CN114828863A - 聚乙二醇化犬尿氨酸酶以及其用于治疗癌症的用途 - Google Patents

聚乙二醇化犬尿氨酸酶以及其用于治疗癌症的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114828863A
CN114828863A CN202080081803.8A CN202080081803A CN114828863A CN 114828863 A CN114828863 A CN 114828863A CN 202080081803 A CN202080081803 A CN 202080081803A CN 114828863 A CN114828863 A CN 114828863A
Authority
CN
China
Prior art keywords
homodimer
seq
polypeptide monomer
kynureninase
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080081803.8A
Other languages
English (en)
Inventor
J·诺兰
M·张
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ekina Oncology
Original Assignee
Ekina Oncology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ekina Oncology filed Critical Ekina Oncology
Publication of CN114828863A publication Critical patent/CN114828863A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y307/00—Hydrolases acting on carbon-carbon bonds (3.7)
    • C12Y307/01—Hydrolases acting on carbon-carbon bonds (3.7) in ketonic substances (3.7.1)
    • C12Y307/01003—Kynureninase (3.7.1.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

描述了共价结合至聚乙二醇的犬尿氨酸酶。本公开的方面提供了用于通过使用此类分子耗竭犬尿氨酸来改善癌症的有效治疗的组合物和方法。

Description

聚乙二醇化犬尿氨酸酶以及其用于治疗癌症的用途
技术领域
本公开涉及合成聚乙二醇化犬尿氨酸酶的组合物和方法以及其用于治疗癌症的用途。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式以电子方式提交并且以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII拷贝创建于2020年10月16日，名称为51175-014WO2_Sequence_Listing_10_16_20_ST25并且大小为12,461字节。
背景技术
犬尿氨酸为经由吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)或色氨酸2,3双加氧酶(TDO)的作用产生的氨基酸色氨酸的代谢产物。许多肿瘤细胞调控IDO和/或TDO的表达以升高犬尿氨酸的局部浓度，这进而抑制将以其他方式攻击肿瘤的肿瘤浸润T细胞的功能。可通过犬尿氨酸酶耗竭犬尿氨酸浓度，犬尿氨酸酶使得犬尿氨酸降解为邻氨基苯甲酸。仍需要开发治疗性化合物，所述治疗性化合物对犬尿氨酸降解具有高催化活性并且针对在血清中失活具有增强的稳定性，从而实现延长的犬尿氨酸耗竭，使得T细胞可有效识别并且攻击肿瘤细胞。
发明内容
本公开提供了共价连接至聚乙二醇(PEG)分子的犬尿氨酸酶。可使用共价连接至犬尿氨酸酶的PEG分子来实现例如更大的血清稳定性以及增加的犬尿氨酸降解催化效率。可将具有增加的催化效率的种类繁多的突变体犬尿氨酸酶以及各式各样的具有各种连接基团的PEG分子与本文所描述的组合物和方法结合使用。可向患者施用本文所描述的分子以治疗癌症，所述癌症表达吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)和/或色氨酸2,3双加氧酶(TDO)，其中局部犬尿氨酸浓度升高，因此防止被T细胞靶向和攻击。
在第一方面中，本公开提供了一种共价结合至一个或多个聚乙二醇(PEG)分子的犬尿氨酸酶均二聚体，其中PEG分子与均二聚体的比率为约10:1至约40:1，诸如约10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1或40:1。
在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约11:1至约39:1，诸如约11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1或39:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约12:1至约38:1，诸如约12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1或38:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约13:1至37:1，诸如约13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1或37:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约14:1至36:1，诸如约14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1或36:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约15:1至35:1，诸如约15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1或35:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约16:1至34:1，诸如约16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1或34:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约17:1至33:1，诸如约17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1或33:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约18:1至32:1，诸如约18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1或32:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约19:1至31:1，诸如约19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1或31:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约20:1至30:1，诸如约20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约21:1至29:1，诸如约21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1或29:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约22:1至28:1，诸如约22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1或28:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约23:1至27:1，诸如约23:1、24:1、25:1、26:1或27:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约24:1至26:1，诸如约24:1、25:1或26:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约25:1。
在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约10:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约11:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约12:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约13:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约14:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约15:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约16:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约17:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约18:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约19:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约20:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约21:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约22:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约23:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约24:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约25:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约26:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约27:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约28:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约29:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约30:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约31:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约32:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约33:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约34:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约35:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约36:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约37:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约38:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约39:1。在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约40:1。
在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约13:1至约33:1，诸如约13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1或33:1。
在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约18:1至约33:1，诸如约18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1或33:1。
在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约18:1至约28:1，诸如约18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1或28:1。
在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约18:1至约23:1，诸如约18:1、19:1、20:1、21:1、22:1或23:1。
在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约23:1至约33:1，诸如约23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1或33:1。
在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约23:1至约28:1，诸如约23:1、24:1、25:1、26:1、27:1或28:1。
在一些实施方案中，PEG分子具有约1kDa至约10kDa的分子量，诸如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10kDa的分子量。在一些实施方案中，PEG分子具有约2kDa至约9kDa的分子量，诸如约2、3、4、5、6、7、8或9kDa。在一些实施方案中，PEG分子具有约3kDa至约8kDa的分子量，诸如约3、4、5、6、7或8kDa。在一些实施方案中，PEG分子具有约4kDa至约7kDa的分子量，诸如约4、5、6或7kDa。在一些实施方案中，PEG分子具有约5kDa至约6kDa的分子量，诸如约5或6kDa。在一些实施方案中，PEG分子具有约5kDa的分子量。在一些实施方案中，PEG分子为直链的。在一些实施方案中，PEG分子为分支链的。
在一些实施方案中，均二聚体通过一个或多个赖氨酸或半胱氨酸残基，诸如借助于连接基团(诸如由赖氨酸胺与琥珀酰亚胺基、醛基、酰胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基或它们的组合的反应形成的连接基团)通过一个或多个赖氨酸残基共价结合至PEG分子。在一些实施方案中，连接基团为琥珀酰亚胺基，诸如琥珀酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基羧甲基、碳酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺或它们的组合，诸如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。在一些实施方案中，连接基团为单官能的。
在一些实施方案中，均二聚体包含两个多肽单体，所述两个多肽单体各自具有与SEQ ID NO:1具至少85％同一性(例如与SEQ ID NO:1具85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列。各多肽单体可相对于SEQ ID NO:1具有一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自由以下组成的组：L8P、K38E、Y47L、I48F、K50Q、I51M、S60N、K64N、D65G、E66K、N67D、N67P、D67S、A68F、A68T、A68V、F71L、F71M、L72N、K84E、E88N、E89K、E89S、E90Q、D92E、K93N、K93T、A95H、A95Q、K96N、I97H、I97L、I97V、A98G、A99G、A99I、A99R、A99S、A99T、A99V、Y100N、Y100S、Y100T、G101A、H102W、E103F、E103H、E103N、E103Q、E103R、E103V、E103W、V104D、V104E、V104F、V104H、V104K、V104L、V104R、G105A、G105H、G105S、G105T、E106D、K106D、K106E、K106H、K106N、R107P、R107S、P108R、I110A、I110F、I110L、I110M、I110T、T111D、T111H、T111N、T111R、G112A、G112C、G112D、G112K、G112L、G112M、G112Q、G112R、G112S、G112T、G112Y、N127K、I131V、A132V、L133V、A136T、L137T、T138S、N140D、H142Q、Q14R、Y156H、K163T、D168E、H169R、Q175L、I183F、I183L、I183P、I183S、E184A、E184D、E184R、E184T、E184V、E185T、M187L、M189I、K191A、K191G、K191H、K191M、K191N、K191R、K191S、K191T、K191W、E197A、E197D、E197F、E197K、E197M、E197Q、E197S、E197T、E197V、I201C、I201E、I201F、I201H、I201L、I201S、I201T、I201V、H203K、L219M、L219W、F220L、V223I、F225Y、H230F、H230L、H230Y、N232S、Y246F、F249W、D250E、S274A、S274C、S274G、S274N、S274T、L278M、A280G、A280S、A280T、G281S、A282M、A282P、G284N、I285L、V303L、V303S、F306W、F306Y、S311N、K315E、D317E、D317K、I331C、I331L、I331N、I331S、I331T、I331V、N333T、P334N、P335T、L337T、L338A、L338Q、S341I、K373E、K373N、N375A、N375H、Y376C、Y376F、Y376L、K378G、K378P、K378Q、K378R、K380G、K380S、A382G、A382R、A382T、T383S、K384G、K384N、P386K、P386S、V387L、N389E、I405L、F407Y、S408D、S408N、N411R、D413S、D413V、Q416T、E419A、E419L、K420E、R421N、V424I、K427M、N429E、G432A以及A436T。在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NO:1具至少90％同一性(例如与SEQ ID NO:1具90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)或与SEQ ID NO:1具至少95％同一性(例如与SEQ ID NO:1具95％、96％、97％、98％或99％同一性)。
在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在A282(例如A282M或A282P)、F306(例如F306W或F306Y)和/或F249(诸如F249W)处包含取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在A99处包含取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ IDNO:1在G112处包含取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在E103处包含取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在V104处包含取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在S408处包含取代。
在一些实施方案中，各多肽单体包含F306W取代。在一些实施方案中，各多肽单体包含L72N取代。在一些实施方案中，各多肽单体包含H102W和N333T取代。在一些实施方案中，各多肽单体包含I183P取代。在一些实施方案中，各多肽单体包含R107P取代。在一些实施方案中，各多肽单体包含A436T取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1包含至少一个选自以下的取代：L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T。在一些实施方案中，各多肽单体包含至少两个、三个、四个或五个选自以下的取代：L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T。在一些实施方案中，各多肽单体包含取代L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1包含取代L72N、A99R、H102W、E103R、V104H、R107P、G112Y、I183P、A282P、F306W、I331S、N333T、S408N以及A436T。
在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:3具至少85％同一性(例如与SEQ ID NO:3具85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQID NO:3具至少90％同一性(例如与SEQ ID NO:3具90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:3具至少95％同一性(例如与SEQ ID NO:3具95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有一个或多个保守氨基酸取代。举例来说，各多肽单体可相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有多达50个保守氨基酸取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，各多肽单体可相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有多达25个保守氨基酸取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，各多肽单体可相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有多达10个保守氨基酸取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，各多肽单体可具有仅通过保守氨基酸取代不同于SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:2具至少85％同一性(例如与SEQ ID NO:2具85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQID NO:2具至少90％同一性(例如与SEQ ID NO:2具90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:2具至少95％同一性(例如与SEQ ID NO:2具95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。各多肽单体可相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有一个或多个保守氨基酸取代。举例来说，各多肽单体可相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有多达50个保守氨基酸取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，各多肽单体可相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有多达25个保守氨基酸取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，各多肽单体可相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有多达10个保守氨基酸取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，各多肽单体可具有仅通过保守氨基酸不同于SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，均二聚体具有至少8000M-1s-1的催化活性(k催化/KM)。在一些实施方案中，均二聚体具有介于约8000M-1s-1与40000M-1s-1；10000M-1s-1与40000M-1s-1；20000M-1s-1与40000M-1s-1；或25000M-1s-1与35000M-1s-1之间的催化活性(k催化/KM)。
在一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约25:1，PEG分子具有约5kDa的分子量并且通过N-羟基琥珀酰亚胺酯碳酸酯连接基团结合至均二聚体。
在另一个方面中，本公开提供了一种延长犬尿氨酸酶多肽的循环半衰期的方法，所述方法包括使犬尿氨酸酶多肽与聚乙二醇化剂接触，其中犬尿氨酸酶多肽形成均二聚体，并且其中聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约10:1至约50:1，诸如约10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1或50:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约11:1至约49:1，诸如11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1或49:在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约12:1至约48:1，诸如12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1或48:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约13:1至约47:1，诸如13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1或47:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约14:1至约46:1，诸如14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1或46:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约15:1至约45:1，诸如15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1或45:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约16:1至约44:1，诸如16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1或44:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约17:1至约43:1，诸如17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1或43:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约18:1至约42:1，诸如18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1或42:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约19:1至约41:1，诸如19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1或41:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约20:1至约40:1，诸如20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1或40:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约21:1至约39:1，诸如21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1或39:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约22:1至约38:1，诸如22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1或38:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约23:1至约37:1，诸如23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1或37:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约24:1至约36:1，诸如24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1或36:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约25:1至约35:1，诸如25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1或35:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约26:1至约34:1，诸如26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1或34:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约27:1至约33:1，诸如27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1或33:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约28:1至约32:1，诸如28:1、29:1、30:1、31:1或32:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约29:1至约31:1，诸如29:1、30:1或31:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约30:1。
在另一个方面中，本公开包含一种制备聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体的方法，其中均二聚体包含两个多肽单体，所述方法包括使均二聚体与聚乙二醇化剂接触，并且其中聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约10:1至约50:1，诸如约10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1或50:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约11:1至约49:1，诸如约11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1或49:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约12:1至约48:1，诸如约12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1或48:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约13:1至约47:1，诸如约13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1或47:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约14:1至约46:1，诸如约14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1或46:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约15:1至约45:1，诸如约15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1或45:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约16:1至约44:1，诸如约16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1或44:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约17:1至约43:1，诸如约17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1或43:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约18:1至约42:1，诸如约18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1或42:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约19:1至约41:1，诸如约19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30；1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1或41:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约20:1至约40:1，诸如约20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1或40:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约21:1至约39:1，诸如约21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1或39:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约22:1至约38:1，诸如约22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1或38:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约23:1至约37:1，诸如约23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1或37:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约24:1至约36:1，诸如约24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1或36:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约25:1至约35:1，诸如约25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1或35:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约26:1至约34:1，诸如约26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1或34:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约27:1至约33:1，诸如约27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1或33:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约28:1至约32:1，诸如约28:1、29:1、30:1、31:1或32:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约29:1至约31:1，诸如约29:1、30:1或31:1。在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约30:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约20:1至约30:1，诸如约20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约10:1至约30:1，诸如约10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约11:1至约29:1，诸如约11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1或29:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约12:1至约28:1，诸如约12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1或28:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约13:1至约27:1，诸如约13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1或27:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约14:1至约26:1，诸如约14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1或26:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约15:1至约25:1，诸如约15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1或25:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约16:1至约24:1，诸如约16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1或24:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约17:1至约23:1，诸如约17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1或23:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约18:1至约22:1，诸如约18:1、19:1、20:1、21:1或22:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约19:1至约21:1，诸如约19:1、20:1或21:1。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率为约20:1。
在本公开的前述方面中的任一者的一些实施方案，PEG分子具有约1kDa至约10kDa的分子量，诸如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10kDa。在一些实施方案中，PEG分子具有约2kDa至约9kDa的分子量，诸如约2、3、4、5、6、7、8或9kDa。在一些实施方案中，PEG分子具有约3kDa至约8kDa的分子量，诸如约3、4、5、6、7或8kDa。在一些实施方案中，PEG分子具有约4kDa至约7kDa的分子量，诸如约4、5、6或7kDa。在一些实施方案中，PEG分子具有约5kDa至约6kDa的分子量，诸如约5或6kDa。在一些实施方案中，PEG分子具有约5kDa的分子量。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂为赖氨酸反应性聚乙二醇化剂，诸如其中PEG分子结合至含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分以及本文描述或本领域中已知的其他赖氨酸反应性部分的反应性基团的聚乙二醇化剂。
在一些实施方案中，聚乙二醇化剂为半胱氨酸反应性聚乙二醇化剂，诸如其中PEG分子结合至含有碘乙酰胺部分或马来酰亚胺部分以及本文描述或本领域中已知的其他半胱氨酸反应性部分的反应性基团的聚乙二醇化剂。
在一些实施方案中，均二聚体通过一个或多个赖氨酸或半胱氨酸残基，诸如借助于由赖氨酸胺与琥珀酰亚胺基、醛基、酰胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基以及它们的组合的反应形成的连接基团通过一个或多个赖氨酸残基共价结合至PEG分子。在一些实施方案中，连接基团为琥珀酰亚胺基，诸如琥珀酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基羧甲基、碳酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺或它们的组合，诸如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。在一些实施方案中，连接基团为单官能的。
在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:1具至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1具有一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自由以下组成的组：L8P、K38E、Y47L、I48F、K50Q、I51M、S60N、K64N、D65G、E66K、N67D、N67P、D67S、A68F、A68T、A68V、F71L、F71M、L72N、K84E、E88N、E89K、E89S、E90Q、D92E、K93N、K93T、A95H、A95Q、K96N、I97H、I97L、I97V、A98G、A99G、A99I、A99R、A99S、A99T、A99V、Y100N、Y100S、Y100T、G101A、H102W、E103F、E103H、E103N、E103Q、E103R、E103V、E103W、V104D、V104E、V104F、V104H、V104K、V104L、V104R、G105A、G105H、G105S、G105T、E106D、K106D、K106E、K106H、K106N、R107P、R107S、P108R、I110A、I110F、I110L、I110M、I110T、T111D、T111H、T111N、T111R、G112A、G112C、G112D、G112K、G112L、G112M、G112Q、G112R、G112S、G112T、G112Y、N127K、I131V、A132V、L133V、A136T、L137T、T138S、N140D、H142Q、Q14R、Y156H、K163T、D168E、H169R、Q175L、I183F、I183L、I183P、I183S、E184A、E184D、E184R、E184T、E184V、E185T、M187L、M189I、K191A、K191G、K191H、K191M、K191N、K191R、K191S、K191T、K191W、E197A、E197D、E197F、E197K、E197M、E197Q、E197S、E197T、E197V、I201C、I201E、I201F、1201H、I201L、I201S、I201T、I201V、H203K、L219M、L219W、F220L、V223I、F225Y、H230F、H230L、H230Y、N232S、Y246F、F249W、D250E、S274A、S274C、S274G、S274N、S274T、L278M、A280G、A280S、A280T、G281S、A282M、A282P、G284N、I285L、V303L、V303S、F306W、F306Y、S311N、K315E、D317E、D317K、I331C、I331L、I331N、I331S、I331T、I331V、N333T、P334N、P335T、L337T、L338A、L338Q、S341I、K373E、K373N、N375A、N375H、Y376C、Y376F、Y376L、K378G、K378P、K378Q、K378R、K380G、K380S、A382G、A382R、A382T、T383S、K384G、K384N、P386K、P386S、V387L、N389E、I405L、F407Y、S408D、S408N、N411R、D413S、D413V、Q416T、E419A、E419L、K420E、R421N、V424I、K427M、N429E、G432A以及A436T。在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:1具至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:1具至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在A282(例如A282M或A282P)、F306(例如F306W或F306Y)或F249(诸如F249W)处包含取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在A99处包含取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在G112处包含取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在E103处包含取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在V104处包含取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在S408处包含取代。在一些实施方案中，各多肽单体包含F306W取代。在一些实施方案中，各多肽单体包含L72N取代。在一些实施方案中，各多肽单体包含H102W和N333T取代。在一些实施方案中，各多肽单体包含I183P取代。在一些实施方案中，各多肽单体包含R107P取代。在一些实施方案中，各多肽单体包含A436T取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1包含至少一个选自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T的取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1包含至少两个、三个、四个或五个选自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T的取代。在一些实施方案中，各多肽单体相对于SEQ ID NO:1包含取代L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T。
在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:3具至少85％、86％、87％、88％、89％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:3具至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:3具至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:2具至少85％、86％、87％、88％、89％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:2具至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有与SEQ ID NO:2具至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，各多肽单体具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，均二聚体具有至少8000M-1s-1的催化活性(k催化/KM)。在一些实施方案中，均二聚体具有介于约8000M-1s-1与40000M-1s-1；10000M-1s-1与40000M-1s-1；20000M-1s-1与40000M-1s-1；或25000M-1s-1与35000M-1s-1之间的催化活性(k催化/KM)。
在本公开的前述方面中的任一者的一些实施方案中，PEG分子与均二聚体的比率为约25:1，PEG分子具有约5kDa的分子量并且通过N-羟基琥珀酰亚胺酯碳酸酯连接基团结合至均二聚体。
在一些实施方案中，均二聚体于水性缓冲液(诸如二磷酸四钠或乙酸钠)中与聚乙二醇化剂接触。在一些实施方案中，水性缓冲液的pH值在约7.5至约9.5范围内，诸如7.5、7.6、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4或9.5。在一些实施方案中，水性缓冲液的离子强度在约250mM至约350mM范围内。在一些实施方案中，使用尺寸排阻色谱法来分离均二聚体。
在本公开的以上方面或实施方案中的任一者的一些实施方案中，犬尿氨酸酶均二聚体可含有WO2015/031771、WO2016/033488或WO2017/151860中所公开的氨基酸取代中的一者或多者，所述专利各自以全文引用的方式并入本文中。
如上文和本文所论述的修饰的多肽可以与未修饰的多肽(例如天然多肽，诸如SEQID NO:1的人犬尿氨酸酶)或与本文所公开的任何多肽序列相比具有某一同一性百分比为特征。举例来说，未修饰的多肽可包含天然犬尿氨酸酶的至少或至多约150、200、250、300、350、400、450或465个残基(或其中可得到的任何范围)。在修饰与未修饰的多肽之间或比较中的任何两个序列之间，同一性百分比可为约、至多或至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(或其中可得到的任何范围)。还考虑上文所论述的同一性百分比可涉及与多肽的未修饰区域相比的特定多肽修饰区域。举例来说，多肽可含有犬尿氨酸酶的修饰或突变的底物识别位点，所述修饰或突变的底物识别位点可基于犬尿氨酸酶的修饰或突变的底物识别位点与来自相同物种或跨物种的未修饰或突变的犬尿氨酸酶的氨基酸序列的同一性进行特征描述。修饰或突变的人多肽表征为例如与未修饰的犬尿氨酸酶具有至少90％同一性意味着所述修饰或突变的人多肽中至少90％的氨基酸与未修饰多肽中的氨基酸相同。
此类未修饰的多肽可为天然犬尿氨酸酶，特别是人异型体或其他灵长类动物异型体。举例来说，天然人犬尿氨酸酶可具有SEQ ID NO:1的序列。其他天然灵长类动物犬尿氨酸酶的非限制性实例包括苏门答腊猩猩(Pongo abelii)犬尿氨酸酶(Genbank ID：XP009235962.1，GI：686708656)、食蟹猕猴(Macaca fascicularis)犬尿氨酸酶(Genbank ID：EHH54849.1，GI：355750522)以及普通黑猩猩(Pan troglodytes)犬尿氨酸酶(Genbank ID：XP_003309314.1，GI：332814521)。示例性天然多肽包括SEQ ID NO:1的具有约、至多或至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可得到的任何范围)的序列。举例来说，天然多肽可包含SEQ ID NO:1的序列的至少或至多约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或465个残基(或其中可得到的任何范围)。
在另一个方面中，本公开包含一种药物制剂，所述药物制剂包含含上文所描述的任一组合物的犬尿氨酸酶均二聚体的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物制剂包含含上文所描述的任一组合物的犬尿氨酸酶均二聚体的药学上可接受的载体。
在另一个方面中，本发明提供了一种治疗具有肿瘤的受试者(例如哺乳动物受试者，诸如人受试者)的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所描述的制剂或酶与本文所描述的任一组合物。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所描述的制剂或酶与本文所描述的任一组合物。在一些实施方案中，受试者已被鉴定为具有表达IDO1、IDO2或TDO的肿瘤，诸如实体肿瘤或血液学肿瘤。在一些实施方案中，受试者为人受试者。
在一些实施方案中，制剂按以下方式施用：瘤内、静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌肉内、皮下、结膜下、血管内、经粘膜、心包内、脐内、经口、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸泡靶细胞、经由导管或经由灌洗。
在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二抗癌疗法。第二抗癌疗法可为手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。在一些实施方案中，第二抗癌疗法可为免疫检查点抑制剂疗法。举例来说，可将犬尿氨酸酶均二聚体与免疫治疗剂混合、缀合、一起施用或单独施用，例如用于治疗癌症或感染性疾病，诸如本文所描述的癌症或感染性疾病。可结合本文所描述的组合物和方法使用的示例性免疫治疗剂包括但不限于抗CTLA-4剂、抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、抗TNF-α交联剂、抗TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂以及抗TWEAKR剂，以及例如针对Mahoney等,Cancer Immunotherapy,14:561-584(2015)的表1中所描述的免疫靶标的剂，所述参考文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中。举例来说，免疫治疗剂可为抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，诸如伊匹单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)。免疫治疗剂可为抗PD-1抗体或其抗原结合片段，诸如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)以及阿特珠单抗(atezolizumab)。免疫治疗剂可为抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，诸如阿特珠单抗或阿维单抗。作为其他实例，免疫靶标4-1BB配体可用抗4-1BB配体抗体靶向；免疫靶标OX40L可用抗OX40L抗体靶向；免疫靶标GITR可用抗GITR抗体靶向；免疫靶标CD27可用抗CD27抗体靶向；免疫靶标TL1A可用抗TL1A抗体靶向；免疫靶标CD40L或CD40可用抗CD40L抗体靶向；免疫靶标LIGHT可用抗LIGHT抗体靶向；免疫靶标BTLA可用抗BTLA抗体靶向；免疫靶标LAG3可用抗LAG3抗体靶向；免疫靶标TIM3可用抗TIM3抗体靶向；免疫靶标Singlecs可用抗Singlecs抗体靶向；免疫靶标ICOS配体可用抗ICOS配体抗体靶向；免疫靶标B7-H3可用抗B7-H3抗体靶向；免疫靶标B7-H4可用抗B7-H4抗体靶向；免疫靶标VISTA可用抗VISTA抗体靶向；免疫靶标TMIGD2可用抗TMIGD2抗体靶向；免疫靶标BTNL2可用抗BTNL2抗体靶向；免疫靶标CD48可用抗CD48抗体靶向；免疫靶标KIR可用抗KIR抗体靶向；免疫靶标LIR可用抗LIR抗体靶向；免疫靶标ILT可用抗ILT抗体靶向；免疫靶标NKG2D可用抗NKG2D抗体靶向；免疫靶标NKG2A可用抗NKG2A抗体靶向；免疫靶标MICA可用抗MICA抗体靶向；免疫靶标MICB可用抗MICB抗体靶向；免疫靶标CD244可用抗CD244抗体靶向；免疫靶标CSF1R可用抗CSF1R抗体靶向；免疫靶标IDO可用抗IDO抗体靶向；免疫靶标TGFβ可用抗TGFβ抗体；免疫靶标CD39可用抗CD39抗体靶向；免疫靶标CD73可用抗CD73抗体靶向；免疫靶标CXCR4可用抗CXCR4抗体靶向；免疫靶标CXCL12可用抗CXCL12抗体靶向；免疫靶标SIRPA可用抗SIRPA抗体靶向；免疫靶标CD47可用抗CD47抗体靶向；免疫靶标VEGF可用抗VEGF抗体靶向；并且免疫靶标神经菌毛素可用抗神经菌毛素抗体靶向(参见例如Mahoney等的表1)。
可与本文所描述的组合物和方法结合使用的免疫治疗剂包括例如抗TWEAK剂、抗细胞表面淋巴细胞蛋白剂、抗BRAF剂、抗MEK剂、抗CD33剂、抗CD20剂、抗HLA-DR剂、抗HLA I类剂、抗CD52剂、抗A33剂、抗GD3剂、抗PSMA剂、抗Ceacan 1剂、抗Galedin 9剂、抗HVEM剂、抗VISTA剂、抗B7 H4剂、抗HHLA2剂、抗CD155剂、抗CD80剂、抗BTLA剂、抗CD160剂、抗CD28剂、抗CD226剂、抗CEACAM1剂、抗TIM3剂、抗TIGIT剂、抗CD96剂、抗CD70剂、抗CD27剂、抗LIGHT剂、抗CD137剂、抗DR4剂、抗CR5剂、抗TNFRS剂、抗TNFR1剂、抗FAS剂、抗CD95剂、抗TRAIL剂、抗DR6剂、抗EDAR剂、抗NGFR剂、抗OPG剂、抗RANKL剂、抗LTβ受体剂、抗BCMA剂、抗TACI剂、抗BAFFR剂、抗EDAR2剂、抗TROY剂以及抗RELT剂。举例来说，免疫治疗剂可为抗TWEAK抗体或其抗原结合片段、抗细胞表面淋巴细胞蛋白抗体或其抗原结合片段、抗BRAF抗体或其抗原结合片段、抗MEK抗体或其抗原结合片段、抗CD33抗体或其抗原结合片段、抗CD20抗体或其抗原结合片段、抗HLA-DR抗体或其抗原结合片段、抗HLA I类抗体或其抗原结合片段、抗CD52抗体或其抗原结合片段、抗A33抗体或其抗原结合片段、抗GD3抗体或其抗原结合片段、抗PSMA抗体或其抗原结合片段、抗Ceacan 1抗体或其抗原结合片段、抗Galedin 9抗体或其抗原结合片段、抗HVEM抗体或其抗原结合片段、抗VISTA抗体或其抗原结合片段、抗B7 H4抗体或其抗原结合片段、抗HHLA2抗体或其抗原结合片段、抗CD155抗体或其抗原结合片段、抗CD80抗体或其抗原结合片段、抗BTLA抗体或其抗原结合片段、抗CD160抗体或其抗原结合片段、抗CD28抗体或其抗原结合片段、抗CD226抗体或其抗原结合片段、抗CEACAM1抗体或其抗原结合片段、抗TIM3抗体或其抗原结合片段、抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、抗CD96抗体或其抗原结合片段、抗CD70抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗LIGHT抗体或其抗原结合片段、抗CD137抗体或其抗原结合片段、抗DR4抗体或其抗原结合片段、抗CR5抗体或其抗原结合片段、抗TNFRS抗体或其抗原结合片段、抗TNFR1抗体或其抗原结合片段、抗FAS抗体或其抗原结合片段、抗CD95抗体或其抗原结合片段、抗TRAIL抗体或其抗原结合片段、抗DR6抗体或其抗原结合片段、抗EDAR抗体或其抗原结合片段、抗NGFR抗体或其抗原结合片段、抗OPG抗体或其抗原结合片段、抗RANKL抗体或其抗原结合片段、抗LTβ受体抗体或其抗原结合片段、抗BCMA抗体或其抗原结合片段、抗TACI抗体或其抗原结合片段、抗BAFFR抗体或其抗原结合片段、抗EDAR2抗体或其抗原结合片段、抗TROY抗体或其抗原结合片段或抗RELT抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，第二抗癌疗法为免疫疗法，诸如施用免疫效应细胞或免疫原性组合物。举例来说，免疫原性组合物可包含癌细胞抗原和任选的佐剂。在一些实施方案中，免疫效应细胞可包括NK细胞、T细胞(例如CAR T细胞)或NK/T细胞。在一些实施方案中，考虑包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞和实施方案的犬尿氨酸酶均二聚体以用于治疗患有癌症的受试者。在一些实施方案中，可用编码CAR和犬尿氨酸酶以及(在一些情况下)转座酶的DNA对细胞进行转染。
在一些实施方案中，本公开提供了一种在具有肿瘤的人受试者中提供T细胞反应的方法，所述方法包括根据上文所描述的治疗方法的任一实施方案向受试者施用犬尿氨酸酶均二聚体。
定义
如本文所用，术语“约”是指值高于或低于所描述的值10％以内。举例来说，短语“约5,000Da”是指值在4,500Da与5,500Da之间并且包括4,500Da和5,500Da。
如本文所用，术语“施用(administering/administration)”和类似术语是指通过任何有效途径直接给予患者一起表达本文所描述的一种或多种蛋白质的治疗剂(例如制剂)。本文描述了示例性施用途径并且包括全身性施用途径，诸如静脉内注射；以及直接施用至患者中枢神经系统的途径，诸如通过脑室内注射、鞘内注射以及立体定位注射等等。
如本文所用，术语“生物学功能等效”在本领域中为充分理解的并且在本文中进一步详细定义。因此，包括约70％与约80％之间或约81％与约90％之间或甚至约91％与约99％之间的氨基酸与对照多肽的氨基酸一致或功能等效的序列，前提条件为维持蛋白质的生物活性。在一些实施方案中，修饰的蛋白质可为与其天然对应物生物学功能等效的。
如本文在相关蛋白质的背景下所用，术语“催化活性”是指与野生型形式的蛋白质相关的生物功能。举例来说，在酶的背景下，术语“催化活性”是指蛋白质以产生对应化学反应的产物的方式实现底物转换的能力。可例如使用本领域中已知的底物转换分析来检测和定量酶的活性水平。作为另一实例，在膜结合受体的背景下，术语“活性”可指由受体例如在结合至其同源配体后起始的信号转导。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”可指例如人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，并且考虑将人工特异性引入特定免疫效应细胞上的工程化受体。可采用CAR在T细胞上赋予单克隆抗体的特异性，从而允许产生大量特异性T细胞，例如用于过继细胞疗法。在具体实施方案中，例如CAR使细胞的特异性定向至肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，CAR包含细胞内活化结构域、跨膜域以及包含肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。在特定实施方案中，CAR包含衍生自单克隆抗体(诸如美国专利7,109,304中所描述的那些单克隆抗体，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中)的单链可变片段(scFv)融合至CD3-ξ跨膜和胞内域的融合物。其他CAR设计的特异性可来源于受体的配体(例如肽)或来源于模式识别受体，诸如Dectin。在特定实施方案中，一种设计可通过使用对B-谱系分子CD19具特异性的CAR对T细胞的特异性进行重定向来靶向恶性B细胞。在某些情况下，可对抗原识别结构域的间隔进行修饰以减少活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，CAR包含用于额外共刺激信号传导的结构域，诸如CD3-ξ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在一些情况下，多种分子可与CAR共表达，包括共刺激分子、用于成像(例如用于正电子发射断层扫描)的报告基因、在添加前药后有条件地消除T细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子以及细胞因子受体。
如本文所用，术语“均二聚体”是指包含两个多肽链的蛋白质(例如犬尿氨酸酶)，所述两个多肽链就氨基酸残基的顺序、数目以及种类来说彼此相同。因此，术语“犬尿氨酸酶均二聚体”是指包含两个单体犬尿氨酸酶多肽链的犬尿氨酸酶，所述两个单体犬尿氨酸酶多肽链就氨基酸残基的顺序、数目以及种类来说彼此相同。
如本文所用，术语“保守突变”、“保守取代”、“保守氨基酸取代”等是指用一个或多个氨基酸取代展现类似物理化学特性(诸如极性、静电荷以及空间体积)的一个或多个不同氨基酸。下表1中概述了二十种天然存在的氨基酸中的每一者的这些特性。
表1.氨基酸和对应侧链的特性
Figure BDA0003660306280000241
Figure BDA0003660306280000251
如本文所用，术语“接触”和“暴露”在应用于细胞时在本文中用于描述使得治疗性构建体和化学治疗或放射治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并列放置的过程。为实现细胞杀伤作用，举例来说，将两种剂以有效杀死细胞或防止细胞分裂的组合量递送至细胞。
如本文所用，术语“有效量”、“治疗有效量”等当用于提及治疗性组合物(诸如本文所描述的载体构建体、病毒载体或细胞)时是指当向包括哺乳动物(例如人)的受试者施用时足以实现有益或所需结果(诸如临床结果)的量。举例来说，在治疗本文所描述的癌症的背景下，这些术语是指与不施用组合物、载体构建体、病毒载体或细胞所获得的反应相比足以实现治疗反应的组合物量。将对应于此类量的本文所描述的给定组合物的量可根据各种因素改变，诸如给定剂、药物制剂、施用途径、疾病或病症的类型、受试者身份(例如年龄、性别、重量)或正在治疗的宿主等。组合物(诸如本公开的载体构建体、病毒载体或细胞)的“有效量”、“治疗有效量”等还包括与对照相比在受试者中产生有益或所需结果的量。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指含有以非天然方式可操作地连接的蛋白质或蛋白质片段的嵌合蛋白。
如本文所用，术语“半衰期”(1/2寿命)是指例如在哺乳动物中注射后其多肽的浓度在体外或在体内下降一半将需要的时间。
如本文所用的术语“KM”是指酶的米-曼常数(Michaelis-Menten constant)并且定义为特定底物使得给定酶在酶催化的反应中产生一半其最大速度时的浓度。如本文所用的术语“k催化”是指每单位时间各酶位点转换成产物的转换数或底物分子数目，并且其中酶以最高效率工作。如本文所用的术语“k催化/KM”为特异性常数，所述常数为酶多高效地将底物转化为产物的度量。
如本文所用，术语“犬尿氨酸酶”是指负责将犬尿氨酸催化降解为邻氨基苯甲酸的酶。术语“犬尿氨酸酶”还指野生型犬尿氨酸酶的变体以及编码所述变体的核酸，诸如与野生型犬尿氨酸酶(例如SEQ ID NO:1)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％或更大同一性)的变体蛋白质或与野生型犬尿氨酸基因的核酸序列具有至少70％序列同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％或更大同一性)的多核苷酸，前提条件为所编码的犬尿氨酸酶类似物保留野生型犬尿氨酸酶的治疗功能。“犬尿氨酸酶”还可指其中存在天然信号肽的犬尿氨酸酶蛋白质。或者，“犬尿氨酸酶”可指其中天然信号肽已移除的犬尿氨酸酶蛋白质(例如成熟蛋白)。犬尿氨酸酶还可指犬尿氨酸酶的催化结构域，或与此类结构域具有至少70％序列同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％或更大同一性)的变体。另外，术语“犬尿氨酸酶”还包括其中多肽可操作地连接至另一剂(诸如另一多肽、半衰期改良剂(诸如聚乙二醇化剂)或治疗剂)的变体。如本领域技术人员将了解的，如本文所用“犬尿氨酸酶”可指所述酶或编码此蛋白质的基因，这根据背景来定那样。
犬尿氨酸酶可以个别“犬尿氨酸酶单体”的二聚体(诸如由各自具有相同氨基酸序列的两个犬尿氨酸酶单体组成的均二聚体)的形式存在。如本文所用的术语“犬尿氨酸酶单体”是指当与另一此类多肽非共价连接时形成二聚犬尿氨酸酶的个别多肽。本公开的犬尿氨酸酶单体可具有例如与本文的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具至少85％同一性(例如具85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体相对于SEQ ID NO:1具有一个或多个氨基酸取代，诸如选自由以下组成的组的氨基酸取代：L8P、K38E、Y47L、I48F、K50Q、I51M、S60N、K64N、D65G、E66K、N67D、N67P、D67S、A68F、A68T、A68V、F71L、F71M、L72N、K84E、E88N、E89K、E89S、E90Q、D92E、K93N、K93T、A95H、A95Q、K96N、I97H、I97L、I97V、A98G、A99G、A99I、A99R、A99S、A99T、A99V、Y100N、Y100S、Y100T、G101A、H102W、E103F、E103H、E103N、E103Q、E103R、E103V、E103W、V104D、V104E、V104F、V104H、V104K、V104L、V104R、G105A、G105H、G105S、G105T、E106D、K106D、K106E、K106H、K106N、R107P、R107S、P108R、I110A、I110F、I110L、I110M、I110T、T111D、T111H、T111N、T111R、G112A、G112C、G112D、G112K、G112L、G112M、G112Q、G112R、G112S、G112T、G112Y、N127K、I131V、A132V、L133V、A136T、L137T、T138S、N140D、H142Q、Q14R、Y156H、K163T、D168E、H169R、Q175L、I183F、I183L、I183P、I183S、E184A、E184D、E184R、E184T、E184V、E185T、M187L、M189I、K191A、K191G、K191H、K191M、K191N、K191R、K191S、K191T、K191W、E197A、E197D、E197F、E197K、E197M、E197Q、E197S、E197T、E197V、I201C、I201E、I201F、1201H、I201L、I201S、I201T、I201V、H203K、L219M、L219W、F220L、V223I、F225Y、H230F、H230L、H230Y、N232S、Y246F、F249W、D250E、S274A、S274C、S274G、S274N、S274T、L278M、A280G、A280S、A280T、G281S、A282M、A282P、G284N、I285L、V303L、V303S、F306W、F306Y、S311N、K315E、D317E、D317K、I331C、I331L、I331N、I331S、I331T、I331V、N333T、P334N、P335T、L337T、L338A、L338Q、S341I、K373E、K373N、N375A、N375H、Y376C、Y376F、Y376L、K378G、K378P、K378Q、K378R、K380G、K380S、A382G、A382R、A382T、T383S、K384G、K384N、P386K、P386S、V387L、N389E、I405L、F407Y、S408D、S408N、N411R、D413S、D413V、Q416T、E419A、E419L、K420E、R421N、V424I、K427M、N429E、G432A以及A436T。本公开的犬尿氨酸酶单体可相对于SEQ ID NO:1例如在A282(例如A282M或A282P)、F306(例如F306W或F306Y)或F249(诸如F249W)处具有取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体相对于SEQ ID NO:1在A99处包含取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体相对于SEQ ID NO:1在G112处包含取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体相对于SEQ ID NO:1在E103处包含取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体相对于SEQ ID NO:1在V104处包含取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体相对于SEQ ID NO:1在S408处包含取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体包含F306W取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体包含L72N取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体包含H102W和N333T取代。
在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体包含I183P取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体包含R107P取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体包含A436T取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体相对于SEQ ID NO:1包含至少一个选自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T的取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体相对于SEQ ID NO:1包含至少两个、三个、四个或五个选自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T的取代。在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶单体相对于SEQ ID NO:1包含取代L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T。
如本文所用，术语“连接基团”是指充当可操作地连接两个不同分子的分子桥的化合物或其部分，其中连接基团的一个部分可操作地连接至第一分子，并且其中连接基团的另一部分可操作地连接至第二分子。
如本文所用，术语“修饰的蛋白质”或“修饰的多肽”包括例如相较于未修饰的蛋白质或多肽具有额外优势(诸如犬尿氨酸降解活性或热力学稳定性)的蛋白质或多肽。
如本文所用，术语“单体”是指作为蛋白质的进一步四级结构的最简单碱基亚单位的单个多肽链。
如本文所用，术语“聚乙二醇化剂”指可偶联(例如共价连接)至活性剂(例如通过各种化学方法在PEG链末端通过羟基偶联至蛋白质)的聚乙二醇(PEG)分子。在一些实施方案中，PEG本身限于每个PEG分子至多两个活性剂。在不同方法中，可使用PEG与氨基酸的共聚物，所述共聚物保留PEG的生物相容性，但具有增加的每个分子许多个连接点的优点，因此提供更大的载药量。
如本文所用，相对于参考多核苷酸或多肽序列的“序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并且在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考多核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸具同一性的核酸或氨基酸的百分比。出于确定核酸或氨基酸序列同一性百分比的目的进行比对可以在本领域技术人员能力范围内的各种方式来实现，例如使用公共可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2或Megalign软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的整个长度上实现最大比对所需的任何算法。举例来说，可使用序列比较计算机程序BLAST产生序列同一性百分比值。作为说明，如下计算给定核酸或氨基酸序列A对、与或针对给定核酸或氨基酸序列B的序列同一性百分比(所述表述可替代地表示为对、与或针对给定核酸或氨基酸序列B具有某一序列同一性百分比的给定核酸或氨基酸序列A)：
100乘以(分数X/Y)
其中X为在所述程序对A与B的比对中由序列比对程序(例如BLAST)评为同一匹配的核苷酸或氨基酸的数目，并且其中Y为B中的核酸总数目。应了解，在核酸或氨基酸序列A的长度与核酸或氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A与B的序列同一性百分比将不等于B与A的序列同一性百分比。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指适合于与诸如哺乳动物(例如人)等受试者的组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应以及其他问题并发症并且符合合理效益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸的化合物并且可互换使用。
如本文所用，“受试者”和“患者”是指人或非人，诸如灵长类动物、哺乳动物以及脊椎动物。在特定实施方案中，受试者为人。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”是指用于获得有益或所需结果(例如临床结果)的方法。有益或所需结果可包括但不限于可检测或不可检测的一种或多种症状或疾患的缓解或改善；疾病或疾患程度的减轻；疾病、病症或疾患的状态稳定(即，不恶化)；疾病或疾患扩散的预防；疾病或疾患进展的延迟或减慢；疾病或疾患的改善或缓解；以及缓和(部分或总体)。“改善”或“缓解”疾病或疾患意味着与不存在治疗的情况下疾病、病症或疾患的程度和/或不希望的临床表现或进展的时间过程相比，所述程度减轻和/或时间过程减慢或延长。“治疗”还可意指与如果不接受治疗的预期存活相比延长存活。需要治疗的患者包括已患有所述疾患或病症的那些患者，以及倾向于发展所述疾患或病症或处于发展所述疾患或病症的风险中的那些患者，以及其中要预防所述疾患或病症的那些患者。
如本文所用，术语“单位剂量”当用于提及治疗性组合物时是指适合作为受试者的单位剂量的物理离散单元，各单元含有预定量的活性材料，所述活性材料经过计算与所需稀释剂(即载体或媒介物)结合产生所需治疗作用。
附图说明
以下图式形成本说明书的一部分并且被包括以进一步证实本发明的某些方面。参考这些图式中的一者或多者结合本文所呈现的对特定实施方案的详细描述可更好地理解本发明。
图1A至图1F：聚乙二醇化犬尿氨酸酶缀合物的产生。A)PEG:犬尿氨酸酶均二聚体输入比率在20:1-60:1范围内的所得每一犬尿氨酸酶单体缀合PEG分子数目。B)PEG:犬尿氨酸酶均二聚体输入比率在20:1-60:1范围内的所得每一犬尿氨酸酶均二聚体缀合PEG分子数目。C)PEG:犬尿氨酸酶均二聚体输入比率为20:1-60:1的情况下PEG分子与犬尿氨酸酶之间的缀合反应的效率。D)由20:1的PEG与犬尿氨酸酶均二聚体输入比率产生的聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体产物的SEC-MALS HPLC。E)由30:1的PEG与犬尿氨酸酶均二聚体输入比率产生的聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体产物的SEC-MALS HPLC。F)由60:1的PEG与犬尿氨酸酶均二聚体输入比率产生的聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体产物的SEC-MALS HPLC。
图1A-1F中所示的所有摩尔输入比率均为PEG与犬尿氨酸酶均二聚体的输入比率。
图2A至图2C：聚乙二醇化犬尿氨酸酶的生物活性的比较。A)不同输入比率(显示为PEG:犬尿氨酸酶均二聚体)情况下犬尿氨酸酶的SEC-HPLC型态。各峰从左到右分别对应于100:1的PEG:犬尿氨酸酶均二聚体摩尔输入比率、80:1的PEG:犬尿氨酸酶均二聚体摩尔输入比率、40:1的PEG:犬尿氨酸酶均二聚体摩尔输入比率、20:1的PEG:犬尿氨酸酶均二聚体摩尔输入比率、10:1的PEG:犬尿氨酸酶均二聚体摩尔输入比率以及非聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体。B)单个静脉内剂量的聚乙二醇化犬尿氨酸酶之后72小时时的小鼠血浆PD。沿x轴的值对应于PEG:犬尿氨酸酶均二聚体的摩尔输入比率。C)如通过抗PEG蛋白质印迹法定量的聚乙二醇化犬尿氨酸酶的CT26肿瘤累积。沿x轴的值表示如实施例3中所描述在向BALB/c小鼠施用犬尿氨酸酶之后评估肿瘤累积时的时间点。在图2C中所示的各时间点，示出了四个垂直柱，这四个垂直柱各自展示由特定PEG与犬尿氨酸酶均二聚体输入比率形成的犬尿氨酸酶的相对肿瘤累积。各时间点的垂直柱从左到右分别对应于由10:1、20:1、40:1以及100:1的摩尔输入比率形成的犬尿氨酸酶均二聚体。
图2A-2C中所示的所有摩尔输入比率均为PEG与犬尿氨酸酶均二聚体的输入比率。
具体实施方式
本公开提供了共价结合至聚乙二醇(PEG)的犬尿氨酸酶蛋白质，以及合成此类蛋白质的方法以及使用所述蛋白质来治疗患有癌症的患者(诸如具有肿瘤的那些患者)的方法。具体地说，本公开提供了以与未共价结合至PEG的犬尿氨酸酶蛋白质相比实现增强的药代动力学和/或药效动力学特性(诸如改善的肿瘤累积、延长的半衰期以及更大的酶促活性)的PEG与犬尿氨酸酶比率为特征的聚乙二醇化犬尿氨酸酶蛋白质。不受机制限制，本文所描述的犬尿氨酸酶蛋白质可对在血清中失活展现增加的抗性，这允许犬尿氨酸酶维持活性以使犬尿氨酸降解持续的小时数增加。因此，以本文所描述的PEG:犬尿氨酸酶比率为特征的聚乙二醇化犬尿氨酸酶可展现基本上改善的治疗特性，从而使它们用于治疗性疾病干预(诸如治疗癌症)为理想的。在一些实施方案中，使用本公开的犬尿氨酸酶蛋白质来治疗癌症患者，诸如具有表达吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)或色氨酸2,3双加氧酶(TDO)的肿瘤的那些癌症患者。
以下部分描述了产生上文所描述的有利治疗特性的PEG:犬尿氨酸酶多肽比率，以及可用于制备此类蛋白质以及使用所述蛋白质来治疗患者的方法。
犬尿氨酸酶蛋白质
聚乙二醇化犬尿氨酸酶的一些实施方案涉及修饰的蛋白质和多肽。特定实施方案涉及一种修饰的蛋白质或多肽，所述修饰的蛋白质或多肽展现类似于未修饰型式的至少一种功能活性，优选为犬尿氨酸降解活性。在其他实施方案中，蛋白质或多肽可进一步修饰以增加血清稳定性。
可使用本领域技术人员所熟悉的分析来实现活性测定，特别是就蛋白质的活性来说，并且可出于比较的目的包括使用修饰或未修饰的蛋白质或多肽的天然和/或重组型式。
在一些实施方案中，可基于犬尿氨酸的增加来鉴定修饰的多肽，诸如修饰的犬尿氨酸酶。举例来说，可鉴定未修饰的多肽的底物识别位点。此鉴定可基于结构分析或同源性分析来进行。可产生涉及此类底物识别位点的修饰的一群突变体。在另一个实施方案中，可从突变体群体选择具有增加的犬尿氨酸降解活性的突变体。所需突变体的选择可包括诸如检测犬尿氨酸降解的副产物或产物的方法。
修饰的蛋白质可具有氨基酸的缺失和/或取代；因此，具有缺失的蛋白质、具有取代的蛋白质以及具有缺失和取代的蛋白质为修饰的蛋白质。在一些实施方案中，这些修饰的蛋白质可还包括插入或添加的氨基酸，诸如在融合蛋白或具有接头的蛋白质的情况下。修饰的缺失型蛋白质缺乏天然蛋白质的一个或多个残基，但可具有天然蛋白质的特异性和/或活性。修饰的缺失型蛋白质还可具有降低的免疫原性或抗原性。修饰的缺失型蛋白质的实例为至少一个抗原性区域(在特定有机体(诸如可施用修饰的蛋白质的有机体类型)中经过确定具抗原性的蛋白质区域)缺失氨基酸残基的蛋白质。
取代或置换变体典型地在蛋白质内的一个或多个位点处含有一个氨基酸与另一氨基酸的交换，并且可被设计成调节多肽的一种或多种特性，特别是它的效应功能和/或生物利用率。取代可能为或可能不为保守取代，保守取代为一个氨基酸经具有类似形状和电荷的氨基酸置换。保守取代为本领域中熟知的并且包括例如：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。
除缺失或取代之外，修饰的蛋白质可具有残基插入，这典型地涉及多肽中添加至少一个残基。这可包括插入靶向肽或多肽或简单地插入单个残基。以下论述称为融合蛋白的末端添加。
还将理解，氨基酸和核酸序列可包括额外的残基，诸如额外的N端或C端氨基酸或5'或3'序列，并且仍大体上如本文所公开的序列中的一者中所阐述，只要序列满足上文阐述的准则，包括维持其中涉及蛋白质表达的生物蛋白质活性。添加末端序列特别适用于可例如包括侧接编码区的5'或3'部分中的任一者的各种非编码序列或可包括已知存在于基因内的各种内部序列(即，内含子)的核酸序列。
在一些实施方案中，根据实施方案的犬尿氨酸酶包含与SEQ ID NO:1、2或3的犬尿氨酸酶具至少约80％，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，犬尿氨酸酶与SEQ IDNO:1、2或3的犬尿氨酸酶具至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且包含选自由以下组成的组的氨基酸取代中的1者、2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者、16者、17者、18者、19者、20者、21者、22者、23者、24者或25者：L8P、K38E、Y47L、I48F、K50Q、I51M、S60N、K64N、D65G、E66K、N67D、N67P、D67S、A68F、A68T、A68V、F71L、F71M、L72N、K84E、E88N、E89K、E89S、E90Q、D92E、K93N、K93T、A95H、A95Q、K96N、I97H、I97L、I97V、A98G、A99G、A99I、A99R、A99S、A99T、A99V、Y100N、Y100S、Y100T、G101A、H102W、E103F、E103H、E103N、E103Q、E103R、E103V、E103W、V104D、V104E、V104F、V104H、V104K、V104L、V104R、G105A、G105H、G105S、G105T、E106D、K106D、K106E、K106H、K106N、R107P、R107S、P108R、I110A、I110F、I110L、I110M、I110T、T111D、T111H、T111N、T111R、G112A、G112C、G112D、G112K、G112L、G112M、G112Q、G112R、G112S、G112T、G112Y、N127K、I131V、A132V、L133V、A136T、L137T、T138S、N140D、H142Q、Q14R、Y156H、K163T、D168E、H169R、Q175L、I183F、I183L、I183P、I183S、E184A、E184D、E184R、E184T、E184V、E185T、M187L、M189I、K191A、K191G、K191H、K191M、K191N、K191R、K191S、K191T、K191W、E197A、E197D、E197F、E197K、E197M、E197Q、E197S、E197T、E197V、I201C、I201E、I201F、I201H、I201L、I201S、I201T、I201V、H203K、L219M、L219W、F220L、V223I、F225Y、H230F、H230L、H230Y、N232S、Y246F、F249W、D250E、S274A、S274C、S274G、S274N、S274T、L278M、A280G、A280S、A280T、G281S、A282M、A282P、G284N、I285L、V303L、V303S、F306W、F306Y、S311N、K315E、D317E、D317K、I331C、I331L、I331N、I331S、I331T、I331V、N333T、P334N、P335T、L337T、L338A、L338Q、S341I、K373E、K373N、N375A、N375H、Y376C、Y376F、Y376L、K378G、K378P、K378Q、K378R、K380G、K380S、A382G、A382R、A382T、T383S、K384G、K384N、P386K、P386S、V387L、N389E、I405L、F407Y、S408D、S408N、N411R、D413S、D413V、Q416T、E419A、E419L、K420E、R421N、V424I、K427M、N429E、G432A以及A436T。在一些实施方案中，犬尿氨酸酶与表2中所提供的犬尿氨酸酶中的一者具至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，犬尿氨酸酶选自表2中所提供的那些犬尿氨酸酶中的一者。
下表2阐述了可与本公开的组合物和方法结合使用的各种犬尿氨酸酶。虽然表2中未明确列出，但本文中的蛋白质(1)是指野生型人犬尿氨酸酶，其氨基酸序列在SEQ ID NO:1中阐述。
SEQ ID NO:1–野生型人犬尿氨酸酶：
MEPSSLELPADTVQRIAAELKCHPTDERVALHLDEEDKLRHFRECFYIPKIQDLPPVDLSLVNKDENAIYFLGNSLGLQPKMVKTYLEEELDKWAKIAAYGHEVGKRPWITGDESIVGLMKDIVGANEKEIALMNALTVNLHLLMLSFFKPTPKRYKILLEAKAFPSDHYAIESQLQLHGLNIEESMRMIKPREGEETLRIEDILEVIEKEGDSIAVILFSGVHFYTGQHFNIPAITKAGQAKGCYVGFDLAHAVGNVELYLHDWGVDFACWCSYKYLNAGAGGIAGAFIHEKHAHTIKPALVGWFGHELSTRFKMDNKLQLIPGVCGFRISNPPILLVCSLHASLEIFKQATMKALRKKSVLLTGYLEYLIKHNYGKDKAATKKPVVNIITPSHVEERGCQLTITFSVPNKDVFQELEKRGVVCDKRNPNGIRVAPVPLYNSFHDVYKFTNLLTSILDSAETKN
表2：本公开的示例性犬尿氨酸酶
Figure BDA0003660306280000351
Figure BDA0003660306280000361
Figure BDA0003660306280000371
Figure BDA0003660306280000381
Figure BDA0003660306280000391
Figure BDA0003660306280000401
Figure BDA0003660306280000411
Figure BDA0003660306280000421
Figure BDA0003660306280000431
Figure BDA0003660306280000441
缀合物
本公开的组合物和方法涉及诸如通过与异源肽区段或聚合物(诸如聚乙二醇(PEG))形成缀合物而进行修饰的犬尿氨酸酶。使犬尿氨酸酶连接至PEG以增加酶的流体动力学半径并且因此增加血清持久性。在一些实施方案中，所公开的多肽可结合至任何靶向剂，诸如具有特异性地并且稳定地结合至肿瘤细胞上的外部感受器或结合位点的能力的配体(美国专利公布2009/0304666)。
聚乙二醇化
在本公开的一些实施方案中，公开了与犬尿氨酸酶的聚乙二醇化有关的方法和组合物。举例来说，根据本文所公开的方法对犬尿氨酸酶进行聚乙二醇化。
聚乙二醇化为将聚(乙二醇)聚合物链共价连接至另一分子(通常为药物或治疗性蛋白质)的方法。常规地通过将PEG的反应性衍生物与靶大分子一起孵育来实现聚乙二醇化。PEG共价连接至药物或治疗性蛋白质可使所述剂避开宿主的免疫系统(降低免疫原性和抗原性)或增加所述剂的流体动力学尺寸(在溶液中尺寸)，这通过降低肾脏清除率延长其循环时间。聚乙二醇化还可为疏水性药物和蛋白质提供水溶性。聚乙二醇化的第一步为在一个或两个末端对PEG聚合物的适当官能化。在各末端用相同反应性部分活化的PEG称为“同双官能的”，而如果存在的官能团不同，那么PEG衍生物被称为“异双官能的”或“异官能的”。制备化学活性或活化的PEG聚合物衍生物以将PEG连接至所需分子。
根据将偶联至PEG的分子上可获得的反应性基团的类型，为PEG衍生物选择合适的官能团。对于蛋白质，典型反应性氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸。还可使用N端氨基和C端羧酸。用于形成第一代PEG衍生物的技术通常为使PEG聚合物与同羟基具反应性的基团(典型地酸酐、酰氯、氯甲酸酯以及碳酸酯)反应。在第二代聚乙二醇化化学中，使更高效的官能团(诸如醛、酯、酰胺等)可用于缀合。
随着聚乙二醇化的应用变得越来越先进和完善，对异双官能PEG用于缀合的需要增加。这些异双官能PEG非常适用于连接两个实体，其中需要亲水、灵活并且生物相容的间隔子。异双官能PEG的优选末端基团为马来酰亚胺、乙烯砜、吡啶基二硫化物、胺、羧酸以及NHS酯。
最常用的修饰剂或接头是基于甲氧基PEG(mPEG)分子的。其活性取决于将蛋白质修饰基团添加至醇末端。在一些情况下，将聚乙二醇(PEG二醇)用作前体分子。随后在两个末端对二醇进行修饰以形成异二聚或均二聚PEG键联分子。
通常在亲核位点(诸如未质子化的硫醇(半胱氨酰残基)或氨基)对蛋白质进行聚乙二醇化。半胱氨酰基特异性(即，胱氨酸反应性)修饰试剂的实例包括PEG马来酰亚胺、PEG碘乙酸酯、PEG硫醇以及PEG乙烯基砜。四者全部在温和条件以及中性至弱碱性pH值下为强半胱氨酰基特异性的。
胺特异性(即，赖氨酸反应性)修饰剂包括PEG NHS酯、PEG三氟乙基磺酸酯、PEG醛、PEG异硫氰酸酯以及若干其他物质。全部在温和条件下反应并且对氨基极具特异性。PEGNHS酯可能为更具反应性的剂之一；然而，其高反应性可使得聚乙二醇化反应难以大规模控制。PEG醛与氨基形成亚胺，然后亚胺在存在氰基硼氢化钠的情况下还原为仲胺。不同于硼氢化钠，氰基硼氢化钠将不还原二硫键。然而，此化学品为高毒性的并且必须小心处置，特别是在较低的pH值下，在较低的pH值下它变为挥发性的。
归因于大多数蛋白质上的多个赖氨酸残基，位点特异性聚乙二醇化可为一项挑战。因为这些试剂与未质子化的氨基反应，所以有可能通过在较低pH值下进行反应将聚乙二醇化定向至较低pK氨基。通常，α-氨基的pK比赖氨酸残基的ε-氨基低1-2个pH单位。通过在7或低于7的pH值下对分子进行聚乙二醇化，常常可实现对N端的高选择性。然而，这仅在如果蛋白质的N端部分不为生物活性所需的情况下为可行的。此外，来自聚乙二醇化的药代动力学益处常常超过体外生物活性的显著损失，从而无论聚乙二醇化化学如何均产生具有大得多的体内生物活性的产物。
在开展聚乙二醇化程序时有若干参数要考虑。在硫醇特异性聚乙二醇化反应中，考虑的参数包括：蛋白质浓度、PEG与蛋白质的比率(以摩尔计)、温度、pH值、反应时间以及(在一些情况下)排除氧。(氧可促进蛋白质形成分子间二硫化物，这将降低聚乙二醇化产物的产率。)在胺特异性修饰中应考虑相同因素(除了氧)，只是pH值可能甚至更为关键，特别是在靶向N端氨基时。
在胺特异性与硫醇特异性修饰中，反应条件可影响蛋白质的稳定性。这可限制温度、蛋白质浓度以及pH值。此外，在开始聚乙二醇化反应之前，PEG接头的反应性应为已知的。举例来说，如果聚乙二醇化剂仅为70％活性的，那么所用PEG的量应确保仅活性PEG分子被算入蛋白质与PEG反应化学计量中。
用于化学缀合的接头
可使用多种接头将犬尿氨酸酶均二聚体内的反应性残基与PEG分子彼此共价偶联，例如以便形成如本文所描述的缀合物。示例性接头包括可例如通过酶水解、光解、在酸性条件下水解、在碱性条件下水解、氧化、二硫化物还原、亲核裂解或有机金属裂解进行裂解的那些接头(参见例如Leriche等,Bioorg.Med.Chem.,20:571-582,2012，所述参考文献的公开内容因其与适合于化学偶联的接头有关而以引用的方式并入本文中)。可用于合成本文所描述的缀合物的接头的实例包括适合与存在于抗体、抗原结合片段、蛋白质、肽以及小分子内的亲核取代基(诸如胺和硫醇部分)反应的含有亲电子剂(诸如迈克尔受体(Michael acceptor))(例如马来酰亚胺)、活化酯、缺电子型羰基化合物以及醛等等的那些接头。举例来说，适合合成治疗性缀合物的接头包括但不限于烷基、环烷基以及杂环烷基接头，诸如开链乙基、丙基、丁基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基链、环己基、环戊基、环丁基、环丙基、哌啶基、吗啉基或含有两个反应性部分的其他接头(例如卤素原子、醛基、酯基、酰氯基团、酰基酸酐基团、甲苯磺酰基、甲磺酰基或对溴苯磺酰基等等，所述基团可由存在于犬尿氨酸酶内的反应性亲核原子代替)；芳基或杂芳基接头，诸如可由存在于犬尿氨酸酶内的反应性亲核原子代替的含有两个卤甲基的苯甲基、亚萘基或吡啶基。示例性接头包括例如Liu等,18:690-697,1979中所描述的4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-L-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、磺基-SMCC、m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、磺基-MBS以及碘乙酸琥珀酰亚胺酯等等，所述参考文献的公开内容因其与用于化学缀合的接头有关而以引用的方式并入本文中。额外的接头包括由Doronina等,Bioconjugate Chem.17:14-24,2006描述的非可裂解马来酰亚胺基己酰基接头，所述参考文献的公开内容因其与用于化学缀合的接头有关而以引用的方式并入本文中。
可使得缀合物的一个组分结合至如本文所描述的另一组分的额外接头包括如下接头，所述接头在接头的一个末端上共价结合至缀合物的一个组分(例如犬尿氨酸酶)，并且在接头的另一末端上含有由存在于接头上的反应性取代基与存在于缀合物的另一组分(例如本文所描述的PEG分子)内的反应性取代基之间的偶合反应形成的化学部分。可存在于缀合物的组分内的示例性反应性取代基包括但不限于丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸残基的羟基部分；赖氨酸残基的氨基部分；天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基部分；以及半胱氨酸残基的硫醇部分，以及非天然存在的氨基酸的炔丙基、叠氮基、卤代芳基(例如氟代芳基)、卤代杂芳基(例如氟代杂芳基)、卤代烷基以及卤代杂烷基部分。可结合本文所描述的缀合物使用的接头包括但不限于含有如下表3中所展示的通过偶联反应形成的化学部分的接头。曲线指定与缀合物的各组分的连接点。
可用于使PEG分子缀合至酶的接头包括在接头的一个末端上共价结合至酶并且在接头的另一末端上含有由存在于接头上的反应性取代基与存在于作为酶的一部分存在的氨基酸残基的侧链中的一者内的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分的那些接头。可存在于犬尿氨酸酶内的反应性取代基包括但不限于丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸残基的羟基部分；赖氨酸残基的氨基部分；天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基部分；以及半胱氨酸残基的硫醇部分，以及非天然存在的氨基酸的炔丙基、叠氮基、卤代芳基(例如氟代芳基)、卤代杂芳基(例如氟代杂芳基)、卤代烷基以及卤代杂烷基部分。
表3.在犬尿氨酸酶均二聚体缀合物的形成中通过偶联反应形成的示例性化学部分
Figure BDA0003660306280000481
Figure BDA0003660306280000491
Figure BDA0003660306280000501
Figure BDA0003660306280000511
Figure BDA0003660306280000521
犬尿氨酸酶在宿主细胞中的重组表达
本公开包括用于从宿主细胞(诸如原核或真核制备细胞)重组表达犬尿氨酸酶蛋白质的组合物和方法。以下部分中进一步详细描述了可用于实现在宿主细胞中表达犬尿氨酸酶蛋白质的示例性方法。
编码犬尿氨酸酶的多核苷酸
可用于从宿主细胞(诸如哺乳动物细胞)表达犬尿氨酸酶蛋白质的一种平台是通过将编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因稳定合并至宿主细胞基因组中(例如通过整合至哺乳动物细胞的核基因组中)。这些基因为编码对应蛋白质的初级氨基酸序列的多核苷酸。为将此类外源性基因引入哺乳动物细胞中，可将这些基因合并至载体中。可通过多种方法将载体引入细胞中，包括转化、转染、直接摄入、射弹轰击以及通过将载体封装于脂质体中。合适的转染或转化细胞的方法的实例为磷酸钙沉淀、电穿孔、微量注射、感染、脂质体转染以及直接摄入。例如Green等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第四版(ColdSpring Harbor University Press,New York(2014))；以及Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,New York(2015))中更详细描述了此类方法，所述参考文献各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
还可将编码本公开的治疗性蛋白质的基因通过使含有编码此类剂的基因的载体靶向细胞膜磷脂来引入哺乳动物细胞中。举例来说，可通过使载体分子连接至VSV-G蛋白(一种对所有细胞膜磷脂具有亲和力的病毒蛋白)来使载体靶向细胞膜的细胞外表面上的磷脂。如此，可使用本领域技术人员熟知的方法制备构建体。
编码本公开的一种或多种治疗性蛋白质的多核苷酸由哺乳动物RNA聚合酶识别和结合对于基因表达来说为重要的。因而，一者可在多核苷酸内包括对转录因子展现高亲和力的序列元件，所述转录因子招募RNA聚合酶并且促进转录起始位点处转录复合物的组装。此类序列元件包括例如哺乳动物启动子，其序列可由特异性转录起动因子并且最终由RNA聚合酶识别和结合。Smith等,Mol.Sys.Biol.,3:73(在线出版)中已描述哺乳动物启动子的实例，所述参考文献的公开内容以引用的方式并入本文中。
在编码一种或多种治疗性蛋白质的多核苷酸已合并至哺乳动物细胞的核DNA中后，可通过本领域中已知的方法诱导此多核苷酸的转录。举例来说，可通过使哺乳动物细胞暴露于外部化学试剂(诸如调节转录因子和/或RNA聚合酶与哺乳动物启动子的结合并且因此调控基因表达的剂)来诱导表达。化学试剂可用于例如通过移除已结合启动子的阻抑蛋白来促进RNA聚合酶和/或转录因子结合至哺乳动物启动子。或者，化学试剂可用于增强哺乳动物启动子对RNA聚合酶和/或转录因子的亲和力，使得在存在所述化学试剂的情况下位于启动子下游的基因的转录速率增加。通过以上机制增强多核苷酸转录的化学试剂的实例为四环素和多西环素(doxycycline)。这些试剂可商购获得(Life Technologies,Carlsbad,CA)并且可根据已建立的方案向哺乳动物细胞施用以促进基因表达。
可包括在用于本文所描述的组合物和方法中的多核苷酸中的其他DNA序列元件为增强子序列。增强子表示另一类调控元件，所述调控元件诱导含有所关注的基因的多核苷酸的构象变化使得DNA采取三维定向，三维定向对于转录起始位点处转录因子和RNA聚合酶的结合为有利的。因此，用于本文所描述的组合物和方法中的多核苷酸包括编码一种或多种治疗性蛋白质并且另外包括哺乳动物增强子序列的那些多核苷酸。许多增强子序列现已知来自哺乳动物基因，并且实例为来自编码哺乳动物球蛋白、弹性酶、白蛋白、α-胎蛋白以及胰岛素的基因的增强子。用于本文所描述的组合物和方法中的增强子还包括那些源自于能够感染真核细胞的病毒的遗传物质的增强子。实例为复制起点晚期一侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期一侧的多形瘤增强子以及腺病毒增强子。Yaniv等,Nature297:17(1982)中公开了诱导真核基因转录的活化的额外增强子序列。
融合蛋白
本公开的一些实施方案涉及融合蛋白。这些分子可具有在N端或C端连接至异源结构域的天然或修饰的犬尿氨酸酶。举例来说，融合物也可采用来自其他物种的前导序列以容许蛋白质在异源宿主中重组表达。另一可用的融合物包括添加蛋白质亲和力标签(诸如血清白蛋白亲和力标签或六组氨酸残基)或免疫活性结构域(诸如抗体表位)，优选为可裂解的以有助于融合蛋白的纯化。非限制性亲和力标签包括聚组氨酸、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)以及谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
在一个特定实施方案中，犬尿氨酸酶可连接至使体内半衰期增加的肽，诸如XTEN多肽(Schellenberger等,2009)、IgG Fc结构域、白蛋白或白蛋白结合肽。
产生融合蛋白的方法为本领域技术人员熟知的。此类蛋白质可例如通过从头合成完全融合蛋白或通过连接编码异源结构域的DNA序列，随后表达完整融合蛋白来制备。通过用编码在串联连接的多肽之间剪接的肽接头的桥接DNA区段连接基因可有助于制备恢复亲本蛋白质的功能活性的融合蛋白。接头将具有足够的长度以允许所得融合蛋白适当折叠。
用于疗法中的酶促犬尿氨酸降解
在一些实施方案中，本公开的犬尿氨酸酶可用于治疗包括在存在耗竭犬尿氨酸的酶的情况下对犬尿氨酸耗竭敏感的癌症的疾病，以防止肿瘤介导的致耐受性效应并且替代地介导肿瘤消除性促炎性反应。在一些实施方案中，犬尿氨酸酶预期用于治疗表达IDO1、IDO2和/或TDO的肿瘤。
本公开的一些实施方案提供了一种修饰的犬尿氨酸酶，用于治疗疾病，诸如肿瘤。具体来说，修饰的犬尿氨酸酶可具有人多肽序列并且因此可防止人患者中的过敏性反应，允许重复给药，并且增加治疗功效。
本发明治疗方法适用的肿瘤包括任何恶性细胞类型，诸如在实体肿瘤或血液学肿瘤中发现的那些恶性细胞类型。示例性实体肿瘤可包括但不限于选自由以下组成的组的器官的肿瘤：胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺以及乳腺。示例性血液学肿瘤包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤等。可使用本文所提供的方法治疗的癌症的其他实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌以及肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠道癌和胃肠道基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer或renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、雀斑恶性黑素瘤、肢端雀斑样黑素瘤、结节性黑素瘤以及B细胞淋巴瘤(包括低等级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中间等级/滤泡性NHL；中间等级扩散性NHL；高等级成免疫细胞性NHL；高等级成淋巴细胞性NHL；高等级小非核裂细胞NHL；巨大肿块NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；以及华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia))、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(AML)以及慢性成髓细胞性白血病。
所述癌症可具体来说属于以下组织学类型，不过不限于这些：恶性赘瘤；癌瘤；未分化癌瘤；巨大和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管细胞癌；肝细胞癌；混合型肝细胞-胆管细胞癌(combined hepatocellular carcinoma andcholangiocarcinoma)；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；家族性结肠息肉腺癌；实体癌；恶性类癌瘤肿瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺癌(apocrineadenocarcinoma)；皮脂腺癌；耵聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特氏病(paget's disease,mammary)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢基质瘤；恶性卵泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性男性细胞瘤(androblastoma,malignant)；足细胞癌；恶性莱迪希细胞肿瘤(leydig cell tumor,malignant)；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤(brenner tumor,malignant)；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤(kaposi's sarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间胚叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤(ewing's sarcoma)；恶性牙原性肿瘤；成釉细胞性牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞性纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；成星形细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞肿瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病(hodgkin's disease)；霍奇金氏副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；大细胞弥散性性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样霉菌病；其他指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴细胞性白血病；浆细胞性白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；骨髓性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸细胞性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；成巨核细胞性白血病；骨髓性肉瘤；以及毛细胞白血病。
在本文中可以多种模式将犬尿氨酸酶用作抗肿瘤剂，用于从肿瘤组织或患有癌症的哺乳动物的循环中耗竭犬尿氨酸和/或犬尿氨酸衍生的代谢产物，或用于在认为需要犬尿氨酸耗竭的情况下耗竭犬尿氨酸。可在哺乳动物的循环中在体内、在其中在组织培养或其他生物培养基中需要耗竭犬尿氨酸和/或犬尿氨酸衍生的代谢产物的情况下在体外以及在其中在身体外部对生物流体、细胞或组织进行操纵并且随后返回到患者哺乳动物体内的离体程序中进行耗竭。从循环、培养基、生物流体或细胞中耗竭犬尿氨酸是为了减少正在处理的材料可获取的犬尿氨酸的量，并且因此包括使所要耗竭的材料与犬尿氨酸耗竭量的犬尿氨酸酶在犬尿氨酸耗竭条件下接触以便降解所接触的材料中的周围犬尿氨酸。
耗竭可以是针对细胞的营养物来源，而不一定是细胞本身。因此，在体内应用中，对肿瘤细胞进行处理包括使肿瘤细胞群体的培养基与犬尿氨酸酶接触。在此实施方案中，培养基可为其中需要犬尿氨酸耗竭的血液、淋巴液、脊髓液等人体流体。
犬尿氨酸和/或犬尿氨酸衍生的代谢产物的耗竭效率可根据应用而广泛变化，并且典型地根据存在于材料中的犬尿氨酸的量、所需耗竭速率以及材料对暴露于犬尿氨酸酶的耐受性而变化。材料中的犬尿氨酸和犬尿氨酸代谢产物水平以及因此犬尿氨酸和犬尿氨酸代谢产物从材料耗竭的速率可容易地通过本领域中熟知的多种化学和生化方法进行监测。本文中还描述了示例性犬尿氨酸耗竭量，并且可例如根据正在治疗的受试者和疾病的严重程度在例如0.001至1,000单位(U)犬尿氨酸酶范围内。
犬尿氨酸耗竭条件为与犬尿氨酸酶的生物活性相容的缓冲和温度条件，并且包括与酶相容的适度温度、盐以及pH值条件，例如生理条件。示例性条件包括约4-40℃，离子强度等于约0.05至0.2M NaCl，并且pH值为约5至9，同时包括生理条件。
在一些实施方案中，本公开考虑使用犬尿氨酸酶作为抗肿瘤剂的方法，并且因此包括使肿瘤细胞群体与治疗有效量的犬尿氨酸酶接触足以抑制肿瘤细胞生长的一段时间。
犬尿氨酸酶的治疗有效量为经过计算实现所需效应(即，耗竭肿瘤组织中或患者的循环中的犬尿氨酸)，并且从而介导肿瘤消除性促炎性反应的预定量。因此，用于施用本公开的犬尿氨酸酶的剂量范围为足够大的那些剂量，以产生其中肿瘤细胞分裂和细胞循环的征兆降低的所需效应。剂量不应大到引起有害副作用，诸如高粘滞综合征、肺水肿、充血性心脏衰竭、神经效应等。通常，剂量将随患者的年龄、状况、性别以及疾病程度改变并且可由本领域技术人员确定。倘若发生任何并发症，可由个别医师调节剂量。
可通过注射或通过随时间推移逐步输注来肠胃外施用犬尿氨酸酶。犬尿氨酸酶可静脉内、腹膜内、经口、肌肉内、皮下、腔内、经皮、经真皮施用，可通过蠕动构件递送，可直接注射至含有肿瘤细胞的组织中，或可通过连接至可含有用于犬尿氨酸的潜在生物传感器的导管的泵来施用。
常规地如例如通过注射单位剂量来静脉内施用含有犬尿氨酸酶的治疗性组合物。
以与投用制剂相容的方式并且以治疗有效量施用组合物。要施用的量取决于要治疗的受试者、受试者的系统利用活性成分的能力以及所需治疗作用的程度。需要施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断并且为各个体所特有的。然而，本文中公开了适合全身性施用的剂量范围并且取决于施用途径。还考虑适合初始施用和加强注射的方案并且典型情况为初始施用随后进行与后续注射或另一施用间隔一小时或多小时的重复剂量。本文描述了示例性多次施用并且特别优选用于连续维持高血清和组织水平的犬尿氨酸酶以及相反地低血清和组织水平的犬尿氨酸。或者，考虑足以将血液中的浓度维持在体内疗法的指定范围内的连续静脉内输注。
蛋白质和肽
在一些实施方案中，本公开涉及包含至少一种蛋白质或肽(诸如犬尿氨酸酶)的新颖组合物。这些肽可包含在融合蛋白中或结合至如上文所描述的剂。
如本文所用，蛋白质或肽通常指但不限于大于约200个氨基酸至从基因翻译的全长序列的蛋白质；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3至约100个氨基酸的肽。为了方便，术语“蛋白质”、“多肽”以及“肽”在本文中可互换使用。
如本文所用，“氨基酸残基”是指任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或本领域中已知的任何氨基酸模拟物。在一些实施方案中，蛋白质或肽的残基为连续的，氨基酸序列残基未间杂任何非氨基酸。在一些实施方案中，序列可包含一个或多个非氨基酸部分。在特定实施方案中，蛋白质或肽的残基的序列可间杂有一个或多个非氨基酸部分。
因此，术语“蛋白质或肽”涵盖包含天然存在的蛋白质中发现的20种常见氨基酸中的至少一者，或至少一个经过修饰或不常见的氨基酸的氨基酸序列。
蛋白质或肽可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，包括通过标准分子生物技术表达蛋白质、多肽或肽，从天然来源分离蛋白质或肽或化学合成蛋白质或肽。先前已公开对应于各种基因的核苷酸和蛋白质、多肽以及肽序列，并且可在本领域技术人员已知的计算机化数据库中找到。一个此类数据库为国家生物技术信息中心基因库(NationalCenter for Biotechnology Information’s Genbank)和GenPept数据库(在万维网上在ncbi.nlm.nih.gov/可获得)。可使用本文所公开或如本领域技术人员将已知的技术来扩增和/或表达已知基因的编码区。或者，蛋白质、多肽以及肽的各种商业制剂为本领域技术人员已知的。
药物组合物
考虑可全身或局部施用新颖犬尿氨酸酶以抑制肿瘤细胞生长，并且最优选地，将患有局部晚期或转移性癌症的癌症患者中的癌细胞杀死。它们可静脉内、鞘内和/或腹膜内施用。它们可单独或与抗增生性药物组合施用。在一个实施方案中，在手术或其他程序之前施用它们以降低患者中的癌症负荷。或者，可在手术之后施用它们以确保任何剩余癌症(例如手术未能消除的癌症)不能存活。
本公开预期不受治疗性制剂的特定性质限制。举例来说，可将此类组合物与生理学可耐受的液体、凝胶或固体载体、稀释剂以及赋形剂一起提供于制剂中。可向哺乳动物施用这些治疗性制剂以用于兽医学用途(诸如在家养动物情况下)以及在人中以类似于其他治疗剂的方式用于临床用途。一般来说，治疗功效所需的剂量将根据用途类型和施用模式以及所列举的个别受试者的要求而改变。
典型地将此类组合物制备成液体溶液或悬浮液，如可注射物。合适的稀释剂和赋形剂为例如水、盐水、右旋糖、甘油等以及它们的组合。此外，如果需要，那么组合物可含有微小量的助剂物质，诸如润湿或乳化剂、稳定剂或pH值缓冲剂。
在考虑临床应用的情况下，可能需要制备包含形式适合于预期应用的蛋白质、抗体以及药物的药物组合物。通常，药物组合物可包含有效量的一种或多种犬尿氨酸酶或溶解或分散于药学上可接受的载体中的额外的剂。短语“药物或药理学上可接受”是指分子实体和组合物当(诸如适当时为人)向动物施用时不产生有害、过敏性或其他不良反应。含有通过本文所公开的方法分离的至少一种犬尿氨酸酶或额外活性成分的药物组合物的制备将为本领域技术人员根据本公开已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,1990所例示，所述参考文献以引用的方式并入本文中。此外，对于动物(例如人)施用，应了解制备应满足如FDA生物标准办公室(FDA Office of Biological Standards)所要求的无菌性、产热原性、总体安全性以及纯度标准。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括如本领域技术人员将已知(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,1990，所述参考文献以引用的方式并入本文中)的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、诸如此类材料以及它们的组合。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑它在药物组合物中的用途。
本公开的一些实施方案可包含不同类型的载体，这取决于它要以固体、液体还是气溶胶形式施用，以及在施用途径(诸如注射)中它是否需要为无菌的。组合物可按以下方式施用：静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌肉内、皮下、经粘膜、经口、经表面、经局部、通过吸入(例如气溶胶吸入)、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸泡靶细胞、经由导管、经由灌洗、于脂质组合物(例如脂质体)中或通过如本领域技术人员将已知(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,1990，所述参考文献以引用的方式并入本文中)的其他方法或前述内容的任何组合。
可将修饰的多肽以游离碱、中性或盐形式调配成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组分的自由氨基形成的那些酸加成盐，或与诸如盐酸或磷酸等无机酸或诸如乙酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸等有机酸形成的酸加成盐。与自由羧基形成的盐也可来源于无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因(procaine)等有机碱。在配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式并且以诸如治疗有效量等量施用。制剂容易以多种剂型施用，诸如被调配成用于肠胃外施用，诸如可注射溶液，或用于递送至肺部的气溶胶，或被调配成用于消化施用，诸如药物释放胶囊等。
另外，根据本公开的一些实施方案，可在存在或不存在惰性稀释剂的情况下将适合于施用的组合物提供于药学上可接受的载体中。载体应为可吸收的并且包括液体、半固体(即，糊状物)或固体载体。除非任何常规介质、剂、稀释剂或载体对接受者或对其中所含的组合物的疗效有害，否则它用于供在实践所述方法中使用的可施用组合物中为适当的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、结合剂、填料等或它们的组合。组合物还可包含各种抗氧化剂以阻止一种或多种组分的氧化。另外，可通过防腐剂(诸如各种抗细菌和抗真菌剂)对微生物的作用进行预防，所述防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或它们组合。
根据本公开的一些实施方案，以任何方便并且实用的方式(即，通过溶解、悬浮、乳化、混合、封装、吸收等)将组合物与载体组合。此类程序对于本领域技术人员来说为常规的。
在本公开的一个具体实施方案中，将组合物与半固体或固体载体充分组合或混合。混合可以任何方便的方式进行，诸如研磨。还可在混合过程中添加稳定剂以防止组合物损失治疗活性，即，在胃中变性。用于组合物中的稳定剂的实例包括缓冲剂、氨基酸(诸如甘氨酸和赖氨酸)、碳水化合物(诸如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇)等。
在其他实施方案中，本公开可涉及使用包括犬尿氨酸酶、一种或多种脂质以及水性溶剂的药物脂质媒介物组合物。如本文所用，术语“脂质”将被定义为包括特性不溶于水并且可用有机溶剂提取的广泛范围的物质中的任一者。此广泛类别的化合物为本领域技术人员熟知的，并且在本文中使用术语“脂质”时，它不限于任何特定结构。实例包括含有长链脂肪族烃和其衍生物的化合物。脂质可为天然存在的或合成的(即，由人设计或制备)。然而，脂质通常为生物物质。生物脂质为本领域中熟知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶脂素(lysolipid)、鞘糖脂、糖脂、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质、可聚合脂质以及它们的组合。当然，所述组合物和方法还考虑将本领域技术人员所理解的除本文具体描述的化合物外的化合物作为脂质。
本领域技术人员将熟悉可用于将组合物分散于脂质媒介物中的一系统技术。举例来说，犬尿氨酸酶或其融合蛋白可分散于含有脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，共价键合至脂质，以悬浮物形式含于脂质中，含有胶束或脂质体或与胶束或脂质体复合，或通过本领域技术人员已知的任何手段以其他方式与脂质或脂质结构相关联。分散可能引起或可能不引起脂质体的形成。
向动物患者施用的组合物的实际剂量可由物理和生理因素决定，诸如体重、疾患的严重程度、所治疗的疾病类型、先前或并行的治疗干预、患者的特发病以及施用途径。根据剂量和施用途径，可根据受试者的反应改变优选剂量和/或有效量的施用次数。在任何情况下，负责施用的操作者将确定组合物中的一种或多种活性成分的浓度以及用于个别受试者的一种或多种适当剂量。
在一些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在一些实施方案中，活性化合物可包含约2％至约75％的重量单位，或例如约25％至约60％以及其中可得到的任何范围。当然，可以使得将在任何给定单位剂量的化合物中获得合适的剂量的方式来准备各治疗可用组合物中的一种或多种活性化合物的量。制备此类药物制剂领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用率、生物半衰期、施用途径、产物保质期以及其他药理学考虑因素等因素，并且因而，可能需要多种剂量和治疗方案。
在其他非限制性实例中，剂量还可包括每次施用每千克体重约1微克、每千克体重约5微克、每千克体重约10微克、每千克体重约50微克、每千克体重约100微克、每千克体重约200微克、每千克体重约350微克、每千克体重约500微克、每千克体重约1毫克、每千克体重约5毫克、每千克体重约10毫克、每千克体重约50毫克、每千克体重约100毫克、每千克体重约200毫克、每千克体重约350毫克、每千克体重约500毫克至每千克体重约1000毫克或更多以及其中可得到的任何范围。在从本文列举的数字可得到的范围的非限制性实例中，基于上文所描述的数字，可施用每千克体重约5毫克至每千克体重约100毫克、每千克体重约5微克至每千克体重约500毫克等的范围。
组合治疗
在一些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及施用犬尿氨酸酶与第二或额外疗法的组合。此类疗法可应用在与犬尿氨酸依赖性相关的任何疾病的治疗中。举例来说，疾病可为癌症。
所述方法和组合物(包括组合疗法)增强治疗或保护作用和/或增加另一抗癌或抗过度增殖性疗法的治疗作用。可以有效实现所需效应(诸如杀死癌细胞和/或抑制细胞过度增殖)的组合量提供治疗性和预防性方法和组合物。此方法可涉及施用犬尿氨酸酶和第二疗法。第二疗法可能具有或可能不具有直接细胞毒性效应。举例来说，第二疗法可为上调免疫系统而不具有直接细胞毒性效应的剂。可使组织、肿瘤或细胞暴露于一种或多种组合物或药理学制剂，所述一种或多种组合物或药理学制剂包含所述剂中的一者或多者(例如犬尿氨酸酶或抗癌剂)，或通过在存在两种或更多种独特组合物或制剂的情况下暴露组织、肿瘤和/或细胞，其中一种组合物提供1)犬尿氨酸酶，2)抗癌剂，或3)犬尿氨酸酶与抗癌剂两者。另外，预期可将此类组合疗法与化学疗法、放射疗法、手术疗法或免疫疗法结合使用。
可相对于抗癌治疗在之前、期间、之后或以各种组合施用犬尿氨酸酶。施用可以在同时至数分钟至数天至数周范围内的间隔来进行。在其中将犬尿氨酸酶与抗癌剂分开向患者提供的实施方案中，将通常确保在每次递送的时间之间不超出显著时间段，使得两种化合物将仍能够对患者发挥有利组合效应。在此类情况中，预期可在彼此约12至24或72h内并且更具体地说在彼此约6-12h内为患者提供犬尿氨酸酶和抗癌疗法。在一些情况下，在相应施用之间过去若干天(2、3、4、5、6或7)至若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)的情况下，可能需要显著延长用于治疗的时间段。
在一些实施方案中，治疗过程将持续1-90天或更久(这一此类范围包括中间天数)。预期可在第1天至第90天(这一此类范围包括中间天数)的任一天或它们的任何组合给予一种剂，并且在第1天至第90天(这一此类范围包括中间天数)或它们的任何组合给予另一剂。在单一天(24-小时时间)内，可给予患者一种或多种所述剂的一个或多次施用。此外，在治疗过程之后，预期存在没有施以抗癌治疗的时间段。根据患者的状况(诸如其预后、强度、健康等)，此时间段可持续1-7天和/或1-5周和/或1-12个月或更久(这一此类范围包括中间天数)。预期将根据需要重复治疗周期。
可采用各种组合。在以下实施例中，犬尿氨酸酶为“A”并且抗癌疗法为“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
向患者施用本发明实施方案的任何化合物或疗法将考虑所述剂的毒性(若有)遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于组合疗法的毒性的步骤。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域技术人员提供可如何使用、制备以及评估本文所描述的组合物和方法的描述，并且旨在仅例示本公开并且不旨在限制本发明人视为其公开内容的范围。
实施例1.聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体的产生
产生用于本文所描述的组合物和方法中的聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体的示例性方法为通过化学缀合。可将犬尿氨酸酶溶解于包含100mM磷酸二钠的pH值为8.5的水性缓冲液中，以例如20:1、30:1、40:1、50:1或60:1PEG分子与犬尿氨酸酶均二聚体的输入比率向所述水性缓冲液中添加固体聚乙二醇化剂，诸如分子量为5kDa的甲氧基-PEG-CH2COO-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。可将此反应混合物在约22℃下保持约30分钟。
用于产生聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体的额外示例性方法可涉及含犬尿氨酸酶均二聚体的水性缓冲液，所述水性缓冲液包含50mM乙酸钠、230mM NaCl、0.1mM磷酸吡哆醛，使用0.6M硼酸钠(pH 9)调节至pH 8.6。可将聚乙二醇化剂(诸如分子量为5kDa的甲氧基-PEG-CH2COO-NHS)溶解于3mM HCl中，使得实现每毫升HCl约0.2g PEG的最终浓度。可以受控方式将此PEG溶液添加至犬尿氨酸酶溶液中，使得反应混合物中实现PEG与犬尿氨酸酶均二聚体30:1的最终比率。反应可在约22℃下进行30分钟。
然后可使用尺寸排阻色谱法加上多角度光散射对聚乙二醇化均二聚体进行分析，使用TSKgel G3000 SWxl柱以及0.6mL/min的流量，在25mM NaH2PO4、150mM NaCl缓冲液中在25℃下历时25min，产生各相应输入PEG:犬尿氨酸酶比率的色谱图(图1D至图1F)。
由各种PEG:犬尿氨酸酶均二聚体输入比率的所测量聚乙二醇化犬尿氨酸酶分子量(图1A至图1B)以及各PEG:犬尿氨酸酶均二聚体输入比率的聚乙二醇化反应效率(图1C)计算所得每一犬尿氨酸酶单体和均二聚体的PEG分子数目。
实施例2.向罹患恶性肿瘤的患者施用聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体
根据本文所公开的方法，具有本领域技术的医师可治疗患者，诸如人患者，以便减轻或缓解表达IDO1、IDO2或TDO的肿瘤的症状。为此目的，具有本领域技术的医师可向人患者施用聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体。可例如全身地(例如静脉内)、通过直接局部灌注浸泡靶细胞、经由导管、经由灌洗、于脂质组合物(例如脂质体)中或通过如本领域技术人员将已知用于治疗肿瘤的其他方法或前述方法的任何组合向患者施用均二聚体。还可通过多种施用途径(例如静脉内和脑室内)向患者施用均二聚体。示例性犬尿氨酸耗竭量可在0.001至1,000单位(U)的犬尿氨酸酶范围内。
可与聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体组合向患者施用一种或多种抗癌疗法(例如放射疗法、手术疗法、免疫疗法)以消除患者的肿瘤细胞。可将本领域中熟知的细胞消除方法(诸如放射)单独或与一种或多种抗癌或抗过度增殖性疗法组合使用以消除患者的肿瘤细胞。如通过本领域中已知的PET成像技术所评估，这些剂和/或治疗可将肿瘤细胞消除至少5％(例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或更多)。可在用第二或更多抗癌疗法治疗之前或之后例如12小时至1个月(例如12小时、24小时、72小时、1周、2周、3周、4周)或更久向患者施用均二聚体。
可以足以治疗表达IDO1、IDO2或TDO2的肿瘤的量向患者施用均二聚体。还可在治疗之前和之后由医师进行标准检验以评估肿瘤尺寸的变化。可根据治疗中所用的施用途径例如在施用均二聚体之后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更久对患者进行评估。在施用聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体之后在肿瘤位点处肿瘤尺寸减小或局部犬尿氨酸酶浓度降低的发现提供如下指示：所述治疗成功治疗了表达IDO1、IDO2或TDO2的肿瘤。
实施例3.用于体内递送的犬尿氨酸酶均二聚体聚乙二醇化密度的优化
在此实施例中，在室温下使用α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基PEG试剂(CAS#883993-35-9)使具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的经过纯化的犬尿氨酸酶与5,000道尔顿PEG在pH 8.5下缀合30分钟。使用5.5-8mg/ml的犬尿氨酸酶浓度并且直接添加各种摩尔当量的5kDa PEG试剂(100:1、80:1、40:1、20:1以及10:1聚乙二醇化剂与犬尿氨酸酶均二聚体)进行缀合反应。在缀合之后，使用30kDa分子量截止值旋转过滤器将最终产物渗滤至1x磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中，以移除任何残余的游离PEG。通过等度尺寸排阻色谱(SEC)方法使用Superdex 200 10/300柱对样品进行分析(图2A)。
为对聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体进行测试，在右胁腹(right flank)为各雌性BALB/c小鼠(6-8周)皮下接种于0.1ml PBS中的CT-26肿瘤细胞(lxl05)以使肿瘤发展。对动物进行随机化并且使用媒介物(PBS pH7.4)静脉内给药，或当平均肿瘤体积达到约200mm3时开始使用10mg/kg差异聚乙二醇化的具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的犬尿氨酸酶。在给药之后6、24、48、72以及120小时，将小鼠末端放血(每个时间点n＝4只小鼠)并且将血浆样品立即用含酸内标物(IS)溶液中止反应并且进行处理用于犬尿氨酸的LC/MS分析(图2B)。从所有组收集肿瘤样品，用RIPA缓冲液溶解，并且将20μg的肿瘤溶解产物加载至SDS-PAGE凝胶上，用于使用抗PEG抗体(Abcam#abS 1257；1:2000稀释)和抗β-肌动蛋白抗体(Cell Signaling Technology#CST-4967)进行蛋白质印迹分析。检测化学发光信号并且使用Alphaview SA密度测定软件定量个别条带的强度(图2C)。
其他实施方案
在不背离本公开的范围和精神的情况下，所描述的公开内容的各种修改和变化对本领域技术人员来说将为显而易见的。虽然已结合具体实施方案描述了本公开，但应了解不应将如所要求的本公开过度限制于此类具体实施方案。实际上，对所描述的用于执行本公开的模式的对本领域技术人员来说显而易见的各种修改旨在在本公开的范围内。
其他实施方案在权利要求书中。
Figure IDA0003660306320000011
Figure IDA0003660306320000021
Figure IDA0003660306320000031
Figure IDA0003660306320000041
Figure IDA0003660306320000051
Figure IDA0003660306320000061
Figure IDA0003660306320000071
Figure IDA0003660306320000081
Figure IDA0003660306320000091
Figure IDA0003660306320000101

Claims (104)

1.一种共价结合至一个或多个聚乙二醇(PEG)分子的犬尿氨酸酶均二聚体，其中PEG分子与均二聚体的比率为约10:1至约40:1。
2.如权利要求1所述的均二聚体，其中所述PEG分子与均二聚体的比率为约20:1至约30:1，任选其中所述PEG分子与均二聚体的比率为约20:1、21:2、22:1、23:1、24:1或25:1。
3.如权利要求1所述的均二聚体，其中所述PEG分子与均二聚体的比率为约25:1。
4.如权利要求1-3中任一项所述的均二聚体，其中所述PEG分子具有约1kDa至约10kDa的分子量。
5.如权利要求4所述的均二聚体，其中所述PEG分子具有约3kDa至约7kDa的分子量。
6.如权利要求5所述的均二聚体，其中所述PEG分子具有约5kDa的分子量。
7.如权利要求1-6中任一项所述的均二聚体，其中所述PEG分子为直链的。
8.如权利要求1-6中任一项所述的均二聚体，其中所述PEG分子为分支链的。
9.如权利要求1-8中任一项所述的均二聚体，其中所述均二聚体通过一个或多个赖氨酸或半胱氨酸残基共价结合至所述PEG分子。
10.如权利要求9所述的均二聚体，其中所述均二聚体通过一个或多个赖氨酸残基共价结合至所述PEG分子。
11.如权利要求1-10中任一项所述的均二聚体，其中所述均二聚体包含两个多肽单体，所述两个多肽单体各自具有与SEQ ID NO:1具至少85％同一性的氨基酸序列，并且其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1具有一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自由以下组成的组：L8P、K38E、Y47L、I48F、K50Q、I51M、S60N、K64N、D65G、E66K、N67D、N67P、D67S、A68F、A68T、A68V、F71L、F71M、L72N、K84E、E88N、E89K、E89S、E90Q、D92E、K93N、K93T、A95H、A95Q、K96N、I97H、I97L、I97V、A98G、A99G、A99I、A99R、A99S、A99T、A99V、Y100N、Y100S、Y100T、G101A、H102W、E103F、E103H、E103N、E103Q、E103R、E103V、E103W、V104D、V104E、V104F、V104H、V104K、V104L、V104R、G105A、G105H、G105S、G105T、E106D、K106D、K106E、K106H、K106N、R107P、R107S、P108R、I110A、I110F、I110L、I110M、I110T、T111D、T111H、T111N、T111R、G112A、G112C、G112D、G112K、G112L、G112M、G112Q、G112R、G112S、G112T、G112Y、N127K、I131V、A132V、L133V、A136T、L137T、T138S、N140D、H142Q、Q14R、Y156H、K163T、D168E、H169R、Q175L、I183F、I183L、I183P、I183S、E184A、E184D、E184R、E184T、E184V、E185T、M187L、M189I、K191A、K191G、K191H、K191M、K191N、K191R、K191S、K191T、K191W、E197A、E197D、E197F、E197K、E197M、E197Q、E197S、E197T、E197V、I201C、I201E、I201F、1201H、I201L、I201S、I201T、I201V、H203K、L219M、L219W、F220L、V223I、F225Y、H230F、H230L、H230Y、N232S、Y246F、F249W、D250E、S274A、S274C、S274G、S274N、S274T、L278M、A280G、A280S、A280T、G281S、A282M、A282P、G284N、I285L、V303L、V303S、F306W、F306Y、S311N、K315E、D317E、D317K、I331C、I331L、I331N、I331S、I331T、I331V、N333T、P334N、P335T、L337T、L338A、L338Q、S341I、K373E、K373N、N375A、N375H、Y376C、Y376F、Y376L、K378G、K378P、K378Q、K378R、K380G、K380S、A382G、A382R、A382T、T383S、K384G、K384N、P386K、P386S、V387L、N389E、I405L、F407Y、S408D、S408N、N411R、D413S、D413V、Q416T、E419A、E419L、K420E、R421N、V424I、K427M、N429E、G432A以及A436T。
12.如权利要求11所述的均二聚体，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:1具至少90％同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的均二聚体，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:1具至少95％同一性的氨基酸序列。
14.如权利要求11-13中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在A282、F306或F249处包含取代。
15.如权利要求11-14中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在A99处包含取代。
16.如权利要求11-15中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在G112处包含取代。
17.如权利要求11-16中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在E103处包含取代。
18.如权利要求11-17中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在V104处包含取代。
19.如权利要求11-18中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在S408处包含取代。
20.如权利要求11-19中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体包含F306W取代。
21.如权利要求11-20中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体包含L72N取代。
22.如权利要求11-21中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体包含H102W和N333T取代。
23.如权利要求11-22中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体包含I183P取代。
24.如权利要求11-23中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体包含R107P取代。
25.如权利要求11-24中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体包含A436T取代。
26.如权利要求11-25中任一项所述的均二聚体，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1包含至少一个选自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T的取代。
27.如权利要求26所述的均二聚体，其中各多肽单体包含至少两个、三个、四个或五个选自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T的取代。
28.如权利要求27所述的均二聚体，其中各多肽单体包含取代L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T。
29.如权利要求1-28中任一项所述的均二聚体，其中所述均二聚体包含两个多肽单体，所述两个多肽单体各自具有与SEQ ID NO:3具至少85％同一性的氨基酸序列。
30.如权利要求29所述的均二聚体，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:3具至少90％同一性的氨基酸序列。
31.如权利要求30所述的均二聚体，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:3具至少95％同一性的氨基酸序列。
32.如权利要求31所述的均二聚体，其中各多肽单体具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
33.如权利要求1-28中任一项所述的均二聚体，其中所述均二聚体包含两个多肽单体，所述两个多肽单体各自具有与SEQ ID NO:2具至少85％同一性的氨基酸序列。
34.如权利要求33所述的均二聚体，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:2具至少90％同一性的氨基酸序列。
35.如权利要求34所述的均二聚体，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:2具至少95％同一性的氨基酸序列。
36.如权利要求35所述的均二聚体，其中各多肽单体具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
37.如权利要求1-36中任一项所述的均二聚体，其中所述均二聚体具有至少8000M-1s-1的催化活性(k催化/KM)。
38.如权利要求37所述的均二聚体，其中所述均二聚体具有介于约8000M-1s-1与40000M-1s-1；10000M-1s-1与40000M-1s-1；20000M-1s-1与40000M-1s-1；或25000M-1s-1与35000M-1s-1之间的催化活性(k催化/KM)。
39.如权利要求1-38中任一项所述的均二聚体，其中所述PEG分子与均二聚体的比率为约25:1，所述PEG分子具有约5kDa的分子量并且通过N-羟基琥珀酰亚胺酯碳酸酯连接基团结合至所述均二聚体。
40.一种制备聚乙二醇化犬尿氨酸酶均二聚体的方法，其中所述均二聚体包含两个多肽单体，所述方法包括使所述均二聚体与聚乙二醇化剂接触，并且其中聚乙二醇化剂与均二聚体的摩尔输入比率为约10:1至约50:1。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述聚乙二醇化剂与均二聚体的摩尔输入比率为约20:1至约40:1，任选其中所述聚乙二醇化剂与均二聚体的摩尔输入比率为约20:1至约30:1，任选其中所述聚乙二醇化剂与均二聚体的摩尔输入比率为约20:1。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述聚乙二醇化剂与均二聚体的摩尔输入比率为约25:1至约35:1。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述聚乙二醇化剂与均二聚体的摩尔输入比率为约30:1。
44.如权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述PEG分子具有约1kDa至约10kDa的分子量。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述PEG分子具有约3kDa至约7kDa的分子量。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述PEG分子具有约5kDa的分子量。
47.如权利要求40-46中任一项所述的方法，其中所述PEG分子为直链的。
48.如权利要求40-46中任一项所述的方法，其中所述PEG分子为分支链的。
49.如权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述均二聚体通过一个或多个赖氨酸或半胱氨酸残基共价结合至所述PEG分子。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述均二聚体通过一个或多个赖氨酸残基共价结合至所述PEG分子。
51.如权利要求40-50中任一项所述的方法，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:1具至少85％同一性的氨基酸序列，并且其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1具有一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自由以下组成的组：L8P、K38E、Y47L、I48F、K50Q、I51M、S60N、K64N、D65G、E66K、N67D、N67P、D67S、A68F、A68T、A68V、F71L、F71M、L72N、K84E、E88N、E89K、E89S、E90Q、D92E、K93N、K93T、A95H、A95Q、K96N、I97H、I97L、I97V、A98G、A99G、A99I、A99R、A99S、A99T、A99V、Y100N、Y100S、Y100T、G101A、H102W、E103F、E103H、E103N、E103Q、E103R、E103V、E103W、V104D、V104E、V104F、V104H、V104K、V104L、V104R、G105A、G105H、G105S、G105T、E106D、K106D、K106E、K106H、K106N、R107P、R107S、P108R、I110A、I110F、I110L、I110M、I110T、T111D、T111H、T111N、T111R、G112A、G112C、G112D、G112K、G112L、G112M、G112Q、G112R、G112S、G112T、G112Y、N127K、I131V、A132V、L133V、A136T、L137T、T138S、N140D、H142Q、Q14R、Y156H、K163T、D168E、H169R、Q175L、I183F、I183L、I183P、I183S、E184A、E184D、E184R、E184T、E184V、E185T、M187L、M189I、K191A、K191G、K191H、K191M、K191N、K191R、K191S、K191T、K191W、E197A、E197D、E197F、E197K、E197M、E197Q、E197S、E197T、E197V、I201C、I201E、I201F、1201H、I201L、I201S、I201T、I201V、H203K、L219M、L219W、F220L、V223I、F225Y、H230F、H230L、H230Y、N232S、Y246F、F249W、D250E、S274A、S274C、S274G、S274N、S274T、L278M、A280G、A280S、A280T、G281S、A282M、A282P、G284N、I285L、V303L、V303S、F306W、F306Y、S311N、K315E、D317E、D317K、I331C、I331L、I331N、I331S、I331T、I331V、N333T、P334N、P335T、L337T、L338A、L338Q、S341I、K373E、K373N、N375A、N375H、Y376C、Y376F、Y376L、K378G、K378P、K378Q、K378R、K380G、K380S、A382G、A382R、A382T、T383S、K384G、K384N、P386K、P386S、V387L、N389E、I405L、F407Y、S408D、S408N、N411R、D413S、D413V、Q416T、E419A、E419L、K420E、R421N、V424I、K427M、N429E、G432A以及A436T。
52.如权利要求51所述的方法，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:1具至少90％同一性的氨基酸序列。
53.如权利要求52所述的方法，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:1具至少95％同一性的氨基酸序列。
54.如权利要求40-53中任一项所述的方法，其中各多肽单体在A282、F306或F249处包含取代。
55.如权利要求40-54中任一项所述的方法，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在A99处包含取代。
56.如权利要求40-55中任一项所述的方法，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在G112处包含取代。
57.如权利要求40-56中任一项所述的方法，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在E103处包含取代。
58.如权利要求40-57中任一项所述的方法，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在V104处包含取代。
59.如权利要求40-58中任一项所述的方法，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1在S408处包含取代。
60.如权利要求51-59中任一项所述的方法，其中各多肽单体包含F306W取代。
61.如权利要求51-60中任一项所述的方法，其中各多肽单体包含L72N取代。
62.如权利要求51-61中任一项所述的方法，其中各多肽单体包含H102W和N333T取代。
63.如权利要求51-62中任一项所述的方法，其中各多肽单体包含I183P取代。
64.如权利要求51-63中任一项所述的方法，其中各多肽单体包含R107P取代。
65.如权利要求51-64中任一项所述的方法，其中各多肽单体包含A436T取代。
66.如权利要求40-65中任一项所述的方法，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1包含至少一个选自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T的取代。
67.如权利要求66所述的方法，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1包含至少两个、三个、四个或五个选自L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T的取代。
68.如权利要求67所述的方法，其中各多肽单体相对于SEQ ID NO:1包含取代L72N、H102W、A282P、F306W、I331S以及N333T。
69.如权利要求40-68中任一项所述的方法，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:3具至少85％同一性的氨基酸序列。
70.如权利要求69所述的方法，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:3具至少90％同一性的氨基酸序列。
71.如权利要求70所述的方法，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:3具至少95％同一性的氨基酸序列。
72.如权利要求71所述的方法，其中各多肽单体具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
73.如权利要求40-68中任一项所述的方法，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:2具至少85％同一性的氨基酸序列。
74.如权利要求73所述的方法，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:2具至少90％同一性的氨基酸序列。
75.如权利要求74所述的方法，其中各多肽单体具有与SEQ ID NO:2具至少95％同一性的氨基酸序列。
76.如权利要求75所述的方法，其中各多肽单体具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
77.如权利要求40-76中任一项所述的方法，其中所述均二聚体具有至少8000M-1s-1的催化活性(k催化/KM)。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述均二聚体具有介于约8000M-1s-1与40000M-1s-1；10000M-1s-1与40000M-1s-1；20000M-1s-1与40000M-1s-1；或25000M-1s-1与35000M-1s-1之间的催化活性(k催化/KM)。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述PEG分子与均二聚体的比率为约25:1，所述PEG分子具有约5kDa的分子量并且通过N-羟基琥珀酰亚胺酯碳酸酯连接基团结合至所述均二聚体。
80.如权利要求40-79中任一项所述的方法，其中所述均二聚体于水性缓冲液中与所述聚乙二醇化剂接触。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述水性缓冲液包含磷酸二钠。
82.如权利要求80所述的方法，其中所述水性缓冲液包含乙酸钠。
83.如权利要求80-82中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲液的pH值在约7.5至约9.5范围内。
84.如权利要求80-83中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲液的离子强度在约250mM至约350mM范围内。
85.如权利要求40-84中任一项所述的方法，其中使用尺寸排阻色谱法来分离所述均二聚体。
86.一种通过如权利要求40-85中任一项所述的方法制备的犬尿氨酸酶均二聚体。
87.一种药物制剂，所述药物制剂包含含如权利要求1-39以及86中任一项所述的犬尿氨酸酶均二聚体的药学上可接受的载体。
88.一种治疗具有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如权利要求87所述的制剂或如权利要求1-39以及86中任一项所述的酶。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述受试者已被鉴定为具有表达IDO1、IDO2或TDO的肿瘤。
90.如权利要求88或89所述的方法，其中所述肿瘤为实体肿瘤。
91.如权利要求88或89所述的方法，其中所述肿瘤为血液学肿瘤。
92.如权利要求88-91中任一项所述的方法，其中所述受试者为人患者。
93.如权利要求88-92中任一项所述的方法，其中所述制剂按以下方式施用：瘤内、静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌肉内、皮下、结膜下、血管内、经粘膜、心包内、脐内、经口、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸泡靶细胞、经由导管或经由灌洗。
94.如权利要求88-93中任一项所述的方法，所述方法还包括施用第二抗癌疗法。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述第二抗癌疗法为放射疗法、手术疗法、免疫疗法或第二抗癌化合物。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述第二抗癌化合物为免疫检查点抑制剂。
97.如权利要求95所述的方法，其中所述第二抗癌化合物包含抗PDI、抗CTLA-4或抗PD-LI抗体。
98.如权利要求95所述的方法，其中所述第二抗癌化合物为抗体。
99.如权利要求95所述的方法，其中所述第二抗癌化合物为抗体-药物缀合物。
100.如权利要求95所述的方法，其中所述免疫疗法包括施用免疫效应细胞或免疫原性组合物。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述免疫原性组合物包含癌细胞抗原。
102.如权利要求100所述的方法，其中所述免疫效应细胞包括NK细胞或T细胞。
103.如权利要求100所述的方法，其中所述免疫效应细胞包括CAR T细胞。
104.一种在具有肿瘤的人受试者中提供T细胞反应的方法，所述方法包括根据如权利要求88-103中任一项所述的方法向所述受试者施用犬尿氨酸酶均二聚体。
CN202080081803.8A 2019-10-17 2020-10-16 聚乙二醇化犬尿氨酸酶以及其用于治疗癌症的用途 Pending CN114828863A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962916493P 2019-10-17 2019-10-17
US62/916,493 2019-10-17
PCT/US2020/056082 WO2021076966A1 (en) 2019-10-17 2020-10-16 Pegylated kynureninase enzymes and uses thereof for the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114828863A true CN114828863A (zh) 2022-07-29

Family

ID=75492823

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080081803.8A Pending CN114828863A (zh) 2019-10-17 2020-10-16 聚乙二醇化犬尿氨酸酶以及其用于治疗癌症的用途

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20210115416A1 (zh)
EP (1) EP4045067A4 (zh)
JP (1) JP2022551976A (zh)
KR (1) KR20220103944A (zh)
CN (1) CN114828863A (zh)
AU (1) AU2020366452A1 (zh)
BR (1) BR112022007349A2 (zh)
CA (1) CA3154817A1 (zh)
IL (1) IL292239A (zh)
WO (1) WO2021076966A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024085280A1 (ko) * 2022-10-20 2024-04-25 서울대학교 산학협력단 신규한 키뉴레니나제 및 이의 용도

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005286763A1 (en) * 2004-09-17 2006-03-30 Biomarin Pharmaceutical, Inc. Variants and chemically-modified variants of phenylalanine ammonia-lyase
BR112016004095A2 (pt) * 2013-08-30 2017-10-17 Univ Texas administração de enzimas de empobrecimento de quinurenina para a terapia contra tumores
EP3423483A4 (en) * 2016-03-02 2019-08-21 Board Of Regents Of the University Of Texas System VARIANTS OF HUMAN ENZYME KYNURENINASE HAVING IMPROVED PHARMACOLOGICAL PROPERTIES

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020366452A1 (en) 2022-05-05
EP4045067A4 (en) 2023-11-15
JP2022551976A (ja) 2022-12-14
US20210115416A1 (en) 2021-04-22
KR20220103944A (ko) 2022-07-25
BR112022007349A2 (pt) 2022-08-23
IL292239A (en) 2022-06-01
EP4045067A1 (en) 2022-08-24
WO2021076966A1 (en) 2021-04-22
CA3154817A1 (en) 2021-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7029316B2 (ja) 腫瘍の治療のための、キヌレニンを枯渇させる酵素の投与
JP2018154644A (ja) Ｉｌ−２部分とポリマーとのコンジュゲート
JP7080053B2 (ja) 腫瘍の治療のための、キヌレニンを枯渇させる酵素の投与
CN115916811A (zh) 偏向于白介素-2受体βγc二聚体并缀合非肽水溶性聚合物的人白介素-2缀合物
JP7432851B2 (ja) ヒトキヌレニナーゼ酵素及びその使用
JP7313497B2 (ja) アデノシンおよび／またはメチルチオアデノシンの酵素媒介枯渇方法
TW202241522A (zh) 免疫刺激化合物及結合物
EP3902560A1 (en) A peptide-mhc-i-antibody fusion protein for therapeutic use in a patient with amplified immune response
CN114828863A (zh) 聚乙二醇化犬尿氨酸酶以及其用于治疗癌症的用途
JP6820123B2 (ja) Ｃｃｌ３変異体を含む融合タンパク質およびその用途
US20230212247A1 (en) Modified cxcl10 for immunotherapy of cancer diseases
TW202409068A (zh) Ｉｌ—２１多肽和使用方法
TW202417053A (zh) 免疫刺激抗體－藥物結合物
CN115590976A (zh) 治疗和/或预防hiv相关疾病的apc偶联物及其制法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination