KR20220103944A - Peg화 키뉴레니나제 효소 및 암 치료를 위한 그의 용도 - Google Patents

Peg화 키뉴레니나제 효소 및 암 치료를 위한 그의 용도 Download PDF

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KR20220103944A
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제임스 놀란
미셸 장
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이케나 온콜로지, 인코포레이티드
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Abstract

폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 키뉴레니나제 효소가 기재되어 있다. 본 개시내용의 양태는 그와 같은 분자를 사용하여 키뉴레닌 고갈에 의해 암의 효과적인 치료를 개선하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

PEG화 키뉴레니나제 효소 및 암 치료를 위한 그의 용도
본 개시내용은 PEG화 키뉴레니나제 효소의 조성물 및 합성 방법 및 암 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
서열 목록
본원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고, 그 전체 내용이 참조로 포함된 서열 목록을 포함한다. 2020년 10월 16일에 생성된 ASCII 사본의 이름은 51175-014WO2_Sequence_Listing_10_16_20_ST25이며 그 크기는 12,461 바이트이다.
키뉴레닌은 인돌아민 2,3 디옥시게나제(IDO) 또는 트립토판 2,3 디옥시게나제(TDO)의 작용을 통해 생성된 아미노산 트립토판의 대사산물이다. 많은 종양 세포는 IDO 및/또는 TDO의 발현을 조절하여 키뉴레닌의 국소 농도를 상승시키고, 이는 차례로 종양을 공격할 종양 침윤 T-세포의 기능을 억제한다. 키뉴레닌 농도는 키뉴레닌의 안트라닐산으로의 분해를 수행하는 키뉴레니나제 효소에 의해 고갈될 수 있다. T-세포가 종양 세포를 효과적으로 식별하고 공격할 수 있도록 키뉴레닌의 장기간 고갈을 달성하기 위해 키뉴레닌 분해에 대한 높은 촉매 활성 및 혈청 비활성화에 대한 향상된 안정성을 갖는 치료 화합물의 개발에 대한 요구가 남아 있다.
본 개시내용은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자에 공유적으로 부착된 키뉴레니나제 효소를 제공한다. 키뉴레니나제에 공유적으로 부착된 PEG 분자는 예를 들어 키뉴레닌 분해의 더 큰 혈청 안정성 및 증가된 촉매 효율을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 연결 기를 갖는 PEG 분자의 분류와 함께 증가된 촉매 효율을 갖는 광범위한 돌연변이체 키뉴레니나제 효소가 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 분자는 인돌라민 2,3 디옥시게나제(IDO) 및/또는 트립토판 2,3 디옥시게나제(TDO)를 발현하는 암의 치료를 위해 환자에게 투여될 수 있으며, 여기서 국소화된 키뉴레닌 농도가 상승하여 T-세포에 의한 표적화 및 공격을 방지할 수 있다.
제1 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자에 공유 결합된 키뉴레니나제 동종이량체를 제공하며, 여기서 PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 10:1 내지 약 40:1, 예컨대 약 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1 또는 40:1이다.
일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 11:1 내지 약 39:1, 예컨대 약 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1 또는 39:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 12:1 내지 약 38:1, 예컨대 약 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1 또는 38:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 13:1 내지 37:1, 예컨대 약 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1 또는 37:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 14:1 내지 36:1, 예컨대 약 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1 또는 36:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 15:1 내지 35:1, 예컨대 약 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1 또는 35:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 16:1 내지 34:1, 예컨대 약 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1 또는 34:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 17:1 내지 33:1, 예컨대 약 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1 또는 33:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 18:1 내지 32:1, 예컨대 약 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1 또는 32:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 19:1 내지 31:1, 예컨대 약 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1 또는 31:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 20:1 내지 30:1, 예컨대 약 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1 또는 30:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 21:1 내지 29:1, 예컨대 약 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1 또는 29:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 22:1 내지 28:1, 예컨대 약 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1 또는 28:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 23:1 내지 27:1, 예컨대 약 23:1, 24:1, 25:1, 26:1 또는 27:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 24:1 내지 26:1, 예컨대 약 24:1, 25:1 또는 26:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 25:1이다.
일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 10:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 11:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 12:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 13:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 14:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 15:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 16:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 17:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 18:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 19:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 20:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 21:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 22:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 23:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 24:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 25:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 26:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 27:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 28:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 29:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 30:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 31:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 32:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 33:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 34:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 35:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 36:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 37:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 38:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 39:1이다. 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 40:1이다.
일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 13:1 내지 약 33:1, 예컨대 약 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 또는 33:1이다.
일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 18:1 내지 약 33:1, 예컨대 약 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 또는 33:1이다.
일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 18:1 내지 약 28:1, 예컨대 약 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 또는 28:1이다.
일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 18:1 내지 약 23:1, 예컨대 약 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 또는 23:1이다.
일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 23:1 내지 약 33:1, 예컨대 약 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 또는 33:1이다.
일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 23:1 내지 약 28:1, 예컨대 약 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 또는 28:1이다.
일부 구현예에서, PEG 분자는 약 1 kDa 내지 약 10 kDa의 분자량, 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 약 2 kDa 내지 약 9 kDa, 예컨대 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 약 3 kDa 내지 약 8 kDa, 예컨대 약 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 약 4 kDa 내지 약 7 kDa, 예컨대 약 4, 5, 6 또는 7 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 약 5 kDa 내지 약 6 kDa, 예컨대 약 5 또는 6kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 약 5 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 선형이다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 분지형이다.
일부 구현예에서, 동종이량체는 하나 이상의 라이신 또는 시스테인 잔기에 의해, 예컨대 연결 기, 예컨대 라이신 아민과 석신이미드 기, 알데하이드 기, 아미드 기, 카바메이트 기, 에스테르 기, 에폭시 기, 카복실 기, 하이드록실 기, 또는 이들의 조합과의 반응으로부터 형성된 연결 기에 의한 하나 이상의 라이신 잔기에 의해 PEG 분자에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 연결 기는 석신이미드 기, 예컨대 석신이미딜 석시네이트, 석신이미딜 프로피오네이트, 석신이미딜 카복시메틸레이트, 석신이미딜 카보네이트, 석신이미딜 석신아미드, N-하이드록시 석신이미드 또는 이들의 조합, 예컨대 N-하이드록시 석신이미드 카보네이트이다. 일부 구현예에서, 연결 기는 일작용성이다.
일부 구현예에서, 동종이량체는 2개의 폴리펩티드 단량체를 포함하고, 이들 각각은 서열번호: 1과 적어도 85% 동일한 (예를 들어, 서열번호: 1과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 갖는다. 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, I51M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D, K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A 및 A436T로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 서열번호: 1과 적어도 90% 동일하거나 (예를 들어, 서열번호: 1과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일함) 또는 서열번호: 1과 적어도 95% 동일하다 (예를 들어, 서열번호: 1과 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일함).
일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 A282 (예를 들어, A282M 또는 A282P), F306 (예를 들어, F306W 또는 F306Y) 및/또는 F249, 예컨대 F249W에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 A99에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 G112에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 E103에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 V104에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 S408에서 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 F306W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 L72N 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 H102W 및 N333T 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 I183P 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 R107P 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 A436T 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 치환 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 치환 L72N, A99R, H102W, E103R, V104H, R107P, G112Y, I183P, A282P, F306W, I331S, N333T, S408N 및 A436T를 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3과 적어도 85% 동일한 (예를 들어, 서열번호: 3과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3과 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 서열번호: 3과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3과 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 서열번호: 3과 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 예를 들어, 각 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3의 아미노산 서열에 대해 최대 50개의 보존적 아미노산 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 보존적 아미노산 치환)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3의 아미노산 서열에 대해 최대 25개의 보존적 아미노산 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 보존적 아미노산 치환)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3의 아미노산 서열에 대해 최대 10개의 보존적 아미노산 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 보존적 아미노산 치환)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 보존적 아미노산 치환에 의해서만 서열번호: 3의 것과 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2와 적어도 85% 동일한 (예를 들어, 서열번호: 2와 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2와 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 서열번호: 2와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2와 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 서열번호: 2와 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는다. 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 각 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2의 아미노산 서열에 대해 최대 50개의 보존적 아미노산 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 보존적 아미노산 치환)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2의 아미노산 서열에 대해 최대 25개의 보존적 아미노산 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 보존적 아미노산 치환)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2의 아미노산 서열에 대해 최대 10개의 보존적 아미노산 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 보존적 아미노산 치환)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 보존적 아미노산에 의해서만 서열번호: 2의 것과 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 동종이량체는 적어도 8000 M-1s-1의 촉매 활성 (kcat/KM)을 갖는다. 일부 구현예에서, 동종이량체는 약 8000M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 10000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 20000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 또는 25000 M-1s-1 내지 35000 M-1s-1의 촉매 활성 (kcat/KM)을 갖는다.
일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 25:1이고, 상기 PEG 분자는 약 5 kDa의 분자량을 갖고, 그리고 N-하이드록시석신이미드 에스테르 카보네이트 연결 기에 의해 동종이량체에 결합된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 키뉴레니나제 폴리펩티드의 순환 반감기를 연장하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 키뉴레니나제 폴리펩티드를 PEG화제와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 키뉴레니나제 폴리펩티드는 동종이량체를 형성하고, 여기서 PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 10:1 내지 약 50:1, 예컨대 약 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1,20:1,21:1,22:1,23:1,24:1,25:1,26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1 또는 50:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 11:1 내지 약 49:1, 예컨대 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1 또는 49:이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 12:1 내지 약 48:1, 예컨대 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1 또는 48:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 13:1 내지 약 47:1, 예컨대 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1 또는 47:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 14:1 내지 약 46:1, 예컨대 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1,41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1 또는 46:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 15:1 내지 약 45:1, 예컨대 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1 또는 45:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 16:1 내지 약 44:1, 예컨대 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1 또는 44:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 17:1 내지 약 43:1, 예컨대 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1 또는 43:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 18:1 내지 약 42:1, 예컨대 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1 또는 42:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 19:1 내지 약 41:1, 예컨대 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1 또는 41:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 20:1 내지 약 40:1, 예컨대 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1 또는 40:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 21:1 내지 약 39:1, 예컨대 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1 또는 39:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 22:1 내지 약 38:1, 예컨대 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31: 1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1 또는 38:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 23:1 내지 약 37:1, 예컨대 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1 또는 37:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 24:1 내지 약 36:1, 예컨대 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1 또는 36:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 25:1 내지 약 35:1, 예컨대 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1 또는 35:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 26:1 내지 약 34:1, 예컨대 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1 또는 34:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 27:1 내지 약 33:1, 예컨대 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1 또는 33:1이다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 28:1 내지 약 32:1, 예컨대 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 또는 32:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 29:1 내지 약 31:1, 예컨대 29:1, 30:1 또는 31:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 30:1이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 PEG화 키뉴레니나제 동종이량체를 생성하는 방법을 포함하고, 동종이량체는 2개의 폴리펩티드 단량체를 포함하고, 상기 방법은 동종이량체를 PEG화제와 접촉시키는 것을 포함하고, 그리고 PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 10:1 내지 약 50:1, 예컨대 약 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1 또는 50:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 11:1 내지 약 49:1, 예컨대 약 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1 또는 49:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 12:1 내지 약 48:1, 예컨대 약 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1 또는 48:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 13:1 내지 약 47:1, 예컨대 약 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1 또는 47:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 14:1 내지 약 46:1, 예컨대 약 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1 또는 46:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 15:1 내지 약 45:1, 예컨대 약 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1 또는 45:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 16:1 내지 약 44:1, 예컨대 약 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1 또는 44:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 17:1 내지 약 43:1, 예컨대 약 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1 또는 43:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 18:1 내지 약 42:1, 예컨대 약 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1 또는 42:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 19:1 내지 약 41:1, 예컨대 약 19:1, 20:1, 21: 1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1 또는 41:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 20:1 내지 약 40:1, 예컨대 약 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1 또는 40:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 21:1 내지 약 39:1, 예컨대 약 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1 또는 39:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 22:1 내지 약 38:1, 예컨대 약 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1 또는 38:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 23:1 내지 약 37:1, 예컨대 약 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31: 1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1 또는 37:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 24:1 내지 약 36:1, 예컨대 약 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1 또는 36:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 25:1 내지 약 35:1, 예컨대 약 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1 또는 35:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 26:1 내지 약 34:1, 예컨대 약 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1 또는 34:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 27:1 내지 약 33:1, 예컨대 약 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1 또는 33:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 28:1 내지 약 32:1, 예컨대 약 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 또는 32:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 29:1 내지 약 31:1, 예컨대 약 29:1, 30:1 또는 31:1이다. 일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 30:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 20:1 내지 약 30:1, 예컨대 약 20:1,21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 또는 30:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 10:1 내지 약 30:1, 예컨대 약 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 또는 30:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 11:1 내지 약 29:1, 예컨대 약 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 또는 29:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 12:1 내지 약 28:1, 예컨대 약 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 또는 28:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 13:1 내지 약 27:1, 예컨대 약 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 또는 27:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 14:1 내지 약 26:1, 예컨대 약 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 또는 26:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 15:1 내지 약 25:1, 예컨대 약 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 또는 25:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 16:1 내지 약 24:1, 예컨대 약 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 또는 24:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 17:1 내지 약 23:1, 예컨대 약 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 또는 23:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 18:1 내지 약 22:1, 예컨대 약 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 또는 22:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 19:1 내지 약 21:1, 예컨대 약 19:1, 20:1, 또는 21:1이다.
일부 구현예에서, PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비는 약 20:1이다.
본 개시내용의 전술한 양태 중 어느 하나의 일부 구현예에서, PEG 분자는 약 1 kDa 내지 약 10 kDa, 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 약 2 kDa 내지 약 9 kDa, 예컨대 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 약 3 kDa 내지 약 8 kDa, 예컨대 약 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 약 4 kDa 내지 약 7 kDa, 예컨대 약 4, 5, 6 또는 7 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 약 5 kDa 내지 약 6 kDa, 예컨대 약 5 또는 6kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 약 5 kDa의 분자량을 갖는다.
일부 구현예에서, PEG화제는 라이신-반응성 PEG화제, 예컨대 PEG화제이고, 상기 PEG 분자는 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 다른 라이신-반응성 모이어티 중에서 N-하이드록시석신이미드 (NHS) 모이어티를 함유하는 반응성 기에 결합된다.
일부 구현예에서, PEG화제는 시스테인-반응성 PEG화제, 예컨대 PEG화제이고, 상기 PEG 분자는 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 다른 시스테인-반응성 모이어티 중에서 요오도아세트아미드 모이어티 또는 말레이미드 모이어티를 함유하는 반응성 기에 결합된다.
일부 구현예에서, 동종이량체는 하나 이상의 라이신 또는 시스테인 잔기에 의해, 예컨대 연결 기, 예컨대 라이신 아민과 석신이미드 기, 알데하이드 기, 아미드 기, 카바메이트 기, 에스테르 기, 에폭시 기, 카복실 기, 하이드록실 기, 또는 이들의 조합과의 반응으로부터 형성된 연결 기에 의한 하나 이상의 라이신 잔기에 의해 PEG 분자에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 연결 기는 석신이미드 기, 예컨대 석신이미딜 석시네이트, 석신이미딜 프로피오네이트, 석신이미딜 카복시메틸레이트, 석신이미딜 카보네이트, 석신이미딜 석신아미드, N-하이드록시 석신이미드 또는 이들의 조합, 예컨대 N-하이드록시 석신이미드 카보네이트이다. 일부 구현예에서, 연결 기는 일작용성이다.
일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, 151M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D, K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A, 및 A436T로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 A282 (예를 들어, A282M 또는 A282P), F306 (예를 들어, F306W 또는 F306Y) 또는 F249, 예컨대 F249W에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 A99에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 G112에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 E103에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 V104에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 S408에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 F306W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 L72N 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 H102W 및 N333T 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 I183P 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 R107P 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 A436T 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 치환 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T를 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 동종이량체는 적어도 8000 M-1s-1의 촉매 활성 (kcat/KM)을 갖는다. 일부 구현예에서, 동종이량체는 약 8000M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 10000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 20000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 또는 25000 M-1s-1 내지 35000 M-1s-1의 촉매 활성 (kcat/KM)을 갖는다.
본 개시내용의 전술한 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 25:1이고, 상기 PEG 분자는 약 5 kDa의 분자량을 갖고, 그리고 N-하이드록시석신이미드 에스테르 카보네이트 연결 기에 의해 동종이량체에 결합된다.
일부 구현예에서, 동종이량체는 이인산나트륨 또는 아세트산나트륨과 같은 수성 완충액에서 PEG화제와 접촉된다. 일부 구현예에서, 수성 완충액의 pH 범위는 약 7.5 내지 약 9.5, 예컨대 7.5, 7.6, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4 또는 9.5이다. 일부 구현예에서, 상기 수성 완충액은 약 250 mM 내지 약 350 mM의 이온 강도의 범위이다. 일부 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피가 사용되어 동종이량체를 단리한다.
본 개시내용의 상기 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 키뉴레니나제 동종이량체는 WO2015/031771, WO2016/033488 또는 W02017/151860에 개시된 아미노산 치환 중 하나 이상을 함유할 수 있으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
상기 및 본 명세서에서 논의된 바와 같은 변형된 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드(예를 들어, 천연 폴리펩티드, 예컨대 서열번호: 1의 인간 키뉴레니나제) 또는 본 명세서에 개시된 임의의 폴리펩티드 서열과 비교하여 특정 백분율의 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 비변형된 폴리펩티드는 천연 키뉴레니나제의 적어도 또는 최대 약 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 465개의 잔기(또는 그 안에서 도출가능한 임의의 범위)를 포함할 수 있다. 백분율 동일성은 변형된 폴리펩티드와 비변형된 폴리펩티드 사이, 또는 비교 시 임의의 2개의 서열 사이에서 약, 최대 또는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%(또는 그 안에서 도출가능한 임의의 범위)일 수 있다. 또한, 상기 논의된 동일성의 백분율은 폴리펩티드의 비변형 영역과 비교하여 폴리펩티드의 특정 변형 영역과 관련될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 폴리펩티드는 같은 종 또는 종에 걸쳐 비변형 또는 돌연변이체 키뉴레니나제에 대한 키뉴레니나제의 변형 또는 돌연변이체 기질 인식 부위의 아미노산 서열의 동일성에 기초하여 특성화될 수 있는 키뉴레니나제의 변형 또는 돌연변이체 기질 인식 부위를 함유할 수 있다. 예를 들어, 비변형 키뉴레니나제에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 것으로 특징지어지는 변형 또는 돌연변이체 인간 폴리펩티드는, 변형 또는 돌연변이체 인간 폴리펩티드에 있는 아미노산의 적어도 90%가 비변형 폴리펩티드에 있는 아미노산과 동일하다는 것을 의미한다.
이러한 비변형된 폴리펩티드는 천연 키뉴레니나제, 특히 인간 동형 또는 다른 영장류 동형일 수 있다. 예를 들어, 천연 인간 키뉴레니나제는 서열번호: 1의 서열을 가질 수 있다. 다른 천연 영장류 키뉴레니나제의 비제한적인 예는 퐁고 아벨리이 키뉴레니나제 (Genbank ID: XP 009235962.1, Gl: 686708656), 마카카 파스시컬라리스 키뉴레니나제 (Genbank ID: EHH54849.1, Gl: 355750522), 및 팬 트로글로다이테스 키뉴레니나제 (Genbank ID: XP_003309314.1, Gl: 332814521)를 포함한다. 예시적인 천연 폴리펩티드는 서열번호: 1의 약, 최대 또는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성 (또는 그 안에서 도출가능한 임의의 범위)을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 천연 폴리펩티드는 서열번호: 1의 서열의 적어도 또는 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 465 잔기 (또는 그 안에서 도출가능한 임의의 범위)를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 약제학적으로 허용 가능한 담체 중에 상기 기재된 조성물 중 어느 하나의 키뉴레니나제 동종이량체를 포함하는 약제학적 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 제형은 약제학적으로 허용 가능한 담체 중에 상기 기재된 조성물 중 어느 하나의 키뉴레니나제 동종이량체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 종양을 갖는 대상체(예를 들어, 포유동물 대상체, 예컨대 인간 대상체)를 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 제형 또는 효소를 본 명세서에 기재된 조성물 중 어느 하나와 함께 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 제형 또는 효소를 본 명세서에 기재된 조성물 중 어느 하나와 함께 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 IDO1, IDO2, 또는 TDO 발현 종양, 예컨대 고형 종양 또는 혈액 종양을 갖는 것으로 확인되었다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다.
일부 구현예에서, 제형은 종양내로, 정맥내로, 진피내로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내, 늑막내로, 기관내로, 안구내로, 비강내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 결막하, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 경구로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 표적 세포를 직접적으로 담는 국소화된 관류에 의해, 카테터를 통해, 또는 세척을 통해 투여된다.
일부 구현예에서, 방법은 또한 대상체에게 제2 항암 요법을 투여하는 것을 포함한다. 제2 항암 요법은 외과적 요법, 화학요법, 방사선 요법, 냉동요법, 호르몬 요법, 면역요법 또는 사이토카인 요법일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 항암 요법은 면역 관문 억제제 요법일 수 있다. 예를 들어, 키뉴레니나제 동종이량체는 예를 들어 암 또는 감염성 질환, 예컨대 본 명세서에 기재된 암 또는 감염성 질환의 치료를 위해 면역요법제와 혼합, 접합, 투여 또는 별도로 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 유용한 예시적인 면역요법제는 비제한적으로, 항-CTLA-4 제제, 항-PD-1 제제, 항-PD-L1 제제, 항-PD-L2 제제, 항-TNF-α 가교제, 항-TRAIL 가교제, 항-CD27 제제, 항-CD30 제제, 항-CD40 제제, 항-4-1BB 제제, 항-GITR 제제, 항-OX40 제제, 항-TRAILR1 제제, 항-TRAILR2 제제, 및 항-TWEAKR 제제, 뿐만 아니라, 예를 들어, 문헌[Mahoney 등, Cancer Immunotherapy, 14:561-584 (2015), 그의 개시내용은 본 명세서에 전체적으로 참조로 포함됨]의 표 1에 기재된 면역학적 표적에 대한 제제를 포함한다. 예를 들어, 면역요법제는 항-CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 이필리무맙 및 트레멜리무맙일 수 있다. 면역요법제는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 및 아테졸리주맙일 수 있다. 면역요법제는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 아테졸리주맙 또는 아벨루맙일 수 있다. 다른 예로서, 면역학적 표적 4-1BB 리간드는 항-4-1BB 리간드 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 OX40L은 항-OX40L 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 GITR는 항-GITR 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 CD27는 항-CD27 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 TL1A는 항-TL1A 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 CD40L 또는 CD40은 항-CD40L 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 LIGHT는 항-LIGHT 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 BTLA는 항-BTLA 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 LAG3는 항-LAG3 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 TIM3는 항-TIM3 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 싱글렉스(Singlecs)는 항-싱글렉스 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 ICOS 리간드는 항-ICOS 리간드 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 B7-H3는 항-B7-H3 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 B7-H4는 항-B7-H4 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 VISTA는 항-VISTA 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 TMIGD2는 항-TMIGD2 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 BTNL2는 항-BTNL2 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 CD48는 항-CD48 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 KIR는 항-KIR 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 LIR는 항-LIR 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 ILT는 항-ILT 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 NKG2D는 항-NKG2D 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 NKG2A는 항-NKG2A 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 MICA는 항-MICA 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 MICB는 항-MICB 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 CD244는 항-CD244 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 CSF1R는 항-CSF1R 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 IDO는 항-IDO 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 TGFβ는 항-TGFβ 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 CD39는 항-CD39 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 CD73는 항-CD73 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 CXCR4는 항-CXCR4 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 CXCL12는 항-CXCL12 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 SIRPA는 항-SIRPA 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 CD47는 항-CD47 항체로 표적화될 수 있고; 면역학적 표적 VEGF는 항-VEGF 항체로 표적화될 수 있고; 그리고 면역학적 표적 뉴로필린은 항-뉴로필린 항체로 표적화될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Mahoney 등]의 표 1 참조).
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 면역요법제는 예를 들어, 항-TWEAK 제제, 항-세포 표면 림프구 단백질 제제, 항-BRAF 제제, 항-MEK 제제, 항-CD33 제제, 항-CD20 제제, 항-HLA-DR 제제, 항-HLA 클래스 I 제제, 항-CD52 제제, 항-A33 제제, 항-GD3 제제, 항-PSMA 제제, 항-세아칸(Ceacan) 1 제제, 항-갈레딘(Galedin) 9 제제, 항-HVEM 제제, 항-VISTA 제제, 항-B7 H4 제제, 항-HHLA2 제제, 항-CD155 제제, 항-CD80 제제, 항-BTLA 제제, 항-CD160 제제, 항-CD28 제제, 항-CD226 제제, 항-CEACAM1 제제, 항-TIM3 제제, 항-TIGIT 제제, 항-CD96 제제, 항-CD70 제제, 항-CD27 제제, 항-LIGHT 제제, 항-CD137 제제, 항-DR4 제제, 항-CR5 제제, 항-TNFRS 제제, 항-TNFR1 제제, 항-FAS 제제, 항-CD95 제제, 항-TRAIL 제제, 항-DR6 제제, 항-EDAR 제제, 항-NGFR 제제, 항-OPG 제제, 항-RANKL 제제, 항-LTβ 수용체 제제, 항-BCMA 제제, 항-TACI 제제, 항-BAFFR 제제, 항-EDAR2 제제, 항-TROY 제제, 및 항-RELT 제제를 포함한다. 예를 들어, 면역요법제는 항-TWEAK 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-세포 표면 림프구 단백질 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-BRAF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-MEK 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD33 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD20 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-HLA-DR 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-HLA 클래스 I 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD52 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-A33 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-GD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-세아칸 1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-갈레딘 9 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-HVEM 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-VISTA 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-B7 H4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-HHLA2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD155 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD80 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-BTLA 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD160 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD226 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CEACAM1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-TIM3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD96 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD70 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-LIGHT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-DR4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-TNFRS 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-TNFR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-FAS 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD95 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-TRAIL 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-DR6 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-EDAR 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-NGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-OPG 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-RANKL 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-LTβ 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-TACI 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-BAFFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-EDAR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-TROY 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-RELT 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 항암 요법은 면역 효과기 세포 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것과 같은 면역 요법이다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 암세포 항원 및 선택적으로 애주번트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 효과기 세포는 NK-세포, T-세포(예를 들어, CAR T-세포) 또는 NK/T-세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 구현예의 키메라 항원 수용체(CAR) 및 키뉴레니나제 동종이량체를 포함하는 T-세포는 암이 있는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위해 고려된다. 일부 구현예에서, 세포는 CAR 및 키뉴레니나제, 및 일부 경우에는 트랜스포사제를 인코딩하는 DNA로 형질감염될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 종양이 있는 인간 대상체에서 T-세포 반응을 제공하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 기재된 치료 방법의 구현예 중 어느 하나에 따른 키뉴레니나제 동종이량체를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
정의
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 기재되는 값보다 10% 초과 또는 미만인 값을 지칭한다. 예를 들어, "약 5,000 Da"라는 문구는 4,500 Da와 5,500 Da 사이의 값을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는", "투여" 등은 임의의 효과적인 경로에 의해 본 명세서에 기재된 하나 이상의 단백질을 함께 발현하는 치료제(예를 들어, 제형)를 환자에게 직접 제공하는 것을 지칭한다. 예시적인 투여 경로는 본 명세서에 기재되어 있고 특히 정맥내 주사와 같은 전신 투여 경로 뿐만 아니라 뇌실내 주사, 척추강내 주사 및 정위 주사와 같은 환자의 중추신경계에 직접 투여하는 경로를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 기능적 등가물"은 당업계에서 잘 이해되고 있으며 본 명세서에서 추가로 상세하게 정의된다. 따라서, 대조군 폴리펩티드의 아미노산과 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산의 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 81% 내지 약 90%, 또는 심지어 약 91% 내지 약 99%를 갖는 서열은 단백질의 생물학적 활성이 유지된다면 포함된다. 변형된 단백질은 일부 구현예에서 그의 천연 대응물과 생물학적으로 기능적으로 동등할 수 있다.
관심 단백질의 맥락에서 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "촉매 활성"은 단백질의 야생형 형태와 관련된 생물학적 기능을 지칭한다. 예를 들어, 효소의 맥락에서, "촉매 활성"이라는 용어는 상응하는 화학 반응의 생성물을 생성하는 방식으로 기질 턴오버(turnover)에 영향을 미치는 단백질의 능력을 지칭한다. 효소의 활성 수준은 예를 들어 당업계에 공지된 기질 턴오버 분석을 사용하여 검출되고 정량화될 수 있다. 또 다른 예로서, 막 결합 수용체의 맥락에서, 용어 "활성"은 예를 들어 그의 동족 리간드에 결합시 수용체에 의해 개시되는 신호 전달을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 예를 들어 인공 T-세포 수용체, 키메라 T-세포 수용체 또는 키메라 면역수용체를 지칭할 수 있으며, 인공 특이성을 특정 면역 효과기 세포에 이식하는 조작된 수용체를 포괄한다. CAR은 단클론성 항체의 특이성을 T-세포에 부여함으로써, 예를 들어 입양 세포 요법에 사용하기 위해 다수의 특정 T-세포가 생성되도록 할 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 예를 들어 종양 연관 항원에 대한 세포의 특이성을 지시한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포내 활성화 도메인, 막횡단 도메인, 및 종양 연관 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 CD3-제타 막횡단 및 엔도도메인에 융합된 단클론성 항체(예컨대 본 명세서에 참조로 전체적으로 포함되어 있는 미국 특허 7,109,304에 기술된 것과 같은 것)로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv)의 융합체를 포함한다. 다른 CAR 디자인의 특이성은 수용체의 리간드(예를 들어, 펩티드) 또는 패턴 인식 수용체예를 들어, 덱틴(Dectin)에서 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, B-계통 분자, CD19에 특이적인 CAR을 사용함으로써 T 세포의 특이성을 재지정함으로써 악성 B 세포를 표적화할 수 있다. 특정 경우에, 항원 인식 도메인의 간격은 활성화 유도 세포사를 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 특정 경우에, CAR은 CD3-제타, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10, 및/또는 OX40과 같은 추가 공동자극 신호전달을 위한 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 분자는 공동자극 분자, 영상화용 리포터 유전자(예를 들어, 양전자 방출 단층촬영용), 전구약물의 첨가 시 T-세포를 조건부로 절제하는 유전자 산물, 귀소 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 및 사이토카인 수용체를 포함하는 CAR과 공동 발현될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "동종이량체"는 아미노산 잔기의 순서, 수 및 종류가 서로 동일한 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질(예를 들어, 키뉴레니나제)을 지칭한다. 따라서, "키뉴레니나제 동종이량체"라는 용어는 아미노산 잔기의 순서, 수 및 종류가 서로 동일한 2개의 단량체성 키뉴레니나제 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키뉴레니나제를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 돌연변이", "보존적 치환", "보존적 아미노산 치환" 등은 유사한 물리화학 특성, 예컨대 극성, 정전기적 전하, 및 입체 부피를 나타내는 하나 이상의 상이한 아미노산에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환을 지칭한다. 이러한 특성은 하기 표 1에 20개의 자연 발생 아미노산 각각에 대해 요약되어 있다.
Figure pct00001
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 세포에 적용될 때 치료 작제물 및 화학요법제 또는 방사선요법제가 표적 세포에 전달되거나 표적 세포와의 직접 병치로 배치되는 과정을 설명하기 위해 본 명세서에 사용된다. 예를 들어, 세포 사멸을 달성하기 위해 두 제제는 세포를 사멸시키거나 분열을 방지하는 데 효과적인 조합된 양으로 세포에 전달된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량", "치료적 유효량" 등은, 본 명세서에 기재된 벡터 작제물, 바이러스 벡터 또는 세포와 같은 치료적 조성물과 관련하여 사용되는 경우에, 포유동물, 예를 들어 인간을 포함하는 대상체에 투여되는 경우, 임상 결과와 같은 유익하거나 원하는 결과를 초래하는 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 암 치료의 맥락에서, 이들 용어는 조성물, 벡터 작제물, 바이러스 벡터 또는 세포의 투여 없이 수득된 반응과 비교하여 치료 반응을 달성하기에 충분한 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 양에 상응하는 본 명세서에 기재된 주어진 조성물의 양은 다양한 인자, 예컨대 주어진 제제, 약제학적 제형, 투여 경로, 질환 또는 장애의 유형, 대상체의 동일성(예를 들어, 연령, 성별, 체중) 또는 치료받는 숙주 등에 따라 변할 수 있다. 본 개시내용의 벡터 작제물, 바이러스 벡터 또는 세포와 같은 조성물의 "유효량", "치료적 유효량" 등은 또한 대조군과 비교하여 대상체에서 유익하거나 원하는 결과를 초래하는 양을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 비-천연 방식으로 작동가능하게 연결된 단백질 또는 단백질 단편을 함유하는 키메라 단백질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "반감기"(½-감기)는 시험관내 또는 생체내, 예를 들어 포유동물에 주사한 후 그의 폴리펩티드 농도가 절반으로 떨어지는 데 필요한 시간을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "KM"은 효소에 대한 미카엘리스-멘텐 상수(Michaelis-Menten constant)를 지칭하며, 효소 촉매 반응에서 주어진 효소가 최대 속도의 1/2을 생성하는 특정 기질의 농도로 정의된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "kcat"는 단위 시간당 생성물로 전환되는 각 효소 부위의 기질 분자의 턴오버 수(turnover number) 또는 그 수를 지칭하며, 이때 효소가 최대 효율로 작용한다. 본 명세서에 사용된 용어 "kcat/KM"은 효소가 기질을 생성물로 얼마나 효율적으로 전환시키는지를 측정한 특이성 상수이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "키뉴레니나제"는 키뉴레닌의 안트라닐산으로의 촉매적 분해를 담당하는 효소를 지칭한다. 용어 "키뉴레니나제"는 또한 야생형 키뉴레니나제 효소의 변이체 및 이를 인코딩하는 핵산, 예컨대 야생형 키뉴레니나제 효소의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열번호: 1)에 대해 적어도 70% 서열 동일성 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 동일성, 또는 그 초과)을 갖는 변이체 단백질 또는 야생형 키뉴레닌 유전자의 핵산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 동일성, 또는 그 초과)을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭하고, 단, 인코딩된 키뉴레니나제 유사체는 야생형 키뉴레니나제의 치료 기능을 유지한다. "키뉴레니나제"는 또한 천연 신호 펩티드가 존재하는 키뉴레니나제 단백질을 지칭할 수 있다. 대안적으로, "키뉴레니나제"는 천연 신호 펩티드가 제거된 키뉴레니나제 단백질(예를 들어, 성숙 단백질)을 지칭할 수 있다. 키뉴레니나제는 또한 키뉴레니나제의 촉매 도메인, 또는 그와 같은 도메인에 대해 적어도 70% 서열 동일성 (예를 들어, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 동일성, 또는 그 초과)을 갖는 변이체를 지칭한다. 추가로, 용어 "키뉴레니나제"는, 또한 폴리펩티드가 다른 제제, 예컨대 다른 폴리펩티드, 반감기 조절제, 예컨대 PEG화제 또는 치료제에 작동가능하게 연결된 변이체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "키뉴레니나제"는 문맥에 따라 이 단백질을 인코딩하는 효소 또는 유전자를 지칭할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 인정될 것이다.
키뉴레니나제는 각각 동일한 아미노산 서열을 갖는 2개의 키뉴레니나제 단량체로 구성된 동종이량체와 같은 개별 "키뉴레니나제 단량체"의 이량체로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "키뉴레니나제 단량체"는 이러한 또 다른 폴리펩티드와 비공유적으로 연결될 때 이량체성 키뉴레니나제 효소를 형성하는 개별 폴리펩티드를 지칭한다.
본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 본 명세서의 서열번호: 1, 서열번호 2, 또는 서열번호: 3과 아미노산 서열 즉, 예를 들어, 적어도 85% 동일한 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 서열번호: 1에 대한 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, 151M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D, K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A, 및 A436T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 갖는다. 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 서열번호: 1에 대해 예를 들어, A282 (예를 들어, A282M 또는 A282P), F306 (예를 들어, F306W 또는 F306Y) 또는 F249, 예컨대 F249W에서의 치환을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 서열번호: 1에 대해 A99에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 서열번호: 1에 대해 G112에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 서열번호: 1에 대해 E103에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 서열번호: 1에 대해 V104에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 서열번호: 1에 대해 S408에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 F306W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 L72N 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 H102W 및 N333T 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 I183P 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 R107P 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 A436T 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 서열번호: 1에 대해 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 서열번호: 1에 대해 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단량체는 서열번호: 1에 대한 치환 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "연결 기"는 2개의 상이한 분자를 작동가능하게 연결하기 위해 분자 브릿지로서 작용하는 화합물 또는 그의 모이어티를 지칭하며, 여기서 연결 기의 한 부분은 제1 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 연결 기의 다른 부분은 제2 분자에 작동가능하게 연결된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩티드"는 예를 들어 키뉴레닌 분해 활성 또는 열역학적 안정성과 같은 비변형된 단백질 또는 폴리펩티드에 비해 추가적인 이점을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단량체"는 단백질의 추가 사차 구조에 대한 가장 단순한 염기 서브유닛인 단일 폴리펩티드 사슬을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "PEG화제"는 다양한 화학적 방법에 의해 PEG 사슬의 말단에 있는 하이드록시 기를 통해 활성제에, 예를 들어 단백질에 커플링될 수 있는 (예를 들어, 공유 결합될 수 있는) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, PEG 자체는 PEG 분자당 최대 2개의 활성제로 제한된다. 상이한 접근법에서, PEG의 생체적합성을 유지하지만 분자당 수많은 부착점의 추가 이점이 있어 더 큰 약물 부하를 제공하는 PEG와 아미노산의 코폴리머(copolymers)가 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요하다면 갭을 도입하여 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성한 후, 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 핵산 또는 아미노산과 동일한 후보 서열 내 핵산 또는 아미노산의 퍼센트로서 정의된다. 핵산 또는 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, 또는 Megalign 소프트웨어를 사용하여 당업자의 능력 내에서 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, 퍼센트 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST를 사용하여 생성될 수 있다. 예시로서, 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 B에 대한, 그와의, 또는 그에 대한 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 A의 퍼센트 서열 동일성(대안적으로 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 B에 대한, 그와의, 또는 그에 대한 특정 퍼센트 서열 동일성을 갖는 주어진 핵산이나 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 × (X/Y 분수)
여기서 X는 A와 B의 해당 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램(예를 들어, BLAST)에 의해 동일한 일치로 점수화된 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수이고, Y는 B에 있는 핵산의 총 수이다. 핵산 또는 아미노산 서열 A의 길이가 핵산 또는 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 퍼센트 서열 동일성은 A에 대한 B의 퍼센트 서열 동일성과 동일하지 않을 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 과도한 독성, 자극, 알러지성 반응 및 합리적인 유익/유해 비율에 상응하는 다른 문제 합병증없이 포유동물(예를 들어, 인간)과 같은 대상체의 조직과 접촉하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 복용 형태를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭하고 상호교환가능하게 사용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대상체" 및 "환자"는 영장류, 포유동물 및 척추동물과 같은 인간 또는 비인간을 지칭한다. 특정 구현예에서, 대상은 인간이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료" 및 "치료하는"은 유익하거나 원하는 결과, 예를 들어 임상 결과를 얻기 위한 접근법을 의미한다. 유익한 또는 원하는 결과는, 검출가능하든지 검출불가능하든지 간에, 하나 이상의 증상 또는 병태의 완화 또는 개선; 질환 또는 병태의 정도의 약화; 질환, 장애 또는 병태의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태; 질병 또는 병태의 확산을 방지하는 것; 질환 또는 병태를 지연시키거나 그 진행을 늦추는 것; 질병 또는 병태의 개선 또는 경감; 및 차도 (부분적이든 전체적이든)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
질병 또는 병태를 "개선" 또는 "경감"하는 것은 질환, 장애 또는 병태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 줄어들고/거나 진행의 시간 과정은 치료의 부재 하의 정도 또는 시간 과정에 비해 느려지거나 길어진다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 사람들은 병태 또는 장애가 이미 있는 사람들, 뿐만 아니라 병태 또는 장애가 발병하기 쉬운 사람들 또는 발병할 위험이 있는 사람들, 뿐만 아니라 상태 또는 장애가 예방되어야 하는 사람들을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 치료 조성물과 관련하여 사용될 때 용어 "단위 용량"은 대상체에 대한 일체형 복용량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며, 각 단위는 필요한 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 회합하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 1f: PEG화된 키뉴레니나제 접합체의 생성. A) PEG:키뉴레니나제 동종이량체의 20:1-60:1 범위의 투입비에 대한 키뉴레니나제 단량체당 접합된 PEG 분자의 결과 수. B) PEG:키뉴레니나제 동종이량체의 20:1-60:1 범위의 투입비에 대한 키뉴레니나제 동종이량체당 접합된 PEG 분자의 결과 수. C) PEG:키뉴레니나제 동종이량체의 투입비가 20:1-60:1인 PEG 분자와 키뉴레니나제 간의 접합 반응의 효율. D) 20:1 PEG 대 키뉴레니나제 동종이량체의 투입비로 인한 PEG화 키뉴레니나제 동종이량체 생성물의 SEC-MALS HPLC. E) 30:1 PEG 대 키뉴레니나제 동종이량체의 투입비로 인한 PEG화 키뉴레니나제 동종이량체 생성물의 SEC-MALS HPLC. F) 60:1 PEG 대 키뉴레니나제 동종이량체의 투입비로 인한 PEG화 키뉴레니나제 동종이량체 생성물의 SEC-MALS HPLC.
도 1a 내지 1f에 나타낸 모든 몰 투입비는 PEG 대 키뉴레니나제 동종이량체의 투입비이다.
도 2a 내지 2c: PEG화 키뉴레니나제 효소의 생물학적 활성의 비교. A) 투입비가 상이한 키뉴레니나제의 SEC-HPLC 프로파일(PEG:키뉴레니나제 동종이량체로 표시). 피크는, 왼쪽에서 오른쪽으로, 각각 PEG:키뉴레니나제 동종이량체의 100:1 몰 투입비, PEG:키뉴레니나제 동종이량체의 80:1 몰 투입비, PEG:키뉴레니나제 동종이량체의 40:1 몰 투입비, PEG:키뉴레니나제 동종이량체의 20:1 몰 투입비, PEG:키뉴레니나제 동종이량체의 10:1 몰 투입비, 및 비-PEG화 키뉴레니나제 동종이량체에 해당한다. B) PEG화 키뉴레니나제의 단일 iv 용량 후 72시간에 마우스 혈장 PD. x-축을 따른 값은 PEG:키뉴레니나제 동종이량체의 몰 투입비에 해당한다. C) 항-PEG 웨스턴 블롯에 의해 정량화된 PEG화 키뉴레니나제의 CT26 종양 축적. x-축을 따른 값은, 실시예 3에 기재된 바와 같이 BALB/c 마우스에 키뉴레니나아제를 투여한 후 종양 축적이 평가된 시점을 나타낸다. 도 2c에 도시된 각 시점에 대해, 4개의 수직 막대가 도시되어 있으며, 각각은 PEG 대 키뉴레니나제 동종이량체의 특정 투입비로부터 형성된 키뉴레니나제에 대한 상대적인 종양 축적을 도시한다. 각 시점의 수직 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 10:1, 20:1, 40:1 및 100:1의 몰 투입비로 형성된 키뉴레니나제 동종이량체에 해당한다.
도 2a 내지 2c에 나타낸 모든 몰 투입비는 PEG 대 키뉴레니나제 동종이량체의 투입비이다.
본 개시내용은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유적으로 결합된 키뉴레니나제 단백질, 뿐만 아니라 이러한 단백질을 합성하는 방법 및 종양을 갖는 환자와 같은 암을 갖는 환자의 치료를 위해 상기를 사용하는 방법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 PEG에 공유 결합되지 않은 키뉴레니나제 단백질과 비교하여 개선된 종양 축적, 연장된 반감기 및 더 큰 효소 활성과 같은 향상된 약동학적 및/또는 약력학적 특성을 나타내는 PEG 대 키뉴레니나제의 비율을 특징으로 하는 PEG화 키뉴레니나제 단백질을 제공한다. 메카니즘에 의해 제한되지 않고, 본 명세서에 기재된 키뉴레니나제 단백질은 혈청에서 비활성화에 대한 증가된 내성을 나타낼 수 있으며, 이는 키뉴레니나제가 증가된 시간 동안 키뉴레닌 분해에 대한 활성을 유지할 수 있게 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 PEG:키뉴레니나제 비율을 특징으로 하는 PEG화 키뉴레니나제 효소는 암 치료와 같은 치료적 질환 개입에 이상적이게 하는 실질적으로 개선된 치료 특성을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제 단백질은 인돌아민 2,3 디옥시게나제 (IDO) 또는 트립토판 2,3 디옥시게나제 (TDO)를 발현하는 종양이 있는 환자와 같은 암 환자를 치료하는 데 사용된다.
이어지는 섹션은 상기에 기재된 유리한 치료 특성을 초래하는 PEG:키뉴레니나제 폴리펩티드의 비율, 뿐만 아니라 이러한 단백질을 생성하고 상기를 환자 치료에 사용하는 데 사용할 수 있는 과정을 기재한다.
키뉴레니나제 단백질
PEG화 키뉴레니나제 효소의 일부 구현예는 변형된 단백질 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정 구현예는 비변형 버전, 바람직하게는 키뉴레닌 분해 활성에 필적하는 적어도 하나의 기능적 활성을 나타내는 변형된 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 추가 구현예에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 혈청 안정성을 증가시키기 위해 추가로 변형될 수 있다.
활성의 결정은 특히 단백질의 활성과 관련하여 당업자에게 친숙한 검정을 사용하여 달성될 수 있고 비교 목적을 위해 변형 또는 비변형 단백질 또는 폴리펩티드의 천연 및/또는 재조합 버전의 사용을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 키뉴레니나아제와 같은 변형된 폴리펩티드는 키뉴레닌의 증가를 기반으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 비변형된 폴리펩티드의 기질 인식 부위가 확인될 수 있다. 이 확인은 구조적 분석 또는 상동성 분석을 기반으로 할 수 있다. 그러한 기질 인식 부위의 변형을 수반하는 돌연변이 집단이 생성될 수 있다. 추가 구현예에서, 키뉴레닌 분해 활성이 증가된 돌연변이체는 돌연변이체 집단으로부터 선택될 수 있다. 원하는 돌연변이체의 선택은 키뉴레닌 분해로부터 부산물 또는 생성물의 검출과 같은 방법을 포함할 수 있다.
변형된 단백질은 아미노산의 결실 및/또는 치환을 가질 수 있고; 따라서 결실된 단백질, 치환된 단백질, 결실 및 치환된 단백질은 변형된 단백질이다. 일부 구현예에서, 이러한 변형된 단백질은 융합 단백질 또는 링커가 있는 단백질과 같이 삽입 또는 첨가된 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 변형된 결실된 단백질은 천연 단백질의 하나 이상의 잔기가 결여되어 있지만, 천연 단백질의 특이성 및/또는 활성을 가질 수 있다. 변형된 결실된 단백질은 또한 감소된 면역원성 또는 항원성을 가질 수 있다. 변형된 결실된 단백질의 예는 적어도 하나의 항원성 영역, 즉 변형된 단백질이 투여될 수 있는 유기체의 유형과 같은 특정 유기체에서 항원성인 것으로 결정된 단백질의 영역으로부터 아미노산 잔기가 결실된 것이다.
치환 또는 대체 변이체는 일반적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산을 다른 것으로 교환하는 것을 포함하고, 폴리펩티드의 하나 이상의 특성, 특히 그의 효과기 기능 및/또는 생체이용률을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수도 있고 아닐 수도 있고, 즉, 하나의 아미노산이 유사한 모양과 전하 중 하나로 대체된다. 보존적 치환은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 하기의 변화를 포함한다: 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 라이신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르테이트에서 글루타메이트으로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파르테이트으로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 라이신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신, 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로.
결실 또는 치환에 추가하여, 변형된 단백질은 전형적으로 폴리펩티드에 적어도 하나의 잔기의 추가를 수반하는 잔기의 삽입을 가질 수 있다. 이는 표적화 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 단순히 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 융합 단백질이라고 하는 말단 첨가는 아래에서 논의된다.
또한 아미노산 및 핵산 서열은 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열과 같은 추가 잔기를 포함할 수 있지만, 상기 서열이 단백질 발현과 관련된 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하는 상기 제시된 기준을 충족시키는 한, 본 명세서에 개시된 서열 중 하나에 제시된 바와 본질적으로 같은 것일 수 있다.
말단 서열의 추가는 특히, 예를 들어 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분 중 하나에 측접된 다양한 비-코딩 서열을 포함하거나, 다양한 내부 서열, 즉, 인트론을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용되며, 이는 유전자 내에서 발생하는 것으로 알려져 있다.
일부 구현예에서, 구현예에 따른 키뉴레니나제는 서열번호: 1, 2 또는 3의 키뉴레니나제와 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키뉴레니나제는 서열번호: 1, 2 또는 3의 키뉴레니나제와 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고 L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, 151M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D, K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A 및 A436T로 이루어진 군으로 선택된 아미노산 치환 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개를 포함한다. 일부 구현예에서, 키뉴레니나제는 표 2에 제공된 키뉴레니나제 중 하나와 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 구현예에서, 키뉴레니나제는 표 2에 제공된 것들 중 하나로부터 선택된다.
하기 표 2는 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 다양한 키뉴레니나제 효소를 제시한다. 표 2에 명시적으로 나열되어 있지는 않지만, 본 명세서의 단백질(1)은 아미노산 서열이 서열번호: 1에 제시된 야생형 인간 키뉴레니나아제를 지칭한다.
서열번호: 1 - 야생형 인간 키뉴레니나제:
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접합체
본 개시내용의 조성물 및 방법은 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 이종 펩티드 세그먼트 또는 폴리머로 접합체를 형성함으로써 변형된 키뉴레니나제를 수반한다. 키뉴레니나아제는 PEG에 연결되어 효소의 유체역학적 반경을 증가시켜 혈청 지속성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 개시된 폴리펩티드는 종양 세포 상의 외부 수용체 또는 결합 부위에 특이적이고 안정적으로 결합하는 능력을 갖는 리간드와 같은 임의의 표적화제에 접합될 수 있다 (미국 특허 공개 2009/0304666).
PEG화
본 개시내용의 일부 구현예에서, 키뉴레니나제의 PEG화와 관련된 방법 및 조성물이 개시된다. 예를 들어, 키뉴레니나제는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 PEG화된다.
PEG화는 폴리에틸렌 글리콜) 폴리머 사슬을 다른 분자, 일반적으로 약물 또는 치료적 단백질에 공유 부착하는 과정이다. PEG화는 PEG와 표적 거대분자와의 반응성 유도체의 인큐베이션에 의해 일상적으로 달성된다. 약물 또는 치료적 단백질에 대한 PEG의 공유 부착은 숙주의 면역계로부터 제제를 가리거나(면역원성 및 항원성 감소) 제제의 유체역학적 크기(용액 내 크기)를 증가시켜 신장 청소율(renal clearance)을 감소시켜 순환 시간을 연장할 수 있다. PEG화는 또한 소수성 약물 및 단백질에 대한 수용해도를 제공할 수 있다. PEG화의 첫 번째 단계는 한쪽 또는 양쪽 말단에서 PEG 폴리머의 적절한 작용화이다. 동일한 반응성 모이어티로 각 말단에서 활성화된 PEG는 "동종이작용성"으로 알려져 있는 반면, 존재하는 작용기가 다른 경우, PEG 유도체는 "이종이작용성" 또는 "이종작용성"으로 지칭된다. PEG 폴리머의 화학적 활성 또는 활성화된 유도체는 PEG를 원하는 분자에 부착하기 위해 제조된다.
PEG 유도체에 대한 적합한 작용기의 선택은 PEG에 커플링될 분자에서 사용 가능한 반응성 기의 유형을 기반으로 한다. 단백질의 경우, 전형적인 반응성 아미노산은 라이신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다. N-말단 아미노 기 및 C-말단 카복실산도 사용될 수 있다. 1세대 PEG 유도체를 형성하는 데 사용되는 기술은 일반적으로 PEG 폴리머를 하이드록실 기와 반응하는 기, 전형적으로 무수물, 산 염화물, 클로로포르메이트, 및 카보네이트와 반응시키는 것이다. 2세대 PEG화 화학에서는, 알데하이드, 에스테르, 아미드 등과 같은 보다 효율적인 작용기가 접합에 사용 가능하다.
PEG화의 적용이 점점 더 진행되고 정교해짐에 따라 접합을 위한 이종이작용성 PEG의 필요성이 증가하였다. 이러한 이종이작용성 PEG는 친수성, 가요성 및 생체 적합성 스페이서가 필요한 두 독립체를 연결하는 데 매우 유용하다. 이종이작용성 PEG의 바람직한 말단 기는 말레이미드, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아민, 카복실산 및 NHS 에스테르이다.
가장 일반적인 변형제 또는 링커는 메톡시 PEG(mPEG) 분자를 기반으로 한다. 그들의 활성은 알코올 말단에 단백질 변형 기를 추가하는 것에 달려 있다. 어떤 경우에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG 디올)이 전구체 분자로 사용된다. 디올은 이종- 또는 동종-이량체성 PEG 연결 분자를 만들기 위해 양 말단에서 후속적으로 변형된다.
단백질은 일반적으로 비양성자화 티올(시스테닐 잔기) 또는 아미노 기와 같은 친핵성 부위에서 PEG화된다. 시스테닐 특이적(즉, 시스틴 반응성) 변형 시약의 예는 PEG 말레이미드, PEG 요오도아세테이트, PEG 티올 및 PEG 비닐 설폰을 포함한다. 4개 모두 온화한 조건에서 시스테닐 특이적이며 중성 내지 약알칼리성인 pH이다.
아민 특이적(즉, 라이신 반응성) 변형제는 PEG NHS 에스테르, PEG 트레실레이트, PEG 알데하이드, PEG 이소티오시아네이트, 및 몇 개의 기타의 것들을 포함한다. 모두 온화한 조건에서 반응하며 아미노 기에 대해 매우 특이적이다. PEG NHS 에스테르는 아마 반응성이 더 큰 반응성 제제 중 하나일 것이고; 그러나 높은 반응성으로 인해 PEG화 반응을 대규모로 제어하기 어려울 수 있다. PEG 알데하이드는 아미노 기와 함께 이민을 형성한 다음, 나트륨 시아노붕소수화물로 2차 아민으로 환원된다. 수소화붕소나트륨과 달리, 나트륨 시아노붕소수화물은 디설파이드 결합을 감소시키지 않는다. 그러나 이 화학물질은 독성이 강하고 특히 휘발성이 되는 낮은 pH에서 조심스럽게 다루어야 한다.
대부분의 단백질에 있는 다중 라이신 잔기로 인해, 부위 특이적 PEG화가 어려울 수 있다. 이러한 시약은 양성자화되지 않은 아미노 기와 반응하기 때문에, 더 낮은 pH에서 반응을 수행하여 더 낮은 pK 아미노 기로 PEG화를 유도할 수 있다. 일반적으로 알파-아미노 기의 pK는 라이신 잔기의 엡실론-아미노 기보다 1-2 pH 단위 낮다. pH 7 이하에서 분자를 PEG화함으로써 N-말단에 대한 높은 선택성을 자주 얻을 수 있다. 그러나 이것은 단백질의 N-말단부가 생물학적 활성에 필요하지 않은 경우에만 실현가능하다. 여전히, PEG화의 약동학적 이점은 종종 시험관 내 생물활성의 상당한 손실보다 더 크고, 이로써 PEG화 화학과 무관하게 훨씬 더 큰 생체내 생물활성을 갖는 생성물이 생성된다.
PEG화 절차를 개발할 때 고려해야 할 몇 가지 파라미터가 있다. 티올 특이적 PEG화 반응의 경우, 고려해야 할 파라미터에는 단백질 농도, PEG 대 단백질 비율(몰 기준), 온도, pH, 반응 시간이 포함되고, 일부 경우에는 산소가 제외된다. (산소는 단백질에 의한 분자간 디설파이드 형성에 기여할 수 있으며, 이는 PEG화된 생성물의 수율을 감소시킬 것이다.) 특히 N-말단 아미노 기를 표적으로 할 때 pH가 훨씬 더 중요할 수 있다는 점을 제외하고, 아민 특이적 변형에 대해 동일한 인자(산소 제외)를 고려해야 한다.
아민 및 티올 특이적 변형 모두에 대해, 반응 조건은 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이것은 온도, 단백질 농도 및 pH를 제한할 수 있다. 또한, PEG화 반응을 시작하기 전에 PEG 링커의 반응성을 알아야 한다. 예를 들어, PEG화제가 단지 70 퍼센트 활성인 경우, 사용된 PEG의 양은 활성 PEG 분자만 단백질 대 PEG 반응 화학량론에서 계수되도록 해야 한다.
화학적 접합을 위한 링커
다양한 링커를 사용하여 키뉴레니나제 동종이량체 및 PEG 분자 내의 반응성 잔기를 서로 공유 커플링하여, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 접합체를 형성할 수 있다. 예시적인 링커는, 예를 들어 효소적 가수분해, 광분해, 산성 조건하 가수분해, 염기성 조건하 가수분해, 산화, 디설파이드 환원, 친핵성 절단 또는 유기금속 절단에 의해 절단될 수 있는 것들을 포함한다(예를 들어, 문헌[Leriche 등, Bioorg 참조 Med. Chem., 20:571-582, 2012], 그 개시내용은 화학적 커플링에 적합한 링커에 관한 것이므로 본 명세서에 참고로 포함됨). 본 명세서에 기재된 접합체의 합성에 유용한 링커의 예는 특히 항체, 항원-결합 단편, 단백질, 펩티드, 및 소분자, 예컨대 아민 및 티올 모이어티 내에 존재하는 친핵성 치환체와의 반응에 적합한 친전자체, 예컨대 마이클(Michael) 수용체 (예를 들어, 말레이미드), 활성화된 에스테르, 전자-결핍된 카보닐 화합물, 및 알데하이드를 함유하는 것을 포함한다. 예를 들어, 치료적 접합체의 합성에 적합한 링커는 비제한적으로, 2개의 반응성 모이어티를 함유하는 알킬, 사이클로알킬, 및 헤테로사이클로알킬 링커, 예컨대 개방-사슬 에틸, 프로필, 부틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 또는 데실 사슬, 사이클로헥실 기, 사이클로펜틸 기, 사이클로부틸 기, 사이클로프로필 기, 피페리디닐 기, 모폴리노 기, 또는 기타 (예를 들어, 특히, 키뉴레니나제 내에 존재하는 반응성 친핵성 원자에 의해 치환될 수 있는 할로겐 원자, 알데하이드 기, 에스테르 기, 아실 클로라이드 기, 아실 무수물 기, 토실 기, 메실 기, 또는 브로실 기), 아릴 또는 헤테로아릴 링커, 예컨대 키뉴레니나제 내에 존재하는 반응성 친핵성 원자에 의해 치환될 수 있는 2개의 할로메틸 기를 함유하는 벤질, 나프틸, 또는 피리딜 기를 포함한다. 예시적인 링커는 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-L-카복실레이트 (SMCC), N-석신이미딜 요오도아세테이트 (SIA), 설포-SMCC, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미딜 에스테르 (MBS), 설포-MBS, 및 석신이미딜 요오도아세테이트를 포함하고, 예를 들어 문헌[Liu 등, 18:690-697, 1979]에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 화학적 접합을 위한 링커에 관한 것이므로 본 명세서에 참고로 포함된다. 추가 링커는 절단 불가능한 말레이미도카프로일 링커를 포함하며, 이는 문헌[Doronina 등, Bioconjugate Chem. 17:14-24, 2006]에 기재되어 있고, 이의 개시 내용은 화학적 접합을 위한 링커에 관한 것이므로 본 명세서에 참조로 포함된다.
접합체의 한 성분이 본원에 기재된 바와 같이 또 다른 성분에 결합될 수 있는 추가의 링커는 링커의 하나의 말단 상에 접합체의 하나의 성분 (예를 들어, 키뉴레니나제)에 공유 결합되고, 그리고 링커의 다른 말단 상에, 링커 상에 존재하는 반응성 치환기와 접합체의 다른 성분 내에 존재하는 반응성 치환기 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 PEG 분자) 사이에 커플링 반응으로부터 형성된 화학 모이어티를 함유하는 링커를 포함한다. 접합체의 성분 내에 존재할 수 있는 예시적인 반응성 치환기는 비제한적으로, 세린, 트레오닌 및 티로신 잔기의 하이드록실 잔기; 라이신 잔기의 아미노 모이어티; 아스파르트산 및 글루탐산 잔기의 카복실 모이어티; 및 시스테인 잔기의 티올 모이어티, 뿐만 아니라 비-자연 발생 아미노산의의 프로파르길, 아지도, 할로아릴 (예를 들어, 플루오로아릴), 할로헤테로아릴 (예를 들어, 플루오로헤테로아릴), 할로알킬, 및 할로헤테로알킬 모이어티를 포함한다. 본 명세서에 기재된 접합체와 함께 유용한 링커는 비제한적으로, 하기 표 3에 도시된 바와 같은 커플링 반응에 의해 형성된 화학적 모이어티를 함유하는 링커를 포함한다. 곡선은 접합체의 각 성분에 대한 부착 지점을 지정한다.
PEG 분자를 효소에 접합시키는 데 사용할 수 있는 링커에는 링커의 하나의 말단에서 효소에 공유 결합되고 링커 상에 존재하는 반응성 치환기와 효소의 일부로서 존재하는 아미노산 잔기의 측쇄 중 하나 내에 존재하는 반응성 치환기 사이에 커플링 반응으로부터 형성된 화학적 모이어티를 함유하는 것을 포함한다. 키뉴레니나제 효소 내에 존재할 수 있는 반응성 치환기는 비제한적으로, 세린, 트레오닌 및 티로신 잔기의 하이드록실 잔기; 라이신 잔기의 아미노 모이어티; 아스파르트산 및 글루탐산 잔기의 카복실 모이어티; 및 시스테인 잔기의 티올 모이어티, 뿐만 아니라 비-자연 발생 아미노산의의 프로파르길, 아지도, 할로아릴 (예를 들어, 플루오로아릴), 할로헤테로아릴 (예를 들어, 플루오로헤테로아릴), 할로알킬, 및 할로헤테로알킬 모이어티를 포함한다.
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숙주 세포에서 키뉴레니나제의 재조합 발현
본 개시내용은 원핵생물 또는 진핵생물 생산자 세포와 같은 숙주 세포로부터 키뉴레니나제 단백질을 재조합적으로 발현시키기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 숙주 세포에서 키뉴레니나제 단백질을 발현시키는 데 사용할 수 있는 예시적인 방법은 다음 섹션에서 더 자세히 기재된다.
키뉴레니나제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드
포유동물 세포와 같은 숙주 세포로부터 키뉴레니나제 단백질을 발현하는 데 사용할 수 있는 한 플랫폼은 (예를 들어, 포유동물 세포의 핵 게놈 내로의 혼입에 의해) 키뉴레니나제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 숙주 세포 게놈에 안정적으로 혼입하는 것이다. 이들 유전자는 상응하는 단백질의 일차 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 이러한 외인성 유전자를 포유동물 세포에 도입하기 위해, 이들 유전자를 벡터에 혼입할 수 있다. 벡터는 형질전환, 형질감염, 직접 흡수, 발사체 충격을 비롯한 다양한 방법에 의해 그리고 리포솜에 벡터의 캡슐화에 의해 세포에 도입될 수 있다. 세포를 형질감염시키거나 형질전환시키는 적합한 방법의 예는 인산칼슘 침전, 전기천공, 미세주입, 감염, 리포펙션(lipofection) 및 직접 흡수이다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌[Green 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition (Cold Spring Harbor University Press, New York (2014)); 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York (2015))]에 더 상세히 기재되어 있고, 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자는 또한 이러한 제제를 인코딩하는 유전자를 함유하는 벡터를 세포막 인지질에 표적화함으로써 포유동물 세포 내로 도입될 수 있다.
예를 들어, 벡터는 벡터 분자를 모든 세포막 인지질에 대해 친화성을 갖는 바이러스 단백질인 VSV-G 단백질에 연결함으로써 세포막의 세포외 표면 상의 인지질에 표적화될 수 있다. 이와 같이, 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 작제물을 생성할 수 있다.
포유동물 RNA 중합효소에 의한 본 개시내용의 하나 이상의 치료적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인식 및 결합은 유전자 발현에 중요하다. 이와 같이, RNA 중합효소를 모집하고 전사 개시 부위에서 전사 복합체의 조립을 촉진하는 전사 인자에 대해 높은 친화성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 내의 서열 요소를 포함할 수 있다. 이러한 서열 요소는 예를 들어 포유동물 프로모터를 포함하고, 이의 서열은 특정 전사 개시 인자 및 궁극적으로 RNA 중합효소에 의해 인식 및 결합될 수 있다. 포유동물 프로모터의 예는 문헌[Smith 등, Mol. Sys. Biol., 3:73, 온라인 발행물]에 개시되었고, 이의 개시내용은 참고로 본 명세서에 포함된다.
하나 이상의 치료적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포유동물 세포의 핵 DNA 내로 혼입되면, 이 폴리뉴클레오티드의 전사는 당업계에 공지된 방법에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, 발현은 포유동물 프로모터에 대한 전사 인자 및/또는 RNA 중합효소의 결합을 조절하여 유전자 발현을 조절하는 제제와 같은 외부 화학 시약에 포유동물 세포를 노출시킴으로써 유도될 수 있다. 화학 시약은 예를 들어 프로모터에 결합한 억제자 단백질을 제거함으로써 RNA 중합효소 및/또는 전사 인자의 포유동물 프로모터에 대한 결합을 촉진하는 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 화학 시약은 RNA 중합효소 및/또는 전사 인자에 대한 포유동물 프로모터의 친화성을 향상시켜, 프로모터의 하류에 위치한 유전자의 전사 속도가 화학 시약의 존재 하에 증가되도록 하는 역할을 할 수 있다. 상기 메커니즘에 의해 폴리뉴클레오티드 전사를 강화하는 화학 시약의 예는 테트라사이클린 및 독시사이클린이다. 이들 시약은 상업적으로 입수가능하며(Life Technologies, Carlsbad, CA), 확립된 프로토콜에 따라 유전자 발현을 촉진하기 위해 포유동물 세포에 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있는 다른 DNA 서열 요소는 인핸서 서열이다. 인핸서는, DNA가 전사 개시 부위에서 전사 인자 및 RNA 중합효소의 결합에 유리한 3차원 방향을 채택하도록 관심 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드에서 형태적 변화를 유도하는 조절 요소의 또 다른 부류를 나타낸다. 따라서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 치료적 단백질을 인코딩하는 것들을 포함하고 추가로 포유동물 인핸서 서열을 포함한다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자로부터 알려져 있으며, 그 예는 포유동물 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백 및 인슐린을 인코딩하는 유전자의 인핸서이다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 인핸서는 또한 진핵 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스의 유전 물질로부터 유래된 인핸서를 포함한다. 예로는 복제 기점의 후반에 있는 SV40 인핸서(bp 100-270), 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후반에 있는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 있다. 진핵생물 유전자 전사의 활성화를 유도하는 추가의 인핸서 서열은 문헌[Yaniv 등, Nature 297:17 (1982)]에 개시되어 있다.
융합 단백질
본 개시내용의 일부 구현예는 융합 단백질에 관한 것이다. 이들 분자는 N- 또는 C-말단에서 이종 도메인에 연결된 천연 또는 변형된 키뉴레니나제를 가질 수 있다. 예를 들어, 융합은 또한 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 허용하기 위해 다른 종의 리더 서열을 이용할 수 있다. 다른 유용한 융합은 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 바람직하게는 절단가능한, 단백질 친화성 태그, 예컨대 혈청 알부민 친화성 태그 또는 6개의 히스티틴 잔기, 또는 면역학적으로 활성 도메인, 예컨대 항체 에피토프의 첨가를 포함한다. 비제한적인 친화성 태그는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질 (MBP), 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)를 포함한다.
특정 구현예에서, 키뉴레니나제는 XTEN 폴리펩티드(Schellenberger 등, 2009), IgG Fc 도메인, 알부민, 또는 알부민 결합 펩티드와 같은 생체내 반감기를 증가시키는 펩티드에 연결될 수 있다.
융합 단백질을 생성하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 완전한 융합 단백질의 새로운 합성에 의해, 또는 이종 도메인을 인코딩하는 DNA 서열의 부착에 이어, 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 생성될 수 있다. 모 단백질의 기능적 활성을 회복하는 융합 단백질의 생산은 나란히 연결된 폴리펩티드 사이에 스플라이싱되는 펩티드 링커를 인코딩하는 브리징 DNA 세그먼트와 유전자를 연결함으로써 촉진될 수 있다. 링커는 생성된 융합 단백질의 적절한 폴딩을 허용하기에 충분한 길이일 것이다.
요법을 위한 효소적 키뉴레닌 분해
일부 구현예에서, 본 개시내용의 키뉴레니나제는 종양 매개된 관용원성 효과를 방지하고 대신에 종양 절제 전-염증 반응을 매개하기 위해 키뉴레닌 고갈에 민감성인 암을 포함한 질환의 치료에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 키뉴레니나제는 IDO1, IDO2, 및/또는 TDO를 발현하는 종양을 치료하는데 사용하기 위해 고려된다.
본 개시내용의 일부 구현예는 종양과 같은 질환을 치료하기 위한 변형된 키뉴레니나제를 제공한다. 특히, 변형된 키뉴레니나아제는 인간 폴리펩티드 서열을 가질 수 있어, 인간 환자의 알러지성 반응을 예방하고 반복 투여가 가능하며 치료 효능을 증가시킬 수 있다.
본 치료 방법이 유용한 종양에는 고형 종양 또는 혈액 종양에서 발견되는 것과 같은 임의의 악성 세포 유형이 포함된다. 예시적인 고형 종양은 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 목, 목, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선, 및 유방으로 이루어진 군으로부터 선택된 기관의 종양을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 혈액 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성종양, 백혈병, 림프종, 아세포종, 골수종 등을 포함한다. 본 명세서에 제공된 방법을 사용하여 치료할 수 있는 암의 추가 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 편평 세포 암, 폐암 (소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피 암종 포함), 복막의 암, 간세포 암, 위 또는 위장암 (위장암 및 위장 기질 암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액샘 암종, 신장 또는 신장암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종, 결절성 흑색종, 뿐만 아니라 B-세포 림프종 (저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL); 소림프구성 (SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고등급 면역아세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 작은 비-절단된 세포 NHL; 큰 부피의 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련된 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증 포함), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 모발 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 만성 골수아세포 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
암은 구체적으로 다음과 같은 조직학적 유형일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화된; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평 세포 암종; 림프상피성 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두상 이행 세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성; 담관암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선양 낭성 암종; 선종성 폴립에서의 선암종; 선암종, 가족성 결장 폴립증; 고체 암종; 유암종, 악성; 세기관지-폐포 선암종; 유두상 선암종; 혐색소 암종; 호산성 암종; 호산세포 선암종; 호염기구 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속물 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 이구 선암종; 점액표피양 암종; 낭샘암종; 유두상 낭샘암종; 유두상 장액 낭샘암종; 점액성 낭샘암종; 점액성 선암종; 인환 세포 암종; 침윤하는 관상 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 파젯 질환, 유선; 샘꽈리 세포 암종; 선편평세포 암종; 편평상피 화생을 갖는 선암종; 흉선종, 악성; 난소 간질성 종양, 악성; 난포막종, 악성; 과립막 세포 종양, 악성; 남성아세포종, 악성; 세르톨리 세포 암종; 라이디히 세포 종양, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 여분의 유선 부신경절종, 악성; 크롬친화세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 거대 착색된 모반에서의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 청색 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유상 조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 혼합된 종양, 악성; 뮬레리안 혼합된 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종; 간엽세포종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 활막 육종; 중피종, 악성; 난소고환종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소 갑상선종, 악성; 융모막암종; 중간콩팥종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종; 연골육종; 악성 연골아세포종; 간엽 연골육종; 뼈의 거대세포 종양; 유잉 육종; 악성 치원성 종양; 법랑아세포성 치아육종; 사기질아세포종, 악성; 법랑아세포성 섬유육종; 송과체종, 악성; 척색종; 신경교종, 악성; 뇌실막세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상아세포종; 교모세포종; 희소돌기아교세포종; 희소돌기아세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경교세포종; 신경교세포종; 망막아세포종; 후각 신경인성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 신경집종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨; 파라육아종; 악성 림프종, 소림프구성; 악성 림프종, 대세포, 확산; 악성 림프종, 여포성; 균상식육종; 다른 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 작은 장 질환; 백혈병; 림프양 백혈병; 혈질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기 백혈병; 호산구 백혈병; 단구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수성 육종; 및 모발 세포 백혈병.
키뉴레니나제는 종양 조직으로부터 키뉴레닌 및/또는 키뉴레닌 유래 대사산물을 고갈시키거나 암에 걸린 포유동물의 순환을 위해, 또는 고갈이 바람직한 것으로 간주되는 경우 키뉴레닌을 고갈시키기 위한 다양한 방식에서 항종양제로 본 명세서에서 사용될 수 있다. 고갈은 포유동물의 순환계에서 생체 내에서, 조직 배양 또는 기타 생물학적 배지에서 키뉴레닌 및/또는 키뉴레닌 유래 대사산물의 고갈이 필요한 경우 시험관 내에서, 및 생물학적 유체, 세포 또는 조직이 몸 밖에서 조작된 후 환자 포유동물의 몸으로 되돌아가는 생체 외 절차에서 수행될 수 있다. 순환, 배양 배지, 생물학적 유체 또는 세포로부터 키뉴레닌의 고갈은 처리되는 물질에 접근할 수 있는 키뉴레닌의 양을 줄이기 위해 수행되며, 따라서 고갈되는 물질을 키뉴레닌 고갈 조건 하에 키뉴레닌-고갈 양의 키뉴레니나제와 접촉시켜, 접촉되는 물질 중의 주변 키뉴레닌을 분해하는 것을 포함한다.
고갈은 반드시 세포 자체가 아니라 세포의 영양소 공급원으로 향할 수 있다. 따라서, 생체내 적용에서, 종양 세포를 치료하는 것은 종양 세포 집단에 대한 영양 배지를 키뉴레니나제와 접촉시키는 것을 포함한다. 이 구현예에서, 배지는 혈액, 림프액, 척수액 등 키뉴레닌 고갈이 요구되는 체액일 수 있다.
키뉴레닌- 및/또는 키뉴레닌 유래 대사산물 고갈 효율은 적용 분야에 따라 크게 달라질 수 있으며, 일반적으로 물질에 존재하는 키뉴레닌의 양, 원하는 고갈 속도, 키뉴레니나제 노출에 대한 물질의 허용도에 따라 다르다. 물질에서 키뉴레닌 및 키뉴레닌 대사산물 수준, 따라서 물질로부터 키뉴레닌 및 키뉴레닌 대사산물 고갈 속도는 당업계에 잘 알려진 다양한 화학적 및 생화학적 방법에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다. 예시적인 키뉴레닌 고갈량은 본 명세서에 추가로 기재되어 있고, 예를 들어 치료되는 대상체 및 질환의 중증도에 따라, 예를 들어 0.001 내지 1,000 단위(U)의 키뉴레니나제의 범위일 수 있다.
키뉴레닌 고갈 조건은 완충제 및 키뉴레니나제의 생물학적 활성과 양립할 수 있는 온도 조건이며, 효소와 양립할 수 있는 적당한 온도, 염 및 pH 조건, 예를 들어 생리학적 조건을 포함한다. 예시적인 조건은 약 4 내지 40℃, 약 0.05 내지 0.2M NaCl과 등가인 이온 강도, 및 약 5 내지 9의 pH를 포함하는 반면, 생리학적 조건이 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 항종양제로서 키뉴레니나제를 사용하는 방법을 고려하고, 따라서 종양 세포 성장을 억제하기에 충분한 기간 동안 종양 세포 집단을 치료 유효량의 키뉴레니나제와 접촉시키는 것을 포함한다.
키뉴레니나제의 치료적 유효량은 원하는 효과를 달성하기 위해, 즉 종양 조직 또는 환자의 순환에서 키뉴레닌을 고갈시키고, 이에 의해 종양 절제 전-염증 반응을 매개하기 위해 계산된 미리 결정된 양이다. 따라서, 본 개시내용의 키뉴레니나제의 투여를 위한 투여량 범위는 종양 세포 분열 및 세포 순환의 증상이 감소되는 원하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 것이다. 복용량은 과점성 증후군, 폐부종, 울혈성 심부전, 신경학적 영향 등과 같은 유해한 부작용을 일으킬 정도로 커서는 안 된다. 일반적으로, 복용량은 환자의 연령, 질환의 상태, 성별 및 질환의 정도에 따라 달라질 것이며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 합병증이 있는 경우 개별 의사가 복용량을 조정할 수 있다.
키뉴레니나제는 주사 또는 시간 경과에 따른 점진적 주입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 키뉴레니나제는 정맥내로, 복강내로, 경구로, 근육내로, 피하로, 공동내, 경피로, 진피로 투여될 수 있고, 연동 수단에 의해 전달될 수 있거나, 종양 세포를 함유하는 조직에 직접 주사될 수 있거나, 또는 키뉴레닌에 대한 잠재적인 바이오센서를 포함할 수 있는 카테터에 연결된 펌프에 의해 투여될 수 있다.
키뉴레니나제를 함유하는 치료 조성물은 예를 들어 단위 용량의 주사와 같이 통상적으로 정맥내 투여된다.
조성물은 복용 제형과 양립할 수 있는 방식으로 그리고 치료적 유효량으로 투여된다. 투여되는 양은 치료할 대상, 활성 성분을 활용하는 대상체의 시스템의 능력, 및 원하는 치료 효과의 정도에 따라 다르다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 종사자의 판단에 따라 다르며 개인마다 다르다. 그러나, 전신 적용을 위한 적절한 투여량 범위가 본 명세서에 개시되어 있고 투여 경로에 의존한다. 초기 투여 및 부스터 샷(booster shot)에 적합한 레지멘이 또한 고려되며, 초기 투여 후, 후속 주사 또는 기타 투여에 의한 1시간 이상의 간격으로 반복 용량으로 대표된다. 예시적인 다중 투여가 본 명세서에 기재되어 있고 키뉴레니나제의 혈청 및 조직 수준을 지속적으로 높게 유지하고 반대로 키뉴레닌의 혈청 및 조직 수준을 낮게 유지하는 것이 특히 바람직하다. 대안적으로, 생체내 요법에 대해 명시된 범위에서 혈액 내 농도를 유지하기에 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.
단백질 및 펩티드
일부 구현예에서, 본 개시내용은 키뉴레니나제와 같은 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 신규 조성물에 관한 것이다. 이들 펩티드는 융합 단백질에 포함될 수 있거나 상기 기재된 바와 같이 제제에 접합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단백질 또는 펩티드는 일반적으로 유전자로부터 번역된 전장 서열까지 약 200개 초과의 아미노산의 단백질; 약 100개 초과의 아미노산의 폴리펩티드; 및/또는 약 3 내지 약 100개 아미노산의 펩티드를 지칭하지만, 이에 제한되지 않는다. 편의상, "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 임의의 자연 발생 아미노산, 임의의 아미노산 유도체, 또는 당업계에 공지된 임의의 아미노산 모방체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기는 아미노산 잔기의 서열을 방해하는 임의의 비-아미노산 없이 순차적이다. 일부 구현예에서, 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기의 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티에 의해 중단될 수 있다.
따라서, "단백질 또는 펩티드"라는 용어는 자연 발생 단백질에서 발견되는 20개 이상의 공통 아미노산 중 적어도 하나, 또는 하나 이상의 변형되거나 흔치않은 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포괄한다.
단백질 또는 펩티드는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원으로부터 단백질 또는 펩티드의 단리, 또는 단백질 또는 펩티드의 화학적 합성을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 다양한 유전자에 상응하는 뉴클레오타이드 및 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드 서열은 이전에 개시되었으며, 당업자에게 공지된 컴퓨터화된 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 그러한 데이터베이스 중 하나는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)의 Genbank 및 GenPept 데이터베이스이다(월드 와이드 웹 ncbi.nlm.nih.gov/에서 사용 가능). 공지된 유전자에 대한 코딩 영역은 본 명세서에 개시된 기술을 사용하여 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 증폭 및/또는 발현될 수 있다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드의 다양한 상업적 제제가 당업자에게 공지되어 있다.
약제학적 조성물
신규 키뉴레니나제는 전신으로 또는 국소적으로 투여되어 종양 세포 성장을 억제하고, 가장 바람직하게는 국소 진행성 또는 전이성 암을 갖는 암 환자에서 암세포를 사멸시킬 수 있는 것으로 고려된다. 이들은 정맥내, 척수강내 및/또는 복강내 투여될 수 있다. 단독으로 또는 항증식성 약물과 함께 투여할 수 있다. 한 구현예에서, 이들은 수술 또는 다른 절차 전에 환자의 암 부하를 감소시키기 위해 투여된다. 대안적으로, 임의의 남아 있는 암(예를 들어, 수술로 제거하지 못한 암)이 생존하지 않도록 수술 후에 투여할 수 있다.
본 개시내용이 치료 제제의 특정한 성질에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 이러한 조성물은 생리학적으로 허용되는 액체, 겔, 또는 고체 담체, 희석제 및 부형제와 함께 제형으로 제공될 수 있다. 이들 치료 제제는 다른 치료제와 유사한 방식으로 가축과 같은 수의학적 용도 및 인간에서의 임상 용도를 위해 포유동물에 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능에 필요한 복용량은 사용 유형 및 투여 방식뿐만 아니라 개별 대상체의 특정 요건에 따라 달라질 것이다.
이러한 조성물은 일반적으로 주사제로서 액체 용액 또는 현탁액으로 제조된다. 적합한 희석제 및 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등, 및 이들의 조합이다. 또한, 원하는 경우, 조성물은 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제와 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.
임상 적용이 고려되는 경우, 의도된 적용에 적합한 형태로 단백질, 항체 및 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체에 용해되거나 분산된 유효량의 하나 이상의 키뉴레니나제 또는 추가 제제를 포함할 수 있다. "약제학적 또는 약리학적으로 허용되는"이라는 문구는 적절한 경우 예를 들어 인간과 같은 동물에게 투여될 때 부정적인, 알레르기성 또는 기타 부적절한 반응을 일으키지 않는 분자적 독립체 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해 단리된 적어도 하나의 키뉴레니나제 또는 추가의 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물의 제조는 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990]에 의해 예시된 바와 같이 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 또한, 동물(예를 들어, 사람) 투여의 경우, 제제는 FDA Office of Biological Standards에서 요구하는 무균, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족해야 하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 당업자에게 알려진 바와 같이 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅물, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해 제제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 예컨대 물질 및 이들의 조합을 포함한다 (예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990] 참조). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 약제학적 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.
본 개시내용의 일부 구현예는 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되어야 하는지 여부, 및 주사와 같은 투여 경로에 대해 멸균되어야 하는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 조성물은 당업자에 알려진 바와 같이 정맥내로, 진피내로, 경피로, 척추강내로, 동맥내로, 복강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 점막으로, 경구로, 국소적으로, 국부적으로, 흡입에 의해 (예를 들어, 에어로졸 흡입), 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 표적 세포를 직접적으로 담는 국소화된 관류에 의해, 카테터를 통해, 세척을 통해, 지질 조성물 (예를 들어, 리포솜)에서, 또는 다른 방법 또는 상기의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990] 참조).
변형된 폴리펩티드는 유리 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 산 부가 염, 예를 들어 단백질성 조성물의 유리 아미노 기로 형성된 것, 또는 무기 산, 예컨대, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 또는 만델산과 같은 유기 산으로 형성된 것을 포함한다. 유리 카복실 기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 제이철 하이드록사이드; 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다. 제형화 시, 용액은 복용 제형과 양립가능한 방식으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형은 주사용 용액과 같은 비경구 투여를 위해 제형화된 것 또는 폐로의 전달을 위한 에어로졸 또는 약물 방출 캡슐 등과 같은 영양 투여를 위해 제형화된 것과 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다.
추가로 본 개시내용의 일부 구현예에 따르면, 투여에 적합한 조성물은 불활성 희석제와 함께 또는 불활성 희석제 없이 약제학적으로 허용 가능한 담체로 제공될 수 있다. 담체는 동화될 수 있어야 하며 액체, 반고체, 즉 페이스트 또는 고체 담체를 포함한다. 임의의 통상적인 매질, 제제, 희석제 또는 담체가 수령체 또는 그 안에 함유된 조성물의 치료 효과에 유해한 경우를 제외하고, 방법을 실행하는 데 사용하기 위한 투여 가능한 조성물에서의 사용이 적절하다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 식염수, 지질, 리포솜, 수지, 결합제, 충전제 등, 또는 이들의 조합을 포함한다. 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가로, 미생물 작용의 예방은 파라벤 (예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 항균 및 항진균제와 같은 보존제 의해 야기될 수 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에 따르면, 조성물은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로, 즉 용액, 현탁액, 유화, 혼합물, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합된다. 이러한 절차는 당업자에게 일상적이다.
본 개시내용의 특정 구현예에서, 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 철저하게 조합되거나 혼합된다. 혼합은 분쇄와 같은 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 치료 활성의 손실, 즉 위의 변성으로부터 조성물을 보호하기 위해 혼합 공정에서 안정화제가 또한 첨가될 수 있다. 조성물에 사용하기 위한 안정화제의 예는 완충액, 아미노산, 예컨대 글리신 및 라이신, 탄수화물, 예컨대 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 푸룩토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 소르비톨, 만니톨 등을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 개시내용은 키뉴레니나제, 하나 이상의 지질, 및 수성 용매를 포함하는 약제학적 지질 비히클 조성물의 용도에 관한 것일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "지질"은 특징적으로 물에 불용성이고 유기 용매로 추출가능한 임의의 광범위한 물질을 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이러한 광범위한 부류의 화합물은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 용어 "지질"이 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예는 장쇄 지방족 탄화수소 및 그 유도체를 포함하는 화합물을 포함한다. 지질은 자연 발생 또는 합성(즉, 사람에 의해 설계 또는 생산)될 수 있다. 그러나 지질은 일반적으로 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 라이소리피드, 글리코스핑고지질, 당지질, 설파티드, 에테르- 및 에스테르-연결된 지방산을 갖는 지질, 중합성 지질, 및 이들의 조합을 포함한다. 물론, 지질로서 당업자에 의해 이해되는 본 명세서에 구체적으로 기재된 것 이외의 화합물도 조성물 및 방법에 포괄된다.
당업자는 지질 비히클에 조성물을 분산시키기 위해 사용될 수 있는 기술의 범위에 익숙할 것이다. 예를 들어, 키뉴레니나제 또는 그의 융합 단백질은 지질을 함유하는 용액 중에 분산되거나, 지질로 용해되거나 또는 지질로 유화되거나, 또는 지질과 혼합되거나, 및 지질과 조합되거나, 지방에 공유 결합되거나, 지질 중의 현탁액으로서 함유되거나, 교질입자 또는 리포솜으로 함유되거나 또는 복합체화되거나 또는 다르게는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 지질 또는 지질 구조와 회합될 수 있다. 분산으로 인해 리포솜이 형성되거나 형성되지 않을 수 있다.
동물 환자에게 투여되는 조성물의 실제 투여량은 신체적 및 생리학적 인자, 예컨대 체중, 병태의 중증도, 치료될 질환의 유형, 이전 또는 동시 치료 개입, 환자의 특발증, 및 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 복용량 및 투여 경로에 따라, 바람직한 복용량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여를 담당하는 종사자는 어떠한 경우에도 조성물의 활성 성분(들) 농도 및 개별 대상체에 대한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 예를 들어 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 활성 화합물은 예를 들어 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 및 그 안에서 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 당연히, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물(들)의 양은, 적절한 복용량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에서 수득되는 방식으로 제조될 수 있다. 인자, 예컨대 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 유통 기한, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항들은 이러한 약제학적 제형을 제조하는 분야의 당업자에 의해 고려될 것이며, 그 자체로 다양한 복용량 및 치료 레지멘이 바람직할 수 있다.
다른 비제한적인 예에서, 용량은 또한 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중, 약 1000 밀리그램/kg/체중 또는 그 초과, 및 그 안에서 도출가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본 명세서에 열거된 수치로부터 유도가능한 범위의 비제한적인 예에서, 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위는 전술한 수치를 기준으로 투여될 수 있다.
병용 치료
일부 구현예에서, 본 구현예의 조성물 및 방법은 제2 요법 또는 추가 요법과 조합된 키뉴레니나제의 투여를 수반한다. 이러한 요법은 키뉴레닌 의존과 관련된 모든 질환의 치료에 적용될 수 있다. 예를 들어, 질환은 암일 수 있다.
병용 요법을 포함하는 방법 및 조성물은 치료 또는 보호 효과를 향상시키고/시키거나 또 다른 항암 또는 항과증식 요법의 치료 효과를 증가시킨다. 치료 및 예방 방법 및 조성물은 암세포의 사멸 및/또는 세포 과증식의 억제와 같은 원하는 효과를 달성하는데 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 이 과정은 키뉴레니나아제와 제2 요법을 투여하는 것을 수반할 수 있다. 제2 요법은 직접적인 세포독성 효과가 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 예를 들어, 제2 요법은 직접적인 세포독성 효과 없이 면역계를 상향조절하는 제제일 수 있다. 조직, 종양 또는 세포는 제제 중 하나 이상(예를 들어, 키뉴레니나제 또는 항암제)를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)에 노출될 수 있거나, 또는 조직, 종양, 및/또는 세포를 2종 이상의 별개의 조성물 또는 제형으로 노출시키고, 여기서 하나의 조성물은 1) 키뉴레니나제, 2) 항암제, 또는 3) 키뉴레니나제 및 항암제 둘 다를 제공한다. 또한, 이러한 병용 요법은 화학요법, 방사선 요법, 외과 요법 또는 면역요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
키뉴레니나제는 항암 치료 전, 도중, 후에, 또는 항암 치료와 관련하여 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시에 내지 수분 내지 수일 내지 수주 범위의 간격일 수 있다. 키뉴레니나제가 항암제와 별도로 환자에게 제공되는 구현예에서, 일반적으로 2종의 화합물이 환자에게 유리하게 조합된 효과를 여전히 발휘할 수 있도록, 각각의 전달 시간 사이에 상당한 기간이 종료되지 않았음을 보장할 것이다. 이러한 경우에, 환자에게 키뉴레니나제 및 항암 요법을 서로 약 12 내지 24시간 또는 72시간 이내에, 보다 구체적으로 서로 약 6 내지 12시간 이내에 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 어떤 상황에서, 각각의 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6, 또는 7) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8)가 경과할 때 치료를 위한 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 과정은 1 내지 90일 이상 지속될 것이다(이러한 범위는 개재 일을 포함함). 1종의 제제는 1일차 내지 90일차의 어느 날 (이러한 범위는 개재 일을 포함함) 또는 그의 임의의 조합에 제공될 수 있고, 또 다른 제제는 1일차 내지 90일차의 어느 날 (이러한 범위는 개재 일을 포함함)에 제공되는 것이 고려된다. 하루(24-시간 주기) 내에, 환자에게 제제(들)를 한 번 또는 여러 번 투여할 수 있다. 더욱이, 치료 과정 후에, 항암 치료가 투여되지 않는 기간이 있는 것으로 고려된다. 이러한 기간은 환자의 병태, 예컨대 그의 예후, 강도, 건강 등에 따라 1 내지 7일, 및/또는 1 내지 5주, 및 / 또는 1 내지 12개월 이상 (이러한 범위는 개재 일을 포함함) 지속될 수 있다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 것으로 예상된다.
다양한 조합이 사용될 수 있다. 아래 예에서, 키뉴레니나제는 "A"이고 항암 요법은 "B"이다:
Figure pct00021
환자에 대한 본 구현예의 임의의 화합물 또는 요법의 투여는 존재하는 경우 제제의 독성을 고려하여 이러한 화합물의 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 구현예에서 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.
실시예
하기 실시예는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법이 어떻게 사용, 제조 및 평가될 수 있는지에 대한 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 본 개시내용의 순전히 예시를 의도하는 것으로 의도된 것이 아니고, 발명자들이 그들의 개시로 간주하는 것의 범위를 제한하기 위한 것이다.
실시예 1. PEG화 키뉴레니나제 동종이량체의 생성
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 PEG화 키뉴레니나제 동종이량체를 생성하는 예시적인 방법은 화학적 접합에 의한 것이다. 키뉴레니나제는 100 mM 인산이나트륨을 포함하는 pH 8.5의 수성 완충액에 용해될 수 있으며, 이에 5 kDa의 분자량을 갖는 메톡시-PEG-CH2COO-N-하이드록시석신이미드(NHS)와 같은 고체 PEG화제가 예를 들어, 20:1, 30:1. 40:1, 50:1 또는 60:1의 PEG 분자 대 키뉴레니나제 동종이량체의 투입비로 첨가될 수 있다. 이 반응 혼합물은 약 22℃에서 약 30분 동안 방치될 수 있다.
PEG화 키뉴레니나제 동종이량체를 생성하기 위한 추가의 예시적인 방법은 pH 9인, 0.6M 붕산나트륨을 사용하여 pH 8.6으로 조정된 50 mM 아세트산나트륨, 230 mM NaCl, 0.1 mM 피리독살 포스페이트를 포함하는 수성 완충액에 키뉴레니나제 동종이량체를 수반할 수 있다. 5 kDa의 분자량을 갖는 메톡시-PEG-CH2COO-NHS와 같은 PEG화제는 HCl 밀리리터당 약 0.2 g PEG의 최종 농도가 달성되도록 3 mM HCl에 용해될 수 있다. 이 PEG 용액은 30:1의 PEG 대 키뉴레니나제 동종이량체의 최종 비율이 반응 혼합물에서 달성되도록 제어된 방식으로 키뉴레니나제 용액에 첨가될 수 있다. 반응은 약 22℃에서 30분 동안 일어날 수 있다.
그 다음, PEG화 동종이량체는 25℃에서 25 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl 완충액에서 25분 동안 유속 0.6ml/분의 TSKgel G3000 SWxl 컬럼을 사용하여 다중각 광산란이 있는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 분석될 수 있고, 결과적으로 각각의 PEG:키뉴레니나제 투입비에 대한 크로마토그램이 생성된다(도 1d 내지 1f).
키뉴레니나제 단량체 및 동종이량체당 PEG 분자의 생성된 수는 PEG:키뉴레니나제 동종이량체(도 1c)의 각 투입비에 대한 PEG화 반응의 효율과 함께 PEG:키뉴레니나제 동종이량체(도 1a 및 1b)의 다양한 투입비에 대한 PEG화 키뉴레니나제의 측정된 분자량으로부터 계산되었다.
실시예 2. 악성 종양을 앓고 있는 환자에 대한 PEG화 키뉴레니나제 동종이량체의 투여
본 명세서에 개시된 방법에 따르면, 당업계의 의사는 IDO1, IDO2 또는 TDO 발현 종양의 증상을 감소 또는 완화시키기 위해 환자, 예컨대 인간 환자를 치료할 수 있다. 이를 위해, 당업계의 의사는 PEG화 키뉴레니나제 동종이량체를 인간 환자에게 투여할 수 있다. 동종이량체는, 예를 들어 전신으로 (예를 들어, 정맥내로), 표적 세포를 직접적으로 담은 국부화된 관류에 의해, 카테터를 통해, 세척을 통해, 지질 조성물 (예를 들면, 리포솜)로, 또는 종양을 치료하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 다른 방법 또는 상기의 임의의 조합에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 동종이량체는 또한 다중 투여 경로, 예를 들어 정맥내 및 뇌실내로 환자에게 투여될 수 있다. 예시적인 키뉴레닌 고갈량은 키뉴레니나제의 0.001 내지 1,000 단위(U)의 범위일 수 있다.
PEG화 키뉴레니나제 동종이량체와 조합하여, 하나 이상의 항암 요법(예를 들어, 방사선 요법, 외과적 요법, 면역요법)을 환자에게 투여하여 환자의 종양 세포를 절제할 수 있다. 방사선조사와 같은 당업계에 잘 알려진 세포 절제 방법은 단독으로 또는 환자의 종양 세포를 절제하기 위해 하나 이상의 항암 또는 항-과증식 요법과 조합하여 사용할 수 있다. 이들 제제 및/또는 치료제는 당업계에 공지된 PET 영상화 기술에 의해 평가 시, 종양 세포를 적어도 5% (예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, 또는 그 초과)까지 절제할 수 있다. 동종이량체는 제2 이상의 항암 요법을 이용한 치료 전 또는 후에, 예를 들어, 12 시간 내지 1 개월 (예를 들어, 12 시간, 24 시간, 72 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4, 주) 또는 그 초과 동안 환자에게 투여될 수 있다.
동종이량체는 IDO1, IDO2 또는 TD02를 발현하는 종양을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 종양 크기의 변화를 평가하기 위해 치료 전후에 의사가 표준 검사를 수행할 수도 있다. 환자는 치료에 사용되는 투여 경로에 따라, 예를 들어, 동종이량체 투여 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 초과 후에 평가될 수 있다. PEG화 키뉴레니나제 동종이량체를 투여한 후 종양 부위에서 종양 크기가 감소하거나 국소 키뉴레니나제 농도가 감소한 발견은 치료가 IDO1, IDO2 또는 TD02를 발현하는 종양을 성공적으로 치료했다는 표시를 제공한다.
실시예 3. 생체 내 전달을 위한 키뉴레니나제 동종이량체 PEG화 밀도의 최적화
본 실시예에서는, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 정제된 키뉴레니나제를 pH 8.5에서 실온에서 30분 동안 α-[3-(3-말레이미도-1-옥소프로필)아미노]프로필-ω-메톡시 PEG 시약(CAS# 883993-35-9)을 사용하여 5,000-달톤 PEG와 접합하였다. 5.5-8 mg/ml의 키뉴레니나제 농도 및 다양한 몰 당량의 5 kDa PEG 시약(100:1, 80:1, 40:1, 20:1, 및 10:1의 PEG화제 대 키뉴레니나제 동종이량체)을 직접 첨가하여 접합 반응을 수행하였다. 접합 후, 최종 생성물을 30 kDa 분자량 컷오프 스핀 필터를 사용하여 1x 인산염 완충 식염수(pH 7.4)로 정용여과하여 임의의 잔류 유리 PEG를 제거하였다. Superdex 200 10/300 컬럼을 사용하여 등용매 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 방법으로 샘플을 분석하였다(도 2a).
PEG화 키뉴레니나제 동종이량체를 시험하기 위해, 각각의 암컷 BALB/c 마우스(6-8주)에 종양 발달을 위해 0.1 ml의 PBS 중 CT-26 종양 세포(lxl05)를 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 동물을 무작위화하고 비히클(PBS pH 7.4)로 정맥내 투여하거나, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 10 mg/kg의 차별적으로 PEG화된 키뉴레니나제는, 평균 종양 부피가 약 200 mm3에 도달할 때 시작되었다. 투약 후 6, 24, 48, 72 및 120시간에, 마우스를 말기 채혈하고(n=4 마우스/시점), 혈장 샘플을 산 함유 내부 표준(IS) 용액으로 즉시 켄칭하고 키뉴레닌의 LC/MS 분석을 위해 처리하였다 (도 2b). 모든 그룹에서 종양 샘플을 수집하고 RIPA 완충액으로 용해하고 20 μg의 종양 용해물을 항-PEG 항체 (Abcam #abS 1257; 1:2000 희석) 및 항-β-액틴 항체 (세포 신호전달 기술 #CST-4967)를 사용하는 웨스턴 블롯 분석을 위해 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 화학발광 신호를 검출하고 개별 밴드의 강도를 Alphaview SA 밀도측정 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다(도 2c).
다른 구현예
기재된 개시내용의 다양한 수정 및 변형은 본 개시내용의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 본 개시내용이 특정 구현예와 관련하여 기재되었지만, 청구된 개시내용이 그러한 특정 구현예에 과도하게 제한되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 당업자에게 명백한 본 개시내용을 수행하기 위한 기술된 방식의 다양한 수정은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
다른 구현예는 청구범위에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Ikena Oncology, Inc. <120> PEGYLATED KYNURENINASE ENZYMES AND USES THEREOF FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> 51175-014WO2 <150> US 62/916,493 <151> 2019-10-17 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 465 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Pro Ser Ser Leu Glu Leu Pro Ala Asp Thr Val Gln Arg Ile 1 5 10 15 Ala Ala Glu Leu Lys Cys His Pro Thr Asp Glu Arg Val Ala Leu His 20 25 30 Leu Asp Glu Glu Asp Lys Leu Arg His Phe Arg Glu Cys Phe Tyr Ile 35 40 45 Pro Lys Ile Gln Asp Leu Pro Pro Val Asp Leu Ser Leu Val Asn Lys 50 55 60 Asp Glu Asn Ala Ile Tyr Phe Leu Gly Asn Ser Leu Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Lys Met Val Lys Thr Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Lys 85 90 95 Ile Ala Ala Tyr Gly His Glu Val Gly Lys Arg Pro Trp Ile Thr Gly 100 105 110 Asp Glu Ser Ile Val Gly Leu Met Lys Asp Ile Val Gly Ala Asn Glu 115 120 125 Lys Glu Ile Ala Leu Met Asn Ala Leu Thr Val Asn Leu His Leu Leu 130 135 140 Met Leu Ser Phe Phe Lys Pro Thr Pro Lys Arg Tyr Lys Ile Leu Leu 145 150 155 160 Glu Ala Lys Ala Phe Pro Ser Asp His Tyr Ala Ile Glu Ser Gln Leu 165 170 175 Gln Leu His Gly Leu Asn Ile Glu Glu Ser Met Arg Met Ile Lys Pro 180 185 190 Arg Glu Gly Glu Glu Thr Leu Arg Ile Glu Asp Ile Leu Glu Val Ile 195 200 205 Glu Lys Glu Gly Asp Ser Ile Ala Val Ile Leu Phe Ser Gly Val His 210 215 220 Phe Tyr Thr Gly Gln His Phe Asn Ile Pro Ala Ile Thr Lys Ala Gly 225 230 235 240 Gln Ala Lys Gly Cys Tyr Val Gly Phe Asp Leu Ala His Ala Val Gly 245 250 255 Asn Val Glu Leu Tyr Leu His Asp Trp Gly Val Asp Phe Ala Cys Trp 260 265 270 Cys Ser Tyr Lys Tyr Leu Asn Ala Gly Ala Gly Gly Ile Ala Gly Ala 275 280 285 Phe Ile His Glu Lys His Ala His Thr Ile Lys Pro Ala Leu Val Gly 290 295 300 Trp Phe Gly His Glu Leu Ser Thr Arg Phe Lys Met Asp Asn Lys Leu 305 310 315 320 Gln Leu Ile Pro Gly Val Cys Gly Phe Arg Ile Ser Asn Pro Pro Ile 325 330 335 Leu Leu Val Cys Ser Leu His Ala Ser Leu Glu Ile Phe Lys Gln Ala 340 345 350 Thr Met Lys Ala Leu Arg Lys Lys Ser Val Leu Leu Thr Gly Tyr Leu 355 360 365 Glu Tyr Leu Ile Lys His Asn Tyr Gly Lys Asp Lys Ala Ala Thr Lys 370 375 380 Lys Pro Val Val Asn Ile Ile Thr Pro Ser His Val Glu Glu Arg Gly 385 390 395 400 Cys Gln Leu Thr Ile Thr Phe Ser Val Pro Asn Lys Asp Val Phe Gln 405 410 415 Glu Leu Glu Lys Arg Gly Val Val Cys Asp Lys Arg Asn Pro Asn Gly 420 425 430 Ile Arg Val Ala Pro Val Pro Leu Tyr Asn Ser Phe His Asp Val Tyr 435 440 445 Lys Phe Thr Asn Leu Leu Thr Ser Ile Leu Asp Ser Ala Glu Thr Lys 450 455 460 Asn 465 <210> 2 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Glu Pro Ser Ser Leu Glu Leu Pro Ala Asp Thr Val Gln Arg Ile 1 5 10 15 Ala Ala Glu Leu Lys Cys His Pro Thr Asp Glu Arg Val Ala Leu His 20 25 30 Leu Asp Glu Glu Asp Lys Leu Arg His Phe Arg Glu Cys Phe Tyr Ile 35 40 45 Pro Lys Ile Gln Asp Leu Pro Pro Val Asp Leu Ser Leu Val Asn Lys 50 55 60 Asp Glu Asn Ala Ile Tyr Phe Asn Gly Asn Ser Leu Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Lys Met Val Lys Thr Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Asp 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Val Gly 290 295 300 Trp Trp Gly His Glu Leu Ser Thr Arg Phe Lys Met Asp Asn Lys Leu 305 310 315 320 Gln Leu Ile Pro Gly Val Cys Gly Phe Arg Ser Ser Thr Pro Pro Ile 325 330 335 Leu Leu Val Cys Ser Leu His Ala Ser Leu Glu Ile Phe Lys Gln Ala 340 345 350 Thr Met Lys Ala Leu Arg Lys Lys Ser Val Leu Leu Thr Gly Tyr Leu 355 360 365 Glu Tyr Leu Ile Lys His Asn Tyr Gly Lys Asp Lys Ala Ala Thr Lys 370 375 380 Lys Pro Val Val Asn Ile Ile Thr Pro Ser His Val Glu Glu Arg Gly 385 390 395 400 Cys Gln Leu Thr Ile Thr Phe Asn Val Pro Asn Lys Asp Val Phe Gln 405 410 415 Glu Leu Glu Lys Arg Gly Val Val Cys Asp Lys Arg Asn Pro Asn Gly 420 425 430 Ile Arg Val Thr Pro Val Pro Leu Tyr Asn Ser Phe His Asp Val Tyr 435 440 445 Lys Phe Thr Asn Leu Leu Thr Ser Ile Leu Asp Ser Ala Glu Thr Lys 450 455 460 Asn 465 <210> 3 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Met Glu Pro Ser Ser Leu Glu Leu Pro Ala Asp Thr Val Gln Arg Ile 1 5 10 15 Ala Ala Glu Leu Lys Cys His Pro Thr Asp Glu Arg Val Ala Leu His 20 25 30 Leu Asp Glu Glu Asp Lys Leu Arg His Phe Arg Glu Cys Phe Tyr Ile 35 40 45 Pro Lys Ile Gln Asp Leu Pro Pro Val Asp Leu Ser Leu Val Asn Lys 50 55 60 Asp Glu Asn Ala Ile Tyr Phe Asn Gly Asn Ser Leu Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Lys Met Val Lys Thr Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Lys 85 90 95 Ile Ala Arg Tyr Gly Trp Arg His Gly Lys Pro Pro Trp Ile Thr Tyr 100 105 110 Asp Glu Ser Ile Val Gly Leu Met Lys Asp Ile Val Gly Ala Asn Glu 115 120 125 Lys Glu Ile Ala Leu Met Asn Ala Leu Thr Val Asn Leu His Leu Leu 130 135 140 Met Leu Ser Phe Phe Lys Pro Thr Pro Lys Arg Tyr Lys Ile Leu Leu 145 150 155 160 Glu Ala Lys Ala Phe Pro Ser Asp His Tyr Ala Ile Glu Ser Gln Leu 165 170 175 Gln Leu His Gly Leu Asn Pro Glu Glu Ser Met Arg Met Ile Lys Pro 180 185 190 Arg Glu Gly Glu Glu Thr Leu Arg Ile Glu Asp Ile Leu Glu Val Ile 195 200 205 Glu Lys Glu Gly Asp Ser Ile Ala Val Ile Leu Phe Ser Gly Val His 210 215 220 Phe Tyr Thr Gly Gln His Phe Asn Ile Pro Ala Ile Thr Lys Ala Gly 225 230 235 240 Gln Ala Lys Gly Cys Tyr Val Gly Phe Asp Leu Ala His Ala Val Gly 245 250 255 Asn Val Glu Leu Tyr Leu His Asp Trp Gly Val Asp Phe Ala Cys Trp 260 265 270 Cys Ser Tyr Lys Tyr Leu Asn Ala Gly Pro Gly Gly Ile Ala Gly Ala 275 280 285 Phe Ile His Glu Lys His Ala His Thr Ile Lys Pro Ala Leu Val Gly 290 295 300 Trp Trp Gly His Glu Leu Ser Thr Arg Phe Lys Met Asp Asn Lys Leu 305 310 315 320 Gln Leu Ile Pro Gly Val Cys Gly Phe Arg Ser Ser Thr Pro Pro Ile 325 330 335 Leu Leu Val Cys Ser Leu His Ala Ser Leu Glu Ile Phe Lys Gln Ala 340 345 350 Thr Met Lys Ala Leu Arg Lys Lys Ser Val Leu Leu Thr Gly Tyr Leu 355 360 365 Glu Tyr Leu Ile Lys His Asn Tyr Gly Lys Asp Lys Ala Ala Thr Lys 370 375 380 Lys Pro Val Val Asn Ile Ile Thr Pro Ser His Val Glu Glu Arg Gly 385 390 395 400 Cys Gln Leu Thr Ile Thr Phe Asn Val Pro Asn Lys Asp Val Phe Gln 405 410 415 Glu Leu Glu Lys Arg Gly Val Val Cys Asp Lys Arg Asn Pro Asn Gly 420 425 430 Ile Arg Val Thr Pro Val Pro Leu Tyr Asn Ser Phe His Asp Val Tyr 435 440 445 Lys Phe Thr Asn Leu Leu Thr Ser Ile Leu Asp Ser Ala Glu Thr Lys 450 455 460 Asn 465

Claims (104)

  1. 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자에 공유 결합된 키뉴레니나제 동종이량체로서, 상기 PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 10:1 내지 약 40:1인, 동종이량체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 20:1 내지 약 30:1이고, 선택적으로 상기 PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 20:1, 21:2, 22:1, 23:1, 24:1, 또는 25:1인, 동종이량체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 25:1인, 동종이량체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 분자는 약 1 kDa 내지 약 10 kDa의 분자량을 갖는, 동종이량체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 PEG 분자는 약 3 kDa 내지 약 7 kDa의 분자량을 갖는, 동종이량체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PEG 분자는 약 5 kDa의 분자량을 갖는, 동종이량체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 분자는 선형인, 동종이량체.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 분자는 분지형인, 동종이량체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동종이량체는 하나 이상의 라이신 또는 시스테인 잔기에 의해 PEG 분자에 공유 결합되는, 동종이량체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 동종이량체는 하나 이상의 라이신 잔기에 의해 PEG 분자에 공유 결합되는, 동종이량체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동종이량체는 서열번호: 1과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 각각 갖는 2개의 폴리펩티드 단량체를 포함하고, 그리고 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, I51M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D, K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A, 및 A436T로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는, 동종이량체.
  12. 제11항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 동종이량체.
  13. 제12항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 동종이량체.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 A282, F306 또는 F249에서 치환을 포함하는, 동종이량체.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 A99에서 치환을 포함하는, 동종이량체.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 G112에서 치환을 포함하는, 동종이량체.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 E103에서 치환을 포함하는, 동종이량체.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 V104에서 치환을 포함하는, 동종이량체.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 S408에서 치환을 포함하는, 동종이량체.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 F306W 치환을 포함하는, 동종이량체.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 L72N 치환을 포함하는, 동종이량체.
  22. 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 H102W 및 N333T 치환을 포함하는, 동종이량체.
  23. 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 I183P 치환을 포함하는, 동종이량체.
  24. 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 R107P 치환을 포함하는, 동종이량체.
  25. 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 A436T 치환을 포함하는, 동종이량체.
  26. 제11항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는, 동종이량체.
  27. 제26항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 포함하는, 동종이량체.
  28. 제27항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 치환 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T를 포함하는, 동종이량체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동종이량체는 서열번호: 3과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 각각 갖는 2개의 폴리펩티드 단량체를 포함하는, 동종이량체.
  30. 제29항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 동종이량체.
  31. 제30항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 동종이량체.
  32. 제31항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는, 동종이량체.
  33. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동종이량체는 서열번호: 2와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 각각 갖는 2개의 폴리펩티드 단량체를 포함하는, 동종이량체.
  34. 제33항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 동종이량체.
  35. 제34항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 동종이량체.
  36. 제35항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는, 동종이량체.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동종이량체는 적어도 8000M-1s-1의 촉매 활성(kcat/KM)을 갖는, 동종이량체.
  38. 제37항에 있어서, 상기 동종이량체는 약 8000M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 10000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 20000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 또는 25000 M-1s-1 내지 35000 M-1s-1의 촉매 활성 (kcat/KM)을 갖는, 동종이량체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 25:1이고, 상기 PEG 분자는 약 5 kDa의 분자량을 갖고, 그리고 N-하이드록시석신이미드 에스테르 카보네이트 연결 기에 의해 동종이량체에 결합되는, 동종이량체.
  40. PEG화 키뉴레니나제 동종이량체를 생성하는 방법으로서, 상기 동종이량체는 2개의 폴리펩티드 단량체를 포함하고, 방법은 상기 동종이량체를 PEG화제와 접촉시키는 것을 포함하되, 여기서 PEG화제 대 동종이량체의 몰 투입비는 약 10:1 내지 약 50:1인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 PEG화제 대 동종이량체의 몰 투입비는 약 20:1 내지 약 40:1이고, 선택적으로, 상기 PEG화제 대 동종이량체의 몰 투입비는 약 20:1 내지 약 30:1이고, 선택적으로, 상기 PEG화제 대 동종이량체의 몰 투입비는 약 20:1인, 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 PEG화제 대 동종이량체의 몰 투입비는 약 25:1 내지 약 35:1인, 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 PEG화제 대 동종이량체의 몰 투입비는 약 30:1인, 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 분자는 약 1 kDa 내지 약 10 kDa의 분자량을 갖는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 PEG 분자는 약 3 kDa 내지 약 7 kDa의 분자량을 갖는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 PEG 분자는 약 5 kDa의 분자량을 갖는, 방법.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 분자는 선형인, 방법.
  48. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 분자는 분지형인, 방법.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동종이량체는 하나 이상의 라이신 또는 시스테인 잔기에 의해 PEG 분자에 공유 결합되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 동종이량체는 하나 이상의 라이신 잔기에 의해 PEG 분자에 공유 결합되는, 방법.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖고, 그리고 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, I51M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D, K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A, 및 A436T로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  54. 제40항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 A282, F306 또는 F249에서 치환을 포함하는, 방법.
  55. 제40항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 A99에서 치환을 포함하는, 방법.
  56. 제40항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 G112에서 치환을 포함하는, 방법.
  57. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 E103에서 치환을 포함하는, 방법.
  58. 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 V104에서 치환을 포함하는, 방법.
  59. 제40항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 S408에서 치환을 포함하는, 방법.
  60. 제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 F306W 치환을 포함하는, 방법.
  61. 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 L72N 치환을 포함하는, 방법.
  62. 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 H102W 및 N333T 치환을 포함하는, 방법.
  63. 제51항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 I183P 치환을 포함하는, 방법.
  64. 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 R107P 치환을 포함하는, 방법.
  65. 제51항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 A436T 치환을 포함하는, 방법.
  66. 제40항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 1에 대해 치환 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T를 포함하는, 방법.
  69. 제40항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  73. 제40항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  77. 제40항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동종이량체는 적어도 8000 M-1s-1의 촉매 활성 (kcat/KM)을 갖는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 동종이량체는 약 8000M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 10000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 20000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1; 또는 25000 M-1s-1 내지 35000 M-1s-1의 촉매 활성 (kcat/KM)을 갖는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 PEG 분자 대 동종이량체의 비는 약 25:1이고, 상기 PEG 분자는 약 5 kDa의 분자량을 갖고, 그리고 N-하이드록시석신이미드 에스테르 카보네이트 연결 기에 의해 동종이량체에 결합되는, 방법.
  80. 제40항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동종이량체는 수성 완충액에서 PEG화제와 접촉되는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 수성 완충제는 인산이나트륨을 포함하는, 방법.
  82. 제80항에 있어서, 상기 수성 완충제는 아세트산나트륨을 포함하는, 방법.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 완충액은 약 7.5 내지 약 9.5의 pH 범위인, 방법.
  84. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 완충액은 약 250 mM 내지 약 350 mM의 이온 강도의 범위인, 방법.
  85. 제40항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피가 사용되어 동종이량체를 단리하는, 방법.
  86. 제40항 내지 제85항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 키뉴레니나제 동종이량체.
  87. 제1항 내지 제39항 및 제86항 중 어느 한 항의 키뉴레니나제 동종이량체를 약제학적으로 허용가능한 담체에 포함하는 약제학적 제형.
  88. 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제87항의 제형 또는 제1항 내지 제39항 및 제86항 중 어느 한 항의 효소의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 대상체는 IDO1, IDO2, 또는 TDO 발현 종양을 갖는 것으로 확인된, 방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 종양은 고형 종양인, 방법.
  91. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 종양은 혈액 종양인, 방법.
  92. 제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 환자인, 방법.
  93. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형은 종양내로, 정맥내로, 진피내로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내, 늑막내로, 기관내로, 안구내로, 비강내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 결막하, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 경구로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 표적 세포를 직접적으로 담는 국소화된 관류에 의해, 카테터를 통해, 또는 세척을 통해 투여되는, 방법.
  94. 제88항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 제2 항암 요법은 방사선 요법, 외과적 요법, 면역요법 또는 제2 항암 화합물인, 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 제2 항암 화합물은 면역 관문 억제제인, 방법.
  97. 제95항에 있어서, 상기 제2 항암 화합물은 항-PDI, 항-CTLA-4, 또는 항-PD-LI 항체를 포함하는, 방법.
  98. 제95항에 있어서, 상기 제2 항암 화합물은 항체인, 방법.
  99. 제95항에 있어서, 상기 제2 항암 화합물은 항체-약물 접합체인, 방법.
  100. 제95항에 있어서, 상기 면역요법은 면역 효과기 세포 또는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 암세포 항원을 포함하는, 방법.
  102. 제100항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 NK-세포 또는 T-세포를 포함하는, 방법.
  103. 제100항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 CAR T-세포를 포함하는, 방법.
  104. 종양을 가진 인간 대상체에서 T-세포 반응을 제공하는 방법으로서, 제88항 내지 제103항 중 어느 한 항의 방법에 따라 키뉴레니나제 동종이량체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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