CN115916811A - 偏向于白介素-2受体βγc二聚体并缀合非肽水溶性聚合物的人白介素-2缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了白介素‑2(IL‑2)缀合物，其包含相对于结合IL‑2受体αβγc三聚体偏向于结合IL‑2受体βγc二聚体的至少一个或多个氨基酸取代以及在N末端处或附近的缀合至水溶性聚合物的非天然氨基酸。所述IL‑2缀合物可用于在患者中治疗和预防细胞增殖和癌症。

Description

偏向于白介素-2受体βγc二聚体并缀合非肽水溶性聚合物的人白介素-2缀合物
背景技术
(1)发明领域
本发明涉及白介素-2(IL-2)缀合物，其至少包含一个或多个偏向于结合至IL-2受体βγc二聚体而非结合至IL-2受体αβγc三聚体的氨基酸取代以及在N末端处或附近缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸。IL-2缀合物用于在患者中治疗和预防细胞增殖和癌症。
(2)相关技术描述
白介素-2(IL-2)于1965年被鉴定为白细胞培养物中产生的因子，当转移时，IL-2可诱导白细胞母细胞的形成。这种活性背后的因子是40多年前发现的第二种细胞因子，最初将其称为T细胞生长因子(TCGF)。在1979年将TCGF称为IL-2，在1983年克隆了IL-2的cDNA。IL-2治疗癌症(转移性黑色素瘤)的首次获批仅在8年后。IL-2蛋白是测量为15.5kDa的四α-螺旋细胞因子。IL-2由多种细胞类型产生，包括NK T细胞、CD8 T细胞、肥大细胞和树突状细胞，但是IL-2的主要产生者是抗原刺激辅助(CD4)T细胞。
IL-2的作用由三个蛋白亚基组成的复合受体系统介导，即IL-2Rα(CD25)、IL-2Rβ(CD122)和共同的γ链(γc/CD132)(见图1)。CD25以低亲和力结合IL-2(无信号转导)。CD122和CD132形成在CD8 T细胞和NK细胞上表达的中间亲和力二聚体受体(Kd，10-9M)。CD25、CD122和CD132形成高亲和力三聚体受体系统(Kd，10-11M)，其以高亲和力结合IL-2，并且在调节性T细胞(Treg)、活化的T细胞和内皮细胞上表达。由于这种亲和力差异，表达IL-2Rαβγc的细胞将优先结合IL-2。高剂量IL-2激活βγc二聚体，从而激活免疫应答。高剂量IL-2还会激活Treg上的αβγc三聚体，其抑制免疫应答的激活，并且可能导致肿瘤抗原的耐受。
IL-2与IL-2Rβγc或IL-2Rαβγc的结合诱导多个信号转导通路和靶基因的转录。这些通路包括Jak/Stat通路、MAPK通路和PI3K通路。通过这些通路，这种强大的细胞因子诱导CD4和CD8 T细胞的激活、增殖和细胞因子的产生和分化，并且激活NK细胞以促进其细胞溶解功能。此外，IL-2促进对免疫应答具有抑制作用的调节性T细胞(Treg)的诱导。1999年发现的IL-2生物学中的Treg组分说明IL-2在促进或缩小针对外来侵袭者(如病原体或癌症)的炎症免疫应答方面的作用；并且增加了对高剂量IL-2如何通过影响CD8 T细胞和NK细胞的功能来促进抗肿瘤免疫的理解的一定程度的细微差别。
癌症免疫疗法中的IL-2
IL-2是第一个成功用于治疗癌症的细胞因子和免疫疗法。1992年，阿地白介素(aldesleukin)，一种非糖基化人重组IL-2类似物(脱丙氨酰基-1，丝氨酸-125人IL-2)经美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗肾细胞癌(RCC)和转移性黑色素瘤。在这些背景下，高剂量阿地白介素导致约10％的完全缓解，但是具有剂量限制性毒性。由于IL-2的半衰期短(在人中约1小时)，使用IL-2治疗患者需要在15分钟内每8小时通过静脉输注施用约3mg，持续5天共14个剂量；休息5天后，重复该疗法。6-12周后可再进行1-2个疗程的治疗。
很多接受高剂量IL-2方案治疗的患者在开始治疗后3-4天开始出现血管泄漏综合征(VLS)；这种影响通常在治疗的第5-10天是剂量限制性的，导致患者住进重症监护室。这种综合征的特征是血管通透性增加，液体和蛋白从毛细血管渗入组织，导致间质水肿、器官灌注减少和器官损伤。与IL-2相关的最显著的3级和4级不良事件的量化包括低血压和肾功能受损。因为按照批准的推荐剂量施用阿地白介素会引起严重的副作用，包括VLS和中性粒细胞功能受损，FDA要求在上市销售时使用黑框警告。此外，阿地白介素的商业配方包括存在十二烷基硫酸钠，这种物质似乎需要通过构象稳定性保持最佳活性。参见Arakawa等，1994,Int.J.Peptide Protein Res.43:583-587。
由于IL-2的半衰期短和剂量限制性毒性阻碍了其在临床上的应用，研究集中于缓解这些问题。对导致VLS的细胞和分子机制的研究表明，IL-2与CD25(IL-2Rα链)的相互作用是VLS的原因。支持这一假设的数据表明，不能与IL-2Rα相互作用的IL-2半衰期延长突变体或阻断IL-2-IL-2Rα结合相互作用并延长半衰期的抗体在小鼠癌症模型中提供有效性，而不会诱导血管泄漏。为使用基因缺失来证实这种作用，使用仅在免疫系统或仅在非免疫组织中携带CD25缺失的小鼠的骨髓嵌合体发现，IL-2的作用仅需要CD25存在于非免疫组织。这些研究证明了工程化半衰期延长的IL-2分子的可能性，这种分子缺乏毒性驱动特征，同时保持野生型IL-2的抗肿瘤活性。
经过几十年的工程化IL-2分子的尝试，临床上出现了积极的数据。通过称为bempegaldesleukin的阿地白介素的聚乙二醇化前药形式，Nektar Therapeutics似乎在制备半衰期延长、具有偏好性、低剂量IL-2方面取得了进展(NKTR-214；参见美国专利号9861705)。Bempegaldesleukin的11个赖氨酸残基中约有6个结合至可水解的二-10kDa聚乙二醇(PEG)分子以形成非活性前药。在6个PEG部分中的4个水解之后，bempegaldesleukin获得活性，其余PEG中的一个或两个假定以使分子的结合偏向远离IL-2Rα的方式定位。在延长暴露的情况下，聚乙二醇化还使bempegaldesleukin与野生型天然IL-2相比，半衰期大大延长(数天对比数分钟)。
除了治疗增殖性疾病和病症以外，还建议IL-2用于治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、急性髓性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、青少年类风湿关节炎、特应性皮炎、乳腺癌和膀胱癌。
鉴于阿地白介素的毒性及其相对较短的半衰期，需要具有降低毒性和延长半衰期的IL-2类似物。未达到的改善包括稳定性、选择性，例如，在各种IL-2受体形式、给药方案，以及限制副作用。IL-2突变蛋白和缀合物可以为治疗恶性黑色素瘤、肾细胞癌和接受IL-2疗法的其他病症提供改进的治疗方法。
发明内容
本发明在此提供了白介素2(IL-2)多肽，其具有至少一个或多个偏向结合至IL-2受体βγc二聚体(IL-2Rβγc)而非结合IL-2受体αβγc三聚体(IL-2Rαβγc)的氨基酸取代，在IL-2多肽的N末端处或附近结合至水溶性聚合物的非天然氨基酸，以及与野生型或天然人IL-2氨基酸序列在其他方面具有至少80％同一性的氨基酸序列。根据表面等离子体共振(SPR)测定所确定的，这些IL-2缀合物对IL-2Rβγc的结合亲和力与天然IL-2基本相似，并且与天然IL-2相比，对IL-2Rα具有降低的或无法检测到的结合亲和力。因此，与市售IL-2多肽相比，这些IL-2缀合物的毒性降低，并且血浆半衰期是市售IL-2多肽的至少5倍。
本发明提供了一种白介素2(IL-2)缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且还包含：(i)相对于野生型人IL-2降低所述IL-2多肽对人IL-2受体αβγc三聚体(IL-2Rαβγc)的亲和力的一个或多个氨基酸取代；和(ii)在所述IL-2多肽的N末端处或附近用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端处或附近的缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入；其中相对于野生型人IL-2所述IL-2多肽与所述人IL-2受体βγc二聚体(IL-2Rβγc)具有基本上相似的结合亲和力。
在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性，条件是所述IL-2多肽至少包含氨基酸E15、H16、L19、D20、D84、N88、V91、Q126、T123和I129，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的所述氨基酸序列中所示的所述位置。
在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少80％同一性，条件是所述IL-2多肽至少包含氨基酸E15、H16、L19、D20、D84、N88、V91、Q126、T123和I129，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的所述氨基酸序列中所示的所述位置。在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽氨基酸序列包含与SEQID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，条件是所述IL-2多肽至少包含氨基酸E15、H16、L19、D20、D84、N88、V91、Q126、T123和I129，其中所述氨基酸位置对应于SEQ IDNO:53的所述氨基酸序列中所示的所述位置。在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少95％同一性，条件是所述IL-2多肽至少包含氨基酸E15、H16、L19、D20、D84、N88、V91、Q126、T123和I129，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的所述氨基酸序列中所示的所述位置。在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少98％同一性，条件是所述IL-2多肽至少包含氨基酸E15、H16、L19、D20、D84、N88、V91、Q126、T123和I129，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的所述氨基酸序列中所示的所述位置。
在进一步的实施方案中，根据表面等离子体共振测定所确定的，所述IL-2多肽缀合物与所述人IL-2受体α单体(IL-2Rα)具有减少的或不具有可检出的结合。
在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代独立地选自由以下组成的组：K34、T36、R37、T40、F41、K42、F43、Y44、E60、E61、K63、P64、E67、L71、M103、C104和Y106，其中所述氨基酸取代位置对应于SEQ ID NO:53的所述氨基酸序列中所示的所述位置。在进一步的实施方案中，在所述IL-2多肽中的所述一个或多个氨基酸取代在位置R37和F41处。在进一步的实施方案中，在所述IL-2多肽中的所述氨基酸取代是R37A和F41K。在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽还包含使用选自由A和S组成的组的氨基酸在位置124处取代半胱氨酸残基：，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53中的所述氨基酸序列中所示的所述氨基酸的所述位置。在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽还包含N末端丙氨酸残基或甲硫氨酸残基。在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽还包含C末端HIS6标签。
在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸被对应于SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列的前10个氨基酸内的位置的氨基酸取代或者插入所述序列内。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸被对应于SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列的P1至Q10的序列内的位置或者插入P1至Q10之间的所述序列内。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸用于取代在位置P1、T2、S3、S4、S5、T6、K7、K8或T9处的氨基酸，或者通过酰胺键连接至N末端氨基酸。在进一步的实施方案中，非天然氨基酸在位置P1、T2、S3、S4、S5、T6、K7、K8或T9处的氨基酸后插入。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸位于对应于SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列的位置4的所述氨基酸位置处。
在进一步的实施方案中，其中所述非天然氨基酸包含官能团且所述水溶性聚合物连接至能够与所述官能团反应以形成共价键的反应性基团。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸选自由以下组成的组：对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对炔丙基氧基-苯丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸、硒半胱氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸和对炔丙基氧基苯丙氨酸。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸是对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物具有1kDa至100kDa之间的平均分子量。在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物具有约30kDa的平均分子量。在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或其组合。在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物是线性或支链PEG。
在进一步的实施方案中，连接至所述反应性基团的所述非肽水溶性聚合物具有下式：
(RG)-(接头)-(POLY)-x
其中RG是能够与非天然氨基酸的官能团形成共价键的反应性基团；接头是共价键或者取代的或非取代的C1-20烷基；POLY是非肽水溶性聚合物；和x是在所述POLY末端处的醇或甲基基团。
在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含炔，且所述非天然氨基酸的所述官能团包含叠氮化物，或者所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含叠氮化物，且所述非天然氨基酸的所述官能团包含炔。
在进一步的实施方案中，连接至所述反应性基团的所述非肽水溶性聚合物具有下式：
Figure BDA0003985829980000071
其中n是约681。
在进一步的实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中所示的所述氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，所述白介素2(IL-2)缀合物具有下式：
Figure BDA0003985829980000081
其中n是约681，或或其具有下式的区域异构体
Figure BDA0003985829980000082
其中n是约681。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含：前述实施方案中任一项所述的IL-2缀合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种在个体中用于治疗增殖性疾病或癌症的方法，其包括：向有需要的个体施用治疗有效量的本文公开的IL-2缀合物的任一实施方案或其的组合物，以在所述个体中治疗所述增殖性疾病或癌症。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于在个体中治疗增殖性疾病或癌症的联合疗法，其包括：向有需要的个体施用治疗有效量的本文公开的IL-2缀合物的任一实施方案或其的组合物，和向所述个体施用治疗有效量的治疗剂，在进一步的实施方案中，所述治疗剂是抗PD1抗体或抗PDL1抗体。在进一步的实施方案中，在施用所述治疗剂之前施用所述IL-2缀合物或组合物。在进一步的实施方案中，在施用所述治疗剂之后施用所述IL-2缀合物或组合物。在进一步的实施方案中，所述IL-2缀合物或组合物与所述治疗剂同时施用。
本发明还提供了根据本文公开的IL-2缀合物的任一实施方案的IL-2缀合物或其组合物用于治疗增殖性疾病或癌症的用途。在进一步的实施方案中，提供了治疗剂和根据本文公开的IL-2缀合物的任一实施方案的IL-2缀合物或其组合物用于治疗增殖性疾病或癌症的用途。在进一步的实施方案中，所述治疗剂是抗PD1抗体或抗PDL1抗体。
本发明还提供了本文公开的IL-2缀合物的任一实施方案的IL-2缀合物或其组合物在制备用于治疗增殖性疾病或癌症的药物中的用途。
本发明还提供了一种IL-2缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQ IDNO:53中所示的所述氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且还包含：(i)一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸取代：K34、T36、R37、T40、F41、K42、F43、Y44、E60、E61、K63、P64、E67、L71、M103、C104和Y106；和(ii)在所述IL-2多肽的N末端处或附近用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端处或附近的缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的所述氨基酸序列中所示的所述位置。
在特定实施方案中，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的所述氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，并且还包含：(i)一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸取代：K34、T36、R37、T40、F41、K42、F43、Y44、E60、E61、K63、P64、E67、L71、M103、C104和Y106；和(ii)在所述IL-2多肽的N末端处或附近用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端处或附近的缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的所述氨基酸序列中所示的所述位置。
在特定实施方案中，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的所述氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且还包含：(i)一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸取代：K34、T36、R37、T40、F41、K42、F43、Y44、E60、E61、K63、P64、E67、L71、M103、C104和Y106；和(ii)在所述IL-2多肽的N末端处或附近用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端处或附近的缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的所述氨基酸序列中所示的所述位置。
在特定实施方案中，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的所述氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且还包含：(i)一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸取代：K34、T36、R37、T40、F41、K42、F43、Y44、E60、E61、K63、P64、E67、L71、M103、C104和Y106；和(ii)在所述IL-2多肽的N末端处或附近用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端处或附近的缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的所述氨基酸序列中所示的所述位置。
在进一步的实施方案中，在所述IL-2多肽中的所述一个或多个氨基酸取代在位置R37和F41处。在进一步的实施方案中，在所述IL-2多肽中的所述氨基酸取代是R37A和F41K。在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽还包含在位置124处的半胱氨酸残基被选自A和S组成的组的氨基酸取代，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53所示的所述氨基酸序列中的氨基酸位置。在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽还包含N末端丙氨酸残基。
在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸被对应于SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列的前10个氨基酸内的位置的氨基酸取代或者插入所述序列内。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸被对应于SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列的P1至Q10的序列内的位置或者插入P1至Q10之间的所述序列内。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸用于取代在位置P1、T2、S3、S4、S5、T6、K7、K8或T9处的氨基酸，或者通过酰胺键连接至N末端氨基酸。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸位于对应于SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列的位置4的所述氨基酸位置处。
在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸包含官能团，并且所述水溶性聚合物连接至能够与所述官能团反应以形成共价键的反应性基团。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸选自由以下组成的组：对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对炔丙基氧基-苯丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸、硒半胱氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸和对炔丙基氧基苯丙氨酸。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸是对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物具有1kDa至100kDa之间的平均分子量。在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物具有约30kDa的平均分子量。在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或其组合。在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物是线性或支链PEG。
在进一步的实施方案中，连接至所述反应性基团的所述非肽水溶性聚合物具有下式：
(RG)-(接头)-(POLY)-x
其中RG是能够与非天然氨基酸的官能团形成共价键的反应性基团；接头是共价键或者取代的或非取代的C1-20烷基；POLY是非肽水溶性聚合物；和x是在所述POLY末端处的醇或甲基基团。
在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含炔，且所述非天然氨基酸的所述官能团包含叠氮化物，或者所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含叠氮化物，且所述非天然氨基酸的所述官能团包含炔。
在进一步的实施方案中，连接至所述反应性基团的所述非肽水溶性聚合物具有下式：
Figure BDA0003985829980000121
其中n是约681。
在进一步的实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中所示的所述氨基酸序列。
本发明还提供了一种组合物，其包含：本文公开的IL-2缀合物的任何实施方案的所述IL-2缀合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供了一种在个体中治疗增殖性疾病或癌症的方法，其包括：向有需要的个体施用治疗有效量的本文公开的IL-2缀合物的任一实施方案的所述IL-2缀合物或其组合物，以在所述个体中治疗所述增殖性疾病或癌症。
本发明还提供了一种用于在个体中治疗增殖性疾病或癌症的联合疗法，其包括：向有需要的个体施用治疗有效量的本文公开的IL-2缀合物的任一实施方案的所述IL-2缀合物或其组合物，和向个体施用治疗有效量的治疗剂，以在所述个体中治疗所述增殖性疾病或癌症。在进一步的实施方案中，所述治疗剂是抗PD1抗体或抗PDL1抗体。在进一步的实施方案中，所述治疗剂是抗PD1在施用所述治疗剂之前在所述治疗剂施用之前施用所述IL-2缀合物或组合物。在进一步的实施方案中，在施用所述治疗剂之后施用所述IL-2缀合物或组合物。在进一步的实施方案中，所述IL-2缀合物或组合物与所述治疗剂同时施用。
本发明还提供了根据本文公开的IL-2缀合物的任一实施方案的所述IL-2缀合物或其组合物用于治疗增殖性疾病或癌症的用途。
本发明还提供了治疗剂和根据本文公开的IL-2缀合物的任一实施方案的所述IL-2缀合物或其组合物用于治疗增殖性疾病或癌症的用途。在进一步的实施方案中，所述治疗剂是抗PD1抗体或抗PDL1抗体。
本发明还提供了本文公开的IL-2缀合物的任一实施方案的所述IL-2缀合物或其组合物在制备用于治疗增殖性疾病或癌症的药物中的用途。
本发明还提供了IL-2缀合物，其包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中所示的所述氨基酸序列。在进一步的实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含所述IL-2缀合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供了一种IL-2部分，其包含在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种白介素2(IL-2)缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的所述氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且还包含：在所述IL-2多肽的N末端处或附近用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端处或附近的缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入，条件是所述IL-2多肽至少包含氨基酸E15、H16、L19、D20、K34、T36、R37、T40、F41、K42、F43、Y44、E60、E61、K63、P64、E67、L71、D84、N88、V91、M103、C104、Y106、Q126、T123和I129，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的所述氨基酸序列中所示的所述位置。
在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽还包含在位置124处的半胱氨酸残基被选自由A和S组成的组的氨基酸取代。
在进一步的实施方案中，所述IL-2多肽还包含N末端丙氨酸残基。
在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸被对应于SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列的前10个氨基酸内的位置的氨基酸取代或者插入所述序列内。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸被对应于SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列的P1至Q10的序列内的位置或者插入P1至Q10之间的所述序列内。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸用于取代在位置P1、T2、S3、S4、S5、T6、K7、K8或T9处的氨基酸，或者通过酰胺键连接至N末端氨基酸。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸位于对应于SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列的位置4的所述氨基酸位置处。
在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸包含官能团，并且所述水溶性聚合物连接至能够与所述官能团反应以形成共价键的反应性基团。
在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸选自由以下组成的组：对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对炔丙基氧基-苯丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸、硒半胱氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸和对炔丙基氧基苯丙氨酸。在进一步的实施方案中，所述非天然氨基酸是对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物具有1kDa至100kDa之间的平均分子量。在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物具有约30kDa的平均分子量。在进一步的实施方案中，根据权利要求65所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或其组合。在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物是线性或支链PEG。
在进一步的实施方案中，所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含炔，且所述非天然氨基酸的所述官能团包含叠氮化物，或者所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含叠氮化物，且所述非天然氨基酸的所述官能团包含炔。
在进一步的实施方案中，包含所述炔的所述非肽水溶性聚合物具有下式：
Figure BDA0003985829980000161
其中n是约681。
在进一步的实施方案中，所述IL-2缀合物包含在SEQ ID NO:22中所示的所述氨基酸序列。
本发明还提供了本文公开的任何实施方案，其中非天然氨基酸并未具体地鉴定为用于取代位置4的丝氨酸残基，因为其对应于SEQ ID NO:2的位置4，实施方案其中非天然氨基酸的取代或插入在N末端区域内，例如，(i)在所述IL-2多肽的N末端的前30个氨基酸内用结合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸取代氨基酸或在所述IL-2多肽的N末端的前30个氨基酸内插入结合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸，或者(ii)在所述IL-2多肽的N末端的前20个氨基酸内用结合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸取代氨基酸或在所述IL-2多肽的N末端的前20个氨基酸内插入结合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸。
因此，本发明提供了(a)IL-2缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQID NO:53中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且还包含：(i)相对于野生型人IL-2降低所述IL-2多肽对人IL-2Rαβγc的亲和力的一个或多个氨基酸取代；和(ii)在所述IL-2多肽的N末端区域内用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端区域内缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入；其中相对于野生型人IL-2所述IL-2多肽对所述人IL-2Rβγc具有基本上相似的结合亲和力。
在特定实施方案中，本发明提供了(a)IL-2缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的所述氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且还包含：(i)相对于野生型人IL-2降低所述IL-2多肽对人IL-2Rαβγc的亲和力的一个或多个氨基酸取代；和(ii)在所述IL-2多肽的N末端的前30个氨基酸内用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端的前30个氨基酸内缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入；其中相对于野生型人IL-2所述IL-2多肽对所述人IL-2Rβγc具有基本上相似的结合亲和力；和(b)IL-2缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的所述氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且还包含：(i)相对于野生型人IL-2降低所述IL-2多肽对人IL-2Rαβγc的亲和力的一个或多个氨基酸取代；和(ii)在所述IL-2多肽的N末端的前20个氨基酸内用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端的前20个氨基酸内缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入；其中相对于野生型人IL-2所述IL-2多肽对所述人IL-2Rβγc具有基本上相似的结合亲和力。
附图说明
图1显示了IL-2与低亲和力(α)、中亲和力(βγc)和高亲和力(αβγc)IL-2受体的相互作用。IL-2以低亲和力结合α单体(无信号转导)。IL-2以中亲和力结合βγc二聚体。βγc二聚体在CD8+T细胞和NK细胞上表达。IL-2以高亲和力结合αβγc三聚体。αβγc三聚体在Treg和活化的T细胞上表达。高剂量IL-2激活βγc二聚体，其激活免疫应答。然而，高剂量还激活Treg上的αβγc三聚体，其抑制免疫应答的激活，并且可能导致肿瘤抗原的耐受。
图2A显示了Ald-6HIS取代变体K34D、T36D、R37G、T40D、F41L、K42G和Y44V与固化的生物素标记的IL-2Rα或生物标记的IL-2Rβ的平衡结合。
图2B显示了ald6HIS取代变体E60T、E61S、K63G、P64A、E67G和L71I与固化的生物素标记的IL-2Rα或生物素标记的IL-2Rβ的平衡结合。
图2C显示了Ald-6HIS取代变体E60T/E61S、E60T/P64A、E61S/P64A、E61S/Y106A、E60T/E61S/P64A、E61S/P64A/Y106A和E61S与固化的生物素标记的IL-2Rα或生物素标记的IL-2Rβ的平衡结合。
图3显示了(i)表达IL-2Rαβγc的小鼠CTLL2 STAT5报告子细胞测定的结果，其比较STAT5通路被阿地白介素、CON2和CON1的激活；(ii)表达IL-2Rαβγc的人Kit225-STAT5报告子细胞测定的结果，其比较STAT5通路被阿地白介素、CON2和CON1的激活；(iii)表达IL-2Rαβγc的人NK92细胞测定的结果，其比较阿地白介素、CON2和CON1的增殖活性；以及(iv)表达IL-2Rβγc的人DERL-7细胞测定的结果，其比较阿地白介素、CON2和CON1的增殖活性。显示了三次独立实验的代表性数据。
图4A比较CON1和CON2在从人供体#1分离的外周血单核细胞(PBMC)中的原代人Treg细胞(表达IL2Rαβγc)和CD8+CTL细胞(表达IL2Rβγc)中激活STAT5通路的能力。
图4B比较CON1和CON2在从人供体#2分离的PBMC中的原代人Treg细胞(表达IL2Rαβγc)和CD8+CTL细胞(表达IL2Rβγc)中激活STAT5通路的能力。
图5A显示了使用表达IL2Rαβγc和STAT5-荧光素酶报告子的Kit225细胞的测定结果。
图5B显示了使用仅表达IL2Rβγc的CD25敲除Kit225细胞的测定结果。
图6显示了在小鼠中以10mg/kg的CON1单剂量IV治疗7天，极大增加脾脏和PB的CD8+、Teff记忆和NK细胞的百分比，这导致CD8+/Treg比率增加。每个细胞群报告为来自脾脏和外周血(PB)的CD45+免疫细胞百分比(每个治疗组4只动物)。PB中较低的细胞计数导致较高的误差线。由于回收的细胞不足，将来自PB载剂组的两只动物、来自脾脏载剂组的一只动物和来自脾脏CON2组的一只动物从数据分析中排除。
图7显示了与野生型相比具有30kDa PEG的IL-2变体具有延长的PK曲线。静脉团注施用0.8mg/kg剂量后，在C57BL/6小鼠中CON1、CON2和阿地白介素总抗体的平均血浆浓度-时间曲线。通过ELISA，使用抗人IL-2抗体确定血浆浓度。数据以平均值±标准差(SD)表示。
图8A显示了响应于对携带已建立的B16F10同基因小鼠黑色素瘤的动物静脉内施用q7dx2的有效剂量(indicated doses)的CON1或CON2的肿瘤生长曲线。箭头表示治疗。在第9天使用单因素ANOVA结合Dunnett多重比较检验对肿瘤尺寸进行统计学分析。将小于5％的概率(p小于0.05)认为是显著的。P-值：*＝p小于0.5，**p小于0.01，****p小于0.0001。
图8B显示了响应于有效剂量的CON1或CON2的治疗在携带同基因小鼠黑色素瘤肿瘤模型B16F10的动物中的体重变化百分比。计算相对于施用第一天治疗的动物体重的体重变化百分比。数据以平均值±SEM表示(n＝每组8只)。箭头表示治疗。
图9A显示了响应于对携带已建立的B16F10同基因小鼠黑色素瘤的动物静脉内施用q7dx2 5mg/kg CON1的肿瘤生长曲线。箭头表示治疗。在第10天使用单因素ANOVA结合Dunnett多重比较检验对肿瘤尺寸进行统计学分析。将小于5％的概率(p小于0.05)认为是显著的。*＝p小于0.5。
图9B显示了响应于CON1的治疗在携带同基因小鼠黑色素瘤肿瘤模型B16F10的动物中的体重变化百分比。计算相对于施用第一天治疗的动物体重的体重变化百分比。箭头表示治疗。数据以平均值±SEM表示(n＝每组8只)。
图10A-J显示了在携带B16F10肿瘤的动物中单次静脉内给予5mg/kg CON1或CON2后的免疫细胞改变和肿瘤应答。使用Miltenyi Biotec Inc.的试剂盒(目录号#130-096-730)制备治疗后第3、7和10天收获的B16F10肿瘤的单细胞悬液。
图10A显示了如通过流式细胞术所测量的并以总活细胞百分比标准化的单次静脉内给予5mg/kg CON1或CON2后肿瘤浸润CD8 T细胞(克隆53-6.7)的变化。数据以平均值±SEM表示(n＝每组5只)。
图10B显示了如通过流式细胞术所测量的并以总活细胞百分比标准化的单次静脉内给予5mg/kg CON1或CON2后表达颗粒酶B的肿瘤浸润CD8 T细胞(GrnzB+，克隆GB11)的变化。数据以平均值±SEM表示(n＝每组5只)。
图10C显示了如通过流式细胞术所测量的并以总活细胞百分比标准化的单次静脉内给予5mg/kg CON1或CON2后肿瘤浸润CD4 T细胞(克隆GK1.5)的变化。数据以平均值±SEM表示(n＝每组5只)。
图10D显示了如通过流式细胞术所测量的并以总活细胞百分比标准化的单次静脉内给予5mg/kg CON1或CON2后肿瘤浸润Foxp3+(克隆FJK-16s)CD4调节性T细胞(Treg)的变化。数据以平均值±SEM表示(n＝每组5只)。
图10E显示了如通过流式细胞术所测量的并以总活细胞百分比标准化的单次静脉内给予5mg/kg CON1或CON2后肿瘤浸润NKp46+(克隆29A1.4)总NK细胞的变化。数据以平均值±SEM表示(n＝每组5只)。
图10F显示了如通过流式细胞术所测量的并以总活细胞百分比标准化的单次静脉内给予5mg/kg CON1或CON2后肿瘤浸润NKp46+Thy1.2+(克隆53-2.1)NKT细胞的变化。数据以平均值±SEM表示(n＝每组5只)。
图10G显示了如通过流式细胞术所测量的并以总活细胞百分比标准化的单次静脉内给予5mg/kg CON1或CON2后表达GrnzB+的肿瘤浸润NKT细胞的变化。数据以平均值±SEM表示(n＝每组5只)。
图10H显示了单次静脉内给予5mg/kg CON1或CON2后在B16F10肿瘤中CD8与Treg的治疗比率的变化。数据以平均值±SEM表示(n＝每组5只)。
图10I显示了单次静脉内给予5mg/kg CON1或CON2后在B16F10肿瘤中NKT与Treg的治疗比率的变化。数据以平均值±SEM表示(n＝每组5只)。
图10J显示了响应于单次静脉内给予5mg/kg CON1或CON2的B16F10肿瘤生长曲线。数据以平均值±SEM表示(n＝每组5只)。
图11显示了当以5mg/kg剂量CON2和CON1和以1mg/kg剂量5PEG向小鼠静脉内注射时，与NKTR-214类似物5PEG相比，在初免小鼠的血液中CON2和CON1具有快速且稳健的pSTAT5体内活性。注射后，收集注射后1小时，1、3、5、7和10天的血液。将收集的全血立即固体并透化，以针对谱系标志物和磷酸-STAT5染色。对每组5只小鼠的CD4、CD8+和NK细胞进行门控，以针对每种化合物在每个时间点通过流式细胞术监测pSTAT5。图12A-12J显示了来自在非人灵长类(NHP)中CON1和CON2的重复剂量药代动力学(PK)、药效学(PD)研究的关键结果。在实验中，将初免雄性食蟹猴随机分成两组(n＝2/组)。在第1天和第8天，静脉团注给予动物0.3和1mg/kg CON1(批号ADC-004D)或者0.1和0.3mg/kg CON2(批号ADC-0048)，并在末次给药后监测两周。施用药物后(用虚线表示)，在多个时间点采集血样进行血液学分析(全血细胞技术和分群)，并且通过流式细胞术方法表征各种淋巴细胞群。
图12A和图12B显示了在有效剂量下NHP中嗜酸性粒细胞的CON1或CON2相关变化。在指定时间点绘制单个动物的数据，实线和虚线表示可用的两只动物的平均值，或者每组中单个动物的平均值。
图12C和图12D显示了在有效剂量下NHP中总淋巴细胞的CON1或CON2相关变化。在指定时间点绘制单个动物的数据，实线和虚线表示可用的两只动物的平均值(只要可用)，或者每组中单个动物的平均值。
图12E和图12F显示了在有效剂量下NHP中基于FAC剖析的细胞毒性T细胞(CTL)的CON1或CON2相关变化。在指定时间点绘制单个动物的数据，实线和虚线表示可用的两只动物的平均值，或者每组中单个动物的平均值。
图12G和图12H显示了使用CON1或CON2给药后在有效剂量下NHP中基于FAC剖析的调节性T细胞(Treg细胞)的CON1和CON2相关变化。在指定时间点绘制单个动物的数据，实线表示可用的两只动物的平均值(只要可用)，或者每组中单个动物的平均值。
图12I和图12J显示了在有效剂量下NHP中基于FAC剖析的自然杀伤细胞(NK细胞)的CON1或CON2相关变化。在指定时间点绘制单个动物的数据，实线表示可用的两只动物的平均值(只要可用)，或者每组中单个动物的平均值。
图13A和图13B显示了如图12E至图12H中所描述给药的NHP中CD8+：Treg比率的CON1和CON2相关变化。在指定时间点的单个动物数据以条形图表示。每个图中的虚线表示每只动物的给药前水平。
图14A显示了IL-2(阿地白介素)与IL-2Rαβγ三聚体的相互作用。
图14B显示了图A中与IL-2Rα界面处的天然IL-2R37/F41残基，并强调了其与IL-2Rα残基的相互作用。图B显示了在与IL-2Rα的界面处具有R37A/F41K取代的IL-2突变体，显示了F41K取代与IL-2Rα残基的冲突以及R37A取代静电相互作用的损失。
图15A显示了成熟天然人IL-2的序列。
图15B显示了成熟阿地白介素的序列，其中氨基酸位置通过编号方案A确定。
图15C显示了成熟阿地白介素的序列，其中氨基酸位置通过编号方案B确定。
图15D显示了成熟CON1的序列，其中氨基酸位置通过编号方案A确定。
图15E显示了成熟CON1的序列，其中氨基酸位置通过编号方案B确定。
图16A显示了在CT26小鼠模型中1mg/kg剂量的阿地白介素作为单一疗法或与mDX400一起作为联合疗法用于减小肿瘤体积的有效性。
图16B显示了在CT26小鼠模型中5mg/kg剂量的CON1作为单一疗法或与mDX400一起作为联合疗法用于减小肿瘤体积的有效性。
图16C显示了在CT26小鼠模型中10mg/kg剂量的CON1作为单一疗法或与mDX400一起作为联合疗法用于减小肿瘤体积的有效性。
图17A显示了图16A中显示的每个治疗组中的单个动物肿瘤体积。
图17B显示了图16B中显示的每个治疗组中的单个动物肿瘤体积。
图18A显示了图16A中显示的每个治疗组中的单个动物体重变化。
图18B显示了图16B中显示的每个治疗组中的单个动物体重变化。
具体实施方案
定义
除非另有说明，否则如本文所用，术语“白介素-2”或“IL-2”指来自任何脊椎动物来源的任何野生型或天然IL-2，包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。该术语涵盖未加工的IL-2以及缺乏N末端前导信号序列的任何成熟形式的IL-2。该术语还涵盖IL-2的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。成熟人IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中所示。未加工的人IL-2还包含N末端20个氨基酸的信号肽，其在成熟的人IL-2分子中不存在。人成熟IL-2具有三个半胱氨酸残基，即，C58、C105和C125，其中C58和C105通过二硫键分子内连接(Tsuji等，1987,J.Biochem.26:129-134)。已发现在大肠杆菌中表达的N-末端丙氨酸残基(desAla1或desA1)缺失且在位置125处半胱氨酸被丝氨酸取代(C125S取代)的重组成熟人IL-2在体外复性后具有生物活性(Wang等，1984,Science,224:1431-1433；Yun等，1988,Kor.J.Biochem.22:120-126)。该分子具有非专利名阿地白介素。
在本领域中，有两种方案用于对desA1 IL-2分子中的氨基酸位置进行编号，如图15A-15D所示。在编号方案A中，desA1 IL-2分子中的氨基酸从N末端倒数第二个氨基酸的数字1开始编号(图15B、图15C和图15D)。在编号方案B中，desA1 IL-2分子中的氨基酸根据天然成熟IL-2的氨基酸序列进行编号，因此从N末端倒数第二个氨基酸的数字2开始编号(图15E)。
如本文所用，氨基酸位置可以如下表示：氨基酸后紧跟位置编号；例如，Trp26或W26。在进行取代的情况下，被进行的氨基酸取代在位置编号之后；例如，Trp26Cys或W26C。在该非限制性示例中，Trp26Cys或W26C表示位置26的氨基酸色氨酸(Trp或W)变为半胱氨酸(Cys或C)。
如本文所用，术语“IL-2突变体”或“突变体IL-2多肽”或“突变体IL-2”指IL-2多肽，天然人IL-2或desAla1、C125S IL-2(例如，阿地白介素)其中任何一个都具有至少一个被天然氨基酸进行的氨基酸取代，该天然氨基酸影响或抑制IL-2与CD25的相互作用。IL-2突变体多肽还可以包含C125S或A取代。IL-2突变体可以是全长的(即，具有N末端丙氨酸残基)和截短的(即，缺乏N末端丙氨酸)。除非另有说明，否则在本文中可以将IL-2突变体称为IL-2突变体肽序列、IL-2突变体多肽、IL-2突变体蛋白或IL-2突变体类似物。
如本文所用，术语“IL-2部分”指IL-2突变体或desAla1、C125S IL-2(例如，阿地白介素)，其中任何一个都具有人IL-2活性和至少一个具有官能团的非天然氨基酸，例如，亲电基团或亲核基团，其适合与非肽水溶性聚合物的反应性基团反应。如以下将进一步详细解释的，本领域普通技术人员可以确定任何给定IL-2部分是否具有IL-2活性。
如本文所用，术语“IL-2缀合物”指与非肽水溶性聚合物缀合的IL-2部分。IL-2部分可以通过共价键直接连接至非肽水溶性聚合物的反应性基团或在其内部，或者IL-2部分可以通过与非肽水溶性聚合物连接的接头的官能团间接连接到非肽水溶性聚合物。
如本文所用，术语“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”可以互换使用，并且涵盖任何非肽水溶性聚(环氧乙烷)。通常，根据本发明使用的PEG包含下式“-(OCH2CH2)n-”，其中(n)是2至4000。如本文所用，PEG还包括“-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-”和“-(OCH2CH2)nO-”，这取决于末端氧是否被替代，例如，在合成转化过程中。在整个说明书和权利要求书中，应记住术语“PEG”包括具有各种末端或“封端”基团等结构。术语“PEG”还意指含有大部分，即大于50％的-OCH2CH2-重复亚基的聚合物。关于具体形式，PEG可以采用任何数量的各种分子量以及结构或几何形状，例如“支链”、“线性”、“叉形”、“多功能”等，将在下文中更加详细地描述。
如本文所用，术语在“非肽水溶性聚合物”聚合物中的“水溶性”是在室温下可溶于水的任何非肽聚合物。通常，水溶性聚合物在过滤后将透射由相同溶液透射的光的至少约75％，更优选至少约95％。以重量计，水溶性聚合物优选至少约35％(重量)溶于水，更优选至少约50％(重量)溶于水，另外更优选约70％(重量)溶于水，另外更优选约85％(重量)溶于水。然而，最优选水溶性聚合物约95％(重量)溶于水或完全溶于水。
在非肽水溶性聚合物如PEG的背景下，分子量可以表示为数均分子量或重均分子量。除非另有说明，否则本文中所有提及的分子量均指重均分子量。分子量确定，数均和重均，均可以使用凝胶渗透色谱或其他液相色谱技术进行测量。
还可以使用其他测量分子量值的方法，如使用端基分析或依数性质测量(例如，冰点降低、沸点升高或渗透压)来确定数均分子量或使用光散射技术、超速离心或粘度测定来确定重均分子量。本发明的聚合物通常是多分散的(即，聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，具有优选小于约1.2、更优选小于约1.15、另外更优选小于约1.10、再另外更优选小于约1.05、最优选小于约1.03的低多分散性值。
如本文所用，当与特定官能团或反应性基团结合使用时，术语“活性”、“反应性”或“活性”是指容易与另一分子上的亲电体或亲核体反应的反应性官能团或反应性基团。这与那些需要强催化剂或非常不切实际的反应条件才能反应的基团(即，“非反应性”或“惰性基团”)形成对比。如本文所用，反应性基团与官能团相互作用，以在两者之间形成共价键。
如本文所用，术语“官能团”或“反应性基团”的任何其同义词意在涵盖其受保护形式以及未受保护形式。
如本文所用，术语“接头”指能够在反应性基团和非肽水溶性聚合物之间形成至少两个共价键的分子部分。
如本文所用，术语“水解稳定的”键(linkage)或键(bond)指化学键，通常是共价键，其在水中基本上是稳定的，也就是说，在生理条件下在很长一段时间内不会发生任何明显程度的水解。水解稳定的键的示例包括但不限于以下：碳-碳键(例如，在脂肪链中)、醚、酰胺、氨基甲酸酯、三唑等。通常，水解稳定的键是在生理条件下表现出小于约1-2％/天的水解速率的键。代表性化学键的水解速率可以在大多数标准化学教科书中找到。
如本文所用，术语“氨基酸”指二十种常见的天然氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、丙氨酸(Phe；L)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
天然编码的氨基酸是本领域技术人员公知的蛋白型氨基酸。其包括20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、阿斯酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及不太常见的吡咯赖氨酸和硒胞嘧啶。天然编码的氨基酸包括22种天然存在的氨基酸的翻译后变体，如异戊二烯化氨基酸、异戊二烯基化氨基酸、肉豆蔻酰化氨基酸、棕榈酰化氨基酸、N-连接糖基化氨基酸、O-连接糖基化氨基酸、磷酸化氨基酸和酰化氨基酸。
如本文所用，术语“非天然氨基酸”或“NNAA”或“非天然氨基酸”或“UAA”均指不是蛋白原氨基酸的氨基酸或其翻译后修饰的变体。特别地，该术语不是20种常见氨基酸之一或吡咯赖氨酸或硒半胱氨酸或者其翻译后修饰的变体的氨基酸。非天然氨基酸的示例包括但不限于对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对炔丙基氧基-苯丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸、硒半胱氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸和对炔丙基氧基苯丙氨酸。
如本文所用，术语“正交”指与细胞或翻译系统的内源性的或无法与细胞的内源性组分起作用的对应分子相比，以降低的效率与细胞的内源性组分起作用的分子(例如，正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))。在tRNA和氨酰-tRNA合成酶的上下文中，正交指与内源性tRNA与内源性tRNA合成酶起作用相比不能或以降低的效率，例如，低于20％有效、低于10％有效、低于5％有效或低于1％有效的正交tRNA与内源性tRNA合成酶起作用，或者与内源性tRNA合成酶与内源性tRNA起作用相比不能或以降低的效率的正交氨酰tRNA合成酶与内源性tRNA合成酶起作用。正交分子缺乏细胞中的官能性内源性互补分子。例如，当与内源性RS对内源性tRNA的氨酰化相比时，细胞中的正交tRNA被细胞的任何内源性RS以效率降低甚至为零氨酰化。在另一个示例中，与内源性RS对内源性tRNA的氨酰化相比，正交RS氨酰化目标细胞中的任何内源性tRNA的效率降低甚至为零。可以将第二正交分子引入与第一正交分子一起起作用的细胞中。例如，正交tRNA/RS对包括引入的互补组分，所述互补组分在细胞中中共同发挥作用，其效率(例如，50％效率、60％效率、70％效率、75％效率、80％效率、90％效率、95％效率或99％或更高效率)与相应的tRNA/RS内源对相同。
如本文所用，术语“互补”指正交对的组分，O-tRNA和O-RS可以一起发挥作用，例如，O-RS氨酰化O-tRNA。
如本文所用，术语“翻译系统”指将天然存在的氨基酸引入生长的多肽链(蛋白)中的组分的集合。翻译系统的组分可以包括例如核糖体、tRNA、合成酶、mRNA、氨基酸等。正交翻译系统的组分包括例如O-RS、O-tRNA、非天然氨基酸等，可以将其添加到体外或体内翻译系统，例如，无细胞、真核生物细胞，例如，酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞、昆虫细胞等。
如本文所用，“联合疗法”指对人或动物个体的治疗，包括连续或同时向个体施用第一治疗剂和第二治疗剂。在通常情况下，第一治疗剂和第二治疗剂分别施用于个体，而不是作为混合物施用于个体；然而，可能存在第一和第二治疗剂在施用之前混合的实施方案。
如本文所用，“组合产物”是如21CFR 3.2(e)中所定义的，并且包括：
1.由两种或更多种受监管的组分(即，药物/器械、生物制品/器械、药物/生物制品或药物/器械/生物制品)组成的产品，其由物理、化学或以其他方式组合或混合并以单一实体形式产生；
2.两种或更多种独立产品，一起包装在单一包装中或作为一个单元，并且由药物和器械产品、器械和生物制品或者生物制品和药品组成；
3.单独包装的药物、器械或生物制品，其根据其研究性计划或拟定的标签旨在仅与获批的单独指定的药物、装置或生物制品一起使用，其中两者均需要达成预期用途、适应症或效果，并且在拟定产品获得批准后，获批产品的标签需要更改，例如，以反映预期用途、剂型、规格、施用途径的变化或者剂量的显著变化；或者
4.单独包装的任何研究性药物、器械或生物制品，其根据拟定的标签仅与另一单独指定的研究性药物、器械或生物制品一起使用，其中两者均需要达成预期用途、适应症或效果。
例如，本发明的IL-2缀合物和用于施用治疗剂的医疗递送器械是组合产品。如本文所用，术语“医疗递送器械”或“器械”或“药物递送器械”可以互换使用，并且具有《食品、药物和化妆品法案》第201(h)节中所阐述的定义，该章节将器械定义为仪器、设备、器具、机器、装置、植入物、体外试剂或者其他类似或相关物品，包括零件或附件，其为：(i)官方国家处方集或美国药典或其任何补充中所承认，(ii)旨在用于诊断人类或其他动物的疾病或其他病况，或者治愈、缓解、治疗或预防疾病，或者(iii)旨在影响人或其他动物身体的结构或任何功能，并且不能通过人或其他动物体内或身体上的化学作用实现其主要预期目的，并且不能通过化学作用实现其主要预期目的在人或其他动物体内或身体上的作用，并且不依赖于代谢以实现其主要预期目的。术语“器械”不包括根据第520(o)节排除的软件功能。器械的示例包括医用笔和自动注射器。
如本文所用，在某些实施方案中，任何疾病或病症的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指改善受试者中存在的疾病或病症。在另一个实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括改善至少一种物理参数，这可能是受试者无法辨别的。在又一个实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括在物理上(例如，可辨别症状的稳定)或生理上(例如，物理参数的稳定)或者两者兼而有之地调节疾病或病症。在又一个实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括推迟或预防疾病或病症的发作。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”指蛋白或组合物在向受试者施用时有效治疗疾病或病症的量。在一些实施方案中，治疗有效量或有效量指蛋白或组合物的量，当给予受试者时有效预防或改善疾病、疾病的进展或导致症状的改善。
如本文所用，术语“基本上相似”或“基本上相同”表示两个或多个数值之间的足够高的相似度，例如，受体结合亲和力、EC50等，以使得本领域技术人员会认为两个或更多个值之间的差异在由所述值测量的生物学特征的范围内具有很小或没有生物学和/或统计学意义。在一些实施方案中，两个或更多个基本上相似的值可以在彼此的5％至100％之间。
如本文所用，关于IL-2的术语“在N末端或附近”指在IL-2的N末端的氨基酸或包含IL-2的前10个氨基酸内的位置。
如本文所用，关于IL-2的术语“N末端区域”指IL-2的N末端的氨基酸或包含IL-2的前20或30个氨基酸内的位置。
白介素缀合物
本发明在此提供了白介素2(IL-2)多肽，其具有至少一个或多个偏向结合至IL-2受体βγc二聚体(IL-2Rβγc)而非结合IL-2受体αβγc三聚体(IL-2Rαβγc)的氨基酸取代，在IL-2多肽的N末端处或附近结合至水溶性聚合物的非天然氨基酸，或在IL-2多肽的N末端处或附近结合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入，以及与野生型或天然人IL-2氨基酸序列在其他方面具有至少80％至95％同一性的氨基酸序列。如通过SPR测定所确定的这些IL-2缀合物与IL-2Rα不具有可检出的结合，同时将与IL-2Rβγc的结合保持在与天然IL-2相似的水平。此外，与市售IL-2多肽相比，这些IL-2缀合物多肽具有降低的毒性，并且血浆半衰期是市售IL-2多肽的至少5倍。
本发明提供了包含如本文所公开的NNAA的IL-2部分，其适合与本文所公开的任何非肽水溶性聚合物缀合以提供如本文所公开的IL-2缀合物。示例性IL-2部分包括以下实施方案，其中在每个实施方案中，其中的NNAA具有或包括能够与非肽水溶性聚合物内或与其连接的反应性基团形成共价键的官能团。
本发明提供了IL-2部分，其包含以下氨基酸序列或由其组成
XXXXXXXXXXQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPXLXXMLXXXFXMPKKATELKHLQCLEXXLXXLEXVLNXAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEXADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:42)
其中X1是A、另一种氨基酸、NNAA或不存在；X2是P、另一种氨基酸或NNAA；X3是T、另一种氨基酸或NNAA；X4是S、另一种氨基酸或NNAA；X5是S、另一种氨基酸或NNAA；X6是S、另一种氨基酸或NNAA；X7是T、另一种氨基酸或NNAA；X8是K、另一种氨基酸或NNAA；X9是K、另一种氨基酸或NNAA；X10是T、另一种氨基酸或NNAA；X35是K或另一种氨基酸；X37是T或另一种氨基酸；X38是R或另一种氨基酸；X41是T或另一种氨基酸；X42是F或另一种氨基酸；X43是K或另一种氨基酸；X45是Y或另一种氨基酸；X61是E或另一种氨基酸；X62是E或另一种氨基酸；X64是K或另一种氨基酸；X65是P或另一种氨基酸；X68是E或另一种氨基酸；X72是L或另一种氨基酸；X107是Y或另一种氨基酸；X125是C或另一种氨基酸；条件是(i)X1-X10仅包含一个NNAA和(ii)在位置35、37、38、41、42、43、45、61、62、64、65、68、72和107处的至少一个氨基酸不是在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的相应位置处的氨基酸。在特定实施方案中，氨基酸X125是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。
在SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置35、37、38、41、42、43、45、61、62、64、65、68、72和107的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的相应氨基酸位置处的氨基酸。在SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置35、37、38、41、42、43、45、61、62、64、65、68、72和107的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的相应位置处的氨基酸，且氨基酸X125是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。在SEQ ID NO:42的上述氨基酸序列的进一步实施方案中，NNAA缀合至非肽水溶性聚合物。在特定实施方案中，NNAA是对叠氮基甲基苯丙氨酸。在进一步的实施方案中，非肽水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2部分，其包含以下或由其组成
XXXXXXXXXQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPXLXXMLXXXFXMPKKATELKHLQCLEXXLXXLEXVLNXAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEXADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:43)
其中X1是P、另一种氨基酸或NNAA；X3是T、另一种氨基酸或NNAA；X4是S、另一种氨基酸或NNAA；X5是S、另一种氨基酸或NNAA；X6是S、另一种氨基酸或NNAA；X7是T、另一种氨基酸或NNAA；X8是K、另一种氨基酸或NNAA；X9是K、另一种氨基酸或NNAA；X9是T、另一种氨基酸或NNAA；X34是K或另一种氨基酸；X36是T或另一种氨基酸；X37是R或另一种氨基酸；X40是T或另一种氨基酸；X41是F或另一种氨基酸；X42是K或另一种氨基酸；X44是Y或另一种氨基酸；X60是E或另一种氨基酸；X61是E或另一种氨基酸；X63是K或另一种氨基酸；X64是P或另一种氨基酸；X67是E或另一种氨基酸；X71是L或另一种氨基酸；X106是Y或另一种氨基酸；和X124是C或另一种氨基酸；条件是(i)X1-X9仅包含一个NNAA和(ii)在位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106处的至少一个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应位置处的氨基酸。在特定实施方案中，氨基酸X124是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。
在SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应氨基酸位置处的氨基酸。在SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应氨基酸位置处的氨基酸，且氨基酸X124是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。在SEQ ID NO:43的上述氨基酸序列的进一步实施方案中，NNAA缀合至非肽水溶性聚合物。在特定实施方案中，NNAA是对叠氮基甲基苯丙氨酸。在进一步的实施方案中，非肽水溶性聚合物是PEG。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2部分，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPXLXXMLXXXFXMPKKATELKHLQCLEXXLXXLEXVLNXAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEXADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:44)
其中X4是缀合至非肽水溶性聚合物的NNAA；X34是K或另一种氨基酸；X36是T或另一种氨基酸；X37是R或另一种氨基酸；X40是T或另一种氨基酸；X41是F或另一种氨基酸；X42是K或另一种氨基酸；X44是Y或另一种氨基酸；X60是E或另一种氨基酸；X61是E或另一种氨基酸；X63是K或另一种氨基酸；X64是P或另一种氨基酸；X67是E或另一种氨基酸；X71是L或另一种氨基酸；X106是Y或另一种氨基酸；和X124是C或另一种氨基酸；条件是在位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106处的至少一个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应位置处的氨基酸。在特定实施方案中，氨基酸X124是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。
在SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应氨基酸位置处的氨基酸。在SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应氨基酸位置处的氨基酸，且氨基酸X124是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。在特定实施方案中，NNAA是对叠氮基甲基苯丙氨酸。在进一步的实施方案中，非肽水溶性聚合物是PEG。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2部分，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTXMLTXKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:45)
其中X4是NNAA；X37是R以外的任何氨基酸；X41是F以外的任何氨基酸；和X124是C以外的任何氨基酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2部分，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTXMLTXKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:46)
其中X5是NNAA；X38是R以外的任何氨基酸；X42是F以外的任何氨基酸；和X125是C以外的任何氨基酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2部分，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:47)
其中X4至NNAA且X124是A或S。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2部分，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:48)
其中X5是NNAA且X125是A或S。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2部分，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:49)
其中X4是缀合至非肽水溶性聚合物的NNAA。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2部分，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:50)
其中X5是NNAA。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2部分，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:51)
其中X4是对叠氮基甲基苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2部分，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:52)
其中X5是对叠氮基甲基苯丙氨酸。
本发明提供了IL-2缀合物，其包含缀合至如本文所公开的任何非肽水溶性聚合物的如本文所公开的NNAA。示例性IL-2缀合物包括以下实施方案。
本发明提供了IL-2缀合物，其包含以下氨基酸序列或由其组成
XXXXXXXXXXQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPXLXXMLXXXFXMPKKATELKHLQCLEXXLXXLEXVLNXAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEXADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:3)
其中X1是A、另一种氨基酸、NNAA或不存在；X2是P、另一种氨基酸或NNAA；X3是T、另一种氨基酸或NNAA；X4是S、另一种氨基酸或NNAA；X5是S、另一种氨基酸或NNAA；X6是S、另一种氨基酸或NNAA；X7是T、另一种氨基酸或NNAA；X8是K、另一种氨基酸或NNAA；X9是K、另一种氨基酸或NNAA；X10是T、另一种氨基酸或NNAA；X35是K或另一种氨基酸；X37是T或另一种氨基酸；X38是R或另一种氨基酸；X41是T或另一种氨基酸；X42是F或另一种氨基酸；X43是K或另一种氨基酸；X45是Y或另一种氨基酸；X61是E或另一种氨基酸；X62是E或另一种氨基酸；X64是K或另一种氨基酸；X65是P或另一种氨基酸；X68是E或另一种氨基酸；X72是L或另一种氨基酸；X107是Y或另一种氨基酸；X125是C或另一种氨基酸；条件是(i)X1-X10仅包含一个NNAA，且NNAA缀合至非肽水溶性聚合物和(ii)在位置35、37、38、41、42、43、45、61、62、64、65、68、72和107处的至少一个氨基酸不是在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的相应位置处的氨基酸。在特定实施方案中，氨基酸X124是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。
在SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置35、37、38、41、42、43、45、61、62、64、65、68、72和107的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的相应氨基酸位置处的氨基酸。在SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置35、37、38、41、42、43、45、61、62、64、65、68、72和107的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的相应氨基酸位置处的氨基酸，且氨基酸X125是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。在特定实施方案中，NNAA是对叠氮基甲基苯丙氨酸。在进一步的实施方案中，非肽水溶性聚合物是PEG。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
XXXXXXXXXQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPXLXXMLXXXFXMPKKATELKHLQCLEXXLXXLEXVLNXAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEXADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:4)
其中X1是P、另一种氨基酸或NNAA；X2是T、另一种氨基酸或NNAA；X3是S、另一种氨基酸或NNAA；X4是S、另一种氨基酸或NNAA；X4是S、另一种氨基酸或NNAA；X6是T、另一种氨基酸或NNAA；X7是K、另一种氨基酸或NNAA；X8是K、另一种氨基酸或NNAA；X9是T、另一种氨基酸或NNAA；X34是K或另一种氨基酸；X36是T或另一种氨基酸；X37是R或另一种氨基酸；X40是T或另一种氨基酸；X41是F或另一种氨基酸；X42是K或另一种氨基酸；X44是Y或另一种氨基酸；X60是E或另一种氨基酸；X61是E或另一种氨基酸；X63是K或另一种氨基酸；X64是P或另一种氨基酸；X67是E或另一种氨基酸；X71是L或另一种氨基酸；X106是Y或另一种氨基酸；和X124是C或另一种氨基酸；条件是(i)X1-X9仅包含一个NNAA，且NNAA缀合至非肽水溶性聚合物，和(ii)在位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106处的至少一个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应位置处的氨基酸。在特定实施方案中，氨基酸X124是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。
在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应氨基酸位置处的氨基酸。在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应氨基酸位置处的氨基酸，且氨基酸X125是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。在特定实施方案中，NNAA是对叠氮基甲基苯丙氨酸。在进一步的实施方案中，非肽水溶性聚合物是PEG。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPXLXXMLXXXFXMPKKATELKHLQCLEXXLXXLEXVLNXAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEXADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:5)
其中X4是缀合至非肽水溶性聚合物的NNAA；X34是K或另一种氨基酸；X36是T或另一种氨基酸；X37是R或另一种氨基酸；X40是T或另一种氨基酸；X41是F或另一种氨基酸；X42是K或另一种氨基酸；X44是Y或另一种氨基酸；X60是E或另一种氨基酸；X61是E或另一种氨基酸；X63是K或另一种氨基酸；X64是P或另一种氨基酸；X67是E或另一种氨基酸；X71是L或另一种氨基酸；X106是Y或另一种氨基酸；和X124是C或另一种氨基酸；条件是在位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106处的至少一个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应位置处的氨基酸。在特定实施方案中，氨基酸X124是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。
在SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应氨基酸位置处的氨基酸。在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的进一步实施方案中，选自位置34、36、37、40、41、42、44、60、61、63、64、67、71和106的至少两个氨基酸不是在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的相应氨基酸位置处的氨基酸，且氨基酸X125是C以外的任何氨基酸，其在进一步的实施方案中可以是氨基酸A或S。在特定实施方案中，NNAA是对叠氮基甲基苯丙氨酸。在进一步的实施方案中，非肽水溶性聚合物是PEG。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTXMLTXKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:6)
其中X4是缀合至非肽水溶性聚合物的NNAA；X37是R以外的任何氨基酸；X41是F以外的任何氨基酸；和X124是C以外的任何氨基酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTXMLTXKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:7)
其中X5是缀合至非肽水溶性聚合物的NNAA；X38是R以外的任何氨基酸；X42是F以外的任何氨基酸；和X125是C以外的任何氨基酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:8)
其中X4是缀合至非肽水溶性聚合物的NNAA，且X124是A或S。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT(SEQ ID NO:9)
其中X5是缀合至非肽水溶性聚合物的NNAA，且X125是A或S。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:10)
其中X4是缀合至非肽水溶性聚合物的NNAA。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:11)
其中X5是缀合至非肽水溶性聚合物的NNAA。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:12)
其中X4是缀合至非肽水溶性聚合物的对叠氮基甲基苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:13)
其中X5是缀合至非肽水溶性聚合物的对叠氮基甲基苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:14)
其中X4是缀合至PEG的对叠氮基甲基苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:15)
其中X5是缀合至PEG的对叠氮基甲基苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:16)
其中是X4是缀合至用甲基封端的PEG(mPEG)的对叠氮基甲基苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:17)
其中X5是缀合至mPEG的对叠氮基甲基苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:18)
其中X4是缀合至用30kDa mPEG封端的PEG的对叠氮基甲基苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:19)
其中X5是缀合至30kDa mPEG的对叠氮基甲基苯丙氨酸。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
PTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:20)
其中X4是通过三唑键缀合至DBCO_30kDa_PEG(PEG1)的对叠氮基甲基苯丙氨酸，其中PEG1具有下式
Figure BDA0003985829980000431
其中n是约681。
在进一步的实施方案中，提供了IL-2缀合物，其包含以下或由其组成
APTSXSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:21)
其中X5是通过三唑键缀合至PEG1的对叠氮基甲基苯丙氨酸。
Stauber等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)103:2788-2793(2006)教导了IL-2/IL-2Rα界面的性质包括由IL-2Rα残基L2α、M25α、L42α和Y43α以及IL-2残基F42IL-2、F44IL-2、Y45IL-2、P65IL-2和L72IL-2主导的疏水中心，以及具有五个离子对(K38α/E61IL-2、R36α/E62IL-2、E1α/K35IL-2、D6α/R38IL-2和E29α/K43IL-2)的极性外周。
Stauber等进一步教导对于IL-2与IL-2Rβ的结合，D20IL2和H16IL2似乎是最关键的残基；D20IL2氢键结合至H133β和Y134β，而H16IL2被嵌入至由Y134β、Q188β以及T74β和T73β的甲基产生的槽中。亦用R41β、V75β、H133β、L19IL2、D84IL2、N88IL2和V91IL2制成界面中的主要范德华力接触。
Stauber等进一步教导对于与IL-2Rγc结合的IL-2，IL-2具有
Figure BDA0003985829980000441
的内埋表面积和一个氢键，根据生物化学数据，Q126IL2是接触γc的最关键的IL-2残基。E15IL2、T123IL2和I129IL2对IL-2/γc界面产生其他显著相互作用。
因此，本发明提供了如本文所公开的IL-2部分和IL-2缀合物，其中NNAA的取代以及相对于野生型人IL-2降低IL-2多肽对人IL-2受体αβγc三聚体(IL-2Rαβγc)的亲和力或者废除与IL-2Rα结合的一个或多个氨基酸取代除外，IL-2多肽氨基酸序列具有与天然IL-2的SEQ ID NO:1，与desA1_IL-2的SEQ ID NO:53或与阿地白介素的SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或100％同一性。在进一步的实施方案中，包含IL-2部分或缀合物的IL-2多肽氨基酸序列具有与天然IL-2的SEQ ID NO:1，与desA1_IL-2的SEQ ID NO:53或与阿地白介素的SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性，条件是所述IL-2多肽至少包含氨基酸E15、H16、L19、D20、D84、N88、V91、Q126、T123和I129(根据编号方案B)。
本发明还提供了本文所公开的任何实施方案，其中非天然氨基酸并未具体鉴定为用于在位置4取代的丝氨酸残基，因为其对应于SEQ ID NO:2的位置4，实施方案其中非天然氨基酸的取代或插入是在N末端区域内，例如，(i)在所述IL-2多肽的N末端的前30个氨基酸内用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸取代氨基酸或在所述IL-2多肽的N末端的前30个氨基酸内缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入，或者(ii)在所述IL-2多肽的N末端的前20个氨基酸内用缀合物至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸取代氨基酸或在所述IL-2多肽的N末端的前20个氨基酸内缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入。
因此，本发明提供了(a)IL-2缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQID NO:53中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且还包含：(i)相对于野生型人IL-2降低所述IL-2多肽对人IL-2Rαβγc的亲和力的一个或多个氨基酸取代；和(ii)在所述IL-2多肽的N末端区域内用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端区域内缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入；其中相对于野生型人IL-2所述IL-2多肽对所述人IL-2Rβγc具有基本上相似的结合亲和力。
在特定实施方案中，本发明提供了IL-2缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且还包含：(i)相对于野生型人IL-2降低所述IL-2多肽对人IL-2Rαβγc的亲和力的一个或多个氨基酸取代；和(ii)在包含所述IL-2多肽的N末端的前30个氨基酸的N末端区域内用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸取代氨基酸或者在包含所述IL-2多肽的N末端的前30个氨基酸的N末端区域内缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入；其中相对于野生型人IL-2所述IL-2多肽对所述人IL-2Rβγc具有基本上相似的结合亲和力。
在特定实施方案中，本发明提供了IL-2缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且还包含：(i)相对于野生型人IL-2降低所述IL-2多肽对人IL-2Rαβγc的亲和力的一个或多个氨基酸取代；和(ii)在包含所述IL-2多肽的N末端的前20个氨基酸的N末端区域内用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸取代氨基酸或者在包含所述IL-2多肽的N末端的前20个氨基酸的N末端区域内缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入；其中相对于野生型人IL-2所述IL-2多肽对所述人IL-2Rβγc具有基本上相似的结合亲和力。
非肽水溶性聚合物
本文提供了缀合物，其包含IL-2突变体，所述IL-2突变体包含通过非天然氨基酸附接至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸(IL-2部分)。对于水溶性聚合物，在某些实施方案中，非肽水溶性聚合物是非肽、无毒、非天然存在和生物相容的。对于生物相容性，如果与单独使用该物质或与另一种物质(例如，活性剂，如IL-2部分)一起使用与活组织结合(例如，向患者施用)相关的有益效果大于由临床医师(例如，内科医师)评价的任何有害效果，则认为该物质具有生物相容性。对于非免疫原性，如果物质在体内的预期用途没有产生不期望的免疫应答(例如，抗体的形成)，或者，如果产生了免疫应答，则如临床医师所评价的，认为这种应答不具有临床意义或重要性，则认为该物质是非免疫原性的。特别优选的是，非肽水溶性聚合物是生物相容性和非免疫原性的。
此外，聚合物的典型特征是具有两个至约300个末端。此类聚合物的示例包括但不限于聚(亚烷基二醇)，如聚乙二醇(“PEG”)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(“POZ”)(在WO2008/106186中对其进行了描述)、聚(N-丙烯酰吗啉)以及前述任何一者的组合。
非肽水溶性聚合物不限于特定结构，且可以是线性(例如，封端的，例如，烷氧基PEG或双功能PEG)、支链或多臂(例如，分叉PEG或附接至多元醇核心的PEG)、树突状(或星形)架构，其各自含有或不含一个或多个可降解的键。此外，非肽水溶性聚合物的内部结构可以以任何数量的不同重复模式组织，并且可以选自由以下组成的组：均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三聚物、无规三聚物和嵌段三聚物。
通常，将活化的PEG和其他活化的非肽水溶性聚合物(即，聚合试剂)用适合于与IL-2部分内的非天然氨基酸的官能团偶联的合适反应性基团活化。因此，聚合试剂将具有与IL-2部分内的非天然氨基酸的官能团反应的反应性基团。用于将这些聚合物与活性部分缀合的代表性聚合试剂和方法是本领域公知的，并且在Zalipsky,S.,等，"Use ofFunctionalized poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides"inPolyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris,Plenus Press,New York(1992)，以及在Zalipsky(1995)Advanced DrugReviews 16:157-182中进行了进一步描述。适合与IL-2部分内的非天然氨基酸的官能团偶联的示例性反应性基团包括羟基、马来酰亚胺、酯、缩醛、缩酮、胺、羧基、醛、醛水合物、酮、乙烯基酮、硫酮、硫醇、乙烯基砜、肼、炔烃、叠氮化物等。在特定实施方案中，反应性基团是炔烃，例如，如下所述的应变炔烃，其能够与叠氮化物形成共价键，叠氮化物包含IL-2部分内的非天然氨基酸的官能团。
在某些实施方案中，用于制备本文所述缀合物的聚合试剂是在不使用光气的情况下制备的。这种方法与例如美国专利号4,902,502所公开的内容形成对比，其具体描述了形成氯甲酸酯并且随后用于形成PEG活性酯，然后将其与IL-2部分的非天然氨基酸反应。光气的使用导致氯化氢的形成，这会导致聚合物中的链断裂，从而增加杂质，这些杂质可能无法使用常规技术去除。因此，不希望受到理论的束缚，由不使用光气形成的聚合试剂制备的IL-2部分缀合物提供了基本上不存在聚合物链降解产物的更高质量组合物。另外，在一个或多个实施方案中，非肽水溶性聚合物与官能团之间的接头不是含氨基甲酸酯的接头。
通常，在缀合物中的非肽水溶性聚合物的重均分子量是从约100道尔顿(Da)至约150,000Da。然而，示例性范围包括在大于5,000Da至约100,000Da范围内、在从约6,000Da至约90,000Da范围内、在从约10,000Da至约85,000Da范围内、在大于约10,000Da至约85,000Da范围内、在从约20,000Da至约85,000Da范围内、在从约10,000Da至约85,000Da范围内、在从约20,000Da至约85,000Da范围内、在从约53,000Da至约85,000Da范围内、在从约25,000Da至约120,000Da范围内、在从约29,000Da至约120,000Da范围内、在从约35,000Da至约120,000Da范围内和在从约40,000Da至约120,000Da范围内的重均分子量。对于任何给定的非肽水溶性聚合物，分子量在一个或多个范围内的PEG是优选的。
非肽水溶性聚合物的示例性重均分子量包括约100Da、约200Da、约300Da、约400Da、约500Da、约600Da、约700Da、约750Da、约800Da、约900Da、约1,000Da、约1,500Da、约2,000Da、约2,200Da、约2,500Da、约3,000Da、约4,000Da、约4,400Da、约4,500Da、约5,000Da、约5,500Da、约6,000Da、约7,000Da、约7,500Da、约8,000Da、约9,000Da、约10,000Da、约11,000Da、约12,000Da、约13,000Da、约14,000Da、约15,000Da、约20,000Da、约22,500Da、约25,000Da、约30,000Da、约35,000Da、约40,000Da、约45,000Da、约50,000Da、约55,000Da、约60,000Da、约65,000Da、约70,000Da和约75,000Da。也可以使用总分子量为上述任何一种的支链形式的非肽水溶性聚合物(例如，由两种20000道尔顿聚合物组成的支链40000Da非肽水溶性聚合物，或由两种10000道尔顿聚合物组成的支链20000Da非肽类水溶性高分子)。在一个或多个实施方案中，缀合物将不具有任何直接或间接连接的PEG部分，其重均分子量小于约6,000道尔顿。
当作为非肽使用时，PEG将通常包含很多(OCH2CH2)单体(或(CH2CH2O)单体，其取决于PEG的定义)。如本说明书通篇所使用的，重复单元的数量由“(OCH2CH2)n”中的下标“n”表示。因此，(n)的值通常落在以下范围中的一个或多个范围内：从2至约3400、从约100至约2300、从约100至约2270、从约136至约2050,from about225至约1930、从约450至约1930、从约1200至约1930、从约568至约2727、从约660至约2730、从约795至约2730、从约795至约2730、从约909至约2730和从约1,200至约1,900。对于已知分子量的任何给定聚合物，可以通过将聚合物的总重均分子量除以重复单元的分子量确定重复单元的数量(即，“n”)。
在一个实施方案中，本文中使用的聚合物是封端聚合物，即，具有至少一个用相对惰性的基团封端的聚合物，如低级C1-6烷氧基，但也可以使用羟基。当聚合物是PEG时，例如，可能需要使用甲氧基-PEG(通常称为mPEG)，其是PEG的线性形式，其中聚合物的一个末端是甲氧基(-OCH3)基团，而另一个末端是羟基或能任选地被化学修饰的其他反应基团。
在某些实施方案中，游离或未结合的PEG是线性聚合物封端，其每个末端均具有羟基：HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，其中(n)典型地在0至约4,000范围。上述聚合物α-,ω-二羟基聚(乙二醇)，可以简写为HO-PEG-OH，其中应理解的是，-PEG-符号可以表示以下结构单元：-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中(n)是如上文所定义的。
在一个或多个实施方案中使用的另一种类型的PEG简而言之是甲氧基-PEG-OH或mPEG，其中一个末端是相对惰性的甲氧基，而另一个末端是羟基。mPEG的化学式在下文中给出。CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，其中(n)是如上文所定义的。
多臂或支链PEG分子，如在美国专利号5,932,462中描述的那些，也可以用作PEG聚合物。例如，PEG可以具有下式：
Figure BDA0003985829980000501
其中polya和polyb是PEG主链(相同或不同)，如甲氧基聚(乙二醇)；R"是非反应性部分，如H、甲基或PEG主链；且P和Q是非反应性键。
此外，PEG可以包括分叉PEG。分叉PEG的示例由下式表示：
Figure BDA0003985829980000502
其中X是一个或多个原子的接头，每个Z是通过定义长度的原子链与CH连接的活化末端基团。国际专利申请公开号WO 99/45964公开了能够在本发明的一个或多个实施方案中使用的各种分叉的PEG结构。将Z官能团连接到支链碳原子的原子链用作系链基团，并且可以包括例如烷基链、醚链、酯链、酰胺链及其组合。
PEG聚合物可以包含具有反应性基团(如羧基)的侧接PEG分子，所述反应性基团沿PEG长度共价连接，而不是在PEG链的末端。侧接反应性基团可以直接或通过接头(如亚烷基)附接至PEG。
本领域普通技术人员将认识到的是，上述关于非肽水溶性聚合物的讨论绝不是详尽的，仅是说明性的，并且所有具有上述性质的聚合物材料都是可以考虑的。如本文所用，术语“聚合试剂”通常指整个分子，其可以包含水溶性聚合物区段和官能团。
通常，对于任何给定的缀合物，将有一种至三种非肽水溶性聚合物共价附接到具有一个或多个IL-2活性的IL-2部分。然而，在一些情况下，缀合物可以具有1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个分别附接到IL-2部分的非肽水溶性聚合物。非肽水溶性聚合物通常附接在位点特异性非天然氨基酸的侧链上，在下文中详细描述。
对于聚合试剂，此处和其他地方描述的那些可以从商业来源购买或从商业可用的原料制备。此外，文献中描述了制备聚合试剂的方法。
IL-2部分的非天然氨基酸和非肽水溶性聚合物之间的附接可以是直接的，其中无插入原子位于IL-2部分与非肽水溶性聚合物之间，或者IL-2部分与非肽水溶性聚合物之间的连接可以是间接的，其中一个或多个原子位于IL-2部分和非肽水溶性聚合物之间。对于间接附接，“接头”作为官能团和非肽水溶性聚合物之间的间隔物。构成接头的一个或多个原子可以包括碳原子、氮原子、硫原子、氧原子及其组合中的一种或多种。接头可以包括酰胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚和/或二硫基。特异性接头的非限制性示例包括选自由以下组成的组的那些：-O-、-S-、-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH2-、-CH2-C(O)-O-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-、-C(O)-O-CH2-CH2-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-N-H-C(O)-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-、二价环烷基、-O-、-S-、氨基酸、-N(R6)-以及前述任何两个或更多个的组合，其中R6是H或选自由以下组成的组的有机基团：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基，(h)是0至6和(J)是0至20。其他特异性间隔物部分具有下式：-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-和-O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，其中每个亚甲基后面的下标值表示式中所含亚甲基的数量，例如，(CH2)1-6表示式中可以包含1、2、3、4、5或6个亚甲基。此外，上述接头中的任何一种还可以包括环氧乙烷低聚物链，其包含1至20个环氧乙烷单体单元[即，-(CH2CH2O)1-20]。也就是说，环氧乙烷低聚物链可以出现在接头之前或之后，并且任选地出现在由两个或更多个原子组成的接头的任何两个原子之间。另外，如果低聚物与聚合物区段相邻并且仅代表聚合物区段的延伸，则将不认为低聚物链是接头的一部分。在特定实施方案中，接头包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。示例性接头包括但不限于
Figure BDA0003985829980000521
其中p是从1至10的整数，并且波浪线表示左边与DBCO的N连接和右边与PEG的C连接的键。在特定实施方案中，p是1、3或5。PEG的任何分子量都可以根据实际需要使用，包括但不限于，根据需要从约100Da至100,000Da或更多(包括但不限于，有时是0.1-50kDa或10-40kDa)。也可以使用支链PEG，包括但不限于PEG分子，每条链的分子量(MW)为1-100kDa(包括但不限于1-50kDa或5-20kDa)。在以下描述了广泛的PEG分子，包括但不限于ShearwaterPolymers,Inc.目录和Nektar Therapeutics目录，其通过引用并入本文。
通常，非肽水溶性聚合物(例如，PEG分子)的至少一个末端可以用于与IL-2部分的非天然氨基酸反应。例如，如本文所述，用于与非天然氨基酸侧链反应的含炔或叠氮反应性基团的非肽水溶性聚合物可用于将非肽水性聚合物分别连接到包含相应叠氮或炔基团的IL-2部分内的位点特异性非天然氨基酸上。在特定实施方案中，当位点特异性非天然氨基酸包含叠氮化物时，则非肽水溶性聚合物通常含有炔反应性基团以影响[3+2]环加成产物(三唑)的形成。或者，如果位点特异性非天然氨基酸包含炔烃，则非肽水溶性聚合物将通常包含叠氮化物反应性基团以影响[3+2]Huisgen环加成产物的形成。如果位点特异性非天然氨基酸包含羰基官能团，则非肽水溶性聚合物将通常包含强亲核反应性基团(包括但不限于酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)，以分别形成相应的腙、肟和氨基脲键。在其他替代方案中，可以使用本文所述的反应性官能团的定向的反向，即，位点特异性非天然氨基酸中的叠氮化物可以与含有炔烃或与其连接的非肽水溶性聚合物反应。
在某些实施方案中，非肽水溶性聚合物是含叠氮化物或炔烃的聚合物，其包含平均分子量为约1,000Da至约100,000Da的非肽水溶性聚合物主链。
非天然氨基酸
非天然氨基酸可以是从业者认为适合的任何非天然氨基酸。在特定实施方案中，非天然氨基酸包括可用于与存在于非肽水溶性聚合物内或连接至非肽水溶性聚合物的接头上的反应性基团形成共价键的官能团。在某些实施方案中，官能团选自由以下组成的组：氨基、羧基、乙酰基、肼基、酰肼基、氨基脲基、硫基、叠氮基和炔基，条件是将官能团选择为能够与非肽水溶性聚合物内的反应性基团形成共价键或与之连接。修饰的氨基酸还描述在，例如，WO2013185115和WO2015006555中，其每一个的全部内容均通过引用并入本文。
在某些实施方案中，氨基酸残基是根据下式中的任何一者：
Figure BDA0003985829980000541
本领域技术人员将意识到的是，蛋白通常由L-氨基酸组成。然而，对于非天然氨基酸，本方法和组合物为从业者提供了在位点特异性位置使用L、D或外消旋非天然氨基酸的能力。在某些实施方案中，本文所述的非天然氨基酸包括天然氨基酸的D型和天然氨基酸的外消旋型。
在上式中，波浪线表示与蛋白的多肽链的其余部分连接的键。这可以将这些非天然氨基酸引入多肽链，就像将天然氨基酸引入相同多肽链一样。在某些实施方案中，将非天然氨基酸通过酰胺键引入多肽链中，如式中所示。
在一些实施方案中，位点特异性非天然氨基酸包括侧链官能团，其与反应性基团有效且选择性地反应且未见于20种常见氨基酸(包括但不限于叠氮基、酮、醛和氨氧基)中以形成稳定缀合物。例如，包含含叠氮基官能团的位点特异性非天然氨基酸的IL-2部分可以与非肽水溶性聚合物的反应性基团反应，该水溶性聚合物含有炔部分以形成由叠氮化合物与炔基团的选择性反应产生的稳定缀合物，从而形成Huisgen[3+2]环加成产物。
可适用于本发明并且可用于与非肽水溶性聚合物反应的示例性位点特异性非天然氨基酸包括但不限于具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲基、叠氮化物和炔官能团的那些。在一些实施方案中，位点特异性非天然氨基酸包含糖部分。此类氨基酸的示例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖氨基-L-丝氨酸。此类氨基酸的示例还包括其中氨基酸和糖之间天然存在的N-或O-键被自然界中不常见的共价键取代的示例，包括但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等。此类氨基酸的示例还包括在天然存在的蛋白中不常见的糖，如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
可适用于本发明的非天然氨基酸的特定示例包括但不限于对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对炔丙基氧基-苯丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸、硒半胱氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸和对炔丙基氧基苯丙氨酸等。可适用于本发明的多种非天然氨基酸的结构的示例提供在例如WO 2002085923中，名称为“In vivo incorporation ofunnatural amino acids”。对于其他甲硫氨酸类似物，亦参见Kiick等，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselectivemodification by the Staudinger ligation,PNAS 99:19-24。
很多适用于本发明的非天然氨基酸可商购自例如Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee,Wis.,USA)。非市售的那些任选地如本文所述或如各种出版物中所述或使用本领域技术人员公知的标准方法合成。对于有机合成技术，参见，例如，Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry(1982，第二版，Willard Grant Press,Boston Mass.)；March等Advanced Organic Chemistry(第三版，1985,Wiley and Sons,New York)；以及Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第三版，Parts A and B,1990,PlenumPress,New York)。描述非天然氨基酸合成的其他出版物包括，例如，WO 2002/085923，名称为“In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids”；Matsoukas等，(1995)J.Med.Chem.,38,4660-4669；King,F.E.&Kidd,D.A.A.(1949)A New Synthesis ofGlutamine and of y-Dipeptides of Glutamic Acid from PhthylatedIntermediates.J.Chem.Soc.,3315-3319；Friedman,0.M.&Chatterrji,R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-TumorAgents.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752；Craig,J.C.等，(1988)Absolute Configurationof the Enantiomers of7-Chloro-4[[4-(diethyl amino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53,1167-1170；Azoulay,M.,Vilmont,M.&Frappier,F.(1991)Glutamine analogues as Potential Antimalarials,Eur.J.Med.Chem.26,201-5；Koskinen,A.M.P.&Rapoport,H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Pralines as Conformationally Constrained Amino AcidAnalogues.J.Org.Chem.54,1859-1866；Christie,B.D.&Rapoport,H.(1985)Synthesis ofOptically Pure Pipecolates from L-Asparagine。Application to the TotalSynthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and lminiumIon Cyclization.J.Org.Chem.1989:1859-1866；Barton等，(1987)Synthesis of Novela-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L-and D-a-Amino-Adipic Acids,L-a-aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives.Tetrahedron Lett.43:4297-4308；和Subasinghe等，(1992)Quisqualicacid analogues:synthesis of beta-heterocyclic2-aminopropanoic acidderivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitizedsite.J.Med.Chem.35:4602-7。亦参见，于2003年12月22日以系列号10/744,899提交和于2002年12月2日以系列号60/435,821提交的名称为“Protein Arrays”的专利申请。
叠氮化物和炔烃的独特反应性使得这些基团对于多肽和其他生物分子的选择性修饰非常有用。有机叠氮化物，特别是脂肪族叠氮化物和炔烃在常见的反应性化学条件下通常是稳定的。特别地，叠氮化物和炔烃官能团或反应性基团对天然多肽中20种常见氨基酸侧链(即R基团)都是惰性的。当接近时，揭示了叠氮基和炔基的“弹簧负载”性质，其通过Huisgen[3+2]环加成反应选择性且有效地反应，生成相应的三唑。参见，例如，Chin J.,等，Science 301:964-7(2003)；Wang,Q.,等，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Chin,J.W.,等，J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)。
由于Huisgen环加成反应涉及选择性环加成反应(参见，例如，Padwa,A.，在COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS,Vol.4，(Trost,B.M.编著，1991)，p.1069-1109；Huisgen,R.在1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY，(Padwa,A.编著，1984)，p.1-176)，而非亲核取代反应，含有叠氮化物和炔烃侧链的位点特异性非天然氨基酸的引入允许合成的多肽在位点特异性的非天然氨基酸位置选择性修饰。涉及含叠氮化物或含炔烃蛋白的环加成反应可在室温下在水溶液条件下在催化量的使Cu(Ⅱ)原位还原成Cu(I)的还原剂存在下通过添加Cu(Ⅱ)(包括但不限于催化量的CuSO4形式)进行。参见，例如，Wang,Q.等，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Tornoe,C.W.等，J.Org.Chem.67:3057-3064(2002)；Rostovtsev等，Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599(2002)。示例性还原剂包括但不限于抗坏血酸盐、金属铜、奎宁、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+和所施加的电位。
在一些情况下，其中Huisgen[3+2]环加成反应是叠氮化物和炔烃之间所需的，抗原结合多肽包含含炔烃部分的位点特异性非天然氨基酸，并且待附接至氨基酸的水溶性聚合物包含叠氮化物部分。或者，也可以进行相反的反应(即，与氨基酸上的叠氮化物部分和非肽水溶性聚合物上的炔烃部分)。
叠氮化物官能团也可以选择性地与含有芳基酯的非肽水溶性聚合物反应，并与芳基膦部分适当官能化以生成酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮化物，然后生成的胺与近端酯键有效反应生成相应的酰胺。参见，例如，E.Saxon和C.Bertozzi,Science 287,2007-2010(2000)。含叠氮化物的氨基酸可以是烷基叠氮化物(包括但不限于2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)，
示例性含叠氮化物的氨基酸包括以下：
Figure BDA0003985829980000581
其中n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，和R3是H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是不存在，m是0和叠氮化物部分位于烷基侧链的对位。在一些实施方案中，n是0-4，且R1和X不存在，且m是0。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是0，m是2，且对叠氮基乙氧基部分位于相对于烷基侧链的对位。
含叠氮化物的氨基酸可从商业来源获得。例如，4-叠氮基苯丙氨酸可以从Chem-Impex International,Inc.(Wood Dale,Ill.)获得。对于无法购买获得的那些含叠氮化物氨基酸，叠氮化物基团可以使用本领域技术人员公知的标准方法相对容易地制备，包括但不限于通过替代适宜的离去基团(包括但不限于卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯)或通过打开适当保护的内酯。参见，例如，March的Advanced Organic Chemistry(第三版，1985,Wiley and Sons,New York)。
在某些实施方案中，非天然氨基酸根据式I所示：
Figure BDA0003985829980000582
或其盐，其中：D是-Ar-W3-或-W1-Y1-C(O)-Y2-W2-；Ar是
Figure BDA0003985829980000583
W1、W2和W3的每一个独立地是单键或低级亚烷基；每个X1独立地是-NH-、-O-或-S-；每个Y1独立地是单键、-NH-或-O-；每个Y2独立地是单键、-NH-、-O-或者N-连接或C-连接的吡咯烷基；以及Z1、Z2和Z3中的一个是-N-，且Z1、Z2和Z3中的其他独立地是-CH-，并且其中波浪线表示与相邻原子的键。
在某些实施方案中，非天然氨基酸根据式II所示：
Figure BDA0003985829980000591
其中D是在式I的上下文中所定义的。在某些实施方案中，非天然氨基酸根据式IIb所示：
Figure BDA0003985829980000592
或其盐，其中W4是C1-C10亚烷基。在进一步的实施方案中，W4是C1-C5亚烷基。在一个实施方案中，W4是C1-C3亚烷基。在一个实施方案中，W4是C1亚烷基。
在特定实施方案中，非天然氨基酸是对叠氮基甲基苯丙氨酸(pAMF)：
Figure BDA0003985829980000593
或其盐。此类非天然氨基酸可以是盐的形式，或者可以引入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中，并且任选地进行翻译后修饰。
接头
在某些实施方案中，IL-2部分可以使用一个或多个能够与IL-2部分氨基酸和非肽水溶性聚合物基团反应的接头连接到非肽水溶性聚合物上。一个或多个接头可以是本领域技术人员显而易见的任何接头。
有用的接头包括本文所述的那些。在某些实施方案中，接头是本领域技术人员公知的任何二价或多价接头。有用的二价接头包括亚烷基、取代的亚烷基、杂亚烷基、取代的杂亚烷基、亚芳基、取代的亚芳基、杂芳基和取代的杂芳基。在某些实施方案中，接头是C1-10亚烷基或C1-10杂亚烷基。在一些实施方案中，C1-10杂亚烷基是PEG。
在通常情况下，接头是水解稳定的。水解稳定的键是在水中基本稳定且在生理pH值下不与水反应的键，包括但不限于在生理条件下长时间，甚至无限期。
接头可以具有宽范围的分子量或分子长度。更大或更小分子量的接头可用于在IL-2部分和连接的非肽水溶性聚合物之间提供所需的空间关系或构象。具有更长或更短分子长度的接头也可用于在部分和连接的非肽水溶性聚合物之间提供所需的空间或柔性。类似地，具有特定性状或构象的接头可用于在多肽到达其靶点之前或之后赋予多肽或连接实体特定性状或构象。多肽和连接实体之间的空间关系的这种优化可以为分子提供新的、调节的或所需的性质。
在某些实施方案中，非肽水溶性聚合物可以连接至接头，在本文中称为接头-非肽水溶性聚合物，其具有一个或多个能够与IL-2部分官能团反应的接头基团。一个或多个接头可以是本领域技术人员显而易见的任何接头或本文所述的那些。在特定实施方案中，连接至所述反应性基团的所述非肽水溶性聚合物具有下式：
(RG)-(接头)-(POLY)-x
其中RG是能够与非天然氨基酸的官能团形成共价键的反应性基团；接头是共价键或取代或非取代的C1-20烷基；POLY是非肽水溶性聚合物；和x是在POLY末端的醇或甲基。
在特定实施方案中，POLY是具有约5至约100千道尔顿(kDa)分子量的聚乙二醇(PEG)。在某些实施方案中，聚乙二醇具有10,000、20,000或30,000kDa的分子量。聚乙二醇的每个乙二醇单元具有约44Da的分子量。因此，30kDa PEG包含约681个乙二醇单元。示例性(RG)-(接头)-(POLY)-x分子具有下式
Figure BDA0003985829980000611
其中p是1至10的整数；n是1至5,000的整数；和R是选自甲基和H的封端基团。在特定实施方案中，p是1-6的整数。
在特定实施方案中，POLY是具有约5至约100千道尔顿(kDa)分子量的聚乙二醇(PEG)。在某些实施方案中，聚乙二醇具有10,000、20,000或30,000kDa的分子量。聚乙二醇的每个乙二醇单元具有约44Da的分子量。因此，30kDa PEG包含约681个乙二醇单元。
其他有用的接头-PEG部分如在US 8,680,315和US 8,754,190中所描述的，其全部内容通过引用并入本文。
示例性缀合物
在某些实施方案中，本文提供了根据下式的缀合物：
(COMP)n-QQ-LL-POLY-x
其中COMP是如上文所述的IL-2部分的非天然氨基酸；QQ是缀合基团的二价残基；LL是任选的接头；n是1至5的整数，POLY是如本文所述的非肽水溶性聚合物，和x是甲基或醇。如上文所讨论的，IL-2部分可以连接至一个或多个非肽水溶性聚合物，其中每个非肽水溶性聚合物连接至IL-2部分的COMP残基。
缀合基团促进本文所述的反应性基团与本文所述的官能团缀合。在某些实施方案中，缀合的缀合基团键在本文中称为QQ。缀合基团可以通过本领域技术人员公知的任何适宜反应机制反应。在某些实施方案中，缀合基团通过[3+2]炔烃-叠氮化物环加成反应、反电子需求Diels-Alder连接反应、硫醇-亲电试剂反应或羰基-氧基胺反应，如本文中所详细描述的。在某些实施方案中，缀合基团包含炔、应变炔、四嗪、硫醇、对乙酰基-苯丙氨酸残基、氧基胺、马来酰亚胺或叠氮化物。
在某些实施方案中，缀合基团是：
Figure BDA0003985829980000621
其中波浪线表示与相邻原子的键，例如，接头、PEG或接头-PEG的碳残基。
例如，在以下描述了其他缀合基团：美国专利公开号2014/0356385、美国专利公开号2013/0189287、美国专利公开号2013/0251783、美国专利号8,703,936、美国专利号9,145,361、美国专利号9,222,940和美国专利号8,431,558。
缀合后，形成缀合基团的二价残基“QQ”，并且与第二化合物的残基键合。二价残基的结构由用于形成缀合物的缀合反应的类型决定。
在某些实施方案中，当通过[3+2]炔烃-叠氮化物环加成反应形成缀合物时，缀合基团的二价残基包含三唑环或包含三唑环的稠合环基团。在某些实施方案中，当通过应变促进的[3+2]炔烃-叠氮化物环加成(SPAAC)反应形成缀合物时，缀合基团的二价残基是：
Figure BDA0003985829980000631
或区域异构体
Figure BDA0003985829980000632
其中波浪线表示与相邻原子的键。
在一个实施方案中，本文提供了根据式(上文)的缀合物，或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或互变异构体；其中QQ包含三唑环。在一个实施方案中，本文提供了根据式(上文)的缀合物，或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或互变异构体；其中QQ是三唑环或包含三唑环的稠合的环基团。在一个实施方案中，本文提供了根据式(上文)的缀合物，或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或互变异构体；其中QQ是：
Figure BDA0003985829980000633
或区域异构体
Figure BDA0003985829980000634
其中波浪线表示与相邻原子的键。
在一个方面中，本文提供了IL-2缀合物，其包含本文所述的水溶性聚合物以及连接至IL-2缀合物的本文所述的任选的接头，其中COMP是IL-2缀合物的残基。在一个实施方案中，本文提供了根据式(上文)的IL-缀合物，或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或互变异构体，其中：COMP是IL-2部分的残基；且QQ包含三唑环或包含三唑环的稠合的环基团。在一个实施方案中，本文提供了根据式(Cl)的IL-2缀合物，或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或互变异构体，其中：COMP是IL-2部分的残基；且QQ是：
Figure BDA0003985829980000641
或区域异构体
Figure BDA0003985829980000642
其中波浪线表示与相邻原子的键。
在一个实施方案中，本文提供了根据下式的缀合物，其中COMP表示IL-2部分的非天然氨基酸残基，p是1至10的整数；n是1至5,000的整数；和R是选自甲基和H的封端基团：
Figure BDA0003985829980000643
或具有下式的区域异构体
Figure BDA0003985829980000644
在特定实施方案中，本文提供了根据任一者的IL-2缀合物，其中COMP表示在一个或多个IL-2部分位置处的非天然氨基酸的残基，所述残基选自由以下组成的组：氨基末端、Pl、T2、S3、S4、S5、T6、K7、K8和T9，其中氨基位置对应于编号方案A。在某些实施方案中，COMP表示在位置S4处的非天然氨基酸残基。
在上述缀合物的特定实施方案中，具有叠氮化物官能团的IL-2部分内的非天然氨基酸残基具有下式：
Figure BDA0003985829980000645
其中波浪线表示IL-2类似物的相邻氨基酸的键。
示例性化合物包括具有下式的缀合物
Figure BDA0003985829980000651
其中p是1至10的整数，且n是1至5,000的整数，或具有下式的区域异构体
Figure BDA0003985829980000652
其中p是1至10的整数，且n是1至5,000的整数，和
Figure BDA0003985829980000653
其中p是1至10的整数，且n是1至5,000的整数，或具有下式的区域异构体
Figure BDA0003985829980000661
其中p是1至10的整数，且n是1至5,000的整数。
示例性化合物包括具有下式的缀合物
Figure BDA0003985829980000662
其中n是1至5,000的整数或具有下式的其区域异构体
Figure BDA0003985829980000663
其中n是1至5,000的整数，和
Figure BDA0003985829980000671
其中n是1至5,000的整数或具有下式的其区域异构体
Figure BDA0003985829980000672
其中n是1至5,000的整数。
示例性缀合物还包括具有下式的缀合物：
CON1
Figure BDA0003985829980000673
其中n是约681或者具有下式的其区域异构体
Figure BDA0003985829980000681
其中n是约681，和
CON2
Figure BDA0003985829980000682
其中n是约681，或者具有下式的其区域异构体
Figure BDA0003985829980000683
其中n是约681。
IL-2缀合物的制备
可以通过标准技术制备IL-2缀合物。在某些实施方案中，在适于从IL-2部分与非肽水溶性聚合物前体形成键的条件下，使IL-2部分与非肽水溶性聚合物前体接触，以形成IL-2部分-水溶性聚合物。在某些实施方案中，在适于形成从IL-2部分到接头的键的条件下，使IL-2部分与接头前体接触。在适于从IL-2部分-接头与非肽水溶性聚合物前体形成键的条件下，使所得IL-2部分-接头与非肽水溶性聚合物前体接触，以形成IL-2部分-接头-非肽水溶性聚合物缀合物。在某些实施方案中，在适于从非肽水溶性聚合物与接头形成键的条件下，使非肽水溶性聚合物前体与接头前体接触。在适于使非肽水溶性聚合物-接头与IL-2部分形成键的条件下，使所得水溶性聚合物前体与IL-2部分接触，以形成IL-2部分-接头-非肽水溶性聚合物缀合物。在本文中公开了用于制备IL-2缀合物的适宜接头，并且在以下实施例中描述了用于缀合的示例性条件。
实施方案还涉及提供编码IL-2部分的分离的核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞，以及用于生产IL-2部分的重组技术。
对于IL-2部分的重组生产，可以分离编码其的核酸并将其插入可复制载体中以进一步克隆(即，扩增DNA)或表达。在一些实施方案中，核酸可以通过同源重组产生，例如如美国专利号5,204,244中所描述的，其全部内容通过引用并入。
很多不同载体是本领域公知的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制原点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，例如如在美国专利号5,534,615中所描述的，其全部内容通过引用并入。
包含一个或多个非天然氨基酸的IL-2部分的表达可以在正交生物合成翻译系统中进行，该系统能够用非天然氨基酸对IL-2序列内的任何选定氨基酸进行位点特异性取代。这种正交生物合成翻译机制包括正交tRNA和正交-RS和正交tRNA/正交-RS对，当将其引入宿主细胞或无细胞翻译系统时，可用于将非天然氨基酸引入目标多肽(蛋白)中。正交tRNA响应于选择密码子递送非天然氨基酸，并且正交合成酶优选氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA。O-RS不能有效地将正交tRNA与任何常见的20种氨基酸氨酰化。构建用于基于细胞或无细胞表达的正交生物合成翻译系统以及使用此类系统在预定位点将非天然氨基酸引入多肽中的方法是本领域公知的和已公开的，例如，美国专利号9797908；7736872；9163271；9797908；97979908；8445446；7736872；7846689；和美国申请20170292139；其每一个的全部内容均通过引用并入本文。
一旦在宿主细胞或无细胞正交翻译系统中产生了引入非天然氨基酸的IL-2部分，则可以通过本领域公知的多种技术从中提取其，包括酶促、化学和/或渗透裂解和物理破坏。细胞因子(例如，IL-2)多肽可以通过本领域公知的标准技术来纯化，如制备色谱、亲和纯化或任何其他适宜技术。
适宜的宿主细胞可以包括细菌细胞，例如大肠杆菌、和真核细胞，例如昆虫细胞(例如，果蝇如黑腹果蝇)、酵母细胞、线虫(例如，C.elegans)、小鼠(例如，小家鼠)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞、人293T细胞、HeLa细胞、NIH 3T3细胞和小鼠红白血病(MEL)细胞)或人细胞或其他真核细胞。其他适宜宿主细胞是本领域技术人员公知的。
当建立细胞系时，通常优选制备稳定的细胞系。例如，对于哺乳动物细胞的稳定转染，众所周知，根据所使用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码选择标记(例如，针对抗生素抗性)的基因与目标基因一起引入宿主细胞。优选的选择标记包括那些赋予药物抗性的标记，如G418、潮霉素或甲氨蝶呤。编码选择标记的核酸分子可以在同一载体上引入宿主细胞，或者可以在单独的载体上引入。用引入的核酸分子稳定转染的细胞可以通过药物选择来鉴定(例如，已经引入选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞则死亡)。
在一个实施方案中，将本文所述的缀合物整合到宿主细胞基因组中。稳定整合的一个优点是实现了单个细胞或克隆之间的一致性。另一个优点是可以选择最好的生产者。因此，建立稳定的细胞系是理想的。在另一个实施方案中，将本文所述的缀合物转染进入宿主细胞。将缀合物转染到宿主细胞中的一个优点是可以最大化蛋白收率。在一个方面中，描述了包含本文所述的核酸构建体或载体的细胞。
药物组合物和施用方法
可以使用本领域可用的方法和本文公开的方法将本文提供的IL-2缀合物配制成药物组合物。本文提供的任何IL-2缀合物可以在适当的药物组合物中提供并通过适当的施用途径施用。
本文提供的方法包括施用药物组合物，其包含至少一种本文提供的IL-2缀合物和一种或多种相容且药学上可接受的载体。在本文中，术语“药学上可接受的”指经联邦政府或州政府的监管机构批准或者在美国药典或其他一般公认的药典中列出适用于动物，且更特别地适用于人。术语“载体”包括与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全和不完全))、赋形剂或载剂。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物是静脉内施用时，可以将水作为载体。盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可以作为液体载体，特别是用于可注射溶液。适宜的药物载体的示例在Martin,E.W.,Remington's PharmaceuticalSciences中进行了描述。
在临床实践中，本文提供的药物组合物或IL-2缀合物可以通过本领域公知的任何途径施用。示例性施用途径包括但不限于吸入、动脉内、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、鼻内、胃肠外、肺和皮下途径。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物或IL-2是胃肠外施用的。
用于胃肠外施用的组合物可以是乳剂或无菌溶液。胃肠外组合物可以包括，例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油和注射用有机酯(例如，油酸乙酯)。这些组合物还可以含有润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。可以通过多种方式进行灭菌，例如使用细菌过滤器、辐射或加热。胃肠外组合物也可以制备成无菌固体组合物形式，其可以在使用时溶解在无菌水或任何其他可注射的无菌介质中。
在一些实施方案中，本文提供的组合物是药物组合物或单一单位剂型。本文提供的药物组合物和单一剂型包含预防或治疗有效量的一种或多种预防性或治疗性IL-2缀合物。
药物组合物可以包含一种或多种药物赋形剂。可以使用任何适宜的药物赋形剂，并且本领域普通技术人员能够选择适宜的药物赋形剂。适宜赋形剂的非限制性示例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。特定赋形剂是否适合引入药物组合物或剂型取决于本领域熟知的多种因素，包括但不限于将剂型施用于受试者的方式和在剂型中的特定IL-2部分。如有需要，组合物或单一单位剂型还可以包含少量润湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。因此，下文提供的药物赋形剂旨在说明而非限制。其他药物赋形剂包括，例如，在Handbook of Pharmaceutical Excipients,Rowe等(编著)，第6版，(2009)中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，药物组合物包含消泡剂。可以使用适宜的消泡剂。在一些方面中，消泡剂选自醇、醚、油、蜡、硅酮、表面活性剂及其组合。在一些方面中，消泡剂选自矿物油、植物油、亚乙基双硬脂酰胺、石蜡、酯蜡、脂肪醇蜡、长链脂肪醇、脂肪酸皂、脂肪酸酯、硅乙二醇、氟硅酮、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物、聚二甲基硅氧烷-二氧化硅、醚、辛醇(octylalcohol)、辛醇(capryl alcohol)、失水山梨糖醇三油酸酯、乙醇、2-乙基己醇、聚二甲基硅氧烷、油醇、西甲硅油及其组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含共溶剂。共溶剂的说明性示例包括乙醇、聚乙二醇、丁二醇、二甲基乙酰胺、丙三醇和丙二醇。
在一些实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的说明性示例包括乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、氢氧化物、二乙醇胺、单乙醇胺、甘氨酸、甲硫氨酸、瓜尔胶和谷氨酸一钠。
在一些实施方案中，药物组合物包含载体或填充剂。载体或填充剂的说明性示例包括乳糖、麦芽糖糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、壳聚糖、硬脂酸、黄原胶和瓜尔胶。
在一些实施方案中，药物组合物包含表面活性剂。表面活性剂的说明性示例包括d-α生育酚、苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶、多库酯钠、山萮酸甘油酯、单油酸甘油酯、月桂酸、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、肉豆蔻醇、磷脂、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧甘油酯、月桂基硫酸钠、失水山梨糖醇酯和维生素E聚乙二醇琥珀酸酯。
在一些实施方案中，药物组合物包含防结块剂。防结块剂的说明性示例包括磷酸钙(三碱)、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和氧化镁。
可以与药物组合物一起使用的其他赋形剂包括，例如，白蛋白、抗氧化剂、抗细菌剂、抗真菌剂、生物可吸收聚合物、螯合剂、控释剂、稀释剂、分散剂、溶解促进剂、乳化剂、胶凝剂、软膏基质、渗透促进剂、防腐剂、增溶剂、溶剂、稳定剂和糖。这些试剂的每一种的特定示例描述在例如Handbook of Pharmaceutical Excipients,Rowe等(编著)，第6版，(2009),The Pharmaceutical Press中，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，药物组合物包含溶剂。在一些方面中，溶剂是盐水溶液，如无菌等渗盐水溶液或葡萄糖溶液。在一些方面中，溶剂是注射用水。
在一些实施方案中，药物组合物是颗粒形式，如微粒或纳米粒。微粒和纳米粒可以由任何适宜材料形成，如聚合物或脂质。在一些方面中，微粒或纳米粒是胶束、脂质体或聚合物囊泡。
本文还提供了包含IL-2缀合物的无水药物组合物和剂型，因为，在一些实施方案中，水能够促进一些蛋白的降解。
本文提供的无水药物组合物和剂型可以使用无水或低水分成分以及低水分或低湿度条件来制备。如果预计在制备、包装和/或储存期间与水分和/或湿气大量接触，则包含乳糖和至少一种包含伯胺或仲胺的活性成分的药物组合物和剂型可以是无水的。
可以制备和储存无水药物组合物以保持其无水性质。因此，可以使用已知防止暴露于水的材料包装无水组合物，使得其可以包含在适宜的处方药盒中。适宜包装的示例包括但不限于密封箔、塑料、单位剂型容器(例如，小瓶)、泡罩包装和条形包装(strip pack)。
本文提供的无乳糖组合物可以包含本领域熟知且列于例如美国药典(USP)SP(XXI)/NF(XVI)的赋形剂。在通常情况下，无乳糖组合物包含药学上相容且药学上可接收的量的活性成分、粘合剂/填充剂和润滑剂。示例性无乳糖剂型包含活性成分、微晶纤维素、预胶化淀粉和硬脂酸镁。
还提供了包含一种或多种赋形剂的药物组合物和剂型，所述赋形剂降低IL-2部分或IL-2缀合物的分解速率。在本文中称为“稳定剂”的此类赋形剂包括但不限于抗氧化剂，如抗坏血酸、pH缓冲剂或盐缓冲剂。
胃肠外剂型
在某些实施方案中，提供了胃肠外剂型。可以通过各种途径向受试者施用胃肠外剂型包括但不限于皮下、静脉内(包括弹丸式注射)、肌内和动脉内。因为其施用通常会绕过受试者对污染物的天然防御，所以胃肠外剂型通常是无菌的或者能够在向受试者施用前灭菌。胃肠外剂型的示例包括但不限于注射用溶液、可溶解或混悬在药学上可接受的注射用载体中的干燥产品、注射用混悬剂和乳剂。
可以用于提供胃肠外剂型的适宜载剂是本领域技术人员熟知的。示例包括但不限于：注射用水USP；水性载剂，例如但不限于，氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；水溶性载剂，例如但不限于，乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性载剂，例如但不限于，玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
增加本文公开的一种或多种蛋白的溶解度的赋形剂也可以引入胃肠外剂型中。
剂量和单位剂型
在人类治疗中，医生会根据预防性或治愈性治疗，并且根据年龄、体重、状况和对待治疗受试者具有特异性的其他因素来确定其认为最合适的剂量。
在某些实施方案中，本文提供的组合物是药物组合物或单一单位剂型。本文提供的药物组合物和单一单位剂型包含预防或治疗有效量的一种或多种预防性或治疗性蛋白。
可有效预防或治疗疾病或其一种或多种症状的IL-2缀合物或组合物的量将随疾病或病症的性质和严重程度以及所施用的IL-2部分的途径而变化。频率和剂量也将根据针对每个受试者的特定因素而变化，这取决于施用的具体疗法(例如，治疗剂或预防剂)，病症、疾病或病况的严重程度，施用途径以及受试者的年龄、身体、体重、应答和既往病史。有效剂量可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-应答曲线外推。
在某些实施方案中，组合物的示例性剂量包括每千克受试者或样品重量毫克或微克量的IL-2部分(例如，约10毫克每千克至约50毫克每千克、约100毫克每千克至约25毫克每千克或约100毫克每千克至约10毫克每千克)。在某些实施方案中，基于IL-2部分的重量，本文提供的向受试者施用以预防、治疗、管理或改善病症或其一个或多个症状的IL-2缀合物的剂量是0.1mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、10mg/kg或15mg/kg或更多/受试者体重。
剂量可以根据适宜时间表施用，例如，每周一次、两次、三次或四次。在一些情况下，可能需要使用本文公开的范围之外的IL-2缀合物剂量，这对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。此外，应注意的是，临床医师或治疗医师结合受试者的应答将知道如何以及何时中断、调整或终止治疗。
不同治疗有效量可适用于不同疾病和病况，如本领域普通技术人员将容易知道的那样。类似地，足以预防、控制、治疗或改善此类病症但不足以引起或足以减少与本文提供的蛋白相关的副作用的量也包括在本文所述的剂量和剂量频率时间表中。此外，当向受试者施用多个剂量的本文提供的组合物时，并非所有剂量都需要相同。例如，可以增加向受试者施用的剂量以提高组合物的预防或治疗效果，或者可以降低剂量以减少特定受试者正在经历的一种或多种副作用。
在某些实施方案中，治疗或预防可以用于一个或多个本文提供的IL-2缀合物或组合物的负荷剂量开始，随后是一个或多个维持剂量。在某些实施方案中，可以施用一定剂量的本文提供的IL-2缀合物或组合物以实现受试者血液或血清中IL-2部分的稳态浓度。稳态浓度可以根据本领域技术人员可用的技术通过测量来确定，或者可以基于受试者的身体特征，如身高、体重和年龄。
在某些实施方案中，相同组合物的施用可以重复，并且施用可以间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在其他实施方案中，可重复施用同一预防或治疗剂，且施用时间至少相隔1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。
治疗应用
对于治疗应用，本文提供的IL-2缀合物可以药学上可接受的剂型(如本领域公知的那些和上面讨论的那些)向哺乳动物，通常是人施用。例如，IL-2缀合物可以作为弹丸式注射或通过一段时间内的连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内或肿瘤内途径，对人进行静脉内施用。IL-2缀合物也适合通过瘤周、病灶内或病灶周围途径施用，以发挥局部和全身治疗效果。腹膜内途径可能特别有用，例如，在治疗卵巢肿瘤中。
本文提供的IL-2缀合物可用于治疗涉及IL-2受体的任何疾病或病况。在一些实施方案中，疾病或病况是将从免疫应答的刺激或放大中获益的疾病或病况。在一些实施方案中，疾病或病况是可能从使用IL-2部分的治疗中获益的疾病或病况。在一些实施方案中，疾病或病况是癌症。在一些实施方案中，疾病或病况是感染性疾病(例如，HIV感染或HCV感染)。
可以用本文提供的IL-2缀合物治疗任何适宜的癌症。说明性适宜的癌症包括，例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)癌，或TNBC)、支气管肿瘤、原发性不明癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、导管癌、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、嗅神经母细胞瘤、输卵管癌、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、眼癌、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、肝细胞癌、组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、唇部和口腔癌、肝癌、小叶原位癌、肺癌、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、涉及NUT基因的中线癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌样瘤、唾液腺癌、Sezary综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、胃癌、T细胞淋巴瘤、畸胎瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和Wilms肿瘤。
在一些实施方案中，待用本文提供的IL-2缀合物治疗的疾病是胃癌、结直肠癌、肾细胞癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、子宫癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫体癌、子宫内膜癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、间皮瘤和/或上皮来源的癌症。在特定实施方案中，疾病是结直肠癌。在一些实施方案中，疾病是卵巢癌。在一些实施方案中，疾病是乳腺癌。在一些实施方案中，疾病是三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，疾病是肺癌。在一些实施方案中，疾病是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，疾病是头颈癌。在一些实施方案中，疾病是肾细胞癌。在一些实施方案中，疾病是脑癌。在一些实施方案中，疾病是子宫内膜癌。
组合产品
进一步提供了包含本文公开的IL-2缀合物或组合物的组合产品。在特定实施方案中，IL-2缀合物包含在医疗递送器械中。治疗递送器械具有章节201(h)中规定的定义，并且包括但不限于注射器、自动注射器、医用笔、泵等。
在特定实施方案中，组合产品包含治疗剂和IL-2缀合物，其以物理、化学或其他方式组合或混合并作为单一实体生产。
组合产品还包括其中IL-2缀合物单独包装的实施方案，并且旨在仅与获批的单独指定的治疗剂或器械一起使用，其中两者都需要实现预期用途、适应症或效果，并且在IL-2缀合物获得批准后则需要更改已获批产品的标签，例如，以反映预期用途、剂型、规格、施用途径或剂量的显著变化。
组合产品还包括其中IL-2缀合物单独包装的实施方案，并且根据其拟定的标签，其仅与另一种单独指定的研究治疗药物或器械一起使用，两者都需要达到预期的用途、适应症或效果。
在特定实施方案中，治疗剂是检查点抑制剂，如PD-1阻断剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。可用于本发明的联合疗法的示例性抗PD-1抗体包括结合PD-1并抑制PD-1结合PD-L1的任何抗体。在进一步的实施方案中，示例性抗PD-1抗体选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗和西米普利单抗(cemiplimab-rwlc)。示例性抗体包括下述抗PD-1抗体和包含抗PD1抗体的组合物以及药学上可接受的载体或盐。
派姆单抗(也称为KEYTRUDA、兰博利珠单抗、MK-3475或SCH-900475)是一种人源化抗PD-1抗体，在美国专利号8,354,509中描述和在例如Hamid等，New England J.Med.369(2):134-144(2013)中公开。纳武单抗(也称为OPDIVO、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558)是一种全人IgG4抗PD-1抗体，在WO2006/121168和美国专利号8,008,449中描述。西米普利单抗(也称为cemiplimab、LIBTAYO或REGN2810)是一种重组人IgG4单克隆抗体，在WO2015112800和美国专利号9,987,500中描述。
在特定实施方案中，治疗剂是化学治疗剂。示例性化学治疗剂包括但不限于
(i)烷化剂，包括但不限于双功能烷化剂、环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥和美法仑；
(ii)单功能烷化剂，包括但不限于达卡巴嗪、亚硝基脲和替莫唑胺(口服达卡巴嗪)；
(iii)蒽环类药物，包括但不限于柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌和戊柔比星；
(iv)细胞骨架破坏剂(紫杉烷类)，包括但不限于紫杉醇、多西紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)和泰素帝；
(v)埃坡霉素，包括但不限于伊沙匹隆和优替隆；
(vi)组蛋白去乙酰化酶抑制剂，包括但不限于，伏立诺他和罗米地辛；
(vii)拓扑异构酶i抑制剂，包括但不限于，伊立替康和拓扑替康；
(viii)拓扑异构酶ii抑制剂，包括但不限于，依托泊苷、替尼泊苷和他氟泊苷；
(ix)激酶抑制剂，包括但不限于，硼替佐米、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、维罗非尼和维莫德吉；
(x)核苷酸类似物和前体类似物，包括但不限于，阿扎胞苷、硫唑嘌呤、氟嘧啶类(例如，如卡培他滨、卡莫氟、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶和替加氟)、阿糖胞苷、吉西他滨、羟基脲、巯基嘌呤、甲氨蝶呤和硫鸟嘌呤(tioguanine)(以前称为硫鸟嘌呤(thioguanine))；
(xi)肽抗生素，包括但不限于，博来霉素和放线菌素；铂类药物，包括但不限于卡铂、顺铂和奥沙利铂；
(xii)类视黄醇，包括但不限于维甲酸、阿利维甲酸和贝沙罗汀；和
(xiii)长春花生物碱和衍生物，包括但不限于，长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
联合疗法
本发明提供了用于治疗人或动物个体的联合疗法，包括对个体连续或同时施用本发明的IL-2缀合物和第二治疗剂。在一个实施方案中，在向个体施用治疗剂之前的时间向个体施用IL-2缀合物。在另一个实施方案中，在向个体施用IL-2缀合物之前的时间向个体施用治疗剂。IL-2缀合物和治疗剂可以分开的剂量和不同的形式施用。
在特定实施方案中，治疗剂是检查点抑制剂，如PD-1阻断剂。PD-1阻断剂可以按照与PD-1阻断剂在特定适应症的单一疗法中被批准的相同剂量、给药频率和治疗持续时间施用。IL-2缀合物的剂量可以按照美国食品和药物管理局(U.S.FDA)批准的相同给药频率和治疗持续时间施用，或者按照针对与IL-2缀合物配对的特定PD-1阻断剂的给药频率和治疗持续时间施用。
在特定实施方案中，PD-1阻断剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。可用于本发明联合疗法的示例性抗PD-1抗体包括与PD-1结合并抑制PD-1结合PD-L1的任何抗体。在进一步的实施方案中，示例性抗PD-1抗体选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗和西米普利单抗。示例性抗体包括下述抗PD-1抗体和包含抗PD1抗体和药学上可接受的盐的组合物。
目前市售的抗PD-1抗体的具体剂量因抗体而异，因此在本发明的联合疗法的特定实施方案中，剂量、给药频率和/或治疗持续时间可以至少与美国FDA批准的用于特定适应症的特定抗PD-1抗体相同。例如，根据需要派姆单抗的批准剂量为每三周200mg(根据需要儿童个体(两岁至至多18岁)为每三周2mg/kg至至多200mg)；纳武单抗的批准剂量为每两周3mg/kg；根据需要西米普利单抗的批准剂量是每三周350mg；根据需要阿特朱单抗的批准剂量是每三周1200mg；根据需要阿维鲁单抗的批准剂量是每两周10mg/kg或800mg；和根据需要德瓦鲁单抗的批准剂量是每两周10mg/kg。
在联合疗法的特定实施方案中，PD-1阻断剂是抗PD-1抗体或抗PD-1抗体片段，其可以以从约150mg至约250mg、从约175mg至约250mg、从约200mg至约250mg、从约150mg至约240mg、从约175mg至约240mg或从约200mg至约240mg的剂量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的剂量是150mg、175mg、200mg、225mg、240mg或250mg。在进一步的实施方案中，抗PD-1抗体或抗PD-1抗体片段可以根据需要以每三周的频率施用。在本发明联合疗法的另一个实施方案中，抗PD-1抗体或抗PD-1抗体片段可以大于250mg的剂量施用，例如，根据需要以每六周的频率施用约400mg的剂量。
在联合疗法的特定实施方案中，PD-1阻断剂是抗PD-1抗体或抗PD-1抗体片段，其可以以约10mg/kg至约1200mg的剂量施用。在进一步的实施方案中，PD-1阻断剂片段可以根据需要以每两到三周的频率施用。
虽然PD-1阻断剂至少可以按照目前上市的PD-1阻断剂单一疗法批准的剂量、给药频率和治疗持续时间施用，但是任何特定组合的实际剂量、给药频率和治疗持续时间可能不同于已获批的PD-1阻断剂单一疗法的那些。因此，在本发明的联合疗法的特定实施方案中，联合疗法中任何特定PD-1阻断剂的剂量、给药频率和治疗持续时间将根据针对联合疗法进行的临床试验确定。
在联合疗法的特定实施方案中，PD-1阻断剂是纳武单抗或纳武单抗的效应物沉默变体，其根据需要每两到三周以3mg/kg的剂量在30至60分钟内静脉内施用，并且其中每个剂量的IL-2缀合物在施用PD-1阻断剂后静脉内施用，持续时间与PD-1阻断剂相同或持续时间小于或大于PD-1阻断剂持续时间。在特定实施方案中，纳武单抗或纳武单抗的效应物沉默变体以3mg/kg的初始剂量在30分钟内静脉内施用，然后在同一天在30分钟内静脉内施用IL-2缀合物，每三周一次，共4剂，然后以固定剂量静脉内施用纳武单抗，每两周240mg，持续30分钟，或每四周480mg，持续30分钟。
在特定实施方案中，PD-1阻断剂是派姆单抗或派姆单抗的效应物沉默变体，其根据需要每三周以200mg的剂量每30分钟静脉内向成人个体施用，或者每三周在30分钟内以2mg/kg的剂量向儿科个体静脉内施用最多200mg，其中每次治疗之后是一剂IL-2缀合物，其中每剂IL-2缀合物在施用PD-1阻断剂后静脉内施用，持续与PD-1阻断剂相同的治疗持续时间或持续时间小于或大于PD-1阻断剂持续时间。
在特定实施方案中，PD-1阻断剂是派姆单抗或派姆单抗的效应物沉默变体，其根据需要每六周在30分钟内以400mg剂量对成人个体进行静脉内施用，其中每次治疗之后是一剂IL-2缀合物，其中每剂IL-2缀合物在施用PD-1阻断剂后静脉内施用，持续与PD-1阻断剂相同的治疗持续时间或持续时间小于或大于PD-1阻断剂持续时间。
在联合疗法的特定实施方案中，PD-1阻断剂是西米普利单抗或西米普利单抗的效应物沉默变体，其根据需要每三周以350mg的剂量在30分钟内静脉内施用，并且其中每剂IL-2缀合物在施用PD-1阻断剂后静脉内施用，持续时间与PD-1阻断剂相同或持续时间小于或大于PD-1阻断剂持续时间。在特定实施方案中，西米普利单抗或西米普利单抗的效应物沉默变体在30分钟内以350mg的初始剂量静脉内向个体施用，然后根据需要每三周在同一天在30分钟内施用IL-2缀合物。
在联合疗法的特定实施方案中，PD-1阻断剂是阿特朱单抗或阿特朱单抗的效应子沉默变体，其根据需要每三周以1200mg的剂量在60分钟内对个体静脉内施用，并且其中每剂IL-2缀合物在施用PD-1阻断剂后静脉内施用，持续时间与PD-1阻断剂相同或持续时间小于或大于PD-1阻断剂持续时间。在特定实施方案中，阿特朱单抗或阿特朱单抗的效应物沉默变体在60分钟内以1200mg的初始剂量静脉内向个体施用，然后根据需要每三周在同一天在30分钟内施用IL-2缀合物。
在联合疗法的特定实施方案中，PD-1阻断剂是阿维鲁单抗或阿维鲁单抗的效应子沉默变体，其根据需要每两周以10mg/kg或800mg的剂量在60分钟内对个体静脉内施用，并且其中每剂IL-2缀合物在施用PD-1阻断剂后静脉内施用，持续时间与PD-1阻断剂相同或持续时间小于或大于PD-1阻断剂持续时间。在特定实施方案中，阿维鲁单抗或阿维鲁单抗的效应物沉默变体在60分钟内以10mg/kg或800mg的初始剂量静脉内向个体施用，然后根据需要每两周在同一天在30分钟内施用IL-2缀合物。
在联合疗法的特定实施方案中，PD-1阻断剂是德瓦鲁单抗或德瓦鲁单抗的效应子沉默变体，其根据需要每两周以10mg/kg的剂量在60分钟内对个体静脉内施用，并且其中每剂IL-2缀合物在施用PD-1阻断剂后静脉内施用，持续时间与PD-1阻断剂相同或持续时间小于或大于PD-1阻断剂持续时间。在特定实施方案中，德瓦鲁单抗或德瓦鲁单抗的效应物沉默变体在60分钟内以10mg/kg的初始剂量静脉内向个体施用，然后根据需要每两周在同一天在30分钟内施用IL-2缀合物。
虽然目前批准的PD-1阻断剂以允许在30至60分钟时间范围内静脉内施用于个体的浓度的制剂形式提供，但是本发明的联合疗法涉及这样的实施方案，其中IL-2缀合物和/或PD-1阻断剂各自以允许分别在单次注射中单独施用于个体的浓度在制剂中提供。能够在单次注射中提供两种阻断剂中的至少一种将显著减少向个体施用两种阻断剂的时间。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种联合疗法，其中同时共同施用IL-2缀合物和PD-1阻断剂。可以通过在单独的制剂中提供IL-2缀合物和PD-1阻断剂并同时向个体提供每种制剂，通过单独的IV或在通过IV向个体施用混合物之前混合，或通过将每种制剂单独注射到个体中来完成共同施用。共同施用也可以通过在单一制剂中提供IL-2缀合物和PD-1阻断剂来实现，然后在单一IV或单一注射中向个体施用。
可以将本发明的联合疗法与化疗联合施用于患有癌症的个体。个体可以在接受本发明的联合疗法的同时接受化疗。在个体完成化疗之后，个体可以接受本发明的联合疗法。在完成联合疗法之后，可以向个体施用化疗。本发明的联合疗法也可以施用于患有复发性或转移性癌症并伴有疾病进展或复发性癌症并且正在接受化疗或已完成化疗的个体。
选择用于化疗的化疗剂的剂量取决于几个因素，包括在待治疗个体中实体的血清或组织周转率(turnover rate)、症状水平、实体的免疫原性以及靶细胞、器官或组织的可及性。其他治疗剂的剂量应该是提供可接受的副作用水平的量。因此，每种其他治疗剂的剂量和给药频率将部分取决于特定治疗剂、所治疗癌症的严重程度和患者特征。在选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子方面提供了指导。参见，例如，Wawrzynczak(1996)AntibodyTherapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编著)(1991)MonoclonalAntibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(编著)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,MarcelDekker,New York,NY；Baert等，(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等，(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等，(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等，(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等，(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等，(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602；Physicians'Desk Reference 2003(Physicians'Desk Reference，第57版)；Medical EconomicsCompany；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月)。临床医师可以确定合适的剂量方案，例如，使用本领域公知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素，并且将取决于，例如，个体的临床病史(例如，既往治疗)、待治疗的癌症类型和阶段以及对联合疗法中一种或多种治疗剂的应答的生物标志物。
例如，派姆单抗目前被美国FDA批准用于(i)治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的联合疗法，包括派姆单抗与培美曲塞和铂化疗或卡铂和紫杉醇或白蛋白结合型紫杉醇；和(ii)治疗头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)，包括派姆单抗和含铂化疗，以及阿特朱单抗目前被批准用于治疗NSCLC的联合疗法，包括贝伐单抗(抗VEGF-A单抗，以商品名AVASTIN上市销售)、紫杉醇和卡铂。
因此，本发明涵盖本发明联合疗法的实施方案，其进一步包括化疗步骤，所述化疗步骤包括含铂化疗、培美曲塞和铂化疗或卡铂和紫杉醇或白蛋白结合型紫杉醇。在特定实施方案中，具有化疗步骤的联合疗法至少可以用于治疗NSCLC和HNSCC。
与化疗步骤结合的联合疗法可以进一步用于治疗任何增殖性疾病，特别地，治疗癌症。在特定实施方案中，本发明的联合疗法可以用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌、胃肠道癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肾癌、霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、食管癌、肛门癌、胆道癌、结直肠癌、宫颈癌、甲状腺癌或唾液腺癌。
在另一个实施方案中，与化疗步骤结合的联合疗法可以进一步用于治疗胰腺癌、支气管癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、末梢神经系统癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤或血液组织癌。
在特定实施方案中，与化疗步骤结合的联合疗法可以用于治疗一种或多种选自以下的癌症：黑色素瘤(转移性或不可切除)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、尿路上皮癌、MSIHC、胃癌、宫颈癌、肝细胞癌(HCC)、梅克尔细胞癌(MCC)、肾细胞癌(包括晚期)和皮肤鳞癌。
联合疗法治疗
本发明的联合疗法可以用于治疗任何增殖性疾病，特别地，治疗癌症。在特定实施方案中，本发明的联合疗法可以用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌、胃肠道癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肾癌、霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、食管癌、肛门癌、胆道癌、结直肠癌、宫颈癌、甲状腺癌或唾液腺癌。
在另一个实施方案中，本发明的联合疗法可以用于治疗胰腺癌、支气管癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、末梢神经系统癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤或血液组织癌。
目前已上市的PD-1阻断剂经美国FDA批准用于治疗至少一种或多种选自以下的癌症：黑色素瘤(转移性或不可切除)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、尿路上皮癌、MSIHC、胃癌、宫颈癌、肝细胞癌(HCC)、梅克尔细胞癌(MCC)、肾细胞癌(包括晚期)和皮肤鳞癌。因此，本发明的联合疗法可以用于治疗至少一种或多种选自以下的癌症：黑色素瘤(转移性或不可切除)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、尿路上皮癌、MSIHC、胃癌、宫颈癌、肝细胞癌(HCC)、梅克尔细胞癌(MCC)、肾细胞癌(包括晚期)和皮肤鳞癌。
试剂盒
在一些实施方案中，本文提供的IL-2缀合物以试剂盒形式提供，即预定量的试剂的包装组合以及用于执行程序的说明书。在一些实施方案中，程序是诊断测定。在进一步实施方案中，程序是治疗程序。
在一些实施方案中，试剂盒还包含用于重构IL-2缀合物的溶剂。在一些实施方案中，IL-2缀合物是在药物组合物形式中提供的。在一些实施方案中，试剂盒还包含IL-2缀合物以外的治疗剂。在进一步的实施方案中，试剂盒包含组合产品，其包含在医疗递送器械中的IL-2缀合物。
下述实施例旨在促进对本发明的进一步理解。
一般方法
Sambrook,Fritsch和Maniatis(1982&1989第2版，2001第3版)MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；以及Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)中描述了分子生物学中的标准方法。标准方法还见于Ausbel等，(2001),Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,JohnWiley and Sons,Inc.New York,NY中，其描述细菌细胞和DNA诱变中的克隆(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷)。
描述了蛋白纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶(Coligan等，(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,NewYork)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产以及蛋白糖基化(参见，例如，Coligan等，(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley andSons,Inc.,New York；Ausubel等，(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17and Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；AmershamPharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的生产、纯化和片段化(参见Coligan等，(2001)Current Protocols inImmunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York和Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。可获得用于表征配体/受体相互作用的标准技术(参见，例如，Coligan等，(2001)CurrentProtocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New York)。
实施例1
对叠氮基甲基苯丙氨酸(pAMF)引入和PEG缀合的IL-2位点
使用Sutro Xpress CF+无细胞表达平台，将单个IL-2变体设计为引入非天然pAMF残基以替代特定残基(Yin等，Sci Rep 2017,7,1,3026)。选择用于pAMF引入的位点，以通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)或无铜缀合方法，例如，通过二苯并环辛炔(DBCO或DIBO)进行应变促进的叠氮化物-炔烃环加成反应(SPAAC)，使聚乙二醇(PEG)部分缀合。
使用PyMOL分析IL-2结合至IL-2Rα、IL-2Rγc和IL-2Rβ的共结晶结构(Stauber等，2006,Proc Natl Acad Sci USA 103:2793；pdb编码2ERJ)，以鉴定哪些残基具有指向溶剂或IL-2Rα界面的侧链。选择此类残基用于pAMF引入，以实现与PEG的缀合。特别地，选择靠近N末端的12个残基用于pAMF引入，这些残基具有指向溶剂的侧链。选择PEG与这些位点中的任何一个的缀合以增加IL-2的半衰期、降低剂量要求和/或增加总体暴露。还选择在这些位点引入pAMF和/或缀合PEG以影响IL-2Rα、IL-2Rγc和IL-2Rβ的结合亲和力，可以将其用于优化治疗性质，如下文所述。如表1中所示，使用标准诱变或基因合成技术制备IL-2变体，并且引入pAMF的位置。
将阿地白介素(DesA1_IL-2_C124S，称为Ald；SEQ ID NO:2)修饰成具有通过Gly-Gly-Ser(GGS)接头连接的羧基末端HIS6-标签(Ald-6HIS)，且在表1中所示的指定位点处引入pAMF。在14C-亮氨酸存在下，在过夜反应中在Xpress+CF中表达这些变体。通过14C掺入评价IL-2变体的表达能力(总收率)，并在以14,000x g离心10分钟后进一步测量溶液中剩余的量(可溶性收率)。在表1中描述了测量的收率。
Figure BDA0003985829980000891
选择pAMF残基以允许缀合不可降解的PEG。在这种设计中，缀合的PEG旨在允许与全部三种IL-2R受体结合并增加半衰期。与上述方法一样，希望对IL-2Rβ和IL-2Rγc具有超过IL-2Rα的选择性和亲和力，以增加T细胞和NK细胞的抗肿瘤应答，同时最大限度地减少免疫抑制性Treg细胞的激活。然而，在这种设计中，所得PEG-IL-2缀合物在初始给药时具有活性。如上所述，与IL-2Rα的一些结合可能是有益的，但可有可无，以通过刺激Treg细胞或其他表达IL2Rα的细胞群来降低全身毒性。扫描位点以确定对IL-2Rα、IL-2Rγc和IL-2Rβ产生最佳结合亲和力以最大化治疗指数的位点。总的来说，长半衰期和选择性受体接合(engagement)可能比标准的基于IL-2的疗法具有更优选的剂量和更高的治疗指数，例如，阿地白介素。
一些变体的溶解度似乎受到蛋白折叠、稳定性或IL-2在某些位点被pAMF取代的聚集倾向的影响。选择具有最高可溶性收率的前三个IL-2变体用于进一步评价，并相应地表达通过IMAC树脂纯化进行纯化，然后用Capto Q树脂进行二次纯化。然而，将IL-2变体与具有下式的支链20kDa PEG(DBCO 2x10 kDa PEG)缀合
Figure BDA0003985829980000901
其中n和p分别为约227。还评价了未缀合和PEG2缀合变体的热稳定性(表2)，IL-2Rα和IL-2Rβ结合(表3)以及CTLL2 STAT5报告子测定(表4)。
Figure BDA0003985829980000902
Figure BDA0003985829980000903
Figure BDA0003985829980000911
Figure BDA0003985829980000912
实施例2
用于降低对IL2Rα亲和力的IL-2突变
如上文所描述的，希望有一种用于治疗目的的IL-2变体，其对IL-2Rα的亲和力低于天然IL-2，同时保持与IL-2Rγc和IL-2Rβ的结合。这种结合选择性预计会增加T细胞和NK细胞的抗肿瘤应答，相对于天然IL-2，免疫抑制性Treg细胞的应答较低。
为产生对IL-2Rα具有一定范围亲和力的IL-2变体，首先使用PyMOL分析IL-2与IL-2Rα、IL-2Rγc和IL-2Rβ结合的共结晶结构(Stauber等，2006,Proc Natl Acad Sci USA103:2793；pdb编码2ERJ)，以鉴定哪些残基具有IL-2Rα界面的侧链。在所有这些位点使用MOE(Molecular Operating Environment(MOE),2013.08；Chemical Computing GroupULC,1010Sherbooke St.West,Suite#910,Montreal,QC,Canada,H3A 2R7,2018.)扫描突变以鉴定预测具有较低IL-2/IL-2Rα亲和力而不显著影响IL-2稳定性的突变。
特别地，选择了14个预测具有所需亲和力和稳定性的点突变。这些突变在Ald-6HIS中产生，并且由以下取代组成：K34D、T36D、R37G、T40D、F41L、K42G、Y44V、E60T、E61S、K63G、P64A、E67G、L71I和Y106A。另外，使用这些四个取代P64A、E60T、E61S、Y106A的组合选择十组三重突变，预期其进一步降低IL-2对IL-2Rα的亲和力。根据编号方案A对氨基酸位置进行编号。
图2A、图2B和图2C显示了各种IL-2变体与固化的生物素-IL-2Rα或生物素-IL-2Rβ的平衡结合。
使用标准诱变或基因合成技术合成的IL-2变体如下表5中所示。表5还显示了IL-2Rα和IL-2Rβ结合数据，如使用实施例9中描述的方法在Biacore T200上通过SPR测定的。
Figure BDA0003985829980000921
Figure BDA0003985829980000931
分别使用如实施例11和实施例12中描述的PathHunter U2OS IL2RB/IL2RG二聚体测定和GloResponse STAT5-luc2-CTLL-2报告子测定确定IL-2变体的功能性活性。结果如表6中所示。
Figure BDA0003985829980000932
为产生对IL-2Rα具有更低亲和力的IL-2变体，设计了另一轮突变体，如表7A-B中所示。具体而言，从上述第一组来看，E60T、E61S和T40D显示出IL-2Rα结合的显著降低以及相对较低的免疫原性风险。R37A和F41K突变也包括在内，因为其此前已被描述为显著降低与IL-2Rα的结合(Heaton等，Cancer Res 1993,53,2597-2602)。IL-2Rα和IL-2Rβ结合数据如使用实施例9中描述的方法在Biacore T200上通过SPR确定的。
Figure BDA0003985829980000941
Figure BDA0003985829980000942
如实施例8中所述进行蛋白热位移测定以确定IL-2变体的稳定性。
Figure BDA0003985829980000943
Figure BDA0003985829980000951
Figure BDA0003985829980000952
Figure BDA0003985829980000953
Figure BDA0003985829980000961
Figure BDA0003985829980000962
Figure BDA0003985829980000963
Figure BDA0003985829980000971
实施例3
组合pAMF位点和Rα突变
将具有S4pAMF取代的阿地白介素与Rα突变R37A和F41K组合以产生IL-2变体Ald_S4pAMF/R37A/F41K(MUT1)。如以下方案中所示，PEG1与MUT1的pAMF缀合以使用SPAAC无铜缀合来延长半衰期，如实施例6中所述，以产生Ald_S4pAMF(PEG1)/R37A/F41K(CON1)。作为用作对照的参照分子，不具有R37A和F41K突变的变体产生平行Ald_S4pAMF(MUT2)和Ald_S4pAMF(PEG1)(CON2)。
Figure BDA0003985829980000972
实施例4
重组IL-2(rIL-2)和含有pAMF的变体的无细胞表达
在Xpress+CFTM反应中表达阿地白介素和变体。无细胞提取物由来自四种工程菌株的四种提取物的混合物制备：(1)OmpT敏感RF1减毒大肠杆菌菌株，经工程改造以过表达大肠杆菌DsbC和FkpA，(2)类似的RF1减毒大肠杆菌菌株，经过工程改造以产生正交CUA编码tRNA，用于在琥珀终止密码子处插入非天然氨基酸，(3)类似的RF1减毒大肠杆菌菌株，经工程改造以产生pAMF特异性氨酰tRNA合成酶和(4)类似RF1减毒大肠杆菌菌株，经工程改造以产生T7 RNA聚合酶。这种无细胞提取物1在室温(20℃)下用50μM碘乙酰胺处理30min，然后添加到包含所有其他成分的预混液中。蛋白合成反应的最终浓度是30％(v/v)细胞提取物1、1％(v/v)细胞提取物2或5μM正交CUA编码tRNA、0.6％(v/v)细胞提取物3或5μM工程化pAMF-特异性氨酰tRNA合成酶、0.5％(v/v)细胞提取物4或100nM T7 RNAP、2mM对叠氮基甲基苯丙氨酸(pAMF)、2mM GSSG、8mM谷氨酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、35mM丙酮酸钠、1.2mM AMP、0.86mM GMP、UMP和CMP的每一种、2mM氨基酸(除了0.5mM酪氨酸和苯丙氨酸以外)、4mM草酸钠、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、15mM磷酸钾、2.5-5μg/mL IL2或变体DNA。无细胞反应在20-30℃下在振荡器上以650rpm在96孔板中以100μL规模、24孔花板中以1mL规模、在100x 10mm皮氏培养皿中以8mL规模或在搅拌罐中以较大规模进行12小时。
实施例5
阿地白介素和变体的纯化
阿地白介素及其变体在N末端或C末端构建有6x组氨酸标签；可切割亲和力标签；例如，在N末端的His SUMO标签；或无标签。通过标准纯化方法纯化无标签阿地白介素和变体。His标记的阿地白介素(Ald-6HIS)和变体通过标准固化金属亲和层析(IMAC)纯化方法进行纯化。具有可切割亲和标签的分子通过酶消化处理，然后进行标准纯化以去除标签和酶。
实施例6
位点特异性PEG化
将无Cu和Cu催化的缀合化学用于将PEG位点特异性缀合到含有pAMF的阿地白介素变体。
SPAAC无铜缀合：将线性或支链mPEG(10KDa，20KDa，30KDa，40KDa)连接到二苯并环辛炔(DBCO)或二苯并环辛炔醇(DIBO)。在22-35℃下，将DBCO/DIBO-mPEG的5mM储备溶液与加入有pAMF的1-50mg/mL阿地白介素变体以DBCO/DIBO-mPEG与pAMF按照2-50的比例混合8小时至5天。
CuAAC缀合：将线性或支链炔-mPEG的5mM储备溶液(10KDa，20KDa，30KDa，40KDa)与加入有pAMF的1-50mg/mL阿地白介素变体在10x磷酸盐缓冲液(100mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.4)中以炔-mPEG与pAMF按照2-50的比例混合。铜试剂单独通过混合CuSO4、配体(三唑，如三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺，或苯并咪唑，如三钾5,5’,5”-[2,2’,2”-亚硝基三(亚甲基)三(1H-苯并咪唑-2,1-二基)]三戊酸酯水合物)、还原剂(抗坏血酸钠，DTT或TCEP)和ROS清除剂(甲硫氨酸，半胱氨酸或组氨酸)来制备。当将抗坏血酸钠作为还原剂时加入氨基胍。以炔烃与铜的摩尔比为1-15、配体与铜的摩尔比为1-5、还原剂与铜的摩尔比为2-10、抗坏血酸与氨基胍的摩尔比为1-5加入铜。然后，在22-35℃下，将铜试剂与蛋白/药物混合物混合8小时至5天。当需要厌氧条件时，所有溶液在混合前用惰性气体吹扫，反应过程中将反应保持在惰性气体下。
除去未缀合的PEG。通过ELISA或无标记技术(如SPR和/或生物层干涉法(BLI))评价未缀合的或PEG缀合的阿地白介素变体的缀合效率、稳定性和与IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rαβ、IL-2Rαβγc和IL-2Rβγc的结合。
实施例7
PEG化密度
通过反相HPLC测定确定PEG化密度。将蛋白在5M胍中变性并用1mM TCEP蛋白混元，并在C8柱上以0-50％的乙腈梯度运行。通过280nm处的UV轨迹积分确定PEG化密度。将未缀合的蛋白和具有已知PEG化密度的不可水解PEG的缀合物作为参考标准品。
实施例8
差示扫描荧光测定法(DSF)
通过在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中将待测蛋白与环境敏感染料(SYPRO Orange，LifeTechnologies，目录号S-6650)混合，并实时监测混合物在其经历受控热变性的时间的荧光，进行蛋白热位移测定。将0.2-2mg/mL的蛋白溶液以1-1的体积比与1-500PBS稀释的SYPRO Orange溶液混合(SYPRO Orange储备染料在DMSO中为5000x)。将10μL等分试样的蛋白染料混合物一式四份分配到384孔微孔板(Bio-Rad，目录号MSP-3852，板在95℃下预热30分钟)中，并用光学透明密封膜(Bio-Rad，目录号MSB-1001)密封板，并置于384孔板实时热循环仪(Bio-Rad CFX384实时系统)中。将蛋白-染料混合物从25℃加热到95℃，以每个循环0.1℃(约1.5℃/分钟)递增，允许在进行荧光测量之前在各温度下平衡3秒。在实验结束时，使用Bio-Rad CFX管理者软件确定转变熔融温度。
实施例9
使用SPR或BLI的无标记动力学分析
该实施例描述了鉴定阿地白介素变体的方法，所述变体在允许(1)对IL-2R结合具有限制性影响/无影响，(2)减少IL-2Rα结合的同时维持类似IL-2Rβ，或(3)相比于rhIL-2减少IL-2Rβγc结合的位点处聚乙二醇化。该实施例还提供了评估结合性质是否仅通过PEG缀合改变的方法。因此，使用一系列无标记测定来确定阿地白介素变体与IL-2R复合物的各种成分之间的相对结合亲和力。
使用胺偶联化学(来自胺偶联试剂盒，GE Life Sciences)将抗Fc多克隆抗体固化在CM5芯片(GE Life Sciences)上。固化步骤在1x HBS-EP+缓冲液(GE Life Sciences；使用前稀释10x储备液)中以25μL/分钟的流速进行。使用MHS(0.05M)和EDC(0.2M)的混合物活化传感器表面7min。将抗Fc抗体以在10mM乙酸钠(pH4.5)中25μg/mL的浓度注入全部四个流动池中持续7分钟。注入乙醇胺(1M，pH 8.5)7分钟以封闭任何剩余的活化基团。将平均12,000个响应单位(RU)的捕获抗体固化在每个流动池上。
在25℃使用1x HBS-EP+缓冲液进行动力学结合实验。在流动池2、3和4上将IL-2Rα-Fc或IL-2Rβ-Fc(Acro Biosystems，目录号ILA-H5251，ILB-H5253)以3-10μg/mL的浓度以10μL/分钟的流动速率注入抗Fc表面中持续12秒，随后以相同流动速率用缓冲剂洗涤30秒。在1nM-10μM浓度范围内进行缀合或未缀合阿地白介素或变体的动力学表征以及一次无抗原注入。在抗Fc表面上捕获配体(IL-2Rα-Fc或IL-2Rβ-Fc)之后，将分析物(IL-2变体)结合180秒，随后以50μL/min的流速进行600秒解离期。在每种配体捕获和分析物结合循环之间，使用10mM甘氨酸pH 2.0以30μL/分钟注射30秒，然后进行30秒缓冲液洗涤步骤，进行再生。使用Biacore T200评价软件对数据进行拟合。
在ForteBio Octet(Pall Life Sciences)和MASS-1(Sierra Sensors)上评价类似方法，以实现更高的通量测量。还评价了分别用于捕获Fc融合蛋白或生物素化蛋白的抗人捕获(AHC)或链霉亲和素(SA)表面。
实施例10
Kit225STAT5-luc测定
使用Promega pGL4.52 luc2P/STAT5 RE/Hygro载体(GenBank登录号JX206457)，用STAT5反应性荧光素酶报告子对人T淋巴细胞Kit225细胞系(Hori等，Blood 70:1069-1072(1987))进行工程改造。该载体包含五个拷贝的STAT5应答元件(STAT5 RE)，其可驱动荧光素酶报告基因luc2P的转录。为评估IL-2分子的效力，将Kit225STAT5luc细胞以1x104个细胞/孔铺板，并静置过夜。然后用连续稀释的IL-2待测物处理Kit225 STAT5 luc细胞，孵育6小时，随后使用BrightGLO荧光素酶底物试剂盒(Promega)测量STAT5激活情况。
实施例11
PathHunter U2OS IL2RB/IL2RG二聚化测定
将U2OS IL2RB/IL2RG(DiscoverX,93-0998C3)细胞解冻，并且在含有100IU青霉素/100μg/mL链霉素(Corning)、2mM GlutaMax(Gibco)、10％热灭活胎牛血清(FBS)(Sigma)的完全DMEM/F-12(Corning)中培养。另外添加250μg/mL潮霉素和500μg/mL G418用于选择。在阿地白介素或变体处理前一天，将25μL细胞以0.075x106个细胞/mL的密度接种在标准白色TC包被的384孔板的完全培养基中，每孔总共有1,875个细胞。在测定当天，使用25μL连续稀释的阿地白介素或变体样品(1μM起始浓度的1:8连续稀释)处理细胞。将细胞在37℃、5％CO2下孵育24小时。添加30μL重构的Beta-Glo(Promega)试剂，并在室温下振荡孵育25分钟。在Envision酶标仪(PerkinElmer)上读取板，使用1μM阿地白介素处理的细胞作为对照，将发光读数转换为相对信号百分比。使用GraphPad Prism使用对数(相对于)对响应、可变斜率、4参数拟合方程对数据进行非线性回归分析。数据表示为相对于以nM为单位的阿地白介素或变体样品剂量的相对信号％。
EXAMPLE 12
GloResponse STAT5-luc2-CTLL-2报告子测定
将GloResponse STAT5-luc2-CTLL-2(Promega,CD2018B05)细胞维持在含有100IU青霉素/100μg/mL链霉素(Corning)、2mM GlutaMax(Gibco)、20％热灭活FBS(Sigma)和10ng/mL IL-2(Peprotech)的完全RPMI-1640(Corning)中。在测定当天，细胞在处理前至少4小时缺乏IL-2。将25μL细胞以0.075x 106个细胞/mL的密度接种到标准白色TC包被的384孔板的完全培养基中，每孔总共有1,875个细胞。使用25μL连续稀释的阿地白介素或变体样品(1μM起始浓度的1:8连续稀释)处理细胞，然后在37℃、5％ CO2下孵育24小时。添加30μL重构的Beta-Glo(Promega)试剂，并在室温下振荡孵育25分钟。在Envision酶标仪(PerkinElmer)上读取板，使用1μM野生型IL-2(阿地白介素)处理的细胞作为对照，将发光读数转换为相对信号百分比。使用GraphPad Prism使用对数(相对于)对响应、可变斜率、4参数拟合方程对数据进行非线性回归分析。数据表示为相对于以nM为单位的样品剂量的相对信号％。
实施例13
NK-92、M07-e和DERL-7细胞增殖测定
将NK-92(IL2RABG,ATCC,CRL-2407)、M07-e(IL2RBG,DSMZ)和DERL-7(IL2RBG,DSMZ,ACC 524)细胞维持在含有100IU青霉素/100μg/mL链霉素(Corning)、2mM GlutaMax(Gibco)、20％热灭活FBS(Sigma)和10ng/mL IL-2(Peprotech)的完全RPMI-1640(Corning)中。在测定当天，细胞在处理前至少4小时缺乏IL-2。将25μL细胞以0.075x 106个细胞/mL的密度接种到标准白色TC包被的384孔板的完全培养基中，每孔总共有1,875个细胞。使用25μL连续稀释的阿地白介素或变体样品(1μM起始浓度的1:8连续稀释)处理细胞，然后在37℃、5％ CO2下孵育24小时。添加30μL重构的CellTiter-Glo(Promega)试剂，并在室温下振荡孵育25分钟。在Envision酶标仪(PerkinElmer)上读取板，使用1μM阿地白介素处理的细胞作为对照，将发光读数转换为相对信号百分比。使用GraphPad Prism使用对数(相对于)对响应、可变斜率、4参数拟合方程对数据进行非线性回归分析。数据表示为相对于以nM为单位的样品剂量的相对信号％。
实施例14
阿地白介素变体的体内活性
将8至10周龄的雌性C57BL/6小鼠用异氟醚麻醉，并在右后肋腹部皮下植入1x 106个B16F10细胞。当形成肿瘤(平均肿瘤尺寸约125或130mm3)时，开始随机分组并开始治疗(每组n＝8)。每周3次监测体重和肿瘤尺寸，直至组平均值为约1,500mm3。为评估单一药剂有效性，向携带已形成B16F10(黑色素瘤)肿瘤的C57BL/6小鼠静脉内(IV)施用载剂和有效剂量的CON1或CON2，每7天给予2剂(q7dx2)。
实施例15
体内免疫细胞表型分析
以载剂或有效剂量CON1或CON2的单次施用，向C57BL/6无瘤或B16F10荷瘤小鼠(如上文所述)静脉内施用。在B16F10荷瘤小鼠中，在治疗开始后3、7或10天收获肿瘤(每组n＝5)，并进行机械和酶促消化，以通过流式细胞术分析免疫细胞亚型。在未荷瘤小鼠中，治疗后7天收集脾脏和外周血(每组n＝4)进行分析。计算淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的数量以及具有T效应表型与T调节表型(Teff:Treg)的比率。预计诱导更多TIL数量和更高Teff:Treg比率的候选药物会对rhIL-2产生更好的治疗应答，并被选择用于进一步开发。
实施例16
阿地白介素变体的体内药代动力学(PK)评估
在非荷瘤C57BL/6动物中对IL-2变体的药代动力学(PK)性质进行评估。小鼠接受单次静脉团注0.8mg/kg CON1、CON2或阿地白介素(每个取样时间n＝3)。在锂肝素化管中收集血液并通过离心收获血浆。将所有样品在-80℃下保存直至进行分析。对样品进行处理并通过ELISA进行分析，以确定变体IL-2物质的血浆浓度。使用Phoenix WinNonLin进行PK参数分析。与阿地白介素相比，具有延长半衰期(T1/2)和暴露(曲线下面积增加，AUC)的30kDaPEG化IL-2变体物质预计具有更高的治疗效用，并且选择用于进一步开发。
实施例17
体外药理学
CON1的体外表征证实了相对于阿地白介素和CON2的IL-2Rβγc偏向性质。当通过SPR评估时，CON1显示与IL-2Rα(小鼠、大鼠、恒河猴、食蟹猴、人)的结合缺乏，以及与IL-2Rβ(人、食蟹猴、恒河猴)的结合在阿地白介素的六倍以内。在表达IL-2Rα的细胞中，CON1的生物活性降低100至5000倍，具体取决于测定方法。人DERL-7细胞系缺乏IL-2Rα的表达，CON1和CON2的效力彼此相差不到2倍。使用IL-2Rα敲除细胞系进一步比较聚乙二醇化和突变蛋白的相对影响，证明在没有IL2-Rα的情况下，CON1中的突变蛋白对效力没有影响。用人PBMC测量pSTAT5激活并与CON1进行比较的实验表明，与非偏向CON2相比，CON1在Treg细胞(表达IL-2Rαβγc)中诱导更大的活性降低，而在CD8 CTL(表达IL-2Rβγc)上观察到CON1和CON2的活性降低相似。
通过表面等离子体共振确定CON1对人、食蟹猴、恒河猴、小鼠和大鼠IL-2-Rα和IL-2-Rβ的结合亲和力
将在Biacore T200(GE Healthcare)仪器上进行的表面等离子体共振(SPR)测定用于确定聚乙二醇化阿地白介素变体对多聚组氨酸标记或Fc标记IL-2受体的单价亲和力。将Biacore T200评价软件用于将每个滴定系列拟合至1:1结合模型或稳态亲和力。针对每组滴定确定结合(kon,M-1s-1)和解离(koff,s-1)速率常数，并用于计算各样品针对各受体的解离常数,KD＝koff/kon。在本文中未报告koff/kon值。
为测量CON1和阿地白介素对IL-2R亚基的亲和力，在抗组氨酸或抗hu Fc抗体表面捕获受体。阿地白介素对所有种类的IL-2Rα的亲和力在9.9至29nM之间，而CON1在2μM下检测时未显示可检查到的与任何IL-2Rα的结合(表10)。阿地白介素和CON1未显示可检测到的与小鼠和大鼠IL-2-Rβ的结合。CON1对人和食蟹猴/恒河猴IL-2-Rβ的亲和力比阿地白介素低六倍。阿地白介素和CON1两者均具有对于人和食蟹猴/恒河猴IL-2-Rβ的1.5倍内的亲和力，分别为0.73μM和1.1μM和4.4μM和5.4μM(表10)。
Figure BDA0003985829980001051
Figure BDA0003985829980001061
CON1对表达IL-2Rα的细胞系显示出极大的活性降低
在小鼠CTLL2-STAT5报告细胞(表达小鼠IL-2Rαβγc)以及人Kit225-STAT5报告细胞(表达人IL-2Rαβγc)中获得了CON1和CON2激活STAT5通路的活性。还在人NK92细胞(表达IL-2Rαβγ)和人DERL-7细胞(表达IL-2Rβγc)中评价了CON1和CON2刺激细胞增殖的活性。三次独立实验的代表性数据如图3中所示，与阿地白介素相比，IL-2Rβγc偏向性CON1比非偏向性CON2(小于5倍)显示出在表达IL-2Rαβγc的细胞中的活性的较大程度的降低(在CTLL2-STAT5报告细胞上大于5000倍，在Kit225-STAT5报告细胞上大于400倍和在NK92细胞上大于100倍)，而CON1(约20倍)和CON2(约40倍)两者在表达IL-2Rβγc的细胞(DERL-7细胞)上观察到活性的类似降低(表11)。
Figure BDA0003985829980001062
Figure BDA0003985829980001071
CON1提高CTL对Treg的相对效力
在分离自不同人供体的PBMC中评价了CON1和CON2在原代人Treg(表达IL-2Rαβγc)和CD8+CTL细胞(表达IL-2Rβγc)中激活STAT5通路的活性。如图4A中所示，对于人供体#1，IL-2Rβγc偏向性CON1在Treg细胞中的活性降低(与阿地白介素相比约3500倍)比非偏向性CON2(与阿地白介素相比约10倍)更大，而在CD8+CTL上观察到CON1和CON2的活性也有类似的降低(与阿地白介素相比约为20倍)。CON1在Treg细胞和CTL上的活性差异导致CTL/Treg细胞的相对效力提高(与约900的阿地白介素相比CON1的相对EC50约为6，且CON2约为1200倍)。如图4B中所示，CON1和CON2在来自人供体#2的Treg细胞和CD8+CTL上观察到类似结果(表12)。
Figure BDA0003985829980001072
Figure BDA0003985829980001081
CON1对表达IL-2Rα的人类细胞的活性大大降低，而在没有IL-2Rα的情况下，IL-2βγc偏向突变蛋白对效力没有影响
评估CON2、MUT1(Ald_S4pAMF/R37A/F41K)和CON1在人T淋巴细胞Kit225细胞系(表达IL-2Rαβγc)以及使用CRISPR-Cas9基因组编辑技术制备的CD25敲除Kit225细胞系(仅表达IL-2Rβγ)中激活STAT5通路的激活。选择待测物来表示工程化IL-2的关键属性：CON2，其具有野生型IL-2活性；MUT1，其没有PEG化的IL-2βγc偏向性；和CON1，其具有PEG化的IL-2βγc偏向性突变蛋白。
在表达IL-2Rαβγc的Kit225细胞中，与阿地白介素相比，IL-2Rβγc偏向性突变蛋白CON1和MUT1的活性降低(分别低190倍和5109倍)比无偏向性CON2(低4倍)更大，后者具有野生型IL-2活性。在仅表达IL-2Rβγc的CD25敲除Kit225细胞中，与阿地白介素相比，CON2和CON1的活性降低24倍。MUT1的活性与阿地白介素类似。如图5A和图5B中所示，工程化人T细胞淋巴细胞Kit225显示出CD25驱动的信号转导对STAT5信号转导效力的影响，CD25的敲除强调R37A/F41K突变蛋白对IL-2R-βγc驱动信号转导无影响。在图5A中，在表达IL-2Rαβγc和STAT5荧光素酶报告子的Kit225细胞中，与阿地白介素相比，IL-2Rβγc偏向性突变蛋白MUT1和CON1比非偏向性CON2(低4倍)显示出活性的较大降低(分别低190倍和5109倍)。在图5B中，在仅表达IL-2Rβγc的CD25敲除Kit225细胞中，MUT1显示出类似于阿地白介素的活性的活性，而CON1显示出低24倍的活性且类似于CON2的活性。在缺乏CD25(IL-2Rα)的情况下，IL-2βγc偏向性突变蛋白对效力没有影响。
实施例18
体内药理学
在小鼠中，外周血的免疫分型显示CON1增加CD8+、Teff记忆和NK群，导致CD8+Teff/Treg比率增加。相对于阿地白介素(t1/2两小时)，PEG化显著改善了CON1(t1/2十小时)的小鼠药代动力学性质。CON1显示在同基因型小鼠模型B16F0中以单一疗法形式的肿瘤生长抑制(TGI)，产生47％ TGI。CON2显示疗效提高(81％ TGI)；然而，在5mg/kg的等效剂量下，CON1的耐受性更好，体重几乎没有或没有减轻。在B16F10肿瘤中评估了CON1对免疫细胞亚型的药效学作用。CON1显示肿瘤中CD8/Treg比率增加；然而，CON2显示出更大的应答幅度和持续时间，这与CON2观察到的更大的肿瘤生长抑制是一致的。与肿瘤微环境中的CON1相比，CON2中CD8 Teff/Treg的更大增加可能部分归因于啮齿动物中IL-2Rα结合亲和力的物种差异。CON1和CON2在初免小鼠单次给药后显示出几乎相同的pSTAT5磷酸化动力学，并且在CD8+和NK细胞中与NKTR-214类似物5PEG相比，pSTAT5激活性质延长，5PEG显示出对CD4的应答持续时间延长。
在小鼠中的CON1治疗导致外周血中CD8+、Teff记忆和NK细胞群增加，以及CD8+/Treg比率增加
在雌性C57BL/6小鼠中评价了CON1和CON2刺激脾脏和外周血(PB)中免疫细胞的体内活性，CON2单次IV给药剂量为3mg/kg，CON1单次IV给药剂量为10mg/kg(剂量选择基于体内有效性)。IV给药后7天，分离免疫细胞并用抗体染色以标记不同的免疫细胞群。与阿地白介素相比，IL-2Rβγc偏向性CON1的治疗极大增加了CD8+、Teff记忆和NK细胞的细胞群(占总免疫细胞的百分比)，从而导致CD8+/Treg比率增加。在CON1治疗小鼠的PBS中也观察到了类似结果。使用CON1治疗仅显示CD8+T细胞和Teff记忆细胞中的细胞群略有增加，这导致CD8+/Treg比率略有增加(图6)。如图6中所示，以10mg/kg剂量对小鼠进行CON1单剂量IV给药7天，大大增加了来自脾脏和PB的CD8+、Teff记忆和NK细胞的百分比，从而导致CD8+/Treg比率增加。
在C57BL/6小鼠中CON1的药代动力学性质
通过在非荷瘤C57BL/6小鼠中单次0.8mg/kg剂量给药后总抗体水平评估CON1的PK性质。在长达7天的几个时间点收集血浆样品用于复合PK分析。IL-2变体CON1、CON2和阿地白介素的平均血浆浓度性质如图7中所示。PK分析表明，与具有野生型IL-2性质的阿地白介素相比，阿地白介素变体CON1和CON2均与不可释放的30kDa PEG缀合，具有更长的t1/2、更低的清除率和更高的暴露量(图7和表13)。在至少两个独立实验中，全部三种分子都显示出可比较的PK性质。还应注意，选择了来自不同研究的代表性阿地白介素数据集与CON1和CON2阿地白介素变体进行比较。报告的阿地白介素终末t1/2是基于最后两个时间点的估计值。
如图7中所示，与阿地白介素相比，CON1和CON2具有延长的PK性质。
Figure BDA0003985829980001101
在同基因型小鼠模型B16F10中CON1的剂量应答在同基因型小鼠黑色素瘤肿瘤B16F10中评价了CON1的剂量应答关系。使用5、7和10mg/kg CON1和5mg/kg CON2(q7dx2：每7天进行两次注射)治疗携带形成的B16F10肿瘤(约125mm3)的小鼠。与载剂对照相比，使用5mg/kg CON1治疗导致显著的有效性(47％TGI,p＝0.0085)(图8A)。活性在5mg/k下趋于平稳，表明缺乏剂量依赖性。5mg/kg下的CON2等效剂量显示出与CON1相比改善的有效性(分别为81％ TGI对比47％)，表明IL-2Rα结合有助于有效性(图8A)。然而，在5mg/kg下CON1比CON2耐受性更好，且伴随极少或无体重减轻(图8B)。如图8A和图8B中所示，CON1在同基因型小鼠肿瘤模型B16F10中显示出显著的抗肿瘤活性且耐受性良好。在同基因型小鼠模型B16F10中CON1的有效性
在同基因型小鼠黑色素瘤肿瘤B16F10中评价了CON1的有效性。使用5mg/kg CON1(q7dx2)治疗携带形成的B16F10肿瘤(约130mm3)的小鼠。与此前的研究一致，与载剂对照相比，5mg/kg CON1显著抑制B16F10肿瘤生长(45％ TGI,p＝0.0197，图9A)，并诱导最低的体重减轻(图9B)。如在图9A和图9B中所示，CON1在同基因型小鼠肿瘤模型B16F10中显示出稳固的有效性和良好的耐受。CON1对B16F10肿瘤的药效学(PD)作用
在B16F10肿瘤中评估了CON1对免疫细胞亚型的PD作用。使用单剂量5mg/kg CON1或CON2治疗携带形成的B16F10肿瘤(约125mm3)的小鼠。为了探索肿瘤微环境中的纵向免疫应答，对治疗后第3、7和10天收集的肿瘤进行流式细胞术分析。免疫浸润检查表明，在给予CON1和CON2的动物中，CD8+T细胞和表达颗粒酶B(GrnZ B+)的CD8+T细胞的频率(活细胞百分比)增加(图10A和图10B)。然而，观察到T细胞浸润和激活动力学的显著差异。CON1在第3天诱导CD8 T细胞和GrnZ B+CD8 T细胞频率的早期增加，而CON2显示延迟激活，在第7天达到峰值并在第10天减少(图10A和图10B)。与载剂治疗组相比，CON1和CON2在第三天显着增加了总NK细胞、NKT细胞和表达GrnZ B+的NKT细胞的频率(图10E、图10F和图10G)。到第7天，这些群体数量下降到与载剂对照相似的水平，并在第10天之前保持低水平(图10E、图10F和图10G)。用CON1和CON2治疗后，与载剂相比，也有较低或类似CD4细胞的趋势，除了第10天CON2的水平增加以外(图10C)。
对CD4细胞群的进一步分析表明，CON1和CON2都在第7天(相对于第3天)促进了Treg细胞的显着减少，随后在第10天恢复(图10D)。CD8+T细胞或NKT细胞的增加和Treg的减少导致肿瘤中这些效应细胞比例的增加。在CON1治疗组的第三天观察到CD8+Teff/Treg和NKT/Treg比率增加，而CON2分别在第七天和第三天显示CD8+Teff/Treg和NKT/Treg比率增加最多(图10H和图10I)。
这些结果表明，虽然CON1和CON2都具有免疫活性，但CON2治疗导致肿瘤微环境中免疫细胞的量级更大、持续时间更长，并且免疫细胞的动力学更有利。这种免疫性质支持CON1相对于CON1略增强的抗肿瘤有效性(图10J)，这与此前研究中观察到的趋势一致。此外，值得注意的是，在第7天CON2诱导的CD8+T细胞扩增以及CD8/Treg比率增加补充了此前有效性研究中通常采用的每周给药方案，这可能进一步有助于其在B16F10模型中的增强的有效性。图10A-J显示IL-2变体CON1诱导B16F10肿瘤微环境中的CD8+T细胞、NK和NK T细胞增加。
CON1治疗后在初免小鼠中STAT5磷酸化的动力学
如图11中所示，在不同时间点(注射后1小时、1、3、5、7和10天)在初免C57BL/6小鼠中评估了CON2、CON1和NKTR-214类似物“5PEG”诱导STAT5磷酸化的活性。CON2和CON1在整个时间点显示出非常相似的pSTAT5体内活性动力学，其中血液中几乎100％的NK和CD8 T细胞在注射后1小时内具有pSTAT5(图11)。当不再在NK或CD8+T细胞中发现pSTAT5时，pSTAT5活性的损失发生在至多72小时时间内。在CD4 T细胞中，CON2和CON1显示pSTAT5的诱导速度较慢(注射后24小时达到峰值)，pSTAT5+CD4T细胞的频率较低(约40％)。与注射后第120天发现pSTAT5完全缺失的NK或CD8+T细胞相比，CD4 T细胞中pSTAT5的逆转也以较慢的动力学发生。5PEG在24(NK或CD8+)或48(CD4)小时显示pSTAT5达到峰值的总体动力学较慢，最大pSTAT5激活较低。虽然CON2和CON1在NK或CD8+T细胞中显示出接近100％的pSTAT5+群，但5PEG IL-2类似物从未达到类似量值，如图11中所示。因此，与5PEG相比，CON2和CON1在初免小鼠的血液中显示出快速且稳固的体内pSTAT5活性。
实施例19
在非人灵长类(NHP)中的CON1和CON2的重复给药药代动力学(PK)和药效学(PD)研究
在癌症患者中，IL-2治疗与血管渗漏综合征(VLS)相关，后者与循环嗜酸性粒细胞的显著增加相关。在NHP中，结果显示在施用CON1和CON2后，嗜酸性粒细胞计数呈剂量相关性增加。然而，在0.3mg/kg的匹配剂量下，CON2相对于CON1具有嗜酸性粒细胞增加的最大量值(图12A和图12B)，表明CON1的潜在安全性优势。
与基于IL-2的药物一致，CON1和CON2的施用导致PD作用，包括给药后48小时内外周淋巴细胞总数的快速减少(边缘化)，随后伴淋巴细胞增加(第4-8天，图12C和图12D)。在第一次和第二次给药后观察到这两种药物的这些周期性趋势，并显示在生命结束时向基线水平的可逆性证据。数据表明，在0.3mg/kg的匹配剂量下，与CON1相比，淋巴细胞扩增的CON1相关幅度更大。
在施用CON1和CON2后，使用流式细胞术分析来表征各种目标淋巴细胞群及其比率。与总淋巴细胞趋势一致，两种药物均引起迅速减少，随后增加细胞毒性T细胞[CTL；CD3+/CD8+/CD4-](图12E和图12F)、调节性T细胞[CD3+/CD4+/CD25+/CD127低](图12G和图12H)和自然杀伤(NK)细胞[CD3-/CD159+](图12I和图12J)。与CON2相比，注意到当CON1≥0.3mg/kg时，NK细胞扩增更大量值，且CD8+:Treg比率具有更大量值(图13A和图13B)。
总而言之，数据表明，相对于NHP中的CON2(非βγc偏向性)，CON1(永久性βγc偏向性)具有更大的药效学性质。
在S4位点加入pAMF的单个不可释放的30kDa PEG进行位点特异性PEG化，可显着延长小鼠(10小时)和NHP(17小时)的半衰期。通过R37A/F41K突变的永久性βγc偏向性消除了与IL-2Rα亚基的结合，并在基于细胞的测定中将αβγc驱动的活性降低100至5000倍，在PBMC中降低2000至3000倍。
实施例20
该实施例提供了来自同基因型小鼠CT26肿瘤模型的数据，该模型表明CON1对肿瘤生长抑制(TGI)的有效性可以通过与抗小鼠PD-1抗体联合施用来增强，并且CON1在5mg/kg和10mg/kg剂量下的单一疗法或与抗小鼠PD1抗体联合使用时具有良好的耐受性。
小鼠
野生型C57BL/6J小鼠来自Jackson实验室。所有动物程序均由MRL的机构动物管理和使用委员会根据实验室动物管理评估和认证协会的指导原则批准。研究由HDBiosciences Inc.(6122Nancy Ridge Drive,San Diego,CA)进行。
肿瘤攻击和治疗
对于同基因型肿瘤实验，在8至12周龄C57BL/6J小鼠的肋腹部皮下(s.c.)注射3x105个CT26细胞。肿瘤直径用电子卡尺测量，肿瘤体积按照长×宽×宽×1/2计算。当肿瘤达到约100mm3时，开始治疗。
根据表14中所示的剂量、时间表和施用途径进行治疗。
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抗小鼠PD-1抗体mDX400包含重链和轻链，其具有在国际专利申请号WO2020185722中公开的氨基酸序列(分别见其中的SEQ ID No.63和64)，其通过引用并入本文。为了控制潜在的同种型效应，使用抗AD5-Hexon小鼠IgG1(D265A)抗体作为IgG1同种型对照。用于配制剂量的载剂是20mM NaOAc，pH 5.5缓冲液。
以1mg/kg给药的阿地白介素显示出与历史观察到的作用相似的肿瘤生长抑制(TGI)作用(之前观察到的作用为69％，本实施例中为68％)(图16A)。当1mg/kg的阿地白介素与10mg/kg的mDX400联合施用时，阿地白介素对TGI的有效性得到增强，联合治疗的TGI为85％，而单一疗法为69％(图16A)。
剂量为5mg/kg的CON1显示出对TGI的有效性，当剂量为5mg/kg的CON1与剂量为10mg/kg的mDX400联合施用时，TGI得到增强，在联合治疗中显示出45％的TGI，而CON1单一疗法为24％(图16B)。以10mg/kg剂量给药的CON1的有效性证明了对TGI的有效性，当以10mg/kg剂量的CON1与以10mg/kg剂量给药的mDX400联合给药时，该有效性得到增强，在联合治疗中显示出49％的TGI，而CON1单一疗法为45％(图16C)。
图17A-17B显示了每个治疗组的个体动物肿瘤体积。针对有应答的治疗组提供了至第36天的完全缓解(CR)。图17A-17B显示了每个治疗组的平均肿瘤体积和平均值的标准误差(初始数量n＝10/组)。由于肿瘤体积大而从研究中去除的动物的肿瘤体积以平均值结转，直到对该治疗组进行最后一次测量。
图18A-18B显示了实验过程期间的体重变化。数据表明，CON1在5和10mg/kg剂量下具有良好的耐受性，无论是作为单一疗法还是与mDX400联合使用。
总结
小鼠CT26同基因肿瘤模型已被用于证明将IL-2治疗与检查点阻断相结合以针对NKTR-214改善肿瘤生长抑制(TGI)的获益(Charych等，Clin Cancer Res；22(3)2016)。阿地白介素单独施用两个疗程，每次1mg/kg，每天两次(BID)，持续5天，或与每5天10mg/kg的小鼠抗PD1抗体(mDX400)联合施用。CON1以10mg/kg的剂量每7天单独或与mDX400联合施用。此处的结果表明，阿地白介素和CON1均具有肿瘤生长抑制作用，并且在与抗PD1抗体联用后该作用进一步增强。CON1的TGI为45％，当与mDX400联用时增加至69％，阿地白介素的TGI为68％，当与mDX400联用时增加至85％。也在5mg/kg剂量下对CON1进行了评价，虽然TGI不太明显，但仍观察到与mDX400联用的获益。通过在整个研究过程中监测体重减轻来评估动物健康状况，CON1在5和10mg/kg剂量下均表现出良好的耐受性。
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尽管参考所示的实施方案描述了本发明，但应当理解的是本发明不限于此。那些本领域普通技术人员和获得本文教导的人员将认识到在其范围内的其他修改和实施方案。因此，本发明不仅限于本文所附的权利要求。
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Claims (80)

1.一种白介素2(IL-2)缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且还包含：
(i)相对于野生型人IL-2降低所述IL-2多肽对人IL-2受体αβγc三聚体(IL-2Rαβγc)的亲和力的一个或多个氨基酸取代；和
(ii)在所述IL-2多肽的N末端处或附近用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端处或附近的缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入；
其中相对于野生型人IL-2，所述IL-2多肽与人IL-2受体βγc二聚体(IL-2Rβγc)具有基本上相似的结合亲和力。
2.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述IL-2多肽与SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性，条件是所述IL-2多肽至少包含氨基酸E15、H16、L19、D20、D84、N88、V91、Q126、T123和I129，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的氨基酸序列中所示的位置。
3.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中根据表面等离子体共振测定所确定的，所述IL-2多肽缀合物与人IL-2受体α单体(IL-2Rα)不具有可检出的结合。
4.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述一个或多个氨基酸取代独立地选自由以下组成的组：K34、T36、R37、T40、F41、K42、F43、Y44、E60、E61、K63、P64、E67、L71、M103、C104和Y106，其中所述氨基酸取代位置对应于SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列中氨基酸的位置。
5.根据权利要求3所述的IL-2缀合物，其中在所述IL-2多肽中的所述一个或多个氨基酸取代在位置R37和F41处。
6.根据权利要求4所述的IL-2缀合物，其中在所述IL-2多肽中的所述氨基酸取代是R37A和F41K。
7.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述IL-2多肽还包含选自由A和S组成的组的氨基酸在位置124处取代半胱氨酸残基，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列中的氨基酸的位置。
8.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述IL-2多肽还包含N末端丙氨酸残基。
9.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸用于取代在位置P1、T2、S3、S4、S5、T6、K7、K8或T9处的氨基酸，或者通过酰胺键连接至N末端氨基酸。
10.根据权利要求9所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸位于对应于SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的位置4的氨基酸位置处。
11.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸包含官能团且所述水溶性聚合物连接有能够与所述官能团反应以形成共价键的反应性基团。
12.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸选自由以下组成的组：对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对炔丙基氧基-苯丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸、硒半胱氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸和对炔丙基氧基苯丙氨酸。
13.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸是对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸。
14.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物具有1kDa至100kDa之间的平均分子量。
15.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物具有约30kDa的平均分子量。
16.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或其组合。
17.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物是线性或支链PEG。
18.根据权利要求11所述的IL-2缀合物，其中连接至所述反应性基团的所述非肽水溶性聚合物具有下式：
(RG)-(接头)-(POLY)-x
其中RG是能够与非天然氨基酸的官能团形成共价键的反应性基团；接头是共价键或者取代的或非取代的C1-20烷基；POLY是非肽水溶性聚合物；和x是在所述POLY末端处的醇或甲基基团。
19.根据权利要求11所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含炔且所述非天然氨基酸的所述官能团包含叠氮化物，或者所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含叠氮化物且所述非天然氨基酸的所述官能团包含炔。
20.根据权利要求18所述的IL-2缀合物，其中连接至所述反应性基团的所述非肽水溶性聚合物具有下式：
Figure FDA0003985829970000031
其中n是约681。
21.根据权利要求1所述的IL-2缀合物，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。
22.一种具有下式的白介素2(IL-2)缀合物
Figure FDA0003985829970000041
其中n是约681，或其具有下式的区域异构体
Figure FDA0003985829970000042
其中n是约681。
23.一种组合物，其包含：
根据前述权利要求中任一项所述的IL-2缀合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
24.一种在个体中治疗增殖性疾病或癌症的方法，其包括：
向有需要的个体施用治疗有效量的权利要求1-22中任一项所述的IL-2缀合物或权利要求23所述的组合物，以在所述个体中治疗所述增殖性疾病或癌症。
25.一种用于在个体中治疗增殖性疾病或癌症的联合疗法，其包括：
向有需要的个体施用治疗有效量的权利要求1-22中任一项所述的IL-2缀合物或权利要求23所述的组合物，以及
向所述个体施用治疗有效量的治疗剂，以在所述个体中治疗所述增殖性疾病或癌症。
26.根据权利要求25所述的联合疗法，其中所述治疗剂是抗PD1抗体或抗PDL1抗体。
27.根据权利要求25所述的联合疗法，其中在施用所述治疗剂之前施用所述IL-2缀合物或组合物。
28.根据权利要求25所述的联合疗法，其中在施用所述治疗剂之后施用所述IL-2缀合物或组合物。
29.根据权利要求25所述的联合疗法，其中所述IL-2缀合物或组合物与所述治疗剂同时施用。
30.根据权利要求1-22中任一项所述的IL-2缀合物或者根据权利要求23所述的组合物用于治疗增殖性疾病或癌症的用途。
31.治疗剂和根据权利要求1-22中任一项所述的IL-2缀合物或者根据权利要求23所述的组合物用于治疗增殖性疾病或癌症的用途。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述治疗剂是抗PD1抗体或抗PDL1抗体。
33.根据权利要求1-22中任一项所述的IL-2缀合物或者根据权利要求23所述的组合物在制备用于治疗增殖性疾病或癌症的药物中的用途。
34.一种白介素2(IL-2)缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且还包含：
(i)一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸取代：K34、T36、R37、T40、F41、K42、F43、Y44、E60、E61、K63、P64、E67、L71、M103、C104和Y106；以及
(ii)在所述IL-2多肽的N末端处或附近用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端处或附近的缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的氨基酸序列中所示的位置。
35.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，所述IL-2多肽氨基酸序列与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性，条件是所述IL-2多肽至少包含氨基酸E15、H16、L19、D20、D84、N88、V91、Q126、T123和I129，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的氨基酸序列中所示的位置。
36.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，其中在所述IL-2多肽中的所述一个或多个氨基酸取代在位置R37和F41处。
37.根据权利要求36所述的IL-2缀合物，其中在所述IL-2多肽中的所述氨基酸取代是R37A和F41K。
38.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，其中所述IL-2多肽还包含在位置124处的半胱氨酸残基被选自由A和S组成的组的的氨基酸取代。
39.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，其中所述IL-2多肽还包含N末端丙氨酸残基。
40.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸用于取代在位置P1、T2、S3、S4、S5、T6、K7、K8或T9处的氨基酸，或者通过酰胺键连接至N末端氨基酸。
41.根据权利要求40所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸位于对应于SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列的位置4的氨基酸位置处。
42.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸包含官能团，并且所述水溶性聚合物连接有能够与所述官能团反应以形成共价键的反应性基团。
43.根据权利要求34所述的IL-2多肽缀合物，其中所述非天然氨基酸选自由以下组成的组：对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对炔丙基氧基-苯丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸、硒半胱氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸和对炔丙基氧基苯丙氨酸。
44.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸是对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸。
45.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物具有1kDa至100kDa之间的平均分子量。
46.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物具有约30kDa的平均分子量。
47.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或其组合。
48.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物是线性或支链PEG。
49.根据权利要求42所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含炔且所述非天然氨基酸的所述官能团包含叠氮化物，或者所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含叠氮化物且所述非天然氨基酸的所述官能团包含炔。
50.根据权利要求48所述的IL-2缀合物，其中包含所述炔的所述非肽水溶性聚合物具有下式：
Figure FDA0003985829970000081
其中n是约681。
51.根据权利要求34所述的IL-2缀合物，其中所述IL-2缀合物包含在SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。
52.一种组合物，其包含：
根据权利要求34-51中任一项所述的IL-2缀合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
53.一种用于在个体中治疗增殖性疾病或癌症的方法，其包括：
向有需要的个体施用治疗有效量的权利要求34-51中所述的IL-2缀合物或者权利要求52所述的组合物，以在所述个体中治疗所述增殖性疾病或癌症。
54.一种用于在个体中治疗增殖性疾病或癌症的联合疗法，其包括：
向有需要的个体施用治疗有效量的权利要求34-51所述的IL-2缀合物或者权利要求52所述的组合物，和
向所述个体施用治疗有效量的治疗剂，以在所述个体中治疗所述增殖性疾病或癌症。
55.根据权利要求54所述的联合疗法，其中所述治疗剂是抗PD1抗体或抗PDL1抗体。
56.根据权利要求54所述的联合疗法，其中在施用所述治疗剂之前施用所述IL-2缀合物或组合物。
57.根据权利要求54所述的联合疗法，其中在施用所述治疗剂之后施用所述IL-2缀合物或组合物。
58.根据权利要求54所述的联合疗法，其中所述IL-2缀合物或组合物与所述治疗剂同时施用。
59.根据权利要求34-51所述的IL-2缀合物或者根据权利要求52所述的组合物用于治疗增殖性疾病或癌症的用途。
60.治疗剂和根据权利要求34-51所述的IL-2缀合物或者根据权利要求52所述的组合物用于治疗增殖性疾病或癌症的用途。
61.根据权利要求60所述的用途，其中所述治疗剂是抗PD1抗体或抗PDL1抗体。
62.根据权利要求34-51所述的IL-2缀合物或者根据权利要求52所述的组合物在制备用于治疗增殖性疾病或癌症的药物中的用途。
63.一种IL-2缀合物，其包含在SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。
64.一种药物组合物，其包含权利要求63所述的IL-2缀合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
65.一种IL-2部分，其包含在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51或SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。
66.一种白介素2(IL-2)缀合物，其包含IL-2多肽，所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且还包含：
在所述IL-2多肽的N末端处或附近用缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸进行的氨基酸取代，或在所述IL-2多肽的N末端处或附近的缀合至非肽水溶性聚合物的非天然氨基酸插入，条件是所述IL-2多肽至少包含氨基酸E15、H16、L19、D20、K34、T36、R37、T40、F41、K42、F43、Y44、E60、E61、K63、P64、E67、L71、D84、N88、V91、M103、C104、Y106、Q126、T123和I129，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:53的氨基酸序列中所示的位置。
67.根据权利要求66所述的IL-2缀合物，其中所述IL-2多肽还包含在位置124处的半胱氨酸残基被选自由A和S组成的组的氨基酸取代。
68.根据权利要求66所述的IL-2缀合物，其中所述IL-2多肽还包含N末端丙氨酸残基。
69.根据权利要求66所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸用于取代在位置P1、T2、S3、S4、S5、T6、K7、K8或T9处的氨基酸，或者通过酰胺键连接至N末端氨基酸。
70.根据权利要求69所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸位于对应于SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列的位置4的氨基酸位置处。
71.根据权利要求66所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸包含官能团，并且所述水溶性聚合物连接至能够与所述官能团反应以形成共价键的反应性基团。
72.根据权利要求66所述的IL-2多肽缀合物，其中所述非天然氨基酸选自由以下组成的组：对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对炔丙基氧基-苯丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸、硒半胱氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸和对炔丙基氧基苯丙氨酸。
73.根据权利要求66所述的IL-2缀合物，其中所述非天然氨基酸是对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸。
74.根据权利要求66所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物具有1kDa至100kDa之间的平均分子量。
75.根据权利要求66所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物具有约30kDa的平均分子量。
76.根据权利要求66所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或其组合。
77.根据权利要求66所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物是线性或支链PEG。
78.根据权利要求71所述的IL-2缀合物，其中所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含炔且所述非天然氨基酸的所述官能团包含叠氮化物，或者所述非肽水溶性聚合物的所述反应性基团包含叠氮化物且所述非天然氨基酸的所述官能团包含炔。
79.根据权利要求78所述的IL-2缀合物，其中包含所述炔的所述非肽水溶性聚合物具有下式：
Figure FDA0003985829970000121
其中n是约681。
80.根据权利要求66所述的IL-2缀合物，其中所述IL-2缀合物具有下式：
Figure FDA0003985829970000122
其中n是约681，或其具有下式的区域异构体
Figure FDA0003985829970000123
其中n是约681。
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