TW202011973A - 人類犬尿胺酸酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本文闡述與具有犬尿胺酸酶活性之蛋白質之使用有關的方法及組合物。舉例而言，在某些態樣中，可揭示一種能夠降解犬尿胺酸之經修飾之犬尿胺酸酶。此外，本發明之某些態樣提供使用所揭示之蛋白質或核酸治療犬尿胺酸耗竭之癌症的組合物及方法。

Description

人類犬尿胺酸酶及其用途

本發明概言之係關於分子生物學及腫瘤學領域。更具體而言，其係關於經工程改造之犬尿胺酸酶及其使用方法。

犬尿胺酸係經由吲哚胺2,3二氧酶(IDO)或色胺酸2,3二氧酶(TDO)之作用產生之胺基酸色胺酸之代謝物。犬尿胺酸對細胞生理發揮多重效應；其中最重要之一個效應係作為T細胞反應之調節劑。許多腫瘤細胞調控IDO及/或TDO酶之合成以提高犬尿胺酸之局部濃度，其伴隨著色胺酸之耗竭。犬尿胺酸之高水準進而用作抑制原本會攻擊腫瘤之腫瘤浸潤T細胞功能的有力方式。

犬尿胺酸產生在癌症中之重要性已得到公認，且導致犬尿胺酸生成酶IDO及TDO之抑制劑的開發。該等化合物中之至少一者目前正經歷II期臨床評估。然而，IDO或TDO抑制對於癌症療法係有問題的，此乃因： (1) 存在IDO以及TDO之兩種同種型，目前犬尿胺酸生成之所有可能路徑之抑制皆需要產生多個小分子抑制劑；(2)可以產生抗抑制性。

人類犬尿胺酸酶對3'0H犬尿胺酸之降解具有強烈偏好，其降解作用之催化效率(Kcat/Km)係犬尿胺酸降解顯示之催化效率的1,000倍。相比之下，一些細菌酶(例如來自螢光假單胞菌(P. fluorescens )之酶)相對於3'OH犬尿胺酸對犬尿胺酸具有強烈偏好。出於治療目的，必須具有在人類中具有活體內應用所必需之藥理學性質之藥劑(亦即治療酶)。該等性質包括： (i)犬尿胺酸之高催化活性，(ii)增強之血清中失活之穩定性，以便在單劑量注射時延長犬尿胺酸在血清及組織中之耗竭。

本發明之態樣藉由提供包含能夠降解L-犬尿胺酸之經工程改造之多肽序列的酶克服本領域之主要缺陷，該等經工程改造之多肽序列具有與人類酶之高度序列一致性以避免引發不利免疫反應且如癌症療法所期望之在血清中顯示有利之藥物動力學。在PCT/US2014/053437中，發明人揭示相對於野生型人類酶具有KYN之高達24倍之降解催化效率的突變人類犬尿胺酸酶(在本文中亦稱為h-KYNase或HsKYN)酶。需要發現相對於PCT/US2014/053437中揭示之彼等酶具有更高催化活性及人類血清中之穩定性的突變h-KYNase。本申請案之態樣解決此需要且揭示具有更高催化效率之突變酶以及具有比野生型h-KYNase更高催化活性之突變酶以及具有增強之血清穩定性之酶。

在第一實施例中，本發明提供經分離、修飾之人類犬尿胺酸酶，該經修飾之酶具有與SEQ ID NO: 1、2、3之人類犬尿胺酸酶或表1中提供之多肽中之一者具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列，且包含至少一個選自由以下組成之群之取代(相對於SEQ ID NO:1之序列)：L8P、K38E、Y47L、I48F、K50Q、I51M、S60N、K64N、D65G、E66K、N67D、N67P、D67S、A68F、A68T、A68V、F71L、F71M、L72N、K84E、E88N、E89K、E89S、E90Q、D92E、K93N、K93T、A95H、A95Q、K96N、I97H、I97L、I97V、A98G、A99G、A99I、A99R、A99S、A99T、A99V、Y100N、Y100S、Y100T、G101A、H102W、E103F、E103H、E103N、E103Q、E103R、E103V、E103W、V104D、V104E、V104F、V104H、V104K、V104L、V104R、G105A、G105H、G105S、G105T、E106D、K106D、K106E、K106H、K106N、R107P、R107S、P108R、I110A、I110F、I110L、I110M、I110T、T111D、T111H、T111N、T111R、G112A、G112C、G112D、G112K、G112L、G112M、G112Q、G112R、G112S、G112T、G112Y、N127K、I131V、A132V、L133V、A136T、L137T、T138S、N140D、H142Q、Q14R、Y156H、K163T、D168E、H169R、Q175L、I183F、I183L、I183P、I183S、E184A、E184D、E184R、E184T、E184V、E185T、M187L、M189I、K191A、K191G、K191H、K191M、K191N、K191R、K191S、K191T、K191W、E197A、E197D、E197F、E197K、E197M、E197Q、E197S、E197T、E197V、I201C、I201E、I201F、I201H、I201L、I201S、I201T、I201V、H203K、L219M、L219W、F220L、V223I、F225Y、H230F、H230L、H230Y、N232S、Y246F、F249W、D250E、S274A、S274C、S274G、S274N、S274T、L278M、A280G、A280S、A280T、G281S、A282M、A282P、G284N、I285L、V303L、V303S、F306W、F306Y、S311N、K315E、D317E、D317K、I331C、I331L、I331N、I331S、I331T、I331V、N333T、P334N、P335T、L337T、L338A、L338Q、S341I、K373E、K373N、N375A、N375H、Y376C、Y376F、Y376L、K378G、K378P、K378Q、K378R、K380G、K380S、A382G、A382R、A382T、T383S、K384G、K384N、P386K、P386S、V387L、N389E、I405L、F407Y、S408D、S408N、N411R、D413S、D413V、Q416T、E419A、E419L、K420E、R421N、V424I、K427M、N429E、G432A及A436T。在一些態樣中，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 1、2或3之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性；或與表1之一種酶具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在某些態樣中，酶可包含A282處之取代(例如，A282M或A282P)、F306 (例如，F306W或F306Y)，或F249，例如F249W。在其他態樣中，酶可包含L72N取代。在其他態樣中，酶可包含F306W取代。在具體態樣中，酶可包含H102W及N333T取代。在另一態樣中，酶可包含A99處之取代。在一些態樣中，酶可包含G112處之取代。在某些具體態樣中，酶包含E103處之取代。在其他態樣中，酶包含V104處之取代。在其他態樣中，酶可包含S408處之取代。在若干態樣中，酶可包含I183P取代。在一些特定態樣中，酶可包含R107P取代。在另一具體態樣中，酶可包含A436T取代。

在其他態樣中，酶可包含至少一個選自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S及N333T之取代。在某些態樣中，酶包含至少兩個、三個、四個或五個選自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S及N333T之取代。在一些態樣中，酶可包含取代L72N、H102W、A282P、F306W、I331S及N333T。在其他態樣中，酶相對於KYN之催化活性(kcat/kM)為至少8000M-1s-1。在其他態樣中，酶相對於KYN之催化活性(kcat/kM)介於約8000M-1s-1與40000 M-1s-1之間、介於10000M-1s-1與40000 M-1s-1之間、介於20000M-1s-1與40000 M-1s-1之間或介於25000M-1s-1與35000 M-1s-1之間。

在其他態樣中，多肽包含與表1之多肽中之一者的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列。在具體態樣中，多肽包含與表1之多肽中之一者具有100%一致性的胺基酸序列。在其他態樣中，多肽包含與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列。在具體態樣中，多肽包含與SEQ ID NO: 2具有100%一致性之胺基酸序列。在某些態樣中，胺基酸序列與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在具體態樣中，多肽包含與SEQ ID NO: 3具有100%一致性之胺基酸序列。

在又一態樣中，實施例之犬尿胺酸酶進一步包含WO/2015/031771、WO/2016/033488或WO/2017/151860中揭示之胺基酸取代中之一者，該等案件各自係全文以引用方式併入本文中。

在其他態樣中，提供能夠降解KYN之包含天然或經修飾之人類或靈長類動物犬尿胺酸酶的多肽。在一些實施例中，多肽在生理條件下能夠降解KYN。舉例而言，多肽對於KYN之催化效率(k _cat /K _M )為至少或約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10⁴ 、10⁵ 、10⁶ M^-1 s^-1 或其中可推導出之任何範圍。

如上文論述之經修飾之多肽之特徵可在於，與未經修飾之多肽(例如，天然多肽，例如SEQ ID NO: 1之人類犬尿胺酸酶)或本文揭示之任何多肽序列相比，具有某一百分比之一致性。舉例而言，未經修飾之多肽可包含天然犬尿胺酸酶之至少或至多約150、200、250、300、350、400、450或465個殘基(或其中可推導出之任何範圍)。經修飾之多肽與未經修飾之多肽之間或任兩個序列相比之一致性百分比可為約、至多或至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% (或其中可推導出之任何範圍)。亦預計，上文論述之一致性百分比可能和與多肽之未經修飾之區相比多肽之特定修飾之區有關。例如，多肽可含有犬尿胺酸酶之經修飾或突變受質識別位點，其可基於犬尿胺酸酶之經修飾或突變受質識別位點之胺基酸序列與來自相同物種或不同物種之未經修飾或突變犬尿胺酸酶之胺基酸序列的一致性進行表徵。經修飾或突變人類多肽之特徵在於(例如)與未經修飾之犬尿胺酸酶具有至少90%一致性，此意味著該經修飾或突變人類多肽中之至少90%胺基酸與未經修飾之多肽中之胺基酸一致。

該未經修飾之多肽可為天然犬尿胺酸酶，特定而言人類同種型或其他靈長類動物同種型。舉例而言，天然人類犬尿胺酸酶可具有SEQ ID NO: 1之序列。天然靈長類動物犬尿胺酸酶之非限制性實例包括蘇門答臘猩猩(Pongo abelii )犬尿胺酸酶(Genbank ID: XP_009235962.1，GI: 686708656)、長尾獼猴(Macaca fascicularis )犬尿胺酸酶(Genbank ID: EHH54849.1，GI: 355750522)，以及黑猩猩屬(Pan troglodytes )犬尿胺酸酶(Genbank ID: XP_003309314.1，GI: 332814521)。例示性天然多肽包括與SEQ ID NO:1具有約、至多或至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性(或其中可推導出之任何範圍)的序列。舉例而言，天然多肽可包含SEQ ID NO:1之序列之至少或至多約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或465個殘基(或其中可推導出之任何範圍)。

在一些態樣中，實施例之多肽包含連接至異源胺基酸序列之犬尿胺酸酶。舉例而言，犬尿胺酸酶可連接至異源胺基酸序列作為融合蛋白。在特定實施例中，犬尿胺酸酶連接至胺基酸序列，例如用於延長活體內半衰期之IgG Fc、白蛋白、白蛋白結合蛋白或XTEN多肽。

為了增加血清持久性，犬尿胺酸酶可連接至一或多個聚醚分子。在特定實施例中，聚醚為聚乙二醇(PEG)。多肽可經由特定胺基酸殘基(例如離胺酸或半胱胺酸)連接(例如，共價)至PEG。對於治療性投與而言，包含犬尿胺酸酶之該多肽可分散於醫藥學上可接受之載劑中。

在一些態樣中，涵蓋編碼該犬尿胺酸酶之核酸。在一些實施例中，核酸經密碼子最佳化用於在細菌中表現。在特定實施例中，細菌為大腸桿菌(E. coli )。在其他態樣中，核酸經密碼子最佳化用於在真菌(例如，酵母)、昆蟲或哺乳動物中表現。在其他態樣中，提供含有該等核酸之載體，例如表現載體。在特定實施例中，編碼犬尿胺酸酶之核酸可操作連接至啟動子，包括(但不限於)異源啟動子。在一個實施例中，犬尿胺酸酶由載體(例如，基因療法載體)遞送至靶細胞。該等病毒可藉由重組DNA技術經修飾以使得編碼犬尿胺酸酶之核酸能夠在靶細胞中表現。該等載體可源自非病毒(例如，質體)或病毒(例如，腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒、慢病毒屬、疱疹病毒或牛痘病毒)來源之載體。非病毒載體較佳與藥劑複合以有利於DNA跨細胞膜進入。該等非病毒載體複合物之實例包括與多陽離子劑之調配物，該等多陽離子劑有利於DNA與基於脂質之遞送系統的縮合。基於脂質之遞送系統之實例將包括基於脂質體之核酸遞送。

在其他態樣中，本發明進一步涵蓋包含該等載體之宿主細胞。宿主細胞可為細菌(例如，大腸桿菌)、真菌細胞(例如，酵母)、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。

在一些實施例中，將載體引入宿主細胞中用於表現犬尿胺酸酶。蛋白質可以任何適宜方式表現。在一個實施例中，蛋白質在宿主細胞中表現，使得蛋白質醣基化。在另一實施例中，蛋白質在宿主細胞中表現，使得蛋白質無醣基化。

在一些實施例中，癌症為對犬尿胺酸耗竭敏感之任何癌症。在一個實施例中，本發明涵蓋治療腫瘤細胞或癌症患者之方法，其包括投與包含該多肽之調配物。在一些實施例中，投與係在使得殺死癌細胞之至少一部分之條件下發生。在另一實施例中，調配物包含在生理條件下具有犬尿胺酸降解活性且進一步包含連接之聚乙二醇鏈的該犬尿胺酸酶。在一些實施例中，調配物為包含上文論述之犬尿胺酸酶中之任一者及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。該等醫藥學上可接受之賦形劑為熟習此項技術者熟知。預計所有上述犬尿胺酸酶皆可用於人類療法。

在又一實施例中，亦提供治療腫瘤細胞之方法，其包括投與包含具有犬尿胺酸降解活性之非細菌(哺乳動物，例如靈長類動物或小鼠)犬尿胺酸酶或編碼其之核酸的調配物。

根據本發明之某些態樣，含有犬尿胺酸酶之該調配物可經靜脈內、真皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、滑膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、腫瘤內、肌內、皮下、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、外用、藉由吸入、輸注、連續輸注、局部灌注、經由導管、經由灌洗、於脂質組合物(例如，脂質體)內或藉由如熟習此項技術者所知之其他方法或上述之任何組合來投與。

在又一實施例中，該方法亦包括向個體至少投與第二抗癌療法。第二抗癌療法可為手術療法、化學療法、輻射療法、冷凍療法、激素療法、免疫療法或細胞介素療法。在某些態樣中，第二抗癌療法可為免疫檢查點抑制劑療法，例如抗PD-1、抗CTLA-4、抗PD-L1抗體、抗LAG3、抗TIM-3、抗ICOS、抗CD137、抗CD40、抗KIR、抗CD40L、抗GITR或抗OX40療法。在其他態樣中，第二抗癌療法可為抗體療法，例如抗體-藥物結合物。在其他態樣中，第二抗癌療法為免疫療法，例如投與免疫效應細胞或免疫原性組合物。舉例而言，免疫原性組合物可包含癌細胞抗原及視情況佐劑。在一些態樣中，免疫效應細胞可包含NK細胞、T細胞(例如，CAR T細胞)或NK/T細胞。

在一些實施例中，涵蓋包含嵌合抗原受體(CAR)及實施例之犬尿胺酸酶之T細胞，其用於治療患有癌症之個體。在一些態樣中，細胞可經編碼CAR及犬尿胺酸酶及在一些情形下轉座酶之DNA轉染。

CAR可靶向任何感興趣之癌細胞抗原，包括(例如) HER2、CD19、CD20及GD2。抗原結合區或結構域可包含源自特定人類單株抗體(例如全文以引用方式併入本文中之美國專利7,109,304中所述之彼等抗體)之單鏈可變片段(scFv)的V_H 及V_L 鏈之片段。片段亦可為人類抗原特異性抗體之任何數目之不同抗原結合結構域。在更具體實施例中，片段為由針對在人類細胞中表現之人類密碼子使用最佳化的序列編碼之抗原特異性scFv。對於CAR之額外實例，參見(例如) WO 2012/031744、WO 2012/079000、WO 2013/059593及美國專利8,465,743，所有該等案件之全文皆以引用方式併入本文中。

犬尿胺酸酶可為本文揭示之任何犬尿胺酸酶。轉染細胞之方法為業內熟知，但在某些態樣中，採用高效率轉染方法，例如電穿孔。舉例而言，可使用核轉染裝置將核酸引入細胞中。較佳地，轉染步驟不包括用病毒感染或轉導細胞，該病毒可引起基因毒性及/或在經治療個體中導致對含有病毒序列之細胞之免疫反應。

多種CAR構築體及其表現載體為業內已知且在本文中進一步詳述。舉例而言，在一些態樣中，CAR表現載體為DNA表現載體，例如質體、線性表現載體或游離基因體。在一些態樣中，載體包含額外序列，例如有利於CAR (例如啟動子、增強子、多-A信號及/或一或多個內含子)表現之序列。在較佳態樣中，CAR編碼序列側接轉位子序列，使得轉座酶之存在允許編碼序列整合至經轉染細胞之基因體中。

在某些態樣中，進一步用轉座酶轉染細胞，該轉座酶有利於CAR編碼序列整合至經轉染細胞之基因體中。在一些態樣中，轉座酶提供為DNA表現載體。然而，在較佳態樣中，轉座酶提供為可表現之RNA或蛋白質，使得在轉基因細胞中不出現轉座酶之長期表現。根據實施例可使用任何轉座酶系統。在其他態樣中，可用慢病毒屬感染細胞以有利於CAR編碼序列及犬尿胺酸酶編碼序列整合至細胞之基因體中。

在一個實施例中，提供包含犬尿胺酸酶或編碼犬尿胺酸酶之核酸的組合物，其用於治療個體之腫瘤。在另一實施例中，提供犬尿胺酸酶或編碼犬尿胺酸酶之核酸在製造用於治療腫瘤之藥劑中的用途。犬尿胺酸酶可為實施例之任何犬尿胺酸酶。

在本發明之方法及/或組合物之上下文中論述之實施例可相對於本文所述之任何其他方法或組合物採用。因此，屬於一種方法或組合物之實施例亦可應用於本發明之其他方法及組合物。

如本文所用之「基本上不含」就指定組分而言在本文中用於意指沒有指定組分被有目的地調配成組合物及/或僅作為污染物或以痕量存在。由組合物之任何非預期污染引起之指定組分之總量較佳低於0.01%。最佳者係其中用標準分析方法不能檢測到任何指定組分之量的組合物。

如本文說明書及申請專利範圍中所用之「一(a或an)」意指一或多個。如本文說明書及申請專利範圍中所用，當與詞語「包含」一起使用時，詞語「一(a或an)」可意指一個或多於一個。如本文說明書及申請專利範圍中所用，「另一」或「又一」可意指至少第二或更多。

如本文說明書及申請專利範圍中所用之術語「約」用於指示，值包括器件之固有誤差變化(該方法用於測定值)，或者存在於研究標的物中之變化。

據以下詳細說明，本發明之其他目的、特徵及優點將變得顯而易見。然而，應理解，詳細說明及具體實例雖然指示本發明之某些實施例，但僅藉助說明給出，此乃因熟習此項技術者自此詳細說明將明瞭在本發明之精神及範圍內之各種改變及修改。

本申請案主張於2018年4月16日提出申請之美國臨時專利申請案號62/658,261之權益，其全文以引用方式併入本文中。

本發明係在國立衛生研究院授予之批准號R01 CA154754之政府支持下完成。美國政府在本發明中享有一定之權利。I. 本實施例

在某些實施例中，本揭示案提供犬尿胺酸酶(Kynase)，一種Kyn耗竭酶。特別地，本申請案提供與野生型人類犬尿胺酸酶相比，對犬尿胺酸降解顯示至少高100倍之催化活性之一組人類犬尿胺酸酶變異體。在一些態樣中，本文提供之犬尿胺酸酶變異體另外具有增加之對血清中失活之抗性。因此，該等酶具有顯著改善之性質，該等性質使得其對於治療性疾病介入(例如癌症之治療)係理想的。在一些態樣中，酶(或編碼酶之序列)可用於治療癌症患者，如具有IDO1及/或TDO2表現腫瘤之彼等患者。

在本研究中，人類Kynase (h-KYNase)已成功地經工程改造以展現相對於WT酶大大改善之對Kyn之催化活性及穩定性，且在小鼠中達成耐久之血漿Kyn耗竭。在CT26及B16-IDO模型中亦展現單一藥劑及PD1組合效能優於主要IDO1抑制劑Epacadostat，且所得之完全反應者(CR)對腫瘤再攻擊具有抗性。腫瘤免疫分型揭示在HsKYN +/- PD1治療時IFNg標記基因表現及M1/M2巨噬細胞比率之上調。主要HsKYN變異體在大鼠及非人類靈長類動物中顯示有利的Kyn降解及PK特徵，且可用於治療癌症，例如其中IDO1及/或TDO2路徑起免疫抑制作用之癌症。II. 定義

如本文所用術語「蛋白質」及「多肽」係指包含經由肽鍵接合之胺基酸的化合物且可互換使用。

如本文所用術語「融合蛋白」係指含有以非天然方式可操作連接之蛋白質或蛋白質片段的嵌合蛋白。

如本文所述術語「半衰期」(½-生命)係指例如在哺乳動物中注射後其多肽濃度在活體外或活體內下降一半所需之時間。

術語「以可操作組合」、「以可操作順序」及「可操作連接」係指其中所述組分處於允許其以其預期方式起作用之關係的鏈接，例如，以核酸分子能夠指導給定基因之轉錄及/或期望蛋白質分子之合成的方式之核酸序列之鏈接，或以產生融合蛋白之方式的胺基酸序列之鏈接。

術語「連接體」意指作為可操作地連接兩個不同分子之分子橋之化合物或部分，其中連接體之一部分可操作連接至第一分子，且其中連接體之另一部分可操作連接至第二分子。

術語「聚乙二醇化」係指與聚乙二醇(PEG)結合，鑒於其高度生物相容性及易於修飾，其已廣泛用作藥物載劑。PEG可經由化學方法藉由PEG鏈末端之羥基與活性劑偶合(例如，共價連接)；然而，PEG本身每分子限於至多兩種活性劑。在另一方法中，PEG及胺基酸之共聚物已經被探索作為新穎生物材料，其將保留PEG之生物相容性，但每個分子將具有多個連接點之附加優點(從而提供更大之載藥量)，且可以合成方式經設計以適應各種應用。

術語「基因」係指包含產生多肽或其前體所必需之控制及編碼序列的DNA序列。多肽可由全長編碼序列或編碼序列之任一部分編碼，以便保留期望酶活性。

術語「天然」係指當自天然來源分離時基因、基因產物或該基因或基因產物之特徵的典型形式。天然形式係在自然群體中最常觀察到之形式，且因此被任意地命名為正常或野生型形式。相比之下，術語「經修飾」、「變異體」或「突變體」係指當與天然基因或基因產物相比時，顯示序列及功能性質(亦即，改變之特徵)之修飾的基因或基因產物。

術語「載體」用於指載體核酸分子，其中可插入核酸序列以引入可被複製之細胞中。核酸序列可為「外源的」，此意指其對於引入載體之細胞係外源的，或者序列與細胞中之序列同源但在其中通常未發現序列之宿主細胞核酸內之位置。載體包括質體、黏粒、病毒(噬菌體、動物病毒及植物病毒)及人工染色體(例如，YAC)。熟習此項技術者可經由標準重組技術將載體充分配備至構築體。

術語「表現載體」係指任何類型之遺傳構築體，其包含編碼能夠被轉錄之RNA之核酸。在一些情形下，RNA分子接著翻譯成蛋白質、多肽或肽。在其他情形下，該等序列例如在反義分子或核酶之產生中不被翻譯。表現載體可含有多種「控制序列」，其係指在特定宿主細胞中轉錄及可能翻譯可操作連接編碼序列所必需的核酸序列。除了管控轉錄及翻譯之控制序列外，載體及表現載體可含有亦用於其他功能且在下文中闡述之核酸序列。

如本文所用之術語「治療有效量」係指用於實現治療效應之方法中之細胞及/或治療組合物(例如治療性多核苷酸及/或治療性多肽)的量。如貫穿本申請案中使用之術語「治療有益益處」或「治療有效」係指相對於此病況之醫學治療促進或增強個體健康狀況之任何事物。此包括(但不限於)降低疾病之體征或症狀之頻率或嚴重程度。舉例而言，癌症之治療可能涉及(例如)腫瘤大小之減小、腫瘤侵襲性之降低、癌症生長速度之降低或轉移之預防。癌症之治療亦可以指延長患有癌症之個體之存活期。

如本文所用術語「K _M 」係指酶之Michaelis-Menten常數，且定義為特定受質之濃度，在該濃度下給定之酶在酶催化反應中產生其最大速度之一半。本文所用術語「k _cat 」係指每單位時間每個酶位點轉化為產物之轉換數或受質分子數，且其中酶以最大效率起作用。如本文所用術語「k _cat /K _M 」係特異性常數，其係酶將受質轉化為產物之效率的量度。

如本文所用術語「嵌合抗原受體(CAR)」可以指例如人工T細胞受體、嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體，且涵蓋將人工特異性移植至特定免疫效應細胞中之經工程改造之受體。CAR可用於將單株抗體之特異性賦予T細胞，從而允許產生大量特異性T細胞，例如，用於過繼細胞療法。在具體實施例中，例如，CAR將細胞之特異性指向腫瘤相關抗原。在一些實施例中，CAR包含細胞內激活結構域、跨膜結構域及包含腫瘤相關抗原結合區之細胞外結構域。在特定態樣，CAR包含源自單株抗體(例如全文以引用方式併入本文中之美國專利7,109,304中所述之彼等抗體)之單鏈可變片段(scFv)與CD3-ζ跨膜及胞內結構域融合的融合物。其他CAR設計之特異性可源自受體(例如，肽)之配位體或源自模式識別受體，例如Dectin。在特定實施例中，可藉由使用對B譜系分子CD19具有特異性之CAR重定向T細胞之特異性來靶向惡性B細胞。在某些情形下，可修飾抗原識別結構域之間隔以減少激活誘導之細胞死亡。在某些情形下，CAR包含用於額外共刺激信號傳導之結構域，例如CD3-ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10及/或OX40。在一些情形下，分子可與CAR共表現，包括共刺激分子、用於成像(例如，用於正電子發射斷層攝影術)之報導基因、在添加前藥時有條件地消融T細胞之基因產物、歸巢受體、趨化介素、趨化介素受體、細胞介素及細胞介素受體。

「治療(Treatment及treating)」係指出於獲得疾病或健康相關病況之治療益處之目的，向個體投與或應用治療劑或對個體實施程序或方式。舉例而言，治療可包括投與醫藥有效量之犬尿胺酸酶。

「個體」及「患者」係指人類或非人類，例如靈長類動物、哺乳動物及脊椎動物。在特定實施例中，個體為人類。III. 犬尿胺酸酶多肽

一些實施例係關於經修飾之蛋白質及多肽。特定實施例係關於展現至少一種與未經修飾形式相當之功能活性、較佳犬尿胺酸降解活性的經修飾之蛋白質或多肽。在其他態樣中，可進一步修飾蛋白質或多肽以增加血清穩定性。因此，當本申請案係關於「經修飾之蛋白質」或「經修飾之多肽」之功能或活性時，熟習此項技術者將理解，此包括(例如)具有超過未經修飾之蛋白質或多肽的額外優點(例如犬尿胺酸降解活性或熱力學穩定性)的蛋白質或多肽。

活性之測定可使用熟習此項技術者熟悉之分析來實現，特別是關於蛋白質之活性，且出於比較目的可包括使用經修飾或未經修飾之蛋白質或多肽的天然及/或重組形式。

在某些實施例中，經修飾之多肽(例如經修飾之犬尿胺酸酶)可基於其在犬尿胺酸中之增加來鑑別。舉例而言，可鑑別未經修飾之多肽之受質識別位點。此鑑別可基於結構分析或同源性分析。可產生涉及該等受質識別位點之修飾的突變體群體。在又一實施例中，具有增加之犬尿胺酸降解活性之突變體可選自突變體群體。期望突變體之選擇可包括諸如檢測來自犬尿胺酸降解之副產物或產物等方法。

經修飾之蛋白質可具有胺基酸之缺失及/或取代；因此，具有缺失之蛋白質、具有取代之蛋白質及具有缺失及取代之蛋白質係經修飾之蛋白質。在一些實施例中，該等經修飾之蛋白可進一步包括插入或添加之胺基酸，例如與融合蛋白或具有連接體之蛋白質。「經修飾之缺失蛋白質」缺少天然蛋白質之一或多個殘基，但可具有天然蛋白質之特異性及/或活性。「經修飾之缺失蛋白質」亦可具有降低之免疫原性或抗原性。經修飾之缺失蛋白質之實例為具有自至少一個抗原性區(亦即經測定在特定生物體、例如可投與經修飾之蛋白質之類型之生物體中具有抗原性之蛋白質的區)缺失之胺基酸殘基的蛋白質。

取代或置換變異體通常含有在蛋白質內之一或多個位點處將一種胺基酸交換為另一種，且可經設計以調節多肽之一種或多種性質，特別是其效應物能及及生物利用度。取代可為保守的或可不為保守的，亦即一個胺基酸經具有相似形狀及電荷之一個胺基酸置換。保守取代為業內所熟知且包括(例如)以下變化：丙胺酸至絲胺酸；精胺酸至離胺酸；天冬醯胺至麩醯胺酸或組胺酸；天冬胺酸鹽至麩胺酸鹽；半胱胺酸至絲胺酸；麩醯胺酸至天冬醯胺；麩胺酸鹽至天冬胺酸鹽；甘胺酸至脯胺酸；組胺酸至天冬醯胺或麩醯胺酸；異白胺酸至白胺酸或纈胺酸；白胺酸至纈胺酸或異白胺酸；離胺酸至精胺酸；甲硫胺酸至白胺酸或異白胺酸；苯丙胺酸至酪胺酸、白胺酸或甲硫胺酸；絲胺酸至蘇胺酸；蘇胺酸至絲胺酸；色胺酸至酪胺酸；酪胺酸至色胺酸或苯丙胺酸；及纈胺酸至異白胺酸或白胺酸。

除了缺失或取代之外，經修飾之蛋白質可具有殘基之插入，其通常涉及在多肽中添加至少一個殘基。此可包括靶向肽或多肽之插入或僅包括單個殘基。下文論述稱為融合蛋白之末端添加物。

術語「生物學功能等效物」在業內係公知的且在本文中進一步詳細定義。因此，包括具有約70%至約80%或約81%至約90%或甚至約91%至約99%與對照多肽之胺基酸一致或功能上等效的胺基酸之序列，前提係維持蛋白質之生物活性。在某些態樣中，經修飾之蛋白質在生物學上可在功能上等效於其天然對應體。

亦應理解，胺基酸及核酸序列可包括額外殘基，例如額外N-或C-末端胺基酸或5'或3'序列，但仍基本上如本文揭示之序列中之一者所示，只要序列符合上述標準，包括維持與蛋白質表現有關之生物蛋白質活性。末端序列之添加特別適用於核酸序列，其可(例如)包括側接編碼區之5'或3'部分中之任一者之各種非編碼序列或可包括各種內部序列，亦即，已知在基因內出現之內含子。

在某些實施例中，根據實施例之犬尿胺酸酶包含與SEQ ID NO: 1、2或3之犬尿胺酸酶具有至少約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列。在其他態樣中，犬尿胺酸酶與SEQ ID NO: 1、2或3之犬尿胺酸酶具有至少約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，且包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個選自由以下組成之群之胺基酸取代：L8P、K38E、Y47L、I48F、K50Q、I51M、S60N、K64N、D65G、E66K、N67D、N67P、D67S、A68F、A68T、A68V、F71L、F71M、L72N、K84E、E88N、E89K、E89S、E90Q、D92E、K93N、K93T、A95H、A95Q、K96N、I97H、I97L、I97V、A98G、A99G、A99I、A99R、A99S、A99T、A99V、Y100N、Y100S、Y100T、G101A、H102W、E103F、E103H、E103N、E103Q、E103R、E103V、E103W、V104D、V104E、V104F、V104H、V104K、V104L、V104R、G105A、G105H、G105S、G105T、E106D、K106D、K106E、K106H、K106N、R107P、R107S、P108R、I110A、I110F、I110L、I110M、I110T、T111D、T111H、T111N、T111R、G112A、G112C、G112D、G112K、G112L、G112M、G112Q、G112R、G112S、G112T、G112Y、N127K、I131V、A132V、L133V、A136T、L137T、T138S、N140D、H142Q、Q14R、Y156H、K163T、D168E、H169R、Q175L、I183F、I183L、I183P、I183S、E184A、E184D、E184R、E184T、E184V、E185T、M187L、M189I、K191A、K191G、K191H、K191M、K191N、K191R、K191S、K191T、K191W、E197A、E197D、E197F、E197K、E197M、E197Q、E197S、E197T、E197V、I201C、I201E、I201F、I201H、I201L、I201S、I201T、I201V、H203K、L219M、L219W、F220L、V223I、F225Y、H230F、H230L、H230Y、N232S、Y246F、F249W、D250E、S274A、S274C、S274G、S274N、S274T、L278M、A280G、A280S、A280T、G281S、A282M、A282P、G284N、I285L、V303L、V303S、F306W、F306Y、S311N、K315E、D317E、D317K、I331C、I331L、I331N、I331S、I331T、I331V、N333T、P334N、P335T、L337T、L338A、L338Q、S341I、K373E、K373N、N375A、N375H、Y376C、Y376F、Y376L、K378G、K378P、K378Q、K378R、K380G、K380S、A382G、A382R、A382T、T383S、K384G、K384N、P386K、P386S、V387L、N389E、I405L、F407Y、S408D、S408N、N411R、D413S、D413V、Q416T、E419A、E419L、K420E、R421N、V424I、K427M、N429E、G432A及A436T。在其他態樣中，犬尿胺酸酶與表1中提供之犬尿胺酸酶中之一者具有至少約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在特定態樣中，犬尿胺酸酶係選自表1中提供之彼等犬尿胺酸酶中之一者。在一些態樣中，例如根據表1之犬尿胺酸酶可經聚乙二醇化或可未經聚乙二醇化。

下表1列出了可與本揭示案之組合物及方法連同使用之各種犬尿胺酸酶。儘管未在表1中明確列出，但「蛋白質(1)」在本文中係指野生型人類犬尿胺酸酶，其胺基酸序列在SEQ ID NO: 1中示出。表 1 ：實施例之例示性犬尿胺酸酶。

IV. 療法之酶促犬尿胺酸降解

在某些態樣中，多肽可用於治療疾病，包括對犬尿胺酸耗竭敏感之癌症，利用耗竭犬尿胺酸之酶，以防止腫瘤介導之致耐受性效應且反而介導腫瘤消融促發炎反應。在某些態樣中，預計犬尿胺酸酶用於治療表現IDO1、IDO2及/或TDO之腫瘤。

本發明之某些態樣提供用於治療疾病(例如腫瘤)之經修飾之犬尿胺酸酶。特別地，經修飾之多肽可具有人類多肽序列且因此可預防人類患者中之過敏反應，允許重複給藥，且提高治療效能。

本發明治療方法有用之腫瘤包括任何惡性細胞類型，例如在實體瘤或血液腫瘤中發現之彼等腫瘤。例示性實體腫瘤可包括(但不限於)選自胰臟、結腸、盲腸、胃、腦、頭、頸、卵巢、腎、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、前列腺及乳房之器官之腫瘤。例示性血液腫瘤包括骨髓、T或B細胞惡性病、白血病、淋巴瘤、胚細胞瘤、骨髓瘤及諸如此類之腫瘤。可使用本文提供之方法治療之癌症的其他實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤、白血病、鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺之腺癌及肺之鱗狀癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric或stomach cancer) (包括胃腸癌及胃腸基質癌)、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney或renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、各種類型之頭頸癌、黑色素瘤、表淺擴散性黑色素瘤、雀斑樣惡性黑色素瘤、肢端雀斑樣黑色素瘤、結節性黑色素瘤以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma) (NHL)；小淋巴球(SL) NHL；中間級/濾泡性NHL；中間級瀰漫性NHL；高級免疫母細胞性NHL；高級淋巴母細胞性NHL；高級小的非裂解細胞NHL；巨大疾病NHL；外套細胞淋巴瘤；AIDS有關之淋巴瘤；及瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia))、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、毛細胞白血病、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(AML)及慢性骨髓母細胞性白血病。

癌症可具體屬於以下組織學類型，但不限於該等：惡性腫瘤；癌；未分化型癌；巨大及梭形細胞癌；小細胞癌；乳頭狀癌；鱗狀細胞癌；淋巴上皮癌；基底細胞癌；毛基質癌；移行細胞癌；乳突狀移行細胞癌；腺癌；惡性胃泌素瘤；膽道癌；肝細胞癌；合併肝細胞癌及膽道癌；小樑性腺癌；腺樣囊性癌；腺瘤性息肉中之腺癌；腺癌，家族性結腸息肉病；實體癌；惡性類癌腫瘤；細支氣管肺泡腺癌；乳頭狀腺癌；難染性癌；嗜酸性球癌；噬氧性腺癌；嗜鹼性球癌；透明細胞腺癌；粒細胞癌；濾泡性腺癌；乳突狀及濾泡性腺癌；非包裹性硬化型癌；腎上腺皮質癌；子宮內膜樣癌；皮膚附件癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聹性腺癌；黏液表皮樣癌；囊腺癌；乳突狀囊腺癌；乳突狀漿液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液腺癌；戒環細胞癌；浸潤性導管癌；髓樣癌；小葉癌；發炎癌；乳房佩吉特氏病(paget's disease)；腺泡細胞癌；腺鱗狀癌；腺癌伴隨鱗狀轉移瘤；惡性胸腺瘤；惡性卵巢基質瘤；惡性泡膜細胞瘤；惡性粒層細胞瘤；惡性雄胚瘤；支持細胞癌；惡性萊迪希氏細胞(leydig cell)腫瘤；惡性脂質細胞瘤；惡性副神經節瘤；惡性乳房外副神經節瘤；嗜鉻細胞瘤；血管球肉瘤；惡性黑色素瘤；無黑色素性黑色素瘤；表淺擴散性黑色素瘤；巨大色素痣中之惡性黑色素瘤；上皮樣細胞黑色素瘤；惡性藍痣；肉瘤；纖維肉瘤；惡性纖維性組織細胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎型橫紋肌肉瘤；小泡型橫紋肌肉瘤；基質肉瘤；惡性混合瘤；苗勒混合瘤(mullerian mixed tumor)；腎母細胞瘤；肝母細胞瘤；癌肉瘤；惡性間葉瘤；惡性勃勒納瘤(brenner tumor)；惡性葉狀瘤；滑膜肉瘤；惡性間皮瘤；無性細胞瘤；胚胎性癌；惡性畸胎瘤；惡性卵巢甲狀腺腫；絨毛膜癌；惡性中腎瘤；血管肉瘤；惡性血管內皮瘤；卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)；惡性血管外皮細胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮質骨肉瘤；軟骨肉瘤；惡性軟骨母細胞瘤；間葉型軟骨肉瘤；骨巨細胞瘤；尤因氏肉瘤(ewing's sarcoma)；惡性牙源性腫瘤；成釉細胞牙肉瘤；惡性成釉細胞瘤；造釉纖維肉瘤；惡性松果體瘤；脊索瘤；惡性神經膠質瘤；室管膜瘤；星細胞瘤；原形質星細胞瘤；原纖維性星細胞瘤；星形母細胞瘤；神經膠母細胞瘤；寡樹突神經膠細胞瘤；成少突神經膠質細胞瘤；原始神經胚外層瘤；小腦肉瘤；神經節成神經細胞瘤；神經胚細胞瘤；視網膜母細胞瘤；嗅覺神經瘤；惡性腦脊髓膜瘤；神經纖維肉瘤；惡性神經鞘瘤；惡性顆粒細胞瘤；惡性淋巴瘤；霍奇金氏病(hodgkin's disease)；霍奇金氏；類肉芽腫；小淋巴球性惡性淋巴瘤；大細胞瀰漫性惡性淋巴瘤；濾泡性惡性淋巴瘤；蕈樣肉芽腫病；其他指定型非霍奇金氏淋巴瘤；惡性組織球增生症；多發性骨髓瘤；肥胖細胞肉瘤；免疫增生小腸疾病；白血病；淋巴性白血病；漿細胞性白血病；紅血球性白血病；淋巴肉瘤細胞白血病；骨髓性白血病；嗜鹼性球性白血病；嗜酸性球性白血病；單核球性白血病；肥胖細胞白血病；巨核細胞白血病；骨髓肉瘤；及毛細胞白血病。

犬尿胺酸酶可在本文中以各種方式用作抗腫瘤劑，用於自腫瘤組織耗竭犬尿胺酸及/或犬尿胺酸源代謝物，或患有癌症之哺乳動物之循環，或用於耗竭犬尿胺酸，其中犬尿胺酸之耗竭被認為係其期望的。

耗竭在哺乳動物之循環中可在活體內執行，在期望組織培養基或其他生物培養基中之犬尿胺酸及/或犬尿胺酸源代謝物耗竭之情形下在活體外執行，且若生物體液、細胞或組織在體外被操縱且隨後返回至患者哺乳動物之身體則以離體程序執行。自循環、培養基、生物體液或細胞中耗竭犬尿胺酸可減少欲處理之材料可及之犬尿胺酸的量，且因此包括使欲耗竭之材料與犬尿胺酸耗竭量的犬尿胺酸酶在犬尿胺酸耗竭條件下接觸，以便降解所接觸材料中之環境犬尿胺酸。

耗竭可針對細胞之營養源，而不一定針對細胞本身。因此，在活體內應用中，處理腫瘤細胞包括使腫瘤細胞群體之營養培養基與犬尿胺酸酶接觸。在此實施例中，培養基可為期望犬尿胺酸耗竭之血液、淋巴液、脊髓液及諸如此類體液。

犬尿胺酸-及/或犬尿胺酸源代謝物耗竭效率可根據應用而廣泛變化，且通常取決於材料中存在之犬尿胺酸之量、期望耗竭速率以及暴露於犬尿胺酸酶之材料之耐受性。材料中之犬尿胺酸及犬尿胺酸代謝物水準及因此犬尿胺酸及犬尿胺酸代謝物自材料中耗竭之速率可容易地藉由業內熟知之各種化學及生化方法監測。例示性犬尿胺酸耗竭量在本文中進一步產生，且範圍可為0.001至100單位(U)之犬尿胺酸，較佳約0.01至10 U，且更較佳約0.1至5 U之犬尿胺酸酶/毫升(mL)欲處理之材料。典型劑量可基於體重投與，且在約5-1000 U/公斤(kg)/天、較佳約5-100 U/kg/天、更佳約10-50 U/kg/天且更佳約20-40 U/kg/天之範圍內。

犬尿胺酸耗竭條件為與犬尿胺酸酶之生物活性相容之緩衝液及溫度條件，且包括與酶相容之適當溫度、鹽及pH條件，例如生理條件。例示性條件包括約4-40℃，離子強度等效於約0.05至0.2 M NaCl，且pH約為5至9，同時包括生理條件。

在特定實施例中，本發明涵蓋使用犬尿胺酸酶作為抗腫瘤劑之方法，且因此包括使腫瘤細胞群體與治療有效量之犬尿胺酸酶接觸足以抑制腫瘤細胞生長之時間段。

犬尿胺酸酶之治療有效量係經計算以實現期望效應，亦即耗竭腫瘤組織或患者之循環中之犬尿胺酸且從而介導腫瘤消融促發炎反應的預定量。因此，本發明之犬尿胺酸酶之投與之劑量範圍為足以產生期望效應之彼等劑量，其中腫瘤細胞分裂及細胞循環之症狀減少。劑量不應太大，以致引起不良副作用，例如，高黏稠度症候群、肺水腫、鬱血性心臟衰竭神經學影響及諸如此類。通常，劑量將隨患者之年齡、疾病狀況、性別及疾病程度而變化，且可由熟習此項技術者確定。倘若出現任何併發症，則個體醫師可調整劑量。

犬尿胺酸酶可藉由注射或藉由隨時間逐漸輸注非經腸投與。犬尿胺酸酶可經靜脈內、腹膜內、經口、肌內、皮下、腔內、經皮、經表皮可藉由蠕動方式遞送，可直接注射至含有腫瘤細胞之組織中，或可以藉由連接至導管之幫浦來投與，該導管可含有犬尿胺酸之潛在生物感測器。

含有犬尿胺酸酶之治療組合物係靜脈內投與，例如藉由注射單位劑量靜脈內投與。術語「單位劑量」當用於治療組合物時係指適合作為個體之單式劑量之物理上離散的單位，每個單位含有經計算可產生期望治療效應之預定量之活性物質以及所需稀釋劑，亦即載劑或媒劑。

組合物以與劑量調配相容之方式且以治療有效量投與。欲投與之量取決於欲治療之個體、個體系統利用活性成分之能力及期望治療效應之程度。需要投與之精確活性成分量取決於從業者之判斷且為每一個體所特有的。然而，本文揭示全身應用之適宜劑量範圍，且其取決於投與之途徑。亦涵蓋初始投與及加強注射之適宜方案且其典型為初始投與，之後藉由隨後之注射或其他投與以一或多個小時間隔重複劑量。本文闡述例示性多次投與，且尤其係連續維持犬尿胺酸之高血清及組織水準，且相反地維持犬尿胺酸之低血清及組織水準。或者，涵蓋足以維持血液中之濃度在活體內療法所指定之範圍內的連續靜脈內輸注。V. 結合物

本發明之組合物及方法涉及例如藉由與異源肽區段或聚合物(例如聚乙二醇)形成結合物的經修飾之犬尿胺酸酶。在其他態樣中，犬尿胺酸酶可與PEG連接以增加酶之流體動力學半徑且從而延長血清持久性。在某些態樣中，所揭示之多肽可與任何靶向劑(例如具有在腫瘤細胞上特異性及穩定地結合外部受體或結合位點之配位體)結合(美國專利公開案2009/0304666)。A. 融合蛋白

本發明之某些實施例係關於融合蛋白。該等分子可具有在N-或C-末端與異源結構域連接之天然或經修飾之犬尿胺酸酶。舉例而言，融合物亦可採用來自其他物種之前導序列以允許蛋白質在異源宿主中重組表現。另一有用之融合物包括添加蛋白親和力標籤(例如血清白蛋白親和力標籤或六組胺酸殘基)，或免疫活性結構域(例如抗體抗原決定基，較佳可裂解之抗體抗原決定基)，以有利於融合蛋白之純化。非限制性親和力標籤包括聚組胺酸、幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)及麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)。

在特定實施例中，犬尿胺酸酶可與延長活體內半衰期之肽(例如XTEN多肽) (Schellenberger等人，2009)、IgG Fc結構域、白蛋白或白蛋白結合肽連接。

產生融合蛋白之方法為熟習此項技術者所熟知。該等蛋白質可藉由(例如)重新合成完全融合蛋白或藉由連接編碼異源結構域之DNA序列、之後表現完整融合蛋白來產生。

藉由將基因與編碼肽連接體之橋接DNA區段連接，可以促進產生恢復親本蛋白質功能活性之融合蛋白，該連接體在串聯連接之多肽之間剪接。連接體之長度足以允許所得融合蛋白之適當摺疊。B. 聚乙二醇化

在本發明之某些態樣中，揭示與犬尿胺酸之聚乙二醇化有關之方法及組合物。舉例而言，犬尿胺酸可根據本文揭示之方法經聚乙二醇化。

聚乙二醇化為聚(乙二醇)聚合物鏈與另一分子(通常為藥物或治療性蛋白質)共價連接之過程。藉由培育PEG之反應性衍生物與靶大分子來常規地實現聚乙二醇化。PEG與藥物或治療性蛋白質之共價連接可「遮蔽」藥劑遠離宿主之免疫系統(降低之免疫原性及抗原性)或增加藥劑之流體動力學大小(溶液中之大小)，此藉由降低腎清除率延長其循環時間。聚乙二醇化亦可為疏水藥物及蛋白質提供水溶性。

聚乙二醇化之第一步驟為PEG聚合物在一個或兩個末端之適宜官能化。在每個末端用相同反應性部分激活之PEG稱為「同雙官能」，而若存在之官能基不同，則PEG衍生物稱為「異雙官能」或「異官能」。製備PEG聚合物之化學活性或激活衍生物以將PEG連接至期望分子。

適用於PEG衍生物之官能基之選擇係基於將與PEG偶合之分子上之可用反應性基團之類型。對於蛋白質，典型之反應性胺基酸包括離胺酸、半胱胺酸、組胺酸、精胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸。亦可使用N-末端胺基及C-末端羧酸。

用於形成第一代PEG衍生物之技術通常為使PEG聚合物與和羥基反應之基團(通常酸酐、醯氯、氯仿及碳酸酯)反應。在第二代聚乙二醇化學中，更有效之官能基(例如醛、酯、醯胺等)可用於結合。

隨著聚乙二醇化之應用變得愈來愈先進及複雜，對結合之異雙官能PEG之需求已經增加。該等異雙官能PEG在連接兩個實體方面非常有用，其中需要親水、撓性及生物相容型間隔物。異雙官能PEG之較佳端基為馬來醯亞胺、乙烯基碸、吡啶基二硫化物、胺、羧酸及NHS酯。

最常見之修飾劑或連接體係基於甲氧基PEG (mPEG)分子。其活性取決於向醇末端添加蛋白質修飾基團。在一些情況下，聚乙二醇(PEG二醇)用作前體分子。隨後在兩端修飾二醇以製備異聚體或均二聚體PEG連接之分子。

蛋白質通常在親核位點(例如未質子化之硫醇(半胱胺醯基殘基)或胺基)經聚乙二醇化。半胱胺醯基特異性修飾試劑之實例包括PEG馬來醯亞胺、PEG碘乙酸酯、PEG硫醇及PEG乙烯基碸。所有四種在在溫和條件及中性至略微鹼性之pH下皆具有強烈半胱胺醯基特異性，但每種皆具有一些缺點。與馬來醯亞胺形成之硫醚在鹼性條件下可能有些不穩定，因此用此連接體可能對調配物選擇有一些限制。與碘PEG形成之硫代胺基甲酸酯鍵更穩定，但游離碘可在一些條件下修飾酪胺酸殘基。PEG硫醇與蛋白質硫醇形成二硫鍵，但此鏈接在鹼性條件下亦可能不穩定。與馬來醯亞胺及碘PEG相比，PEG-乙烯基反應性相對較慢；然而，形成之硫醚鏈接極為穩定。其較慢之反應速率亦可使PEG-乙烯基碸反應更容易控制。

由於天然半胱胺醯基殘基通常呈二硫鍵之形式或為生物活性所必需，因此很少在該等殘基處實施位點特異性聚乙二醇化。另一方面，定點誘變可用於為硫醇特異性連接體納入半胱胺醯基聚乙二醇化位點。必須設計半胱胺酸突變，使得其對聚乙二醇化試劑可及且在聚乙二醇化後仍具有生物活性。

胺特異性修飾劑包括PEG NHS酯、PEG甲苯磺酸酯、PEG醛、PEG異硫氰酸酯及其他幾種。所有皆在溫和條件下反應且對胺基極具特異性。PEG NHS酯可能為反應性較強之試劑之一；然而，其高反應性可使聚乙二醇化反應難以大規模控制。PEG醛與胺基形成亞胺，其接著經氰基硼氫化鈉還原為二級胺。與硼氫化鈉不同，氰基硼氫化鈉不會還原二硫鍵。然而，此化學物質毒性很大且必須小心處理，特別是在較低pH下，其會揮發。

由於大多數蛋白質上存在多個離胺酸殘基，故位點特異性聚乙二醇化可能為挑戰。幸運的是，由於該等試劑與未質子化之胺基反應，故可藉由在較低pH下實施反應將聚乙二醇化合物引導至低-pK胺基。通常，α-胺基之pK比離胺酸殘基之ε-胺基低1-2個pH單位。藉由在pH 7或更低pH下聚乙二醇化分子，可以經常獲得對N-末端之高選擇性。然而，僅當蛋白質之N-末端部分並非生物活性所必需的時，此才係可行的。此外，來自聚乙二醇化之藥物動力學益處經常超過活體外生物活性之顯著損失，從而導致產品具有遠更大之活體內生物活性，而不管聚乙二醇化學如何。

在研發聚乙二醇化程序時，有若干參數需要考慮。幸運的是，通常有不超過四個或五個關鍵參數。對聚乙二醇化條件之最佳化之「實驗之設計」方法可為極為有用的。對於硫醇特異性聚乙二醇化反應，欲考慮之參數包括：蛋白質濃度、PEG對蛋白質比率(基於莫耳濃度)、溫度、pH、反應時間，且在一些情況下排除氧。(氧可促進蛋白質形成分子間二硫鍵，此會降低聚乙二醇化產物之產率。)特別是當靶向N-末端胺基時，除了pH可能更為關鍵外，應考慮相同之因素(除氧氣外)進行胺特異性修飾。

對於胺及硫醇特異性修飾，反應條件可能影響蛋白質之穩定性。此可能會限制溫度、蛋白質濃度及pH。另外，在開始聚乙二醇化反應之前，應知曉PEG連接體之反應性。舉例而言，若聚乙二醇化劑之活性僅為70%，則所用PEG之量應確保在蛋白質對PEG反應之化學計量中僅計數活性PEG分子。VI. 蛋白質及肽

在某些實施例中，本發明係關於包含至少一種蛋白質或肽(例如犬尿胺酸酶)之新穎組合物。該等肽可包含在融合蛋白中或與如上文文獻所述之試劑結合。

如本文所用，蛋白質或肽通常係指(但不限於)大於約200個胺基酸、高達自基因翻譯之全長序列的蛋白質；大於約100個胺基酸之多肽；及/或約3至約100個胺基酸之肽。為方便起見，術語「蛋白質」、「多肽」及「肽」在本文中可互換使用。

如本文所用，「胺基酸殘基」係指任何天然胺基酸、任何胺基酸衍生物或業內已知之任何胺基酸模擬物。在某些實施例中，蛋白質或肽之殘基係連續的，無任何非胺基酸中斷胺基酸殘基之序列。在其他實施例中，序列可包含一個或多個非胺基酸部分。在特定實施例中，蛋白質或肽之殘基序列可由一或多個非胺基酸部分中斷。

因此，術語「蛋白質或肽」涵蓋包含天然蛋白質中發現之20種常見胺基酸中之至少一種或至少一種經修飾或不常見之胺基酸的胺基酸序列。

蛋白質或肽可藉由熟習此項技術者已知之任何技術製備，該等技術包括經由標準分子生物學技術表現蛋白質、多肽或肽，自天然來源分離蛋白質或肽，或化學合成蛋白質或肽。先前已揭示對應於各種基因之核苷酸及蛋白質、多肽及肽序列，且可在熟習此項技術者已知之計算機化資料庫中發現。一種該資料庫係國家生物技術資訊中心之Genbank及GenPept資料庫(可自全球資訊網在ncbi.nlm.nih.gov/獲得)。可使用本文揭示之技術或如熟習此項技術者已知擴增及/或表現已知基因之編碼區。或者，熟習此項技術者已知蛋白質、多肽及肽之各種商業製劑。VII. 核酸及載體

在本發明之某些態樣中，可揭示編碼犬尿胺酸酶或含有犬尿胺酸酶之融合蛋白的核酸序列。根據使用之表現系統，可基於習用方法選擇核酸序列。舉例而言，若犬尿胺酸酶係源自人類犬尿胺酸酶且含有大腸桿菌中很少使用之多個密碼子，則其可能會干擾表現。因此，其各別基因或變異體可經密碼子最佳化用於大腸桿菌表現。各種載體亦可用於表現感興趣之蛋白質。例示性載體包括(但不限於)質體載體、病毒載體、轉位子或基於脂質體之載體。VIII. 宿主細胞

宿主細胞可為任何可經轉化以允許犬尿胺酸酶及其結合物表現及分泌的細胞。宿主細胞可為細菌、哺乳動物細胞、酵母或絲狀真菌。各種細菌包括埃希氏菌屬(Escherichia )及芽孢桿菌屬(Bacillus) 。發現屬於酵母菌屬(Saccharomyces )或畢赤酵母屬(Pichia )之酵母可用作適當的IX. 醫藥組合物

預計新穎犬尿胺酸酶可全身或局部投與以在患有局部晚期或轉移性癌症之癌症患者中抑制腫瘤細胞生長且最佳地殺死癌細胞。其可經靜脈內、鞘內及/或腹膜內投與。其可單獨或與抗增殖藥物組合投與。在一個實施例中，其係在手術或其他程序之前投與以減少患者中之癌症負荷。或者，其可在手術後投與以確保任何剩餘之癌症(例如，手術未能消除之癌症)不能存活。

本發明並不意欲受到治療製劑之特定性質之限制。舉例而言，該等組合物可與生物學上可耐受之液體、凝膠或固體載體、稀釋劑及賦形劑一起提供於調配物中。該等治療製劑可投與哺乳動物用於獸醫用途，例如用於家畜，以及在人類中以類似於其他治療劑之方式臨床使用。一般而言，治療效能所需之劑量將根據使用類型及投與方式以及個別個體之特殊要求而變化。

該等組合物通常作為注射物製備為液體溶液或懸浮液。適宜稀釋劑及賦形劑為(例如)水、鹽水、右旋糖、甘油或諸如此類及其組合。另外，若期望，該組合物可含有微量輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、穩定劑或pH緩衝劑。

在涵蓋臨床應用之情況下，可能需要以適合於預期應用之形式製備包含蛋白質、抗體及藥物之醫藥組合物。通常，醫藥組合物可包含有效量之一或多種犬尿胺酸酶或在醫藥學上可接受之載劑中溶解或分散之其他藥劑。片語「醫藥學或藥理學上可接受的」係指當投與動物時(例如若適當，人類)不產生不利的、過敏或其他不利反應的分子實體及組合物。如由以引用方式併入本文中Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版，1990)所例示，熟習此項技術者根據本揭示案將已知含有至少一種藉由本文揭示之方法分離之犬尿胺酸酶或額外活性成分之醫藥組合物的製備。此外，對於動物(例如，人類)投與，應理解，製劑應滿足FDA生物標準辦公室所需之無菌、致熱原性、一般安全性及純度標準。

如本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」包括如熟習此項技術者所知之任何及所有溶劑、分散介質、塗料、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩定劑、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、染料、諸如此類材料及其組合(參見，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990，以引用方式併入本文中)。除非任何習用載劑與活性成分不相容，否則涵蓋其在醫藥組合物中之使用。

本發明之某些實施例可包含不同類型之載體，此取決於其是以固體、液體抑或氣溶膠形式投與，以及其是否需要對於投與之途徑(例如注射)係無菌的。組合物可經靜脈內、真皮內、經皮、鞘內、動脈內、腹膜內、鼻內、陰道內、直腸內、肌內、皮下、黏膜、經口、外用、局部、藉由吸入(例如，氣溶膠吸入)、藉由注射、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由局部灌注直接浸浴靶細胞、經由導管、經由灌洗、於脂質組合物(例如，脂質體)中或藉由如熟習此項技術者已知之上述之任何組合來投與(參見，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990，以引用方式併入本文中)。

可將經修飾之多肽調配成呈游離鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽包括酸加成鹽，例如，與蛋白質性組合物之游離胺基形成之彼等鹽，或與無機酸(例如鹽酸或磷酸)或有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸)形成之彼等鹽。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，例如鈉、鉀、銨、鈣或鐵之氫化物；或有機鹼，例如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。在調配時，溶液將以與劑量調配物相容之方式及以治療有效之量投與。調配物易於以各種劑型投與，例如調配用於非經腸投與，例如可注射溶液或用於遞送至肺之氣溶膠，或調配用於飲食投與，例如藥物釋放膠囊及諸如此類。

此外，根據本發明之某些態樣，適用於投與之組合物可在具有或無惰性稀釋劑之醫藥學上可接受之載劑中提供。載劑應可同化且包括液體、半固體，亦即膏糊或固體載體。除非任何習用介質、試劑、稀釋劑或載劑對接受者或其中所含組合物之治療有效性有害，否則其在可投與組合物中用於實踐該等方法之用途係適當的。載劑或稀釋劑之實例包括脂肪、油、水、鹽水溶液、脂質、脂質體、樹脂、黏合劑、填充劑及諸如此類或其組合。該組合物亦可包含各種抗氧化劑以阻止一或多種組分之氧化。另外，預防微生物之作用可由防腐劑實現，例如各種抗菌劑及抗真菌劑，包括(但不限於)對羥苯甲酸酯(例如，對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞或其組合。

根據本發明之某些態樣，以任何方便且實用之方式，亦即藉由溶解、懸浮、乳化、混合、囊封、吸收及諸如此類組合組合物與載體。該等程序對於熟習此項技術者係常規的。

在本發明之具體實施例中，將組合物與半固體或固體載劑澈底組合或混合。混合可以任何方便之方式(例如研磨)實施。亦可在混合過程中添加穩定劑，以保護組合物免於損失治療活性，亦即在胃中變性。用於組合物中之穩定劑之實例包括緩衝劑、胺基酸(例如甘胺酸及離胺酸)、碳水化合物(例如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇等)。

在其他實施例中，本發明可關於包括犬尿胺酸酶、一或多種脂質及水性溶劑之醫藥脂質媒劑組合物的用途。如本文所用術語「脂質」將被定義為包括任何廣泛範圍之物質，該等物質之特徵在於在水中不溶且可用有機溶劑萃取。此類廣泛之化合物為熟習此項技術者所熟知，且如本文所用之術語「脂質」，其不限於任何特定之結構。實例包括含有長鏈脂肪族烴及其衍生物之化合物。脂質可為天然或合成的(亦即，由人設計或產生)。然而，脂質通常為生物物質。生物脂質為業內所熟知，且包括(例如)中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、類固醇、萜烯、溶血脂、鞘醣脂、醣酯、硫脂、具有醚及酯連接之脂肪酸之脂質、可聚合脂質及其組合。當然，除了本文具體闡述之彼等化合物以外之化合物亦被熟習此項技術者理解為亦包括在組合物及方法中之脂質。

熟習此項技術者可熟悉用於在脂質媒劑中分散組合物之技術範圍。舉例而言，犬尿胺酸酶或其融合蛋白可分散於含有脂質之溶液中，用脂質溶解，用脂質乳化，與脂質混合，與脂質組合，與脂質共價鍵結，包含作為脂質中之懸浮液，含有或與膠束或脂質體複合，或者藉由熟習此項技術者已知之任何方法與脂質或脂質結構締合。分散可能會或可能不會導致脂質體之形成。

投與動物患者之組合物之實際劑量可藉由物理及生理因素來確定，例如患者之體重、病況之嚴重程度、所治療之疾病之類型、先前或同時之治療介入、特發病，以及投與之途徑。根據投與之劑量及途徑，較佳劑量及/或有效量之投與數量可根據個體之反應而變化。在任一情形下，負責投與之執業醫師將決定組合物中活性成分之濃度及用於個別個體之適當劑量。

在某些實施例中，醫藥組合物可包含(例如)至少約0.1%之活性化合物。在其他實施例中，活性化合物可包含約2%至約75%，或約25%至約60%及其中可衍生之任何範圍的重量單位。當然，每種治療上有用之組合物中活性化合物之量可以在任何給定單位劑量之化合物中獲得適宜劑量之方式製備。諸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、投與途徑、產品儲放壽命等因素以及其他藥理學考慮將由熟習此項技術者涵蓋用於製備該等醫藥製劑，且因此，可能期望多種劑量及治療方案。

在其他非限制性實例中，劑量亦可包含每次投與約1微克/kg/體重、約5微克/kg/體重、約10微克/kg/體重、約50微克/kg/體重、約100微克/kg/體重、約200微克/kg/體重、約350微克/kg/體重、約500微克/kg/體重、約1毫克/kg/體重、約5毫克/kg/體重、約10毫克/kg/體重、約50毫克/kg/體重、約100毫克/kg/體重、約200毫克/kg/體重、約350毫克/kg/體重、約500毫克/kg/體重至約1000毫克/kg/體重或更多及其中可衍生之任何範圍。在自本文列示之數字之可衍生範圍的非限制性實例中，基於上述數字，可投與約5毫克/kg/體重至約100毫克/kg/體重、約5微克/kg/體重至約500毫克/kg/體重等之範圍。X. 組合治療

在某些實施例中，本發明實施例之組合物及方法涉及與第二或另外之療法組合投與犬尿胺酸酶。該療法可應用於治療與犬尿胺酸依賴性相關之任何疾病。舉例而言，該疾病可為癌症。

方法及組合物(包括組合療法)增強治療或保護效應，及/或增加另一抗癌療法或抗過度增殖療法之治療效應。治療性及預防性方法及組合物可以有效實現期望效應(例如殺死癌細胞及/或抑制細胞過度增殖)之組合量提供。該過程可涉及投與犬尿胺酸酶及第二療法。第二療法可能具有或可能不具有直接細胞毒性效應。舉例而言，第二療法可為上調免疫系統而無直接細胞毒性效應之藥劑。組織、腫瘤或細胞可暴露於一或多種包含一或多種藥劑(例如，犬尿胺酸酶或或抗癌劑)之組合物或藥理學調配物，或藉由暴露組織、腫瘤及/或細胞於兩種或更多種不同組合物或調配物，其中一種組合物提供1) 犬尿胺酸酶，2)抗癌劑，或3)犬尿胺酸酶及抗癌劑二者。而且，預計該組合療法可與化學療法、放射療法、手術療法或免疫療法結合使用。

當應用於細胞時，術語「接觸」及「暴露」在本文中用於闡述治療性構築體及化學治療劑或放射性治療劑遞送至靶細胞或與靶細胞直接並置放置的過程。例如，為了實現細胞殺傷，將兩種藥劑以有效殺死細胞或防止其分裂之組合量遞送至細胞。

犬尿胺酸酶可以相對於抗癌治療在之前、期間、之後或以各種組合投與。投與可以同時至數分鐘至數天至數週之間隔。在將犬尿胺酸與抗癌劑分開提供給患者之實施例中，通常可確保在每次遞送之時間之間不會停止相當長之一段時間，使得兩種化合物仍然能夠對患者發揮有利地組合之效應。在該等情況下，預計可彼此在約12至24或72小時內、更具體地彼此在約6-12小時內向患者提供犬尿胺酸酶及抗癌症法。在一些情況下，可能期望顯著延長治療時間段，其中在各別投與之間流逝幾天(2、3、4、5、6或7天)至幾週(1、2、3、4、5、6、7或8)。

在某些實施例中，療程將持續1-90天或更長時間(此該範圍包括插入天)。預計可在第1天至第90天之任何一天(此該範圍包括插入天)或其任一組合給予一種藥劑，且在第1天至第90天之任何一天(此該範圍包括插入天)或其任一組合給予另一種藥劑。在一天(24小時時段)內，患者可被給予一或多種藥劑之一或多次投與。此外，在療程之後，預計有一段時間未投與抗癌治療。根據患者之狀況(例如其預後、力量、健康等)，此時間段可能持續1-7天及/或1-5週及/或1-12個月或更長時間(此該範圍包括插入天)。預計將根據需要重複治療週期。

可以採用各種組合。對於下文之實例，犬尿胺酸酶為「A」且抗癌療法為「B」： A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

向患者投與本發明實施例之任何化合物或療法將遵循該等化合物之投與之一般方案，同時考慮藥劑之毒性(若有的話)。因此，在一些實施例中，存在可歸因於組合療法之監測毒性之步驟。XI. 實例

本發明包括以下實例以展現本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，下列實例中揭示之技術代表本發明者發現可良好用於實踐本發明之技術，且因此可認為該等技術係實踐本發明之較佳方式。然而，彼等熟習此項技術者借助於本揭示案應瞭解，可在不背離本發明之精神及範疇之情況下對所揭示具體實施例作出多種改變且仍獲得相同或類似結果。實例 1- 人類 Kynase (h-KYNase) 之研發及表徵

本研究涉及工程改造h-KYNase變異體且研發變異體作為多種腫瘤之治療劑。工程改造許多人類變異體且測定其對Kyn之催化活性(K_cat /K_m )，與細菌工具Kynase相當(圖1A及下面之表2)。最佳化變異體用於增加催化活性及在90%人類血清中之活體外抗失活性(表示為在血清中培育一段時間後之殘餘活性)。發現經工程改造之人類變異體極大地改善了人類血清活體外之催化穩定性(圖1B及表2)。

人類變異體(例如蛋白質(68)及(153))在單次靜脈內劑量後顯示小鼠中延長之Kyn降解(圖1C)。對於該等研究，向6-8週且體重約18-20 g之BALB/c雌性小鼠靜脈內投用媒劑(PBS pH7.4)或10mg/kg (68) / (153)。在投用後6、24、48、72及120小時，最終將小鼠放血(n = 4隻小鼠/時間點)且立即用含有酸之內標準品(IS)溶液淬滅血漿樣品且處理用於犬尿胺酸之LC/MS分析。 表2：所選酶變異體之催化活性及血清穩定性

實例 2 - HsKYN 效能及抗腫瘤記憶

接下來，在CT26小鼠模型以及B16-IDO模型中測試HsKYN變異體之活體內效能。向6-8週齡雌性BALB/c小鼠之右下腹側中皮下植入100 μl PBS中之500,000個CT26細胞。在細胞接種後第4天開始給藥。將蛋白質(68)以10mg/kg Q6D皮下給藥3個劑量；Epacadostat以300mg/kg QD經口給藥(5天，2天休息)；抗PD-1以10mg/kg Q3D腹膜內給藥5個劑量。用數位卡尺每週量測腫瘤三次，且使用公式體積 = (LxWxT)xPi/6計算腫瘤體積。當腫瘤達到＞2,000mm³ 時，處死動物(圖2A)。在自(A)出現最後一個完全反應者(CR)後100天，將幼稚BALB/c小鼠及CR用皮下植入左下腹側之CT26再攻擊。如上所述量測腫瘤體積，且結果顯示在圖2B中。實例 3 - HsKYN 腫瘤免疫分型

在攜帶CT26腫瘤之小鼠中實施(68)之免疫分型。向6-8週齡雌性BALB/c之右下腹側中皮下植入100 μl PBS中之500,000個CT26細胞。在細胞接種後第4天開始給藥。用數位卡尺每週量測腫瘤三次，且使用公式體積 = (LxWxT)xPi/6計算腫瘤體積。在最後一個劑量後24h處死動物且收集腫瘤用於進一步分析。將蛋白質(68)以10mg/kg Q6D皮下給藥2個劑量；抗PD-1以10mg/kg Q3D腹膜內給藥3個劑量。使用Qiagen RNAeasy套組提取RNA，且使用PanCancer免疫分型組將100ng RNA用於Nanostring分析(圖3A)。圖3B中之研究，將(68)以10mg/kg Q6D皮下給藥2個劑量。用來自Miltenyi之腫瘤解離套組消解腫瘤。將單細胞懸浮液用經標記之抗體染色且使用Fortessa進行分析： CD8 (CD45+ CD3+ CD8+ CD4-)；Treg (CD45+ CD3+ CD4+ CD8- FoxP3+ CD25+)；M1巨噬細胞(CD45+ CD11b+ F4/80+ MHCII+ CD206-)；M2巨噬細胞(CD45+ CD11b+ F4/80+ MHCII+ CD206+)。實例 4- 大鼠及 NHP 中之主要 HsKYN 變異體 PD 及 PK 特性

藉由經由尾靜脈緩慢注射，向雄性Sprague Dawley大鼠(200-300g)靜脈內投用單劑量或3個週劑量之10mg/kg (153)。在投藥前24hr (-24h)、第一、第二或第三劑量後6、24、48、72或120 hr收集血樣(n=4隻小鼠/時間點)。如圖1C中所述處理血漿樣品，且藉由LC/MS分析犬尿胺酸水準(圖4A)。接下來，藉由經由頭靜脈緩慢注射，向一隻雄性及一隻雌性食蟹猴(≥2歲)靜脈投用單劑量之10mg/kg (153)。在投藥前(0h)、投藥後0.25、6、24、48、72、120、168、240及336 hr收集血液。將血漿樣品分成兩部分：一部分如圖1C所述進行處理，用於犬尿胺酸LC/MS分析(圖4B)；另一部分進行聚乙二醇化蛋白之ELISA分析(抗PEG抗體(Abcam編號ab51257)捕獲及生物素化抗PEG抗體(Abcam編號ab53449)檢測)。使用WinNonlin軟體程序藉由非隔室方法分析血漿濃度對時間數據，且計算具有C0、Cmax、T1/2、AUC0-最後、AUC0-inf之藥物動力學參數。

因此，本研究顯示，Kynase之犬尿胺酸降解廣泛適用於表現IDO及TDO之腫瘤。HsKYN蛋白質工程改造實現催化活性增加500倍以上，且大大提高了催化穩定性，從而產生了穩健且耐久之活體內Kyn耗竭。與Epacadostat相比，HsKYN變異體展現優異單一藥劑及PD1組合效能，以及持續抗腫瘤記憶。增加之IFNg相關之T細胞發炎特徵基因表現及M1/M2巨噬細胞比率可能為HsKYN +/- PD1介導之腫瘤效能的潛在機制。最後，臨床前毒物學物種之有利PK/PD特性支持主要HsKYN變異體之進一步臨床研發。 * * *

根據本揭示案，無需過多實驗即可製作及執行本文揭示及主張之所有方法。儘管已經根據較佳實施例闡述了本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者應明瞭，可在不背離本發明之概念、精神及範圍之情況下對方法及步驟或本文所述方法之步驟之順序進行變化。更特定而言，應明瞭，某些在化學及生理上皆相關之試劑可取代本文所述試劑且同時可達成相同或相似結果。熟習此項技術者明瞭之所有該等相似取代及修改皆被認為係在由所附申請專利範圍限定之本發明之精神、範圍及概念內。參考文獻

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在以下編號之實施例中進一步闡述本揭示案： 實施例1. 一種經分離、經修飾之人類犬尿胺酸酶，該經修飾之酶具有與SEQ ID NO: 1之人類犬尿胺酸酶具有至少90%一致性的胺基酸序列且包含至少一個選自由以下組成之群之取代：L8P、K38E、Y47L、I48F、K50Q、I51M、S60N、K64N、D65G、E66K、N67D、N67P、D67S、A68F、A68T、A68V、F71L、F71M、L72N、K84E、E88N、E89K、E89S、E90Q、D92E、K93N、K93T、A95H、A95Q、K96N、I97H、I97L、I97V、A98G、A99G、A99I、A99R、A99S、A99T、A99V、Y100N、Y100S、Y100T、G101A、H102W、E103F、E103H、E103N、E103Q、E103R、E103V、E103W、V104D、V104E、V104F、V104H、V104K、V104L、V104R、G105A、G105H、G105S、G105T、E106D、K106D、K106E、K106H、K106N、R107P、R107S、P108R、I110A、I110F、I110L、I110M、I110T、T111D、T111H、T111N、T111R、G112A、G112C、G112D、G112K、G112L、G112M、G112Q、G112R、G112S、G112T、G112Y、N127K、I131V、A132V、L133V、A136T、L137T、T138S、N140D、H142Q、Q14R、Y156H、K163T、D168E、H169R、Q175L、I183F、I183L、I183P、I183S、E184A、E184D、E184R、E184T、E184V、E185T、M187L、M189I、K191A、K191G、K191H、K191M、K191N、K191R、K191S、K191T、K191W、E197A、E197D、E197F、E197K、E197M、E197Q、E197S、E197T、E197V、I201C、I201E、I201F、I201H、I201L、I201S、I201T、I201V、H203K、L219M、L219W、F220L、V223I、F225Y、H230F、H230L、H230Y、N232S、Y246F、F249W、D250E、S274A、S274C、S274G、S274N、S274T、L278M、A280G、A280S、A280T、G281S、A282M、A282P、G284N、I285L、V303L、V303S、F306W、F306Y、S311N、K315E、D317E、D317K、I331C、I331L、I331N、I331S、I331T、I331V、N333T、P334N、P335T、L337T、L338A、L338Q、S341I、K373E、K373N、N375A、N375H、Y376C、Y376F、Y376L、K378G、K378P、K378Q、K378R、K380G、K380S、A382G、A382R、A382T、T383S、K384G、K384N、P386K、P386S、V387L、N389E、I405L、F407Y、S408D、S408N、N411R、D413S、D413V、Q416T、E419A、E419L、K420E、R421N、V424I、K427M、N429E、G432A及A436T。 實施例2. 如實施例1之酶，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO: 2-176中之任一者之胺基酸序列具有至少90%一致性。 實施例3. 如實施例1或2之酶，其包含A282、F306及/或F249處之取代。 實施例4. 如實施例1至3中任一項之酶，其包含F306W取代。 實施例5. 如實施例1至4中任一項之酶，其包含L72N取代。 實施例6. 如實施例1至5中任一項之，其包含H102W及/或N333T取代。 實施例7. 如實施例1至6中任一項之酶，其包含A99處之取代。 實施例8. 如實施例1至7中任一項之酶，其包含G112處之取代。 實施例9. 如實施例1至8中任一項之酶，其包含E103處之取代。 實施例10. 如實施例1至9中任一項之酶，其包含V104處之取代。 實施例11. 如實施例1至10中任一項之酶，其包含S408處之取代。 實施例12. 如實施例1至11中任一項之酶，其包含I183P取代。 實施例13. 如實施例1至12中任一項之酶，其包含R107P取代。 實施例14. 如實施例1至13中任一項之酶，其包含A436T取代。 實施例15. 如實施例1至14中任一項之酶，其包含至少一個選自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S及N333T之取代。 實施例16. 如實施例1至15中任一項之酶，其包含至少兩個、三個、四個或五個選自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S及N333T之取代。 實施例17. 如實施例1至16中任一項之酶，其包含取代L72N、H102W、A282P、F306W、I331S及N333T。 實施例18. 如實施例1至17中任一項之酶，其中該酶相對於KYN之催化活性(kcat/kM)為至少8000M^-1 s^-1 。 實施例19. 如實施例1至18中任一項之酶，其中該酶對犬尿胺酸(KYN)之催化活性(kcat/kM)介於約8000M^-1 s^-1 與40000 M^-1 s^-1 之間；介於10000M^-1 s^-1 與40000 M^-1 s^-1 之間；介於20000M^-1 s^-1 與40000 M^-1 s^-1 之間；或介於25000M^-1 s^-1 與35000 M^-1 s^-1 之間。 實施例20. 如實施例1至19中任一項之酶，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少90%一致性。 實施例21. 如實施例20之酶，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少95%一致性。 實施例22. 如實施例1至19中任一項之酶，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列具有至少90%一致性。 實施例23. 如實施例22之酶，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列具有至少95%一致性。 實施例24. 如實施例1至23中任一項之酶，其進一步包含異源肽區段。 實施例25. 如實施例1至24中任一項之酶，其中該酶與聚乙二醇(PEG)偶合。 實施例26. 如實施例25之酶，其中該酶經由一或多個Lys或Cys殘基與PEG偶合。 實施例27. 一種核酸，其包含編碼如實施例1至26中任一項之酶的核苷酸序列。 實施例28. 如實施例27之核酸，其中該核酸經密碼子最佳化用於在細菌、真菌、昆蟲或哺乳動物中表現。 實施例29. 一種表現載體，其包含如實施例27或28之核酸。 實施例30. 一種宿主細胞，其包含如實施例27或28之核酸或如實施例29之表現載體。 實施例31. 如實施例30之宿主細胞，其中該宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。 實施例32. 如實施例31之宿主細胞，其中該宿主細胞為細菌細胞。 實施例33. 如實施例31之宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞，視情況其中該哺乳動物細胞為免疫效應細胞。 實施例34. 如實施例33之宿主細胞，其中該免疫效應細胞為NK細胞或T細胞。 實施例35. 一種醫藥調配物，其包含於醫藥學上可接受之載劑中的根據實施例1至26中任一項之酶。 實施例36. 一種治療患有腫瘤之個體之方法，其包括向該個體投與有效量之如實施例1至26中任一項之酶或如實施例35之調配物。 實施例37. 一種組合物，其包含有效量之如實施例1至26中任一項之酶或如實施例35之調配物，其用於治療患有腫瘤之個體。 實施例38. 如實施例36之方法或如實施例37之組合物，其中該個體經鑑別為患有表現IDO1、IDO2或TDO之腫瘤。 實施例39. 如實施例36或38之方法或如實施例37或38之組合物，其中該腫瘤為實體腫瘤。 實施例40. 如實施例36或38之方法或如實施例37或38之組合物，其中該腫瘤為血液腫瘤。 實施例41. 如實施例36及38至40中任一項之方法或如實施例37至40中任一項之組合物，其中該個體為人類患者。 實施例42. 如實施例36及38至41中任一項之方法或如實施例37至41中任一項之組合物，其中該酶或該調配物係經腫瘤內、靜脈內、真皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、眼內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、肌內、皮下、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍內、經口、藉由吸入、藉由注射、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由局部灌注直接浸浴靶細胞、經由導管或經由灌洗來投與。 實施例43. 如實施例36及38至42中任一項之方法，其進一步包括至少投與第二抗癌療法。 實施例44. 如實施例43之方法,，其中該第二抗癌療法為輻射療法、手術療法、免疫療法或第二抗癌化合物。 實施例45. 如實施例44之方法，其中該第二抗癌化合物為免疫檢查點抑制劑。 實施例46. 如實施例44或45之方法，其中該第二抗癌化合物為抗體。 實施例47. 如實施例44至46中任一項之方法，其中該第二抗癌化合物包含抗PD1、抗CTLA-4或抗PD-L1抗體。 實施例48. 如實施例44至47中任一項之方法，其中該第二抗癌化合物為抗體-藥物結合物。 實施例49. 如實施例44至48中任一項之方法，其中該免疫療法包括投與免疫效應細胞或免疫原性組合物。 實施例50. 如實施例49之方法，其中該免疫原性組合物包含癌細胞抗原。 實施例51. 如實施例49或50之方法，其中該等免疫效應細胞包含NK細胞或T細胞。 實施例52. 如實施例49至51中任一項之方法，其中該等免疫效應細胞包含CAR T細胞。 實施例53. 一種轉基因T細胞，其包含根據實施例1至26中任一項之表現之犬尿胺酸酶。 實施例54. 如實施例53之細胞，其進一步包含表現之嵌合抗原T細胞受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。 實施例55. 如實施例53或54之細胞，其中該細胞為人類T細胞。 實施例56. 如實施例54或55之細胞，其中編碼該CAR及該犬尿胺酸酶之DNA整合至該細胞之基因體中。 實施例57. 如實施例54至56中任一項之細胞，其中將該CAR靶向癌細胞抗原。 實施例58. 如實施例57之細胞，其中該癌細胞抗原為HER2、CD19、CD20或GD2。 實施例59. 一種在患有腫瘤之人類個體中提供T細胞反應的方法，其包括向該個體投與有效量之根據實施例53至58中任一項之轉基因細胞。 實施例60. 一種組合物，其包含有效量之根據實施例53至58中任一項之轉基因細胞，其用於治療患有腫瘤之個體。 實施例61. 如實施例59之方法或如實施例60之組合物，其中該等轉基因細胞為自體的。 實施例62. 如實施例59之方法或如實施例60之組合物，其中該等轉基因細胞為異源的。 實施例63. 一種根據實施例1至26中任一項之犬尿胺酸酶、根據實施例27或28之核酸或根據實施例29之表現載體的用途，其用於製造用於治療腫瘤的藥劑。

序列附錄： SEQ ID NO: 1：野生型人類KYNase

SEQ ID NO: 2 蛋白質168：

SEQ ID NO: 3 蛋白質153：

以下圖式構成本說明書之一部分，且包括以進一步說明本發明之某些態樣。藉由參考該等圖式中之一或多者結合本文提出之具體實施例的詳細說明，可以更好地理解本發明。

圖 1A-C ： HsKYN 蛋白質工程者之成功結果。 A) 人類變異體之Kyn催化活性(K_cat /K_m )增加＞500倍，與細菌工具Kynase相當。B) 人類變異體極大地改善了活體外人類血清中之催化穩定性。C) 如本文表1中所示，人類變異體(68)及(153)在單次靜脈內劑量後顯示小鼠中延長之Kyn降解。

圖 2A-B ： HsKYN 變異體的活體內效能。 A) 在CT26模型中，蛋白質(68)與抗PD-1組合顯示出優於Epacadostat之顯著腫瘤生長抑制/存活益處。B) 用CT26再攻擊完全反應者(CR)，且沒有CR發生腫瘤，確認針對CT26之抗腫瘤記憶。相比之下，用CT26接種之幼稚小鼠發生腫瘤。

圖 3A-B ：在攜帶 CT26 腫瘤之小鼠中之蛋白質 (68) 之免疫分型。 A) 使用Nanostring之多工基因表現分析揭示在HsKYN +/-抗PD1治療後IFNγ基因印記之上調。B) FAC分析展現HsKYN治療增加了CD8/Treg及M1/M2巨噬細胞比率。

圖 4A-C ：毒物學物種 (tox species) 中蛋白質 (153) 之 PD/PK 特性。 A) 在單次及重複之10 mg/kg之每週靜脈注射劑量後，蛋白質(153)在大鼠中展現穩健且耐久之血漿Kyn耗竭。B) 在獼猴中單次靜脈注射後，蛋白質(153)降解血漿Kyn ≥50%高達7天。C) 具有有利之T1/2 ＞ 6天之蛋白質(153)猴PK曲線。

Claims (20)

1. 經修飾之人類犬尿胺酸酶，該經修飾之酶具有與SEQ ID NO: 1之人類犬尿胺酸酶具有至少90%一致性的胺基酸序列且包含至少一個選自由以下組成之群之取代：L8P、K38E、Y47L、I48F、K50Q、I51M、S60N、K64N、D65G、E66K、N67D、N67P、D67S、A68F、A68T、A68V、F71L、F71M、L72N、K84E、E88N、E89K、E89S、E90Q、D92E、K93N、K93T、A95H、A95Q、K96N、I97H、I97L、I97V、A98G、A99G、A99I、A99R、A99S、A99T、A99V、Y100N、Y100S、Y100T、G101A、H102W、E103F、E103H、E103N、E103Q、E103R、E103V、E103W、V104D、V104E、V104F、V104H、V104K、V104L、V104R、G105A、G105H、G105S、G105T、E106D、K106D、K106E、K106H、K106N、R107P、R107S、P108R、I110A、I110F、I110L、I110M、I110T、T111D、T111H、T111N、T111R、G112A、G112C、G112D、G112K、G112L、G112M、G112Q、G112R、G112S、G112T、G112Y、N127K、I131V、A132V、L133V、A136T、L137T、T138S、N140D、H142Q、Q14R、Y156H、K163T、D168E、H169R、Q175L、I183F、I183L、I183P、I183S、E184A、E184D、E184R、E184T、E184V、E185T、M187L、M189I、K191A、K191G、K191H、K191M、K191N、K191R、K191S、K191T、K191W、E197A、E197D、E197F、E197K、E197M、E197Q、E197S、E197T、E197V、I201C、I201E、I201F、I201H、I201L、I201S、I201T、I201V、H203K、L219M、L219W、F220L、V223I、F225Y、H230F、H230L、H230Y、N232S、Y246F、F249W、D250E、S274A、S274C、S274G、S274N、S274T、L278M、A280G、A280S、A280T、G281S、A282M、A282P、G284N、I285L、V303L、V303S、F306W、F306Y、S311N、K315E、D317E、D317K、I331C、I331L、I331N、I331S、I331T、I331V、N333T、P334N、P335T、L337T、L338A、L338Q、S341I、K373E、K373N、N375A、N375H、Y376C、Y376F、Y376L、K378G、K378P、K378Q、K378R、K380G、K380S、A382G、A382R、A382T、T383S、K384G、K384N、P386K、P386S、V387L、N389E、I405L、F407Y、S408D、S408N、N411R、D413S、D413V、Q416T、E419A、E419L、K420E、R421N、V424I、K427M、N429E、G432A及A436T。
2. 如請求項1之酶，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO: 2-176中之任一者之胺基酸序列具有至少90%一致性。
3. 如請求項1之酶，其包含： (a) A282、F306或F249處之取代； (b) F306W取代； (c) L72N取代； (d) H102W及N333T取代； (e) A99處之取代； (f) G112處之取代； (g) E103處之取代； (h) V104處之取代； (i) S408處之取代； (j) I183P取代； (k) R107P取代；及/或 (l) A436T取代。
4. 如請求項1之酶，其包含至少一個選自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S及N333T之取代，視情況其中該酶包含至少兩個、三個、四個或五個選自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S及N333T之取代。
5. 如請求項4之酶，其包含該等取代L72N、H102W、A282P、F306W、I331S及N333T。
6. 如請求項5之酶，其中該酶對犬尿胺酸(KYN)之催化活性(kcat/kM)為至少8000M^-1 s^-1 ，視情況其中該酶對KYN之催化活性介於約8000M^-1 s^-1 與40000 M^-1 s^-1 之間；介於10000M^-1 s^-1 與40000 M^-1 s^-1 之間；介於20000M^-1 s^-1 與40000 M^-1 s^-1 之間；或介於25000M^-1 s^-1 與35000 M^-1 s^-1 之間。
7. 如請求項1之酶，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少90%一致性，視情況其中該胺基酸序列與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少95%一致性。
8. 如請求項1至7中任一項之酶，其進一步包含異源肽區段。
9. 如請求項1至7中任一項之酶，其中該酶與聚乙二醇(PEG)偶合，視情況其中該酶在一或多個Lys或Cys殘基處與PEG偶合。
10. 一種核酸，其包含編碼如請求項1至8中任一項之酶的核苷酸序列，視情況其中該核酸經密碼子最佳化用於在細菌、真菌、昆蟲或哺乳動物中表現。
11. 一種表現載體，其包含如請求項10之核酸。
12. 一種宿主細胞，其包含如請求項10之核酸或如請求項11之表現載體，視情況其中該宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，視情況其中該哺乳動物細胞為哺乳動物免疫效應細胞，視情況其中該哺乳動物免疫效應細胞為NK細胞或T細胞。
13. 一種醫藥調配物，其包含於醫藥學上可接受之載劑中的如請求項1至9中任一項之酶。
14. 一種如請求項1至9中任一項之酶或如請求項13之調配物的用途，其係用於製備治療患有腫瘤之個體的藥物。
15. 如請求項14之用途，其中該個體經鑑別為患有表現IDO1、IDO2或TDO之腫瘤，視情況其中： (a) 該腫瘤為實體腫瘤或血液腫瘤； (b) 該個體為人類患者； (c) 該酶或該調配物係經腫瘤內、靜脈內、真皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、眼內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、肌內、皮下、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍內、經口、藉由吸入、藉由注射、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由局部灌注直接浸浴靶細胞、經由導管或經由灌洗來投與；及/或 (d) 該酶或該調配物係與至少第二抗癌療法一起投與，視情況其中該第二抗癌療法為輻射療法、手術療法、免疫療法或第二抗癌化合物，視情況其中： (i) 該第二抗癌化合物為免疫檢查點抑制劑，視情況其中該免疫檢查點抑制劑包含抗體或抗體-藥物結合物，視情況其中該抗體為抗PD1、抗CTLA-4或抗PD-L1抗體；及/或 (ii) 該免疫療法包括投與免疫效應細胞或免疫原性組合物，視情況其中該免疫原性組合物包含癌細胞抗原及/或其中該等免疫效應細胞包含NK細胞、T細胞或CAR T細胞。
16. 一種組合物，其包含有效量之如請求項1至9中任一項之酶或如請求項13之調配物，該組合物用於治療患有腫瘤之個體。
17. 如請求項16之組合物，其中該個體經鑑別為患有表現IDO1、IDO2或TDO之腫瘤，視情況其中： (a) 該腫瘤為實體腫瘤或血液腫瘤； (b) 該個體為人類患者； (c) 該酶或該調配物係經腫瘤內、靜脈內、真皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、眼內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、肌內、皮下、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍內、經口、藉由吸入、藉由注射、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由局部灌注直接浸浴靶細胞、經由導管或經由灌洗來投與；及/或 (d) 該酶或該調配物係與至少第二抗癌療法一起投與，視情況其中該第二抗癌療法為輻射療法、手術療法、免疫療法或第二抗癌化合物，視情況其中： (i) 該第二抗癌化合物為免疫檢查點抑制劑，視情況其中該免疫檢查點抑制劑包含抗體或抗體-藥物結合物，視情況其中該抗體為抗PD1、抗CTLA-4或抗PD-L1抗體；及/或 (ii) 該免疫療法包括投與免疫效應細胞或免疫原性組合物，視情況其中該免疫原性組合物包含癌細胞抗原及/或其中該等免疫效應細胞包含NK細胞、T細胞或CAR T細胞。
18. 一種轉基因T細胞，其包含表現之如請求項1至8中任一項之犬尿胺酸酶，視情況其中： (a) 該轉基因T細胞進一步包含表現之嵌合抗原T細胞受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)； (b) 該轉基因T細胞為人類轉基因T細胞； (c) 編碼該CAR及該犬尿胺酸酶之DNA整合至該細胞之基因體中；及/或 (d) 其中該CAR靶向癌細胞抗原，視情況其中該癌細胞抗原為HER2、CD19、CD20或GD2。
19. 一種如請求項18之轉基因T細胞的用途，其係用於製備促進患有腫瘤之人類個體中之T細胞反應的藥物。
20. 一種組合物，其包含有效量之如請求項18之轉基因T細胞，其用於治療患有腫瘤之個體，視情況其中： (a) 該等轉基因細胞為自體的；或 (b) 該等轉基因細胞為異源的。

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