CN101104077A - 重组人白介素-2与聚乙二醇的偶合物 - Google Patents

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李广善
靳雪峰
傅李芳
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Abstract

本发明涉及重组人白介素－2通过氨基酸或寡肽与单甲基聚乙二醇连接形成的偶合物；这种偶合物具有较好的血浆稳定性，能够在体内缓慢释放重组人白介素活性发挥药理作用。

Description

重组人白介素-2与聚乙二醇的偶合物
技术领域
本发明涉及重组人白介素-2通过氨基酸或寡肽与单甲基聚乙二醇连接形成的偶合物；这种偶合物具有较好的血浆稳定性，能够在体内缓慢释放重组人白介素活性发挥药理作用。
背景技术
重组人白介素-2具有促进T细胞的成熟和分化，激活淋巴因子激活的杀伤细胞，促进干扰素的产生等生物活性，是免疫疗法中最重要的细胞因子之一，临床具有较好的抗肿瘤活性。
但是，作为蛋白类药物，重组人白介素-2在体内易被酶解失活，生物半衰期短，影响了其药理作用的发挥。
聚乙二醇(PEG)是具有良好的生物兼容性的中性聚合物，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。将PEG与多肽和蛋白类药物分子偶联后，能够提高药物在血浆中的稳定性，减少药物的酶解；避免免疫系统对药物的识别和清除，降低免疫原性；同时避免药物在肾脏的代谢清除，从而显著延长多肽或蛋白类药物在体内的半衰期。
目前PEG对多肽或蛋白的化学修饰均是通过PEG的活性衍生物与药物分子中的氨基形成酰胺键或氨基甲酸酯键。由于蛋白或多肽分子中存在多个氨基，因此得到的偶合物是多种交联产物的混合物。而且，由于对活性位点的直接修饰或空间位阻作用，被修饰药物的生物活性损失较大。
发明内容
本发明的目的是提供聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与rhIL-2连接形成的偶合物。通过选择适当的连接子可以保持偶合物在血浆中的稳定性；到达靶组织后，连接子可以在细胞内释放活性形式的rhIL-2分子，产生药理作用。
本发明一方面提供式I所示的单甲氧基聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与rhIL-2分子中的氨基连接形成的偶合物：
CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-CONH-(rhIL-2)
            I
本发明另一方面提供式II所示的单甲氧基聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与rhIL-2分子中的氨基连接形成的偶合物：
CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-CONH-(rhIL-2)
                    II
式I、II中，PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇，AA代表L-氨基酸残基n为1-6的整数。
本发明还提供含有式I、II所示的单甲氧基聚乙二醇与rhIL-2的偶合物作为活性成分的药物组合物。
本发明最后还提供含有式I、II所示的单甲氧基聚乙二醇与rhIL-2的偶合物，以及含有式I、II所示的单甲氧基聚乙二醇与rhIL-2的偶合物作为活性成分的药物组合物作为抗肿瘤药物的用途。
具体实施方式
本发明中聚乙二醇与rhIL-2的偶合物的制备可以分为聚乙二醇衍生物的合成及其与rhIL-2的交联两个部分。
式I所示的偶合物可以按照如下方法制备：单甲氧基聚乙二醇在叔丁醇钾作用下，与溴乙酸乙酯反应；反应产物经氢氧化钠水解，然后将水解产物酸化，得到羧甲基取代的单甲氧基聚乙二醇衍生物CH3O-PEG-OCH2COOH；通过接肽反应，制备寡肽衍生物CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-COOH；CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-COOH与N-羟基琥珀酰亚胺反应成活泼酯CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-COOSu，后者再与rhIL-2分子中的游离氨基连接，形成偶合物CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-CONH-(rhIL-2)(I)。
式II所示的偶合物可以按照如下方法制备：单甲氧基聚乙二醇与光气反应得到单甲氧基聚乙二醇的氯甲酸酯衍生物CH3O-PEG-OCH2CH2OCOCl，再与氨基酸分子中的氨基反应，形成氨基甲酸酯衍生物CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-AA-COOH；后者通过接肽反应，制备寡肽衍生物CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOH；CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOH与N-羟基琥珀酰亚胺反应成活泼酯CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOSu，后者再与rhIL-2分子中的游离氨基连接，形成偶合物CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-CONH-(rhIL-2)(II)。
下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，这些实施例不应作为对本发明的范围的限制。
实施例1CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-CONH-(rhIL-2)(I1)的制备1.1 CH3O-PEG5000-OCH2COOH的制备
将单甲氧基聚乙醇(MW5000)20.0g(4mmol)加到安装了分水器的圆底烧瓶中，加入甲苯溶解，蒸馏，并不断补充干燥的甲苯，在油浴中加热回流，至无水分蒸出。撤去分水器，加入8mmol的叔丁醇钾，回流反应1小时。然后缓慢加入8mmol的溴乙酸乙酯，回流反应6小时。过滤，将滤液减压蒸干，用CH2Cl2溶解残留物，加无水乙醚沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，缓慢加入0.1N的氢氧化钠溶液，至pH达到10，室温搅拌2小时。然后用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，用等体积的三氯甲烷提取3次，合并提取液，用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，加无水乙醚沉淀，滤集固体，得CH3O-PEG5000-OCH2COOH12.5g。
1.2 CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu的制备
将CH3O-PEG5000-OCH2COOH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量甘氨酸甲酯，5倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，然后缓慢加入0.1N的氢氧化钠溶液，至pH达到10，室温搅拌2小时。用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，减压蒸除四氢呋喃，然后将水溶液用Sephadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Gly-OH。
将CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Gly-OH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量N-羟基琥珀酰亚胺，1倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，过滤，得到CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu的溶液备用。
1.3 CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-CONH-(rhIL-2)(I1)的制备
将重组人白介素-2(rhIL-2)溶于pH6.5，100mM的磷酸缓冲液，配成2mg/ml的溶液，滴加3倍摩尔量的CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu的溶液，4℃搅拌反应3小时。将反应液用pH6.0，20mM磷酸缓冲液稀释20倍。取羧甲基琼脂糖离子交换树脂(CM-Sepharose)装柱，离子交换树脂先用5个柱体积的pH6.0，20mM磷酸缓冲液预平衡，然后将稀释后的反应液上样，先用pH6.0，20mM磷酸缓冲液洗脱，除去未反应的PEG衍生物；再用A液为pH7.0，20mM的磷酸缓冲液，B液为含1M氯化钠的pH7.0，20mM的磷酸缓冲液梯度洗脱，收集第二峰面积下的组分，即得一分子PEG与一分子rhIL-2交联的产物CH3O-PEG5000-CH2CONH-Gly-CONH-(rhIL-2)。
实施例2CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Gly-CONH-(rhIL-2)(I2)的制备
参照实施例1.1的方法，用分子量12000的单甲氧基聚乙二醇代替分子量5000的单甲氧基聚乙二醇制备CH3O-PEG12000-OCH2COOH。
参照实施例1.2的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2COOH代替CH3O-PEG5000-OCH2COOH制备CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Gly-COOSu。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Gly-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-CH2CONH-Gly-CONH-(rhIL-2)。
实施例3CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-CONH-(rhIL-2)(I3)的制备
参照实施例2的方法，用L-丙氨酸代替甘氨酸制备CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-COOSu。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-CH2CONH-Ala-CONH-(rhIL-2)。
实施例4CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Leu-CONH-(rhIL-2)(I4)的制备
参照实施例2的方法，用L-亮氨酸代替甘氨酸制备CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Leu-COOSu。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Leu-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-CH2CONH-Leu-CONH-(rhIL-2)。
实施例5CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Gly-CONH-(rhIL-2)(I5)的制备
将CH3O-PEG12000-OCH2CH2-NHCO-Ala-OH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量甘氨酸甲酯，5倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，然后缓慢加入0.1N的氢氧化钠溶液，至pH达到10，室温搅拌2小时。用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，减压蒸除四氢呋喃，然后将水溶液用Sephadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH3O-PEG12000-OCH2CH2-NHCO-Ala-Gly-OH。
将CH3O-PEG12000-OCH2CH2-NHCO-Ala-Gly-OH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量N-羟基琥珀酰亚胺，1倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，过滤，得到CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Gly-COOSu的溶液备用。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Gly-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-CH2CONH-Ala-Gly-CONH-(rhIL-2)。
实施6CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-CONH-(hIL-2)(I6)的制备
参照实施例5的方法，用L-亮氨酸甲酯代替甘氨酸甲酯，与CH3O-PEG12000-OCH2CH2-NHCO-Ala-OH反应，制备CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-COOH，再与N-羟基琥珀酰亚胺成活泼酯，制得CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-COOSu。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-COOSu代替  CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-CH2CONH-Ala-Leu-CONH-(rhIL-2)。
实施7CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-Ala-Leu-CONH-(hIL-2)(I7)的制备
参照实施例5的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-COOH与L-丙氨酸甲酯缩合，缩合产物经水解CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-Ala-COOH，再与L-亮氨酸甲酯缩合，缩合产物水解得到CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-Ala-Leu-COOH，最后与N-羟基琥珀酰亚胺成活泼酯，制得CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-Ala-Leu-COOSu。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-Ala-Leu-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-CH2CONH-Ala-Leu-Ala-Leu-CONH-(rhIL-2)。
实施例8CH3O-PEG5000-OCH2CH2OCONH-Gly-CONH-(rhIL-2)(II1)的制备
8.1CH3O-PEG5000-OCH2CH2OCONH-Gly-COOSu的制备
将单甲氧基聚乙二醇(MW5000)14.4g用20ml甲苯和12ml二氯甲烷的混合溶剂溶解，加入1g(20mmol)无水三乙胺，0.56g三光气，搅拌反应过夜。将反应液减压蒸干，将残留物用干燥的四氢呋喃溶解，加入5倍摩尔量L-丙氨酸和干燥的三乙胺，室温搅拌反应过夜。用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，减压蒸除四氢呋喃，然后将水溶液用Sephadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH3O-PEG5000-CH2CH2OCONH-Ala-OH。
将CH3O-PEG5000-OCH2CH2OCONH-Gly-OH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量N-羟基琥珀酰亚胺，1倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，过滤，得到CH3O-PEG5000-OCH2CH2OCONH-Gly-COOSu的溶液备用。
8.2CH3O-PEG5000-OCH2CH2OCONH-Gly--CONH-(rhIL-2)(II1)的制备
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG5000-OCH2CH2OCONH-Gly-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG5000-OCH2CH2OCONH-Gly-CONH-(rhIL-2)。
实施例9CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Gly-CONH-(rhIL-2)(II2)的制备
参照实施例8.1的方法，用分子量12000的单甲氧基聚乙二醇代替分子量5000的单甲氧基聚乙二醇制备CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Gly-COOSu。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Gly-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Gly-CONH-(rhIL-2)。
实施例10 CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-CONH-(rhIL-2)(II3)的制备
参照实施例9的方法，用L-丙氨酸代替甘氨酸制备CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-COOSu。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-CONH-(rhIL-2)。
实施例11CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Leu-CONH-(rhIL-2)(II4)的制备
参照实施例9的方法，用L-亮氨酸代替甘氨酸制备CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Leu-COOSu。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Leu-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Leu-CONH-(rhIL-2)。
实施例12CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Gly-CONH-(rhIL-2)(II5)的制备
将CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-NHCO-Ala-OH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量甘氨酸甲酯，5倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，然后缓慢加入0.1N的氢氧化钠溶液，至pH达到10，室温搅拌2小时。用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，减压蒸除四氢呋喃，然后将水溶液用Sephadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Gly-OH。
将CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Gly-OH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量N-羟基琥珀酰亚胺，1倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，过滤，得到CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Gly-COOSu的溶液备用。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Gly-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Gly-CONH-(rhIL-2)。
实施13 CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-CONH-(hIL-2)(II6)的制备
参照实施例12的方法，用L-亮氨酸甲酯代替甘氨酸甲酯，与CH3O-PEG12000OCH2CH2OCONH-NHCO-Ala-OH反应，制备CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-COOH，再与N-羟基琥珀酰亚胺成活泼酯，制得CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-COOSu。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CH2OCONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-CONH-(rhIL-2)。
实施14CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-Ala-Leu-CONH-(hIL-2)(II7)的制备
参照实施例12的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-COOH与L-丙氨酸甲酯缩合，缩合产物经水解CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-Ala-COOH，再与L-亮氨酸甲酯缩合，缩合产物水解得到CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-Ala-Leu-COOH，最后与N-羟基琥珀酰亚胺成活泼酯，制得CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-Ala-Leu-COOSu。
参照实施例1.3的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-Ala-Leu-COOSu代替CH3O-PEG5000-OCH2CH2OCONH-Gly-COOSu，与rhIL-2反应，制得CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-CONH-(rhIL-2)。
实施例15白介素-2的PEG偶合物的活性评价
用重组人白介素-2依赖细胞株(CTLL-2)/MTT法测定白介素-2及其PEG偶合物的生物学活性，用国家标准品校准确定效价(IU)。以人血清白蛋白为标准蛋白，用Lowry法测定蛋白质含量，计算样品生物活性(IU/ml)与蛋白质含量(mg/ml)的比值，即为比活性。
表1白介素-2及其PEG偶合物的生物活性
    样品     IU/mg
    rhIL-2     1.84×107
    I4     0.78×107
    I5     1.20×107
    I6     1.09×107
    I7     1.33×107
    II4     0.89×107
    II5     0.75×107
    II6     0.87×107
    II7     0.84×107
实施例16体外酶稳定性的测定
在pH 7.8的0.1％的胰蛋白酶溶液，分别加入待测样品，于37℃恒温水浴保温，分别于0、10min、30min、1h、2h、4h、8h、12h及24h取样，按照实施例15的方法，测定各样品在不同时间点的生物活性。
表2白介素-2及其PEG偶合物的酶稳定性
样品     酶作用不同时间(min)生物效价(×107IU/mg)
    0     10     30     60     120
    rhIL-2     1.84     0.49     0.23     0.12     0.05
    I4     0.78     0.62     0.55     0.52     0.33
    I5     1.20     0.93     0.72     0.57     0.39
    I6     1.09     0.86     0.56     0.45     0.22
    I7     1.33     1.09     0.78     0.49     0.34
    II4     0.89     1.06     0.76     0.45     0.27
    II5     0.75     1.26     0.83     0.47     0.31
    II6     0.87     0.82     0.53     0.33     0.21
    II7     0.84     0.73     0.60     0.50     0.24

Claims (5)

1.聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与重组人白介素-2(rhIL-2)连接形成的偶合物。
2.式I所示的聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与rhIL-2分子中的氨基连接形成的偶合物：
CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-CONH-(rhIL-2)
              I
式I中，PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇，AA代表L-氨基酸残基n为1-6的整数。
3.式II所示的聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与rhIL-2分子中的氨基连接形成的偶合物：
CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-CONH-(rhIL-2)
               II
式I、II中，PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇，AA代表L-氨基酸残基n为1-6的整数。
4.含有式I、II所示的单甲氧基聚乙二醇与rhIL-2的偶合物作为活性成分的药物组合物。
5.式I、II所示的单甲氧基聚乙二醇与rhIL-2的偶合物，以及含有式I、II所示的单甲氧基聚乙二醇与rhIL-2的偶合物作为活性成分的药物组合物作为抗肿瘤药物的用途。
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