CN114195881B - 一种制备醋酸舍莫瑞林的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备醋酸舍莫瑞林的方法，涉及多肽合成技术领域，包括：通过多肽固相合成方法制得；其中，合成过程用到的缩合剂包括离子液体；上述离子液体为由阴阳离子组成的盐；上述阴离子包括[NTf2]‑；上述阳离子结构至少包括咪唑、氮杂啶、烷基、酯基。本发明提供的方法制得的醋酸舍莫瑞林的纯度和收率均明显增加；且产品的稳定性和半衰期显著增加，免疫活性得到有效提升。
Description
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种制备醋酸舍莫瑞林的方法。
背景技术
醋酸舍莫瑞林（Sermorelin acetate）是人工合成的具有29个氨基酸的生长激素释放素，是内源性促生长激素释放激素（GHRH）的氨基末端片段，具有显著的调节生长的效应。传统的醋酸舍莫瑞林合成方法是化学法。化学合成反应高度取决于肽链序列，随着肽链的复杂性增加，方法开发和分析变得至关重要。一般来说，化学多肽合成包括保护、激活、缩合和去保护几个主要步骤。化学合成路线中主要问题包括片段的低溶解性和消旋问题。随着肽链长度的增加，杂质的种类和含量增加，杂质与最终产品的结构很相似，将大幅增加纯化难度导致最终产品成本的增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备醋酸舍莫瑞林的方法，该方法制得的醋酸舍莫瑞林的纯度和收率均明显增加；且产品的稳定性和半衰期显著增加，免疫活性得到有效提升。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种多肽合成用缩合剂，包括离子液体；
上述离子液体为由阴阳离子组成的盐；所述阴离子包括[NTf2]-；
上述阳离子结构至少包括咪唑、氮杂啶、烷基、酯基。本发明制备得到的离子液体是一个多功能化合物，不仅可以作为构建肽键反应的缩合剂，同时还对氨基酸原料结构中的活性基团起到一定的保护作用。将其应用于多肽的合成工艺过程中，所有试剂原料都得到充分利用，反应副产物除了二氧化碳，就是反应释放的盐类物质作为离子液体恰好能够充当反应介质的作用，反应无需或者减少额外溶剂的使用；且离子液体可回收循环利用，绿色环保，降低成本。
在一些实施例中，缩合剂还包括DMAP、HOBt和HBTU中的一种；以及，DCC、DIC和NMM中的一种。
在一些实施例中，离子液体的原料组成包括4-(氮杂啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯。本发明以4-(氮杂啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯作为原料之一，制备得到的离子液体作为缩合剂，应用于醋酸舍莫瑞林的合成，能够有效的促进缩合反应的进行，提高反应效率，制得的醋酸舍莫瑞林产品的纯度和收率明显提升，其纯度＞97.5%，收率＞86%。
在一些实施例中，离子液体的原料组成还包括咪唑、1-溴代辛烷、1,6-二溴己烷。
上述离子液体的制备方法，包括：
取咪唑和1-溴代辛烷，在NaH作用下得到产物A；
取产物A和1,6-二溴己烷在加热回流条件下反应得到产物B；
取产物B和4-(氮杂啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯在碳酸钾作用下得到离子液体。
具体的，上述离子液体的制备方法，包括：
取咪唑和NaH加入THF中，0~2℃条件下搅拌40~50 min后，恢复至室温加入1-溴代辛烷，搅拌反应20~24 h；用THF萃取、薄层色谱硅胶柱纯化得到产物A；
取1,6-二溴己烷溶于乙腈中，浓度为0.8~1.4 g/mL，加热回流，缓慢滴加产物A的乙腈溶液（浓度为0.1~0.2 g/mL），体系置于85~95℃下反应22~24 h；减压蒸馏除溶剂，用无水乙醚洗涤3~4次，得到产物B；
取产物B和4-(氮杂啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯以及碳酸钾加入至乙腈中，85~95℃下搅拌反应68~76 h；过滤，滤液减压蒸馏除溶剂，用无水乙醚洗涤3~5次；之后产物溶于超纯水中，加入过量LiNTf2进行阴离子交换5~7 h，然后用二氯甲烷萃取、无水硫酸钠干燥、蒸干溶剂得到离子液体。
在一些实施例中，咪唑和NaH的摩尔比为1∶1~1.1；咪唑与THF的固液比为0.3~0.4g/mL；1-溴代辛烷与咪唑的摩尔比为1~1.2∶1。
在一些实施例中，产物A与1,6-二溴己烷的摩尔比为1∶14~16。
在一些实施例中，产物B和4-(氮杂啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的摩尔比为1∶1.1~1.5；碳酸钾与产物B的摩尔比为6~7∶1；产物B与乙腈的固液比为0.015~0.025 g/mL。
一种制备醋酸舍莫瑞林的方法，包括：所述醋酸舍莫瑞林通过多肽固相合成方法制得；其中，合成过程用到的缩合剂包括上述多肽合成用缩合剂。
具体的，一种制备醋酸舍莫瑞林的方法，包括：
步骤1：树脂溶胀
取C末端酰胺化序列用氨基树脂进行溶胀处理；
步骤2：接第一个氨基酸
采用沙芯抽滤除去溶剂，加入C端第一个Fmoc-氨基酸，在DMAP和DCC以及上述离子液体条件下振荡处理，用醋酸酐封闭；
步骤3：脱保护
除去DMF后加入脱保护液进行脱保护处理；
步骤4：茚三酮检测；
步骤5：洗树脂
依次用DMF、甲醇、DMF各洗两次；
步骤6：缩合
取第二个Fmoc-氨基酸、HOBt、离子液体混合均匀，加入反应体系中，再加入DIC进行反应，检测呈阴性；
步骤7：洗树脂
依次用DMF、甲醇、DMF各洗两次；
步骤8：重复步骤2至步骤6的操作，按照醋酸舍莫瑞林肽链的氨基酸顺序依次连接相应的氨基酸得到多肽Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg；
步骤9：将缩合完成的多肽依次用DMF、甲醇、DMF各洗两次；抽干后茚三酮检测阴性；
步骤10：脱保护
脱除肽链最后N端氨基酸的Fmoc保护；洗树脂后抽干；
步骤11：切割
从树脂上切割多肽，配制切割液进行切割处理得到醋酸舍莫瑞林粗品；
步骤12：纯化
取醋酸舍莫瑞林粗品，纯水溶解，通过高效液相色谱进行纯化、冻干得到醋酸舍莫瑞林。
在一些实施例中，步骤2中离子液体与DMAP的摩尔比为1∶1~2。
在一些实施例中，步骤3中脱保护液包括18~24%哌啶-DMF。
在一些实施例中，步骤6中离子液体与HOBt的摩尔比为1∶1~2。
更优选地，步骤2和步骤6中还加入2-(三甲基硅)苯基三氟甲烷磺酸盐，其与离子液体的摩尔比为0.1~0.3∶1。本发明在缩合步骤中加入2-(三甲基硅)苯基三氟甲烷磺酸盐，制得的醋酸舍莫瑞林的纯度和收率明显提升，特别是在离子液体存在的条件下，提升效果明显，可能是2-(三甲基硅)苯基三氟甲烷磺酸盐的存在，对离子液体的催化缩合性能起到增效的作用，两者同时使用，显著提升了多肽产品的纯度和收率，其纯度＞99%，收率＞90%，改善了产品质量。
在一些实施例中，步骤11中切割液包括：TFA 93~95%、水1~2%、EDT 1.5~2.5%和TIS1~1.5%。
在一些实施例中，醋酸舍莫瑞林的肽链中赖氨酸的侧链ε-氨基被化学修饰，所述化学修饰用化合物包括N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺。本发明采用N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺通过酰胺化反应对醋酸舍莫瑞林的肽链中赖氨酸的侧链ε-氨基进行化学修饰，得到的修饰物具有更长的半衰期，作用于小鼠体内，显示出更长的GH持续释放时间；且具有更高的生物活性，进一步增强醋酸舍莫瑞林提高单核吞噬细胞吞噬功能的效果，提升非特异性免疫功能；同时能增强醋酸舍莫瑞林拮抗免疫抑制剂环磷酰胺所致的免疫抑制作用的功效；具有更高的应用价值。
在一些实施例中，N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺通过酰胺化反应对醋酸舍莫瑞林进行化学修饰。
具体的，在一种制备醋酸舍莫瑞林的方法中，步骤8和步骤9之间增加化学修饰操作，步骤包括：
反应体系中加入水合肼，除去Fmoc-Lys(Dde)-OH的保护基；然后取N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺、HOBt溶于DMF中，并加入DIC，混合均匀后加入上述反应体系中，混合反应得到化学修饰的醋酸舍莫瑞林。
进一步地的，化学修饰操作步骤具体包括：
反应体系中加入含1~2%水合肼的DMF溶液，反应3~5 min除去Fmoc-Lys(Dde)-OH的保护基Dde，抽干；重复操作2~3次，然后用DMF和甲醇交替洗涤4~6次，茚三酮检测为蓝色；取1.5~3倍摩尔量的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺、2~4倍摩尔量的HOBt，用DMF溶解，并加入1~1.5倍摩尔量的DIC，混合均匀后加入反应体系中，反应1~2 h后，抽干、DMF洗涤5~6次，茚三酮检测为无色，最后用甲醇洗涤2~3次后抽干，得到化学修饰的醋酸舍莫瑞林。
本发明的又一目的在于，提供了N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺在增强醋酸舍莫瑞林免疫活性、延长半衰期中的用途。
本发明又公开了上述离子液体在多肽固相合成或液相合成中的用途。
在一些实施例中，离子液体作为载体、缩合剂、溶剂或催化剂的用途。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明以4-(氮杂啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯作为原料之一，制备得到的离子液体应用于多肽的合成工艺过程中，作为缩合剂能够有效的促进缩合反应的进行，制得的醋酸舍莫瑞林产品的纯度和收率明显提升，其纯度＞97.5%，收率＞86%。同时，在缩合步骤中加入2-(三甲基硅)苯基三氟甲烷磺酸盐，能够对离子液体的催化缩合性能起到增效的作用，多肽产品的纯度和收率进一步提升。此外，本发明采用N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺通过酰胺化反应对醋酸舍莫瑞林的肽链中赖氨酸的侧链ε-氨基进行化学修饰，使得药物具有更长的半衰期，且具有更高的生物活性，进一步增强醋酸舍莫瑞林提升非特异性免疫功能的能力；增强拮抗免疫抑制剂环磷酰胺所致的免疫抑制作用的效果，具有更高的应用价值。
因此，本发明提供了一种制备醋酸舍莫瑞林的方法，该方法制得的醋酸舍莫瑞林的纯度和收率均明显增加；且产品的稳定性和半衰期显著增加，免疫活性得到有效提升。
附图说明
图1为本发明试验例1中离子液体的红外光谱测试结果；
图2为本发明试验例1中醋酸舍莫瑞林的红外光谱测试结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
离子液体的制备：
取咪唑和NaH加入THF中，0℃条件下搅拌45 min后，恢复至室温加入1-溴代辛烷，搅拌反应24 h；用THF萃取、薄层色谱硅胶柱纯化得到产物A；其中，咪唑和NaH的摩尔比为1∶1；咪唑与THF的固液比为0.35 g/mL；1-溴代辛烷与咪唑的摩尔比为1.1∶1；
取1,6-二溴己烷溶于乙腈中，浓度为1.2 g/mL，加热回流，缓慢滴加产物A（与1,6-二溴己烷的摩尔比为1∶15.5）的乙腈溶液（浓度为0.16 g/mL），体系置于92℃下反应24 h；减压蒸馏除溶剂，用无水乙醚洗涤4次，得到产物B；
取产物B和4-(氮杂啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯（两者摩尔比为1∶1.3）以及碳酸钾加入（与产物B的摩尔比为6.4∶1）至乙腈中，产物B与乙腈的固液比为0.021 g/mL，90℃下搅拌反应72 h；过滤，滤液减压蒸馏除溶剂，用无水乙醚洗涤5次；之后产物溶于超纯水中，加入过量LiNTf2进行阴离子交换6.5 h，然后用二氯甲烷萃取、无水硫酸钠干燥、蒸干溶剂得到功能性离子液体。
一种制备醋酸舍莫瑞林的方法：
步骤1：树脂溶胀
取C末端酰胺化序列用氨基树脂（购自天津南开合成科技有限公司），加入二氯甲烷（添加量为16 mL/g树脂）振荡30 min；多肽合成用仪器为SYMPHONY 12通道多肽合成仪；
步骤2：接第一个氨基酸
采用沙芯抽滤除去溶剂，加入3倍摩尔量的C端第一个Fmoc-氨基酸，接着加入6倍摩尔量的DMAP和6倍摩尔量的DCC，再加入4倍摩尔量的离子液体，最后加入DMF溶解振荡30min后，用醋酸酐封闭；
步骤3：脱保护
除去DMF后加入20%哌啶-DMF溶解（加入量为15 mL/g树脂），混合5 min后过滤，除去溶剂，再加入20%哌啶-DMF溶解（加入量为15 mL/g树脂），混合15 min；
步骤4：检测
抽滤除去溶剂，取20粒树脂，用乙醇洗涤三次后加入茚三酮、KCN以及苯酚溶液各两滴，（108±2）℃加热5 min，颜色变为深蓝色即阳性反应；
步骤5：洗树脂
依次用DMF（10 mL/g）、甲醇（10 mL/g）、DMF（10 mL/g）各洗两次；
步骤6：缩合
取3倍摩尔量的Fmoc-氨基酸、1.5倍摩尔量的HOBt、1.5倍摩尔量的离子液体混合均匀，加入反应体系中，然后立刻加入3倍摩尔量的DIC，反应30 min后，检测呈阴性；
步骤7：洗树脂
依次用DMF（10 mL/g）、甲醇（10 mL/g）、DMF（10 mL/g）各洗两次；
步骤8：重复步骤2至步骤6的操作，按照表1中氨基酸顺序依次连接相应的氨基酸得到多肽；
步骤9：将缩合完成的多肽依次用DMF（10 mL/g）、甲醇（10 mL/g）、DMF（10 mL/g）各洗两次；抽干10 min，茚三酮检测阴性；
步骤10：脱除肽链最后N端氨基酸的Fmoc保护（操作同步骤3），检测呈阳性，溶液抽干；按照下列方法洗树脂，按照顺序依次用DMF（10 mL/g）、甲醇（10 mL/g）、DMF（10 mL/g）、DCM（10 mL/g）各洗两次，抽干10 min；
步骤11：切割
从树脂上切割多肽，配制切割液（10 mL/g）：TFA 94%、水 2%、EDT 2.5%和TIS1.5%；将树脂装入烧瓶或者离心管中，切割液和树脂的比例按照10 mL/g，恒温震荡，120min；将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，常温挥干得到醋酸舍莫瑞林粗品；
步骤12：纯化
取醋酸舍莫瑞林粗品，纯水溶解，用0.45 μm滤膜过滤得溶解液；纯化条件：高效液相色谱仪，色谱柱为Venusi MRC-ODS C18色谱柱，规格30×250 mm；流动相A液：0.1% 三氟乙酸水溶液，流动相B液：0.1% 三氟乙酸和乙腈；上样量30 μL，流速为1.0 mL/min；梯度洗脱：90% A液+10% B液，B液 10%→80%，时间25 min；收集从检测器出来的样品；将纯化后的溶液进行常规条件冻干，即得到醋酸舍莫瑞林。
HPLC法对样品进行常规纯度鉴定，测试条件：
色谱柱为Venusi MRC-ODS C18色谱柱，规格4.6×150 mm；流动相A液：0.1% 三氟乙酸水溶液，流动相B液：0.1% 三氟乙酸和乙腈；上样量10 μL，流速为1.0 mL/min；梯度洗脱：0~5 min：100% A液；5~30 min：A液 100%→20%。
MS法鉴定多肽分子量：取纯化后样品加入水溶解，加入5%乙酸+8%乙腈+87%水溶解测试电喷雾离子化质谱测定分子量。检测得到的醋酸舍莫瑞林的分子量为：m/z [M+H]+,3358.01。
表1 氨基酸顺序表
实施例2：
离子液体的制备与实施例1相同。
一种制备醋酸舍莫瑞林的方法与实施例1的区别为：步骤6中采用HBTU替代HOBt；
采用NMM替代DIC。
实施例3：
离子液体的制备与实施例1相同。
一种制备醋酸舍莫瑞林的方法与实施例1的区别为：
步骤2中离子液体与DMAP的摩尔比为1∶2；
步骤6中离子液体与HOBt的摩尔比为1∶2。
实施例4：
一种制备醋酸舍莫瑞林的方法与实施例1的区别为：
步骤2中采用DMAP替代离子液体；
步骤6中采用HOBt替代离子液体。
实施例5：
一种制备醋酸舍莫瑞林的方法与实施例1的区别为：
步骤2中离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐；
步骤6中离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐。
实施例6：
离子液体的制备与实施例1相同。
一种制备稳定性醋酸舍莫瑞林的方法：其制备方法与实施例1中醋酸舍莫瑞林的制备方法的区别在于，在步骤8和步骤9之间增加化学修饰步骤，具体为：
反应体系中加入含2%水合肼的DMF（25 mL/g）溶液，反应3 min除去Fmoc-Lys(Dde)-OH的保护基Dde，抽干；重复上述操作两次，然后用DMF（10 mL/g）和甲醇（10 mL/g）交替洗涤6次，茚三酮检测为蓝色；取2倍摩尔量的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺、2倍摩尔量的HOBt，用DMF溶解，并加入1.5倍摩尔量的DIC，混合均匀后加入反应体系中，反应1.5 h后，抽干、DMF洗涤5次，茚三酮检测为无色，最后用甲醇洗涤2次后抽干。
实施例7：
一种制备稳定性醋酸舍莫瑞林的方法与实施例6的区别为：步骤2和步骤6中不添加离子液体。
实施例8：
离子液体的制备与实施例6相同。
一种制备稳定性醋酸舍莫瑞林的方法与实施例6的区别为：步骤2和步骤6中离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐。
实施例9：
一种制备稳定性醋酸舍莫瑞林的方法与实施例1的区别为：步骤2和步骤6中还加入2-(三甲基硅)苯基三氟甲烷磺酸盐，其与离子液体的摩尔比为0.2∶1。
实施例10：
一种制备稳定性醋酸舍莫瑞林的方法与实施例4的区别为：步骤2和步骤6中还加入2-(三甲基硅)苯基三氟甲烷磺酸盐，其与离子液体的摩尔比为0.2∶1。
实施例11：
一种制备稳定性醋酸舍莫瑞林的方法与实施例5的区别为：步骤2和步骤6中还加入2-(三甲基硅)苯基三氟甲烷磺酸盐，其与离子液体的摩尔比为0.2∶1。
试验例1：
1、红外表征
取少量样品于溴化钾压片上，利用毛细管将样品涂抹均匀；或者粉末样品直接与溴化钾混合压片制得测试样品；然后置于测试样品台上进行测试。测试条件包括：波长范围4000~500 cm-1，扫描次数16次。
对实施例1制备的离子液体进行上述测试，结果如图1所示。从图中分析可知，实施例1制备的离子液体的红外图谱中，在3142 cm-1和3081 cm-1附近分别出现N=C-H键和C=C-H键不饱和C-H键的伸缩振动峰；2800~3000 cm-1范围内出现甲基、亚甲基的伸缩振动特征吸收峰，在1580 cm-1和1465 cm-1附近出现甲基、亚甲基的弯曲振动峰；在1709 cm-1附近出现C=O键的伸缩振动特征峰；在1643 cm-1附近出现C=N键的伸缩振动特征峰；在1145 cm-1和1046 cm-1附近分别出现C-N键和C-O键的伸缩振动特征峰；以上结果表明实施例1中离子液体成功制备。
对实施例1和实施例6制备的醋酸舍莫瑞林进行上述测试，结果如图2所示。从图中分析可知，相比于实施例1制备的醋酸舍莫瑞林的红外光谱，实施例6制备的醋酸舍莫瑞林的红外图谱中，2800~3000 cm-1范围内出现甲基、亚甲基的伸缩振动特征吸收峰强度增加，在1720 cm-1附近出现酯基中C=O键的伸缩振动特征峰；以上结果表明成功采用N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺对醋酸舍莫瑞林的肽链中赖氨酸的侧链ε-氨基进行化学修饰。
2、醋酸舍莫瑞林纯度和收率分析
实施例1~11制备的醋酸舍莫瑞林的纯度和收率如表2所示：
表2 纯度和收率测试结果
从表2中数据可以看出，实施例1制备的醋酸舍莫瑞林的纯度和收率明显高于实施例4和实施例5，表明采用4-(氮杂啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯作为原料制得离子液体，作为缩合剂，应用于多肽的合成，能够有效提高醋酸舍莫瑞林的纯度和收率，且离子液体可以回收，循环使用。实施例6制备的醋酸舍莫瑞林的纯度和收率与实施例1相比无显著差异，实施例7的效果与实施例4相当，实施例8的效果与实施例5相当，表明采用N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺对醋酸舍莫瑞林的肽链中赖氨酸的侧链ε-氨基进行化学修饰，对得到产品的纯度和收率不产生消极影响。此外，实施例9制备的醋酸舍莫瑞林的纯度和收率明显高于实施例1，实施例10的效果与实施例4相当，实施例11的效果要好于实施例5，表明缩合过程中以2-(三甲基硅)苯基三氟甲烷磺酸盐作为缩合剂助剂，对离子液体的缩合性能具有明显的增益效果，能够有效提升醋酸舍莫瑞林产品的纯度和收率。
试验例2：
1、生长激素释放活性测定
小鼠体内生长激素（GH）持续释放测试：
测试对象：昆明小鼠，雌性，体重19~23 g；实验动物的护理和使用制度和实验动物指导方针一致。
实验分组及给药：昆明小鼠21只，随机分为3组，每组7只；实验设置分组包括实验K1组：实施例1制备得到的醋酸舍莫瑞林；实验K2组：实施例6制备得到的醋酸舍莫瑞林；空白对照D组：含3%吐温80的生理盐水。实验给药，按0.0145 μmol/kg剂量在昆明小鼠臀部皮下注射样品，其中注射样品的配制为：取样品粉末，滴加终浓度为3%的纯药用吐温80，磁力搅拌8 min后缓慢滴加生理盐水，滴加过程不断搅拌，滴加完毕后快速搅拌两次，每次15min，中间间隔12 min；离心取上清液得到注射样品。
测试方法：各组小鼠经过12∶12 h明暗交替饲养，温度为25±2℃。实验组按剂量在昆明小鼠臀部皮下注射样品，空白对照组注射等量生理盐水；分别在给药前、给药后不同天每天早上准时8∶30内眦采血50 μL，6000 r/min离心30 min取血清，用于GH测定，直到GH分泌达正常值。
结果分析
测试结果如表3所示：
表3 持续释放测试结果
| 组别 | 持续时间/d |
| K1 | 0.02 |
| K2 | 5 |
从表3中的数据可以看出，本发明实施例6制备的醋酸舍莫瑞林作用于小鼠体内，GH持续释放时间明显长于实施例1制备的，表明采用N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺对醋酸舍莫瑞林的肽链中赖氨酸的侧链ε-氨基进行化学修饰，得到的醋酸舍莫瑞林修饰物具有更长的半衰期，有效提升药物在体内作用时间，提升治疗效果。
2、免疫活性测定
测试对象：昆明小鼠，雌雄各半，体重19~23 g。
动物模型建立：昆明小鼠28只随机分为4组，每组7只；分为实验K1组：实施例1制备得到的醋酸舍莫瑞林，腹腔注射0.18 mg/kg；实验K2组：实施例6制备得到的醋酸舍莫瑞林，腹腔注射0.18 mg/kg；实验组同时每日腹腔注射环磷酰胺35 mg/kg；空白对照D组：生理盐水1 mL/(20 g/d)腹腔注射一次；模型对照M组：每日腹腔注射环磷酰胺35 mg/kg。各组分别于每日上午8∶30腹腔注射药物，持续5 d。
指标检测：
对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响
按照常规方法制备腹腔细胞悬液1.5×107/mL，取100 μL置于96孔板中，另设置加100 μL RPMI 1640作为空白对照，放入37℃、5% CO2培养箱中培养4 h后除去培养基，贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞单层；然后每孔加入100 μL 0.1%的中性红生理盐水液，继续培养30min后除去上清液，PBS液洗4遍后每孔加入100 μL细胞溶解溶液（乙酸/无水乙醇=1/1，v/v），室温下放置过夜，最后于540 nm 酶标仪上测吸光度A。
T淋巴细胞增殖反应
采用MTT比色法进行测试。按照常规方法制备腹腔细胞悬液2.5×107/mL，取100 μL置于96孔板中，每孔加100 μL含ConA（终浓度为5 mg/L）的完全培养液，置于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养68 h后，每孔加10 μL MTT（5 g/L）振荡混匀，继续培养4 h；然后每孔加100 μL DMSO振荡混匀，置于570 nm酶标仪上测A值。刺激指数按照下列公式计算：
刺激指数=实验孔A均值/对照孔A均值
测试结果分析
测试结果如表4所示：
表4 免疫活性测试结果
| 组别 | A值 | 刺激指数 |
| D | 0.19±0.04 | 1.91±0.38 |
| M | 0.04±0.01 | 1.13±0.42 |
| K1 | 0.09±0.02 | 1.45±0.31 |
| K2 | 0.15±0.03 | 1.76±0.37 |
从表4中的数据可以看出，M组处理后的A值与刺激指数均明显低于D组，表明实验模型成功建立。本发明实施例6制备的醋酸舍莫瑞林作用于小鼠体内，测定的A值与刺激指数明显高于实施例1制备的，表明采用N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺对醋酸舍莫瑞林的肽链中赖氨酸的侧链ε-氨基进行化学修饰，得到的醋酸舍莫瑞林修饰物具有更高的生物活性，进一步增强醋酸舍莫瑞林提高单核吞噬细胞吞噬功能的效果，提升非特异性免疫功能；并且能增强醋酸舍莫瑞林拮抗免疫抑制剂环磷酰胺所致的小鼠免疫抑制作用的效果。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (6)
1.一种多肽合成用缩合剂，包括离子液体；
所述离子液体为由阴阳离子组成的盐；所述阴离子包括[NTf2]-；
所述阳离子结构至少包括咪唑、氮杂啶、烷基、酯基；
所述离子液体的原料组成包括咪唑、1-溴代辛烷、1,6-二溴己烷、4-(氮杂啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯；
所述离子液体的制备方法，包括：
取咪唑和NaH加入THF中，0~2℃条件下搅拌40~50min后，恢复至室温加入1-溴代辛烷，搅拌反应20~24h；用THF萃取、薄层色谱硅胶柱纯化得到产物A；
取1,6-二溴己烷溶于乙腈中，浓度为0.8~1.4g/mL，加热回流，缓慢滴加产物A的乙腈溶液浓度为0.1~0.2g/mL，体系置于85~95℃下反应22~24h；减压蒸馏除溶剂，用无水乙醚洗涤3~4次，得到产物B；
取产物B和4-(氮杂啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯以及碳酸钾加入至乙腈中，85~95℃下搅拌反应68~76h；过滤，滤液减压蒸馏除溶剂，用无水乙醚洗涤3~5次；之后产物溶于超纯水中，加入过量LiNTf2进行阴离子交换5~7h，然后用二氯甲烷萃取、无水硫酸钠干燥、蒸干溶剂得到离子液体。
2.根据权利要求1所述的一种多肽合成用缩合剂，其特征在于：所述缩合剂还包括DMAP、HOBt和HBTU中的一种；以及，DCC、DIC和NMM中的一种。
3.一种制备醋酸舍莫瑞林的方法，包括：所述醋酸舍莫瑞林通过多肽固相合成方法制得；其中，合成过程用到的缩合剂包括权利要求1或权利要求2所述的多肽合成用缩合剂。
4.根据权利要求3所述的一种制备醋酸舍莫瑞林的方法，其特征在于：所述醋酸舍莫瑞林的肽链中赖氨酸的侧链ε-氨基被化学修饰，所述化学修饰用化合物包括N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺。
5.根据权利要求4所述的一种制备醋酸舍莫瑞林的方法，其特征在于：所述N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-6-O-硬脂酰-D-异谷氨酰胺通过酰胺化反应对醋酸舍莫瑞林进行化学修饰。
6.权利要求1所述的多肽合成用缩合剂在醋酸舍莫瑞林合成中的用途。
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