgaccgc 2400
gttgataagt tcgcggccag agctgaattg ctggcgtggg gtggggttga actggtcgtg 2460
tcctgccata tcccttacct gctttatcaa gtctccaagg cgcatcaccc ggttgtgctg 2520
cctataccaa cgataagcgg taggggcttt gcctgtgtag aacgggttgc ggctaaagcg 2580
gtgggaaaag tgcgggtcat ggtctaaaag ctcacccagc acacgcgtgg ttgctgcaag 2640
aagcttcatc tgcgcagatt taccgttacg gtcagcgtag acagggtcaa taagccatat 2700
gaactgggct ttgccgttag ttgggttaat acccacccag gctggcccga cgctatgagt 2760
aatcagtgag cgcaccacgt cgcggacgta cgggtttaag tctgcggggt caccgcctgc 2820
ggtacctact tggtcaacgt ctacgaccag gacggcggcg tactgcttgg tggtgagcat 2880
ggcgtactcg caccgtccta aagcatcagt ctcgaagcga tacatacgcg gcgagttcgt 2940
gccgtcagcg ttgcgtcgat aggccttttt aaagtctcgt gtgactgaac cgtggagtac 3000
atcgcggcct agatgatcgc gtaaaaggtc gcggtcactg gcagatgctg gggtgttgtc 3060
cagtccacca cggtcgcgct cgacgcgggt aggtgtttta gtgtgcgcat tctgcgcatg 3120
agtctgtaaa ctcatgaccg tgctttctcc caggtgtgtg ctgggtgata agcgaaagtc 3180
atcgggttgc cgcccggtgg ctttcttcgt ttttcattgt ctttccctga ctctaaatga 3240
caccggtgtt atttactagc catgacacgc gaaaaatatg ccttttacct gcggttacgt 3300
atggctagac atatggcaag ctatacgtaa ccgcgtttca gctgcacagg gctgtctgcg 3360
cagatttacc atcacgggac ttttcccagt tcaggctgcg catatttacg catacaacga 3420
aagcggttgc gcagatttac cacacactct gcgctgattt accgatacgc agaaaaagcg 3480
tgcgcagatt tacccatacg gtggcgaatt atccagagca ataggtatac agcaatacag 3540
taatacaggt gccataaacc tgtattactg tattgctgta tgcctgtaaa cctttattta 3600
ttgttgtgga cgtattcttc gaggtaggtg ctaacaatct cgcggatggt cacgcctttt 3660
tgggcggcga tgactttaag ttctgcgtga aggtcgcggt cgatttcaat cgtcatcttc 3720
ttgacgtagt cgcggcctgt gggttggtgg aatgcgcttc gcactgtttt cttctcggct 3780
gctggagtta gcttcgtggc ttttttcatt gaggttcgcg ggccttgctg cgccctggcg 3840
cgttctttac tggtgctcat ttcatcatct ccatgagttc gtcggcgacg tggtcgtagc 3900
cgtgcatgtc ggggcctggg cagtatccaa acgctaggtg catatcttcg cgtagcggga 3960
tttcggtttt aaagtgcggc atgtgttccg cgtcgagcgc ttctcgtgcc gcgtcaaggg 4020
cgctggtgcc tttcctggcg aacgtcagta agactgcatg aggtgttccg ttgactgcgt 4080
cgcgcagctc ccatactcgg gagaggtcgg cagcagcaga acgggtcgga agaatgatga 4140
agtcgctgac tgcgattgct gcttcgatag cgttctcgtc tcctggcggc acatcgatac 4200
cgactgggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg 4260
tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga 4320
aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg 4380
ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg 4440
ctacagggcg ctcccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc 4500
gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt 4560
gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat 4620
acgactcact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg cggccgctct agaactagt 4679

<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
9xHis tag
<400> 48
His His His His His His His His His
1 5

Claims (39)

1. ＤＮＡ発現ベクターであって、
   ａ． ｔｏｘＰと、
   ｂ． Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、
   ｃ． タンパク質をコードするＤＮＡ配列と
   を含み、
   前記ｔｏｘＰ及び前記変異体ｔｏｘＯが、前記タンパク質をコードするＤＮＡセグメントの発現を調節する、前記ＤＮＡ発現ベクター。
2. シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ発現ベクター。
3. 前記タンパク質が前記シグナルペプチドに結合している、請求項２に記載のＤＮＡ発現ベクター。
4. 前記変異体ｔｏｘＯが配列番号１である、請求項１に記載のＤＮＡ発現ベクター。
5. 前記シグナルペプチドが配列番号５である、請求項２に記載のＤＮＡ発現ベクター。
6. 前記タンパク質が、ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１０７、またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＡ発現ベクター。
7. 前記タンパク質が、配列番号１１、７～２０のいずれか１つから選択される、請求項６に記載のＤＮＡ発現ベクター。
8. 前記タンパク質が、受容体結合タンパク質またはその機能部分に結合しているジフテリア毒素またはその機能部分を含む、請求項１に記載のＤＮＡ発現ベクター。
9. 前記受容体結合タンパク質が、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＥＧＦ、ＦＧＦ、サブスタンスＰ、ＣＤ４、αＭＳＨ、ＧＲＰ、ＴＴ断片Ｃ、ＧＣＳＦ、ヘレグリンβ１、これらの機能部分、またはこれらの組合せを含む群から選択される、請求項８に記載のＤＮＡ発現ベクター。
10. 前記タンパク質が、配列番号１２～１５のいずれか１つから選択される、請求項８に記載のＤＮＡ発現ベクター。
11. ＤＮＡ発現ベクターであって、
    ａ． ｔｏｘＰと、
    ｂ． Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、
    ｃ． タンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、前記タンパク質が、
    ｉ． シグナル配列、
    ｉｉ． ジフテリア受容体結合ドメインを含まない、または機能しないジフテリア毒素受容体結合ドメインを有する、ジフテリア毒素またはその機能部分、及び
    ｉｉｉ． ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＥＧＦ、ＦＧＦ、サブスタンスＰ、ＣＤ４、αＭＳＨ、ＧＲＰ、ＴＴ断片Ｃ、ＧＣＳＦ、ヘレグリンβ１、これらの機能部分、またはこれらの組合せを含む群から選択されるターゲット受容体結合ドメイン
    を含む、前記ＤＮＡ配列と
    を含み、
    前記ｔｏｘＰ及び前記変異体ｔｏｘＯが、前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列の発現を調節する、前記ＤＮＡ発現ベクター。
12. 前記ＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌が、シグナルペプチドに結合しているジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質を生成し、前記シグナルペプチドにより、前記ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質がペリプラズム、培地、または両方の位置に向けられる、請求項１１に記載のＤＮＡ発現ベクター。
13. 前記細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、前記シグナルペプチドが前記ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質を前記ペリプラズムに向ける、請求項１２に記載のＤＮＡ発現ベクター。
14. 前記細菌がコリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）であり、前記シグナルペプチドが前記ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質を前記培地に向ける、請求項１２に記載のＤＮＡ発現ベクター。
15. 配列番号３を含む、請求項１１に記載のＤＮＡ発現ベクター。
16. 切断可能なタンパク質タグをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１２に記載のＤＮＡ発現ベクター。
17. 前記切断可能なタンパク質タグが前記ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質に結合している、請求項１２に記載のＤＮＡ発現ベクター。
18. 前記ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質が、配列番号１２～１５のいずれか１つから選択される、請求項１１に記載のＤＮＡ発現ベクター。
19. 凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質を生成するための方法であって、以下のステップ：
    ａ． 細菌を、請求項１～１８に記載のベクターのＤＮＡ発現により形質転換すること、
    ｂ． 形質転換体を形成すること、
    ｃ． 前記形質転換体を培地内でインキュベートして、前記培地内に分泌されるタンパク質の発現を可能にすること、及び
    ｄ． 前記培地から前記タンパク質を精製すること
    を含む、前記方法。
20. 前記細菌がコリネバクテリウム・ジフテリエである、請求項１９に記載の方法。
21. 凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質を生成するための方法であって、以下のステップ：
    ａ． コリネバクテリウム・ジフテリエ株をＤＮＡベクターにより形質転換することであって、前記ＤＮＡベクターが、
    ｉ． ｔｏｘＰと、
    ｉｉ． Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、
    ｉｉｉ． タンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、前記タンパク質が、
    ａ． シグナルペプチド、
    ｂ． ジフテリア受容体結合ドメインを含まない、または機能しないジフテリア毒素受容体結合ドメインを有する、ジフテリア毒素またはその機能部分、及び
    ｃ． ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＥＧＦ、ＦＧＦ、サブスタンスＰ、ＣＤ４、αＭＳＨ、ＧＲＰ、ＴＴ断片Ｃ、ＧＣＳＦ、ヘレグリンβ１、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、これらの機能断片、またはこれらの組合せを含む群から選択されるターゲット受容体結合ドメイン
    を含む、前記ＤＮＡ配列と
    を含み、前記ｔｏｘＰ及び前記変異体ｔｏｘＯが、前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列の発現を調節する、前記形質転換すること、
    ｂ． 形質転換体を形成すること、
    ｃ． 前記形質転換体を培地内でインキュベートして、前記培地内に分泌される前記タンパク質の発現を可能にすること、ならびに
    ｄ． 前記培地から前記ジフテリア毒素融合タンパク質を精製すること
    を含む、前記方法。
22. 前記ジフテリア毒素受容体融合タンパク質が、配列番号１２～１５のいずれか１つから選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記コリネバクテリウム・ジフテリエ株がコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ） Ｃ７ベータ（－）、ｔｏｘ（－）である、請求項２１に記載の方法。
24. 結核患者を処置する方法であって、以下のステップ：
    ａ． 請求項２１に示されるようにジフテリア毒素融合タンパク質を調製すること、
    ｂ． 前記ジフテリア毒素融合タンパク質を結核患者に投与すること
    を含む、前記方法。
25. 変異体ｔｏｘＯプロモーターを含む、ＤＮＡ発現ベクター。
26. 請求項１～１８に記載のＤＮＡ発現ベクターを含有する、コリネバクテリウム・ジフテリエ株。
27. タンパク質を作製する方法であって、以下のステップ：
    ａ． ｔｏｘＰと、Ｆｅが媒介する遺伝子発現調節をブロックする変異体ｔｏｘＯと、シグナル配列と、タンパク質をコードするＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ発現ベクターを提供すること、
    ｂ． 細菌株を前記ＤＮＡベクターにより形質転換して、形質転換体を形成すること、
    ｃ． 前記形質転換体を培地内である期間の間インキュベートして、前記培地内に分泌されるタンパク質の発現を可能にすること、及び
    ｄ． 前記培地から前記タンパク質を精製すること
    を含む、前記方法。
28. 配列番号１２～１５のいずれか１つから選択される、融合タンパク質。
29. 請求項２８に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
30. 請求項２８に記載の融合タンパク質と、少なくとも１種以上の他の化学療法剤とを含む、医薬組成物。
31. 前記他の化学療法剤が、イソニアジド、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、エチオナミド、プロチオナミド、テリジドン、チアセタゾン、シクロセリン、カプレオマイシン、パラ－アミノサリチル酸（ＰＡＳ）、ビオマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ベダキリン、またはデラマニド、リネゾリド、テデゾリド、アモキシシリン・クラブラン酸、メロペネム、イミペネム、クラリスロマイシン、またはクロファジミンからなる群から選択される、請求項３０に記載の医薬組成物。
32. 請求項２８に記載の医薬組成物及び少なくとも１種以上の他の抗微生物剤。
33. 前記抗微生物剤が、イソニアジド、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、エチオナミド、プロチオナミド、テリジドン、チアセタゾン、シクロセリン、カプレオマイシン、パラ－アミノサリチル酸（ＰＡＳ）、ビオマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ベダキリン、またはデラマニド、リネゾリド、テデゾリド、アモキシシリン・クラブラン酸、メロペネム、イミペネム、クラリスロマイシン、またはクロファジミンからなる群から選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
34. 対象におけるがんを処置または予防する方法であって、前記対象に、有効量の、配列番号１２～１５のいずれか１つから選択される融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
35. 対象における結核を処置または予防する方法であって、前記対象に、有効量の、配列番号１１～１５のいずれか１つから選択される融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
36. 請求項１～１８のいずれか１項に記載のＤＮＡ発現ベクターを含む、原核細胞株。
37. 請求項１～１８のいずれかに記載のＤＮＡ発現ベクターを含む、キット。
38. 配列番号２を含むｔｏｘＰ。
39. 配列番号１２～１５のいずれか１つのタンパク質。

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