BR112020020772A2 - enzimas quinureninase humana e usos das mesmas - Google Patents

Abstract

  ENZIMAS QUINURENINASE HUMANA E USOS DAS MESMAS. Métodos e composições relacionados ao uso de uma proteína com atividade de quinureninase são descritos. Por exemplo, em certos aspectos, uma quinureninase modificada capaz de degradar a quinurenina é divulgada. Além disso, certos aspectos da invenção fornecem composições e métodos para o tratamento de câncer com depleção de quinurenina usando as proteínas ou ácidos nucleicos divulgados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENZI- MAS QUINURENINASE HUMANA E USOS DAS MESMAS".

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos nº 62/658.261, depositado em 16 de abril de 2018, cuja totalidade é incorporada no presente documento por referência.

[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob o nº de concessão R01 CA154754 concedido pelo National Institutes of Health. O governo dos EUA possui certos direitos sobre a invenção. Antecedentes da Invenção

1. Campo da Invenção

[003] A presente invenção refere-se geralmente ao campo da bio- logia molecular e oncologia. Mais particularmente, refere-se a enzimas quinureninase modificadas e métodos para usar as mesmas.

2. Descrição da Técnica Relacionada

[004] A quinurenina é um metabólito do aminoácido triptofano ge- rado pela ação da indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) ou triptofano 2,3- dioxigenase (TDO). A quinurenina exerce vários efeitos na fisiologia celular; um dos mais importantes é como um modulador das respostas das células T. Muitas células tumorais regulam a síntese das enzimas IDO e/ou TDO para elevar a concentração local de quinurenina, que é acompanhada pela depleção de triptofano. Altos níveis de quinurenina, por sua vez, servem como uma forma poderosa de inibir a função das células T que se infiltram no tumor que, de outra forma, atacariam o tumor.

[005] A importância da produção de quinurenina no câncer é bem reconhecida e levou ao desenvolvimento de inibidores das enzimas IDO e TDO geradoras de quinurenina; pelo menos um desses com- postos está atualmente em avaliação clínica de Fase II. No entanto, a inibição de IDO ou TDO é problemática para a terapia do câncer por-

que: (1) existem duas isoformas de IDO e junto com TDO, a inibição de todas as vias possíveis para a geração de quinurenina atualmente requer a geração de múltiplos inibidores de pequenas moléculas; (2) pode surgir resistência à inibição.

[006] A quinureninase humana tem uma forte preferência pela degradação da 3'0H-quinurenina, que é degradada com uma eficiência catalítica (Kcat/Km) cerca de 1.000 superior à exibida para a degrada- ção da quinurenina. Em contraste, algumas enzimas bacterianas, tais como a enzima de P. fluorescens, têm forte preferência por quinureni- na em vez de 3'OH-quinurenina. Para fins terapêuticos, é essencial ter um agente (ou seja, uma enzima terapêutica) que tenha as proprieda- des farmacológicas necessárias para aplicações in vivo em humanos. Essas incluem: (i) alta atividade catalítica para quinurenina, (ii) estabi- lidade aperfeiçoada para desativação em soro, a fim de atingir a de- pleção prolongada de quinurenina em soro e tecidos após injeção de dose única

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Aspectos da presente invenção superam uma deficiência importante na técnica, fornecendo enzimas que compreendem se- quências de polipeptídeos modificadas capazes de degradar L- quinurenina, tendo um alto grau de identidade de sequência com a en- zima humana para evitar a elicitação de respostas imunes adversas e exibindo farmacocinética favorável em soro conforme desejado para a terapia do câncer. Em PCT/US2014/053437, os inventores divulgaram enzimas quinureninase humanas mutantes (também referida aqui co- mo h-KYNase ou HsKYN) tendo eficiência catalítica até 24 vezes mai- or para a degradação de KYN em relação à enzima humana do tipo selvagem. Existe uma necessidade para a descoberta de enzimas h- KYNase mutantes tendo maior atividade catalítica e estabilidade em soro humano em relação às divulgadas em PCT/US2014/053437. As-

pectos do presente pedido abordam esta necessidade e divulgam en- zimas mutantes tendo maior eficiência catalítica e também enzimas mutantes tendo maior atividade catalítica do que a h-KYNase do tipo selvagem, bem como enzimas com estabilidade sérica aperfeiçoada.

[008] Em uma primeira modalidade, a invenção fornece uma en- zima quinureninase humana modificada isolada, a referida enzima modificada tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma enzima quinureninase humana das SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou um dos po- lipeptídeos fornecidos na Tabela 1 e compreendendo pelo menos uma substituição (em relação à sequência da SEQ ID NO: 1) selecionada a partir do grupo que consiste em L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, I51M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D,K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W,

D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A e A436T. Em alguns aspectos, a sequência de aminoácidos é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; ou pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma enzima da Tabela 1. Em certos aspectos, a enzima pode compreender uma substituição em A282 (por exemplo, A282M ou A282P), F306 (por exemplo, F306W ou F306Y) ou F249, tal como F249W. Em outros as- pectos, a enzima pode compreender a substituição de L72N. Em ainda outros aspectos, a enzima pode compreender a substituição de F306W. Em aspectos específicos, a enzima pode compreender as substituições H102W e N333T. Em outro aspecto, a enzima pode compreender uma substituição em A99. Em alguns aspectos, a enzima pode compreender uma substituição em G112. Em certos aspectos específicos, a enzima compreende uma substituição em E103. Em ou- tros aspectos, a enzima compreende uma substituição em V104. Em outros aspectos, a enzima pode compreender uma substituição em S408. Em vários aspectos, a enzima pode compreender a substituição I183P. Em alguns aspectos particulares, a enzima pode compreender a substituição R107P. Em outro aspecto específico, a enzima pode compreender a substituição A436T.

[009] Em ainda outros aspectos, a enzima pode compreender pelo menos uma substituição selecionada a partir de L72N, H102W, A282P, F306W, I331S e N333T. Em certos aspectos, a enzima com- preende pelo menos duas, três, quatro ou cinco substituições selecio- nadas a partir de L72N, H102W, A282P, F306W, I331S e N333T. Em alguns aspectos, a enzima pode compreender as substituições L72N, H102W, A282P, F306W, I331S e N333T. Em um aspecto adicional, a enzima tem uma atividade catalítica em relação à KYN (kcat/kM) de pelo menos 8000M-1s-1. Em outros aspectos, a enzima tem uma ativi- dade catalítica relativa à KYN (kcat/kM) entre cerca de 8000M-1s-1 e 40000 M-1s-1; 10000M-1s-1 e 40000 M-1s-1; 20000M-1s-1 e 40000 M-1s-1; ou 25000M-1s-1 e 35000 M-1s-1.

[0010] Em ainda outros aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoáci- dos de um dos polipeptídeos da Tabela 1. Em aspectos específicos, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos 100% idên- tica a um dos polipeptídeos da Tabela 1. Em ainda outros aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em aspectos específicos, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoáci- dos 100% idêntica à SEQ ID NO: 2. Em certos aspectos, a sequência de aminoácidos é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em aspectos específicos, o polipeptídeo compreende uma se- quência de aminoácidos 100% idêntica à SEQ ID NO: 3.

[0011] Em um outro aspecto, uma enzima quinureninase das mo- dalidades compreende ainda uma das substituições de aminoácidos divulgadas em WO/2015/031771, WO/2016/033488 ou WO/2017/151860, cada um dos quais é incorporado no presente do-

cumento por referência em sua totalidade.

[0012] Em outros aspectos, são fornecidos polipeptídeos que compreendem uma quinureninase humana modificada, primata ou na- tiva capaz de degradar KYN. Em algumas modalidades, os polipeptí- deos são capazes de degradar KYN sob condições fisiológicas. Por exemplo, os polipeptídeos têm uma eficiência catalítica para KYN (kcat/KM) de pelo menos ou cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 104, 105, 106 M−1s−1 ou qualquer faixa derivável entre.

[0013] Um polipeptídeo modificado, conforme discutido acima, po- de ser distinguido como tendo uma certa porcentagem de identidade em comparação a um polipeptídeo não modificado (por exemplo, um polipeptídeo nativo, tal como quinureninase humana da SEQ ID NO: 1) ou a qualquer sequência de polipeptídeos divulgada aqui. Por exem- plo, o polipeptídeo não modificado pode compreender pelo menos, ou até, cerca de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 465 resíduos (ou qualquer faixa derivável entre) de uma quinureninase nativa. A porcen- tagem de identidade pode ser cerca de no máximo ou pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% (ou qualquer faixa derivável entre) entre os polipeptídeos modificados e não modificados, ou entre quaisquer duas sequências em compara- ção. É também contemplado que a porcentagem de identidade discuti- da acima pode referir-se a uma região modificada particular de um po- lipeptídeo em comparação a uma região não modificada de um poli- peptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo pode conter um local de reco- nhecimento do substrato modificado ou mutante de uma quinureninase que pode ser distinguido com base na identidade da sequência de aminoácidos do local de reconhecimento do substrato modificado ou mutante da quinureninase para aquele de uma quinureninase não mo- dificada ou mutante da mesma espécie ou entre as espécies. Um poli-

peptídeo humano modificado ou mutante distinguido, por exemplo, como tendo pelo menos 90% de identidade a uma quinureninase não modificada, significa que pelo menos 90% dos aminoácidos nesse po- lipeptídeo humano modificado ou mutante são idênticos aos aminoáci- dos no polipeptídeo não modificado.

[0014] Tal polipeptídeo não modificado pode ser uma quinureni- nase nativa, particularmente uma isoforma humana ou outras isofor- mas de primatas. Por exemplo, a quinureninase humana nativa pode ter a sequência da SEQ ID NO: 1. Exemplos não limitantes de outras quinureninases primatas nativas incluem quinureninase de Pongo abe- lii (Genbank ID: XP_009235962.1, GI: 686708656), quinureninase de Macaca fascicularis(Genbank ID: EHH54849.1, GI: 355750522), e qui- nureninase de Pan troglodytes (Genbank ID: XP_003309314.1, GI: 332814521). Polipeptídeos nativos exemplares incluem uma sequên- cia tendo cerca de no máximo ou pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade (ou qualquer faixa derivável entre) da SEQ ID NO: 1. Por exemplo, o poli- peptídeo nativo pode compreender pelo menos ou até cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 465 resíduos (ou qualquer faixa derivável entre) da sequência da SEQ ID NO: 1.

[0015] Em alguns aspectos, os polipeptídeos das modalidades compreendem uma quinureninase ligada a uma sequência de aminoá- cidos heteróloga. Por exemplo, a quinureninase pode estar ligada à sequência de aminoácidos heteróloga como uma proteína de fusão. Em uma modalidade particular, a quinureninase está ligada a sequên- cias de aminoácidos, tais como uma Fc de IgG, albumina, uma proteí- na de ligação a albumina ou um polipeptídeo XTEN para aumentar a meia-vida in vivo.

[0016] Para aumentar a persistência sérica, a quinureninase pode estar ligada a uma ou mais moléculas de poliéter. Em uma modalidade particular, o poliéter é polietilenoglicol (PEG). O polipeptídeo pode es- tar ligado (por exemplo, covalentemente) ao PEG por meio de resí- duos de aminoácidos específicos, tais como lisina ou cisteína. Para administração terapêutica, tal polipeptídeo compreendendo a quinure- ninase pode ser disperso em um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0017] Em alguns aspectos, um ácido nucleico que codifica tal qui- nureninase é contemplado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico foi otimizado por códon para expressão em bactérias. Em modalidades particulares, as bactérias são E. coli. Em outros aspectos, o ácido nu- cleico foi otimizado por códon para expressão em fungos (por exem- plo, levedura), insetos ou mamíferos. Em outros aspectos, são forneci- dos vetores, tais como vetores de expressão, contendo tais ácidos nu- cleicos. Em modalidades particulares, o ácido nucleico que codifica a quinureninase está operacionalmente ligado a um promotor, incluindo, mas não se limitando a, promotores heterólogos. Em uma modalidade, uma quinureninase é liberada a uma célula alvo por um vetor (por exemplo, um vetor de terapia genética). Tais vírus podem ter sido mo- dificados por tecnologia de DNA recombinante para permitir a expres- são do ácido nucleico que codifica a quinureninase na célula alvo. Es- ses vetores podem ser derivados de vetores de origem não viral (por exemplo, plasmídeos) ou viral (por exemplo, adenovírus, vírus adeno- associado, retrovírus, lentivírus, vírus do herpes ou vírus vaccinia). Os vetores não virais são preferencialmente complexados com agentes para facilitar a entrada do DNA através da membrana celular. Exem- plos de tais complexos de vetores não virais incluem a formulação com agentes policatiônicos que facilitam a condensação do DNA e siste- mas de liberação à base de lipídios. Um exemplo de um sistema de liberação à base de lipídios incluiria a liberação de ácidos nucleicos baseada em lipossomas.

[0018] Em ainda outros aspectos, a presente invenção contempla ainda células hospedeiras compreendendo tais vetores. As células hospedeiras podem ser bactérias (por exemplo, E. coli), células fúngi- cas (por exemplo, levedura), células de inseto ou células de mamífe- ros.

[0019] Em algumas modalidades, os vetores são introduzidos nas células hospedeiras para expressar a quinureninase. As proteínas po- dem ser expressas de qualquer maneira adequada. Em uma modali- dade, as proteínas são expressas em uma célula hospedeira de tal modo que a proteína seja glicosilada. Em outra modalidade, as proteí- nas são expressas em uma célula hospedeira de tal modo que a prote- ína seja aglicosilada.

[0020] Em algumas modalidades, o câncer é qualquer câncer que seja sensível à depleção de quinurenina. Em uma modalidade, a pre- sente invenção contempla um método para tratar uma célula tumoral ou um paciente com câncer, compreendendo administrar uma formu- lação compreendendo tal polipeptídeo. Em algumas modalidades, a administração ocorre sob condições tais que pelo menos uma porção das células do câncer são mortas. Em outra modalidade, a formulação compreende uma tal quinureninase com atividade de degradação da quinurenina em condições fisiológicas e compreendendo ainda uma cadeia de polietilenoglicol ligada. Em algumas modalidades, a formu- lação é uma formulação farmacêutica que compreende qualquer uma das quinureninases e excipientes farmaceuticamente aceitáveis acima discutidos. Tais excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos para aqueles técnicos no assunto. Todas as quinurenina- ses acima podem ser consideradas úteis para terapia humana.

[0021] Em uma outra modalidade, também pode ser fornecido um método para tratar uma célula tumoral compreendendo administrar uma formulação compreendendo uma quinureninase não bacteriana (mamífero, por exemplo, primata ou camundongo) que tem atividade de degradação da quinurenina ou um ácido nucleico que codifica a mesma.

[0022] De acordo com certos aspectos da presente invenção, tal formulação contendo a quinureninase pode ser administrada por via intravenosa, intradérmica, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostática, intrapleural, intrassinovial, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravítrea, intravaginal, intravítrea, intravaginal, intramuscular, subcutânea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, por inalação, infusão, infusão contínua, perfusão localizada, por meio de um cateter, por meio de lavagem, em composições lipídicas (por exemplo, lipossomas), ou por outro método ou qualquer combinação dos anteriores, como seria conhecido por um versado na técnica.

[0023] Em uma outra modalidade, o método também compreende administrar pelo menos uma segunda terapia anticâncer ao paciente. A segunda terapia anticâncer pode ser uma terapia cirúrgica, quimiote- rapia, radioterapia, crioterapia, terapia hormonal, imunoterapia ou te- rapia com citocinas. Em certos aspectos, a segunda terapia anticâncer pode ser uma terapia com inibidor do ponto de controle imunológico, tal como anticorpo anti-PD-1, anti-CTLA-4, anti-PD-L1, terapia anti- LAG3, anti-TIM-3, anti-ICOS, anti-CD137, anti-CD40, anti-KIR, anti- CD40L, anti-GITR ou anti-OX40. Em outros aspectos, a segunda tera- pia anticâncer pode ser uma terapia com anticorpos, tal como um con- jugado anticorpo-fármaco. Em ainda outros aspectos, a segunda tera- pia anticâncer é uma imunoterapia, tal como a administração de célu- las imunes efetoras ou uma composição imunogênica. Por exemplo, a composição imunogênica pode compreender antígenos de células cancerígenas e, opcionalmente, um adjuvante. Em alguns aspectos,

as células imunes efetoras podem compreender células NK, células T (por exemplo, células T CAR) ou células NK/T.

[0024] Em algumas modalidades, uma célula T compreendendo um receptor quimérico de antígeno (CAR) e uma enzima quinureni- nase das modalidades são contempladas para uso no tratamento de um paciente com câncer. Em alguns aspectos, a célula pode ser trans- fectada com um DNA que codifica o CAR e a quinureninase e, em al- guns casos, uma transposase.

[0025] O CAR pode direcionar qualquer antígeno de células can- cerígenas de interesse, incluindo, por exemplo, HER2, CD19, CD20 e GD2. As regiões ou domínio de ligação ao antígeno podem compreen- der um fragmento das cadeias VH e VL de um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado de um anticorpo monoclonal humano par- ticular, tal como aqueles descritos na Patente dos EU de nº 7.109.304, que é incorporada no presente documento por referência em sua tota- lidade. O fragmento também pode ser qualquer número de diferentes domínios de ligação ao antígeno de um anticorpo específico do antí- geno humano. Em uma modalidade mais específica, o fragmento é um scFv específico do antígeno codificado por uma sequência que é oti- mizada para uso de códon humano para expressão em células huma- nas. Para exemplos adicionais de CARs, vide, por exemplo, WO 2012/031744, WO 2012/079000, WO 2013/059593 e Patente dos EU de nº 8.465.743, todos os quais são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[0026] A quinureninase pode ser qualquer quinureninase divulgada no presente documento. Os métodos de transfecção de células são bem conhecidos na técnica, mas em certos aspectos, métodos de transfecção altamente eficientes, tais como eletroporação, são empre- gados. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser introduzidos nas células usando um aparelho de nucleofecção. De preferência, a etapa de transfecção não envolve infectar ou transduzir as células com vírus, o que pode causar genotoxicidade e/ou levar a uma resposta imune a células contendo sequências virais em um paciente tratado.

[0027] Uma ampla faixa de construtos do CAR e vetores de ex- pressão para os mesmos são conhecidos na técnica e são mais deta- lhados aqui. Por exemplo, em alguns aspectos, o vetor de expressão do CAR é um vetor de expressão de DNA, tal como um plasmídeo, vetor de expressão linear ou epissoma. Em alguns aspectos, o vetor compreende sequências adicionais, tais como a sequência que facilita a expressão do CAR, tal como um promotor, aperfeiçoador, sinal poli- A e/ou um ou mais íntrons. Em aspectos preferidos, a sequência de codificação do CAR é flanqueada por sequências de transposon, de tal modo que a presença de uma transposase permite que a sequência de codificação se integre no genoma da célula transfectada.

[0028] Em certos aspectos, as células são ainda transfectadas com uma transposase que facilita a integração de uma sequência de codificação do CAR no genoma das células transfectadas. Em alguns aspectos, a transposase é fornecida como vetor de expressão de DNA. No entanto, em aspectos preferidos, a transposase é fornecida como um RNA expressável ou uma proteína de tal modo que a ex- pressão a longo prazo da transposase não ocorra nas células transgê- nicas. Qualquer sistema de transposase pode ser usado de acordo com as modalidades. Em outros aspectos, as células podem ser infec- tadas com um lentivírus para facilitar a integração da sequência de co- dificação do CAR e da sequência de codificação da quinureninase no genoma da célula.

[0029] Em uma modalidade, uma composição que compreende uma quinureninase ou um ácido nucleico que codifica uma quinureni- nase é fornecida para uso no tratamento de um tumor em um paciente. Em outra modalidade, é fornecido o uso de uma quinureninase ou um ácido nucleico que codifica uma quinureninase na fabricação de um medicamento para o tratamento de um tumor. A quinureninase pode ser qualquer quinureninase das modalidades.

[0030] As modalidades discutidas no contexto dos métodos e/ou composições da invenção podem ser empregadas em relação a qual- quer outro método ou composição descrito aqui. Assim, uma modali- dade pertencente a um método ou composição pode ser aplicada a outros métodos e composições da invenção também.

[0031] Conforme usado no presente documento, "essencialmente livre", em termos de um componente especificado, é usado no presen- te documento para significar que nenhum dos componentes especifi- cados foi propositalmente formulado em uma composição e/ou está presente somente como contaminante ou em pequenas quantidades. A quantidade total do componente especificado resultante de qualquer contaminação não intencional de uma composição é de preferência inferior a 0,01%. Mais preferida é uma composição em que nenhuma quantidade do componente especificado pode ser detectada com mé- todos analíticos padrão.

[0032] Conforme usado no presente documento no relatório des- critivo e nas reivindicações, "um" ou "uma" pode significar um ou mais. Conforme usado no presente documento no relatório descritivo e nas reivindicações, quando usado em conjunto com a palavra "compreen- dendo", as palavras "um" ou "uma" podem significar um ou mais de um. Conforme usado no presente documento, no relatório descritivo e nas reivindicações, "outro" ou "adicional" pode significar pelo menos um segundo ou mais.

[0033] Conforme usado no presente documento no relatório des- critivo e nas reivindicações, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor ou a variação que existe entre os pacientes do estudo.

[0034] Outros objetos, características e vantagens da presente in- venção tornarão-se evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem certas modalidades da inven- ção, são dados somente a título de ilustração, uma vez que várias mu- danças e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tor- narão aparentes para aqueles técnicos no assunto a partir desta des- crição detalhada. Breve Descrição das Figuras

[0035] As seguintes figuras fazem parte do presente relatório des- critivo e são incluídas para demonstrar ainda certos aspectos da pre- sente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por refe- rência a uma ou mais dessas figuras em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas aqui.

[0036] FIGURAS 1A-C: Resultado de sucesso da engenharia de proteínas HsKYN. A) As variantes humanas alcançaram um aumento > 500 vezes da atividade catalítica (Kcat/Km) para Kyn, comparável à fer- ramenta bacteriana Kynases. B) As variantes humanas melhoraram amplamente a estabilidade catalítica em soro humano in vitro. C) As variantes humanas (68) e (153), conforme estabelecidas na Tabela 1, aqui, mostraram degradação de Kyn prolongada em camundongos após uma dose iv única.

[0037] FIGURAS 2A-B: Eficácia in vivo da variante de HsKYN. A) A proteína (68) em combinação com antiPD-1 demonstrou benefícios significativos de inibição/sobrevivência do crescimento tumoral superi- ores ao Epacadostat, no modelo CT26. B) Os respondedores comple- tos (CRs) foram desafiados novamente com CT26 e nenhum dos CRs desenvolveu tumores, confirmando a memória antitumoral contra CT26. Em contraste, camundongos virgens inoculados com CT26 de-

senvolveram tumores.

[0038] FIGURAS 3A-B: Perfil imunológico da Proteína (68) em camundongos com tumor CT26. A) A análise da expressão do gene Multiplex usando Nanostring revelou a regulação positiva da assinatu- ra do gene IFNγ após o tratamento com HsKYN +/- antiPD1. B) A aná- lise de FACs demonstrou que o tratamento com HsKYN aumentou as razões de macrófagos CD8/Treg e M1/M2.

[0039] FIGURAS 4A-C: Os perfis PD/PK da Proteína (153) em es- pécies tox. A) A proteína (153) demonstrou depleção de Kyn plasmáti- ca robusta e durável em ratos após uma(s) dose(s) iv única e repeti- da(s) semanalmente de 10 mg/kg. B) A proteína (153) degradou a Kyn plasmática ≥50% por até 7 dias após uma dose iv única em macacos cyno. C) Perfil de PK de macaco da proteína (153) com T1/2 favorável > 6 dias. Descrição de Modalidades Ilustrativas I. As presentes modalidades

[0040] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece qui- nureninases (Quinase), uma enzima de depleção de Kyn. Em particu- lar, o pedido fornece um conjunto de variantes de quinureninase hu- mana que exibem atividade catalítica pelo menos 100 vezes maior em relação à degradação de quinurenina em comparação com a enzima quinureninase humana do tipo selvagem. Em alguns aspectos, as va- riantes de quinureninase fornecidas no presente documento adicio- nalmente aumentam a resistência à desativação em soro. Assim, es- sas enzimas têm propriedades significativamente melhoradas que as tornam ideais para a intervenção terapêutica em doenças, tal como o tratamento de câncer. Em alguns aspectos, as enzimas (ou sequên- cias que codificam as enzimas) podem ser usadas para tratar pacien- tes com câncer, tais como aqueles com tumores que expressam IDO1 e/ou TDO2.

[0041] Nos estudos presentes, a quinase humana (h-KYNase) foi modificada com sucesso para exibir atividade catalítica amplamente melhorada e estabilidade em relação a Kyn sobre a enzima WT, e atingiu depleção durável de Kyn no plasma em camundongos. A eficá- cia do agente único e da combinação de PD1 também foi demonstrada em modelos CT26 e B16-IDO, superior ao inibidor principal de IDO1 Epacadostat, e os respondedores completos (CRs) resultantes eram resistentes à reintrodução do tumor. O perfil imunológico do tumor re- velou a regulação positiva das expressões genéticas de assinatura de IFNg e da razão de macrófagos M1/M2 após o tratamento com HsKYN +/-PD1. A variante principal de HsKYN exibiu degradação de Kyn favo- rável e perfil de PK em ratos e primatas não humanos, e pode ser usada para o tratamento de cânceres, tais como cânceres onde as vi- as IDO1 e/ou TDO2 desempenham um papel imunossupressor. II. Definições

[0042] Conforme usado no presente documento, os termos "prote- ína" e "polipeptídeo" referem-se a compostos que compreendem ami- noácidos unidos por meio de ligações peptídicas e são usados alter- nadamente.

[0043] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína de fusão" refere-se a uma proteína quimérica contendo proteínas ou fragmentos de proteínas operacionalmente ligados de uma forma não nativa.

[0044] Conforme usado no presente documento, o termo "meia- vida" (½-vida) refere-se ao tempo que seria necessário para a concen- tração de um polipeptídeo da mesma cair pela metade in vitro ou in vivo, por exemplo, após a injeção em um mamífero.

[0045] Os termos "em combinação operável", "em ordem operável" e "operacionalmente ligado" referem-se a uma ligação em que os componentes assim descritos estão em uma relação que os permite funcionar da maneira pretendida, por exemplo, uma ligação de se- quências de ácido nucleico de tal maneira que uma molécula de ácido nucleico seja capaz de dirigir a transcrição de um determinado gene e/ou a síntese da molécula de proteína desejada, ou uma ligação de sequências de aminoácidos de tal maneira que uma proteína de fusão seja produzida.

[0046] O termo "ligante" refere-se a um composto ou fração que atua como uma ponte molecular para operacionalmente ligar duas mo- léculas diferentes, em que uma porção do ligante está operacional- mente ligada a uma primeira molécula e em que outra porção do ligan- te está operacionalmente ligada a uma segunda molécula.

[0047] O termo "PEGuilado" refere-se à conjugação com polietile- noglicol (PEG), que tem sido amplamente usado como um transporta- dor de fármacos, dado seu alto grau de biocompatibilidade e facilidade de modificação. O PEG pode ser acoplado (por exemplo, covalente- mente ligado) a agentes ativos através dos grupos hidróxi no final da cadeia de PEG por meio de métodos químicos; no entanto, o próprio PEG está limitado a no máximo dois agentes ativos por molécula. Em uma abordagem diferente, copolímeros de PEG e aminoácidos foram explorados como um novo biomaterial que reteria a biocompatibilidade do PEG, mas que teria a vantagem adicional de vários pontos de fixa- ção por molécula (fornecendo assim maior carga de fármaco), e isso pode ser projetado sinteticamente para atender a uma variedade de aplicações.

[0048] O termo "gene" refere-se a uma sequência de DNA que compreende sequências de controle e de codificação necessárias para a produção de um polipeptídeo ou precursor do mesmo. O polipeptí- deo pode ser codificado por uma sequência de codificação de compri- mento total ou por qualquer porção da sequência de codificação de modo que a atividade enzimática desejada seja retida.

[0049] O termo "nativo" refere-se à forma típica de um gene, um produto genético ou uma característica desse gene ou produto genéti- co quando isolado de uma fonte de ocorrência natural. Uma forma na- tiva é aquela que é observada com mais frequência em uma popula- ção natural e, portanto, é arbitrariamente designada a forma normal ou do tipo selvagem. Em contraste, o termo "modificado", "variante" ou "mutante" refere-se a um gene ou produto genético que exibe modifi- cação na sequência e propriedades funcionais (ou seja, características alteradas) quando comparado ao gene nativo ou produto genético.

[0050] O termo "vetor" é usado para referir-se a uma molécula de ácido nucleico do transportador na qual uma sequência de ácido nu- cleico pode ser inserida para introdução em uma célula onde ela pode ser replicada. Uma sequência de ácido nucleico pode ser "exógena", o que significa que é estranha à célula na qual o vetor está sendo intro- duzido ou que a sequência é homóloga a uma sequência na célula, mas em uma posição dentro do ácido nucleico da célula hospedeira na qual a sequência normalmente não é encontrada. Os vetores incluem plasmídeos, cosmídeos, vírus (bacteriófagos, vírus de animais e vírus de plantas) e cromossomos artificiais (por exemplo, YACs). Um versa- do na técnica estaria bem equipado para construir um vetor por meio de técnicas recombinantes padrão.

[0051] O termo "vetor de expressão" refere-se a qualquer tipo de construção genética compreendendo um ácido nucleico que codifica para um RNA capaz de ser transcrito. Em alguns casos, as moléculas de RNA são então traduzidas em uma proteína, polipeptídeo ou peptí- deo. Em outros casos, essas sequências não são traduzidas, por exemplo, na produção de moléculas antissenso ou ribozimas. Os veto- res de expressão podem conter uma variedade de "sequências de controle", que refere-sem às sequências de ácido nucleico necessárias para a transcrição e, possivelmente, tradução de uma sequência de codificação operacionalmente ligada em uma célula hospedeira parti- cular. Além das sequências de controle que governam a transcrição e tradução, os vetores e vetores de expressão podem conter sequências de ácido nucleico que também servem a outras funções e são descri- tas infra.

[0052] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como usado no presente documento, refere-se a uma quantidade de células e/ou composição terapêutica (tal como um polinucleotídeo terapêutico e/ou polipeptídeo terapêutico) que é empregada em métodos para al- cançar um efeito terapêutico. O termo "benefício terapêutico" ou "tera- peuticamente eficaz", conforme usado ao longo deste pedido, refere- se a algo que promova ou aperfeiçoe o bem-estar do paciente em re- lação ao tratamento médico desta condição. Isso inclui, mas não se limita a, uma redução na frequência ou gravidade dos sinais ou sinto- mas de uma doença. Por exemplo, o tratamento do câncer pode en- volver, por exemplo, uma redução no tamanho de um tumor, uma re- dução na capacidade de invasão de um tumor, redução na taxa de crescimento do câncer ou prevenção de metástases. O tratamento do câncer também pode referir-se ao prolongamento da sobrevivência de um paciente com câncer.

[0053] O termo "KM", tal como usado no presente documento, refe- re-se à constante de Michaelis-Menten para uma enzima e é definido como a concentração do substrato específico em que uma determina- da enzima produz metade de sua velocidade máxima em uma reação catalisada por enzima. O termo "kcat", tal como usado no presente do- cumento, refere-se ao número de rotatividade ou ao número de molé- culas do substrato que local da enzima converte em produto por uni- dade de tempo, e no qual a enzima está trabalhando com eficiência máxima. O termo "kcat/KM", conforme usado no presente documento, é a constante de especificidade, que é uma medida de quão eficiente-

mente uma enzima converte um substrato em produto.

[0054] O termo "receptores quiméricos de antígeno de células T (CARs)", conforme usado no presente documento, pode referir-se a receptores de células T artificiais, receptores quiméricos de antígeno de células T ou imunorreceptores quiméricos, por exemplo, e abran- gem receptores modificados que enxertam uma especificidade artificial em uma célula efectora imune particular. Os CARs podem ser empre- gados para transmitir a especificidade de um anticorpo monoclonal a uma célula T, permitindo assim que um grande número de células T específicas seja gerado, por exemplo, para uso em terapia celular ado- tiva. Em modalidades específicas, os CARs direcionam a especificida- de da célula para um antígeno associado ao tumor, por exemplo. Em algumas modalidades, os CARs compreendem um domínio de ativa- ção intracelular, um domínio transmembranar e um domínio extracelu- lar que compreende uma região de ligação ao antígeno associada ao tumor. Em aspectos específicos, os CARs compreendem fusões de fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) derivados de anticorpos monoclonais (tais como aqueles descritos na Patente dos EUA de nº

7.109.304, que é incorporada no presente documento por referência em sua totalidade), fundidos à transmembrana CD3-zeta e endodomí- nios. A especificidade de outros projetos de CAR pode ser derivada de ligantes de receptores (por exemplo, peptídeos) ou de receptores de reconhecimento de padrão, tais como as dectinas. Em modalidades particulares, pode-se direcionar as células B malignas redirecionando a especificidade das células T usando um CAR específico para a mo- lécula da linhagem B, CD19. Em certos casos, o espaçamento do do- mínio de reconhecimento de antígeno pode ser modificado para redu- zir a morte celular induzida por ativação. Em certos casos, os CARs compreendem domínios para sinalização coestimulatória adicional, tal como CD3-zeta, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10 e/ou OX40. Em alguns casos, as moléculas podem ser coexpressas com o CAR, inclu- indo moléculas coestimulatórias, genes repórter para imageamento (por exemplo, para tomografia por emissão de pósitrons), produtos ge- néticos que ablacionam condicionalmente as células T após a adição de um pró-fármaco, receptores de retorno, quimiocinas, receptores de quimiocinas, citocinas e receptores de citocinas.

[0055] "Tratamento" e "tratando" referem-se à administração ou aplicação de um agente terapêutico a um paciente ou desempenho de um procedimento ou modalidade em um paciente com a finalidade de obter um benefício terapêutico de uma doença ou condição relaciona- da à saúde. Por exemplo, um tratamento pode incluir a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma quinureninase.

[0056] "Paciente" e "indivíduo" referem-se a um ser humano ou não humano, tal como primatas, mamíferos e vertebrados. Em modali- dades particulares, o paciente é um humano. III. Polipeptídeos de quinureninase

[0057] Algumas modalidades referem-se a proteínas e polipeptí- deos modificados. Modalidades particulares referem-se a uma proteína ou polipeptídeo modificados que exibe pelo menos uma atividade fun- cional que é comparável à versão não modificada, de preferência, a atividade de degradação da quinurenina. Em outros aspectos, a prote- ína ou polipeptídeo podem ser modificados adicionalmente para au- mentar a estabilidade do soro. Assim, quando o presente pedido refe- re-se à função ou atividade da "proteína modificada" ou um "polipeptí- deo modificado", um versado na técnica entenderia que isso inclui, por exemplo, uma proteína ou polipeptídeo que possui uma vantagem adi- cional sobre a proteína ou polipeptídeo não modificados, tal como ati- vidade de degradação da quinurenina ou estabilidade termodinâmica.

[0058] A determinação da atividade pode ser alcançada usando ensaios familiares aos técnicos no assunto, particularmente no que diz respeito à atividade da proteína, e pode incluir, para fins de compara- ção, o uso de versões nativas e/ou recombinantes da proteína ou poli- peptídeo modificados ou não modificados.

[0059] Em certas modalidades, um polipeptídeo modificado, tal como uma quinureninase modificada, pode ser identificado com base em seu aumento em quinurenina. Por exemplo, os locais de reconhe- cimento de substrato do polipeptídeo não modificado podem ser identi- ficados. Esta identificação pode ser baseada em análise estrutural ou análise de homologia. Uma população de mutantes envolvendo modi- ficações de tais locais de reconhecimento de substrato pode ser gera- da. Em uma outra modalidade, os mutantes com atividade degradante de quinurenina aumentada podem ser selecionados a partir da popula- ção mutante. A seleção de mutantes desejados pode incluir métodos, tal como a detecção de subprodutos ou produtos da degradação de quinurenina.

[0060] As proteínas modificadas podem possuir deleções e/ou substituições de aminoácidos; assim, uma proteína com uma deleção, uma proteína com uma substituição e uma proteína com uma deleção e uma substituição são proteínas modificadas. Em algumas modalida- des, essas proteínas modificadas podem incluir ainda inserções ou aminoácidos adicionados, tais como com proteínas de fusão ou proteí- nas com ligantes, por exemplo. Uma "proteína deletada modificada" carece de um ou mais resíduos da proteína nativa, mas pode possuir a especificidade e/ou atividade da proteína nativa. Uma "proteína dele- tada modificada" também pode ter imunogenicidade ou antigenicidade reduzida. Um exemplo de uma proteína deletada modificada é aquela que tem um resíduo de aminoácidos deletado de pelo menos uma re- gião antigênica, ou seja, uma região da proteína determinada como antigênica em um organismo particular, tal como o tipo de organismo que pode ser administrado a proteína modificada.

[0061] As variantes de substituição ou reposição contêm normal- mente a troca de um aminoácido por outro em um ou mais locais den- tro da proteína e podem ser projetadas para modular uma ou mais propriedades do polipeptídeo, particularmente suas funções efetoras e/ou biodisponibilidade. As substituições podem ou não ser conserva- tivas, ou seja, um aminoácido é substituído por outro de forma e carga semelhantes. As substituições conservativas são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, as alterações de: alanina para serina; arginina para lisina; asparagina para glutamina ou histidina; aspartato para glutamato; cisteína para serina; glutamina para asparagina; glu- tamato para aspartato; glicina para prolina; histidina para asparagina ou glutamina; isoleucina para leucina ou valina; leucina para valina ou isoleucina; lisina para arginina; metionina para leucina ou isoleucina; fenilalanina para tirosina, leucina ou metionina; serina para treonina; treonina para serina; triptofano para tirosina; tirosina para triptofano ou fenilalanina; e valina para isoleucina ou leucina.

[0062] Além de uma deleção ou substituição, uma proteína modifi- cada pode possuir uma inserção de resíduos, que normalmente envol- ve a adição de pelo menos um resíduo no polipeptídeo. Isso pode in- cluir a inserção de um peptídeo ou polipeptídeo de direcionamento ou simplesmente um único resíduo. Adições terminais, chamadas proteí- nas de fusão, são discutidas abaixo.

[0063] O termo "biologicamente funcionalmente equivalente" é bem compreendido na técnica e é ainda definido em detalhes no pre- sente documento. Consequentemente, as sequências que têm entre cerca de 70% e cerca de 80%, ou entre cerca de 81% e cerca de 90%, ou mesmo entre cerca de 91% e cerca de 99% de aminoácidos que são idênticos ou funcionalmente equivalentes aos aminoácidos de um polipeptídeo de controle são incluídos, desde que a atividade biológica da proteína seja mantida. Uma proteína modificada pode ser biologi-

camente funcionalmente equivalente à sua contraparte nativa em cer- tos aspectos.

[0064] Também será entendido que as sequências de aminoáci- dos e de ácido nucleico podem incluir resíduos adicionais, tais como aminoácidos N- ou C-terminais adicionais ou sequências 5 'ou 3', e ainda ser essencialmente conforme estabelecido em uma das sequên- cias divulgadas aqui, desde que a sequência atenda aos critérios es- tabelecidos acima, incluindo a manutenção da atividade biológica da proteína onde a expressão da proteína está em causa. A adição de sequências terminais se aplica particularmente a sequências de ácido nucleico que podem, por exemplo, incluir várias sequências não codifi- cantes que flanqueiam as porções 5 'ou 3' da região de codificação ou podem incluir várias sequências internas, ou seja, íntrons, que são co- nhecidas por ocorrer dentro dos genes.

[0065] Em certas modalidades, uma quinureninase de acordo com as modalidades compreende uma sequência de aminoácidos pelo me- nos cerca de 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à quinureninase das SEQ ID NOs: 1, 2 ou 3. Em ainda outros aspectos, uma quinureninase é pelo menos cerca de 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à quinureni- nase das SEQ ID NOs: 1, 2 ou 3 e compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 das substituições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que con- siste em L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, I51M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H,

V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D,K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A e A436T. Em outros aspectos, uma quinureninase é pelo menos cerca de 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98% ou 99% idêntica a uma das quinureninases fornecidas na Tabela 1. Em aspectos específicos, a quinureninase é selecionada a partir de uma daquelas fornecidas na Tabela 1. Em alguns aspectos, uma qui- nureninase, por exemplo, de acordo com a Tabela 1, pode ou não ser PEGuilada.

[0066] A Tabela 1, abaixo, apresenta várias enzimas quinureni- nase que podem ser usadas em conjunto com as composições e mé-

todos da presente divulgação.

Embora não listado explicitamente na Tabela 1, "Proteína (1)", no presente documento, refere-se à quinure- ninase humana do tipo selvagem, a sequência de aminoácidos da qual é apresentada na SEQ ID NO: 1.

Tabela 1: Enzimas quinureninase exemplares das modalidades.

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 2 9 N67D/L72N/E103Q/M189I/F225Y/S274G/I331V/I405L/S408N His NÃO 3 9 N67D/L72N/E103Q/M189I/F225Y/S274G/I331V/I405L/S408N His SIM 4 7 A99I/G112A/F306Y/I331N/I405L/S408N/A436T His NÃO 5 7 A99I/G112A/F306Y/I331N/I405L/S408N/A436T His SIM 6 10 Q14R/A99I/G112A/M189I/H230Y/F306Y/I331N/I405L/S408N/A436T His NÃO 7 10 Q14R/A99I/G112A/M189I/H230Y/F306Y/I331N/I405L/S408N/A436T His SIM

27/102 8 17 N67D/L72N/E103Q/A99I/G112A/M189I/F225Y/S274G/I331V/F306Y/K3 His NÃO 80S/A382R/K384N/P386K/I405L/S408N/A436T 9 17 N67D/L72N/E103Q/A99I/G112A/M189I/F225Y/S274G/I331V/F306Y/K3 His SIM 80S/A382R/K384N/P386K/I405L/S408N/A436T 10 18 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/K106E/R107S/I110M/A136T/M His NÃO 189I/F225Y/S274G/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 11 27 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/K106E/R107S/I110M/I131V/L1 His NÃO 33V/A136T/T138S/M189I/F225Y/G274T/L278M/G281S/A282P/F306W/ K315E/D317E/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 12 25 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/V223I/F225Y/S274G/A280S/G281S/A282P/I 331C/N333T/S341I/I405L/S408N

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 13 25 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His SIM 112Y/A132V/A136T/M189I/V223I/F225Y/S274G/A280S/G281S/A282P/I 331C/N333T/S341I/I405L/S408N 14 8 A99I/G112A/G284N/I285L/F306Y/I331N/I405L/S408N/A436T His NÃO 15 7 A99I/G112A/K191N/F306Y/I331N/I405L/S408N/A436T His NÃO 16 10 L8P/A99I/G112A/Q175L/F306Y/I331N/K373E/K378R/I405L/S408N/A43 His NÃO 6T 17 10 A99I/G112A/F306Y/I331N/K380S/A382R/K384N/P386K/I405L/S408N/A His NÃO

28/102 436T 18 9 A99I/G112A/F306Y/I331N/N375H/Y376L/K378P/I405L/S408N/A436T His NÃO 19 22 N67D/A68T/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110L/T1 His NÃO 11H/G112Y/A136T/M189I/F225Y/S274G/F306W/I331C/N333T/S341I/I4 05L/S408N 20 23 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/K106E/R107S/I110M/A132V/A His NÃO 136T/M189I/F225Y/G274S/A280S/G281S/A282P/F306W/I331C/N333T/ S341I/I405L/S408N 21 23 N67D/F71L/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/G1 His NÃO 12Y/A136T/M189I/F225Y/S274G/A280S/G281S/A282P/I331C/N333T/S 341I/I405L/S408N

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 22 ***sequenciamento não foi totalmente resolvido*** His NÃO 23 26 D67N/A68V/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/K106E/R107S/M110I/T1 His NÃO 11H/G112Y/A136T/M189I/F225Y/G274T/A280S/G281S/A282P/F306W/ K315E/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 24 25 D67N/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/K106E/R107S/I110M/T111H/G His NÃO 112Y/A136T/M189I/F225Y/G274S/A280S/G281S/A282P/F306W/K315E /I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 25 29 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO

29/102 112Y/A132V/A136T/M189I/V223I/F225Y/S274G/A280S/G281S/A282P/ V303L/F306W/S311N/K315E/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 26 23 D67S/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/K106E/R107S/I110M/A132V/L1 His NÃO 33V/A136T/M189I/F225Y/G274A/A280S/A282P/F306W/I331C/N333T/S 341I/I405L/S408N 27 24 D67N/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/K106E/R107S/I110M/T111H/G His NÃO 112Y/A136T/M189I/F225Y/G274N/L278M/A282P/F306W/K315E/I331C/ N333T/S341I/I405L/S408N 28 22 D67N/A68V/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/K106E/R107S/M110I/A1 His NÃO 36T/M189I/F225Y/G274T/G281S/A282P/F306W/I331C/N333T/S341I/I4 05L/S408N

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 29 27 N67D/F71L/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T11 His NÃO 1H/G112Y/A136T/M189I/V223I/F225Y/G274S/A280S/G281S/A282P/F3 06W/K315E/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 30 25 D67N/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/K106E/R107S/I110M/T111H/G His NÃO 112Y/A136T/M189I/F225Y/G274S/A280S/G281S/A282P/F306W/D317 E/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 31 29 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/V223I/M189I/F225Y/S274G/A280S/G281S/A282P/

30/102 V303S/F306W/K315E/D317K/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 32 24 N67D/A68T/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T1 His NÃO 11H/G112Y/A136T/M189I/F225Y/G274N/A280S/A282P/F306W/I331C/ N333T/S341I/I405L/S408N 33 24 N67D/A68T/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T1 His SIM 11H/G112Y/A136T/M189I/F225Y/G274N/A280S/A282P/F306W/I331C/ N333T/S341I/I405L/S408N 34 20 L72N/A99V/Y100N/H102W/E103F/V104E/K106D/R107S/T111H/G112Y His NÃO /L133V/A136T/F225Y/S274N/A280S/G281S/A282P/F306W/I331C/N33 3T

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 35 21 L72N/A99V/Y100N/H102W/E103F/V104E/K106D/R107S/T111N/G112Y His NÃO /I131V/L133V/A136T/F225Y/S274T/A280S/G281S/A282P/F306W/I331 C/N333T 36 22 L72N/A99V/Y100N/H102W/E103F/V104E/K106D/R107S/I110M/T111N/ His NÃO G112Y/I131V/L133V/A136T/F225Y/S274N/A280S/G281S/A282P/F306 W/I331C/N333T 37 22 N67D/F71L/L72N/A99V/Y100N/H102W/E103F/V104E/K106D/R107S/I1 His NÃO 10M/T111H/G112Y/A136T/F225Y/S274G/A280S/G281S/A282P/F306W

31/102 /I331C/N333T 38 21 L72N/E90Q/A99V/Y100N/H102W/E103F/V104E/K106D/R107S/I110M/ His NÃO T111D/G112Y/A136T/F225Y/S274N/A280S/G281S/A282M/F306W/I33 1C/N333T 39 16 Y100T/H102W/E103F/V104E/K106D/R107S/T111H/G112Y/A136T/M18 His NÃO 9I/F225Y/A280G/A282P/F306W/I331C/N333T 40 19 A99S/Y100S/G101A/H102W/E103F/V104E/K106D/R107S/I110M/T111 His NÃO H/G112Y/A136T/F225Y/A280T/A282P/F306W/I331C/N333T/K373N 41 3 K191S-E197T-I201H His NÃO 42 3 K191R-E197S-I201T His NÃO 43 3 K191S-E197T-I201T His NÃO

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 44 2 I183P-E184A His NÃO 45 3 K191R-E197F-I201T His NÃO 46 2 K191R-I201E His NÃO 47 3 K191W-E197V-I201E His NÃO 48 3 K191H-E197V-I201E His NÃO 49 2 E197M-I201L His NÃO 50 3 K191G-E197V-I201H His NÃO

32/102 51 3 K191T-E197Q-I201E His NÃO 52 3 K191H-E197V-I201E His NÃO 53 25 N67D/A68T/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T1 His NÃO 11H/G112Y/A136T/M189I/F225Y/G274N/A280S/A282P/F306W/I331C/ N333T/S341I/K373N/I405L/S408N 54 22 L72N/E90Q/A99V/Y100N/H102W/E103F/V104E/K106D/R107S/I110M/ His NÃO T111D/G112Y/A136T/F225Y/S274N/A280S/G281S/A282M/F306W/I33 1C/N333T/K373N 55 37 N67D/A68T/L72N/E88N/E89K/D92E/K93T/A95Q/K96N/I97H/A98G/A99 His NÃO I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110L/T111H/G112Y/A136T/M1 89I/F225Y/A280S/A282P/F306W/I331L/N333T/P335T/L338A/S341I/I40 5L/S408N/E419A/K420E/R421N/V424I

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 56 36 (conta a Y47L/I48F/K50Q/del51- His NÃO deleção de 62/K64N/D65G/E66K/N67P/A68F/L72N/E88N/E89S/E90Q/K93N/K96N/ 10 resíduos I97L/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110L/T111H/G112Y/ como uma A136T/M189I/F225Y/A280G/A282P/F306W/I331C/N333T/S341I/I405L/ mutação) S408N 57 29 Q14R/K38E/I51M/N67D/A68T/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D His NÃO /R107S/M110L/T111H/G112Y/N127K/A136T/M189I/K191N/E197T/F22 5Y/H230F/S274G/F306W/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N

33/102 58 29 S60N/N67D/L72N/K84E/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M1 His NÃO 10I/T111H/G112Y/A132V/A136T/Y156H/K163T/M189I/V223I/F225Y/S2 74G/A280S/G281S/A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 59 26 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/V223I/F225Y/S274G/A280S/G281S/A282P/I 331C/N333T/L338Q/S341I/I405L/S408N 60 26 N67D/L72N/A99I/Y100N/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T His NÃO 111H/G112Y/A132V/A136T/M189I/V223I/F225Y/S274G/A280S/G281S/ A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 61 27 N67D/L72N/I97V/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T11 His NÃO 1H/G112Y/A132V/A136T/N140D/M189I/V223I/F225Y/S274G/A280S/G 281S/A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 62 28 N67D/A68T/L72N/E90Q/K93N/A95H/K96N/I97L/A99I/H102W/E103F/V1 His NÃO 04E/E106D/R107S/M110L/T111H/G112Y/A136T/M189I/F225Y/A280S/ A282P/F306W/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 63 25 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/V223I/F225Y/S274G/A280S/G281S/A282P/I 331C/N333T/S341I/I405L/S408N 64 26 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/D168E/M189I/V223I/F225Y/S274G/A280S/G281S/

34/102 A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 65 26 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/V223I/F225Y/D250E/S274G/A280S/G281S/ A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 66 25 N67D/A68T/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T1 His NÃO 11H/G112Y/A136T/D168E/M189I/F225Y/G274N/A280S/A282P/F306W/ I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 67 25 N67D/A68T/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T1 His NÃO 11H/G112Y/A136T/M189I/F225Y/D250E/G274N/A280S/A282P/F306W/ I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 68 8 L72N/A99I/H102W/G112Y/A282P/F306W/I331S/N333T His NÃO

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 69 8 L72N/A99I/H102W/G112Y/A282P/F306W/I331S/N333T His SIM 70 9 L72N/A99I/H102W/G112Y/A282P/F306W/I331S/N333T/P334N His NÃO 71 16 L72N/A99I/H102W/E103F/E106D/M110I/T111H/G112Y/A132V/A136T/ His NÃO M189I/A282P/I331C/N333T/S341I/S408N 72 19 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/T111H/G112Y/A His NÃO 136T/M189I/A280S/A282P/F306W/I331C/N333T/I405L/S408N 73 28 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/K191S/E197T/I201H/V223I/F225Y/S274G/A

35/102 280S/G281S/A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 74 28 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/K191R/E197F/I201T/V223I/F225Y/S274G/A 280S/G281S/A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 75 28 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/K191SW/E197V/I201E/V223I/F225Y/S274G /A280S/G281S/A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 76 27 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/E197M/I201L/V223I/F225Y/S274G/A280S/G 281S/A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 77 28 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/K191H/E197V/I201E/V223I/F225Y/S274G/A 280S/G281S/A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 78 28 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/K191R/E197S/I201T/V223I/F225Y/S274G/A 280S/G281S/A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 79 28 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/K191G/E197V/I201H/V223I/F225Y/S274G/A

36/102 280S/G281S/A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 80 28 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/K191S/E197T/I201T/V223I/F225Y/S274G/A 280S/G281S/A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 81 28 N67D/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/E106D/R107S/M110I/T111H/G His NÃO 112Y/A132V/A136T/M189I/K191G/E197A/I201E/V223I/F225Y/S274G/A 280S/G281S/A282P/I331C/N333T/S341I/I405L/S408N 82 12 L72N/A99S/H102W/E103F/V104K/K106H/R107S/G112Y/A282P/F306 His NÃO W/I331C/N333T 83 12 N67D/L72N/A99I/H102W/K106D/S274G/A280S/G281S/A282P/F306W/I His NÃO 331S/N333T

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 84 24 N67D/A68T/L72N/A99I/H102W/E103F/V104E/K106D/R107S/I110L/T11 His NÃO 1H/G112Y/A136T/M189I/F225Y/S274N/A280S/A282P/F306W/I331C/N 333T/S341I/I405L/S408N 85 13 L72N/A99I/H102W/E103V/V104E/K106D/R107S/T111H/G112Y/A282P/ His NÃO F306W/I331S/N333T 86 12 L72N/A99V/H102W/E103F/V104E/K106N/T111N/A280S/A282P/F306W His NÃO /I331S/N333T 87 10 L72N/A99I/H102W/G112Y/A282P/F306W/I331S/N333T/T383S/D413V His NÃO

37/102 88 13 L72N/A99I/Y100N/H102W/G112Y/H169R/M187L/Y246F/A282P/F306W His NÃO /I331S/N333T/A382T 89 11 L72N/A99I/H102W/V104R/G105H/R107P/G112Y/A282P/F306W/I331S/ His NÃO N333T 90 11 L72N/H102W/E103N/K106D/R107P/T111R/G112Y/A282P/F306W/I331 His NÃO T/N333T 91 10 L72N/A99I/H102W/G112Y/A282P/F306W/I331S/N333T/Y376F/K378Q His NÃO 92 11 L72N/A99I/H102W/G112Y/K191S/E197D/I201E/A282P/F306W/I331S/N His NÃO 333T 93 10 L72N/A99I/H102W/G112Y/K191A/I201V/A282P/F306W/I331S/N333T His NÃO

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 94 15 L72N/A99I/H102W/G112Y/I183P/E184A/M187L/M189I/K191N/E197T/I2 His NÃO 01T/A282P/F306W/I331S/N333T 95 His NÃO 96 15 F71M/L72N/E103F/V104H/G105T/I183P/E184A/M187L/M189I/K191N/E His NÃO 197T/I201T/A280S/A282P/F306Y 97 15 F71M/L72N/E103F/V104H/G105T/I183P/E184A/M187L/M189I/K191N/E His SIM 197T/I201T/A280S/A282P/F306Y 98 7 L72N/H102W/G112Y/A282P/F306W/I331S/N333T His NÃO

38/102 99 9 L72N/G101A/H102W/G112Y/E184A/A282P/F306W/I331S/N333T His NÃO 100 10 L72N/A99I/H102W/G112Y/I183P/E184A/A282P/F306W/I331S/N333T His NÃO 101 12 L72N/A99I/H102W/G112Y/I183L/M189I/K191S/I201T/A282P/F306W/I3 His NÃO 31S/N333T 102 12 L72N/A99I/H102W/G112Y/M187L/M189I/K191R/I201T/A282P/F306W/I His NÃO 331S/N333T 103 13 L72N/A99V/E103Q/H102W/G112Y/I183P/E184A/E197A/I201T/A282P/F His NÃO 306W/I331S/N333T 104 13 L72N/A99I/H102W/E103Q/V104D/G105S/G112Y/I183P/E184A/A282P/ His NÃO F306W/I331S/N333T 105 9 L72N/A99I/H102W/G112Y/I183P/A282P/F306W/I331S/N333T His NÃO

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 106 13 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/G112Y/I183P/M189I/K191S/A282P/ His NÃO F306W/I331S/N333T 107 11 L72N/H102W/R107P/G112Y/I183P/E184A/E197A/A282P/F306W/I331S His NÃO /N333T 108 11 L72N/A99T/H102W/G112Y/I183P/E184A/I201T/A282P/F306W/I331S/N His NÃO 333T 109 12 L72N/A99I/H102W/G112Y/A136T/L137T/F225Y/A282P/F306W/I331S/N His NÃO 333T/F407Y

39/102 110 10 L72N/A99I/H102W/G112Y/A282P/F306W/I331S/N333T/I405L/S408D/A His NÃO 436T 111 13 L72N/A99I/H102W/G112Y/I183P/E184A/M187L/M189I/K191N/A282P/F His NÃO 306W/I331S/N333T 112 13 L72N/A99V/H102W/E103Q/G112Y/I183P/E184A/E197A/I201T/A282P/F His NÃO 306W/I331S/N333T 113 15 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/G105A/R107P/G112Y/M187L/K191 His NÃO S/I201T/A282P/F306W/I331S/N333T 114 15 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/G105A/R107P/G112Y/M187L/K191 His SIM S/I201T/A282P/F306W/I331S/N333T

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 115 14 L72N/H102W/V104D/G105A/G112Y/I183F/E184T/M189I/K191S/I201T/ His NÃO A282P/F306W/I331S/N333T 116 14 L72N/A99V/H102W/V104H/G105A/G112Y/M187L/M189I/K191S/I201T/ His NÃO A282P/F306W/I331S/N333T 117 14 L72N/A99I/H102W/V104D/G105S/G112Y/I183P/M187L/M189I/I201T/A His NÃO 282P/F306W/I331S/N333T 118 16 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104D/G112Y/I183P/E184A/M189I/K191R/I His NÃO 201T/A280S/A282P/F306W/I331S/N333T

40/102 119 12 L72N/A99I/H102W/E103Q/V104H/G112Y/I183L/M189I/A282P/F306W/I His NÃO 331S/N333T 120 13 L72N/A99I/H102W/G112Y/I183S/E183A/M189I/K191N/I201T/A282P/F3 His NÃO 06W/I331S/N333T 121 10 L72N/A99I/H102W/G112Y/A136T/L137T/A282P/F306W/I331S/N333T His NÃO 122 13 L72N/A99I/H102W/G112Y/A136T/L137T/F220L/F225Y/H230L/A282P/F His NÃO 306W/I331S/N333T 123 11 L72N/A99I/H102W/G112Y/L137T/F220L/H203K/A282P/F306W/I331S/N His NÃO 333T 124 13 L72N/A99I/H102W/G112Y/A136T/L137T/F225Y/A282P/F306W/I331S/N His NÃO 333T/F407Y

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 125 11 L72N/A99I/H102W/R107P/G112Y/I183L/E184A/A282P/F306W/I331S/N His NÃO 333T 126 15 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/G105S/R107P/G112Y/M187L/K191 His NÃO R/I201T/A282P/F306W/I331S/N333T 127 15 L72N/A99I/H102W/G112Y/I183L/E184R/M187L/M189I/K191N/E197K/I2 His NÃO 01T/A282P/F306W/I331S/N333T 128 13 L72N/A99I/H102W/G112Y/E184D/M187L/M189I/K191R/E197A/I201T/A His NÃO 282P/F306W/I331S/N333T

41/102 129 13 L72N/A99I/H102W/G112Y/I183S/E184V/M187L/M189I/K191R/A282P/F His NÃO 306W/I331S/N333T 130 14 L72N/A99V/H102W/V104D/G112Y/E184A/M187L/M189I/K191R/E197A His NÃO /A282P/F306W/I331S/N333T 131 15 L72N/A99V/H102W/V104H/G105A/G112Y/M189I/K191S/I201T/A282P/ His NÃO F306W/I331S/N333T 132 16 L72N/A99I/H102W/E103Q/V104D/G105S/G112Y/I183P/M189I/K191S/I His NÃO 201T/A280S/A282P/F306W/I331S/N333T 133 13 L72N/A99V/H102W/E103Q/R107P/G112Y/I183P/E184A/I201T/A282P/ His NÃO F306W/I331S/N333T

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 134 14 L72N/A99T/H102W/E103F/R107P/G112Y/I183P/E184A/I201T/A282P/S His NÃO 724C/F306W/I331S/N333T 135 9 L72N/A99V/H102W/R107P/G112Y/A282P/F306W/I331S/N333T His NÃO 136 17 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/G105A/R107P/G112Y/M187L/K191 His NÃO S/I201T/A282P/F306W/I331S/N333T/I405L/S408D 137 16 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104D/G112Q/I183P/E184A/M189I/K191R/ His NÃO I201T/A280S/A282P/F306W/I331S/N333T 138 14 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/G112Y/I183P/A282P/F306W His NÃO

42/102 /I331S/N333T/S408N/A436T 139 17 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/G105A/R107P/G112L/M187L/K191 His NÃO S/I201T/F220L/F225Y/A282P/F306W/I331S/N333T 140 18 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/G105A/R107P/G112L/A136T/M187 His NÃO L/K191S/I201T/H230L/A282P/F306W/I331S/N333T 141 18 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/G105A/R107P/G112C/M187L/K191 His NÃO S/I201T/F220L/F225Y/A282P/F306W/I331S/N333T 142 16 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104D/G112R/I183P/E184A/M189I/K191R/ His NÃO I201T/A280S/A282P/F306W/I331S/N333T 143 12 L72N/A99V/H102W/V104H/G105A/M189I/K191S/I201T/A282P/F306W/I His NÃO 331S/N333T

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 144 12 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104D/R107P/G112C/I201E/A282P/F306W His NÃO /I331S/N333T 145 12 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104D/G112L/M187L/I201T/A282P/F306W/ His NÃO I331S/N333T 146 12 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104L/G112D/K191S/A282P/F306W/I331S/ His NÃO N333T/S408N 147 14 L72N/A99I/H102W/E103Q/V104L/G112Y/A136T/K191S/A282P/F306W/ His NÃO I331S/N333T/S408N/A436T

43/102 148 15 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104L/R107P/G112Y/A136T/I183P/K191S/I His NÃO 201T/A282P/F306W/I331S/N333T 149 14 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/G112Y/H142Q/K191S/I201T His NÃO /A282P/F306W/I331S/N333T 150 14 L72N/A99I/H102W/E103Q/V104H/G112D/K191S/I201T/F225Y/A282P/ His NÃO F306W/I331S/N333T/S408N 151 15 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/G105A/R107P/G112Y/M187L/K191 His NÃO S/I201T/A282P/F306W/I331S/N333T/S408D 152 14 L72N/A99G/H102W/E103H/V104H/R107P/G112Y/I183P/A282P/F306W His NÃO /I331S/N333T/S408N/A436T

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 153 14 L72N/A99R/H102W/E103R/V104H/R107P/G112Y/I183P/A282P/F306W His NÃO /I331S/N333T/S408N/A436T 154 14 L72N/A99G/H102W/E103W/V104H/R107P/G112Y/I183P/A282P/F306 His NÃO W/I331S/N333T/S408N/A436T 155 13 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/I183P/A282P/F306W/I331S/ His NÃO N333T/S408N/A436T 156 15 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/G112Y/N140D/I183P/A282P His NÃO /F306W/I331S/N333T/S408N/A436T

44/102 157 15 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/I110F/G112Y/I183P/A282P/ His NÃO F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 158 14 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/G112L/I183P/A282P/F306W His NÃO /I331S/N333T/S408N/A436T 159 14 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/G112K/I183P/A282P/F306W His NÃO /I331S/N333T/S408N/A436T 160 15 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/T111R/G112R/I183P/A282P/ His NÃO F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 161 15 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/G112Y/I183P/L219M/A282P/ His NÃO F306W/I331S/N333T/S408N/A436T

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 162 16 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/G105A/R107P/T111N/Y112A/I183P/ His NÃO A282P/F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 163 19 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/G112Y/I183P/E184A/M189I/ His NÃO K191R/I201T/L219W/A282P/F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 164 15 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/G112Y/D168E/I183P/A282P/ His NÃO F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 165 19 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/G112Y/I183P/E184A/M189I/ His NÃO K191R/I201T/F249W/A282P/F306W/I331S/N333T/S408N/A436T

45/102 166 15 L72N/A99V/H102W/E103Q/V104H/R107P/G112Y/I183P/F249W/A282P His NÃO /F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 167 14 Sequência AA idêntica a (138) His NÃO 168 15 L72N/A99R/H102W/E103R/V104H/R107P/G112Y/I183P/F249W/A282P His NÃO /F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 169 15 L72N/A99G/H102W/E103W/V104H/R107P/G112Y/I183P/F249W/A282 His NÃO P/F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 170 15 L72N/A99G/H102W/E103W/V104H/R107P/Y112K/I183P/F249W/A282 His NÃO P/F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 171 14 L72N/A99G/H102W/E103W/V104F/R107P/G112Y/I183P/A282P/F306 His NÃO W/I331S/N333T/S408N/A436T

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 172 15 L72N/A99G/H102W/E103W/V104H/R107P/G112Y/I183P/A282P/F306 His NÃO W/I331S/N333T/S408N/A436T e inserção de arginina entre P107 e P108 173 16 L72N/A99G/H102W/E103W/V104H/R107P/P108R/G112Y/I183P/A282P His NÃO /F306W/I331S/N333T/S408N/A436T -e inserção de leucina entre P107 e R108 174 14 L72N/A99G/H102W/E103W/V104H/R107P/Y112K/I183P/A282P/F306 His NÃO W/I331S/N333T/S408N/A436T

46/102 175 15 L72N/A99G/H102W/E103W/V104H/R107P/G112Y/I183P/K191M/A282 His NÃO P/F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 176 17 L72N/A99G/H102W/E103W/V104H/R107P/G112Y/I183P/M189I/I201S/ His NÃO N232S/A282P/F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 177 18 L72N/A99G/H102W/E103W/V104H/R107P/G112Y/I183P/E184A/M189I/ His NÃO K191R/I201F/A282P/F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 178 17 F71M/L72N/E103F/V104H/G105T/I110T/G112T/I183P/E184A/M187L/M His NÃO 189I/K191N/E197T/I201T/A280S/A282P/F306Y 179 22 I183P/E184A/M187L/M189I/K191S/E197T/I201T/N375A/Y376C/K378G/ His NÃO K380G/A382G/K384G/P386S/N411R/D413S/Q416T/E419L/K427M/N42 9E/G432A/A436T

Proteína Número de Lista de mutações Etiqueta PEGuilado mutações 180 19 A99I/G112S/F306Y/I405L/S408N/A436T/I183P/E185T/M189I/K191N/N His NÃO 375H/Y376L/K378P/K380S/A382R/K384N/P386K/V387L/N389E 181 13 L72N/A99R/H102W/E103R/V104D/G112M/I183P/A282P/F306W/I331S/ His NÃO N333T/S408N/A436T 182 16 L72N/A99G/H102W/E103W/V104H/R107P/G112M/I183P/I201F/F249W His NÃO /A282P/F306W/I331S/N333T/S408N/A436T 183 17 L72N/A99G/H102W/E103W/V104H/R107P/G112Y/I183P/M189I/I201C/ His NÃO F249W/A282P/F306W/I331S/N333T/S408N/A436T

47/102 184 15 L72N/A99R/H102W/E103R/V104H/R107P/G112Y/I183P/A282P/F306W His NÃO /I331S/N333T/L337T/S408N/A436T 185 17 L72N/A99R/H102W/E103R/V104H/R107P/I110A/G112Y/I183P/A280G/ His NÃO A282P/F306W/I331S/N333T/L337T/S408N/A436T

IV. Degradação enzimática da quinurenina para terapia

[0067] Em certos aspectos, os polipeptídeos podem ser usados para o tratamento de doenças, incluindo cânceres que são sensíveis à depleção de quinurenina, com enzimas que esgotam a quinurenina, para prevenir efeitos tolerogenéticos mediados por tumor e, em vez mediar respostas pró-inflamatórias de ablação de tumor. Em certos aspectos, as quinureninases são contempladas para uso no tratamen- to de tumores que expressam IDO1, IDO2 e/ou TDO.

[0068] Certos aspectos da presente invenção fornecem uma qui- nureninase modificada para o tratamento de doenças, tais como tumo- res. Particularmente, o polipeptídeo modificado pode ter sequências de polipeptídeos humanas e, portanto, pode prevenir reações alérgicas em pacientes humanos, permitir dosagem repetida e aumentar a eficá- cia terapêutica.

[0069] Os tumores para os quais os presentes métodos de trata- mento são úteis incluem qualquer tipo de célula maligna, tal como as encontradas em um tumor sólido ou um tumor hematológico. Tumores sólidos exemplares podem incluir, mas não estão limitados a, um tu- mor de um órgão selecionado a partir do grupo que consiste em pân- creas, cólon, ceco, estômago, cérebro, cabeça, pescoço, ovário, rim, laringe, sarcoma, pulmão, bexiga, melanoma, próstata e mama. Tumo- res hematológicos exemplares incluem tumores da medula óssea, ma- lignidades de células T ou B, leucemias, linfomas, blastomas, mielo- mas e similares. Outros exemplos de cânceres que podem ser trata- dos usando os métodos fornecidos no presente documento incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, câncer de células escamosas, câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago (incluindo câncer gastrointestinal e câncer estromal gas- trointestinal), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de mama, cân- cer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, car- cinoma de glândula salivar, câncer renal ou renal, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireoide, vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, melanoma, melanoma de disseminação superficial, melano- ma lentigo maligno, melanomas lentiginosos acrais, melanomas nodu- lares, bem como linfoma de células B (incluindo linfoma não Hodgkin de grau baixo/folicular (NHL); NHL de linfocítico pequeno (SL); NHL de grau intermediário/folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de grau alto; LNH linfoblástico de grau alto; NHL de cé- lulas pequenas não clivadas de grau alto; NHL de doença volumosa; linfoma de células do manto; linfoma relacionado à AIDS; e macroglo- bulinemia de Waldenstrom), leucemia linfocítica crônica (CLL), leuce- mia linfoblástica aguda (ALL), leucemia de células pilosas, mieloma múltiplo, leucemia mieloide aguda (AML) e leucemia mieloblástica crô- nica.

[0070] O câncer pode ser especificamente do seguinte tipo histo- lógico, embora não se limite a estes: neoplasia maligna; carcinoma; carcinoma indiferenciado; carcinoma de células gigantes e fusiformes; carcinoma de células pequenas; carcinoma papilar; carcinoma de célu- las escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma basocelular; carci- noma pilomatrix; carcinoma de células transicionais; carcinoma de cé- lulas de transição papilar; adenocarcinoma; gastrinoma maligno; co- langiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular e colangiocarcinoma combinados; adenocarcinoma trabecular; carcino- ma adenóide cístico; adenocarcinoma em pólipo adenomatoso; ade- nocarcinoma, polipose coli familiar; carcinoma sólido; tumor carcinóide maligno; adenocarcinoma branchiolo-alveolar; adenocarcinoma papi-

lar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifí- lico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma pa- pilar e folicular; carcinoma esclerosante não encapsulante; carcinoma cortical adrenal; carcinoma endometrioide; carcinoma de apêndice da pele; adenocarcinoma apócrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocar- cinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermóide; cistadenocarcino- ma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células em anel de sinete; carcinoma do ducto infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatório; doença de paget mamária; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma com metaplasia escamosa; timoma maligno; tumor do estroma ovariano maligno; tecoma maligno; tumor de células da granulosa maligno; androblastoma maligno; carcinoma de células de Sertoli; tumor de células de Leydig, maligno; tumor de células lipídicas maligno; paraganglioma maligno; paraganglioma extra-mamário malig- no; feocromocitoma; glomangiossarcoma; melanoma maligno; mela- noma amelanótico; melanoma expansivo superficial; melanoma malig- no em nevo pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevo azul maligno; sarcoma; fibrossarcoma; histiocitoma fibroso ma- ligno; mixossarcoma; lipossarcoma; leiomiossarcoma; rabdomiossar- coma; rabdomiossarcoma embrionário; rabdomiossarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor misto, maligno; tumor misto mulleriano; ne- froblastoma; hepatoblastoma; carcinossarcoma; mesênquimoma ma- ligno; tumor de brenner maligno; tumor filodes maligno; sarcoma sino- vial; mesotelioma maligno; disgerminoma; carcinoma embrionário; te- ratoma maligno; struma ovarii maligno; coriocarcinoma; mesonefroma maligno; hemangiossarcoma; hemangioendotelioma maligno; sarcoma de kaposi; hemangiopericitoma maligno; linfangiossarcoma; osteos-

sarcoma; osteossarcoma justacortical; condrossarcoma; condroblas- toma maligno; condrossarcoma mesenquimal; tumor de células gigan- tes do osso; sarcoma de Ewing; tumor odontogênico maligno; odonto- sarcoma ameloblástico; ameloblastoma maligno; fibrossarcoma ame- loblástico; pinealoma maligno; cordoma; glioma maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplasmático; astrocitoma fibrilar; as- troblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebelar; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogênico olfatório; meningi- oma maligno; neurofibrossarcoma; neurilemoma maligno; tumor de células granulares maligno; linfoma maligno; doença de Hodgkin; hod- gkin's; paragranuloma; linfoma maligno, pequeno linfocítico; linfoma maligno de células grandes, difuso; linfoma maligno folicular; micose fungóide; outros linfomas não hodgkin especificados; histiocitose ma- ligna; mieloma múltiplo; sarcoma de mastócitos; doença imunoprolife- rativa do intestino delgado; leucemia; leucemia linfóide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células de linfossar- coma; Leucemia mielóide; leucemia basofílica; leucemia eosinofílica; leucemia monocítica; leucemia de mastócitos; leucemia megaca- rioblástica; sarcoma mieloide; e leucemia de células cabeludas.

[0071] A quinureninase pode ser usada no presente documento como um agente antitumoral em uma variedade de modalidades para a depleção de quinurenina e/ou metabólitos derivados de quinurenina do tecido tumoral, ou a circulação de um mamífero com câncer, ou pa- ra a depleção de quinurenina, onde sua depleção é considerada dese- jável.

[0072] A depleção pode ser conduzida in vivo na circulação de um mamífero, in vitro nos casos em que a depleção de metabólitos deri- vados de quinurenina e/ou quinurenina em cultura de tecidos ou outros meios biológicos é desejada, e em procedimentos ex vivo onde fluidos biológicos, células ou tecidos são manipulados fora do corpo e subse- quentemente devolvidos ao corpo do paciente mamífero. A depleção de quinurenina da circulação, meios de cultura, fluidos biológicos ou células é conduzido para reduzir a quantidade de quinurenina acessí- vel ao material sendo tratado e, portanto, compreende colocar o mate- rial a ser depletado em contato com uma quantidade de depleção de quinurenina da quinureninase sob condições de depleção de quinure- nina para degradar a quinurenina ambiente no material sendo contata- do.

[0073] O esgotamento pode ser direcionado para a fonte de nutri- entes para as células, e não necessariamente para as próprias células. Portanto, em uma aplicação in vivo, o tratamento de uma célula tumo- ral inclui colocar o meio nutriente para uma população de células tu- morais em contato com a quinureninase. Nesta modalidade, o meio pode ser sangue, fluido linfático, fluido espinhal e fluido corporal simi- lar, onde a depleção de quinurenina é desejada.

[0074] A eficiência de depleção de metabólitos derivados de quinu- renina e/ou quinurenina pode variar amplamente, dependendo da apli- cação e, normalmente, dependendo da quantidade de quinurenina presente no material, a taxa de depleção desejada e a tolerância do material à exposição à quinureninase. Os níveis de quinurenina e me- tabólito de quinurenina em um material e, portanto, as taxas de deple- ção de quinurenina e metabólito de quinurenina do material, podem ser facilmente monitorados por uma variedade de métodos químicos e bioquímicos bem conhecidos na técnica. Quantidades de depleção de quinurenina exemplares são descritas mais adiante, e podem variar de 0,001 a 100 unidades (U) de quinureninase, de preferência cerca de 0,01 a 10 U, e mais preferencialmente cerca de 0,1 a 5 U de quinure- ninase por mililitro (mL) de material sendo tratado. As dosagens típicas podem ser administradas com base no peso corporal e estão na faixa de cerca de 5-1000 U/quilograma (kg)/dia, de preferência cerca de 5- 100 U/kg/dia, mais preferencialmente cerca de 10-50 U/kg/dia, e mais preferencialmente cerca de 20-40 U/kg/dia.

[0075] As condições de depleção de quinurenina são condições de tampão e temperatura compatíveis com a atividade biológica de uma quinureninase e incluem condições moderadas de temperatura, sal e pH compatíveis com a enzima, por exemplo, condições fisiológicas. Condições exemplares incluem cerca de 4-40 °C, força iônica equiva- lente a cerca de 0,05 a 0,2 M de NaCl e um pH de cerca de 5 a 9, en- quanto as condições fisiológicas são incluídas.

[0076] Em uma modalidade particular, a invenção contempla mé- todos de uso de uma quinureninase como um agente antitumoral e, portanto, compreende colocar uma população de células tumorais em contato com uma quantidade terapeuticamente eficaz de quinureni- nase por um período de tempo suficiente para inibir o crescimento de células tumorais.

[0077] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma quinure- ninase é uma quantidade predeterminada calculada para atingir o efei- to desejado, ou seja, para depletar a quinurenina no tecido tumoral ou na circulação de um paciente e, assim, mediar uma resposta pró- inflamatória de ablação de tumor. Assim, as faixas de dosagem para a administração de quinureninase da invenção são aquelas grandes o suficiente para produzir o efeito desejado no qual os sintomas de divi- são de células tumorais e ciclo celular são reduzidos. A dosagem não deve ser tão grande a ponto de causar efeitos colaterais adversos, tais como síndromes de hiperviscosidade, edema pulmonar, insuficiência cardíaca congestiva, efeitos neurológicos e similares. Geralmente, a dosagem irá variar com a idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente e pode ser determinada por um versado na técnica. A do- sagem pode ser ajustada pelo clínico individual no caso de qualquer complicação.

[0078] A quinureninase pode ser administrada parenteralmente por injeção ou por infusão gradual ao longo do tempo. A quinureninase pode ser administrada por via intravenosa, intraperitoneal, oral, intra- muscular, subcutânea, intracavidade, transdérmica, dérmica, pode ser administrada por meios peristálticos, pode ser injetada diretamente no tecido que contém as células tumorais ou pode ser administrada por uma bomba conectada a um cateter que pode conter um biossensor potencial para quinurenina.

[0079] As composições terapêuticas contendo quinureninase são convencionalmente administradas por via intravenosa, como por inje- ção de uma dose unitária, por exemplo. O termo "dose unitária", quan- do usado em referência a uma composição terapêutica, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagem unitária pa- ra o paciente, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente necessário, ou seja, transportador ou veículo.

[0080] As composições são administradas de uma maneira com- patível com a formulação de dosagem e em uma quantidade terapeuti- camente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do paciente a ser tratado, da capacidade do sistema do paciente de usar o ingredi- ente ativo e do grau de efeito terapêutico desejado. As quantidades precisas de ingrediente ativo que devem ser administradas dependem do julgamento do clínico e são peculiares a cada indivíduo. No entan- to, intervalos de dosagem adequados para aplicação sistêmica são divulgados no presente documento e dependem da via de administra- ção. Regimes adequados para administração inicial e doses de reforço também são contemplados e são tipificados por uma administração inicial seguida por doses repetidas em intervalos de uma ou mais ho-

ras por uma injeção subsequente ou outra administração. Múltiplas administrações exemplares são descritas aqui e são particularmente preferidas para manter continuamente altos níveis de quinureninase em soro e nos tecidos e, inversamente, baixos níveis de quinurenina em soro e nos tecidos. Alternativamente, a infusão intravenosa contí- nua suficiente para manter as concentrações no sangue nas faixas es- pecificados para terapias in vivo é contemplada. V. Conjugados

[0081] As composições e métodos da presente invenção envolvem quinureninases modificadas, tais como por formação de conjugados com segmentos de peptídeos heterólogos ou polímeros, tais como po- lietilenoglicol. Em outros aspectos, as quinureninases podem ser liga- das ao PEG para aumentar o raio hidrodinâmico da enzima e, portan- to, aumentar a persistência em soro. Em certos aspectos, o polipeptí- deo divulgado pode ser conjugado a qualquer agente de direciona- mento, tal como um ligante tendo a capacidade de se ligar de forma específica e estável a um receptor externo ou local de ligação em uma célula tumoral (Publicação de Patente dos EUA de nº 2009/0304666). A. Proteínas de Fusão

[0082] Certas modalidades da presente invenção referem-se a proteínas de fusão. Estas moléculas podem ter uma quinureninase na- tiva ou modificada ligada no N- ou C-terminal a um domínio heterólo- go. Por exemplo, as fusões também podem empregar sequências líder de outras espécies para permitir a expressão recombinante de uma proteína em um hospedeiro heterólogo. Outra fusão útil inclui a adição de uma etiqueta de afinidade de proteína, tal como uma etiqueta de afinidade de albumina sérica ou seis resíduos de histidina, ou um do- mínio imunologicamente ativo, tal como um epítopo de anticorpo, pre- ferencialmente clivável, para facilitar a purificação da proteína de fu- são. Os marcadores de afinidade não limitantes incluem poli-histidina,

proteína de ligação à quitina (CBP), proteína de ligação à maltose (MBP) e glutationa-S-transferase (GST).

[0083] Em uma modalidade particular, a quinureninase pode estar ligada a um peptídeo que aumenta a meia-vida in vivo, tal como um polipeptídeo XTEN (Schellenberger et al., 2009), domínio Fc de IgG, albumina ou peptídeo de ligação à albumina.

[0084] Os métodos para de gerar proteínas de fusão são bem co- nhecidos por aqueles técnicos no assunto. Tais proteínas podem ser produzidas, por exemplo, por síntese de novo da proteína de fusão completa, ou por ligação da sequência de DNA que codifica o domínio heterólogo, seguida pela expressão da proteína de fusão intacta.

[0085] A produção de proteínas de fusão que recuperam as ativi- dades funcionais das proteínas parentais pode ser facilitada pela co- nexão de genes com um segmento de DNA em ponte que codifica um ligante de peptídeo que é dividido entre os polipeptídeos conectados em tandem. O ligante teria comprimento suficiente para permitir o do- bramento apropriado da proteína de fusão resultante. B. PEGuilação

[0086] Em certos aspectos da invenção, métodos e composições relacionados à PEGuilação de quinureninase são divulgados. Por exemplo, a quinureninase pode ser PEGuilada de acordo com os mé- todos divulgados aqui.

[0087] A PEGuilação é o processo de ligação covalente de cadei- as de polímero de poli(etilenoglicol) a outra molécula, normalmente um fármaco ou proteína terapêutica. A PEGuilação é rotineiramente al- cançada pela incubação de um derivado reativo de PEG com a ma- cromolécula alvo. A ligação covalente de PEG a um fármaco ou prote- ína terapêutica pode "mascarar" o agente do sistema imunológico do hospedeiro (imunogenicidade e antigenicidade reduzidas) ou aumentar o tamanho hidrodinâmico (tamanho em solução) do agente, o que pro-

longa seu tempo circulatório reduzindo liberação. A PEGuilação tam- bém pode fornecer solubilidade em água para fármacos e proteínas hidrofóbicas.

[0088] A primeira etapa da PEGuilação é a funcionalização ade- quada do polímero de PEG em um ou ambos os terminais. Os PEGs que são ativados em cada terminal com a mesma fração reativa são conhecidos como "homobifuncionais", enquanto que, se os grupos funcionais presentes forem diferentes, então o derivado de PEG é re- ferido como "heterobifuncional" ou "heterofuncional". Os derivados quimicamente ativos ou ativados do polímero de PEG são preparados para anexar o PEG à molécula desejada.

[0089] A escolha do grupo funcional adequado para o derivado de PEG é baseada no tipo de grupo reativo disponível na molécula que será acoplada ao PEG. Para as proteínas, os aminoácidos reativos típicos incluem lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, áci- do glutâmico, serina, treonina e tirosina. O grupo amino N-terminal e o ácido carboxílico C-terminal também podem ser usados.

[0090] As técnicas usadas para formar derivados de PEG de pri- meira geração geralmente fazem reagir o polímero de PEG com um grupo que é reativo com grupos hidroxila, normalmente anidridos, clo- retos de ácido, cloroformatos e carbonatos. Na química de PEGuilação de segunda geração, grupos funcionais mais eficientes, tais como al- deído, ésteres, amidas, etc., são disponibilizados para conjugação.

[0091] À medida que as aplicações de PEGuilação se tornam cada vez mais avançadas e sofisticadas, tem havido um aumento na neces- sidade de PEGs heterobifuncionais para a conjugação. Esses PEGs heterobifuncionais são muito úteis na ligação de duas entidades, onde um espaçador hidrofílico, flexível e biocompatível é necessário. Os grupos finais preferidos para PEGs heterobifuncionais são maleimida, vinil sulfonas, dissulfeto de piridila, amina, ácidos carboxílicos e éste-

res NHS.

[0092] Os agentes de modificação mais comuns, ou ligantes, são baseados em moléculas de metóxi-PEG (mPEG). Sua atividade de- pende da adição de um grupo modificador de proteína à extremidade de álcool. Em alguns casos, o polietilenoglicol (PEG diol) é usado co- mo a molécula precursora. O diol é subsequentemente modificado em ambas as extremidades para fazer uma molécula ligada a PEG hete- rodimérica ou homodimérica.

[0093] As proteínas são geralmente PEGuiladas em locais nucleo- fílicos, tais como tióis não protonados (resíduos de cisteinila) ou gru- pos amino. Exemplos de reagentes de modificação específicos de cis- teinila incluem PEG-maleimida, PEG-iodoacetato, PEG-tióis e PEG- vinilsulfona. Todos os quatro são fortemente específicos para cisteinila sob condições suaves e pH neutro a ligeiramente alcalino, mas cada um tem algumas desvantagens. O tioéter formado com as maleimidas pode ser um tanto instável sob condições alcalinas, portanto, pode ha- ver alguma limitação às opções de formulação com este ligante. A li- gação carbamotioato formada com PEGs de iodo é mais estável, mas o iodo livre pode modificar os resíduos de tirosina em algumas condi- ções. Os PEG-tióis formam ligações dissulfeto com tióis de proteína, mas esta ligação também pode ser instável sob condições alcalinas. A reatividade do PEG-vinilsulfona é relativamente lenta em comparação com a maleimida e o iodo de PEG; no entanto, a ligação tioéter forma- da é bastante estável. Sua taxa de reação mais lenta também pode tornar a reação PEG-vinilsulfona mais fácil de controlar.

[0094] A PEGuilação específica de local em resíduos de cisteinil nativos raramente é realizada, uma vez que esses resíduos estão ge- ralmente na forma de ligações dissulfeto ou são necessários para a atividade biológica. Por outro lado, a mutagênese direcionada ao local pode ser usada para incorporar locais de PEGuilação de cisteinila para ligantes específicos de tiol. A mutação da cisteína deve ser projetada de tal modo que seja acessível ao reagente de PEGuilação e ainda seja biologicamente ativa após a PEGuilação.

[0095] Os agentes de modificação específicos de amina incluem PEG NHS éster, PEG tresilato, PEG aldeído, PEG isotiocianato e vá- rios outros. Todos reagem sob condições moderadas e são muito es- pecíficos para grupos amino. O éster PEG NHS é provavelmente um dos agentes mais reativos; no entanto, sua alta reatividade pode tornar a reação de PEGuilação difícil de controlar em grande escala. O PEG aldeído forma uma imina com o grupo amino, que é então reduzida a uma amina secundária com cianoboro-hidreto de sódio. Ao contrário do boro-hidreto de sódio, o cianoboro-hidreto de sódio não reduz as ligações dissulfeto. No entanto, este produto químico é altamente tóxi- co e deve ser manuseado com cautela, especialmente em pH mais baixo, onde se torna volátil.

[0096] Devido aos múltiplos resíduos de lisina na maioria das pro- teínas, a PEGuilação específica de local pode ser um desafio. Feliz- mente, como esses reagentes reagem com grupos amino não proto- nados, é possível direcionar a PEGuilação para grupos amino de pK inferior realizando a reação em um pH mais baixo. Geralmente, a pK do grupo alfa-amino é 1-2 unidades de pH inferior ao grupo épsilon- amino dos resíduos de lisina. Ao PEGuilar a molécula em pH 7 ou infe- rior, alta seletividade para o N-terminal frequentemente pode ser al- cançada. No entanto, isso só é viável se a porção N-terminal da prote- ína não for necessária para a atividade biológica. Ainda assim, os be- nefícios farmacocinéticos da PEGuilação frequentemente superam uma perda significativa de bioatividade in vitro, resultando em um pro- duto com muito maior bioatividade in vivo, independentemente da química da PEGuilação.

[0097] Existem vários parâmetros a serem considerados ao de-

senvolver um procedimento de PEGuilação. Felizmente, geralmente não há mais do que quatro ou cinco parâmetros principais. A aborda- gem de "projeto de experimentos" para a otimização das condições de PEGuilação pode ser muito útil. Para reações de PEGuilação específi- cas de tiol, os parâmetros a serem considerados incluem: concentra- ção de proteína, proporção de PEG para proteína (em uma base mo- lar), temperatura, pH, tempo de reação e, em alguns casos, a exclusão de oxigênio. (O oxigênio pode contribuir para a formação de dissulfeto intermolecular pela proteína, o que reduzirá o rendimento do produto PEGuilado). Os mesmos fatores devem ser considerados (com exce- ção do oxigênio) para a modificação específica da amina, exceto que o pH pode ser ainda mais crítico, particularmente quando se direciona o grupo amino N-terminal.

[0098] Para modificações específicas de amina e tiol, as condições de reação podem afetar a estabilidade da proteína. Isso pode limitar a temperatura, a concentração de proteína e o pH. Além disso, a reativi- dade do ligante de PEG deve ser conhecida antes de iniciar a reação de PEGuilação. Por exemplo, se o agente de PEGuilação é somente 70 por cento ativo, a quantidade de PEG usada deve garantir que so- mente as moléculas de PEG ativas sejam contadas na estequiometria da reação de proteína para PEG. VI. Proteínas e Peptídeos

[0099] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a novas composições compreendendo pelo menos uma proteína ou pep- tídeo, tal como uma quinureninase. Estes peptídeos podem estar compreendidos em uma proteína de fusão ou conjugados a um agen- te, conforme descrito supra.

[00100] Conforme usado aqui, uma proteína ou peptídeo geralmen- te refere-se, mas não está limitado a, uma proteína com mais de cerca de 200 aminoácidos, até uma sequência de comprimento total traduzi-

da a partir de um gene; um polipeptídeo com mais de cerca de 100 aminoácidos; e/ou um peptídeo de cerca de 3 a cerca de 100 aminoá- cidos. Por conveniência, os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptí- deo" são usados indistintamente no presente documento.

[00101] Conforme usado no presente documento, um "resíduo de aminoácido" refere-se a qualquer aminoácido de ocorrência natural, qualquer derivado de aminoácido ou qualquer mimetizador de aminoá- cido conhecido na técnica. Em certas modalidades, os resíduos de proteína ou peptídeo são sequenciais, sem quaisquer não aminoáci- dos interrompendo a sequência de resíduos de aminoácidos. Em ou- tras modalidades, a sequência pode compreender uma ou mais fra- ções não aminoácidas. Em modalidades particulares, a sequência de resíduos de proteína ou peptídeo pode ser interrompida por uma ou mais frações não aminoácidas.

[00102] Por conseguinte, o termo "proteína ou peptídeo" abrange sequências de aminoácidos compreendendo pelo menos um dos 20 aminoácidos comuns encontrados em proteínas de ocorrência natural, ou pelo menos um aminoácido modificado ou incomum.

[00103] Proteínas ou peptídeos podem ser feitos por qualquer téc- nica conhecida pelos técnicos no assunto, incluindo a expressão de proteínas, polipeptídeos ou peptídeos através de técnicas de biologia molecular padrão, o isolamento de proteínas ou peptídeos de fontes naturais ou a síntese química de proteínas ou peptídeos. As sequên- cias de nucleotídeos e proteínas, polipeptídeos e peptídeos corres- pondentes a vários genes foram anteriormente divulgadas e podem ser encontradas em bases de dados computadorizadas conhecidas por aqueles técnicos no assunto. Uma dessas bases de dados é a ba- se de dados Genbank e GenPept do National Center for Biotechnology Information (disponível na Internet em ncbi.nlm.nih.gov/). As regiões de codificação para genes conhecidos podem ser amplificadas e/ou expressas usando as técnicas divulgadas aqui ou como seria conheci- do por aqueles técnicos no assunto. Alternativamente, várias prepara- ções comerciais de proteínas, polipeptídeos e peptídeos são conheci- das por aqueles técnicos no assunto. VII. Ácidos Nucleicos e Vetores

[00104] Em certos aspectos da invenção, as sequências de ácido nucleico que codificam uma quinureninase ou uma proteína de fusão contendo uma quinureninase podem ser divulgadas. Dependendo de qual sistema de expressão é usado, as sequências de ácido nucleico podem ser selecionadas com base em métodos convencionais. Por exemplo, se a quinureninase é derivada da quinureninase humana e contém múltiplos códons que são raramente usados em E. coli, então isso pode interferir na expressão. Portanto, os respectivos genes ou variantes dos mesmos podem ser otimizados por códons para a ex- pressão de E. coli. Vários vetores também podem ser usados para ex- pressar a proteína de interesse. Os vetores exemplares incluem, mas não estão limitados a, vetores plasmídicos, vetores virais, transposon ou vetores baseados em lipossomas. VIII. Celulas Hospedeiras

[00105] As células hospedeiras podem ser quaisquer que possam ser transformadas para permitir a expressão e secreção de quinureni- nase e conjugados da mesma. As células hospedeiras podem ser bac- térias, células de mamíferos, leveduras ou fungos filamentosos. Várias bactérias incluem Escherichia e Bacillus. Leveduras pertencentes aos gêneros Saccharomyces ou Pichia encontrariam uso como um apro- priado. IX. Composições Farmacêuticas

[00106] É contemplado que a nova quinureninase pode ser adminis- trada sistemicamente ou localmente para inibir o crescimento de célu- las tumorais e, mais preferencialmente, para matar células canceríge-

nas em pacientes com câncer com cânceres localmente avançados ou metastáticos. Elas podem ser administradas por via intravenosa, intra- tecal e/ou intraperitoneal. Elas podem ser administradas sozinhas ou em combinação com fármacos antiproliferativos. Em uma modalidade, elas são administradas para reduzir a carga de câncer no paciente an- tes da cirurgia ou outros procedimentos. Alternativamente, elas podem ser administradas após a cirurgia para garantir que qualquer câncer remanescente (por exemplo, câncer que a cirurgia não conseguiu eli- minar) não sobreviva.

[00107] Não se pretende que a presente invenção seja limitada pela natureza particular da preparação terapêutica. Por exemplo, tais com- posições podem ser fornecidas em formulações juntamente com líqui- dos, gel ou transportadores sólidos, diluentes e excipientes fisiologi- camente toleráveis. Estas preparações terapêuticas podem ser admi- nistradas a mamíferos para uso veterinário, tal como com animais do- mésticos, e uso clínico em humanos de uma maneira semelhante a outros agentes terapêuticos. Em geral, a dosagem necessária para eficácia terapêutica irá variar de acordo com o tipo de uso e modo de administração, bem como os requisitos particulares de indivíduos.

[00108] Tais composições são normalmente preparadas como solu- ções ou suspensões líquidas, como injetáveis. Diluentes e excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou similares, e combinações dos mesmos. Além disso, se desejado, as composições podem conter pequenas quantidades de substâncias au- xiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes es- tabilizadores ou agentes tamponantes de pH.

[00109] Quando as aplicações clínicas são contempladas, pode ser necessário preparar composições farmacêuticas compreendendo pro- teínas, anticorpos e fármacos em uma forma apropriada para a aplica- ção pretendida. Geralmente, as composições farmacêuticas podem compreender uma quantidade eficaz de uma ou mais quinureninase ou agentes adicionais dissolvidos ou dispersos em um transportador far- maceuticamente aceitável. As frases "farmaceuticamente ou farmaco- logicamente aceitável" referem-se a entidades moleculares e composi- ções que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa quando administradas a um animal, tal como, por exemplo, um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém pelo menos uma quiureninase isolada pelo método divulgado aqui, ou ingrediente ativo adicional, será conhecida pelos técnicos no assunto à luz da presente divulgação, conforme exemplificado por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed., 1990, incorporado no presente documento por referência. Além disso, para administração em animais (por exemplo, humanos), será enten- dido que as preparações devem atender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza, conforme exigido pelo Offi- ce of Biological Standards da FDA.

[00110] Conforme usado no presente documento, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, surfactantes, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes retardadores de absorção, sais, conservantes, fármacos, estabilizadores de fármacos, géis, ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes edulcorantes, agen- tes aromatizantes, corantes, tais como materiais e combinações dos mesmos, como seria conhecido por um versado na técnica (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed., 1990, incor- porado aqui por referência). Exceto na medida em que qualquer trans- portador convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições farmacêuticas é contemplado.

[00111] Certas modalidades da presente invenção podem compre-

ender diferentes tipos de transportadores, dependendo se é para ser administrado na forma sólida, líquida ou aerossol, e se precisa ser es- téril para a via de administração, tal como injeção. As composições podem ser administradas por via intravenosa, intradérmica, transdér- mica, intratecal, intra-arterial, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, intrarretal, intramuscular, subcutânea, mucosa, oral, tópica, local, por inalação (por exemplo, inalação de aerossol), por injeção, por infusão, por infusão contínua, por perfusão localizada, banhando as células al- vo diretamente, por meio de um cateter, por meio de uma lavagem, em composições lipídicas (por exemplo, lipossomas), ou por outros méto- dos ou qualquer combinação dos anteriores, como seria conhecido por um versado na técnica (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceuti- cal Sciences, 18ª Ed., 1990, incorporado aqui por referência).

[00112] Os polipeptídeos modificados podem ser formulados em uma composição em uma base livre, neutra ou em forma de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou tais ácidos orgânicos como o ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser deri- vados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico; ou tais bases orgânicas co- mo isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Após a formu- lação, as soluções serão administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade terapeuticamente efi- caz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como formuladas para administração pa- renteral, tais como soluções injetáveis ou aerossóis para distribuição aos pulmões, ou formuladas para administrações alimentares, tais co-

mo cápsulas de liberação de fármacos e similares.

[00113] Além disso, de acordo com certos aspectos da presente invenção, a composição adequada para administração pode ser forne- cida em um transportador farmaceuticamente aceitável com ou sem um diluente inerte. O transportador deve ser assimilável e inclui trans- portadores líquidos, semissólidos, ou seja, pastas ou sólidos. Exceto na medida em que qualquer meio, agente, diluente ou transportador convencional seja prejudicial para o receptor ou para a eficácia tera- pêutica da composição nele contida, seu uso em composição adminis- trável para uso na prática dos métodos é apropriado. Exemplos de transportadores ou diluentes incluem gorduras, óleos, água, soluções salinas, lipídios, lipossomas, resinas, aglutinantes, enchimentos e simi- lares, ou combinações dos mesmos. A composição também pode compreender vários antioxidantes para retardar a oxidação de um ou mais componentes. Além disso, a prevenção da ação de microrganis- mos pode ser realizada por conservantes, tais como vários agentes antibacterianos e antifúngicos, incluindo, mas não se limitando a, pa- rabenos (por exemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal ou combinações dos mesmos.

[00114] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a composição é combinada com o transportador de qualquer maneira conveniente e prática, ou seja, por solução, suspensão, emulsificação, mistura, encapsulação, absorção e similares. Tais procedimentos são de rotina para os técnicos no assunto.

[00115] Em uma modalidade específica da presente invenção, a composição é combinada ou completamente misturada com um trans- portador semissólido ou sólido. A mistura pode ser realizada de qual- quer maneira conveniente, tal como moagem. Agentes estabilizantes também podem ser adicionados no processo de mistura para proteger a composição da perda de atividade terapêutica, ou seja, desnatura-

ção no estômago. Exemplos de estabilizantes para uso em uma com- posição incluem tampões, aminoácidos, tais como glicina e lisina, car- boidratos, tais como dextrose, manose, galactose, frutose, lactose, sa- carose, maltose, sorbitol, manitol, etc.

[00116] Em outras modalidades, a presente invenção pode referir- se ao uso de uma composição farmacêutica de veículo lipídico que inclui quinureninases, um ou mais lipídios e um solvente aquoso. Con- forme usado no presente documento, o termo "lipídio" será definido para incluir qualquer uma de uma faixa gama de substâncias que é caracteristicamente insolúvel em água e extraível com um solvente orgânico. Esta ampla classe de compostos é bem conhecida pelos técnicos no assunto e, como o termo "lipídio" é usado no presente do- cumento, não está limitado a qualquer estrutura particular. Os exem- plos incluem compostos que contêm hidrocarbonetos alifáticos de ca- deia longa e seus derivados. Um lipídio pode ser de ocorrência natural ou sintético (ou seja, projetado ou produzido pelo homem). No entanto, um lipídio é geralmente uma substância biológica. Lípidios biológicos são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, gorduras neu- tras, fosfolípidios, fosfoglicéridos, esteróides, terpenos, lisolípidios, gli- coesfingolípidios, glicolípidios, sulfatidos, lipídios com ácidos graxos ligados a éter e éster, lipídios polimerizáveis e combinações dos mes- mos. Claro, compostos diferentes daqueles especificamente descritos no presente documento que são entendidos por um versado na técnica como lipídios também são abrangidos pelas composições e métodos.

[00117] Um versado na técnica estaria familiarizado com a varieda- de de técnicas que podem ser empregadas para dispersar uma com- posição em um veículo lipídico. Por exemplo, a quinureninase ou uma proteína de fusão da mesma pode ser dispersa em uma solução con- tendo um lipídio, dissolvida com um lipídio, emulsionada com um lipí- dio, misturada com um lipídio, combinada com um lipídio, covalente-

mente ligada a um lipídio, contida como uma suspensão em um lípido, contida ou complexada com uma micela ou lipossoma, ou de outro modo associada a um lipídio ou estrutura lipídica por qualquer meio conhecido pelos técnicos no assunto. A dispersão pode ou não resul- tar na formação de lipossomas.

[00118] A quantidade de dosagem real de uma composição admi- nistrada a um paciente animal pode ser determinada por fatores físicos e fisiológicos, tais como peso corporal, gravidade da condição, o tipo de doença a ser tratada, intervenções terapêuticas anteriores ou simul- tâneas, idiopatia do paciente e assim por diante a via de administra- ção. Dependendo da dosagem e da via de administração, o número de administrações de uma dosagem preferida e/ou uma quantidade eficaz pode variar de acordo com a resposta do paciente. O médico respon- sável pela administração irá, em qualquer caso, determinar a concen- tração de ingrediente(s) ativo(s) em uma composição e dose(s) apro- priada(s) para o paciente individual.

[00119] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas po- dem compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 0,1% de um composto ativo. Em outras modalidades, um composto ativo pode compreender entre cerca de 2% a cerca de 75% do peso da unidade, ou entre cerca de 25% a cerca de 60%, por exemplo, e qualquer faixa derivável entre. Naturalmente, a quantidade de composto(s) ativo(s) em cada composição terapeuticamente útil pode ser preparada de tal forma que uma dosagem adequada será obtida em qualquer determi- nada dose unitária do composto. Fatores, tais como solubilidade, bio- disponibilidade, meia-vida biológica, via de administração, prazo de validade do produto, bem como outras considerações farmacológicas, serão contemplados por um versado na técnica de preparação de tais formulações farmacêuticas e, como tal, uma variedade de dosagens e regimes de tratamento podem ser desejáveis.

[00120] Em outros exemplos não limitantes, uma dose também po- de compreender cerca de 1 micrograma/kg/peso corporal, cerca de 5 micrograma/kg/peso corporal, cerca de 10 micrograma/kg/peso corpo- ral, cerca de 50 micrograma/kg/peso corporal, cerca de 100 microgra- mas/kg/peso corporal, cerca de 200 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 350 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 500 microgra- mas/kg/peso corporal, cerca de 1 miligrama/kg/peso corporal, cerca de 5 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 10 miligramas/kg/peso corpo- ral, cerca de 50 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 100 miligra- mas/kg/peso corporal, cerca de 200 miligramas/kg/peso corporal, cer- ca de 350 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 500 miligra- ma/kg/peso corporal, a cerca de 1000 miligramas/kg/peso corporal ou mais por administração, e qualquer faixa derivável entre. Em exemplos não limitantes de uma faixa derivável dos números listados aqui, uma faixa de cerca de 5 miligramas/kg/peso corporal a cerca de 100 mili- gramas/kg/peso corporal, cerca de 5 microgramas/kg/peso corporal a cerca de 500 miligramas/kg/peso corporal, etc., pode ser administrada, com base nos números descritos acima. X. Tratamentos de Combinação

[00121] Em certas modalidades, as composições e métodos das presentes modalidades envolvem a administração de uma quinureni- nase em combinação com uma segunda terapia ou terapia adicional. Tal terapia pode ser aplicada no tratamento de qualquer doença asso- ciada à dependência de quinurenina. Por exemplo, a doença pode ser câncer.

[00122] Os métodos e composições, incluindo terapias de combina- ção, aperfeiçoam o efeito terapêutico ou protetor e/ou aumentam o efeito terapêutico de outra terapia anticâncer ou anti-hiperproliferativa. Métodos terapêuticos e profiláticos e composições podem ser forneci- dos em uma quantidade combinada eficaz para alcançar o efeito dese-

jado, tal como a morte de uma célula cancerígena e/ou a inibição da hiperproliferação celular. Este processo pode envolver administrar uma quinureninase e uma segunda terapia. A segunda terapia pode ou não ter um efeito citotóxico direto. Por exemplo, a segunda terapia pode ser um agente que regula positivamente o sistema imunológico sem ter um efeito citotóxico direto. Um tecido, tumor ou célula pode ser ex- posto a uma ou mais composições ou formulação(ões) farmacológi- ca(s) compreendendo um ou mais dos agentes (por exemplo, uma quinureninase ou um agente anticâncer), ou expondo o tecido, tumor e/ou célula com duas ou mais composições ou formulações distintas, em que uma composição fornece 1) uma quinureninase, 2) um agente anticâncer ou 3) uma quinureninase e um agente anticâncer. Além dis- so, é contemplado que tal terapia de combinação pode ser usada em conjunto com quimioterapia, radioterapia, terapia cirúrgica ou imunote- rapia.

[00123] Os termos "colocado(a) em contato e "exposto", quando aplicados a uma célula, são usados no presente documento para des- crever o processo pelo qual um construto terapêutico e um agente quimioterápico ou radioterápico são liberados a uma célula alvo ou são colocados em justaposição direta com a célula alvo. Para alcançar a morte celular, por exemplo, ambos os agentes são liberados a uma célula em uma quantidade combinada eficaz para matar a célula ou evitar que ela se divida.

[00124] Uma quinureninase pode ser administrada antes, durante, após ou em várias combinações em relação a um tratamento anticân- cer. As administrações podem ser em intervalos que variam de simul- taneamente a minutos a dias a semanas. Em modalidades em que a quinureninase é fornecida a um paciente separadamente de um agen- te anticâncer, geralmente se asseguraria que um período de tempo significativo não expirou entre o tempo de cada liberação, de tal modo que os dois compostos ainda seriam capazes de exercer um efeito combinado de forma vantajosa no paciente. Em tais casos, é contem- plado que se pode fornecer a um paciente a quinureninase e a terapia anticâncer dentro de cerca de 12 a 24 ou 72 horas uma da outra e, mais particularmente, dentro de cerca de 6 a 12 horas uma da outra. Em algumas situações, pode ser desejável estender o período de tem- po para o tratamento significativamente quando vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8) decorrem entre as respectivas administrações.

[00125] Em certas modalidades, um curso de tratamento durará de 1 a 90 dias ou mais (essa tal faixa inclui dias intermediários). É con- templado que um agente pode ser dado em qualquer dia do dia 1 ao dia 90 (essa tal faixa inclui dias intermediários) ou qualquer combina- ção dos mesmos, e outro agente é dado em qualquer dia do dia 1 ao dia 90 (essa tal faixa inclui dias intermediários) ou qualquer combina- ção dos mesmos. Em um único dia (período de 24 horas), o paciente pode receber uma ou várias administrações do(s) agente(s). Além dis- so, após um curso de tratamento, é contemplado que há um período de tempo em que nenhum tratamento anticâncer é administrado. Este período de tempo pode durar 1 a 7 dias e/ou 1 a 5 semanas e/ou 1 a 12 meses ou mais (essa tal faixa inclui dias intermediários), depen- dendo da condição do paciente, tal como seu prognóstico, força, saú- de, etc. Espera-se que os ciclos de tratamento sejam repetidos con- forme necessário.

[00126] Várias combinações podem ser empregadas. Para o exem- plo abaixo, uma quinureninase é "A" e uma terapia anticâncer é "B": A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

[00127] A administração de qualquer composto ou terapia das pre-

sentes modalidades a um paciente seguirá os protocolos gerais para a administração de tais compostos, levando em consideração a toxicida- de, se houver, dos agentes. Portanto, em algumas modalidades, há uma etapa de monitoramento da toxicidade que é atribuível à terapia de combinação. XI. Exemplos

[00128] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles técnicos no assunto que as técnicas divulgadas nos exemplos que se- guem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua prática. No entanto, aqueles técnicos no assunto devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado similar ou semelhante sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Exemplo 1 - Desenvolvimento e Distinção da Quinase Humana (h- KYNase)

[00129] Os presentes estudos envolveram a engenharia de varian- tes de h-KYNase e desenvolveram as variantes como terapêuticas pa- ra uma ampla faixa de tumores. Numerosas variantes humanas foram modificadas e sua atividade catalítica (Kcat/Km) para Kyn, comparável à ferramenta bacteriana Kynases, foi determinada (Figura 1A e Tabela 2, abaixo). As variantes foram otimizadas para atividade catalítica au- mentada e para resistência à desativação em 90% de soro humano in vitro (expressa como atividade residual após incubação em soro por um certo tempo). Verificou-se que as variantes humanas modificadas melhoraram muito a estabilidade catalítica em soro humano in vitro (Figura 1B e Tabela 2).

[00130] As variantes humanas, tais como as proteínas (68) e (153),

mostraram degradação de Kyn prolongada em camundongos após uma única dose intravenosa (Figura 1C). Para estes estudos, camun- dongos fêmeas BALB/c, de 6 a 8 semanas, pesando aproximadamen- te 18 a 20 g, foram dosados iv com veículo (PBS pH 7,4) ou 10 mg/kg de (68)/(153). Às 6, 24, 48, 72 e 120 horas após a dosagem, os ca- mundongos sangraram terminalmente (n = 4 camundongos/ponto de tempo) e as amostras de plasma foram imediatamente extintas com solução de Padrão Interno (IS) contendo ácido e processadas para análise LC/MS de quinurenina.

Tabela 2: Atividades catalíticas e estabilidade sérica para variantes enzimáticas selecionadas Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 2 PLP 27 ± 9 3 PLP 28 0,86 0,31 2800 4 PLP 19 ± 10 5 PLP 15 0,85 0,57 1500

74/102 6 PLP 16 ± 6 7 PLP 12 0,71 0,57 1246 8 PLP 15 ± 5 9 PLP 10 0,71 0,69 1023 10 PLP 58 ± 12 11 PLP 176 0,6 0,034 17647 12 PLP 554 1,21 0,022 55367 13 PLP 698 1,5 0,021 69775 14 PLP 24 1 0,43 2350 15 PLP 20 1,22 0,67 1967 16 PLP 29 1,4 0,48 2920

Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 17 PLP 23 1,68 0,75 2250 18 PLP 20 1,38 0,7 2000 19 PLP 587 0,55 0,0093 58700 20 PLP 388 0,993 0,026 38789 21 PLP 424 0,94 0,022 42398

75/102 22 PLP 342 1,06 0,031 34226 23 PLP 405 0,85 0,021 40524 24 PLP 379 0,87 0,023 37913 25 PLP 336 0,7 0,021 33623 26 PLP 389 0,65 0,017 38916 27 PLP 368 0,76 0,021 36829 28 PLP 305 1,109 0,036 30467 29 PLP 526 1,32 0,0251 52590 30 PLP 342 1,06 0,031 34226 31 PLP 277 0,698 0,0252 27698 32 PLP 550 0,852 0,0155 54968

Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 33 PLP 580 1,3 0,022 57979 34 PLP 366 1,011 0,0276 36630 35 PLP 219 0,874 0,0399 21904 36 PLP 270 0,645 0,0239 26987 37 PLP 536 0,638 0,0119 53613

76/102 38 PLP 488 0,84 0,0173 48790 39 PLP 90 0,53 0,06 9020 40 PLP 24 0,22 0,09 2400 41 PLP 2,1 0,50 1,90 260 42 PLP 4 0,250 0,640 400 43 PLP 4 0,30 0,70 428 44 PLP 3 0,15 0,48 313 45 PLP 3 0,270 0,950 280 46 PLP 3 0,250 1,000 250 47 PLP 3 0,250 0,730 335 48 PLP 3 0,320 0,950 340

Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 49 PLP 3 0,27 0,8 340 50 PLP 3 0,23 0,7 320 51 PLP 52 PLP 53 PLP 591 0,975 0,017 59075

77/102 54 PLP 457 1,737 0,038 45706 55 PLP 512 1,024 0,020 51222 56 PLP 269 1,042 0,039 26861 57 PLP 363 0,970 0,027 36330 58 PLP 411 1,192 0,029 41111 59 PLP 635 1,098 0,017 63492 60 PLP 788 1,048 0,013 78780 61 PLP 368 0,805 0,022 36770 62 PLP 359 0,507 0,014 35933 63 PLP 415 0,954 0,023 41464 64 PLP 502 0,457 0,009 50183

Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 65 PLP 100 0,262 0,026 10046 66 PLP 127 0,253 0,020 12666 67 PLP 47 0,210 0,044 4729 68 PLP 96 0,471 0,049 9554 41 ±11 28 ±8 14 ±2 69 PLP 127 0,580 0,045 12692

78/102 70 PLP 70 0,470 0,067 7015 71 PLP 0,94 0,089 10506 72 PLP 2,15 0,14 15357 73 PLP 242 1,7 70 24200 74 PLP 75 PLP 76 PLP 77 PLP 78 PLP 79 PLP 80 PLP

Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 81 PLP 82 PLP 110 0,87 0,0787 11054,63787 83 PLP 159 1,27 0,08 15875 84 PLP 292 1,75 0,06 29167 85 PLP 85 1,27 0,15 8467

79/102 86 PLP 149 1,28 0,086 14884 87 PLP 100 0,712 0,071 10028 88 PLP 63 0,95 0,15 6333 89 PLP 138 1,38 0,1 13800 90 PLP 120 1,2 0,1 12000 91 PLP 141 0,82 0,058 14137,93103 92 PLP 90 0,72 0,08 9000 93 PLP 83 1 0,12 8333 94 PLP 200 1,2 0,06 20000 95 PLP 96 PLP 137 1,5 0,1 13700

Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 97 PLP 67 0,67 0,099 6729 98 PLP 0,58 0,118 4897 99 PLP 0,73 0,089 8266 100 PLP 0,73 0,046 16148 101 PLP 1,02 0,055 18569

80/102 102 PLP 0,97 0,087 11141 103 PLP 0,92 0,041 22282 104 PLP 0,96 0,049 19537 105 PLP 1,01 0,053 18825 106 PLP 145 0,93 0,065 14470 107 PLP 0,71 0,037 19165 108 PLP 0,47 0,119 3981 109 PLP 0,81 0,029 27722 110 PLP 0,99 0,039 25306 111 PLP 135,1 1,18 0,09 13511 112 PLP 140,2 0,76 0,05 14016

Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 113 PLP 248 1,44 0,06 24798 9 3 114 PLP 271,7 0,89 0,032 27169 115 PLP 68,8 0,67 0,1 6883 116 PLP 173,3 1 0,06 17326 117 PLP 132,3 0,99 0,08 13228

81/102 118 PLP 193,3 1,11 0,06 19332 16 4 119 PLP 142 1,31 0,092 14205 120 PLP 108 0,81 0,075 10814 121 PLP 197 0,42 0,021 19719 122 PLP 348 0,82 0,024 34797 123 PLP 81 1,03 0,127 8106 124 PLP 244 0,66 0,027 24395 125 PLP 301 1,31 0,044 30103 126 PLP 220 0,98 0,045 21971 127 PLP 315 1,26 0,040 31455 128 PLP 267 1,07 0,040 26684

Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 129 PLP 193 0,86 0,045 19309 130 PLP 169 0,58 0,034 16898 131 PLP 309 1,10 0,036 30903 132 PLP 192 1,15 0,060 19201 133 PLP 169 1,07 0,063 16870

82/102 134 PLP 150 0,82 0,054 15035 135 PLP 75 0,82 0,109 7487 136 PLP 350 1,235 0,035 35286 137 PLP 210 0,943 0,0449 21002 4 2 1 138 PLP 314 1,414 0,045 31422 45 ±8 27 ±7 22 ±4 139 PLP 243 1,418 0,0583 24322 140 PLP 181 0,91 0,05 18068 141 PLP 160 0,97 0,06 16020 142 PLP 165 1,10 0,07 16467,07 33 18 2 143 PLP 159 1,07 0,07 15952,38 144 PLP 139 0,08 0,05 1400

Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 145 PLP 88 0,93 0,11 8837,76 146 PLP 106 0,74 0,07 10584 147 PLP 127 1,09 0,09 12740 148 PLP 144 1,06 0,07 14403,79 149 PLP 130 1,03 0,08 13039,09

83/102 150 PLP 130 1,03 0,05 18889 151 PLP 130 1,08 0,08 13626 152 PLP 92 0,692 0,0756 9153 62 42 32 153 PLP 337 1,01 0,03 33667 72 ±8 68 ±10 56 ±8 154 PLP 235 0,598 0,0255 23451 69 53 155 PLP 236 1,21 0,051 23633 26 5 0 156 PLP 353 1,15 0,033 35323 35 3 0 157 PLP 423 1,26 0,030 42282 76 59 38 158 PLP 309 1,14 0,037 30894 66 48 33 159 PLP 296 1,39 0,047 29638 55 35 22 160 PLP 243 1,98 0,081 24335 41 16 3

Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 161 PLP 251 1,05 0,042 25120 71 66 55 162 PLP 248 1,12 0,045 24800 63 55 41 163 PLP 173 0,99 0,058 17290 77 66 45 164 PLP 330 0,34 0,010 33010 16 5 0 165 PLP 354 1,63 0,046 35430 87 51 42

84/102 166 PLP 347 1,06 0,031 34710 76 53 43 167 PLP 316 1,04 0,033 31650 69 51 45 168 PLP 330 0,78 0,024 33000 97 ±1 88 ±11 82 ±1 169 PLP 99 0,47 0,047 9900 73 75 56 170 PLP 177 0,70 0,040 17663,0 76 65 60 171 PLP 275 0,71 0,026 27517,0 65 63 57 172 PLP 148 0,53 0,036 14750,0 79 79 65 173 PLP 209 0,99 0,047 20930,0 83 64 72 174 PLP 274 0,58 0,021 27371,0 68 76 47 175 PLP 146 0,56 0,038 14605,0 69 73 65 176 PLP 206 0,60 0,029 20552,0 64 67 44

Estabilidade em % Média de estabilidade 90% de soro Proteína Cofator Vezes sobre o kcat Km kcat/Km 24h 48h 72h 120h tipo selvagem (s-1) (mM) (M-1 s-1) 177 PLP 167 0,63 0,038 16684,0 65 45 43 178 PLP 160 1,40 0,090 15500 179 PLP 14 1,10 0,80 1400 180 PLP 20 1,40 0,70 2000 181 PLP 115 0,723 0,063 11476,2 70 22

85/102 182 PLP 171 0,685 0,040 17125,0 52 25 183 PLP 171 0,684 0,040 17100,0 91 45 184 PLP 346 1,440 0,042 34615,4 63 3 185 PLP 137 0,959 0,070 13700,0 0 0

Exemplo 2 - Eficácia de HsKYN e Memória Antitumor

[00131] Em seguida, a eficácia in vivo da variante de HsKYN foi tes- tada no modelo de camundongo CT26, bem como em modelos B16- IDO. Camundongos BALB/c fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram implantados por via subcutânea com 500.000 células CT26 em 100 μl de PBS no flanco inferior direito. A dosagem começou no Dia 4 após a inoculação das células. A proteína (68) foi dosada por via subcutânea em 10 mg/kg de Q6D para 3 doses; Epacadostat foi administrado por via oral a 300 mg/kg de QD (5 dias em 2 dias livres); AntiPD-1 foi ad- ministrado por via intraperitoneal a 10mg/kg de Q3D por 5 doses. Os tumores foram medidos três vezes por semana com compassos digi- tais e os volumes tumorais foram calculados usando a fórmula Volume = (LxWxT) xPi/6. Os animais foram sacrificados quando os tumores atingiram > 2.000 mm3 (Figura 2A). Cem dias após o aparecimento do último respondedor completo (CR) de (A), camundongos BALB/c vir- gens e CRs foram desafiados novamente com CT26 implantado por via subcutânea no flanco esquerdo inferior. Os volumes tumorais fo- ram medidos como descrito acima e os resultados são mostrados na Figura 2B. Exemplo 3 - Perfil Imunológico do tumor de HsKYN

[00132] O perfil Imunológico de (68) foi realizado em camundongos portadores do tumor CT26. BALB/c fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram implantados por via subcutânea com 500.000 células CT26 em 100 μl de PBS no flanco inferior direito. A dosagem começou no Dia 4 após a inoculação das células. Os tumores foram medidos três vezes por semana com compassos digitais e os volumes tumorais foram cal- culados usando a fórmula Volume = (LxWxT) xPi/6. Os animais foram sacrificados 24h após a última dose e os tumores coletados para pos- terior análise. A proteína (68) foi dosada por via subcutânea em 10 mg/kg de Q6D para 2 doses; o AntiPD-1 foi administrado por via intra-

peritoneal de 10mg/kg de Q3D para 3 doses. O RNA foi extraído usando o kit RNAeasy da Qiagen e 100 ng de RNA foram usados para a análise de Nanostring usando o PanCancer Immune Profiling Panel (Figura 3A). Para os estudos na Figura 3B, (68) foi administrado por via subcutânea a 10 mg/kg de Q6D para 2 doses. Os tumores foram digeridos com o kit de dissociação de tumor da Miltenyi. As suspen- sões de células únicas foram coradas com anticorpos marcados e ana- lisadas usando Fortessa: CD8 (CD45+ CD3+ CD8+ CD4-); Tregs (CD45+ CD3+ CD4+ CD8- FoxP3+ CD25+); Macrófagos M1 (CD45+ CD11b+ F4/80+ MHCII+ CD206-); Macrófagos M2 (CD45+ CD11b+ F4/80+ MHCII+ CD206+). Exemplo 4 - Perfis Principais de PD e PK da Variante de HsKYN

[00133] Ratos Sprague Dawley machos (200-300g) foram adminis- trados iv, com uma dose única ou 3 doses semanais de 10mg/kg (153), por injeção lenta por meio da veia da cauda. O sangue foi cole- tado 24 horas antes da dose (-24 horas), 6, 24, 48, 72 ou 120 horas após a 1ª, 2ª ou 3ª dose (n = 4 camundongos/ponto de tempo). As amostras de plasma foram processadas conforme descrito na Figura 1C e os níveis de quinurenina foram analisados por LC/MS (Figura 4A). Em seguida, um macaco Cynomolgus macho e uma fêmea (≥ 2 anos de idade) foram administrados iv com uma dose única de 10 mg/kg (153) por injeção lenta por meio da veia cefálica. O sangue foi coletado pré-dosagem (0h), 0,25, 6, 24, 48, 72, 120, 168, 240 e 336 horas após a dosagem. As amostras de plasma foram divididas em duas partes: uma parte foi processada conforme descrito na Figura 1C para análise por LC/MS de quinurenina (Figura 4B); a outra parte foi submetida a análise por ELISA de captura de proteína peguilada (anti- corpo anti-PEG (Abcam # ab51257) e detecção de anticorpo anti-PEG biotinilado (Abcam # ab53449)). Os dados de concentração plasmática versus tempo foram analisados por abordagens não compartimentais usando o programa de software WinNonlin e os parâmetros farmaco- cinéticos com C0, Cmax, T1/2, AUC0-last, AUC0-inf foram calculados.

[00134] Assim, os presentes estudos mostraram que a degradação da quinurenina pela quinase é amplamente aplicável a tumores que expressam IDO e TDO. A engenharia da proteína HsKYN alcançou um aumento de mais de 500 vezes na atividade catalítica e uma estabili- dade catalítica amplamente melhorada, levando à depleção de Kyn robusta e durável in vivo. A variante de HsKYN demonstrou agente único superior e eficácia de combinação de PD1 em comparação com Epacadostat, bem como memória antitumoral sustentada. A expressão aumentada do gene da assinatura inflamatória de células T relaciona- das ao IFNg e a razão de macrófagos M1/M2 são provavelmente os mecanismos subjacentes à eficácia do tumor mediada por HsKYN +/- PD1. Finalmente, os perfis de PK/PD favoráveis em espécies de tox pré-clínicas apoiam o desenvolvimento clínico da variante de HsKYN principal. ***

[00135] Todos os métodos divulgados e reivindicados no presente documento podem ser feitos e executados sem experimentação inde- vida à luz da presente divulgação. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades pre- feridas, será evidente para aqueles técnicos no assunto que variações podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na sequência das etapas do método descrito aqui, sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos no presente documento, en- quanto os mesmos resultados ou resultados semelhantes seriam al- cançados. Todos esses substitutos e modificações semelhantes evi- dentes para os técnicos no assunto são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações anexas. Referências

[00136] As referências a seguir, na medida em que fornecem pro- cedimentos exemplares ou outros detalhes complementares aos aqui estabelecidos, são especificamente incorporadas no presente docu- mento por referência. Ahmed et al., HER2-specific T cells target primary glioblas- toma stem cells and induce regression of autologous experimental tu- mors, Clinical Cancer Research, 16 (2):474-485, 2010. Austin-Ward e Villaseca, Revista Medica de Chile, 126(7):838-845, 1998. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Gre- ene Publishing Associates e Wiley Interscience, NY, 1994. Bukowski et al., Clinical Cancer Res., 4 (10):2337-2347,

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[00137] A divulgação é ainda descrita nas seguintes modalidades numeradas:

[00138] Modalidade 1. Enzima quinureninase humana modificada isolada, a referida enzima tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a uma enzima quinureninase humana da SEQ ID NO: 1 e que compreende pelo menos uma substituição seleci-

onada a partir do grupo que consiste em L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, I51M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D,K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A e A436T

[00139] Modalidade 2. Enzima, de acordo com a modalidade 1, em que a sequência de aminoácidos é pelo menos 90% idêntica à se-

quência de aminoácidos de qualquer um dos polipeptídeos da Tabela

1.

[00140] Modalidade 3. Enzima, de acordo com a modalidade 1 ou 2, compreendendo uma substituição em A282, F306 e/ou F249.

[00141] Modalidade 4. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, compreendendo a substituição de F306W.

[00142] Modalidade 5. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4, compreendendo a substituição de L72N.

[00143] Modalidade 6. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, compreendendo as substituições de H102W e/ou N333T.

[00144] Modalidade 7. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, compreendendo uma substituição em A99.

[00145] Modalidade 8. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, compreendendo uma substituição em G112.

[00146] Modalidade 9. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8, compreendendo uma substituição em E103.

[00147] Modalidade 10. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, compreendendo uma substituição em V104.

[00148] Modalidade 11. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 10, compreendendo uma substituição em S408.

[00149] Modalidade 12. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 11, compreendendo a substituição de I183P.

[00150] Modalidade 13. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 12, compreendendo a substituição de R107P.

[00151] Modalidade 14. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13, compreendendo a substituição de A436T.

[00152] Modalidade 15. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 14, compreendendo pelo menos uma substituição selecionada a partir de L72N, H102W, A282P, F306W, I331S e N333T.

[00153] Modalidade 16. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15, compreendendo pelo menos duas, três, quatro ou cinco substituições selecionadas a partir de L72N, H102W, A282P, F306W, I331S e N333T.

[00154] Modalidade 17. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 16, compreendendo as substituições de L72N, H102W, A282P, F306W, I331S e N333T.

[00155] Modalidade 18. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, em que a enzima tem uma atividade catalítica em relação à KYN (kcat/kM) de pelo menos 8000M-1s-1.

[00156] Modalidade 19. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 18, em que a enzima tem uma atividade catalítica pa- ra quinurenina (KYN) (kcat/kM) entre cerca de 8000M-1s-1 e 40000 M- 1s-1; 10000M-1s-1 e 40000 M-1s-1; 20000M-1s-1 e 40000 M-1s-1; ou 25000M-1s-1 e 35000 M-1s-1.

[00157] Modalidade 20. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que a sequência de aminoácidos é pelo me- nos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[00158] Modalidade 21. Enzima, de acordo com a modalidade 20, em que a sequência de aminoácidos é pelo menos 95% idêntica à se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[00159] Modalidade 22. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que a sequência de aminoácidos é pelo me- nos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

[00160] Modalidade 23. Enzima, de acordo com a modalidade 22, em que a sequência de aminoácidos é pelo menos 95% idêntica à se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

[00161] Modalidade 24. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 23, compreendendo ainda um segmento de peptídeo heterólogo.

[00162] Modalidade 25. Enzima, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que a enzima está acoplada ao polietilenogli- col (PEG).

[00163] Modalidade 26. Enzima, de acordo com a modalidade 25, em que a enzima está acoplada ao PEG por meio de um ou mais resí- duos Lys ou Cys.

[00164] Modalidade 27. Ácido nucleico compreendendo uma se- quência de nucleotídeos que codifica a enzima, conforme definida em qualquer uma das modalidades 1 a 26.

[00165] Modalidade 28. Ácido nucleico, de acordo com a modalida- de 27, em que o ácido nucleico otimizado por códon para expressão em bactérias, fungos, insetos ou mamíferos.

[00166] Modalidade 29. Vetor de expressão compreendendo o áci- do nucleico, conforme definido na modalidade 27 ou 28.

[00167] Modalidade 30. Célula hospedeira, compreendendo o ácido nucleico, conforme definido na modalidade 27 ou 28, ou o vetor de ex- pressão, conforme definido na modalidade 29.

[00168] Modalidade 31. Célula hospedeira, de acordo com a moda- lidade 30, em que a célula hospedeira é uma célula bacteriana, uma célula fúngica, uma célula de inseto ou uma célula de mamífero.

[00169] Modalidade 32. Célula hospedeira, de acordo com a moda- lidade 31, em que a célula hospedeira é uma célula bacteriana.

[00170] Modalidade 33. Célula hospedeira, de acordo com a moda- lidade 31, em que a célula hospedeira é uma célula de mamífero, op- cionalmente em que a célula de mamífero é uma célula imune efetora.

[00171] Modalidade 34. Célula hospedeira, de acordo com a moda- lidade 33, em que a célula imune efetora é uma célula NK ou uma cé- lula T.

[00172] Modalidade 35. Formulação farmacêutica, compreendendo uma enzima, conforme definida em qualquer uma das modalidades 1 a

26, em um transportador farmaceuticamente aceitável.

[00173] Modalidade 36. Método para tratar um paciente tendo um tumor, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz da enzima, conforme definida em qualquer uma das modalidades 1 a 26, ou a formulação, conforme definida na modalidade 35.

[00174] Modalidade 37. Composição, compreendendo uma quanti- dade eficaz da enzima, conforme definida em qualquer uma das moda- lidades 1 a 26, ou a formulação, conforme definida na modalidade 35, para uso no tratamento de um paciente tendo um tumor.

[00175] Modalidade 38. Método, de acordo com a modalidade 36, ou composição, de acordo com a modalidade 37, em que o paciente foi identificado como tendo um tumor que expressa IDO1, IDO2 ou TDO.

[00176] Modalidade 39. Método, de acordo com a modalidade 36 ou 38, ou composição, de acordo com a modalidade 37 ou 38, em que o tumor é um tumor sólido.

[00177] Modalidade 40. Método, de acordo com a modalidade 36 ou 38, ou composição, de acordo com a modalidade 37 ou 38, em que o tumor é um tumor hematológico.

[00178] Modalidade 41. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 36 e 38 a 40, ou composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 37 a 40, em que o paciente é um paciente hu- mano.

[00179] Modalidade 42. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 36 e 38 a 41, ou a composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 37 a 41, em que a enzima ou formulação é ad- ministrada por via intratumoral, intravenosa, intradérmica, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostáti- ca, intrapleural, intratraqueal, intraocular, intranasal, intravítrea, intra- vaginal, intrarretal, intramuscular, subcutânea, subconjuntival, intrave-

sicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, oral, por inalação, por injeção, por infusão, por infusão contínua direta, por perfusão localiza- da, banhando as células alvo diretamente, por meio de um cateter ou por meio de uma lavagem.

[00180] Modalidade 43. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 36 e 38 a 42, compreendendo ainda administrar pelo menos uma segunda terapia anticâncer.

[00181] Modalidade 44. Método, de acordo com a modalidade 43, em que a segunda terapia anticâncer é radioterapia, terapia cirúrgica, uma imunoterapia ou um segundo composto anticâncer.

[00182] Modalidade 45. Método, de acordo com a modalidade 44, em que o segundo composto anticâncer é um inibidor do ponto de con- trole imunológico.

[00183] Modalidade 46. Método, de acordo com a modalidade 44 ou 45, em que o segundo composto anticâncer é um anticorpo.

[00184] Modalidade 47. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 44 a 46, em que o segundo composto anticâncer com- preende um anticorpo anti-PD1, anti-CTLA-4 ou anti-PD-L1.

[00185] Modalidade 48. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 44 a 47, em que o segundo composto anticâncer é um conjugado anticorpo-fármaco.

[00186] Modalidade 49. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 44 a 48, em que a imunoterapia compreende administrar células imunes efetoras ou uma composição imunogênica.

[00187] Modalidade 50. Método, de acordo com a modalidade 49, em que a composição imunogênica compreende antígenos de células cancerígenas.

[00188] Modalidade 51. Método, de acordo com a modalidade 49 ou 50, em que as células imunes efetoras compreendem células NK ou células T.

[00189] Modalidade 52. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 49 a 51, em que as células imunes efetoras compreen- dem células T CAR.

[00190] Modalidade 53. Célula T transgênica, compreendendo uma enzima quinureninase expressa, conforme definida em qualquer uma das modalidades 1 a 26.

[00191] Modalidade 54. Célula, de acordo com a modalidade 53, compreendendo ainda um receptor quimérico de antígeno de células T (CAR) expresso ou um receptor de célula T (TCR) modificado.

[00192] Modalidade 55. Célula, de acordo com a modalidade 53 ou 54, em que a célula é uma célula T humana.

[00193] Modalidade 56. Célula, de acordo com a modalidade 54 ou 55, em que o DNA que codifica o CAR e a quinureninase está integra- do no genoma da célula.

[00194] Modalidade 57. Célula, de acordo com qualquer uma das modalidades 54 a 56, em que o CAR é direcionado a um antígeno de células cancerígenas.

[00195] Modalidade 58. Célula, de acordo com a modalidade 57, em que o antígeno de célula cancerígena é HER2, CD19, CD20 ou GD2.

[00196] Modalidade 59. Método para fornecer uma resposta de cé- lulas T em um paciente humano tendo um tumor, compreendendo ad- ministrar uma quantidade eficaz de células transgênicas, conforme de- finidas em qualquer uma das modalidades 53 a 58, ao paciente.

[00197] Modalidade 60. Composição, compreendendo uma quanti- dade eficaz de células transgênicas, conforme definidas em qualquer uma das modalidades 53 a 58, para uso no tratamento de um paciente tendo um tumor.

[00198] Modalidade 61. Método, de acordo com a modalidade 59, ou a composição, de acordo com a modalidade 60, em que as células transgênicas são autólogas.

[00199] Modalidade 62. Método, de acordo com a modalidade 59, ou a composição, de acordo com a modalidade 60, em que as células transgênicas são heterólogas.

[00200] Modalidade 63. Uso de uma enzima quinureninase, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 26, um ácido nucleico, de acordo com a modalidade 27 ou 28, ou um vetor de expressão, de acordo com a modalidade 29, na fabricação de um medicamento para o tratamento de um tumor.

Apêndice de sequências: SEQ ID NO: 1: KYNase humana do tipo selvagem

MEPSSLELPADTVQRIAAELKCHPTDERVALHLDEEDKLRHFRECFYI PKIQDLPPVDLSLVNKDENAIYFLGNSLGLQPKMVKTYLEEELDKWAK IAAYGHEVGKRPWITGDESIVGLMKDIVGANEKEIALMNALTVNLHLL MLSFFKPTPKRYKILLEAKAFPSDHYAIESQLQLHGLNIEESMRMIKPR EGEETLRIEDILEVIEKEGDSIAVILFSGVHFYTGQHFNIPAITKAGQAK GCYVGFDLAHAVGNVELYLHDWGVDFACWCSYKYLNAGAGGIAGA FIHEKHAHTIKPALVGWFGHELSTRFKMDNKLQLIPGVCGFRISNPPIL LVCSLHASLEIFKQATMKALRKKSVLLTGYLEYLIKHNYGKDKAATKKP VVNIITPSHVEERGCQLTITFSVPNKDVFQELEKRGVVCDKRNPNGIR

VAPVPLYNSFHDVYKFTNLLTSILDSAETKN SEQ ID NO: 2 Proteína 168:

MEPSSLELPADTVQRIAAELKCHPTDERVALHLDEEDKLRHFRECFYI PKIQDLPPVDLSLVNKDENAIYFNGNSLGLQPKMVKTYLEEELDKWA KIARYGWRHGKPPWITYDESIVGLMKDIVGANEKEIALMNALTVNLHL LMLSFFKPTPKRYKILLEAKAFPSDHYAIESQLQLHGLNPEESMRMIK PREGEETLRIEDILEVIEKEGDSIAVILFSGVHFYTGQHFNIPAITKAGQ AKGCYVGWDLAHAVGNVELYLHDWGVDFACWCSYKYLNAGPGGIA GAFIHEKHAHTIKPALVGWWGHELSTRFKMDNKLQLIPGVCGFRSST PPILLVCSLHASLEIFKQATMKALRKKSVLLTGYLEYLIKHNYGKDKAA

TKKPVVNIITPSHVEERGCQLTITFNVPNKDVFQELEKRGVVCDKRNP NGIRVTPVPLYNSFHDVYKFTNLLTSILDSAETKN* SEQ ID NO: 3 Proteína 153:

MEPSSLELPADTVQRIAAELKCHPTDERVALHLDEEDKLRHFRECFYI PKIQDLPPVDLSLVNKDENAIYFNGNSLGLQPKMVKTYLEEELDKWA KIARYGWRHGKPPWITYDESIVGLMKDIVGANEKEIALMNALTVNLHL LMLSFFKPTPKRYKILLEAKAFPSDHYAIESQLQLHGLNPEESMRMIK PREGEETLRIEDILEVIEKEGDSIAVILFSGVHFYTGQHFNIPAITKAGQ AKGCYVGFDLAHAVGNVELYLHDWGVDFACWCSYKYLNAGPGGIA GAFIHEKHAHTIKPALVGWWGHELSTRFKMDNKLQLIPGVCGFRSST PPILLVCSLHASLEIFKQATMKALRKKSVLLTGYLEYLIKHNYGKDKAA TKKPVVNIITPSHVEERGCQLTITFNVPNKDVFQELEKRGVVCDKRNP NGIRVTPVPLYNSFHDVYKFTNLLTSILDSAETKN*

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Enzima quinureninase humana modificada isolada, ca- racterizada por ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a uma enzima quinureninase humana da SEQ ID NO: 1 e que compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste em L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, I51M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D,K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y,

S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A e A436T

2. Enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela sequência de aminoácidos ser pelo menos 90% idêntica à se- quência de aminoácidos de qualquer um dos polipeptídeos da Tabela

1.

3. Enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender: (a) uma substituição em A282, F306 ou F249; (b) a substituição de F306W; (c) a substituição de L72N; (d) as substituições de H102W e N333T; (e) uma substituição em A99; (f) uma substituição em G112; (g) uma substituição em E103; (h) uma substituição em V104; (i) uma substituição em S408; (j) a substituição de I183P; (k) a substituição de R107P; e/ou (l) a substituição de A436T.

4. Enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender pelo menos uma substituição selecionada a partir de L72N, H102W, A282P, F306W, I331S e N333T, opcionalmente em que a enzima compreende pelo menos duas, três, quatro ou cinco substi- tuições selecionadas a partir de L72N, H102W, A282P, F306W, I331S e N333T.

5. Enzima, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por compreender as substituições L72N, H102W, A282P, F306W, I331S e N333T.

6. Enzima, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela enzima ter uma atividade catalítica para quinurenina (KYN) (kcat/kM) de pelo menos 8000M-1s-1, opcionalmente em que a enzima tem uma atividade catalítica para KYN entre cerca de 8000M-1s-1 e 40000 M-1s-1; 10000M-1s-1 e 40000 M-1s-1; 20000M-1s-1 e 40000 M-1s-1; ou 25000M-1s-1 e 35000 M-1s-1.

7. Enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela sequência de aminoácidos ser pelo menos 90% idêntica à se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, opcionalmente em que a sequência de aminoácidos é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

8. Enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por compreender ainda um segmento de peptídeo heterólogo.

9. Enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pela enzima estar acoplada a polietilenoglicol (PEG), opcionalmente em que a enzima está acoplada a PEG em um ou mais resíduos Lys ou Cys.

10. Ácido nucleico, caracterizado por compreender uma se- quência de nucleotídeos que codifica a enzima, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, opcionalmente em que o ácido nucleico é otimizado por códon para expressão em bactérias, fungos, insetos ou mamíferos.

11. Vetor de expressão, caracterizado por compreender o ácido nucleico, como definido na reivindicação 10.

12. Célula hospedeira, caracterizada por compreender o ácido nucleico, como definido na reivindicação 10, ou o vetor de ex- pressão, como definido na reivindicação 11, opcionalmente em que a célula hospedeira é uma célula bacteriana, uma célula fúngica, uma célula de inseto ou uma célula de mamífero, opcionalmente em que a célula de mamífero é uma célula imune efetora de mamífero, opcio-

nalmente em que a célula imune efetora de mamífero é uma célula NK ou uma célula T.

13. Formulação farmacêutica, caracterizada por compreen- der uma enzima, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em um transportador farmaceuticamente aceitável.

14. Método para tratar um paciente tendo um tumor, carac- terizado por compreender administrar ao paciente uma quantidade efi- caz da enzima, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou a formulação, como definida na reivindicação 13.

15. Composição, caracterizada por compreender uma quantidade eficaz da enzima, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 9, ou a formulação, como definida na reivindicação 13, para uso no tratamento de um paciente tendo um tumor.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, ou composi- ção, de acordo com a reivindicação 15, caracterizados pelo paciente ser identificado como tendo um tumor que expressa IDO1, IDO2 ou TDO, opcionalmente em que: (a) o tumor é um tumor sólido ou um tumor hematológico; (b) o paciente é um paciente humano; (c) a enzima ou formulação é administrada por via intratu- moral, intravenosa, intradérmica, intra-arterial, intraperitoneal, intrale- sional, intracraniana, intra-articular, intraprostática, intrapleural, intra- traqueal, intraocular, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarretal, in- tramuscular, subcutânea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intra- pericárdica, intraumbilical, oral, por inalação, por injeção, por infusão, por infusão contínua direta, por perfusão localizada, banhando as célu- las alvo diretamente, por meio de um cateter ou por meio de uma la- vagem; e/ou (d) a enzima ou formulação é administrada com pelo menos uma segunda terapia anticâncer, opcionalmente em que a segunda terapia anticâncer é radioterapia, terapia cirúrgica, uma imunoterapia ou um segundo composto anticâncer, opcionalmente em que: (i) o segundo composto anticâncer é um inibidor do ponto de controle imunológico, opcionalmente em que o inibidor do ponto de controle imunológico compreende um anticorpo ou conjugado anticor- po-fármaco, opcionalmente em que o anticorpo é um anticorpo anti- PD1, anti-CTLA-4 ou anti-PD-L1; e/ou (ii) a imunoterapia compreende administrar células imunes efetoras ou uma composição imunogênica, opcionalmente em que a composição imunogênica compreende antígenos de células cancerí- genas e/ou em que as células imunes efetoras compreendem células NK, células T ou células T CAR.

17. Célula T transgênica, caracterizada por compreender uma enzima quinureninase expressa, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, opcionalmente em que: (a) a célula T transgênica compreende ainda um receptor quimérico de antígeno de células T (CAR) expresso ou um receptor de células T (TCR) modificado; (b) a célula T transgênica é uma célula T transgênica hu- mana; (c) o DNA que codifica o CAR e a quinureninase é integra- do ao genoma da célula; e/ou (d) em que o CAR é direcionado a um antígeno de células cancerígenas, opcionalmente em que o antígeno de células cancerí- genas é HER2, CD19, CD20 ou GD2.

18. Método para promover uma resposta de célula T em um paciente humano tendo um tumor, caracterizado por compreender administrar uma quantidade eficaz de células transgênicas, como defi- nidas na reivindicação 17, ao paciente.

19. Composição, caracterizada por compreender uma quantidade eficaz de células transgênicas, como definidas na reivindi- cação 17, para uso no tratamento de um paciente tendo um tumor, op- cionalmente em que: (a) as células transgênicas são autólogas; ou (b) as células transgênicas são heterólogas.

20. Uso de uma enzima quinureninase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou um ácido nucleico, como definido na reivindicação 10, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um tumor.

Atividade Catalítica Aumentada Estabilidade Catalítica Aumentada

Proteína (153)

Petição 870200127635, de 09/10/2020, pág. 115/136 da iza im Ot e inas Proteína (68) Qu

% de Atividade Quinase do Tipo Selvagem Humana

Enzimas Variantes de "Quinase" Humana Bacterianas de Tempo (horas) Instrumento 1/4

Aumento da depleção de quinurenina plasmática em camundongos

Proteína (68) Proteína (153)

% kimurenine

% kimurenine Veículo Veículo

Petição 870200127635, de 09/10/2020, pág. 116/136 Proteína (68) + antiPD-1 Dia 22 após o novo desafio

Veículo Veículo Proteína Camundongos virgens CRs - Proteína (68)

Proteína CRs - Proteína (68) 2/4

Volume tumoral (mm3 -/+SEM) Volume tumoral (mm3 -/+SEM) Volume tumoral (mm3 -/+SEM)

Dias após a inoculação das células Dias após a inoculação das células

Mapa de calor_ativação de célula T

8) 8)

Petição 870200127635, de 09/10/2020, pág. 117/136 (6 (6 lo í na ína Tumores_IFNg ícu te te Razão CD8/Tregs Ve o o Pr Pr

Contagens Razão CD8/Treg (% de CD45) 3/4

Tumores_GZMB Razão M1/M2

Contagens Razão M1/M2 (em CD45)

lo 8) o 8) u (6 8) ul (6 íc (6 eíc a Ve na a V ín teí ín te ro e o P ot Pr Pr

Dose Única de Proteína (153) Rato PD Dose de Repetição de Proteína (153) Rato PD

Petição 870200127635, de 09/10/2020, pág. 118/136 % Kyn em relação à pré-dose

% Kyn em relação à pré-dose Dose Única de Proteína (153) Cyno PD n = 18 linha de base

Proteína (153) Cyno PK 4/4

Concentração (mg/mL)

% Kyn em relação à pré-dose Tempo (h)

Variante (dose @ mg/kg)

Proteína (153) @10 mg/kg