JP2022551976A - Ｐｅｇ化キヌレニナーゼ酵素及びがんの治療のためのその使用 - Google Patents

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Abstract

ポリエチレングリコールに共有結合したキヌレニナーゼ酵素について記載する。本開示の態様は、そのような分子を用いるキヌレニン除去によってがんの効果的な治療を改善するための組成物及び方法を提供する。【選択図】なし

Description

本開示は、ＰＥＧ化キヌレニナーゼ酵素の組成物及び合成方法、ならびにがんの治療のためのそれらの使用に関する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を含有し、これをもって参照によりその全体を援用する。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年１０月１６日に作成されたものであり、名前が５１１７５－０１４ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１０＿１６＿２０＿ＳＴ２５でありサイズが１２，４６１バイトである。
キヌレニンは、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）かトリプトファン２，３ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）かのどちらかの作用によって生成する、アミノ酸トリプトファンの代謝産物である。多くの腫瘍細胞はＩＤＯ及び／またはＴＤＯの発現を調節してキヌレニンの局所濃度を上昇させ、これが今度は、腫瘍を攻撃するはずの腫瘍内浸潤Ｔ細胞の機能を阻害する。キヌレニン濃度は、キヌレニンからアントラニル酸への分解を行うものであるキヌレニナーゼ酵素によって除去することができる。Ｔ細胞が腫瘍細胞を効果的に識別及び攻撃することができるようなキヌレニンの長期除去を実現するためには、キヌレニン分解の触媒活性が高く、血清中での失活に対する安定性が強化された治療化合物を開発することが必要とされ続けている。
本開示は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共有結合したキヌレニナーゼ酵素を提供する。キヌレニナーゼに共有結合しているＰＥＧ分子は、例えば、より高い血清中安定性、及びキヌレニン分解の触媒効率の向上を実現するために用いられ得る。向上した触媒効率を有する多くの一連のキヌレニナーゼ酵素変異種が、様々な連結基を有する多様なＰＥＧ分子と一緒に、本明細書に記載の組成物及び方法に関連して使用され得る。本明細書に記載の分子は、局所キヌレニン濃度が上昇しておりそれによってＴ細胞による標的化及び攻撃が妨げられている、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）及び／またはトリプトファン２，３ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）が発現するがんを治療するために、患者に投与され得る。
第１の態様において、本開示は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共有結合したキヌレニナーゼホモ二量体であって、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比が約１０：１～約４０：１、例えば約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１または４０：１である、当該ホモ二量体を提供する。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１１：１～約３９：１、例えば、約１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１または３９：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１２：１～約３８：１、例えば約１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１または３８：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１３：１～３７：１、例えば約１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１または３７：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１４：１～３６：１、例えば約１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１または３６：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１５：１～３５：１、例えば約１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１または３５：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１６：１～３４：１、例えば約１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１または３４：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１７：１～３３：１、例えば約１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１または３３：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１８：１～３２：１、例えば約１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１または３２：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１９：１～３１：１、例えば約１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１または３１：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約２０：１～３０：１、例えば約２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１または３０：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約２１：１～２９：１、例えば約２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１または２９：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約２２：１～２８：１、例えば約２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１または２８：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約２３：１～２７：１、例えば約２３：１、２４：１、２５：１、２６：１または２７：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約２４：１～２６：１、例えば約２４：１、２５：１または２６：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２５：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約１０：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約１１：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約１２：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約１３：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約１４：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約１５：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約１６：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約１７：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約１８：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約１９：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２０：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２１：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２２：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２３：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２４：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２５：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２６：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２７：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２８：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２９：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約３０：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約３１：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約３２：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約３３：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約３４：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約３５：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約３６：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約３７：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約３８：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約３９：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約４０：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１３：１～約３３：１、例えば約１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１または３３：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１８：１～約３３：１、例えば約１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１または３３：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１８：１～約２８：１、例えば約１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１または２８：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約１８：１～約２３：１、例えば約１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１または２３：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約２３：１～約３３：１、例えば約２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１または３３：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は、約２３：１～約２８：１、例えば約２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１または２８：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、約１ｋＤａ～約１０ｋＤａの分子量、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、約２ｋＤａ～約９ｋＤａ、例えば約２、３、４、５、６、７、８または９ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、約３ｋＤａ～約８ｋＤａ、例えば約３、４、５、６、７または８ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、約４ｋＤａ～約７ｋＤａ、例えば約４、５、６または７ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、約５ｋＤａ～約６ｋＤａ、例えば約５または６ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は約５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は直鎖型である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は分岐型である。
いくつかの実施形態では、ホモ二量体は、１つ以上のリジンまたはシステイン残基によって、例えば、１つ以上のリジン残基によって連結基、例えばリジンアミンとスクシンイミド基、アルデヒド基、アミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基またはその組合せとの反応から形成された連結基によって、ＰＥＧ分子に共有結合している。いくつかの実施形態では、連結基はスクシンイミド基、例えば、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルカーボネート、スクシンイミジルスクシンアミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドまたはその組合せ、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミドカーボネートである。いくつかの実施形態では、連結基は一官能性である。
いくつかの実施形態では、ホモ二量体は、配列番号１と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号１と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を各々が有している２つのポリペプチド単量体を含む。各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較して、Ｌ８Ｐ、Ｋ３８Ｅ、Ｙ４７Ｌ、Ｉ４８Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ｉ５１Ｍ、Ｓ６０Ｎ、Ｋ６４Ｎ、Ｄ６５Ｇ、Ｅ６６Ｋ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｐ、Ｄ６７Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｔ、Ａ６８Ｖ、Ｆ７１Ｌ、Ｆ７１Ｍ、Ｌ７２Ｎ、Ｋ８４Ｅ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｓ、Ｅ９０Ｑ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｔ、Ａ９５Ｈ、Ａ９５Ｑ、Ｋ９６Ｎ、Ｉ９７Ｈ、Ｉ９７Ｌ、Ｉ９７Ｖ、Ａ９８Ｇ、Ａ９９Ｇ、Ａ９９Ｉ、Ａ９９Ｒ、Ａ９９Ｓ、Ａ９９Ｔ、Ａ９９Ｖ、Ｙ１００Ｎ、Ｙ１００Ｓ、Ｙ１００Ｔ、Ｇ１０１Ａ、Ｈ１０２Ｗ、Ｅ１０３Ｆ、Ｅ１０３Ｈ、Ｅ１０３Ｎ、Ｅ１０３Ｑ、Ｅ１０３Ｒ、Ｅ１０３Ｖ、Ｅ１０３Ｗ、Ｖ１０４Ｄ、Ｖ１０４Ｅ、Ｖ１０４Ｆ、Ｖ１０４Ｈ、Ｖ１０４Ｋ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｒ、Ｇ１０５Ａ、Ｇ１０５Ｈ、Ｇ１０５Ｓ、Ｇ１０５Ｔ、Ｅ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｈ、Ｋ１０６Ｎ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｓ、Ｐ１０８Ｒ、Ｉ１１０Ａ、Ｉ１１０Ｆ、Ｉ１１０Ｌ、Ｉ１１０Ｍ、Ｉ１１０Ｔ、Ｔ１１１Ｄ、Ｔ１１１Ｈ、Ｔ１１１Ｎ、Ｔ１１１Ｒ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｃ、Ｇ１１２Ｄ、Ｇ１１２Ｋ、Ｇ１１２Ｌ、Ｇ１１２Ｍ、Ｇ１１２Ｑ、Ｇ１１２Ｒ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｎ１２７Ｋ、Ｉ１３１Ｖ、Ａ１３２Ｖ、Ｌ１３３Ｖ、Ａ１３６Ｔ、Ｌ１３７Ｔ、Ｔ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｈ１４２Ｑ、Ｑ１４Ｒ、Ｙ１５６Ｈ、Ｋ１６３Ｔ、Ｄ１６８Ｅ、Ｈ１６９Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、Ｉ１８３Ｆ、Ｉ１８３Ｌ、Ｉ１８３Ｐ、Ｉ１８３Ｓ、Ｅ１８４Ａ、Ｅ１８４Ｄ、Ｅ１８４Ｒ、Ｅ１８４Ｔ、Ｅ１８４Ｖ、Ｅ１８５Ｔ、Ｍ１８７Ｌ、Ｍ１８９Ｉ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９１Ｇ、Ｋ１９１Ｈ、Ｋ１９１Ｍ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ１９１Ｒ、Ｋ１９１Ｓ、Ｋ１９１Ｔ、Ｋ１９１Ｗ、Ｅ１９７Ａ、Ｅ１９７Ｄ、Ｅ１９７Ｆ、Ｅ１９７Ｋ、Ｅ１９７Ｍ、Ｅ１９７Ｑ、Ｅ１９７Ｓ、Ｅ１９７Ｔ、Ｅ１９７Ｖ、Ｉ２０１Ｃ、Ｉ２０１Ｅ、Ｉ２０１Ｆ、Ｉ２０１Ｈ、Ｉ２０１Ｌ、Ｉ２０１Ｓ、Ｉ２０１Ｔ、Ｉ２０１Ｖ、Ｈ２０３Ｋ、Ｌ２１９Ｍ、Ｌ２１９Ｗ、Ｆ２２０Ｌ、Ｖ２２３Ｉ、Ｆ２２５Ｙ、Ｈ２３０Ｆ、Ｈ２３０Ｌ、Ｈ２３０Ｙ、Ｎ２３２Ｓ、Ｙ２４６Ｆ、Ｆ２４９Ｗ、Ｄ２５０Ｅ、Ｓ２７４Ａ、Ｓ２７４Ｃ、Ｓ２７４Ｇ、Ｓ２７４Ｎ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ２７８Ｍ、Ａ２８０Ｇ、Ａ２８０Ｓ、Ａ２８０Ｔ、Ｇ２８１Ｓ、Ａ２８２Ｍ、Ａ２８２Ｐ、Ｇ２８４Ｎ、Ｉ２８５Ｌ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｆ３０６Ｗ、Ｆ３０６Ｙ、Ｓ３１１Ｎ、Ｋ３１５Ｅ、Ｄ３１７Ｅ、Ｄ３１７Ｋ、Ｉ３３１Ｃ、Ｉ３３１Ｌ、Ｉ３３１Ｎ、Ｉ３３１Ｓ、Ｉ３３１Ｔ、Ｉ３３１Ｖ、Ｎ３３３Ｔ、Ｐ３３４Ｎ、Ｐ３３５Ｔ、Ｌ３３７Ｔ、Ｌ３３８Ａ、Ｌ３３８Ｑ、Ｓ３４１Ｉ、Ｋ３７３Ｅ、Ｋ３７３Ｎ、Ｎ３７５Ａ、Ｎ３７５Ｈ、Ｙ３７６Ｃ、Ｙ３７６Ｆ、Ｙ３７６Ｌ、Ｋ３７８Ｇ、Ｋ３７８Ｐ、Ｋ３７８Ｑ、Ｋ３７８Ｒ、Ｋ３８０Ｇ、Ｋ３８０Ｓ、Ａ３８２Ｇ、Ａ３８２Ｒ、Ａ３８２Ｔ、Ｔ３８３Ｓ、Ｋ３８４Ｇ、Ｋ３８４Ｎ、Ｐ３８６Ｋ、Ｐ３８６Ｓ、Ｖ３８７Ｌ、Ｎ３８９Ｅ、Ｉ４０５Ｌ、Ｆ４０７Ｙ、Ｓ４０８Ｄ、Ｓ４０８Ｎ、Ｎ４１１Ｒ、Ｄ４１３Ｓ、Ｄ４１３Ｖ、Ｑ４１６Ｔ、Ｅ４１９Ａ、Ｅ４１９Ｌ、Ｋ４２０Ｅ、Ｒ４２１Ｎ、Ｖ４２４Ｉ、Ｋ４２７Ｍ、Ｎ４２９Ｅ、Ｇ４３２Ａ及びＡ４３６Ｔからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号１と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である）、または配列番号１と少なくとも９５％同一である（例えば、配列番号１と９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である）。
いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較して、Ａ２８２（例えばＡ２８２ＭまたはＡ２８２Ｐ）、Ｆ３０６（例えばＦ３０６ＷまたはＦ３０６Ｙ）、及び／またはＦ２４９、例えばＦ２４９Ｗに置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較してＡ９９に置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較してＧ１１２に置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較してＥ１０３に置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較してＶ１０４に置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較してＳ４０８に置換を含む。
いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、Ｆ３０６Ｗ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、Ｌ７２Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、Ｈ１０２Ｗ及びＮ３３３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体はＩ１８３Ｐ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体はＲ１０７Ｐ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体はＡ４３６Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較して、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つの置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔの置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較して、Ｌ７２Ｎ、Ａ９９Ｒ、Ｈ１０２Ｗ、Ｅ１０３Ｒ、Ｖ１０４Ｈ、Ｒ１０７Ｐ、Ｇ１１２Ｙ、Ｉ１８３Ｐ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ、Ｎ３３３Ｔ、Ｓ４０８Ｎ及びＡ４３６Ｔの置換を含む。
いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号３と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号３と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号３と少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号３と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号３と少なくとも９５％同一である（例えば、配列番号３と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は配列番号３のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号３のアミノ酸配列と比較して１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する。例えば、各ポリペプチド単量体は、配列番号３のアミノ酸配列と比較して５０個以下の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の保存的アミノ酸置換）を有し得る。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号３のアミノ酸配列と比較して２５個以下の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の保存的アミノ酸置換）を有し得る。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号３のアミノ酸配列と比較して１０個以下の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の保存的アミノ酸置換）を有し得る。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号３とは保存的アミノ酸置換によってのみ異なっているアミノ酸配列を有し得る。
いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号２と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号２と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号２と少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号２と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号２と少なくとも９５％同一である（例えば、配列番号２と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。各ポリペプチド単量体は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して１つ以上の保存的アミノ酸置換を有し得る。例えば、各ポリペプチド単量体は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して５０個以下の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の保存的アミノ酸置換）を有し得る。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して２５個以下の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の保存的アミノ酸置換）を有し得る。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して１０個以下の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の保存的アミノ酸置換）を有し得る。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号２とは保存的アミノ酸によってのみ異なっているアミノ酸配列を有し得る。
いくつかの実施形態では、ホモ二量体は、少なくとも８０００Ｍ－１ｓ－１の触媒活性（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体は、約８０００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；１００００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；２００００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；または２５０００Ｍ－１ｓ－１～３５０００Ｍ－１ｓ－１の触媒活性（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２５：１であり、ＰＥＧ分子は、約５ｋＤａの分子量を有し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルカーボネート連結基によってホモ二量体に結合している。
別の態様において、本開示は、キヌレニナーゼポリペプチドの循環半減期を延ばす方法であって、キヌレニナーゼポリペプチドをＰＥＧ化剤に接触させることを含み、キヌレニナーゼポリペプチドがホモ二量体を形成し、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比が約１０：１～約５０：１、例えば約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１または５０：１である、当該方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１１：１～約４９：１、例えば１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１または４９：である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１２：１～約４８：１、例えば１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１または４８：１。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１３：１～約４７：１、例えば１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１または４７：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１４：１～約４６：１、例えば１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１または４６：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１５：１～約４５：１、例えば１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１または４５：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１６：１～約４４：１、例えば１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１または４４：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１７：１～約４３：１、例えば１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１または４３：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１８：１～約４２：１、例えば１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１または４２：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１９：１～約４１：１、例えば１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１または４１：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２０：１～約４０：１、例えば２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１または４０：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２１：１～約３９：１、例えば２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１または３９：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２２：１～約３８：１、例えば２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１または３８：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２３：１～約３７：１、例えば２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１または３７：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２４：１～約３６：１、例えば２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１または３６：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２５：１～約３５：１、例えば２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１または３５：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２６：１～約３４：１、例えば２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１または３４：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２７：１～約３３：１、例えば２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１または３３：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２８：１～約３２：１、例えば２８：１、２９：１、３０：１、３１：１または３２：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２９：１～約３１：１、例えば２９：１、３０：１または３１：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は約３０：１である。
別の態様において、本開示は、ＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体を製造する方法であって、ホモ二量体が２つのポリペプチド単量体を含み、方法が、ホモ二量体をＰＥＧ化剤に接触させることを含み、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比が約１０：１～約５０：１、例えば約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１または５０：１である、当該方法を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１１：１～約４９：１、例えば約１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１または４９：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１２：１～約４８：１、例えば約１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１または４８：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１３：１～約４７：１、例えば約１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１または４７：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１４：１～約４６：１、例えば約１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１または４６：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１５：１～約４５：１、例えば約１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１または４５：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１６：１～約４４：１、例えば約１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１または４４：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１７：１～約４３：１、例えば約１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１または４３：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１８：１～約４２：１、例えば約１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１または４２：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１９：１～約４１：１、例えば約１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０；１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１または４１：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２０：１～約４０：１、例えば約２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１または４０：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２１：１～約３９：１、例えば約２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１または３９：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２２：１～約３８：１、例えば約２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１または３８：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２３：１～約３７：１、例えば約２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１または３７：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２４：１～約３６：１、例えば約２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１または３６：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２５：１～約３５：１、例えば約２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１または３５：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２６：１～約３４：１、例えば約２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１または３４：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２７：１～約３３：１、例えば約２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１または３３：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２８：１～約３２：１、例えば約２８：１、２９：１、３０：１、３１：１または３２：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２９：１～約３１：１、例えば約２９：１、３０：１または３１：１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は約３０：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約２０：１～約３０：１、例えば約２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１または３０：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１０：１～約３０：１、例えば約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１または３０：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１１：１～約２９：１、例えば約１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１または２９：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１２：１～約２８：１、例えば約１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１または２８：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１３：１～約２７：１、例えば約１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１または２７：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１４：１～約２６：１、例えば約１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１または２６：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１５：１～約２５：１、例えば約１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１または２５：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１６：１～約２４：１、例えば約１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１または２４：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１７：１～約２３：１、例えば約１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１または２３：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１８：１～約２２：１、例えば約１８：１、１９：１、２０：１、２１：１または２２：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は、約１９：１～約２１：１、例えば約１９：１、２０：１または２１：１である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とのモル投入量比は約２０：１である。
本開示の上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、約１ｋＤａ～約１０ｋＤａ、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、約２ｋＤａ～約９ｋＤａ、例えば約２、３、４、５、６、７、８または９ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、約３ｋＤａ～約８ｋＤａ、例えば約３、４、５、６、７または８ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、約４ｋＤａ～約７ｋＤａ、例えば約４、５、６または７ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、約５ｋＤａ～約６ｋＤａ、例えば約５または６ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は約５ｋＤａの分子量を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤は、リジン反応性ＰＥＧ化剤、例えば、本明細書に記載されているまたは当技術分野で知られている数あるリジン反応性部分の中でもＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）部分を含有する反応性基にＰＥＧ分子が結合したＰＥＧ化剤である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化剤は、システイン反応性ＰＥＧ化剤、例えば、本明細書に記載されているまたは当技術分野で知られている数あるシステイン反応性部分の中でもヨードアセトアミド部分またはマレイミド部分を含有する反応性基にＰＥＧ分子が結合したＰＥＧ化剤である。
いくつかの実施形態では、ホモ二量体は、１つ以上のリジンまたはシステイン残基によって、例えば１つ以上のリジン残基によってリジンアミンとスクシンイミド基、アルデヒド基、アミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基及びその組合せとの反応から形成された連結基によって、ＰＥＧ分子に共有結合している。いくつかの実施形態では、連結基はスクシンイミド基、例えば、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルカーボネート、スクシンイミジルスクシンアミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドまたはその組合せ、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミドカーボネートである。いくつかの実施形態では、連結基は一官能性である。
いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有し、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較して、Ｌ８Ｐ、Ｋ３８Ｅ、Ｙ４７Ｌ、Ｉ４８Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ｉ５１Ｍ、Ｓ６０Ｎ、Ｋ６４Ｎ、Ｄ６５Ｇ、Ｅ６６Ｋ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｐ、Ｄ６７Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｔ、Ａ６８Ｖ、Ｆ７１Ｌ、Ｆ７１Ｍ、Ｌ７２Ｎ、Ｋ８４Ｅ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｓ、Ｅ９０Ｑ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｔ、Ａ９５Ｈ、Ａ９５Ｑ、Ｋ９６Ｎ、Ｉ９７Ｈ、Ｉ９７Ｌ、Ｉ９７Ｖ、Ａ９８Ｇ、Ａ９９Ｇ、Ａ９９Ｉ、Ａ９９Ｒ、Ａ９９Ｓ、Ａ９９Ｔ、Ａ９９Ｖ、Ｙ１００Ｎ、Ｙ１００Ｓ、Ｙ１００Ｔ、Ｇ１０１Ａ、Ｈ１０２Ｗ、Ｅ１０３Ｆ、Ｅ１０３Ｈ、Ｅ１０３Ｎ、Ｅ１０３Ｑ、Ｅ１０３Ｒ、Ｅ１０３Ｖ、Ｅ１０３Ｗ、Ｖ１０４Ｄ、Ｖ１０４Ｅ、Ｖ１０４Ｆ、Ｖ１０４Ｈ、Ｖ１０４Ｋ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｒ、Ｇ１０５Ａ、Ｇ１０５Ｈ、Ｇ１０５Ｓ、Ｇ１０５Ｔ、Ｅ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｈ、Ｋ１０６Ｎ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｓ、Ｐ１０８Ｒ、Ｉ１１０Ａ、Ｉ１１０Ｆ、Ｉ１１０Ｌ、Ｉ１１０Ｍ、Ｉ１１０Ｔ、Ｔ１１１Ｄ、Ｔ１１１Ｈ、Ｔ１１１Ｎ、Ｔ１１１Ｒ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｃ、Ｇ１１２Ｄ、Ｇ１１２Ｋ、Ｇ１１２Ｌ、Ｇ１１２Ｍ、Ｇ１１２Ｑ、Ｇ１１２Ｒ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｎ１２７Ｋ、Ｉ１３１Ｖ、Ａ１３２Ｖ、Ｌ１３３Ｖ、Ａ１３６Ｔ、Ｌ１３７Ｔ、Ｔ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｈ１４２Ｑ、Ｑ１４Ｒ、Ｙ１５６Ｈ、Ｋ１６３Ｔ、Ｄ１６８Ｅ、Ｈ１６９Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、Ｉ１８３Ｆ、Ｉ１８３Ｌ、Ｉ１８３Ｐ、Ｉ１８３Ｓ、Ｅ１８４Ａ、Ｅ１８４Ｄ、Ｅ１８４Ｒ、Ｅ１８４Ｔ、Ｅ１８４Ｖ、Ｅ１８５Ｔ、Ｍ１８７Ｌ、Ｍ１８９Ｉ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９１Ｇ、Ｋ１９１Ｈ、Ｋ１９１Ｍ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ１９１Ｒ、Ｋ１９１Ｓ、Ｋ１９１Ｔ、Ｋ１９１Ｗ、Ｅ１９７Ａ、Ｅ１９７Ｄ、Ｅ１９７Ｆ、Ｅ１９７Ｋ、Ｅ１９７Ｍ、Ｅ１９７Ｑ、Ｅ１９７Ｓ、Ｅ１９７Ｔ、Ｅ１９７Ｖ、Ｉ２０１Ｃ、Ｉ２０１Ｅ、Ｉ２０１Ｆ、１２０１Ｈ、Ｉ２０１Ｌ、Ｉ２０１Ｓ、Ｉ２０１Ｔ、Ｉ２０１Ｖ、Ｈ２０３Ｋ、Ｌ２１９Ｍ、Ｌ２１９Ｗ、Ｆ２２０Ｌ、Ｖ２２３Ｉ、Ｆ２２５Ｙ、Ｈ２３０Ｆ、Ｈ２３０Ｌ、Ｈ２３０Ｙ、Ｎ２３２Ｓ、Ｙ２４６Ｆ、Ｆ２４９Ｗ、Ｄ２５０Ｅ、Ｓ２７４Ａ、Ｓ２７４Ｃ、Ｓ２７４Ｇ、Ｓ２７４Ｎ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ２７８Ｍ、Ａ２８０Ｇ、Ａ２８０Ｓ、Ａ２８０Ｔ、Ｇ２８１Ｓ、Ａ２８２Ｍ、Ａ２８２Ｐ、Ｇ２８４Ｎ、Ｉ２８５Ｌ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｆ３０６Ｗ、Ｆ３０６Ｙ、Ｓ３１１Ｎ、Ｋ３１５Ｅ、Ｄ３１７Ｅ、Ｄ３１７Ｋ、Ｉ３３１Ｃ、Ｉ３３１Ｌ、Ｉ３３１Ｎ、Ｉ３３１Ｓ、Ｉ３３１Ｔ、Ｉ３３１Ｖ、Ｎ３３３Ｔ、Ｐ３３４Ｎ、Ｐ３３５Ｔ、Ｌ３３７Ｔ、Ｌ３３８Ａ、Ｌ３３８Ｑ、Ｓ３４１Ｉ、Ｋ３７３Ｅ、Ｋ３７３Ｎ、Ｎ３７５Ａ、Ｎ３７５Ｈ、Ｙ３７６Ｃ、Ｙ３７６Ｆ、Ｙ３７６Ｌ、Ｋ３７８Ｇ、Ｋ３７８Ｐ、Ｋ３７８Ｑ、Ｋ３７８Ｒ、Ｋ３８０Ｇ、Ｋ３８０Ｓ、Ａ３８２Ｇ、Ａ３８２Ｒ、Ａ３８２Ｔ、Ｔ３８３Ｓ、Ｋ３８４Ｇ、Ｋ３８４Ｎ、Ｐ３８６Ｋ、Ｐ３８６Ｓ、Ｖ３８７Ｌ、Ｎ３８９Ｅ、Ｉ４０５Ｌ、Ｆ４０７Ｙ、Ｓ４０８Ｄ、Ｓ４０８Ｎ、Ｎ４１１Ｒ、Ｄ４１３Ｓ、Ｄ４１３Ｖ、Ｑ４１６Ｔ、Ｅ４１９Ａ、Ｅ４１９Ｌ、Ｋ４２０Ｅ、Ｒ４２１Ｎ、Ｖ４２４Ｉ、Ｋ４２７Ｍ、Ｎ４２９Ｅ、Ｇ４３２Ａ及びＡ４３６Ｔからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較して、Ａ２８２（例えばＡ２８２ＭまたはＡ２８２Ｐ）、Ｆ３０６（例えばＦ３０６ＷまたはＦ３０６Ｙ）、またはＦ２４９、例えばＦ２４９Ｗに置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は配列番号１と比較してＡ９９に置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は配列番号１と比較してＧ１１２に置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は配列番号１と比較してＥ１０３に置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較してＶ１０４に置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較してＳ４０８に置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体はＦ３０６Ｗ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体はＬ７２Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体はＨ１０２Ｗ及びＮ３３３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体はＩ１８３Ｐ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体はＲ１０７Ｐ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体はＡ４３６Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較して、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較して、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つの置換を含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号１と比較して、置換Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔを含む。
いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は配列番号３のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は、配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、各ポリペプチド単量体は配列番号２のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ホモ二量体は少なくとも８０００Ｍ－１ｓ－１の触媒活性（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体は、約８０００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；１００００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；２００００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；または２５０００Ｍ－１ｓ－１～３５０００Ｍ－１ｓ－１の触媒活性（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有する。
本開示の上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比は約２５：１であり、ＰＥＧ分子は、約５ｋＤａの分子量を有し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルカーボネート連結基によってホモ二量体に結合している。
いくつかの実施形態では、ホモ二量体は、水性緩衝液、例えば二リン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムの中でＰＥＧ化剤と接触する。いくつかの実施形態では、水性緩衝液のｐＨは、約７．５～約９．５の範囲、例えば、７．５、７．６、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４または９．５である。いくつかの実施形態では、水性緩衝液のイオン強度は約２５０ｍＭ～約３５０ｍＭの範囲である。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてホモ二量体を単離する。
本開示の上記態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、キヌレニナーゼホモ二量体は、ＷＯ２０１５／０３１７７１、ＷＯ２０１６／０３３４８８またはＷＯ２０１７／１５１８６０に開示されるアミノ酸置換の１つ以上を含有し得、参照によりこれらの各々の全体を本明細書に援用する。
上記及び本明細書に記述される改変型ポリペプチドは、非改変型ポリペプチド（例えば、天然ポリペプチド、例えば配列番号１のヒトキヌレニナーゼ）または本明細書に開示される任意のポリペプチド配列と比較して、ある百分率の同一性を有することを特徴とし得る。例えば、非改変型ポリペプチドは、天然キヌレニナーゼの少なくともまたは最大で約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または４６５個（またはその中で導き出せる任意の範囲）の残基を含み得る。改変型及び非改変型ポリペプチドの間の、または比較される任意の２つの配列の間の同一性百分率は、おおよそで、最大で、または少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（またはその中で導き出せる任意の範囲）であり得る。上に述べた同一性百分率が、ポリペプチドの非改変領域と比較したときのポリペプチドの特定の改変領域に関するものであってよいことも企図される。例えば、ポリペプチドは、キヌレニナーゼの改変型または変異型基質認識部位のアミノ酸配列と、同じ種からの、または種をまたいだ非改変型または変異型キヌレニナーゼのそれとの同一性に基づいて特徴付けられることができる、キヌレニナーゼの改変型または変異型基質認識部位を含有するものであってもよい。例えば非改変型キヌレニナーゼとの少なくとも９０％の同一性を有することを特徴とする改変型または変異型ヒトポリペプチドは、当該改変型または変異型ヒトポリペプチド中のアミノ酸の少なくとも９０％が非改変型ポリペプチド中のアミノ酸と同一であることを意味する。
そのような非改変型ポリペプチドは、天然キヌレニナーゼ、特にヒトアイソフォームまたは他の霊長類アイソフォームであり得る。例えば、天然ヒトキヌレニナーゼは配列番号１の配列を有し得る。他の天然霊長類キヌレニナーゼの非限定的な例としては、Ｐｏｎｇｏ ａｂｅｌｉｉキヌレニナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＸＰ＿００９２３５９６２．１、ＧＩ：６８６７０８６５６）、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓキヌレニナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＥＨＨ５４８４９．１、ＧＩ：３５５７５０５２２）、及びＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓキヌレニナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＸＰ＿００３３０９３１４．１、ＧＩ：３３２８１４５２１）が挙げられる。例示的な天然ポリペプチドには、配列番号１との同一性がおおよそで、最大で、または少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはその中で導き出せる任意の範囲）である配列が含まれる。例えば、天然ポリペプチドは、少なくともまたは最大で約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または４６５個（またはその中で導き出せる任意の範囲）の、配列番号１の配列の残基を含み得る。
別の態様では、本開示は、上記組成のいずれか１つを有するキヌレニナーゼホモ二量体を薬学的に許容される担体の中に含む医薬製剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、上記組成のいずれか１つを有するキヌレニナーゼホモ二量体を薬学的に許容される担体の中に含む。
別の態様において、本開示は、腫瘍を有する対象（例えば、哺乳動物対象、例えばヒト対象）を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の製剤または本明細書に記載の組成のいずれか１つを有する酵素を対象に投与することを含む、当該方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載の製剤または本明細書に記載の組成のいずれか１つを有する酵素を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２またはＴＤＯ発現腫瘍、例えば固形腫瘍または造血器腫瘍を有することが確認されている。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。
いくつかの実施形態では、製剤は、腫瘍内に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸腔内に、気管内に、眼内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下に、小嚢内に、経粘膜的に、心嚢内に、臍帯内に、経口的に、吸引によって、注射によって、輸注によって、持続注入によって、標的細胞に直接注ぐ局部灌流によって、カテーテルによって、または洗浄によって投与される。
いくつかの実施形態では、方法は、第２の抗がん療法を対象に施行することも含む。第２抗がん療法は、外科的療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法であり得る。いくつかの実施形態では、第２抗がん療法は免疫チェックポイント阻害剤療法であり得る。例えば、キヌレニナーゼホモ二量体を例えばがんまたは感染性疾患、例えば本明細書に記載のがんまたは感染性疾患の治療のために免疫療法剤と混合してもよいし、それに結合体化させてもよいし、それと共に投与してもよいし、または免疫療法剤とは別個に投与してもよい。本明細書に記載の組成物及び方法に関連して有用となる例示的な免疫療法剤は、限定されないが、抗ＣＴＬＡ－４剤、抗ＰＤ－１剤、抗ＰＤ－Ｌ１剤、抗ＰＤ－Ｌ２剤、抗ＴＮＦ－α架橋剤、抗ＴＲＡＩＬ架橋剤、抗ＣＤ２７剤、抗ＣＤ３０剤、抗ＣＤ４０剤、抗４－１ＢＢ剤、抗ＧＩＴＲ剤、抗ＯＸ４０剤、抗ＴＲＡＩＬＲ１剤、抗ＴＲＡＩＬＲ２剤、及び抗ＴＷＥＡＫＲ剤ならびに、例えばＭａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，１４：５６１－５８４（２０１５）の表１に記載の免疫標的に指向される薬剤を含み、参照によりその開示内容の全体を本明細書に援用する。例えば、免疫療法剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合性断片、例えばイピリムマブ及びトレメリムマブであり得る。免疫療法剤は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性断片、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ及びアテゾリズマブであってもよい。免疫療法剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片、例えばアテゾリズマブまたはアベルマブであってもよい。他の例として、免疫標的４－１ＢＢリガンドは抗４－１ＢＢリガンド抗体によって標的化され得；免疫標的ＯＸ４０Ｌは抗ＯＸ４０Ｌ抗体によって標的化され得；免疫標的ＧＩＴＲは抗ＧＩＴＲ抗体によって標的化され得；免疫標的ＣＤ２７は抗ＣＤ２７抗体によって標的化され得；免疫標的ＴＬ１Ａは抗ＴＬ１Ａ抗体によって標的化され得；免疫標的ＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０は抗ＣＤ４０Ｌ抗体によって標的化され得；免疫標的ＬＩＧＨＴは抗ＬＩＧＨＴ抗体によって標的化され得；免疫標的ＢＴＬＡは抗ＢＴＬＡ抗体によって標的化され得；免疫標的ＬＡＧ３は抗ＬＡＧ３抗体によって標的化され得；免疫標的ＴＩＭ３は抗ＴＩＭ３抗体によって標的化され得；免疫標的Ｓｉｎｇｌｅｃｓは抗Ｓｉｎｇｌｅｃｓ抗体によって標的化され得；免疫標的ＩＣＯＳリガンドは抗ＩＣＯＳリガンド抗体によって標的化され得；免疫標的Ｂ７－Ｈ３は抗Ｂ７－Ｈ３抗体によって標的化され得；免疫標的Ｂ７－Ｈ４は抗Ｂ７－Ｈ４抗体によって標的化され得；免疫標的ＶＩＳＴＡは抗ＶＩＳＴＡ抗体によって標的化され得；免疫標的ＴＭＩＧＤ２は抗ＴＭＩＧＤ２抗体によって標的化され得；免疫標的ＢＴＮＬ２は抗ＢＴＮＬ２抗体によって標的化され得；免疫標的ＣＤ４８は抗ＣＤ４８抗体によって標的化され得；免疫標的ＫＩＲは抗ＫＩＲ抗体によって標的化され得；免疫標的ＬＩＲは抗ＬＩＲ抗体によって標的化され得；免疫標的ＩＬＴは抗ＩＬＴ抗体によって標的化され得；免疫標的ＮＫＧ２Ｄは抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によって標的化され得；免疫標的ＮＫＧ２Ａは抗ＮＫＧ２Ａ抗体によって標的化され得；免疫標的ＭＩＣＡは抗ＭＩＣＡ抗体によって標的化され得；免疫標的ＭＩＣＢは抗ＭＩＣＢ抗体によって標的化され得；免疫標的ＣＤ２４４は抗ＣＤ２４４抗体によって標的化され得；免疫標的ＣＳＦ１Ｒは抗ＣＳＦ１Ｒ抗体によって標的化され得；免疫標的ＩＤＯは抗ＩＤＯ抗体によって標的化され得；免疫標的ＴＧＦβは抗ＴＧＦβ抗体によって標的化され得；免疫標的ＣＤ３９は抗ＣＤ３９抗体によって標的化され得；免疫標的ＣＤ７３は抗ＣＤ７３抗体によって標的化され得；免疫標的ＣＸＣＲ４は抗ＣＸＣＲ４抗体によって標的化され得；免疫標的ＣＸＣＬ１２は抗ＣＸＣＬ１２抗体によって標的化され得；免疫標的ＳＩＲＰＡは抗ＳＩＲＰＡ抗体によって標的化され得；免疫標的ＣＤ４７は抗ＣＤ４７抗体によって標的化され得；免疫標的ＶＥＧＦは抗ＶＥＧＦ抗体によって標的化され得；そして免疫標的ニューロピリンは抗ニューロピリン抗体によって標的化され得る（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．の表１を参照されたい）。
本明細書に記載の組成物及び方法に関連して使用され得る免疫療法剤としては、例えば、抗ＴＷＥＡＫ剤、抗細胞表面リンパ球タンパク質剤、抗ＢＲＡＦ剤、抗ＭＥＫ剤、抗ＣＤ３３剤、抗ＣＤ２０剤、抗ＨＬＡ－ＤＲ剤、抗ＨＬＡクラスＩ剤、抗ＣＤ５２剤、抗Ａ３３剤、抗ＧＤ３剤、抗ＰＳＭＡ剤、抗Ｃｅａｃａｎ１剤、抗Ｇａｌｅｄｉｎ９剤、抗ＨＶＥＭ剤、抗ＶＩＳＴＡ剤、抗Ｂ７ Ｈ４剤、抗ＨＨＬＡ２剤、抗ＣＤ１５５剤、抗ＣＤ８０剤、抗ＢＴＬＡ剤、抗ＣＤ１６０剤、抗ＣＤ２８剤、抗ＣＤ２２６剤、抗ＣＥＡＣＡＭ１剤、抗ＴＩＭ３剤、抗ＴＩＧＩＴ剤、抗ＣＤ９６剤、抗ＣＤ７０剤、抗ＣＤ２７剤、抗ＬＩＧＨＴ剤、抗ＣＤ１３７剤、抗ＤＲ４剤、抗ＣＲ５剤、抗ＴＮＦＲＳ剤、抗ＴＮＦＲ１剤、抗ＦＡＳ剤、抗ＣＤ９５剤、抗ＴＲＡＩＬ剤、抗ＤＲ６剤、抗ＥＤＡＲ剤、抗ＮＧＦＲ剤、抗ＯＰＧ剤、抗ＲＡＮＫＬ剤、抗ＬＴβ受容体剤、抗ＢＣＭＡ剤、抗ＴＡＣＩ剤、抗ＢＡＦＦＲ剤、抗ＥＤＡＲ２剤、抗ＴＲＯＹ剤、及び抗ＲＥＬＴ剤が挙げられる。例えば、免疫療法剤は、抗ＴＷＥＡＫ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗細胞表面リンパ球タンパク質抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＢＲＡＦ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＭＥＫ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ３３抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ２０抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＨＬＡクラスＩ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ５２抗体もしくはその抗原結合性断片、抗Ａ３３抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＧＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＰＳＭＡ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗Ｃｅａｃａｎ１抗体もしくはその抗原結合性断片、抗Ｇａｌｅｄｉｎ９抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＨＶＥＭ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＶＩＳＴＡ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗Ｂ７ Ｈ４抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＨＨＬＡ２抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ１５５抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ８０抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＢＴＬＡ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ１６０抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ２８抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ２２６抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ９６抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ７０抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ２７抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＬＩＧＨＴ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ１３７抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＤＲ４抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＲ５抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＴＮＦＲＳ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＴＮＦＲ１抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＦＡＳ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ９５抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＴＲＡＩＬ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＤＲ６抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＥＤＡＲ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＮＧＦＲ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＯＰＧ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＬＴβ受容体抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＢＣＭＡ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＴＡＣＩ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＢＡＦＦＲ抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＥＤＡＲ２抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＴＲＯＹ抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＲＥＬＴ抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。
いくつかの実施形態では、第２抗がん療法は、免疫療法、例えば、免疫エフェクター細胞または免疫原性組成物を投与することである。例えば、免疫原性組成物は、がん細胞抗原、及び任意選択的にアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）またはＮＫ／Ｔ細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞、及び実施形態のキヌレニナーゼホモ二量体を、がんを有する対象の治療に使用することが企図される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及びキヌレニナーゼ、ならびに場合によってはトランスポゼースをコードするＤＮＡを細胞にトランスフェクトしてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍を有するヒト対象におけるＴ細胞応答をもたらす方法であって、上記治療方法の実施形態のいずれか１つに従ってキヌレニナーゼホモ二量体を対象に投与することを含む、当該方法を提供する。
定義
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、記載されている値の上下１０％以内に入る値を指す。例えば、「約５，０００Ｄａ」という語句は、端点を含めた４，５００～５，５００Ｄａの値を指す。
本明細書中で使用する場合、「投与すること」、「投与」などの用語は、何らかの有効な経路によって本明細書に記載の１つ以上のタンパク質を一緒に発現させる治療剤（例えば製剤）を患者に直接与えることを意味する。例示的な投与経路は本明細書に記載されており、全身投与経路、例えば静脈内注射、ならびに患者の中枢神経系への直接的な投与経路、例えば数ある中でも脳室内注射、クモ膜下腔内注射及び定位注射によるものを含む。
本明細書中で使用する場合、「生物学的機能等価体」という用語は、当技術分野で十分に認識されており、本明細書中で詳しくさらに定義されている。したがって、タンパク質の生物活性が維持されるという条件で、アミノ酸の約７０％～約８０％、または約８１％～約９０％、さらに言えば約９１～約９９％が対照ポリペプチドのアミノ酸と同一または機能的に等価である配列が含まれる。改変型タンパク質は、いくつかの実施形態ではその天然の対応物と生物学的機能が等価であり得る。
関心対象のタンパク質の文脈で本明細書中で使用する場合、「触媒活性」という用語は、タンパク質の野生型形態に関連する生物学的機能を指す。例えば、酵素の文脈では、「触媒活性」という用語は、対応する化学反応の生成物が得られる方法で基質ターンオーバーをもたらすタンパク質の能力を指す。酵素の活性レベルは、例えば当技術分野で知られている基質ターンオーバーアッセイを用いて、検出及び定量され得る。別の例を挙げると、膜結合受容体の文脈では、「活性」という用語は、受容体によって例えばその同族リガンドとの結合により開始されるシグナル伝達を指し得る。
「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体またはキメラ免疫受容体を指し得、特定の免疫エフェクター細胞に人工特異性を移植する操作型受容体を包含し得る。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与してそれによって、例えば養子細胞療法に使用するための、多くの特異性Ｔ細胞の生成を可能にするために採用され得る。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、細胞の特異性を例えば腫瘍関連抗原へ差し向ける。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータ膜貫通及びエンドドメインと融合したモノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体（例えば米国特許第７，１０９，３０４号に記載のもの。参照によりその全体を本明細書に援用する）を含む。他のＣＡＲデザインの特異性は、受容体のリガンド（例えばペプチド）に由来するもの、またはパターン認識受容体、例えばデクチンに由来するものであり得る。特定の実施形態では、Ｂ系統分子ＣＤ１９に特異的なＣＡＲを使用することによって、Ｔ細胞の特異性を指向先転換することによって悪性Ｂ細胞を標的化することができる。場合によっては、抗原認識ドメインの間隔を改変して活性化誘導細胞死を軽減することができる。ある場合には、ＣＡＲは、付加的な共刺激シグナル伝達のためのドメイン、例えば、ＣＤ３－ゼータ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０及び／またはＯＸ４０を含む。場合によっては、共刺激分子、画像化（例えば陽電子放射断層撮影）のためのレポーター遺伝子、プロドラッグを与えた時にＴ細胞を条件付きで除去する遺伝子産物、帰巣受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン及びサイトカイン受容体を含めた分子を、ＣＡＲと共発現させることがある。
本明細書中で使用する場合、「ホモ二量体」という用語は、アミノ酸残基の順序、数及び種類に関して互いに同一である２本のポリペプチド鎖を含むタンパク質（例えばキヌレニナーゼ）を指す。したがって、「キヌレニナーゼホモ二量体」という用語は、アミノ酸残基の順序、数及び種類に関して互いに同一である２本の単量体型キヌレニナーゼポリペプチド鎖を含むキヌレニナーゼを指す。
本明細書中で使用する場合、「保存的変異」、「保存的置換」、「保存的アミノ酸置換」などの用語は、１つ以上のアミノ酸を、類似した物理化学的特質、例えば、極性、静電電荷及び立体体積を呈する１つ以上の異なるアミノ酸に置換することを意味する。天然に存在する２０種のアミノ酸の各々についてこれらの特質を以下の表１にまとめる。
Figure 2022551976000001
本明細書中で使用される「接触した」及び「曝露された」という用語は、細胞に対して適用される場合、治療構築物及び化学療法剤もしくは放射線療法剤を標的細胞に送達するまたは標的細胞のすぐ隣に配置するプロセスを表すために本明細書中で使用される。例えば、細胞殺滅を成し遂げるために両薬剤を、細胞を殺滅するためまたはそれが分裂するのを防ぐために有効な合計量で細胞に送達する。
本明細書中で使用される「有効量」、「治療的有効量」などの用語は、治療薬組成物、例えば、本明細書に記載のベクター構築物、ウイルスベクターまたは細胞に関して使用される場合、哺乳動物を含めた対象、例えばヒトに投与されたときに有益なまたは所望の結果、例えば臨床結果をもたらすのに十分な量を指す。例えば、本明細書に記載のがんの治療の文脈においてこれらの用語は、組成物、ベクター構築物、ウイルスベクターまたは細胞の投与なしで得られる応答に比べて治療奏効をもたらすのに十分な組成物の量を指す。そのような量に相当する本明細書に記載の所与の組成物の量は、様々な因子、例えば、与える薬剤、医薬製剤、投与経路、疾患もしくは障害の種類、対象の識別情報（例えば、年齢、性別、体重）、または治療されようとしている宿主などに応じて様々であり得る。組成物、例えば本開示のベクター構築物、ウイルスベクターまたは細胞の「有効量」、「治療的有効量」などには、対照に比べ有益なまたは望ましい結果を対象にもたらす量も含まれる。
本明細書中で使用する場合、「融合タンパク質」という用語は、天然にはない方法で機能可能に連結されているタンパク質またはタンパク質断片を含有するキメラタンパク質を指す。
本明細書中で使用する場合、「半減期」（１／２寿命）という用語は、試験管内または生体内で、例えば哺乳動物に注射した後に、そのポリペプチドの濃度が半分に下がるまでに必要とされるであろう時間を指す。
本明細書中で使用される「ＫＭ」という用語は、酵素に関するミカエリス・メンテン定数を指し、酵素触媒反応において所与の酵素がその最大速度の半分を生む特定基質の濃度として定義される。本明細書中で使用される「ｋｃａｔ」という用語は、ターンオーバー数、または酵素が最大効率で働いている単位時間あたりに各酵素部位が生成物に変換する基質分子の数を指す。本明細書中で使用される「ｋｃａｔ／ＫＭ」という用語は、どれだけ効率的に酵素が基質を生成物に変換するかについての尺度である特異性定数である。
本明細書中で使用する場合、「キヌレニナーゼ」という用語は、キヌレニンからアントラニル酸への触媒的分解を担う酵素を指す。「キヌレニナーゼ」という用語は、野生型キヌレニナーゼ酵素の多様体及びそれをコードする核酸、例えば、野生型キヌレニナーゼ酵素のアミノ酸配列（例えば配列番号１）との少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．９％の、またはそれを上回る同一性）を有する多様体タンパク質、あるいはコードされるキヌレニナーゼ類縁体が野生型キヌレニナーゼの治療的機能を保持するという条件で野生型キヌレニン遺伝子の核酸配列との少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．９％の、またはそれを上回る同一性）を有するポリヌクレオチドも指す。「キヌレニナーゼ」は、天然シグナルペプチドが存在しているキヌレニナーゼタンパク質も指す場合もある。あるいは、「キヌレニナーゼ」は、天然のシグナルペプチドが除去されたキヌレニナーゼタンパク質（例えば成熟タンパク質）を指す場合もある。キヌレニナーゼは、キヌレニナーゼの触媒ドメイン、またはそのようなドメインとの少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．９％の、またはそれを上回る同一性）を有する多様体を指す場合もある。加えて、「キヌレニナーゼ」という用語は、ポリペプチドが別の薬剤、例えば、別のポリペプチド、半減期改変剤、例えばＰＥＧ化剤、または治療剤に機能可能に連結されている多様体も含む。本明細書中で使用する場合、「キヌレニナーゼ」は、当業者には理解されるように、文脈に応じて酵素、またはこのタンパク質をコードする遺伝子を指し得る。
キヌレニナーゼは、個々の「キヌレニナーゼ単量体」の二量体、例えば、同じアミノ酸配列を各々が有している２つのキヌレニナーゼ単量体で構成されるホモ二量体として存在し得る。本明細書中で使用される「キヌレニナーゼ単量体」という用語は、別のそのようなポリペプチドと非共有結合的に結び付けられたときに二量体型キヌレニナーゼ酵素を形成する個々のポリペプチドを指す。本開示のキヌレニナーゼ単量体は、本明細書の配列番号１、配列番号２または配列番号３と例えば少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である）アミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体は、配列番号１と比較して１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｌ８Ｐ、Ｋ３８Ｅ、Ｙ４７Ｌ、Ｉ４８Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ｉ５１Ｍ、Ｓ６０Ｎ、Ｋ６４Ｎ、Ｄ６５Ｇ、Ｅ６６Ｋ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｐ、Ｄ６７Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｔ、Ａ６８Ｖ、Ｆ７１Ｌ、Ｆ７１Ｍ、Ｌ７２Ｎ、Ｋ８４Ｅ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｓ、Ｅ９０Ｑ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｔ、Ａ９５Ｈ、Ａ９５Ｑ、Ｋ９６Ｎ、Ｉ９７Ｈ、Ｉ９７Ｌ、Ｉ９７Ｖ、Ａ９８Ｇ、Ａ９９Ｇ、Ａ９９Ｉ、Ａ９９Ｒ、Ａ９９Ｓ、Ａ９９Ｔ、Ａ９９Ｖ、Ｙ１００Ｎ、Ｙ１００Ｓ、Ｙ１００Ｔ、Ｇ１０１Ａ、Ｈ１０２Ｗ、Ｅ１０３Ｆ、Ｅ１０３Ｈ、Ｅ１０３Ｎ、Ｅ１０３Ｑ、Ｅ１０３Ｒ、Ｅ１０３Ｖ、Ｅ１０３Ｗ、Ｖ１０４Ｄ、Ｖ１０４Ｅ、Ｖ１０４Ｆ、Ｖ１０４Ｈ、Ｖ１０４Ｋ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｒ、Ｇ１０５Ａ、Ｇ１０５Ｈ、Ｇ１０５Ｓ、Ｇ１０５Ｔ、Ｅ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｈ、Ｋ１０６Ｎ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｓ、Ｐ１０８Ｒ、Ｉ１１０Ａ、Ｉ１１０Ｆ、Ｉ１１０Ｌ、Ｉ１１０Ｍ、Ｉ１１０Ｔ、Ｔ１１１Ｄ、Ｔ１１１Ｈ、Ｔ１１１Ｎ、Ｔ１１１Ｒ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｃ、Ｇ１１２Ｄ、Ｇ１１２Ｋ、Ｇ１１２Ｌ、Ｇ１１２Ｍ、Ｇ１１２Ｑ、Ｇ１１２Ｒ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｎ１２７Ｋ、Ｉ１３１Ｖ、Ａ１３２Ｖ、Ｌ１３３Ｖ、Ａ１３６Ｔ、Ｌ１３７Ｔ、Ｔ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｈ１４２Ｑ、Ｑ１４Ｒ、Ｙ１５６Ｈ、Ｋ１６３Ｔ、Ｄ１６８Ｅ、Ｈ１６９Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、Ｉ１８３Ｆ、Ｉ１８３Ｌ、Ｉ１８３Ｐ、Ｉ１８３Ｓ、Ｅ１８４Ａ、Ｅ１８４Ｄ、Ｅ１８４Ｒ、Ｅ１８４Ｔ、Ｅ１８４Ｖ、Ｅ１８５Ｔ、Ｍ１８７Ｌ、Ｍ１８９Ｉ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９１Ｇ、Ｋ１９１Ｈ、Ｋ１９１Ｍ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ１９１Ｒ、Ｋ１９１Ｓ、Ｋ１９１Ｔ、Ｋ１９１Ｗ、Ｅ１９７Ａ、Ｅ１９７Ｄ、Ｅ１９７Ｆ、Ｅ１９７Ｋ、Ｅ１９７Ｍ、Ｅ１９７Ｑ、Ｅ１９７Ｓ、Ｅ１９７Ｔ、Ｅ１９７Ｖ、Ｉ２０１Ｃ、Ｉ２０１Ｅ、Ｉ２０１Ｆ、１２０１Ｈ、Ｉ２０１Ｌ、Ｉ２０１Ｓ、Ｉ２０１Ｔ、Ｉ２０１Ｖ、Ｈ２０３Ｋ、Ｌ２１９Ｍ、Ｌ２１９Ｗ、Ｆ２２０Ｌ、Ｖ２２３Ｉ、Ｆ２２５Ｙ、Ｈ２３０Ｆ、Ｈ２３０Ｌ、Ｈ２３０Ｙ、Ｎ２３２Ｓ、Ｙ２４６Ｆ、Ｆ２４９Ｗ、Ｄ２５０Ｅ、Ｓ２７４Ａ、Ｓ２７４Ｃ、Ｓ２７４Ｇ、Ｓ２７４Ｎ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ２７８Ｍ、Ａ２８０Ｇ、Ａ２８０Ｓ、Ａ２８０Ｔ、Ｇ２８１Ｓ、Ａ２８２Ｍ、Ａ２８２Ｐ、Ｇ２８４Ｎ、Ｉ２８５Ｌ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｆ３０６Ｗ、Ｆ３０６Ｙ、Ｓ３１１Ｎ、Ｋ３１５Ｅ、Ｄ３１７Ｅ、Ｄ３１７Ｋ、Ｉ３３１Ｃ、Ｉ３３１Ｌ、Ｉ３３１Ｎ、Ｉ３３１Ｓ、Ｉ３３１Ｔ、Ｉ３３１Ｖ、Ｎ３３３Ｔ、Ｐ３３４Ｎ、Ｐ３３５Ｔ、Ｌ３３７Ｔ、Ｌ３３８Ａ、Ｌ３３８Ｑ、Ｓ３４１Ｉ、Ｋ３７３Ｅ、Ｋ３７３Ｎ、Ｎ３７５Ａ、Ｎ３７５Ｈ、Ｙ３７６Ｃ、Ｙ３７６Ｆ、Ｙ３７６Ｌ、Ｋ３７８Ｇ、Ｋ３７８Ｐ、Ｋ３７８Ｑ、Ｋ３７８Ｒ、Ｋ３８０Ｇ、Ｋ３８０Ｓ、Ａ３８２Ｇ、Ａ３８２Ｒ、Ａ３８２Ｔ、Ｔ３８３Ｓ、Ｋ３８４Ｇ、Ｋ３８４Ｎ、Ｐ３８６Ｋ、Ｐ３８６Ｓ、Ｖ３８７Ｌ、Ｎ３８９Ｅ、Ｉ４０５Ｌ、Ｆ４０７Ｙ、Ｓ４０８Ｄ、Ｓ４０８Ｎ、Ｎ４１１Ｒ、Ｄ４１３Ｓ、Ｄ４１３Ｖ、Ｑ４１６Ｔ、Ｅ４１９Ａ、Ｅ４１９Ｌ、Ｋ４２０Ｅ、Ｒ４２１Ｎ、Ｖ４２４Ｉ、Ｋ４２７Ｍ、Ｎ４２９Ｅ、Ｇ４３２Ａ及びＡ４３６Ｔからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する。本開示のキヌレニナーゼ単量体は、例えば、配列番号１と比較してＡ２８２（例えばＡ２８２ＭまたはＡ２８２Ｐ）、Ｆ３０６（例えばＦ３０６ＷまたはＦ３０６Ｙ）、またはＦ２４９、例えばＦ２４９Ｗに置換を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体は、配列番号１と比較してＡ９９に置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体は、配列番号１と比較してＧ１１２に置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体は、配列番号１と比較してＥ１０３に置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体は、配列番号１と比較してＶ１０４に置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体は、配列番号１と比較してＳ４０８に置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体はＦ３０６Ｗ置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体はＬ７２Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体はＨ１０２Ｗ及びＮ３３３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体はＩ１８３Ｐ置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体はＲ１０７Ｐ置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体はＡ４３６Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体は、配列番号１と比較して、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体は、配列番号１と比較して、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼ単量体は、配列番号１と比較してＬ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔの置換を含む。
本明細書中で使用する場合、「連結基」という用語は、連結基の一方の部分が第１分子に機能可能に連結され、連結基のもう一方の部分が第２分子に機能可能に連結された、２つの異なる分子を機能可能に連結する分子架橋として作用する、化合物またはその部分を指す。
本明細書中で使用する場合、「改変型タンパク質」または「改変型ポリペプチド」という用語は、例えば、非改変型タンパク質またはポリペプチドよりも優れる付加的な利点、例えばキヌレニン分解活性または熱力学的安定性を有するタンパク質またはポリペプチドを含む。
本明細書中で使用する場合、「単量体」という用語は、タンパク質のさらなる四次構造の最も単純な基本サブユニットである単一のポリペプチド鎖を指す。
本明細書中で使用する場合、「ＰＥＧ化剤」という用語は、タンパク質に対する様々な化学的方法の手段でＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシ基によって例えば活性剤に結合する（例えば共有結合で連結される）ことができるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を指す。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ自体は、ＰＥＧ分子１つあたり多くとも２つの活性剤を上限とする。異なる手法では、ＰＥＧの生体適合性を保持しているが分子１つあたりの結合点が多数あることの利点が付加されており、かくしてより大きな薬物搭載量をもたらす、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーを使用することができる。
本明細書中で使用する場合、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して「配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るべく配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の中の核酸またはアミノ酸と同一である、候補配列中の核酸またはアミノ酸の百分率と定義される。核酸またはアミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲内である様々な方法で、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアを使用して成し遂げられ得る。当業者であれば、比較しようとする配列の完全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含めて、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。例えば、配列同一性パーセント値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して生成され得る。例示として、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれに照らした所与の核酸またはアミノ酸配列Ａの配列同一性パーセントは（これは代わりに、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれに照らしたある配列同一性パーセントを有する所与の核酸またはアミノ酸配列Ａ、と表現され得るが）、以下のとおりに算出され：
１００掛ける（分数Ｘ／Ｙ）
式中のＸは、配列アラインメントプログラム（例えばＢＬＡＳＴ）によってそのプログラムのＡとＢとのアラインメントにおいて同一な一致として評価されるヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂ中の核酸の合計数である。核酸またはアミノ酸配列Ａの長さが核酸またはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの配列同一性パーセントが、Ａに対するＢの配列同一性パーセントと等しくならないことは、認識されよう。
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な利益／リスク比に見合って過度の毒性、刺激、アレルギー反応及び他の問題となる合併症を伴わずに対象、例えば哺乳動物（例えばヒト）の組織との接触に適している化合物、物質、組成物及び／または剤形を指す。
本明細書中で使用する場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結び付けられたアミノ酸を含む化合物を指し、互換的に使用される。
本明細書中で使用する場合、「対象」及び「患者」は、ヒトまたは非ヒト、例えば霊長類、哺乳動物、及び脊椎動物のいずれかを指す。特定の実施形態では、対象はヒトである。
本明細書中で使用する場合、「治療」及び「治療すること」は、有益なまたは所望の結果、例えば臨床結果を得るための手法を指す。有益なまたは所望の結果には、検出可能であろうと検出可能でなかろうと、１つ以上の症候または症状の緩和または改善；疾患または症状の度合いの低減；疾患、障害または症状の安定化された（つまり悪化していない）状態；疾患または症状の広がりを防止すること；疾患または症状を遅らせるまたは減速させること；疾患または症状の改善または一時的緩和；及び（部分あるいは完全）寛解が含まれ得るが、これらに限定されない。疾患または症状を「改善すること」または「一時的に緩和すること」は、治療なしでの程度または経時変化と比較して、疾患、障害または症状の程度及び／または望ましくない臨床兆候が減少すること、及び／または進行の経時変化が減速もしくは長期化することを意味する。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延ばすことも意味し得る。治療を必要とする者には、既に症状または障害を有する者、及び症状または障害を発症しやすいまたは発症するリスクがある者、及び症状または障害が予防されるべき者が含まれる。
本明細書中で使用する場合、「単位用量」という用語は、治療薬組成物に関して使用される場合、対象のための単位投薬量として適し、各単位が必要な希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと共に所望の治療効果を生むように算出された所定量の活性物質を含有する、物理的に別個な単位を指す。
以下の図面は、本明細書の一部を形成するものであり、本発明のある態様をさらに示すために含まれている。本発明は、本明細書に提供される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。
ＰＥＧ化キヌレニナーゼ結合体の生成。ＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体の２０：１～６０：１の投入量比で得られたキヌレニナーゼ単量体１つあたりの結合体化ＰＥＧ分子の数。図１Ａ～１Ｆに示されるモル投入量比は全て、ＰＥＧのキヌレニナーゼホモ二量体に対する投入量比である。 ＰＥＧ化キヌレニナーゼ結合体の生成。ＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体の２０：１～６０：１の投入量比で得られたキヌレニナーゼホモ二量体１つあたりの結合体化ＰＥＧ分子の数。図１Ａ～１Ｆに示されるモル投入量比は全て、ＰＥＧのキヌレニナーゼホモ二量体に対する投入量比である。 ＰＥＧ化キヌレニナーゼ結合体の生成。ＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体の２０：１～６０：１の投入量比でのＰＥＧ分子とキヌレニナーゼとの結合体化反応の効率。図１Ａ～１Ｆに示されるモル投入量比は全て、ＰＥＧのキヌレニナーゼホモ二量体との投入量比である。 ＰＥＧ化キヌレニナーゼ結合体の生成。ＰＥＧとキヌレニナーゼホモ二量体との２０：１の投入量比で得られたＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体生成物のＳＥＣ－ＭＡＬＳ ＨＰＬＣ。図１Ａ～１Ｆに示されるモル投入量比は全て、ＰＥＧのキヌレニナーゼホモ二量体に対する投入量比である。 ＰＥＧ化キヌレニナーゼ結合体の生成。ＰＥＧとキヌレニナーゼホモ二量体との３０：１の投入量比で得られたＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体生成物のＳＥＣ－ＭＡＬＳ ＨＰＬＣ。図１Ａ～１Ｆに示されるモル投入量比は全て、ＰＥＧのキヌレニナーゼホモ二量体に対する投入量比である。 ＰＥＧ化キヌレニナーゼ結合体の生成。ＰＥＧとキヌレニナーゼホモ二量体との６０：１の投入量比で得られたＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体生成物のＳＥＣ－ＭＡＬＳ ＨＰＬＣ。図１Ａ～１Ｆに示されるモル投入量比は全て、ＰＥＧのキヌレニナーゼホモ二量体に対する投入量比である。 ＰＥＧ化キヌレニナーゼ酵素の生物活性の比較。異なる投入量比でのキヌレニナーゼのＳＥＣ－ＨＰＬＣプロファイル（ＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体として示される）。ピークは左から右に向かってそれぞれ、ＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体の１００：１のモル投入量比、ＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体の８０：１のモル投入量比、ＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体の４０：１のモル投入量比、ＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体の２０：１のモル投入量比、ＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体の１０：１のモル投入量比、及び非ＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体に対応する。図２Ａ～２Ｃに示されるモル投入量比は全て、ＰＥＧのキヌレニナーゼホモ二量体に対する投入量比である。 ＰＥＧ化キヌレニナーゼ酵素の生物活性の比較。ＰＥＧ化キヌレニナーゼの単回ｉｖ投薬から７２時間後のマウス血漿ＰＤ。ｘ軸の値はＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体のモル投入量比に対応する。図２Ａ～２Ｃに示されるモル投入量比は全て、ＰＥＧのキヌレニナーゼホモ二量体に対する投入量比である。 ＰＥＧ化キヌレニナーゼ酵素の生物活性の比較。抗ＰＥＧウェスタンブロットによって定量されたＰＥＧ化キヌレニナーゼのＣＴ２６腫瘍蓄積量。ｘ軸の値は、実施例３に記載されるＢＡＬＢ／ｃマウスへのキヌレニナーゼの投与の後に腫瘍蓄積量を評価した時間点を表す。図２Ｃに示される各時間点について４つの垂直なバーが示されており、これらはそれぞれ、ＰＥＧとキヌレニナーゼホモ二量体との特定の投入量比によって形成されたキヌレニナーゼの相対腫瘍蓄積量を表す。各時間点での垂直なバーは、左から右に向かってそれぞれ、１０：１、２０：１、４０：１及び１００：１のモル投入量比によって形成されたキヌレニナーゼホモ二量体に対応する。図２Ａ～２Ｃに示されるモル投入量比は全て、ＰＥＧのキヌレニナーゼホモ二量体に対する投入量比である。
本開示は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合したキヌレニナーゼタンパク質ならびに、そのようなタンパク質を合成する方法、及びがんを有する患者、例えば腫瘍を有する患者の治療のためのその使用方法を提供する。特に、本開示は、ＰＥＧに共有結合していないキヌレニナーゼタンパク質に比べて向上した薬物動態特性及び／または薬力学的特性、例えば、改善された腫瘍蓄積量、延長された半減期及びより大きな酵素活性をもたらすＰＥＧとキヌレニナーゼとの比を特徴とする、ＰＥＧ化キヌレニナーゼタンパク質を提供する。機序によって限定するわけではないが、本明細書に記載のキヌレニナーゼタンパク質は、血清中での不活化に対する向上した抵抗性を呈し得、これは、より長い時間にわたってキヌレニナーゼがキヌレニン分解活性を維持することを可能にする。かくして、本明細書に記載のＰＥＧ：キヌレニナーゼ比を特徴とするＰＥＧ化キヌレニナーゼ酵素は、それを治療的疾患介入、例えばがんの治療のための理想的なものにする実質的に改善された治療的特質を呈し得る。いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼタンパク質は、がん患者、例えば、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）またはトリプトファン２，３ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）を発現する腫瘍を有する患者を治療するために使用される。
以下の節に、上記の有益な治療的特質をもたらすＰＥＧ：キヌレニナーゼポリペプチドの比、ならびにそのようなタンパク質を製造するため及びそれを患者の治療に使用するために用いられ得るプロセスを記載する。
キヌレニナーゼタンパク質
ＰＥＧ化キヌレニナーゼ酵素のいくつかの実施形態は、改変型タンパク質及びポリペプチドに関する。特定の実施形態は、非改変型形態と同程度の少なくとも１つの機能的活性、好ましくはキヌレニン分解活性を呈する改変型タンパク質またはポリペプチドに関する。さらなる実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、血清中での安定性を向上させるようにさらに改変され得る。
活性の決定は、特にタンパク質の活性に関する、当業者によく知られているアッセイを用いて成し遂げられ得、比較目的のために、天然及び／または組換え形態の、改変型か非改変型かのどちらかのタンパク質またはポリペプチドの使用を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変型ポリペプチド、例えば改変型キヌレニナーゼは、そのキヌレニンの増加に基づいて同定され得る。例えば、非改変型ポリペプチドの基質認識部位が同定され得る。この同定は、構造解析または相同性解析に基づくものであり得る。そのような基質認識部位の改変を伴った変異体の集団が生み出され得る。さらなる実施形態では、キヌレニン分解活性が増大した変異体が、変異体集団から選択され得る。所望の変異体の選択は、例えば、キヌレニン分解による副生成物または生成物の検出などの方法を含み得る。
改変型タンパク質は、アミノ酸の欠失及び／または置換を有し得、したがって、欠失を有するタンパク質、置換を有するタンパク質、及び欠失と置換を有するタンパク質は、改変型タンパク質である。いくつかの実施形態では、これらの改変型タンパク質は、融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質の場合のように、挿入または付加アミノ酸をさらに含み得る。改変欠失型タンパク質は、天然タンパク質の１つ以上の残基を欠くが、天然タンパク質の特異性及び／または活性は有し得る。改変欠失型タンパク質はまた、低減された免疫原性または抗原性を有することもある。改変欠失型タンパク質の一例は、少なくとも１つの抗原性領域から、つまり、特定の生物、例えば改変型タンパク質が投与され得る生物の一種において抗原性であることが判定されたタンパク質の領域から、アミノ酸残基が欠失したものである。
置換または置換え多様体は典型的には、タンパク質中の１つ以上の部位において１つのアミノ酸と別のものとの交換が含まれており、ポリペプチドの１つ以上の特性、特にそのエフェクター機能及び／または生物学的利用能を調節するように設計され得る。置換は、保存的なもの、すなわち、あるアミノ酸を形状及び電荷が類似しているもので置き換えるものであってもよく、保存的でなくてもよい。保存的置換は当技術分野でよく知られており、例えば、アラニンからセリンへ；アルギニンからリジンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ；アスパルテートからグルタメートへ；システインからセリンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタメートからアスパルテートへ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへ；リジンからアルギニンへ；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへ；フェニルアラインからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへ；セリンからスレオニンへ；スレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；及びバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化を含む。
欠失または置換に加えて、改変型タンパク質は、ポリペプチドにおける少なくとも１つの残基の付加を伴うことが典型的である残基の挿入を有し得る。これには、標的指向性ペプチドもしくはポリペプチドの、または単に単一の残基の挿入が含まれ得る。融合タンパク質と呼ばれる末端付加については以下に述べる。
タンパク質発現に関係する生物学的タンパク質活性の維持を含めて上に示される基準を配列が満たしている限りにおいて、アミノ酸及び核酸配列が、付加的な残基、例えば付加的なＮ－もしくはＣ－末端アミノ酸または５’もしくは３’配列を含みながらなおも本質的には、本明細書に開示される配列の１つに示されるようなものであり得ることも、理解されよう。末端配列の付加はとりわけ、例えば、コード領域の５’もしくは３’部分のどちらかに隣接する様々な非コード配列を含み得る、または遺伝子内に現れることが知られている様々な内部配列、すなわちイントロンを含み得る、核酸配列に適用される。
いくつかの実施形態では、実施形態によるキヌレニナーゼは、配列番号１、２または３のキヌレニナーゼと少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、キヌレニナーゼは、配列番号１、２または３のキヌレニナーゼと少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、Ｌ８Ｐ、Ｋ３８Ｅ、Ｙ４７Ｌ、Ｉ４８Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ｉ５１Ｍ、Ｓ６０Ｎ、Ｋ６４Ｎ、Ｄ６５Ｇ、Ｅ６６Ｋ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｐ、Ｄ６７Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｔ、Ａ６８Ｖ、Ｆ７１Ｌ、Ｆ７１Ｍ、Ｌ７２Ｎ、Ｋ８４Ｅ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｓ、Ｅ９０Ｑ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｔ、Ａ９５Ｈ、Ａ９５Ｑ、Ｋ９６Ｎ、Ｉ９７Ｈ、Ｉ９７Ｌ、Ｉ９７Ｖ、Ａ９８Ｇ、Ａ９９Ｇ、Ａ９９Ｉ、Ａ９９Ｒ、Ａ９９Ｓ、Ａ９９Ｔ、Ａ９９Ｖ、Ｙ１００Ｎ、Ｙ１００Ｓ、Ｙ１００Ｔ、Ｇ１０１Ａ、Ｈ１０２Ｗ、Ｅ１０３Ｆ、Ｅ１０３Ｈ、Ｅ１０３Ｎ、Ｅ１０３Ｑ、Ｅ１０３Ｒ、Ｅ１０３Ｖ、Ｅ１０３Ｗ、Ｖ１０４Ｄ、Ｖ１０４Ｅ、Ｖ１０４Ｆ、Ｖ１０４Ｈ、Ｖ１０４Ｋ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｒ、Ｇ１０５Ａ、Ｇ１０５Ｈ、Ｇ１０５Ｓ、Ｇ１０５Ｔ、Ｅ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｈ、Ｋ１０６Ｎ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｓ、Ｐ１０８Ｒ、Ｉ１１０Ａ、Ｉ１１０Ｆ、Ｉ１１０Ｌ、Ｉ１１０Ｍ、Ｉ１１０Ｔ、Ｔ１１１Ｄ、Ｔ１１１Ｈ、Ｔ１１１Ｎ、Ｔ１１１Ｒ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｃ、Ｇ１１２Ｄ、Ｇ１１２Ｋ、Ｇ１１２Ｌ、Ｇ１１２Ｍ、Ｇ１１２Ｑ、Ｇ１１２Ｒ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｎ１２７Ｋ、Ｉ１３１Ｖ、Ａ１３２Ｖ、Ｌ１３３Ｖ、Ａ１３６Ｔ、Ｌ１３７Ｔ、Ｔ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｈ１４２Ｑ、Ｑ１４Ｒ、Ｙ１５６Ｈ、Ｋ１６３Ｔ、Ｄ１６８Ｅ、Ｈ１６９Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、Ｉ１８３Ｆ、Ｉ１８３Ｌ、Ｉ１８３Ｐ、Ｉ１８３Ｓ、Ｅ１８４Ａ、Ｅ１８４Ｄ、Ｅ１８４Ｒ、Ｅ１８４Ｔ、Ｅ１８４Ｖ、Ｅ１８５Ｔ、Ｍ１８７Ｌ、Ｍ１８９Ｉ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９１Ｇ、Ｋ１９１Ｈ、Ｋ１９１Ｍ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ１９１Ｒ、Ｋ１９１Ｓ、Ｋ１９１Ｔ、Ｋ１９１Ｗ、Ｅ１９７Ａ、Ｅ１９７Ｄ、Ｅ１９７Ｆ、Ｅ１９７Ｋ、Ｅ１９７Ｍ、Ｅ１９７Ｑ、Ｅ１９７Ｓ、Ｅ１９７Ｔ、Ｅ１９７Ｖ、Ｉ２０１Ｃ、Ｉ２０１Ｅ、Ｉ２０１Ｆ、Ｉ２０１Ｈ、Ｉ２０１Ｌ、Ｉ２０１Ｓ、Ｉ２０１Ｔ、Ｉ２０１Ｖ、Ｈ２０３Ｋ、Ｌ２１９Ｍ、Ｌ２１９Ｗ、Ｆ２２０Ｌ、Ｖ２２３Ｉ、Ｆ２２５Ｙ、Ｈ２３０Ｆ、Ｈ２３０Ｌ、Ｈ２３０Ｙ、Ｎ２３２Ｓ、Ｙ２４６Ｆ、Ｆ２４９Ｗ、Ｄ２５０Ｅ、Ｓ２７４Ａ、Ｓ２７４Ｃ、Ｓ２７４Ｇ、Ｓ２７４Ｎ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ２７８Ｍ、Ａ２８０Ｇ、Ａ２８０Ｓ、Ａ２８０Ｔ、Ｇ２８１Ｓ、Ａ２８２Ｍ、Ａ２８２Ｐ、Ｇ２８４Ｎ、Ｉ２８５Ｌ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｆ３０６Ｗ、Ｆ３０６Ｙ、Ｓ３１１Ｎ、Ｋ３１５Ｅ、Ｄ３１７Ｅ、Ｄ３１７Ｋ、Ｉ３３１Ｃ、Ｉ３３１Ｌ、Ｉ３３１Ｎ、Ｉ３３１Ｓ、Ｉ３３１Ｔ、Ｉ３３１Ｖ、Ｎ３３３Ｔ、Ｐ３３４Ｎ、Ｐ３３５Ｔ、Ｌ３３７Ｔ、Ｌ３３８Ａ、Ｌ３３８Ｑ、Ｓ３４１Ｉ、Ｋ３７３Ｅ、Ｋ３７３Ｎ、Ｎ３７５Ａ、Ｎ３７５Ｈ、Ｙ３７６Ｃ、Ｙ３７６Ｆ、Ｙ３７６Ｌ、Ｋ３７８Ｇ、Ｋ３７８Ｐ、Ｋ３７８Ｑ、Ｋ３７８Ｒ、Ｋ３８０Ｇ、Ｋ３８０Ｓ、Ａ３８２Ｇ、Ａ３８２Ｒ、Ａ３８２Ｔ、Ｔ３８３Ｓ、Ｋ３８４Ｇ、Ｋ３８４Ｎ、Ｐ３８６Ｋ、Ｐ３８６Ｓ、Ｖ３８７Ｌ、Ｎ３８９Ｅ、Ｉ４０５Ｌ、Ｆ４０７Ｙ、Ｓ４０８Ｄ、Ｓ４０８Ｎ、Ｎ４１１Ｒ、Ｄ４１３Ｓ、Ｄ４１３Ｖ、Ｑ４１６Ｔ、Ｅ４１９Ａ、Ｅ４１９Ｌ、Ｋ４２０Ｅ、Ｒ４２１Ｎ、Ｖ４２４Ｉ、Ｋ４２７Ｍ、Ｎ４２９Ｅ、Ｇ４３２Ａ及びＡ４３６Ｔからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、キヌレニナーゼは、表２に示されるキヌレニナーゼの１つと少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。いくつかの実施形態では、キヌレニナーゼは、表２に示されているもののうちの１つから選択される。
以下の表２は、本開示の組成物及び方法と共に使用され得る様々なキヌレニナーゼ酵素を示す。表２中に明示的には列挙されていないが、本明細書のタンパク質（１）は野生型ヒトキヌレニナーゼを指し、そのアミノ酸配列は配列番号１に示されている。
配列番号１－野生型ヒトキヌレニナーゼ：
ＭＥＰＳＳＬＥＬＰＡＤＴＶＱＲＩＡＡＥＬＫＣＨＰＴＤＥＲＶＡＬＨＬＤＥＥＤＫＬＲＨＦＲＥＣＦＹＩＰＫＩＱＤＬＰＰＶＤＬＳＬＶＮＫＤＥＮＡＩＹＦＬＧＮＳＬＧＬＱＰＫＭＶＫＴＹＬＥＥＥＬＤＫＷＡＫＩＡＡＹＧＨＥＶＧＫＲＰＷＩＴＧＤＥＳＩＶＧＬＭＫＤＩＶＧＡＮＥＫＥＩＡＬＭＮＡＬＴＶＮＬＨＬＬＭＬＳＦＦＫＰＴＰＫＲＹＫＩＬＬＥＡＫＡＦＰＳＤＨＹＡＩＥＳＱＬＱＬＨＧＬＮＩＥＥＳＭＲＭＩＫＰＲＥＧＥＥＴＬＲＩＥＤＩＬＥＶＩＥＫＥＧＤＳＩＡＶＩＬＦＳＧＶＨＦＹＴＧＱＨＦＮＩＰＡＩＴＫＡＧＱＡＫＧＣＹＶＧＦＤＬＡＨＡＶＧＮＶＥＬＹＬＨＤＷＧＶＤＦＡＣＷＣＳＹＫＹＬＮＡＧＡＧＧＩＡＧＡＦＩＨＥＫＨＡＨＴＩＫＰＡＬＶＧＷＦＧＨＥＬＳＴＲＦＫＭＤＮＫＬＱＬＩＰＧＶＣＧＦＲＩＳＮＰＰＩＬＬＶＣＳＬＨＡＳＬＥＩＦＫＱＡＴＭＫＡＬＲＫＫＳＶＬＬＴＧＹＬＥＹＬＩＫＨＮＹＧＫＤＫＡＡＴＫＫＰＶＶＮＩＩＴＰＳＨＶＥＥＲＧＣＱＬＴＩＴＦＳＶＰＮＫＤＶＦＱＥＬＥＫＲＧＶＶＣＤＫＲＮＰＮＧＩＲＶＡＰＶＰＬＹＮＳＦＨＤＶＹＫＦＴＮＬＬＴＳＩＬＤＳＡＥＴＫＮ
Figure 2022551976000002
Figure 2022551976000003
Figure 2022551976000004
Figure 2022551976000005
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Figure 2022551976000007
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Figure 2022551976000011
結合体
本開示の組成物及び方法は、例えば異種ペプチドセグメントまたはポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合体を形成することによる改変型キヌレニナーゼを含む。キヌレニナーゼは、酵素の流体力学的半径を増大させてそれによって血清における持続性を向上させるためにＰＥＧに連結される。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、任意の標的指向剤、例えば腫瘍細胞上の外部受容体または結合部位に特異的かつ安定的に結合する能力を有するリガンド（米国特許公開第２００９／０３０４６６６号）に結合体化され得る。
ＰＥＧ化
本開示のいくつかの実施形態では、キヌレニナーゼのＰＥＧ化に関する方法及び組成物が開示される。例えば、キヌレニナーゼは、本明細書に開示される方法に従ってＰＥＧ化される。
ＰＥＧ化は、ポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖を別の分子、通常であれば薬物または治療タンパク質に共有結合させるプロセスである。ＰＥＧ化は慣例的にはＰＥＧの反応性誘導体と標的巨大分子とのインキュベーションによって成し遂げられる。薬物または治療タンパク質に対するＰＥＧの共有結合は、薬剤を宿主の免疫系から隠すこと（免疫原性及び抗原性の低減）、または薬剤の流体力学的サイズ（溶液中でのサイズ）を大きくすることができ、これは腎クリアランスの軽減によってその循環時間を延ばす。ＰＥＧ化は、疎水性薬物及びタンパク質に水溶性を付与することもできる。ＰＥＧ化の第１工程は、ＰＥＧポリマーの片方または両方の末端における好適な官能化である。各末端が同じ反応性部分によって活性化されたＰＥＧが「ホモ二官能性」として知られる一方、存在する官能基が異なっている場合にはＰＥＧ誘導体は「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と呼称される。化学的に活性であるかまたは活性化されたＰＥＧポリマーの誘導体を調製して、ＰＥＧを所望の分子に結合させる。
ＰＥＧ誘導体に適する官能基の選択は、ＰＥＧに連結されることになる分子に付いている利用可能な反応性基の種類に基づいて行われる。タンパク質の場合、典型的な反応性アミノ酸としては、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン及びチロシンが挙げられる。Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボン酸を用いることもできる。第１世代ＰＥＧ誘導体を形成するために用いられる技術は一般に、ＰＥＧポリマーをヒドロキシル基との反応性を有する基、典型的には無水物、酸クロリド、クロロホルメート及びカーボネートと反応させることである。第２世代ＰＥＧ化化学では、より効率的な官能基、例えば、アルデヒド、エステル、アミドなどを結合体化のために利用できるようにする。
ＰＥＧ化の用途がますます進歩し洗練されるにつれて、結合体化のためのヘテロ二官能性ＰＥＧの必要性が高まってきた。これらのヘテロ二官能性ＰＥＧは、親水性の、柔軟な、及び生体適合性のスペーサーが必要とされる場合に、２つの実体を連結する上で非常に有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧの好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸及びＮＨＳエステルである。
最も一般的な改変剤またはリンカーは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分子に基づくものである。その活性は、アルコール末端に対するタンパク質改変基の付加によって決まる。場合によっては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧジオール）を前駆体分子として使用する。次いで、ヘテロまたはホモ二量体型ＰＥＧ連結分子を作るためにジオールの両末端を改変する。
タンパク質は通常、求核性部位、例えば非プロトン化チオール（システイニル残基）またはアミノ基においてＰＥＧ化される。システイニル特異的（つまりシスチン反応性）改変試薬の例としては、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヨードアセテート、ＰＥＧチオール及びＰＥＧビニルスルホンが挙げられる。４つとも全て、穏やかな条件及び中性～弱アルカリ性ｐＨの下でのシステイニル特異性が強い。
アミン特異的（つまりリジン反応性）改変剤には、ＰＥＧ ＮＨＳエステル、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧイソチオシアネート及び他のいくつかのものが含まれる。どれも穏やかな条件の下で反応し、アミノ基に対して非常に特異的である。ＰＥＧ ＮＨＳエステルは、より反応性が高い薬剤の１つとされるが、その高い反応性がＰＥＧ化反応の大きなスケールでの制御を難しくする可能性がある。ＰＥＧアルデヒドはアミノ基とイミンを形成し、次いでこれはシアノ水素化ホウ素ナトリウムによって第二級アミンに還元される。水素化ホウ素ナトリウムとは違ってシアノ水素化ホウ素ナトリウムはジスルフィド結合を還元することがない。しかしながら、この化学物質は毒性が高く、慎重な取り扱いが、とりわけそれが揮発性になる低めのｐＨにおいては、なされねばならない。
大部分のタンパク質には複数のリジン残基が付いているため、部位特異的なＰＥＧ化は難題となり得る。これらの試薬は非プロトン化アミノ基と反応するので、低めのｐＨで反応を実施することによってＰＥＧ化を低ｐＫアミノ基へと導くことが可能である。総じてアルファアミノ基のｐＫは、リジン残基のイプシロンアミノ基に比べて１～２ｐＨ単位だけ低い。分子をｐＨ７以下でＰＥＧ化することによって、Ｎ末端に対する高い選択性を頻繁に得ることができる。しかしながら、これが実現可能となるのは、タンパク質のＮ末端部分が生物活性のために必要とされない場合だけである。それでもなお、ＰＥＧ化による薬物動態の利点の方が試験管内での生物活性の大幅な低下よりもしばしば重要となり、結果としてＰＥＧ化化学にもかかわらず生体内生物活性がよりはるかに大きい生成物が得られる。
ＰＥＧ化手順を開発するときに考慮すべきいくつかのパラメータが存在する。チオール特異的なＰＥＧ化反応の場合、考慮すべきパラメータとしては、タンパク質濃度、（モル基準での）ＰＥＧ対タンパク質比率、温度、ｐＨ、反応時間、及び場合によっては酸素の排除（酸素はタンパク質による分子間ジスルフィド形成の原因になり得るが、これはＰＥＧ化生成物の収率を低下させることになる）が挙げられる。アミン特異的な改変では、（酸素は別として）同じ因子を考慮すべきであり、但し、ｐＨは、とりわけＮ末端アミノ基を標的とする場合において、よりいっそう肝要となり得る。
アミン特異的及びチオール特異的な改変の両方において、反応条件はタンパク質の安定性に影響を与え得る。これは、温度、タンパク質濃度及びｐＨを制限し得る。加えて、ＰＥＧ化反応を開始する前にＰＥＧリンカーの反応性を知っておかねばならない。例えば、ＰＥＧ化剤の活性が７０％しかない場合、使用されるＰＥＧの量は、活性なＰＥＧ分子だけがＰＥＧに対するタンパク質の反応の化学量論に算入されていることを保証するものでなければならない。
化学的結合体化のためのリンカー
キヌレニナーゼホモ二量体の反応性残基とＰＥＧ分子とを互いに共有結合で連結するために、例えば本明細書に記載の結合体を形成すべく、様々なリンカーが使用され得る。例示的なリンカーとしては、例えば酵素的加水分解、光分解、酸性条件下での加水分解、塩基性条件下での加水分解、酸化、ジスルフィド還元、求核的切断または有機金属による切断によって切断され得るものが挙げられる（例えば、Ｌｅｒｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０：５７１－５８２，２０１２を参照されたく、参照によりその開示内容を化学カップリングに適するリンカーに関して本明細書に援用する）。本明細書に記載の結合体の合成に有用となるリンカーの例としては、数ある中でも、抗体、抗原結合性断片、タンパク質、ペプチド及び低分子、例えばアミン及びチオール部分の中に存在している求核性置換基との反応に適した、求電子剤を含有するもの、例えば、マイケル受容体（例えばマレイミド）、活性エステル、電子不足性カルボニル化合物、及びアルデヒドが挙げられる。例えば、治療剤結合体の合成に適するリンカーとしては、アルキル、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルリンカー、例えば開放鎖型のエチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルもしくはデシル鎖、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、シクロブチル基、シクロプロピル基、ピペリジニル基、モルホリノ基、または２つの反応性部分（例えば、数ある中でも、キヌレニナーゼ中に存在する反応性求核性原子によって置き換えられ得るハロゲン原子、アルデヒド基、エステル基、アシルクロリド基、アシル無水物基、トシル基、メシル基またはブロシル基）を含有する他のもの、アリールもしくはヘテロアリールリンカー、例えば、キヌレニナーゼ中に存在する反応性求核性原子によって置き換えられ得る２つのハロメチル基を含有するベンジル、ナフチルもしくはピリジル基、が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なリンカーとしては、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－Ｌ－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、スルホ－ＳＭＣＣ、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＭＢＳ）、スルホ－ＭＢＳ、及びスクシンイミジルヨードアセテート、とりわけ例えばＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，１８：６９０－６９７，１９７９に記載されるものが挙げられ、参照によりその開示内容を化学的結合体化のためのリンカーに関して本明細書に援用する。さらなるリンカーとしては非切断可能マレイミドカプロイルリンカーが挙げられ、これはＤｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７：１４－２４，２００６に記載されており、参照によりその開示内容を化学的結合体化のためのリンカーに関して本明細書に援用する。
本明細書に記載されるように結合体の片方の成分をもう片方に結合させ得るさらなるリンカーとしては、リンカーの一方の末端において結合体の一方の成分（例えばキヌレニナーゼ）に共有結合し、リンカーの他方の末端にはリンカー上に存在する反応性置換基と結合体の他方の成分（例えば本明細書に記載のＰＥＧ分子）の中に存在する反応性置換基とのカップリング反応によって形成された化学部分を含有しているリンカーが挙げられる。結合体の成分の中に存在し得る例示的な反応性置換基としては、セリン、スレオニン及びチロシン残基のヒドロキシル部分；リジン残基のアミノ部分；アスパラギン酸及びグルタミン酸残基のカルボキシ部分；ならびにシステイン残基のチオール部分が挙げられるとともに、天然に存在しないアミノ酸のプロパルギル、アジド、ハロアリール（例えばフルオロアリール）、ハロヘテロアリール（例えばフルオロヘテロアリール）、ハロアルキル及びハロヘテロアルキル部分も挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の結合体と共に有用となるリンカーとしては、以下の表３に描かれる、カップリング反応によって形成された化学部分を含有するリンカーが挙げられるが、それらに限定されない。曲線は結合体の各成分との結合点を表す。
ＰＥＧ分子を酵素に結合体化させるために使用され得るリンカーとしては、リンカーの一方の末端において酵素に共有結合し、リンカーの他方の末端にはリンカー上に存在する反応性置換基と酵素の一部として存在しているアミノ酸残基の側鎖の１つの中に存在する反応性置換基とのカップリング反応によって形成された化学部分を含有しているものが挙げられる。キヌレニナーゼ酵素中に存在し得る反応性置換基としては、セリン、スレオニン及びチロシン残基のヒドロキシル部分；リジン残基のアミノ部分；アスパラギン酸及びグルタミン酸残基のカルボキシ部分；ならびにシステイン残基のチオール部分が挙げられるとともに、天然に存在しないアミノ酸のプロパルギル、アジド、ハロアリール（例えばフルオロアリール）、ハロヘテロアリール（例えばフルオロヘテロアリール）、ハロアルキル及びハロヘテロアルキル部分も挙げられるが、これらに限定されない。
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宿主細胞におけるキヌレニナーゼの組換え発現
本開示は、宿主細胞、例えば原核または真核プロデューサー細胞から組換えによってキヌレニナーゼタンパク質を発現させるための組成物及び方法を含む。宿主細胞におけるキヌレニナーゼタンパク質の発現をもたらすために用いられ得る例示的な方法は、以下の節の中でさらに詳しく記載される。
キヌレニナーゼをコードするポリヌクレオチド
哺乳動物細胞などの宿主細胞からキヌレニナーゼタンパク質を発現させるために用いられ得る１つのプラットフォームは、宿主細胞ゲノム中へのキヌレニナーゼをコードする１つ以上の遺伝子の安定的な組込み（例えば、哺乳動物細胞の核ゲノムの中への組込み）によるものである。これらの遺伝子は、対応するタンパク質の一次アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。そのような外来遺伝子を哺乳動物細胞内に導入するためにこれらの遺伝子はベクター内に組み込まれ得る。ベクターは、形質転換、トランスフェクション、直接取込み、粒子撃込みを含めた様々な方法によって、及びリポソームによるベクターのカプセル化によって、細胞内に導入され得る。細胞のトランスフェクションまたは形質転換を行う好適な方法の例は、リン酸カルシウム沈澱、電気穿孔、マイクロインジェクション、感染、リポフェクション及び直接取込みである。そのような方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１４））、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１５））の中でより詳しく記載されており、参照によりこれらの各々の開示内容を本明細書に援用する。
本開示の治療タンパク質をコードする遺伝子は、そのような薬剤をコードする遺伝子を含有するベクターを細胞膜リン脂質に指向することによっても哺乳動物細胞に導入され得る。例えば、あらゆる細胞膜リン脂質に対する親和性を有するウイルスタンパク質であるＶＳＶ－Ｇタンパク質にベクター分子を連結することによって、ベクターを細胞膜の細胞外表面上のリン脂質に指向することができる。そのような構築物は、当業者によく知られている方法を用いて製造され得る。
哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼによる、本開示の１つ以上の治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの認識及び結合は、遺伝子発現のために重要である。このため、ＲＮＡポリメラーゼを動員し転写開始部位での転写複合体の組立てを促進する転写因子に対する高い親和性を呈する配列エレメントをポリヌクレオチド内に含めることがある。そのような配列エレメントとしては、例えば、特定の転写開始因子及び最終的にはＲＮＡポリメラーゼによって配列の認識及び結合がなされ得る哺乳動物プロモーターが挙げられる。哺乳動物プロモーターの例は、オンライン公開のＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｓｙｓ．Ｂｉｏｌ．，３：７３に記載されており、参照によりその開示内容を本明細書に援用する。
１つ以上の治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドがひとたび哺乳動物細胞の核ＤＮＡ中に組み込まれたならば、このポリヌクレオチドの転写は、当技術分野で知られている方法によって誘発され得る。例えば、哺乳動物細胞を外部化学試薬、例えば、哺乳動物プロモーターに対する転写因子及び／またはＲＮＡポリメラーゼの結合を調節して結果として遺伝子発現を制御する薬剤に曝露することによって、発現が誘発され得る。化学試薬は、例えばプロモーターに結合したリプレッサータンパク質を除去することによって、哺乳動物プロモーターに対するＲＮＡポリメラーゼ及び／または転写因子の結合を容易にする役割を果たし得る。あるいは、化学試薬は、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写の速度が化学試薬の存在下では増加するように、ＲＮＡポリメラーゼ及び／または転写因子に対する哺乳動物プロモーターの親和性を強化する役割を果たし得る。上記機序によってポリヌクレオチド転写を強める化学試薬の例は、テトラサイクリン及びドキシサイクリンである。これらの試薬は市販されており（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、遺伝子発現を促進するために、確立されたプロトコールに従って哺乳動物細胞に投与され得る。
本明細書に記載の組成物及び方法に使用するためにポリヌクレオチドに含められ得る他のＤＮＡ配列エレメントはエンハンサー配列である。エンハンサーは、ＤＮＡが転写開始部位における転写因子及びＲＮＡポリメラーゼの結合に有利に働く三次元的配向を採るような、関心対象の遺伝子を含有するポリヌクレオチドにおける立体配座変化を誘発する、別の部類の調節エレメントに相当する。それゆえ、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するためのポリヌクレオチドには、１つ以上の治療タンパク質をコードし、さらには哺乳動物エンハンサー配列を含むものが含まれる。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られており、例としては、哺乳動物グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトタンパク質及びインスリンをコードする遺伝子からのエンハンサーが挙げられる。本明細書に記載の組成物及び方法に使用するためのエンハンサーには、真核細胞に感染することができるウイルスの遺伝物質から得られたものも含まれる。例としては、複製起点（ｂｐ１００～２７０）の後ろ側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側にあるポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物遺伝子転写の活性化を誘発するさらなるエンハンサー配列は、Ｙａｎｉｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７（１９８２）に開示されている。
融合タンパク質
本開示のいくつかの実施形態は、融合タンパク質に関する。これらの分子は、Ｎ－またはＣ－末端において異種ドメインに連結された、天然または改変型のキヌレニナーゼを有し得る。例えば、融合体には、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にするための他の種からのリーダー配列も使用され得る。別の有用な融合体は、タンパク質親和性タグ、例えば、血清アルブミン親和性タグもしくは６つのヒスチジン残基、または免疫活性ドメイン、例えば、融合タンパク質の精製を容易にするために切断可能であることが好ましい抗体エピトープの付加を含む。限定はされないが、親和性タグとしては、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
特定の実施形態では、キヌレニナーゼは、生体内での半減期を延ばすペプチド、例えば、ＸＴＥＮポリペプチド（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、アルブミン、またはアルブミン結合性ペプチドに連結され得る。
融合タンパク質を生成する方法は当業者によく知られている。そのようなタンパク質は、例えば、完全な融合タンパク質からのｄｅ ｎｏｖｏ合成によって、または異種ドメインをコードするＤＮＡ配列の結合とその後の完全融合タンパク質の発現によって製造され得る。親タンパク質の機能活性が回復した融合タンパク質の製造は、タンデムに連結されるポリペプチドの間に接合されるペプチドリンカーをコードする架橋ＤＮＡセグメントに遺伝子を連結することによって容易となり得る。リンカーは、得られる融合タンパク質の適切な折りたたみを可能にするのに十分な長さを有するものとされよう。
療法のための酵素的キヌレニン分解
いくつかの実施形態では、本開示のキヌレニナーゼは、キヌレニン除去に対する感受性を有するがんを含めた疾患を、キヌレニンを除去する酵素によって治療するために使用され得、その結果、腫瘍によって媒介される免疫寛容作用を阻害してその代わりに腫瘍除去的炎症促進応答を媒介する。いくつかの実施形態では、キヌレニナーゼは、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２及び／またはＴＤＯを発現している腫瘍の治療に使用するために企図される。
本開示のいくつかの実施形態は、疾患、例えば腫瘍を治療するための改変型キヌレニナーゼを提供する。詳しくは、改変型キヌレニナーゼは、ヒトポリペプチド配列を有し得、それゆえ、ヒト患者におけるアレルギー反応を防止し得、反復投薬を可能にし得、治療有効性を向上させ得る。
本発明の治療方法が有用となる腫瘍には、任意の悪性細胞種、例えば、固形腫瘍または造血器腫瘍にみられるものが含まれる。例示的な固形腫瘍には、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、咽頭、肉腫、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺及び乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍が含まれ得るが、これらに限定されない。例示的な造血器腫瘍としては、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、骨髄腫などが挙げられる。本明細書に提供される方法を用いて治療され得るがんのさらなる例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌腫を含む）、腹膜のがん、肝細胞癌、胃癌または胃部癌（消化管癌及び消化管間質癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸癌、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、様々なタイプの頭頸部癌、メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端黒子型メラノーマ、結節型メラノーマが挙げられるとともに、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽腫性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄芽球性白血病も挙げられるが、これらに限定されない。
がんは、限定はされないが具体的には以下の組織学的タイプのものであり得る：悪性新生物；癌腫；未分化癌腫；巨細胞及び紡錘細胞癌腫；小細胞癌腫；乳頭状癌腫；扁平上皮細胞癌腫；リンパ上皮癌腫；基底細胞癌腫；石灰化上皮腫；移行上皮癌腫；乳頭状移行上皮癌腫；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌腫；肝細胞癌腫；肝細胞癌腫と胆管癌腫との混合型；線維柱帯腺癌；腺様嚢胞癌腫；腺腫性ポリープにおける腺癌；家族性大腸ポリポーシス腺癌；固形癌腫；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌腫；好酸性癌腫；好酸性腺癌；好塩基性癌腫；明細胞腺癌；顆粒細胞癌腫；濾胞性腺癌；乳頭状及び濾胞性腺癌；非被嚢性硬化性癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜癌腫；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌腫；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌腫；浸潤性乳管癌腫；髄様癌腫；小葉癌腫；炎症性癌腫；乳房パジェット病；腺房細胞癌腫；腺扁平上皮癌腫；扁平上皮化生を伴った腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫；悪性アンドロブラストーマ；セルトリ細胞癌腫；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；クロム親和性細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑における悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ、悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑液肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎芽性癌腫；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管周皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽腫；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮歯牙肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星細胞腫；原形質性星細胞腫；線維性星細胞腫；星芽細胞腫；神経膠芽腫；希突起膠腫；希突起芽腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節芽腫；神経芽腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫瘍；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；傍肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性びまん性大細胞リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉腫；他の特定済みの非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；ならびに有毛細胞白血病。
本明細書においてキヌレニナーゼは、がんを有する哺乳動物の腫瘍組織もしくは循環系からキヌレニン及び／またはキヌレニン由来代謝産物を除去するための、またはキヌレニンの除去をその除去が望ましいとみなされる場合に行うための様々な様式で抗腫瘍剤として使用され得る。除去は、哺乳動物の循環系において生体内で行われてもよいし、組織培養物もしくは他の生物学的培地におけるキヌレニン及び／またはキヌレニン由来代謝産物の除去が望ましい場合に試験管内で行われてもよいし、生体液、細胞もしくは組織が体外で操作され、その後、患者哺乳動物の身体へ戻される場合に生体外での手順において行われてもよい。循環系、培養培地、生体液または細胞からのキヌレニンの除去は、処理しようとしている材料に到達できるキヌレニンの量を減らすために行われ、それゆえ、除去すべき材料とキヌレニン除去用量のキヌレニナーゼとの接触を、接触させようとしている材料において周囲のキヌレニンを分解するようなキヌレニン除去条件の下で行うことを含む。
除去の標的が必ずしも細胞自体である必要はなく、細胞のための栄養源であってもよい。したがって、生体内での用途において、腫瘍細胞を治療することは、腫瘍細胞の集団のための栄養媒体をキヌレニナーゼに接触させることを含む。この実施形態では、媒体は、血液、リンパ液、髄液、及びキヌレニン除去が望まれる類似する体液であり得る。
キヌレニン及び／またはキヌレニン由来代謝産物の除去効率は、用途によって実に様々であり得、典型的には、材料中に存在するキヌレニンの量、所望の除去速度、及びキヌレニナーゼへの曝露に対する材料の耐性によって決まる。材料のキヌレニン及びキヌレニン代謝産物レベル、したがって材料からのキヌレニン及びキヌレニン代謝産物除去の速度は、当技術分野でよく知られている様々な化学的及び生化学的方法によって容易に追跡評価され得る。例示的なキヌレニン除去用量は本明細書中にさらに記載されており、例えば、治療されようとしている対象、及び疾患の重症度に応じて例えば０．００１～１，０００単位（Ｕ）のキヌレニナーゼの範囲であり得る。
キヌレニン除去条件は、キヌレニナーゼの生物活性に適合する緩衝液及び温度条件であり、酵素に適合する穏やかな温度、塩及びｐＨ条件、例えば生理条件を含む。例示的な条件としては、生理条件を含めた約４～４０℃、約０．０５～０．２ＭのＮａＣｌと等価なイオン強度、及び約５～９のｐＨが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示は、抗腫瘍剤としてキヌレニナーゼを使用する方法を企図し、したがって、腫瘍細胞成長を阻害するのに十分な期間にわたって腫瘍細胞の集団を治療的有効量のキヌレニナーゼと接触させることを含む。
キヌレニナーゼの治療的有効量は、所望の効果を得るように、つまり、腫瘍組織または患者の循環系においてキヌレニンを除去してそれによって腫瘍除去的炎症促進応答を媒介するように算出された所定の量である。したがって、本開示のキヌレニナーゼの投与のための投薬量範囲は、腫瘍細胞分裂及び細胞循環の症候が減少する所望の効果をもたらすのに十分に大きいものとする。投薬量は、有害な副作用、例えば、過粘稠度症候群、肺水腫、鬱血性心不全、神経学的作用などを引き起こすほどに大きくするべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、症状、性別及び疾患の程度によって様々であろうし、当業者によって決定され得るものである。投薬量は、何らかの合併症があった場合に個別の医師によって調整され得る。
キヌレニナーゼは、注射によって、または経時的に緩徐な輸注によって非経口的に投与され得る。キヌレニナーゼは、静脈内に、腹腔内に、経口的に、筋肉内に、皮下に、腔内に、経皮的に、皮膚に投与され得るか、蠕動手段によって送達され得るか、腫瘍細胞を含有する組織の中に直接注入され得るか、またはキヌレニンのための電位バイオセンサを収容し得るカテーテルに連結されたポンプによって投与され得る。
キヌレニナーゼを含有する治療薬組成物は、慣例的には静脈内に、例えば単位用量の注射によって投与される。
組成物は、治療的有効量で、剤形に適合する方法で投与される。投与すべき量は、治療される対象、対象の身体が活性成分を利用する能力、及び所望の治療効果の度合いによって決まる。投与される必要がある活性成分の厳密な量は実施者の判断によって決まり、各個体に固有のものである。しかしながら、全身用途に適する投薬量範囲は本明細書に開示されており、投与経路によって決まる。初回投与及び追加投薬のための好適な投薬計画も企図され、典型的には、初回投与を行ってその後に１時間以上の間隔で投薬を後続注射または他の投与によって繰り返す。例示的な多回投与については本明細書に記載がなされており、キヌレニナーゼの血清中及び組織中レベルを継続的に高く維持し、キヌレニンの血清中及び組織中レベルを逆に低く維持するために特に好適である。あるいは、生体内での治療のために指定された範囲に血中濃度を維持するのに十分な連続的静脈内輸注が企図される。
タンパク質及びペプチド
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つのタンパク質またはペプチド、例えばキヌレニナーゼを含む新規組成物に関する。これらのペプチドは、融合タンパク質中に含められ得、または上述のように薬剤に結合体化され得る。
本明細書中で使用する場合、総じてタンパク質またはペプチドは、限定はされないが、遺伝子から翻訳される完全長配列を上限とする約２００アミノ酸超のタンパク質；約１００アミノ酸超のポリペプチド；及び／または約３～約１００アミノ酸のペプチドを指す。便宜のため、本明細書中では「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語を互換的に使用する。
本明細書中で使用する場合、「アミノ酸残基」は、任意の天然に存在するアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または当技術分野で知られている任意のアミノ酸模倣体を指す。いくつかの実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であり、アミノ酸残基の配列に割り込む非アミノ酸が何ら存在していない。いくつかの実施形態では、配列は１つ以上の非アミノ酸部分を含み得る。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基の配列に１つ以上の非アミノ酸部分が割り込んでいることがある。
したがって、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質においてみられる一般的な２０種のアミノ酸のうちの少なくとも１つ、または少なくとも１つの修飾もしくは異常アミノ酸を含むアミノ酸配列を包含する。
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、天然供給源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含めた、当業者に知られている任意の技術によって作られ得る。様々な遺伝子に対応するヌクレオチド、ならびにタンパク質、ポリペプチド及びペプチド配列は以前に開示されており、当業者に知られているコンピュータ化されたデータベースにおいて見つかり得る。１つのそのようなデータベースは、米国国立生物工学情報センターのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである（ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／において利用可能）。本明細書に開示されているかまたは当業者に知られているであろう技術を用いて、既知の遺伝子のコード領域を増幅する及び／または発現させることができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドの様々な商用調製品が当業者に知られている。
医薬組成物
新規キヌレニナーゼは、局所進行または転移がんを有するがん患者において腫瘍細胞成長を阻害するため及び最も好ましくはがん細胞を殺滅するために全身または局所投与され得ることが企図される。それは、静脈内に、クモ膜下腔内に、及び／または腹腔内に投与され得る。それは単独で、または抗増殖薬と組み合わせて投与され得る。一実施形態では、外科手術または他の処置の前に患者におけるがん腫瘍量を減少させるためにそれを投与する。あるいは、外科手術の後に、いかなる残存がん（例えば、外科手術で除去し損なったがん）も生存しないことを確実にするためにそれを投与する。
本開示を治療薬製剤の特定の性質によって限定することは意図しない。例えば、そのような組成物は、生理学的に忍容可能な液体、ゲルまたは固体の担体、希釈剤及び賦形剤と一緒に製剤として提供され得る。これらの治療薬製剤は、飼育動物などに関する獣医学用途のために、及びヒトにおける臨床用途のために、他の治療剤と同様の方法で哺乳動物に投与され得る。一般に、治療有効性のために必要とされる投薬量は、用途の種類及び投与様式、ならびに個々の対象の個別の必要条件によって様々であろう。
そのような組成物は、典型的には、液体溶液または懸濁液として、注射剤として調製される。好適な希釈剤及び賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、及びその組合せである。加えて、必要に応じて組成物は、少量の補助物質、例えば、湿潤もしくは乳化剤、安定化剤またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。
臨床用途が企図される場合、タンパク質、抗体及び薬物を含む医薬組成物を、意図した用途に適する形態で調製する必要があり得る。一般に、医薬組成物は、薬学的に許容される担体の中に溶解または分散した、有効量の１つ以上のキヌレニナーゼまたは付加的薬剤を含み得る。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、例えばヒトなどの動物に適切に投与されたときに、有害な、アレルギー性の、または他の不都合な反応を生じさせない、分子実体及び組成物を指す。本明細書に開示される方法によって単離された少なくとも１つのキヌレニナーゼ、または付加的な活性成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，１９９０によって例が示されているように、本開示に鑑みれば当業者には分かるであろう。さらに、動物（例えばヒト）への投与のためには調製剤が、ＦＤＡの生物製品基準局が要求している無菌状態、発熱原性、一般的安全性、及び純度の基準を満たさねばならないことが理解されよう。
当業者には分かるであろうが、本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、同じような類の材料、及びその組合せが含まれる（例えば、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，１９９０を参照されたい）。何らかの従来の担体に活性成分との適合性がない場合を除き、医薬組成物におけるその使用が企図される。
本開示のいくつかの実施形態は、固体、液体またはエアゾールのいずれの形態で投与されるのか、及び注射などの投与形態のために無菌である必要があるのかに応じて、異なる類の担体を含み得る。組成物は、静脈内に、皮内に、経皮的に、クモ膜下腔内に、動脈内に、腹腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、経粘膜的に、経口的に、表面に、局所に、吸入（例えばエアゾール吸入）によって、注射によって、輸注によって、連続輸注によって、標的細胞に直接注ぐ局部灌流によって、カテーテルによって、洗浄によって、脂質組成物（例えばリポソーム）中に入れて、または当業者に知られているであろう他の方法もしくは上記の任意の組合せによって投与され得る（例えば、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，１９９０を参照されたい）。
改変型ポリペプチドは、遊離塩基、中性または塩の形態で組成物に製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基によって形成されるもの、あるいは、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸などの有機酸によって形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基によって形成される塩を、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインなどの有機塩基から得ることもできる。製剤化後、液剤は、投与製剤に適合する方法で、治療的に有効となるような量で投与される。製剤は様々な剤形で簡単に投与され、例えば、注射液剤または肺への送達のためのエアゾール剤のように非経口投与のために製剤化され、または薬物放出性カプセルなどのように消化による投与のために製剤化される。
さらには、本開示のいくつかの実施形態によれば、投与に適する組成物は、不活性希釈剤を伴うかまたは伴わずに、薬学的に許容される担体中で提供され得る。担体は同化可能なものでなければならず、液体、半固体すなわちペースト、または固体の単体を含む。何らかの従来の媒体、薬剤、希釈剤または担体がレシピエントに対して、またはその中に含有する組成物の治療有効性に対して悪影響をもたらす場合を除き、方法の実施に使用するための投与可能組成物におけるその使用は適切である。担体または希釈剤の例としては、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、フィラーなど、またはその組合せが挙げられる。組成物は、１つ以上の成分の酸化を遅らせるための様々な酸化防止剤も含み得る。加えて、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはその組合せを含むがこれらに限定されない様々な抗菌及び抗真菌剤などの保存剤によって微生物の活動の抑制をもたらすことができる。
本開示のいくつかの実施形態によれば、組成物は、任意の簡便及び実用的な方法で、つまり、溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル化、吸収などによって、担体と結合する。そのような手順は当業者にとっては一般的である。
本開示の具体的な実施形態では、組成物は半固体または固体担体と結合または完全に混合される。混合は、任意の簡便な方法、例えば粉砕することで行われ得る。混合プロセスでは、治療活性の低下、すなわち胃内での変性から組成物を保護するために安定化剤も加えられ得る。組成物に使用するための安定化剤の例としては、緩衝剤、アミノ酸、例えばグリシン及びリジン、炭水化物、例えばデキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどが挙げられる。
さらなる実施形態では、本開示は、キヌレニナーゼ、１つ以上の脂質、及び水性溶媒を含む、医薬脂質ビヒクル組成物の使用に関し得る。本明細書中で使用する場合、「脂質」という用語は、水に不溶であり有機溶媒で抽出できることを特徴とする広範な物質のいずれかを含むものと定義されよう。この広い部類の化合物は当業者によく知られており、「脂質」という用語が本明細書中で使用される場合、それはいかなる特定の構造にも限定されない。例としては、長鎖脂肪族炭化水素を含有する化合物及びその誘導体が挙げられる。脂質は、天然に存在するもの、または合成のもの（すなわち人間によって設計または製造されたもの）であり得る。しかしながら、脂質は通常は生物学的物質である。生物学的脂質は当技術分野でよく知られており、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテルに及びエステルに結合した脂肪酸を有する脂質、重合性脂質、ならびにその組合せが挙げられる。当然、本明細書に具体的に記載されているもの以外の、当業者によって脂質として理解される化合物も、組成物及び方法に包含される。
当業者であれば、組成物を脂質ビヒクル中に分散させるために採用され得る様々な技術に精通しているであろう。例えば、当業者に知られている任意の手段によってキヌレニナーゼまたはその融合タンパク質を、脂質を含有する溶液に分散させてもよいし、脂質に溶解させてもよいし、脂質で乳化させてもよいし、脂質と混合してもよいし、脂質と結合してもよいし、脂質に共有結合させてもよいし、懸濁物として脂質中に含有させてもよいし、ミセルまたはリポソームで内包または複合体化してもよいし、あるいは脂質または脂質構造体と会合させてもよい。分散は、リポソームの形成をもたらすものであってもなくてもよい。
動物患者に投与される組成物の実際の投薬量は、物理学的及び生理学的因子、例えば、体重、症状の重症度、治療しようとしている疾患の種類、以前のまたは同時進行の治療的介入、患者の突発性疾患、及び投与経路によって決定され得る。投薬量及び投与経路に応じて、好ましい投薬量及び／または有効量の投与の回数は、対象の応答によって変更され得る。いずれにせよ、投与を担当する実施者が、組成物中の活性成分（複数可）の濃度、及び個体対象に適する用量（複数可）を決定する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、活性化合物は、例えば、単位の重量の約２％～約７５％、または約２５％～約６０％、及びその中で導き出せる任意の範囲を構成し得る。当然ながら、治療的に有用な各組成物の中の活性化合物（複数可）の量は、化合物の任意の所与の単位用量で好適な投薬量が得られるような方法で用意され得る。因子、例えば、溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命、及び他の薬理学的考慮事項が、そのような医薬製剤を調製する分野の当業者によって企図されることになり、かくして、様々な投薬量及び治療計画が望ましいものとなり得る。
他の非限定的な例では、用量はまた、１投与あたり約１マイクログラム／ｋｇ／体重から、約５マイクログラム／ｋｇ／体重から、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重から、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重から、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重から、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重から、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重から、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重から、約１ミリグラム／ｋｇ／体重から、約５ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重から、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重から、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重以上まで、またはその中で導き出せる任意の範囲を含み得る。本明細書中に列挙される数から導き出せる範囲の非限定的な例では、上記数に基づいて約５ミリグラム／ｋｇ／体重～約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重～約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などが投与され得る。
併用治療
いくつかの実施形態では、本実施形態の組成物及び方法は、第２のまたは付加的な療法と組み合わせたキヌレニナーゼの投与を伴う。そのような療法は、キヌレニン依存性に関連する任意の疾患の治療において適用され得る。例えば、疾患はがんであり得る。
方法及び組成物は、併用療法を含めて、治療的もしくは保護的効果を増強する、及び／または別の抗がんまたは抗過剰増殖療法の治療効果を増大させる。治療的及び予防的方法及び組成物は、所望の効果、例えばがん細胞の殺滅及び／または細胞過剰増殖の阻害をもたらすのに効果的な、組み合わされた量で提供され得る。このプロセスは、キヌレニナーゼ及び第２療法を施与することを伴い得る。第２療法は、直接的な細胞傷害作用を有していてもいなくてもよい。例えば、第２療法は、直接的な細胞傷害作用を有さずに免疫系を上方制御する薬剤であり得る。薬剤（例えばキヌレニナーゼまたは抗がん剤）の１つ以上を含む１つ以上の組成物もしくは薬理製剤（複数可）に組織、腫瘍もしくは細胞を曝露してもよいし、または１つの組成物を１）キヌレニナーゼ、２）抗がん剤、もしくは３）キヌレニナーゼと抗がん剤との両方を提供するものとした２つ以上の別個な組成物もしくは製剤に組織、腫瘍及び／または細胞を曝露することによるものであってもよい。また、そのような併用療法が化学療法、放射線療法、外科的療法または免疫療法と一緒に用いられ得ることも企図される。
キヌレニナーゼは、抗がん治療の前に、間に、後に、または様々な組合せで投与され得る。投与は、同時進行から数分、数日、数週までにわたる間隔で行われ得る。キヌレニナーゼが抗がん剤とは別個に患者に提供される実施形態では、２つの化合物が有益に組み合わさった効果を依然として患者に対して働かせることができるように、各送達の時間の狭間に経過する期間があまり長くならないことを確保するのが通常であろう。そのような場合、キヌレニナーゼ及び抗がん療法が互いの約１２～２４または７２時間以内、より詳しくは互いの約６～１２時間以内に患者に提供され得ることが企図される。いくつかの状況においては、それぞれの投与の間に数日（２、３、４、５、６または７）～数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）を経過させて治療のための期間を大幅に延ばすことが望ましい場合がある。
いくつかの実施形態では、治療のクールは１～９０日間以上続くことになる（このそのような範囲は介入日を含む）。１日目～９０日目（このそのような範囲は介入日を含む）のうちの任意の日またはその任意の組合せの日に１つの薬剤が与えられ得、１日目～９０日目（このそのような範囲は介入日を含む）のうちの任意の日またはその任意の組合せの日に別の薬剤が与えられ得ることが企図される。単一の日（２４時間の期間）のうちに患者に薬剤（複数可）の１回または複数回の投与が与えられ得る。さらには、治療のクールの後に、抗がん治療が施行されない期間が存在することが企図される。この期間は、患者の状態、例えば予後、体力、健康状態などに応じて１～７日間及び／または１～５週間及び／または１～１２ヶ月以上（このそのような範囲は介入日を含む）続き得る。必要に応じて治療サイクルが繰り返されるであろうことが予想される。
様々な組合せが採用され得る。下記例においてキヌレニナーゼは「Ａ」であり抗がん療法は「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ
Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
患者に対する本発明の実施形態の任意の化合物または療法の施与は、薬剤の毒性があるならばそれを考慮しつつ、そのような化合物の投与のための一般的なプロトコールに従って行われることになる。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因する毒性を追跡評価するステップが存在する。
以下の実施例は、本明細書に記載の組成物及び方法がどのように用いられ得るか、作られ得るか及び評価され得るかについての説明を当業者に提供するために提示されており、単に本開示の例示として意図したものであり、本発明者らが当人らの開示とみなす範囲を限定する意図はない。
実施例１．ＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体の生成
本明細書に記載の組成物及び方法に使用するためのＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体を生成する例示的な方法は、化学的結合体化によるものである。キヌレニナーゼは、１００ｍＭのリン酸二ナトリウムを含むｐＨ８．５の水性緩衝液に溶かされ得るが、これに、５ｋＤａの分子量を有するメトキシ－ＰＥＧ－ＣＨ２ＣＯＯ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などの固体ＰＥＧ化剤がＰＥＧ分子とキヌレニナーゼホモ二量体との例えば２０：１、３０：１、４０：１、５０：１または６０：１の投入量比で添加され得る。この反応混合物は約３０分間、約２２℃に置かれ得る。
ＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体を生成するためのさらなる例示的な方法は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、２３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのリン酸ピリドキサールを含み０．６Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）を使用してｐＨが８．６に調整された水性緩衝液の中のキヌレニナーゼホモ二量体を用い得る。ＰＥＧ化剤、例えば５ｋＤａの分子量を有するメトキシ－ＰＥＧ－ＣＨ２ＣＯＯ－ＮＨＳは、ＨＣｌ１ミリリットルあたり約０．２ｇのＰＥＧの終濃度となるように３ｍＭのＨＣｌに溶かされ得る。このＰＥＧ溶液は、反応混合物においてＰＥＧとキヌレニナーゼホモ二量体との３０：１の最終比が実現されるような制御された方法でキヌレニナーゼ溶液に添加され得る。反応は約２２℃で３０分間行われ得る。
その後、ＰＥＧ化ホモ二量体は、多角度光散乱と共にサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＮａＨ２ＰＯ４が２５ｍＭでありＮａＣｌが１５０ｍＭである緩衝液を０．６ｍＬ／分の流速で２５分間にわたって２５℃で流すＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷｘｌカラムを使用して分析され得、その結果、各個々のＰＥＧ：キヌレニナーゼ投入量比についてクロマトグラムが得られる（図１Ｄ～１Ｆ）。
得られたキヌレニナーゼ単量体及びホモ二量体１つあたりのＰＥＧ分子の数を、ＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体の様々な投入量比において測定されたＰＥＧ化キヌレニナーゼの分子量から算出するとともに（図１Ａ～１Ｂ）、ＰＥＧ：キヌレニナーゼホモ二量体の各投入量比でのＰＥＧ化反応の効率（図１Ｃ）を求めた。
実施例２．悪性腫瘍患者へのＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体の投与
本明細書に開示される方法に従って、当技術分野の医師は、患者、例えばヒト患者を、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２またはＴＤＯ発現腫瘍の症候を軽減または緩和するように治療し得る。この目標のために、当技術分野の医師は、ヒト患者にＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体を投与し得る。ホモ二量体は患者に例えば全身的に（例えば静脈内に）、標的細胞に直接注ぐ局所灌流によって、カテーテルによって、洗浄によって、脂質組成物（例えばリポソーム）中に入れて、または腫瘍を治療する分野の当業者に知られているであろう他の方法もしくは上記の任意の組合せによって投与され得る。ホモ二量体は、患者に複数の投与経路によって、例えば静脈内と脳室内とに投与されてもよい。例示的なキヌレニン除去用量は、０．００１～１，０００単位（Ｕ）の範囲のキヌレニナーゼであり得る。
患者の腫瘍細胞を除去するために、ＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体と組み合わせて１つ以上の抗がん療法（例えば、放射線療法、外科的療法、免疫療法）を患者に施行してもよい。患者の腫瘍細胞を除去するために、当技術分野でよく知られている細胞除去の方法、例えば放射線照射が単独で、または１つ以上の抗がんもしくは抗過剰増殖療法と組み合わせて用いられ得る。これらの薬剤及び／または治療は、当技術分野で知られているＰＥＴ画像化技術で評価した場合、腫瘍細胞を少なくとも５％（例えば少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％またはそれよりも多く）除去し得る。ホモ二量体は、第２のまたはそれ以上の抗がん療法による治療の例えば１２時間～１ヶ月（例えば、１２時間、２４時間、７２時間、１週間、２週間、３週間、４週間）またはそれ以上前または後に患者に投与され得る。
ホモ二量体は、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２またはＴＤＯ２を発現する腫瘍を治療するのに十分な量で患者に投与され得る。腫瘍サイズの変化を評価するために、治療の前及び後に医師によって標準的な検査も実施され得る。患者は、治療に用いられる投与経路に応じてホモ二量体の投与の例えば１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月後またはそれ以上後に評価され得る。ＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体の投与の後に腫瘍の部位において腫瘍サイズが減少または局所キヌレニナーゼ濃度が低下していれば、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２またはＴＤＯ２を発現する腫瘍の治療において治療は成功を収めたことを示している。
実施例３．生体内送達のためのキヌレニナーゼホモ二量体ＰＥＧ化密度の最適化
この実施例では、α－［３－（３－マレイミド－１－オキソプロピル）アミノ］プロピル－ω－メトキシＰＥＧ試薬（ＣＡＳ＃８８３９９３－３５－９）を使用して、配列番号２のアミノ酸配列を有する精製されたキヌレニナーゼをｐＨ８．５で３０分間にわたって室温で５，０００ダルトンのＰＥＧに結合体化させた。結合体化反応は、キヌレニナーゼ濃度を５．５～８ｍｇ／ｍｌとし、様々なモル当量の５ｋＤａ ＰＥＧ試薬（ＰＥＧ化剤とキヌレニナーゼホモ二量体とが１００：１、８０：１、４０：１、２０：１及び１０：１）を直接添加して実施した。結合体化の後、最終生成物をｐＨ７．４の１×のリン酸緩衝生理食塩水で３０ｋＤａの分子量カットオフのスピンフィルターによって透析濾過して全ての残存遊離ＰＥＧを除去した。試料を無勾配のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法によってＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００カラムを使用して分析した（図２Ａ）。
ＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体を試験するために、各雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）の右腹側に、ＣＴ－２６腫瘍細胞（１×１０５）を含んだ０．１ｍｌのＰＢＳを腫瘍発現のために皮下接種した。動物を無作為化し、ビヒクル（ＰＢＳ ｐＨ７．４）を静脈内投与したか、または差次的にｐｅｇ化された配列番号２のアミノ酸配列を有するキヌレニナーゼ１０ｍｇ／ｋｇを平均腫瘍体積がおよそ２００ｍｍ３に達した時に開始した。投与から６、２４、４８、７２及び１２０時間後にマウスの全採血を行い（ｎ＝４マウス／時間点）、すぐさま血漿試料を内部標準（ＩＳ）溶液を含有する酸でクエンチし、キヌレニンのＬＣ／ＭＳ分析（図２Ｂ）のための処理を行った。腫瘍試料を全ての群から採取し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解させ、２０μｇの腫瘍溶解物を抗ＰＥＧ抗体（Ａｂｃａｍ ＃ａｂＳ １２５７；１：２０００希釈）及び抗β－アクチン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃ＣＳＴ－４９６７）によるウェスタンブロット分析のためのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに装填した。化学発光信号を検出し、個々のバンドの強度を、Ａｌｐｈａｖｉｅｗ ＳＡ密度測定ソフトウェアを使用して定量した（図２Ｃ）。
他の実施形態
本開示の範囲及び趣旨から逸脱せずに、記載されている本開示の様々な改変形態及び変形形態が当業者にとって明らかであろう。本開示を特定の実施形態に関して記載してきたが、特許請求される本開示がそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際、本開示を実施するための、当業者にとって明らかである記載される形態の様々な改変形態は、本開示の範囲内に入ることが意図される。
他の実施形態は特許請求の範囲の中に含まれている。

Claims (104)

  1. １つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共有結合したキヌレニナーゼホモ二量体であって、ＰＥＧ分子とホモ二量体との比が約１０：１～約４０：１である、前記ホモ二量体。
  2. ＰＥＧ分子とホモ二量体との比が約２０：１～約３０：１であり、場合によってはＰＥＧ分子とホモ二量体との比が約２０：１、２１：２、２２：１、２３：１、２４：１または２５：１である、請求項１に記載のホモ二量体。
  3. ＰＥＧ分子とホモ二量体との比が約２５：１である、請求項１に記載のホモ二量体。
  4. 前記ＰＥＧ分子が約１ｋＤａ～約１０ｋＤａの分子量を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  5. 前記ＰＥＧ分子が約３ｋＤａ～約７ｋＤａの分子量を有する、請求項４に記載のホモ二量体。
  6. 前記ＰＥＧ分子が約５ｋＤａの分子量を有する、請求項５に記載のホモ二量体。
  7. 前記ＰＥＧ分子が直鎖型である、請求項１～６のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  8. 前記ＰＥＧ分子が分岐型である、請求項１～６のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  9. 前記ホモ二量体が１つ以上のリジンまたはシステイン残基によって前記ＰＥＧ分子に共有結合している、請求項１～８のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  10. 前記ホモ二量体が１つ以上のリジン残基によって前記ＰＥＧ分子に共有結合している、請求項９に記載のホモ二量体。
  11. 前記ホモ二量体が、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を各々が有している２つのポリペプチド単量体を含み、各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較して、
    Ｌ８Ｐ、Ｋ３８Ｅ、Ｙ４７Ｌ、Ｉ４８Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ｉ５１Ｍ、Ｓ６０Ｎ、Ｋ６４Ｎ、Ｄ６５Ｇ、Ｅ６６Ｋ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｐ、Ｄ６７Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｔ、Ａ６８Ｖ、Ｆ７１Ｌ、Ｆ７１Ｍ、Ｌ７２Ｎ、Ｋ８４Ｅ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｓ、Ｅ９０Ｑ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｔ、Ａ９５Ｈ、Ａ９５Ｑ、Ｋ９６Ｎ、Ｉ９７Ｈ、Ｉ９７Ｌ、Ｉ９７Ｖ、Ａ９８Ｇ、Ａ９９Ｇ、Ａ９９Ｉ、Ａ９９Ｒ、Ａ９９Ｓ、Ａ９９Ｔ、Ａ９９Ｖ、Ｙ１００Ｎ、Ｙ１００Ｓ、Ｙ１００Ｔ、Ｇ１０１Ａ、Ｈ１０２Ｗ、Ｅ１０３Ｆ、Ｅ１０３Ｈ、Ｅ１０３Ｎ、Ｅ１０３Ｑ、Ｅ１０３Ｒ、Ｅ１０３Ｖ、Ｅ１０３Ｗ、Ｖ１０４Ｄ、Ｖ１０４Ｅ、Ｖ１０４Ｆ、Ｖ１０４Ｈ、Ｖ１０４Ｋ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｒ、Ｇ１０５Ａ、Ｇ１０５Ｈ、Ｇ１０５Ｓ、Ｇ１０５Ｔ、Ｅ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｈ、Ｋ１０６Ｎ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｓ、Ｐ１０８Ｒ、Ｉ１１０Ａ、Ｉ１１０Ｆ、Ｉ１１０Ｌ、Ｉ１１０Ｍ、Ｉ１１０Ｔ、Ｔ１１１Ｄ、Ｔ１１１Ｈ、Ｔ１１１Ｎ、Ｔ１１１Ｒ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｃ、Ｇ１１２Ｄ、Ｇ１１２Ｋ、Ｇ１１２Ｌ、Ｇ１１２Ｍ、Ｇ１１２Ｑ、Ｇ１１２Ｒ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｎ１２７Ｋ、Ｉ１３１Ｖ、Ａ１３２Ｖ、Ｌ１３３Ｖ、Ａ１３６Ｔ、Ｌ１３７Ｔ、Ｔ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｈ１４２Ｑ、Ｑ１４Ｒ、Ｙ１５６Ｈ、Ｋ１６３Ｔ、Ｄ１６８Ｅ、Ｈ１６９Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、Ｉ１８３Ｆ、Ｉ１８３Ｌ、Ｉ１８３Ｐ、Ｉ１８３Ｓ、Ｅ１８４Ａ、Ｅ１８４Ｄ、Ｅ１８４Ｒ、Ｅ１８４Ｔ、Ｅ１８４Ｖ、Ｅ１８５Ｔ、Ｍ１８７Ｌ、Ｍ１８９Ｉ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９１Ｇ、Ｋ１９１Ｈ、Ｋ１９１Ｍ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ１９１Ｒ、Ｋ１９１Ｓ、Ｋ１９１Ｔ、Ｋ１９１Ｗ、Ｅ１９７Ａ、Ｅ１９７Ｄ、Ｅ１９７Ｆ、Ｅ１９７Ｋ、Ｅ１９７Ｍ、Ｅ１９７Ｑ、Ｅ１９７Ｓ、Ｅ１９７Ｔ、Ｅ１９７Ｖ、Ｉ２０１Ｃ、Ｉ２０１Ｅ、Ｉ２０１Ｆ、１２０１Ｈ、Ｉ２０１Ｌ、Ｉ２０１Ｓ、Ｉ２０１Ｔ、Ｉ２０１Ｖ、Ｈ２０３Ｋ、Ｌ２１９Ｍ、Ｌ２１９Ｗ、Ｆ２２０Ｌ、Ｖ２２３Ｉ、Ｆ２２５Ｙ、Ｈ２３０Ｆ、Ｈ２３０Ｌ、Ｈ２３０Ｙ、Ｎ２３２Ｓ、Ｙ２４６Ｆ、Ｆ２４９Ｗ、Ｄ２５０Ｅ、Ｓ２７４Ａ、Ｓ２７４Ｃ、Ｓ２７４Ｇ、Ｓ２７４Ｎ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ２７８Ｍ、Ａ２８０Ｇ、Ａ２８０Ｓ、Ａ２８０Ｔ、Ｇ２８１Ｓ、Ａ２８２Ｍ、Ａ２８２Ｐ、Ｇ２８４Ｎ、Ｉ２８５Ｌ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｆ３０６Ｗ、Ｆ３０６Ｙ、Ｓ３１１Ｎ、Ｋ３１５Ｅ、Ｄ３１７Ｅ、Ｄ３１７Ｋ、Ｉ３３１Ｃ、Ｉ３３１Ｌ、Ｉ３３１Ｎ、Ｉ３３１Ｓ、Ｉ３３１Ｔ、Ｉ３３１Ｖ、Ｎ３３３Ｔ、Ｐ３３４Ｎ、Ｐ３３５Ｔ、Ｌ３３７Ｔ、Ｌ３３８Ａ、Ｌ３３８Ｑ、Ｓ３４１Ｉ、Ｋ３７３Ｅ、Ｋ３７３Ｎ、Ｎ３７５Ａ、Ｎ３７５Ｈ、Ｙ３７６Ｃ、Ｙ３７６Ｆ、Ｙ３７６Ｌ、Ｋ３７８Ｇ、Ｋ３７８Ｐ、Ｋ３７８Ｑ、Ｋ３７８Ｒ、Ｋ３８０Ｇ、Ｋ３８０Ｓ、Ａ３８２Ｇ、Ａ３８２Ｒ、Ａ３８２Ｔ、Ｔ３８３Ｓ、Ｋ３８４Ｇ、Ｋ３８４Ｎ、Ｐ３８６Ｋ、Ｐ３８６Ｓ、Ｖ３８７Ｌ、Ｎ３８９Ｅ、Ｉ４０５Ｌ、Ｆ４０７Ｙ、Ｓ４０８Ｄ、Ｓ４０８Ｎ、Ｎ４１１Ｒ、Ｄ４１３Ｓ、Ｄ４１３Ｖ、Ｑ４１６Ｔ、Ｅ４１９Ａ、Ｅ４１９Ｌ、Ｋ４２０Ｅ、Ｒ４２１Ｎ、Ｖ４２４Ｉ、Ｋ４２７Ｍ、Ｎ４２９Ｅ、Ｇ４３２Ａ及びＡ４３６Ｔ
    からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  12. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のホモ二量体。
  13. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載のホモ二量体。
  14. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較してＡ２８２、Ｆ３０６またはＦ２４９に置換を含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  15. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較してＡ９９に置換を含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  16. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較してＧ１１２に置換を含む、請求項１１～１５のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  17. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較してＥ１０３に置換を含む、請求項１１～１６のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  18. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較してＶ１０４に置換を含む、請求項１１～１７のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  19. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較してＳ４０８に置換を含む、請求項１１～１８のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  20. 各ポリペプチド単量体が前記Ｆ３０６Ｗ置換を含む、請求項１１～１９のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  21. 各ポリペプチド単量体が前記Ｌ７２Ｎ置換を含む、請求項１１～２０のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  22. 各ポリペプチド単量体が前記Ｈ１０２Ｗ及びＮ３３３Ｔ置換を含む、請求項１１～２１のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  23. 各ポリペプチド単量体が前記Ｉ１８３Ｐ置換を含む、請求項１１～２２のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  24. 各ポリペプチド単量体が前記Ｒ１０７Ｐ置換を含む、請求項１１～２３のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  25. 各ポリペプチド単量体が前記Ａ４３６Ｔ置換を含む、請求項１１～２４のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  26. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較して、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項１１～２５のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  27. 各ポリペプチド単量体が、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つの置換を含む、請求項２６に記載のホモ二量体。
  28. 各ポリペプチド単量体が前記置換Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔを含む、請求項２７に記載のホモ二量体。
  29. 前記ホモ二量体が、配列番号３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を各々が有している２つのポリペプチド単量体を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  30. 各ポリペプチド単量体が、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載のホモ二量体。
  31. 各ポリペプチド単量体が、配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３０に記載のホモ二量体。
  32. 各ポリペプチド単量体が配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項３１に記載のホモ二量体。
  33. 前記ホモ二量体が、配列番号２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を各々が有している２つのポリペプチド単量体を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  34. 各ポリペプチド単量体が、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３３に記載のホモ二量体。
  35. 各ポリペプチド単量体が、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載のホモ二量体。
  36. 各ポリペプチド単量体が配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載のホモ二量体。
  37. 前記ホモ二量体が少なくとも８０００Ｍ－１ｓ－１の触媒活性（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有する、請求項１～３６のいずれかに記載のホモ二量体。
  38. 前記ホモ二量体が、約８０００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；１００００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；２００００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；または２５０００Ｍ－１ｓ－１～３５０００Ｍ－１ｓ－１の触媒活性（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有する、請求項３７に記載のホモ二量体。
  39. ＰＥＧ分子とホモ二量体との比が約２５：１であり、
    前記ＰＥＧ分子が、約５ｋＤａの分子量を有し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルカーボネート連結基によって前記ホモ二量体に結合している、請求項１～３８のいずれか１項に記載のホモ二量体。
  40. ＰＥＧ化キヌレニナーゼホモ二量体を製造する方法であって、
    前記ホモ二量体が２つのポリペプチド単量体を含み、
    前記方法が、前記ホモ二量体をＰＥＧ化剤に接触させることを含み、
    ＰＥＧ化剤とホモ二量体とのモル投入量比が約１０：１～約５０：１である、
    前記方法。
  41. ＰＥＧ化剤とホモ二量体とのモル投入量比が約２０：１～約４０：１であり、場合によってはＰＥＧ化剤とホモ二量体とのモル投入量比が約２０：１～約３０：１であり、場合によってはＰＥＧ化剤とホモ二量体とのモル投入量比が約２０：１である、請求項４０に記載の方法。
  42. ＰＥＧ化剤とホモ二量体とのモル投入量比が約２５：１～約３５：１である、請求項４０に記載の方法。
  43. ＰＥＧ化剤とホモ二量体とのモル投入量比が約３０：１である、請求項４０に記載の方法。
  44. 前記ＰＥＧ分子が約１ｋＤａ～約１０ｋＤａの分子量を有する、請求項４０～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記ＰＥＧ分子が約３ｋＤａ～約７ｋＤａの分子量を有する、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ＰＥＧ分子が約５ｋＤａの分子量を有する、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ＰＥＧ分子が直鎖型である、請求項４０～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記ＰＥＧ分子が分岐型である、請求項４０～４６のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記ホモ二量体が１つ以上のリジンまたはシステイン残基によって前記ＰＥＧ分子に共有結合している、請求項４０～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記ホモ二量体が１つ以上のリジン残基によって前記ＰＥＧ分子に共有結合している、請求項４９に記載の方法。
  51. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有し、各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較して、
    Ｌ８Ｐ、Ｋ３８Ｅ、Ｙ４７Ｌ、Ｉ４８Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ｉ５１Ｍ、Ｓ６０Ｎ、Ｋ６４Ｎ、Ｄ６５Ｇ、Ｅ６６Ｋ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｐ、Ｄ６７Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｔ、Ａ６８Ｖ、Ｆ７１Ｌ、Ｆ７１Ｍ、Ｌ７２Ｎ、Ｋ８４Ｅ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｓ、Ｅ９０Ｑ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｔ、Ａ９５Ｈ、Ａ９５Ｑ、Ｋ９６Ｎ、Ｉ９７Ｈ、Ｉ９７Ｌ、Ｉ９７Ｖ、Ａ９８Ｇ、Ａ９９Ｇ、Ａ９９Ｉ、Ａ９９Ｒ、Ａ９９Ｓ、Ａ９９Ｔ、Ａ９９Ｖ、Ｙ１００Ｎ、Ｙ１００Ｓ、Ｙ１００Ｔ、Ｇ１０１Ａ、Ｈ１０２Ｗ、Ｅ１０３Ｆ、Ｅ１０３Ｈ、Ｅ１０３Ｎ、Ｅ１０３Ｑ、Ｅ１０３Ｒ、Ｅ１０３Ｖ、Ｅ１０３Ｗ、Ｖ１０４Ｄ、Ｖ１０４Ｅ、Ｖ１０４Ｆ、Ｖ１０４Ｈ、Ｖ１０４Ｋ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｒ、Ｇ１０５Ａ、Ｇ１０５Ｈ、Ｇ１０５Ｓ、Ｇ１０５Ｔ、Ｅ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｈ、Ｋ１０６Ｎ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｓ、Ｐ１０８Ｒ、Ｉ１１０Ａ、Ｉ１１０Ｆ、Ｉ１１０Ｌ、Ｉ１１０Ｍ、Ｉ１１０Ｔ、Ｔ１１１Ｄ、Ｔ１１１Ｈ、Ｔ１１１Ｎ、Ｔ１１１Ｒ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｃ、Ｇ１１２Ｄ、Ｇ１１２Ｋ、Ｇ１１２Ｌ、Ｇ１１２Ｍ、Ｇ１１２Ｑ、Ｇ１１２Ｒ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｎ１２７Ｋ、Ｉ１３１Ｖ、Ａ１３２Ｖ、Ｌ１３３Ｖ、Ａ１３６Ｔ、Ｌ１３７Ｔ、Ｔ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｈ１４２Ｑ、Ｑ１４Ｒ、Ｙ１５６Ｈ、Ｋ１６３Ｔ、Ｄ１６８Ｅ、Ｈ１６９Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、Ｉ１８３Ｆ、Ｉ１８３Ｌ、Ｉ１８３Ｐ、Ｉ１８３Ｓ、Ｅ１８４Ａ、Ｅ１８４Ｄ、Ｅ１８４Ｒ、Ｅ１８４Ｔ、Ｅ１８４Ｖ、Ｅ１８５Ｔ、Ｍ１８７Ｌ、Ｍ１８９Ｉ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９１Ｇ、Ｋ１９１Ｈ、Ｋ１９１Ｍ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ１９１Ｒ、Ｋ１９１Ｓ、Ｋ１９１Ｔ、Ｋ１９１Ｗ、Ｅ１９７Ａ、Ｅ１９７Ｄ、Ｅ１９７Ｆ、Ｅ１９７Ｋ、Ｅ１９７Ｍ、Ｅ１９７Ｑ、Ｅ１９７Ｓ、Ｅ１９７Ｔ、Ｅ１９７Ｖ、Ｉ２０１Ｃ、Ｉ２０１Ｅ、Ｉ２０１Ｆ、１２０１Ｈ、Ｉ２０１Ｌ、Ｉ２０１Ｓ、Ｉ２０１Ｔ、Ｉ２０１Ｖ、Ｈ２０３Ｋ、Ｌ２１９Ｍ、Ｌ２１９Ｗ、Ｆ２２０Ｌ、Ｖ２２３Ｉ、Ｆ２２５Ｙ、Ｈ２３０Ｆ、Ｈ２３０Ｌ、Ｈ２３０Ｙ、Ｎ２３２Ｓ、Ｙ２４６Ｆ、Ｆ２４９Ｗ、Ｄ２５０Ｅ、Ｓ２７４Ａ、Ｓ２７４Ｃ、Ｓ２７４Ｇ、Ｓ２７４Ｎ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ２７８Ｍ、Ａ２８０Ｇ、Ａ２８０Ｓ、Ａ２８０Ｔ、Ｇ２８１Ｓ、Ａ２８２Ｍ、Ａ２８２Ｐ、Ｇ２８４Ｎ、Ｉ２８５Ｌ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｆ３０６Ｗ、Ｆ３０６Ｙ、Ｓ３１１Ｎ、Ｋ３１５Ｅ、Ｄ３１７Ｅ、Ｄ３１７Ｋ、Ｉ３３１Ｃ、Ｉ３３１Ｌ、Ｉ３３１Ｎ、Ｉ３３１Ｓ、Ｉ３３１Ｔ、Ｉ３３１Ｖ、Ｎ３３３Ｔ、Ｐ３３４Ｎ、Ｐ３３５Ｔ、Ｌ３３７Ｔ、Ｌ３３８Ａ、Ｌ３３８Ｑ、Ｓ３４１Ｉ、Ｋ３７３Ｅ、Ｋ３７３Ｎ、Ｎ３７５Ａ、Ｎ３７５Ｈ、Ｙ３７６Ｃ、Ｙ３７６Ｆ、Ｙ３７６Ｌ、Ｋ３７８Ｇ、Ｋ３７８Ｐ、Ｋ３７８Ｑ、Ｋ３７８Ｒ、Ｋ３８０Ｇ、Ｋ３８０Ｓ、Ａ３８２Ｇ、Ａ３８２Ｒ、Ａ３８２Ｔ、Ｔ３８３Ｓ、Ｋ３８４Ｇ、Ｋ３８４Ｎ、Ｐ３８６Ｋ、Ｐ３８６Ｓ、Ｖ３８７Ｌ、Ｎ３８９Ｅ、Ｉ４０５Ｌ、Ｆ４０７Ｙ、Ｓ４０８Ｄ、Ｓ４０８Ｎ、Ｎ４１１Ｒ、Ｄ４１３Ｓ、Ｄ４１３Ｖ、Ｑ４１６Ｔ、Ｅ４１９Ａ、Ｅ４１９Ｌ、Ｋ４２０Ｅ、Ｒ４２１Ｎ、Ｖ４２４Ｉ、Ｋ４２７Ｍ、Ｎ４２９Ｅ、Ｇ４３２Ａ及びＡ４３６Ｔ
    からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項４０～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項５１に記載の方法。
  53. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項５２に記載の方法。
  54. 各ポリペプチド単量体が、Ａ２８２、Ｆ３０６またはＦ２４９に置換を含む、請求項４０～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較してＡ９９に置換を含む、請求項４０～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較してＧ１１２に置換を含む、請求項４０～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較してＥ１０３に置換を含む、請求項４０～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較してＶ１０４に置換を含む、請求項４０～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較してＳ４０８に置換を含む、請求項４０～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 各ポリペプチド単量体が前記Ｆ３０６Ｗ置換を含む、請求項５１～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 各ポリペプチド単量体が前記Ｌ７２Ｎ置換を含む、請求項５１～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 各ポリペプチド単量体が前記Ｈ１０２Ｗ及びＮ３３３Ｔ置換を含む、請求項５１～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 各ポリペプチド単量体が前記Ｉ１８３Ｐ置換を含む、請求項５１～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 各ポリペプチド単量体が前記Ｒ１０７Ｐ置換を含む、請求項５１～６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 各ポリペプチド単量体が前記Ａ４３６Ｔ置換を含む、請求項５１～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較して、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項４０～６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較して、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つの置換を含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 各ポリペプチド単量体が、配列番号１と比較して、前記置換Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ及びＮ３３３Ｔを含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 各ポリペプチド単量体が、配列番号３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４０～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 各ポリペプチド単量体が、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６９に記載の方法。
  71. 各ポリペプチド単量体が、配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項７０に記載の方法。
  72. 各ポリペプチド単量体が配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項７１に記載の方法。
  73. 各ポリペプチド単量体が、配列番号２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４０～６８のいずれか１項に記載の方法。
  74. 各ポリペプチド単量体が、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項７３に記載の方法。
  75. 各ポリペプチド単量体が、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項７４に記載の方法。
  76. 各ポリペプチド単量体が配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記ホモ二量体が少なくとも８０００Ｍ－１ｓ－１の触媒活性（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有する、請求項４０～７６のいずれかに記載の方法。
  78. 前記ホモ二量体が、約８０００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；１００００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；２００００Ｍ－１ｓ－１～４００００Ｍ－１ｓ－１；または２５０００Ｍ－１ｓ－１～３５０００Ｍ－１ｓ－１の触媒活性（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有する、請求項７７に記載の方法。
  79. ＰＥＧ分子とホモ二量体との比が約２５：１であり、
    前記ＰＥＧ分子が、約５ｋＤａの分子量を有し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルカーボネート連結基によって前記ホモ二量体に結合している、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記ホモ二量体が水性緩衝液中で前記ＰＥＧ化剤と接触する、請求項４０～７９のいずれかに記載の方法。
  81. 前記水性緩衝液がリン酸二ナトリウムを含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記水性緩衝液が酢酸ナトリウムを含む、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記水性緩衝液のｐＨが約７．５～約９．５の範囲である、請求項８０～８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 前記水性緩衝液のイオン強度が約２５０ｍＭ～約３５０ｍＭの範囲である、請求項８０～８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. サイズ排除クロマトグラフィーを用いて前記ホモ二量体を単離する、請求項４０～８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. 請求項４０～８５のいずれか１項に記載の方法によって製造されるキヌレニナーゼホモ二量体。
  87. 請求項１～３９及び請求項８６のいずれか１項に記載のキヌレニナーゼホモ二量体を薬学的に許容される担体の中に含む医薬製剤。
  88. 腫瘍を有する対象を治療する方法であって、
    有効量の請求項８７に記載の製剤または請求項１～３９及び請求項８６のいずれか１項に記載の酵素を対象に投与すること
    を含む、前記方法。
  89. 前記対象が、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２またはＴＤＯ発現腫瘍を有することが確認されている、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項８８または請求項８９に記載の方法。
  91. 前記腫瘍が造血器腫瘍である、請求項８８または請求項８９に記載の方法。
  92. 前記対象がヒト患者である、請求項８８～９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. 前記製剤が、腫瘍内に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸腔内に、気管内に、眼内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下に、小嚢内に、経粘膜的に、心嚢内に、臍帯内に、経口的に、吸引によって、注射によって、輸注によって、持続注入によって、標的細胞に直接注ぐ局部灌流によって、カテーテルによって、または洗浄によって投与される、請求項８８～９２のいずれか１項に記載の方法。
  94. 第２の抗がん療法を施行することをさらに含む、請求項８８～９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記第２抗がん療法が、放射線療法、外科的療法、免疫療法または第２抗がん化合物である、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記第２抗がん化合物が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記第２抗がん化合物が、抗ＰＤＩ、抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－ＬＩ抗体を含む、請求項９５に記載の方法。
  98. 前記第２抗がん化合物が抗体である、請求項９５に記載の方法。
  99. 前記第２抗がん化合物が抗体－薬物複合体である、請求項９５に記載の方法。
  100. 前記免疫療法が、免疫エフェクター細胞または免疫原性組成物を投与することを含む、請求項９５に記載の方法。
  101. 前記免疫原性組成物ががん細胞抗原を含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記免疫エフェクター細胞がＮＫ細胞またはＴ細胞を含む、請求項１００に記載の方法。
  103. 前記免疫エフェクター細胞がＣＡＲ Ｔ細胞を含む、請求項１００に記載の方法。
  104. 腫瘍を有するヒト対象におけるＴ細胞応答をもたらす方法であって、
    請求項８８～１０３のいずれか１項に記載の方法に従ってキヌレニナーゼホモ二量体を前記対象に投与することを含む、前記方法。
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