TW202340251A - 抗ｎｏｔｃｈ２抗體及結合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供抗 Notch2 抗體及結合物及其使用方法。

Description

抗　NOTCH2　抗體及結合物及其使用方法
本發明涉及抗 Notch2 抗體及結合物及其使用方法。
Notch 受體家族為進化保留跨膜受體中的一類，其傳遞影響海膽及人類等各種生物發育的信號。Notch 受體及其配體 Delta 及 Serrate (在哺乳動物中稱為 Jagged) 為具有大胞外域的跨膜蛋白，該跨膜蛋白包含表皮生長因子 (EGF) 樣重複序列。Notch 旁系同源物的數量因物種而異。例如，哺乳動物中有四種 Notch 受體 (Notch1-Notch4)，秀麗隱桿線蟲 ( Caenorhabditis elegans) 中有兩種 (LIN-12 及 GLP-1)，且黑腹果蠅 ( Drosophila melanogaster) 中有一種 (Notch)。在轉運到細胞表面的過程中由弗林蛋白酶樣蛋白酶在跨膜域 N 端側之 S1 位點以蛋白水解方式處理 Notch 受體，從而產生細胞外 Notch (ECN) 次單元及 Notch 跨膜次單元 (NTM)。這兩個次單元保持非共價締合並構成成熟的異二聚體細胞表面受體。Notch 受體及 Notch 傳訊路徑綜述於例如 Aster 等人， Annu. Rev. Pathol. Mech.Dis.3:587-613, 2008 及 Bolos 等人， Endocrine Reviews28:339-363, 2007 中。
Notch2 ECN 次單元包含 36 個 N 端 EGF 樣重複序列，隨後為三個串聯重複的 Lin 12/Notch 重複序列 (LNR) 模組，其在位點 S1 之前。每個 LNR 模組包含三個雙硫鍵及預計會配位鈣離子的一組保守的酸性及極性殘基。EGF 重複區域內有活化配體的結合位點。
Notch 配體與 ECN 次單元之結合啟動兩次連續的蛋白酶切割，這兩次蛋白酶切割通過經調節膜內蛋白水解發生。金屬蛋白酶 (ADAM10 或 ADAM17) 在位點 S2 的第一次切割使 Notch 跨膜次單元易感於靠近質膜內小葉之位點 S3 的第二次切割。由包含早老素及呆蛋白（nicastrin）並促進 γ-分泌酶活性的多蛋白複合物催化的位點 S3 切割釋放 Notch 跨膜次單元之細胞內部分，使其移動至細胞核並活化標靶基因的轉錄。(關於 Notch 的蛋白酶切割之綜述，參見例如，Sisodia 等人， Nat. Rev. Neurosci.3:281-290, 2002。)
已在人類中識別出 Jagged 及 Delta 樣類別的五個 Notch 配體 (Jagged1 (亦稱為 Serrate1)、Jagged2 (亦稱為 Serrate2)、Delta-like1 (亦稱為 DLL1)、Delta-like3 (亦稱為 DLL3) 及 Delta-like4 (亦稱為 DLL4))。每個配體均為單程跨膜蛋白，具有結合 Notch 所必需的保守 N 端 Delta、Serrate、LAG-2 (DSL) 模體。在 DSL 模體 C 端的一系列 EGF 樣模組在跨膜片段之前。與 Notch 受體不同，配體在 C 端具有 70 至 215 個胺基酸的短細胞質尾部。此外，還報導了其他類型的配體 (例如，DNER、NB3 及 F3/Contactin)。(關於 Notch 配體及配體媒介之 Notch 活化之綜述，參見例如，D’Souza 等人， Oncogene27:5148-5167, 2008。)
Notch 路徑在各種發育及生理過程中發揮作用，包括影響蠅及脊椎動物神經生成的過程。一般而言，Notch 傳訊參與側向抑制、譜系決定及細胞組之間的邊界之建立 (參見例如，Bray, Molecular Cell Biology7:678-679, 2006)。已顯示抑制 Jagged-Notch 傳訊可誘導哺乳動物呼吸道中分泌性棒狀細胞的快速喪失及纖毛細胞的增加。在臨床前氣喘模型中，亦顯示 Jagged 阻滯可逆轉杯狀細胞化生。 參見Lafkas 等人， Nature528:127-131 (2015)。
黏液阻塞性肺病之特徵在於咳嗽、咳痰、瀰漫性黏液阻塞、慢性發炎、氣道壁擴張及頻繁的細菌感染。在健康個體中，將肺部的黏液層自遠端氣道快速轉運到氣管。在患有黏液阻塞性疾病的個體中，離子流體轉運或黏蛋白分泌或兩者兼有的上皮缺陷會導致黏液濃度過高及黏液轉運失敗，以及黏液黏附到氣道表面。這導致無法藉由咳嗽清除的小氣道中的黏液累積，從而導致氣道阻塞、感染及發炎。
仍然需要治療黏液阻塞性肺病。本文所述的發明滿足此需求並提供其他益處。
本發明提供包含結合 Notch2 之抗原結合域的結合物及其使用方法。
在一些實施例中，本揭露提供一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中該結合物抑制 Jagged1 媒介的傳訊 (Jagged1-mediated signaling)，但不抑制 DLL1 媒介的傳訊。
在一些實施例中，本揭露提供一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中該結合物抑制 Jagged1 媒介的傳訊相比 DLL1 媒介的傳訊達更大之程度。
在一些實施例中，該結合物能達到對 Jagged1 媒介的傳訊之最大抑制為 100%，及對 DLL1 媒介的傳訊之最大抑制為小於 80%、或小於 70%、或小於 60%。
在一些實施例中，該結合物不抑制 Jagged1 與 Notch2 之結合。在一些實施例中，該結合物不抑制 DLL1 與 Notch2 之結合。
在一些實施例中，該結合物結合 Notch2 之 EGF7 重複序列 (repeat) 內的表位。在一些實施例中，該結合物結合 Notch2 之胺基酸 260 至 296 內的表位。在一些實施例中，該結合物結合 Notch2 之胺基酸 260 至 296 內的不連續表位。
在一些實施例中，本揭露提供一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中該結合物結合 Notch2 之 EGF7 重複序列內的表位。
在一些實施例中，本揭露提供一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中該結合物結合 Notch2 之胺基酸 260 至 296 內的表位。
在一些實施例中，本揭露提供一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中該結合物結合 Notch2 之胺基酸 260 至 296 內的不連續表位。
在一些實施例中，該結合物接觸人類 Notch2 之精胺酸 268 (R268)。在一些實施例中，該結合物不結合包含離胺酸 268 (K268) 的 Notch2。
在一些實施例中，該結合物結合包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列的多肽且不結合包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列的多肽。
在一些實施例中，該結合物與人類 Notch2 及食蟹獼猴 Notch2 結合。在一些實施例中，該結合物不與小鼠 Notch2 結合。在一些實施例中，該結合物與天竺鼠 Notch2 結合。在一些實施例中，該結合物不與人類 Notch1 或人類 Notch3 結合。
在一些實施例中，如藉由表面電漿共振所測定，該結合物以小於 10 nM、小於 8 nM、小於 5 nM、小於 3 nM、小於 2 nM 或小於 1 nM 之親和力 (K D) 結合人類 Notch2。
在一些實施例中，該結合物以小於 10 nM、小於 5 nM、小於 3 nM、小於 2 nM 或小於 1 nM 之 IC50 抑制 Jagged1 媒介的傳訊。在一些實施例中，使用高通量篩選 (high-content screening，HCS) 測定來確定 Jagged1 媒介之傳訊的抑制。
在一些實施例中，各抗原結合域獨立地包含： a)        重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列的 CDR-L3； b)       重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列的 CDR-L3； c)        重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列的 CDR-L3； d)       重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列的 CDR-L3；或 e)        重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列的 CDR-L3。
在一些實施例中，本揭露提供一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中各抗原結合域獨立地包含： a)        重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列的 CDR-L3； b)       重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列的 CDR-L3； c)        重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列的 CDR-L3； d)       重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列的 CDR-L3；或 e)        重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列的 CDR-L3。
在一些實施例中，各抗原結合域獨立地包含： a)        VH 序列，其與 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； b)       VL 序列，其與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； c)        如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列； d)       VH 序列，其與選自 SEQ ID NO: 17 至 24、26、28、30 及 32 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； e)        VL 序列，其與選自 SEQ ID NO: 15、16、25、27、29 及 31 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； f)        如 (d) 中所定義之 VH 序列及如 (e) 中所定義之 VL 序列； g)       VH 序列，其與 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； h)       VL 序列，其與 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； i)         如 (g) 中所定義之 VH 序列及如 (h) 中所定義之 VL 序列； j)         VH 序列，其與選自 SEQ ID NO: 102 至 106 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； k)       VL 序列，其與選自 SEQ ID NO: 98 至 100 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； l)         如 (j) 中所定義之 VH 序列及如 (k) 中所定義之 VL 序列； m)     VH 序列，其與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； n)       VL 序列，其與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； o)       如 (m) 中所定義之 VH 序列及如 (n) 中所定義之 VL 序列； p)       VH 序列，其與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； q)       VL 序列，其與 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； r)        如 (p) 中所定義之 VH 序列及如 (q) 中所定義之 VL 序列； s)        VH 序列，其與 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； t)         VL 序列，其與 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性；或 u)       如 (s) 中所定義之 VH 序列及如 (t) 中所定義之 VL 序列。
在一些實施例中，各抗原結合域獨立地包含： a)        VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列； b)       VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列； c)        如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列； d)       VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 17 至 24、26、28、30 及 32 之胺基酸序列； e)        VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 15、16、25、27、29 及 31 之胺基酸序列； f)        如 (d) 中所定義之 VH 序列及如 (e) 中所定義之 VL 序列； g)       VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列； h)       VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列； i)         如 (g) 中所定義之 VH 序列及如 (h) 中所定義之 VL 序列； j)         VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 101 至 106 之胺基酸序列； k)       VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 98 至 100 之胺基酸序列； l)         如 (j) 中所定義之 VH 序列及如 (k) 中所定義之 VL 序列； m)     VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列； n)       VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列； o)       如 (m) 中所定義之 VH 序列及如 (n) 中所定義之 VL 序列； p)       VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列； q)       VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列； r)        如 (p) 中所定義之 VH 序列及如 (q) 中所定義之 VL 序列； s)        VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列； t)         VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列；或 u)       如 (s) 中所定義之 VH 序列及如 (t) 中所定義之 VL 序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中各抗原結合域獨立地包含： a)        VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列； b)       VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列； c)        如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列； d)       VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 17 至 24、26、28、30 及 32 之胺基酸序列； e)        VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 15、16、25、27、29 及 31 之胺基酸序列； f)        如 (d) 中所定義之 VH 序列及如 (e) 中所定義之 VL 序列； g)       VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列； h)       VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列； i)         如 (g) 中所定義之 VH 序列及如 (h) 中所定義之 VL 序列； j)         VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 101 至 106 之胺基酸序列； k)       VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 98 至 100 之胺基酸序列； l)         如 (j) 中所定義之 VH 序列及如 (k) 中所定義之 VL 序列； m)     VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列； n)       VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列； o)       如 (m) 中所定義之 VH 序列及如 (n) 中所定義之 VL 序列； p)       VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列； q)       VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列； r)        如 (p) 中所定義之 VH 序列及如 (q) 中所定義之 VL 序列； s)        VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列； t)         VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列；或 u)       如 (s) 中所定義之 VH 序列及如 (t) 中所定義之 VL 序列。
在一些實施例中，各抗原結合域獨立地包含： a)        VH 序列，其與選自 SEQ ID NO: 17 至 24、26、28、30 及 32 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； b)       VL 序列，其與選自 SEQ ID NO: 15、16、25、27、29 及 31 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； c)        如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列； d)       VH 序列，其與選自 SEQ ID NO: 102 至 106 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； e)        VL 序列，其與選自 SEQ ID NO: 98 至 100 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性；或 f)        如 (d) 中所定義之 VH 序列及如 (e) 中所定義之 VL 序列。
在一些實施例中，各抗原結合域包含： a)        VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 17 至 24、26、28、30 及 32 之胺基酸序列； b)       VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 15、16、25、27、29 及 31 之胺基酸序列； c)        如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列； d)       VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 101 至 106 之胺基酸序列； e)        VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 98 至 100 之胺基酸序列；或 f)        如 (d) 中所定義之 VH 序列及如 (e) 中所定義之 VL 序列。
在一些實施例中，各抗原結合域獨立地包含： a)        SEQ ID NO: 26 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 25 之 VL 序列； b)       SEQ ID NO: 28 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 27 之 VL 序列； c)        SEQ ID NO: 30 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 29 之 VL 序列；或 d)       SEQ ID NO: 32 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 31 之 VL 序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中各抗原結合域獨立地包含： a)        SEQ ID NO: 26 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 25 之 VL 序列； b)       SEQ ID NO: 28 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 27 之 VL 序列； c)        SEQ ID NO: 30 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 29 之 VL 序列；或 d)       SEQ ID NO: 32 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 31 之 VL 序列。
在一些實施例中，各抗原結合域包含相同的 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3 胺基酸序列。在一些實施例中，各抗原結合域包含相同的 VH 及 VL 胺基酸序列。
在一些實施例中，各抗原結合域為人類或人源化抗原結合域。在一些實施例中，各抗原結合域係選自 Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH 及 F(ab') 2。在一些實施例中，各抗原結合域為 Fab、Fab' 或 Fab'-SH。
在一些實施例中，至少一個抗原結合域係透過半胱胺酸胺基酸之硫醇基 (sulfhydryl) 基團與該非肽連接子共價連接。在一些實施例中，該抗原結合域係透過半胱胺酸胺基酸之硫醇基基團與該非肽連接子共價連接。
在一些實施例中，該半胱胺酸胺基酸係在抗原結合域之恆定區或骨架區 (framework region) 中。在一些實施例中，該半胱胺酸胺基酸係在抗原結合域之輕鏈恆定區中。在一些實施例中，該半胱胺酸胺基酸為工程化半胱胺酸胺基酸。在一些實施例中，該半胱胺酸胺基酸為在抗原結合域之輕鏈恆定區中的 K149C 工程化半胱胺酸胺基酸。
在一些實施例中，至少一個抗原結合域係透過離胺酸胺基酸之胺基團與該非肽連接子共價連接。在一些實施例中，各抗原結合域係透過離胺酸胺基酸之胺基團與該非肽連接子共價連接。在一些實施例中，該離胺酸胺基酸係在該抗原結合域之恆定區或骨架區中。
在一些實施例中，該結合物包含兩個、三個、四個、五個或六個抗原結合域。
在一些實施例中，該結合物之各抗原結合域為 Fab，其中 Fab 輕鏈包含 SEQ ID NO: 107 之胺基酸序列且 Fab 重鏈包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
在一些實施例中，該非肽連接子為多元醇。在一些實施例中，該非肽連接子為多臂多元醇。在一些實施例中，該多臂多元醇為二聚體、三聚體、四聚體或六聚體。在一些實施例中，該多臂多元醇之各臂包含與抗原結合域形成琥珀醯亞胺接附 (succinimide attachment) 的馬來醯亞胺 (maleimide) 部分。在一些實施例中，該多臂多元醇係選自： ； ； ； ； ； ；或 ； 其中各 n 獨立地選自 1 至 50、1 至 40、1 至 30、1 至 20、1 至 15 或 1 至 10 的整數。
在一些實施例中，本揭露提供一種生產結合物的方法，其包含將至少兩個與人類 Notch2 結合 (bind) 的抗原結合域與非肽連接子結合 (conjugating)。
在一些實施例中，本揭露提供一種醫藥組成物，其包含該結合物及醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中，該醫藥組成物進一步包含另外的治療劑。在一些實施例中，該另外的治療劑係選自高張鹽水、甘露醇、α 鏈道酶 (dornase alpha)、N-乙醯基半胱胺酸、半胱胺及支氣管擴張劑。
在一些實施例中，該結合物或醫藥組成物用為藥物。在一些實施例中，該結合物或醫藥組成物用於治療黏液阻塞性肺病。在一些實施例中，該黏液阻塞性肺病選自慢性阻塞性肺病 (COPD)、囊腫纖維化、原發性纖毛運動障礙、非囊腫纖維化支氣管擴張症及細支氣管炎。
在一些實施例中，本揭露提供該結合物或醫藥組成物在製造藥物中之用途，該藥物用於治療黏液阻塞性肺病。在一些實施例中，該黏液阻塞性肺病選自慢性阻塞性肺病 (COPD)、囊腫纖維化、原發性纖毛運動障礙、非囊腫纖維化支氣管擴張症及細支氣管炎。
在一些實施例中，本揭露提供該結合物或醫藥組成物在製造藥物中之用途，該藥物用於減少個體中的分泌細胞數量。在一些實施例中，該藥物增加纖毛細胞數量。在一些實施例中，該藥物將分泌細胞轉化為纖毛細胞。在一些實施例中，該分泌細胞位於該個體的肺中。在一些實施例中，該分泌細胞為杯狀細胞。
在一些實施例中，本揭露提供一種治療患有黏液阻塞性肺病的個體之方法，其包含向該個體投予有效量之該結合物或醫藥組成物。在一些實施例中，該黏液阻塞性肺病選自慢性阻塞性肺病 (COPD)、囊腫纖維化、原發性纖毛運動障礙、非囊腫纖維化支氣管擴張症及細支氣管炎。
在一些實施例中，本揭露提供一種減少個體中的分泌細胞數量之方法，其包含向受試者投予有效量之該結合物或醫藥組成物，以消耗該個體中的分泌細胞。在一些實施例中，該方法包含增加纖毛細胞數量。在一些實施例中，該方法包含將分泌細胞轉化為纖毛細胞。在一些實施例中，該分泌細胞位於該個體的肺中。在一些實施例中，該分泌細胞為杯狀細胞。
在一些實施例中，該方法進一步包含對該個體投予另外的治療劑。在一些實施例中，該另外的治療劑係選自高張鹽水、甘露醇、α 鏈道酶、N-乙醯基半胱胺酸、半胱胺及支氣管擴張劑。
相關申請的交叉引用
本申請案請求於 2022 年 1 月 19 日遞交之美國臨時申請案序列號 63/300,731 的優先權，其完整內容藉由引用併入本文。 序列表
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「受體人框架」為本文中之目的是如下述定義的衍生自人免疫球蛋白框架或人共通骨架、包含輕鏈可變域 (VL) 框架或重鏈可變域 (VH) 框架的胺基酸序列之框架。「衍生自 (derived from)」人免疫球蛋白骨架或人共通骨架的受體人骨架可包含與此等為相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列的變更。在一些態樣中，胺基酸變更數目為 10 或更少、9 或更少、8 或更少、7 或更少、6 或更少、5 或更少、4 或更少、3 或更少、或 2 或更少。在一些態樣中，VL 受體人框架與 VL 人免疫球蛋白框架序列或人共通骨架序列的序列相同。
「親和力」係指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」，係指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對於其搭配物 Y 之親和力通常可藉由解離常數 (K D) 來表示。可以藉由本領域已知的習知方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。下面描述了用於測量結合親和力的具體說明性和例示性方法。
術語「親和力成熟」之抗體是指在一或多個互補決定區 (CDR) 中具有一或多種變化之抗體，與不具有此等變化之親本抗體相比，此類變化引起該抗體對抗原之親和力的改善。
術語「抗 Notch2 抗體」及「結合至 Notch2 之抗體」係指能夠以足夠親和力結合 Notch2，從而使得該抗體可用作靶向 Notch2 之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一些態樣中，當例如藉由表面電漿共振 (SPR) 量測時，抗 Notch2 抗體與無關、非 Notch2 蛋白質結合之程度小於該抗體與 Notch2 結合約 10%。在某些態樣中，結合至 Notch2 之抗體之解離常數 (K D) 是 ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或≤ 0.001 nM (例如 10 -8M 或更低，例如 10 -8M 至 10 -13M，例如 10 -9至 10 -13M)。當抗體的 K D為 1 μM 或更少時，稱該抗體與 Notch2 「特異性結合」。於某些態樣中，抗 Notch2 抗體結合至 Notch2 之表位，其在不同物種之 Notch2 是保守性。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出預期抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括 (但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab') 2；從抗體片段所形成之雙功能抗體 (diabody)、線性抗體；單鏈抗體分子 (例如 scFv 及 scFab)；單域抗體 (dAb)；及多特異性抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Holliger 及 Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。
術語「表位 (epitope)」表示抗 Notch2 抗體與之結合的抗原上的位點，無論是蛋白性的還是非蛋白性的。表位可由連續的胺基酸延伸形成 (線性表位) 或包含不連續的胺基酸 (即，不連續表位或構象表位)，例如，由於抗原的折疊，即藉由蛋白抗原的三級折疊而在空間上接近。線性表位通常在蛋白抗原暴露於變性劑後仍與抗 Notch2 抗體結合，而構象表位通常在變性劑處理後被破壞。在獨特空間構象中，表位包含至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個、至少 6 個、至少 7 個或 8 個至 10 個胺基酸。
篩選與特定表位結合的抗體 (即與相同表位結合者) 可使用本技術領域的常規方法進行，例如諸如但不限於丙胺酸掃描、肽印漬 (參見 Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463)、肽裂解分析、表位切除、表位萃取、抗原的化學修飾 (參見 Prot. Sci. 9 (2000) 487-496)、及和交叉阻斷 (參見「Antibodies」, Harlow 及 Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)。
基於抗原結構的抗體剖析 (ASAP)，也稱為修飾輔助剖析 (MAP)，允許根據從眾多化學或酶修飾的抗原表面的各抗體結合剖析，將特異性結合 Notch2 的眾多單株抗體進行分箱 (bin) (參見例如 US 2004/0101920)。各分箱中的抗體都與相同表位結合，這個表位可能是獨特的表位，與另一分箱所代表的表位明顯不同或部分重疊。
又，競爭性結合可用來易於確定抗體是否與 Notch2 的相同表位結合，或與參考抗 Notch2 抗體競爭性結合。例如，與參考抗 Notch2 抗體「結合在相同表位的抗體」係指在競爭性測定中阻斷參考抗 Notch2 抗體與其抗原結合 50% 或更多的抗體，且反之，參考抗體在競爭測定中阻斷該抗體與其抗原結合 50% 或更多。又例如，為了確定抗體是否與參考抗 Notch2 抗體結合在相同表位，讓參考抗體在飽和條件下與 Notch2 結合。在去除過量的參考抗 Notch2 抗體後，評估有關抗 Notch2 抗體與 Notch2 結合的能力。如果在參考抗 Notch2 抗體飽和結合後，抗 Notch2 抗體與能夠與 Notch2 結合，則可以斷定該抗 Notch2 抗體與參考抗 Notch2 抗體結合的表位不同。但是，如果在參考抗 Notch2 抗體飽和結合後，該抗 Notch2 抗體不能與 Notch2 結合，則該抗 Notch2 抗體可能與參考抗 Notch2 抗體結合的表位相同。為了確認該抗體是否與相同的表位結合，或者只是由於立體原因而阻礙了結合，可以使用常規實驗 (例如，使用 ELISA、RIA、表面電漿共振、流式細胞儀或本技術中可獲得的任何其他定量或定性的抗體結合測定進行胜肽突變和結合分析)。此測定應分兩次設置進行，即以兩種抗體為飽和抗體。如果在這兩種設置中，只有第一種 (飽和) 抗體能夠與 Notch2 結合，則可斷定該抗 Notch2 抗體和參考抗 Notch2 抗體競爭結合至 Notch2。
在一些態樣中，如果一個抗體的 1 倍、5 倍、10 倍、20 倍或 100 倍的過量抑制另一抗體的結合至少 50%、至少 75%、至少 90% 或甚至 99% 或更多 (藉由競爭性結合測定測量)，則認為兩個抗體與相同或重疊的表位結合 (參見例如 Junghans 等人，Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502)。
在一些態樣中，如果抗原中基本上所有的胺基酸突變降低或消除了一個抗體的結合，也降低或消除了另一抗體的結合，則認為兩個抗體與相同表位結合。如果只有減少或消除一個抗體結合的胺基酸突變的次集合 (subset) 減少或消除另一抗體的結合，則認為兩種抗體具有「重疊表位 (overlapping epitope)」。
術語「嵌合」抗體是指其中重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且該等種類中之若干種可進一步分為亞類 (同型)，例如 IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1及 IgA 2。在某些態樣中，該抗體是屬 IgG 1同型。在某些態樣中，該抗體是屬 IgG 1同型，具有 P329G、L234A 及 L235A 突變以減少 Fc 區域效應功能。在其他態樣中，該抗體是屬 IgG 2同型。在某些態樣中，該抗體是屬 IgG 4同型，在鉸鏈區中具有 S228P 突變以改善 IgG 4抗體之穩定性。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
「效用功能 (effector function)」，係指歸因於抗體的 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效用功能的實例包括：C1q 結合和補體依賴性細胞毒性 (CDC)；Fc 受體結合；抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體 (例如 B 細胞受體) 的下調；以及 B 細胞活化。
藥劑例如醫藥組成物的「治療有效量」係指在所需之給藥劑量和時間段內有效實現所需的治療或預防效果的量。
本文中的術語「Fc 區域」，用於定義包含至少一部分恆定區域的免疫球蛋白重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異體 Fc 區域。在一些態樣中，人 IgG 重鏈 Fc 區域自 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈的羧基端。但是，由宿主細胞產生的抗體可能經歷重鏈 C 端的一種或多種，特別是一種或兩種胺基酸之轉譯後切割。因此，由宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈的特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或者可包括全長重鏈的切割變異體。重鏈的最後兩個 C 端胺基酸為甘胺酸 (G446) 及離胺酸 (K447，根據 Kabat EU 索引編號)。因此，可以存在或可以不存在 Fc 區域之 C 端離胺酸 (Lys447) 或 C 端甘胺酸 (Gly446) 及離胺酸 (Lys447)。在一些態樣中，包含在根據本發明之抗體中的包括本文所述之 Fc 區的重鏈包含另外的 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，根據 EU 索引編號)。在一些態樣中，包含在根據本發明之抗體中的包括本文所述之 Fc 區的重鏈包含另外的 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 EU 索引編號)。除非本文另有說明，否則 Fc 區域或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) (另見上文)。
「框架」或「FR」係指互補決定區 (CDR) 之外的可變域殘基。可變域之 FR 通常由四個 FR 域組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，CDR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構或具有包含本文所定義之 Fc 區域的重鏈之抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」和「宿主細胞培養物」可互換使用，係指已向其中引入外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉化細胞中篩選或選擇的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變子代細胞。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。
「人共通骨架」是代表一系列人免疫球蛋白 VL 或 VH 骨架序列中最常見的胺基酸殘基的骨架。通常，人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的選擇來自可變域序列的次群組。通常，序列的亞組是如 Kabat 等人在 Sequences of Proteins of Immunological Interest(第 5 版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 1-3 卷) 中所述之亞組 。在一些態樣中，對於 VL，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 κ I 或 II。在一些態樣中，對於 VH，亞組是如上文 Kabat 等人在 上述文獻中所述之亞組 I 或 III。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 CDR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些態樣中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 CDR 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」係指已經歷人源化之抗體。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變並決定抗原結合特異性的各個區域，例如「互補決定區」(「CDR」)。
通常，抗體包括六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，及三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本文中，例示性 CDR 包括： (a) 高度可變環存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及 96-101 (H3) 處 (Chothia 及 Lesk， J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))； (b) CDR 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2) 及 95-102 (H3) (Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))； (c) 抗原接觸存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及 93-101 (H3) 處 (MacCallum 等人 J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996))；及 (d) 通過 Chothia 及 Kabat 的組合定義的 CDR：VL 域中之位置 24 至 34 (L1)、50 至 56 (L2) 及 89 至 97 (L3)，以及 VH 域中之位置 26 至 35 (H1)、50 至 65 (H2) 及 95 至 102 (H3)。
除非另有說明，否則 CDR 根據 Kabat 等人在上述文獻中所述之方法來確定。本領域之技術人員將理解，也可以根據 Chothia 在上述文獻、McCallum 在上述文獻中所述之方法或任何其他科學上接受之命名系統來確定 CDR 名稱。在一些態樣中，CDR 殘基包含在圖 1 至 3 及/或本文的特定序列表中鑑定出的那些。
「免疫結合物」是與一個或多個異源分子結合之抗體，其包括但不限於細胞毒性劑。
「受試者」或「個體」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。在某些態樣中，個體或受試者為人類。
「分離的」抗體是從其自然環境的組分中分離出來之抗體。在一些態樣中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 方法測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人， J. Chromatogr. B848:79-87 (2007).
術語「核酸分子」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中該鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5’ 至 3’ 表示。在本文中，術語核酸分子包括：去氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如互補 DNA (cDNA) 和基因組 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言信使 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更多個這些分子的混合聚合物。核酸分子可以是線性或環狀的。此外，術語核酸分子包括有義股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的例子包括帶有衍生糖、磷酸鹽連接或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子還包括適於在體外及/或體內例如在宿主或患者體內直接表現本發明之抗體的載體的 DNA 和 RNA 分子。此等 DNA (例如，cDNA) 或 RNA (例如，mRNA) 載體可以是未修飾的或經過修飾的。例如，mRNA 可經化學修飾以增強 RNA 載體之安定性及/或所編碼之分子的表現，使得 mRNA 可被注射入個體體內以生成抗體 (參見例如 Stadler 等人，Nature Medicine 2017，在線發表于 2017 年 6 月 12 日，doi:10.1038/nm.4356 或 EP 2 101 823 B1)。
「分離的」核酸係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「經分離之編碼抗 Notch2 抗體的核酸」係指編碼抗 Notch2 抗體重鏈和輕鏈 (或其片段) 之一種或多種核酸分子，包括在單個載體或單獨抗體中之此等核酸分子，並且此等核酸分子存在於宿主細胞中的一個或多個位置。
如本文所用的術語「單株抗體」係指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即包含群體的個別抗體是相同的和/或結合相同的抗原決定位，除了例如含有天然生成之突變或於單株抗體製劑生產過程中產生的可能的變異體抗體之外，此等變異體通常係以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，意欲根據本發明使用的單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
術語「黏液阻塞性肺病」係指一組以瀰漫性黏液阻塞、慢性發炎、氣道壁擴張及頻繁的細菌感染為特徵的疾病。在黏液阻塞性肺病中，過高濃度的黏液無法有效地自遠端氣道輸送到氣管，且黏液黏附在氣道表面，導致氣流阻塞、感染及發炎。非限制性例示性黏液阻塞性肺病包括慢性阻塞性肺病 (COPD)、囊腫纖維化、原發性纖毛運動障礙、非囊腫纖維化支氣管擴張症及細支氣管炎。
「裸抗體」係指未與異源部分 (例如，細胞毒性部分) 或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥組成物中。
「天然抗體」係指具有不同結構的天然生成之免疫球蛋白分子。例如，Ig 天然 IgG 抗體為約 150,000 道耳頓、由二條相同的輕鏈及二條相同的重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體醣蛋白。從 N 端 至 C 端，每條重鏈具有可變域 (VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變區，接著係三個重鏈恆定域 (CH1、CH2及CH3)。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有可變域 (VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變區，接著為輕鏈恆定 (CL) 域。
除非另有說明，否則如本文所使用之術語「Notch2」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然 Notch2，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如，人) 以及囓齒動物 (例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 Notch2 以及在細胞處理中得到的任何形式的 Notch2。該術語亦涵蓋天然 Notch2 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。例示性人類 Notch2 之胺基酸序列在本文中如 UniProtKB/Swiss-Prot: Q04721.3 及 SEQ ID NO: 70 所示。例示性食蟹獼猴 Notch2 蛋白之胺基酸序列如 UniProt 中所示：A0A2K5U7N0_MACFA。另一示例性食蟹獼猴 Notch2 在本文中如SEQ ID NO: 71 所示。例示性天竺鼠 Notch2 之胺基酸序列在本文中如 UniProt所示: H0VU21 及 SEQ ID NO: 72 所示。例示性天竺鼠 Notch2 之胺基酸序列在本文中如 UniProt所示: O35516 及 SEQ ID NO: 73 所示。例示性人類 Notch2 之胺基酸序列在本文中如 UniProt所示: Q9QW30 及 SEQ ID NO: 81 所示。
術語「藥品仿單」用於指涉通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、投予途徑、聯合療法、禁忌症及/或警告等資訊。
相對於參照多肽序列所述之「胺基酸序列同一性百分比 (%)」，是指候選序列中胺基酸殘基與參照多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸序列同一性百分比之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR) 軟件或 FASTA 程式套件實現。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何算法。可替代地，可使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 生成同一性百分比值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司開發，並且其源代碼已與用戶文檔一起歸檔在位於美國華盛頓特區 20559 的美國著作權局，其已經注冊 (美國版權註冊號 TXU510087) 並在 WO 2001/007611 中有所描述。
除非另有說明，否則出於本文之目的，使用 FASTA 套件 36.3.8c 版或更高版本的 ggsearch 程式及 BLOSUM50 比較矩陣來生成胺基酸序列同一性百分比值。FASTA 程式包由以下作者開發：W. R. W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258；及 Pearson et. al.(1997) (Genomics 46:24-36)，並可從以下網址公開存取：www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 或 www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta。可替代地，可使用透過 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi 存取的公用伺服器，使用 ggsearch (global protein:protein) 程式和預設選項 (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) 比較序列，以確保執行全局而不是局部比對。胺基酸同一性百分比提供於輸出比對標題中。
術語「醫藥組成物」或「醫藥調配物」係指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不含對組成物將投予之個體具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」是指醫藥組成物或調配物中除對個體無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文中所使用的「治療」(及其語法變異體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療個體之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。在一些態樣中，本發明之抗體用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性框架區 (FR) 及三個互補決定區 (CDR)。(參見，例如，Kindt 等人 Kuby Immunology, 6 thed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)。) 單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見，例如，Portolano 等人， J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson 等人， Nature352:624-628 (1991)。
如本文所用，術語「載體」是指一種核酸分子，其能夠傳送與其連接之另一種核酸。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。這些載體在本文中稱為「表現載體」。 II. 組成物及方法
在一些態樣中，本發明部分地基於結合 Notch2 並抑制 Jagged1 媒介之傳訊但不抑制 DLL1 媒介之傳訊的抗體。本發明之抗體可用於例如診斷或治療黏液阻塞性肺病。 A. 例示性抗 Notch2 抗體
在一些態樣中，本發明提供了與 Notch2 結合之抗體。在一些態樣中，提供了與 Notch2 結合之分離抗體。在一些態樣中，本發明提供了與 Notch2 特異性結合之抗體。在某些態樣中，抗 Notch2 抗體： —   抑制 Jagged1 媒介之傳訊； —   不抑制 DLL1 媒介之傳訊； —   不抑制 Jagged1 與 Notch2 的結合； —   不抑制 DLL1 與 Notch2 的結合； —   結合 Notch2 之 EGF7 重複序列中的表位； —   結合 Notch2 之胺基酸 260 至 296 中的表位； —   結合 Notch2 之胺基酸 260 至 296 中的不連續表位； —   接觸人類 Notch2 之精胺酸 268 (R268)； —   不結合含離胺酸 268 (268K) 之 Notch2； —   結合包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列的多肽且不結合包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列的多肽；且/或 —   例如當藉由表面電漿共振測定時，以小於 20 nM、小於 15 nM、小於 10 nM 或小於 5 nM之親和力 (K D) 與人類 Notch2 結合。 包含抗體 1B2 或其人源化型式的一個或多個 CDR 之抗體
在一些態樣中，本發明提供了一種抗 Notch2 抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。在又一態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列；CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；及 CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列。在又一態樣中，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含 (a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列；及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在某些態樣中，如本文提供之抗 Notch2 抗體的任何一個或多個胺基酸在以下 CDR 位置被取代： -在 CDR-H2 (SEQ ID NO: 6) 中：位置 2 -在 CDR-H3 (SEQ ID NO: 8) 中：位置 2、4、5 及/或 6。 在某些態樣中，該取代為保守性取代，如本文所提供。在某些態樣中，以下取代中之任一者或多者可以任何組合進行： -在 CDR-H2 (SEQ ID NO: 6) 中：S2Q (Kabat 編號為 S51Q) -在 CDR-H3 (SEQ ID NO: 8) 中：S2G (Kabat 編號為 S96G)；R4K (Kabat 編號為 R98K); W5L (W99L by Kabat numbering)；及/或 G6A (Kabat 編號為 G100A)。
在本文提供的任一方面，抗 Notch2 抗體為人源化抗體。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體進一步包含受體人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共通骨架。在一些態樣中，該抗 Notch2 抗體包含 VH，該 VH 包含SEQ ID NO: 92 之 FR1 序列；SEQ ID NO: 93 或 94 之 FR2 序列；SEQ ID NO: 95、96 或 109 之 FR3 序列；及/或 SEQ ID NO: 97 之 FR4 序列。在一些態樣中，該抗 Notch2 抗體包含 VL，該 VL 包含SEQ ID NO: 87 之 FR1 序列；SEQ ID NO: 88 之 FR2 序列；SEQ ID NO: 89 或 90 之 FR3 序列；及/或 SEQ ID NO: 91 之 FR4 序列。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VH 域，該 VH 域包含選自以下項的一個或多個重鏈框架序列：(a) SEQ ID NO: 92 之重鏈框架區域 1 (HC-FR1)；(b) SEQ ID NO: 93 或 94 之重鏈框架區域 2 (HC-FR2)；(c) SEQ ID NO: 95、96 或 109 之重鏈框架區域 3 (HC-FR3)；及 (d) SEQ ID NO: 97 之重鏈框架區域 4 (HC-FR4)。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VH 域，該 VH 域包含 SEQ ID NO: 92 之 HC-FR1。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VH 域，該 VH 域包含 SEQ ID NO: 93 或 94 之 HC-FR2。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VH 域，該 VH 域包含 SEQ ID NO: 95、96 或 109 之 HC-FR3。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VH 域，該 VH 域包含 SEQ ID NO: 97 之 HC-FR4。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VH 域，該 VH 域包含 HC-FR1，該 HC-FR1 與 SEQ ID NO: 92 具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域包含 HC-FR1，該 HC-FR1 與 SEQ ID NO: 92 具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域包含 HC-FR1，該 HC-FR1 與 SEQ ID NO: 92 具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VH 域，該 VH 域包含 HC-FR2，該 HC-FR2 與 SEQ ID NO: 93 或 94 具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域包含 HC-FR2，該 HC-FR2 與 SEQ ID NO: 93 或 94 具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域包含 HC-FR2，該 HC-FR2 與 SEQ ID NO: 93 或 94 具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VH 域，該 VH 域包含 HC-FR3，該 HC-FR3 與 SEQ ID NO: 95、96 或 109 具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域包含 HC-FR3，該 HC-FR3 與 SEQ ID NO: 95、96 或 109 具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域包含 HC-FR3，該 HC-FR3 與 SEQ ID NO: 95、96 或 109 具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VH 域，該 VH 域包含 HC-FR4，該 HC-FR4 與 SEQ ID NO: 97 具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域包含 HC-FR4，該 HC-FR4 與 SEQ ID NO: 97 具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域包含 HC-FR4，該 HC-FR4 與 SEQ ID NO: 97 具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VL 域，該 VL 域包含選自以下項的一個或多個輕鏈框架工作序列：(a) SEQ ID NO: 87 之輕鏈框架工作區域 1 (LC-FR1)；(b) SEQ ID NO: 88 之輕鏈框架工作區域 2 (LC-FR2)；(c) SEQ ID NO: 89 或 90 之輕鏈框架工作區域 3 (LC-FR3)；及 (d) SEQ ID NO: 91 之輕鏈框架工作區域 4 (LC-FR4)。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VL 域，該 VL 域包含 SEQ ID NO: 87 之 LC-FR1。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VL 域，該 VL 域包含 SEQ ID NO: 88 之 LC-FR2。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VL 域，該 VL 域包含 SEQ ID NO: 89 或 90 之 LC-FR3。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VL 域，該 VL 域包含 SEQ ID NO: 91 之 LC-FR4。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VL 域，該 VL 域包含 LC-FR1，該 LC-FR1 與 SEQ ID NO: 87 具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域包含 LC-FR1，該 LC-FR1 與 SEQ ID NO: 87 具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域包含 LC-FR1，該 LC-FR1 與 SEQ ID NO: 87 具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VL 域，該 VL 域包含 LC-FR2，該 LC-FR2 與 SEQ ID NO: 88 具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域包含 LC-FR2，該 LC-FR2 與 SEQ ID NO: 88 具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域包含 LC-FR2，該 LC-FR2 與 SEQ ID NO: 88 具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VL 域，該 VL 域包含 LC-FR3，該 LC-FR3 與 SEQ ID NO: 89 或 90 具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域包含 LC-FR3，該 LC-FR3 與 SEQ ID NO: 89 或 90 具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域包含 LC-FR3，該 LC-FR3 與 SEQ ID NO: 89 或 90 具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 VL 域，該 VL 域包含 LC-FR4，該 LC-FR4 與 SEQ ID NO: 91 具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域包含 LC-FR1，該 LC-FR1 與 SEQ ID NO: 91 具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域包含 LC-FR1，該 LC-FR1 與 SEQ ID NO: 91 具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 的一個或多個 CDR 序列。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 的一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 的 CDR 序列及 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 的 CDR 序列。
在又一態樣中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之 胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之 胺基酸序列；及 VH 域，該 VH 域與 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；及 VL 域，該 VL 域與 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之 胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之 胺基酸序列；及 VH 域，該 VH 域與 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；及 VL 域，該 VL 域與 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；其中該抗體與 Notch2 特異性結合。在一些態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，該抗體與 Notch2 結合的解離常數 (K D) 相比於包含 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該 VH 序列與 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該 VH 序列與 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在某些方面，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 Notch2 抗體保留與 Notch2 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 中之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列。在一些態樣中，提供了一種抗 Notch2 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，該 VL 序列與 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，該 VL 序列與 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在某些方面，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 Notch2 抗體保留與 Notch2 結合之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 中之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 1；(b) CDR-L2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 2；及 (c) CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 3。
在一些態樣中，提供了一種抗 Notch2 抗體，其中該抗體包含上文提供之任一態樣中的 VH 序列及上文提供之任一態樣中的 VL 序列。在一些態樣中，該抗體分別包含 SEQ ID NO: 14、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30 或 32 和 SEQ ID NO: 13、15、16、25、27、29 或 31 中之 VH 和 VL 序列，其包括彼等序列之轉譯後修飾。
在某些態樣中，提供了一種與抗 Notch2 抗體結合至同一表位的抗體，其包含 SEQ ID NO: 32 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 31 之 VL 序列。在某些態樣中，提供了一種抗 Notch2 抗體，該抗體結合 Notch2 之 EGF7 重複序列中的表位。在一些實施例中，提供了一種抗 Notch2 抗體，該抗體結合 Notch2 之胺基酸 260 至 296 (SEQ ID NO: 70) 中的表位。在一些實施例中，提供了一種抗 Notch2 抗體，該抗體結合 Notch2 之胺基酸 260 至 296 (SEQ ID NO: 70) 中的表位。
在某些態樣中，提供了一種與抗 Notch2 抗體競爭與 Notch2 結合的抗體，其包含 SEQ ID NO: 32 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 31 之 VL 序列。
在一些實施例中，抗 Notch2 抗體為 Fab，其中 Fab 輕鏈包含 SEQ ID NO: 107 之胺基酸序列且 Fab 重鏈包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。 包含抗體 3107 的一個或多個 CDR 之抗體
在一些態樣中，本發明提供了一種抗 Notch2 抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列。在又一態樣中，該抗體抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 38, CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 35；及 CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 37。在又一態樣中，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 36；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 37；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 38。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含 (a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列；及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 40 之 VH 的一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 39 之 VL 的一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 40 之 VH 的 CDR 序列及 SEQ ID NO: 39 之 VL 的 CDR 序列。
在又一態樣中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 40 之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 39 之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 40 之 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自 SEQ ID NO: 40 及 101 至 106 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 40 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自 SEQ ID NO: 40 及 101 至 106 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 40 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自 SEQ ID NO: 40 及 101 至 106 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 40 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自 SEQ ID NO: 40 及 101 至 106 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 39 之 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自 SEQ ID NO: 39 及 98 至 100 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 39 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自 SEQ ID NO: 39及 98 至 100 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 39 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自 SEQ ID NO: 39 及 98 至 100 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 39 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自 SEQ ID NO: 39 及 98 至 100 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；及 VH 域，該 VH 域与選自 SEQ ID NO: 40 和 101 至 106 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；及 VL 域，該 VL 域與選自 SEQ ID NO: 39 和 98 至 100 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域與選自 SEQ ID NO: 40 和 101 至 106 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域與選自 SEQ ID NO: 39 和 98 至 100 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；及 VH 域，該 VH 域与選自 SEQ ID NO: 40 和 101 至 106 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；及 VL 域，該 VL 域與選自 SEQ ID NO: 39 和 98 至 100 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；其中該抗體與 Notch2 特異性結合。在一些態樣中，VH 域與選自 SEQ ID NO: 40 和 101 至 106 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域與選自 SEQ ID NO: 39 和 98 至 100 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，該抗體與 Notch2 結合的解離常數 (K D) 相比於包含 SEQ ID NO: 40 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 39 之 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該 VH 序列與選自 SEQ ID NO: 40 和 101 至 106 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該 VH 序列與選自 SEQ ID NO: 40 和 101 至 106 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在某些方面，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 Notch2 抗體保留與 Notch2 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 40 和 101 至 106 中之任一者，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Notch2 抗體包含選自 SEQ ID NO: 40 及 101 至 106 之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 36；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 37；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 38。
在一些態樣中，提供了一種抗 Notch2 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，該 VL 序列與選自 SEQ ID NO: 39 和 98 至 100 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，該 VL 序列與選自 SEQ ID NO: 39 和 98 至 100 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在某些方面，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 Notch2 抗體保留與 Notch2 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 39 和 98 至 100 中之任一者，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Notch2 抗體包含選自 SEQ ID NO: 39 及 98 至 100 之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 33；(b) CDR-L2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 34；及 (c) CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 35。
在一些態樣中，提供了一種抗 Notch2 抗體，其中該抗體包含上文提供之任一態樣中的 VH 序列及上文提供之任一態樣中的 VL 序列。在一些態樣中，該抗體分別包含 SEQ ID NO: 40 和 SEQ ID NO: 39 中之 VH 和 VL 序列，其包括彼等序列之轉譯後修飾。在一些態樣中，該抗體包含選自SEQ ID NO: 101 至 106 之 VH 序列及選自SEQ ID NO: 98 至 100 之 VL 序列，其包括彼等序列之轉譯後修飾。 包含抗體 2338 的一個或多個 CDR 之抗體
在一些態樣中，本發明提供了一種抗 Notch2 抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列。在又一態樣中，該抗體抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 46, CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 43；及 CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 45。在又一態樣中，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 44；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 45；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 46。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含 (a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列；及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列；(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 48 之 VH 的一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 47 之 VL 的一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 48 之 VH 的 CDR 序列及 SEQ ID NO: 47 之 VL 的 CDR 序列。
在又一態樣中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 48 之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 47 之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 48 之 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 48 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 48 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 48 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 48 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 48 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 48 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 48 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 47 之 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 47 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 47 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 47 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 47 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 47 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 47 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 47 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列；及 VH 域，該 VH 域與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；及 VL 域，該 VL 域與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列；及 VH 域，該 VH 域與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；及 VL 域，該 VL 域與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；其中該抗體與 Notch2 特異性結合。在一些態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，該抗體與 Notch2 結合的解離常數 (K D) 相比於包含 SEQ ID NO: 48 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 47 之 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該 VH 序列與 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該 VH 序列與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在某些方面，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 Notch2 抗體保留與 Notch2 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 48 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 48 中之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 44；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 45；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 46。在一些態樣中，提供了一種抗 Notch2 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，該 VL 序列與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，該 VL 序列與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在某些方面，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 Notch2 抗體保留與 Notch2 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 47 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 47 中之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 41；(b) CDR-L2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 42；及 (c) CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 43。
在一些態樣中，提供了一種抗 Notch2 抗體，其中該抗體包含上文提供之任一態樣中的 VH 序列及上文提供之任一態樣中的 VL 序列。在一些態樣中，該抗體分別包含 SEQ ID NO: 48 和 SEQ ID NO: 47 中之 VH 和 VL 序列，其包括彼等序列之轉譯後修飾。 包含抗體 2430 的一個或多個 CDR 之抗體
在一些態樣中，本發明提供了一種抗 Notch2 抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列。在又一態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列；CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列；及 CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。在又一態樣中，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 53；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 54；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 55。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含 (a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列；及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 58 之 VH 的一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 的一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 58 之 VH 的 CDR 序列及 SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 的 CDR 序列。
在又一態樣中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 58 之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 58 之 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 58 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 58 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 58 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 58 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 58 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 58 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 58 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列；及 VH 域，該 VH 域與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；及 VL 域，該 VL 域與 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列；及 VH 域，該 VH 域與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；及 VL 域，該 VL 域與 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；其中該抗體與 Notch2 特異性結合。在一些態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，該抗體與 Notch2 結合的解離常數 (K D) 相比於包含 SEQ ID NO: 58 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 56 或 57 之 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該 VH 序列與 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該 VH 序列與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在某些方面，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 Notch2 抗體保留與 Notch2 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 58 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 58 中之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 53；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 54；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 55。在一些態樣中，提供了一種抗 Notch2 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，該 VL 序列與 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，該 VL 序列與 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在某些方面，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 Notch2 抗體保留與 Notch2 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 56 或 57 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 56 或 57 中之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列。
在一些態樣中，提供了一種抗 Notch2 抗體，其中該抗體包含上文提供之任一態樣中的 VH 序列及上文提供之任一態樣中的 VL 序列。在一些態樣中，該抗體分別包含 SEQ ID NO: 58 和 SEQ ID NO: 56 或 57 中之 VH 和 VL 序列，其包括彼等序列之轉譯後修飾。 包含抗體 2621 的一個或多個 CDR 之抗體
在一些態樣中，本發明提供了一種抗 Notch2 抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列。在又一態樣中，該抗體抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 64, CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 61；及 CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 63。在又一態樣中，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 62；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 63；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 64。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列。在一些態樣中，該抗體包含 (a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列；及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自以下項的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種抗體，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 66 之 VH 的一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 65 之 VL 的一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 66 之 VH 的 CDR 序列及 SEQ ID NO: 65 之 VL 的 CDR 序列。
在又一態樣中，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 66 之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 65 之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 66 之 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 66 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 66 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 66 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 66 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 66 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 66 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 66 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 65 之 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 65 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 65 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 65 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 65 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 65 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：SEQ ID NO: 65 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 65 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列；及 VH 域，該 VH 域與 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；及 VL 域，該 VL 域與 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列；及 VH 域，該 VH 域與 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；及 VL 域，該 VL 域與 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性；其中該抗體與 Notch2 特異性結合。在一些態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在一些態樣中，該抗體與 Notch2 結合的解離常數 (K D) 相比於包含 SEQ ID NO: 66 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 65 之 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該 VH 序列與 SEQ ID NO:66 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該 VH 序列與 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在某些方面，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 Notch2 抗體保留與 Notch2 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 66 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 66 中之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 62；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 63；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 64。在一些態樣中，提供了一種抗 Notch2 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，該 VL 序列與 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，該 VL 序列與 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性。在某些方面，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 Notch2 抗體保留與 Notch2 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 65 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 Notch2 抗體包含 SEQ ID NO: 65 中之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 59；(b) CDR-L2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 60；及 (c) CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 61。
在一些態樣中，提供了一種抗 Notch2 抗體，其中該抗體包含上文提供之任一態樣中的 VH 序列及上文提供之任一態樣中的 VL 序列。在一些態樣中，該抗體分別包含 SEQ ID NO: 66 和 SEQ ID NO: 65 中之 VH 和 VL 序列，其包括彼等序列之轉譯後修飾。
在又一態樣中，本發明提供了一種與本文提供之抗 Notch2 抗體結合至同一表位的抗體。在又一態樣中，本發明提供了一種與本文提供之抗 Notch2 抗體競爭結合至 Notch2 的抗體。
在本發明的又一態樣中，根據任一上述態樣之抗 Notch2 抗體為單株抗體，包括嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。在一些態樣中，抗 Notch2 抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體或 F(ab’) 2片段。在一些態樣中，該抗體為全長抗體，例如本文所定義之完整 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 抗體或其他抗體類別或同型。
在又一態樣中，如以下 1-8 部分所述，根據任一上述態樣之抗 Notch2 抗體可單獨或組合地結合任何特徵： 1. 抗體親和力
在某些方面，本文提供之抗體具有的解離常數 (K D) 是 ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或 ≤ 0.001 nM (例如 10 -8M 或更小，例如 10 -8M 之 10 -13M，例如 10 -9M 之 10 -13M)。
在一些態樣中，使用 BIACORE ®表面電漿共振測定法測得 K D。例如，使用 BIACORE ®-2000 或 BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway，NJ) 於 25℃ 用固定化抗原 CM5 晶片以 ~10 反應單位 (RU) 進行檢定。在一些態樣中，根據供應商的說明，用 N-乙基- N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC) 和 N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 活化羧甲基化葡聚醣生物感測器晶片 (CM5，BIACORE, Inc.)。用 10 mM 醋酸鈉 (pH 4.8) 將抗原稀釋至 5 μg/ml (約 0.2 μM)，然後以 5 μl/分鐘的流速注入，以獲得大約 10 反應單位 (RU) 的偶合蛋白。注入抗原後，注入 1 M 乙醇胺以封閉未反應的基團。在動力學測量中，將 Fab 之兩倍連續稀釋液 (0.78 nM 至 500 nM) 在 25°C 下以約 25 μl/min 的流速注入含 0.05% 聚山梨糖醇酯 20 (TWEEN-20 TM) 界面活性劑 (PBST) 的 PBS 中。藉由同時擬合締合和解離感測圖，使用簡單的一比一 (1:1) Langmuir 結合模型 (BIACORE ®評估軟體 3.2 版) 計算締合速率 (k on) 和解離速率 (k off)。平衡解離常數 (K D) 藉由 k off/k on比率計算得出。參閱，例如，Chen 等人， J. Mol. Biol.293:865-881 (1999)。
在另一個使用 BIAcore™ T200 機器的例示性測定中，例如，在蛋白 A 晶片上捕獲具有人 IgG1 恆定區的抗體，以達到約 300 RU。在一些此類實施例中，將純化抗原的連續稀釋液在 37℃ 下以 100 μL/min 的流速注入含另外 3 mM CaCl 2的HBS-P緩衝液中。使用 1:1 Langmuir 結合模型 (例如 BIAcore™ T200 評估軟體 2.0 版) 計算締合速率 (ka) 和解離速率 (kd)。平衡解離常數 (K D) 可通過比率 kd/ka 計算得出。
如果藉由表面電漿共振測定法測得的締合速率 (on-rate) 超過 10 6M -1s -1，則可以使用螢光淬滅技術確定締合速率，該技術可測量 25°C 下 PBS (pH 7.2) 中的 20 nM 抗原抗體 (Fab 形式) 在存在濃度升高的抗原的情況下螢光發射強度的增加或減少 (激發波長 = 295 nm；發射波長 = 340 nm，帶通 16 nm)，該抗原濃度可藉由分光光度計諸如停流分光光度計 (Aviv Instruments) 或帶有攪拌比色皿的 8000 系列 SLM-AMINCO TM分光光度計 (ThermoSpectronic) 測得。
在另一種方法中，K D通過放射性標記的抗原結合測定 (RIA) 進行測量。在一些態樣中，使用目標抗體及其抗原之 Fab 型式執行 RIA。例如，藉由在連續系列未標記的抗原存在下用最小濃度的 ( 125I) 標記的抗原平衡 Fab，然後用抗 Fab 抗體塗覆的板捕獲結合的抗原，來測量 Fab 對抗原的溶液結合親和力 (參見例如 Chen 等人， J. Mol. Biol.293:865-881(1999))。為確定測定的條件，用溶於 50 mM 碳酸鈉 (pH 9.6) 中的 5 μg/ml 捕獲抗 Fab 抗體 (Cappel Labs) 將 MICROTITER ®多孔板 (Thermo Scientific) 包被隔夜，且隨後用溶於 PBS 中的 2% (w/v) 牛血清白蛋白在室溫 (約 23°C) 下將其阻斷。在非吸附板 (Nunc #269620) 中，將 100 pM 或 26 pM [ 125I]-抗原與所關注 Fab 的系列稀釋液混合 (例如，與 Presta 等人在 Cancer Res.57: 4593-4599 (1997) 中所述之抗 VEGF 抗體 Fab-12 的評估結果一致)。然後將所關注 Fab 過夜孵育；但是，可繼續孵育更長時間 (例如約 65 小時)，以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕獲板上，在室溫下進行孵育 (例如，孵育 1 小時)。然後除去溶液，用溶於 PBS 中的 0.1% 聚山梨糖醇酯 20 (TWEEN-20 ®) 將板洗滌八次。當板乾燥後，將閃爍劑 (MICROSCINT-20 TM；Packard) 以 150 μl/孔的量加入，並利用 TOPCOUNT TM伽瑪計數器 (Packard) 進行 10 分鐘計數。選擇提供小於或等於最大結合濃度的 20% 的各種 Fab 的濃度以用於競爭性結合測定中。 2. 抗體片段
在某些態樣中，本文提供之抗體為抗體片段。
在一些態樣中，抗體片段為 Fab、Fab’、Fab’-SH 或 F(ab’) 2片段，特別是 Fab 片段。木瓜酶對完整抗體之消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自包含重鏈和輕鏈可變域 (分別為 VH 和 VL) 及輕鏈之恆定域 (CL) 和重鏈之第一恆定域 (CH1)。因此，術語「Fab 片段」係指包含輕鏈 (包含 VL 域和 CL 域) 及重鏈片段 (包含 VH 域和 CH1 域) 之抗體片段。「Fab’ 片段」與 Fab 片段的區別在於在 CH1 域的羧基末端增加了殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH 是 Fab’ 片段，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個 F(ab') 2片段，該片段具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 片段) 及一部分 Fc 區。關於包含補救受體結合抗原決定位位殘基且具有增加的 體內半衰期之 Fab 及 F(ab') 2片段的論述，參見美國專利號 5,869,046。
在一些態樣中，抗體片段為雙抗體、三抗體或四抗體。雙抗體為具有兩個抗原結合位點 (其可為二價或雙特異性的) 之抗體片段。參見例如 EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人, Nat. Med. 9:129-134 (2003)中。
在又一態樣中，抗體片段為單鏈 Fab 片段。「單鏈 Fab 片段」或「scFab」是由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體重鏈恆定域 1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成的多肽，其中該抗體域及該連接子在 N 端至 C 端方向具有以下序列之一：a) VH-CH1-連接子-VL-CL、b) VL-CL-連接子-VH-CH1、c) VH-CL-連接子-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接子-VH-CL。特定而言，該連接子為至少 30 個胺基酸且較佳地 32 至 50 個胺基酸組成之多肽。該單鏈 Fab 片段通過 CL 域與 CH1 域之間的天然雙硫鍵達到穩定。此外，這些單鏈 Fab 片段可通過插入半胱胺酸殘基產生鏈間二硫鍵而得到進一步穩定 (例如，根據 Kabat 編號，在變異重鏈之位置 44 和變異輕鏈之位置 100 處插入)。
在一些態樣中，抗體片段為單鏈可變片段 (scFv)。「單鏈變異片段」 或 「scFv」 為抗體之重鏈 (VH) 和輕鏈 (VL) 的可變域之融合蛋白，其通過連接子連接。特別地，連接子為 10 個至 25 個胺基酸組成之短多肽，並且通常富含甘胺酸以提高柔韌性，並含有絲胺酸或蘇胺酸以提高溶解性，並且可將 VH 之 N 端與 VL 之 C 端連接，或反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了連接子，但是該蛋白仍保留了原始抗體的特異性。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269 頁至第 315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。
在一些態樣中，該連接子為非肽連接子。在一些態樣中，該非肽連接子為多元醇。在一些態樣中，該多元醇為多臂多元醇。在一些態樣中，該多臂多元醇為二聚體、三聚體、四聚體或六聚體。在一些態樣中，該多臂多元醇之各臂包含與抗原結合域形成琥珀醯亞胺接附的馬來醯亞胺部分。
在一些態樣中，該多臂多元醇係選自： ； ； ； ； ； ；或 ； 其中各 n 獨立地選自 1 至 50、1 至 40、1 至 30、1 至 20、1 至 15 或 1 至 10 的整數。在一些態樣中，該多臂多元醇係選自： ； ； ； ； ； ；及 。
在一些態樣中，抗體片段為單域抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些態樣中，單域抗體為人單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌) 之重組產生。 3. 嵌合和人源化抗體
在某些態樣中，本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利號 4,816,567；及 Morrison 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)。在一個實例中，嵌合抗體包含非人可變區 (例如，來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物如猴的可變區) 及人恆定區。在又一個實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類或子類相比於其親代抗體已發生變更。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些態樣中，嵌合抗體為人源化抗體。通常，非人抗體為人源化抗體以降低對人的免疫原性，同時保留親代非人抗體之特異性及親和力。通常，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中 CDR (或其部分) 來源於非人抗體，並且 FR (或其部分) 來源於人抗體序列。人源化抗體視情況將包含人恆定區之至少一部分。在一些態樣中，人源化抗體中的一些 FR 殘基經來自非人抗體 (例如衍生 CDR 殘基之抗體) 之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法綜述於例如 Almagro 和 Fransson， Front. Biosci.13:1619-1633 (2008) 中，並且進一步描述於例如：Riechmann 等人 ， Nature332:323-329 (1988)；Queen 等人， Proc. Nat’l Acad. Sci. USA86:10029-10033 (1989)；US 專利號 5,821,337、7,527,791、6,982,321 和 7,087,409；Kashmiri 等人， Methods36:25-34 (2005) (具體描述了決定區 (SDR) 接枝)；Padlan， Mol. Immunol.28:489-498 (1991) (描述了「表面重塑」)；Dall’Acqua 等人， Methods36:43-60 (2005) (描述了「FR 改組」)；Osbourn 等人， Methods36:61-68 (2005)；及 Klimka 等人， Br. J. Cancer，83:252-260 (2000) (描述了 FR 改組的「導向選擇」法)。
可以用於人源化的人框架區域包括但不限於：使用「最佳匹配」方法選擇的框架區域 (參見例如 Sims 等人 J. Immunol.151:2296 (1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共有序列的框架區域 (參見例如：Carter 等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89: 4285 (1992)；及 Presta 等人 J. Immunol.，151: 2623 (1993))；人成熟的 (體細胞突變) 框架區域或人種系框架區域 (參見例如 Almagro 和 Fransson， Front. Biosci.13: 1619-1633 (2008))；以及來源於篩選 FR 文庫的框架區域 (參見例如：Baca 等人， J. Biol. Chem.272: 10678-10684 (1997)；及 Rosok 等人， J. Biol. Chem.271: 22611-22618 (1996))。 4. 人抗體
在某些態樣中，本文提供之抗體為人抗體。可使用此領域中所公知的各種技術生產人抗體。人抗體一般性描述於：van Dijk 和 van de Winkel， Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-74 (2001)；及 Lonberg， Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008)。
可透過對轉基因動物投予免疫原來製備人抗體，該轉基因動物已被修飾以響應於抗原攻擊而產生完整的人抗體或具有人可變區的完整抗體。此等動物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合到動物的染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已被滅活。有關從轉基因動物中獲得人抗體的方法的綜述，參見 Lonberg， Nat. Biotech.23:1117-1125 (2005)。另見例如：美國專利號 6,075,181 和 6,150,584 (描述了 XENOMOUSE TM技術)；美國專利號 5,770,429 (描述了 HuMab® 技術)；美國專利號 7,041,870 (描述了 K-M MOUSE® 技術)；及美國專利申請公開號 US 2007/0061900 (描述了 VelociMouse® 技術)。由此等動物產生的來源於完整抗體的人可變區可被進一步修飾，例如透過與不同的人恆定區結合來修飾。
人抗體也可透過基於融合瘤的方法進行製備。用於生產人單株抗體的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤細胞株已有描述。(參見例如：Kozbor J. Immunol.，133: 3001 (1984)；Brodeur 等人， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp. 51-63 (Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；及 Boerner 等人， J. Immunol.，147: 86 (1991)。) 透過人 B 細胞融合瘤技術產生的人抗體也描述於 Li 等人 ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA，103:3557-3562 (2006)。其他方法包括描述於例如以下文獻中的那些：美國專利號 7,189,826 (描述了由融合瘤細胞株生產單株人 IgM 抗體)，及 Ni， Xiandai Mianyixue，26(4):265-268 (2006) (描述了人-人融合瘤)。人融合瘤技術 (Trioma 技術) 也描述於以下文獻中：Vollmers 和 Brandlein， Histology and Histopathology，20(3):927-937 (2005)；及 Vollmers 和 Brandlein， Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3):185-91 (2005)。
人抗體也可以藉由分離選自人源性噬菌體展示文庫的可變域序列來產生。然後可以將此等可變域序列與所需的人恆定域結合。下文描述了從抗體文庫中選擇人類抗體的技術。 5. 來源於文庫之抗體
在某些方面，本文提供之抗體來源於文庫。用於本發明之抗體可透過篩選組合文庫中具有所需之一種或多種活性的抗體來分離。例如，用於篩選組合文庫的方法綜述於例如 Lerner 等人的 Nature Reviews16:498-508 (2016)。例如，此領域中所公知的多種方法用於產生噬菌體展示庫並篩選此等庫中具有所需之結合特性的抗體。此等方法綜述於以下文獻中：Frenzel 等人的 mAbs8:1177-1194 (2016)；Bazan 等人的 Human Vaccines and Immunotherapeutics8:1817-1828 (2012)；及 Zhao 等人的 Critical Reviews in Biotechnology36:276-289 (2016)；以及 Hoogenboom 等人的 Methods in Molecular Biology178:1-37 (O’Brien 等人主編，Human Press，Totowa，NJ，2001)；及 Marks 和 Bradbury 的 Methods in Molecular Biology248:161-175 (Lo 主編，Human Press，Totowa，NJ，2003)。
在某些噬菌體展示方法中，透過聚合酶鏈反應 (PCR) 分別克隆 VH 和 VL 基因庫，並在噬菌體文庫中隨機重組，然後可按照以下文獻所述之方法篩選抗原結合噬菌體：Winter 等人， Annual Review of Immunology12: 433-455 (1994)。噬菌體通常以單鏈 Fv (scFv) 片段或 Fab 片段展示抗體片段。來自免疫源的文庫無需構建融合瘤即可向免疫原提供高親和性抗體。可替代地，可以在不進行任何免疫的情況下選殖天然譜系 (例如，來自人) 以向各種非自身以及自身抗原提供抗體的單一來源，如 Griffiths 等人在 EMBO Journal12: 725-734 (1993) 中所述。最後，還可以透過克隆幹細胞中未重排的 V 基因片段，並使用包含隨機序列的 PCR 引物來編碼高變異性 CDR3 區域並在體外完成重排，由此合成天然文庫，如 Hoogenboom 和 Winter 在 Journal of Molecular Biology227: 381-388 (1992) 中所述。描述人抗體噬菌體庫的專利公開包括例如：美國專利號 5,750,373、7,985,840、7,785,903 及 8,679,490；以及美國專利公開號 2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764 及 2007/0292936。
用於篩選組合文庫中具有所需活性之抗體的此領域中所公知方法的其他實例包括核醣體和 mRNA 展示以及用於細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞上的抗體展示和選擇的方法。酵母表面展示方法綜述於例如 Scholler 等人的 Methods in Molecular Biology503:135-56 (2012)、及 Cherf 等人的 Methods in Molecular biology1319:155-175 (2015) 以及 Zhao 等人的 Methods in Molecular Biology889:73-84 (2012) 中。於核醣體展示方法描述於例如 He 等人的 Nucleic Acids Research25:5132-5134 (1997) 及 Hanes 等人的 PNAS94:4937-4942 (1997) 中。
從人抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中被視作人抗體或人抗體片段。 6. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點 (即不同抗原上之不同抗原決定位位或同一抗原上之不同抗原決定位) 具有結合特異性的單株抗體。在某些態樣中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。在某些態樣中，結合特異性之一為對 Notch2 的結合特異性，而其他特異性則為針對任何其他抗原。在某些態樣中，雙特異性抗體可與 Notch2 的兩個 (或更多個) 不同表位結合。多特異性 (例如，雙特異性) 抗體也可用於將細胞毒性劑或細胞定位於表現 Notch2 之細胞。多特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。
用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對 (參見 Milstein 和 Cuello， Nature305: 537 (1983)) 和「杵臼」(knob-in-hole) 工程 (參見例如美國專利號 5,731,168，及 Atwell 等人 J. Mol. Biol. 270:26 (1997))。多特異性抗體也可透過以下方法進行製備：用於製備抗體 Fc-異二聚體分子的工程改造靜電轉向效應 (參見例如 WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段 (參見例如美國專利號 4,676,980；及 Brennan 等人 ， Science，229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體 (參見例如 Kostelny 等人， J. Immunol.，148(5):1547-1553 (1992)；及 WO 2011/034605)；使用常用輕鏈技術規避輕鏈錯配問題 (參見例如 WO 98/50431)；使用「雙抗體」技術製備雙特異性抗體片段 (參見例如，Hollinger 等人 ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體 (參見例如 Gruber 等人 ， J. Immunol., 152:5368 (1994))；以及按照例如 Tutt 等人 J. Immunol.147: 60 (1991) 所述的製備三特異性抗體。
本文還包括具有三個或更多個抗原結合位點之工程化抗體，包括例如「章魚抗體」(Octopus antibodies) 或 DVD-Ig (參見例如 WO 2001/77342 及 WO 2008/024715)。具有三個或更多個抗原結合位點之多特異性抗體的其他實例可參見 WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792 及 WO 2013/026831 中。雙特異性抗體或其抗原結合片段還包括「雙重作用 FAb」或「DAF」，其包含與 Notch2 以及另一種不同抗原或 Notch2 的兩個不同表位結合之抗原結合位點 (參見例如 US 2008/0069820 及 WO 2015/095539)。
多特異性抗體也可提供為不對稱形式，其包含在一個或多個具有相同抗原特異性之結合臂中交叉的域，即透過交換 VH/VL 域 (參見例如 WO 2009/080252 及 WO 2015/150447)、CH1/CL 域 (參見例如 WO 2009/080253) 或完整的 Fab 臂 (參見例如 WO 2009/080251、WO 2016/016299，另見 Schaefer 等人，PNAS，108 (2011) 1187-1191，及 Klein 等人，MAbs 8 (2016) 1010-20) 實現。在一些態樣中，多特異性抗體包含 cross-Fab 片段。術語「cross-Fab 片段」或「xFab 片段」或「交叉 Fab 片段」 是指其中重鏈和輕鏈之可變區或恆定區發生交換的 Fab 片段。cross-Fab 片段包含由輕鏈可變區 (VL) 和重鏈恆定區 1 (CH1) 構成之多肽鏈以及由重鏈可變區 (VH) 和輕鏈恆定區 (CL) 構成之多肽鏈。還可透過將帶電荷或不帶電荷之胺基酸突變引入域界面引導正確 Fab 配對，從而設計不對稱之 Fab 臂。參見例如 WO 2016/172485。
用於多特異性抗體之各種其他分子形式為本技術領域中已知的並且包括在本文中 (參見例如 Spiess 等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。
還包括於本文中的特定類型之多特異性抗體為雙特異性抗體，該雙特異性抗體被設計為同時結合至標靶細胞 (例如腫瘤細胞) 上之表面抗原以及 T 細胞受體 (TCR) 之活化不變組分 (例如 CD3) 複合物，用於重定向 T 細胞以殺死標靶細胞。因此，在某些態樣中，本文中提供之抗體為多特異性抗體，特定而言雙特異性抗體，其中，結合特異性中的一種針對 Notch2，且另一種則針對 CD3。
可用於此目的之雙特異性抗體形式包括但不限於所謂「BiTE」(bispecific T cell engager) 分子，其中，兩個 scFv 分子透過柔性連接子融合 (參見例如 WO 2004/106381、WO 2005/061547、WO 2007/042261 及 WO 2008/119567；Nagorsen 和 Bäuerle，Exp Cell Res 317，1255-1260 (2011))；雙抗體 (Holliger 等人，Prot Eng 9，299-305 (1996)) 及其衍生物，諸如串聯雙抗體 (「TandAb」；Kipriyanov 等人，J Mol Biol 293，41-56 (1999))；「DART」(雙親和性重定位) 分子，其基於雙抗體形式，但具有 C 端二硫鍵以供進一步穩定 (Johnson 等人，J Mol Biol 399，436-449 (2010))，以及所謂 triomab，它們為完整的小鼠/大鼠 IgG 雜合分子 (參見 Seimetz 等人的綜述：Cancer Treat Rev 36，458-467 (2010))。本文所包括之特定 T 細胞雙特異性抗體形式描述於：WO 2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；及 Bacac 等人 Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498。 7. 抗體變異體
在某些態樣中，考慮到本文提供之抗體的胺基酸序列變異體。例如，可能希望改變抗體的結合親和力及/或其他生物學特性。可藉由將適當的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵，例如抗原結合特徵。 a) 取代、插入和刪除變異體
在某些態樣中，提供了具有一個或多個胺基酸取代的抗體變異體。取代誘變的目標位點包括 CDR 和 FR。保守取代列於表 1 之「優選取代」標題下。表 1 中之「例示性取代」標題下提供了更多實質性變更，並且下文將參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。可將胺基酸取代引入目標抗體中，並篩選具有所需活性之產物，例如，保留/改善的抗原結合特徵、降低的免疫原性或改善的 ADCC 或 CDC。 表 1
原始 殘基 例示性 取代 較佳 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
一種類型的取代變異體涉及取代一個或多個親代抗體 (例如，人源化或人抗體) 之高度可變區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變異體將相對於親代抗體在某些生物學特性 (例如提高親和性、降低免疫原性) 上具有修飾 (例如，改善) 及/或基本上保留親代抗體之某些生物學特性。例示性取代變異體是親和性成熟的抗體，其可以方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和性成熟技術，例如本文所述的那些。簡而言之，取代一個或多個。CDR 殘基發生突變，並且變異體抗體在噬菌體上展示並篩選出特定的生物學活性 (例如，結合親和性)。
可以在 CDR 中進行更改 (例如，取代)，以改善抗體親和性。此等修改可以在 CDR 「熱點」中進行，即由密碼子編碼的殘基在體細胞成熟過程中經歷發生突變 (參見例如 Chowdhury， Methods Mol. Biol.207: 179-196 (2008)) 及/或與抗原接觸的殘基，並測試所得變異體 VH 或 VL 之結合親和性。藉由構築二級文庫且自其中重新選擇以實現親和力成熟已描述於例如 Hoogenboom 等人 Methods in Molecular Biology178:1-37 (O’Brien 等人編, Human Press, Totowa, NJ, (2001)) 中。在親和性成熟之某些態樣中，通過多種方法 (例如，易錯 PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變) 將多樣性引入選擇用於成熟的變異基因中。然後創建第二文庫。然後篩選該文庫，以識別具有所需之親和性的任何抗體變異體。引入多樣性的另一種方法是 CDR 定向方法，其中將若干 CDR 殘基 (例如，每次 4-6 個殘基) 隨機化。可通過例如丙胺酸掃描誘變或建模以特異性識別參與抗原結合的 CDR 殘基。特別地，CDR-H3 和 CDR-L3 經常成為靶點。
在某些態樣中，在一個或多個 CDR 內可能發生取代、插入或缺失，只要此等修改不顯著降低抗體以結合抗原的能力即可。例如，可在 CDR 中實施基本上不降低結合親和力的保留式修改 (例如，本文所提供之保留取代)。例如，此等修改可能在 CDR 中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之某些 VH 和 VL 序列變異體中，每個 CDR 均未改變，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
如 Cunningham 和 Wells (1989) ( Science，244:1081-1085) 所述，用於識別可能誘變的抗體殘基或區域的一種有用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在該方法中，識別殘基或目標殘基組 (例如，帶電荷的殘基，如 arg、asp、his、lys 和 glu)，並用中性或帶負電荷的胺基酸 (例如，丙胺酸或聚丙胺酸) 取代以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在胺基酸位置引入更多取代，表明對初始取代具有良好的功能敏感性。可替代地或另外地，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基和鄰近殘基可靶向或消除為取代的候選物。可篩選變異體以確定它們是否含有所需之特性。
胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子之其他插入變異體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酶 (例如，對於 ADEPT (針對抗體之酶前藥治療)) 或提高抗體血清半衰期之多肽。 b) 醣基化變異體
在某些態樣中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體發生醣基化之程度。抗體中添加或缺失醣基化位點可透過改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地實現。
當抗體包含 Fc 區域時，可改變與其相連的寡糖。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，該寡醣通常藉由 N-鍵聯附接至 Fc 區之 CH2 域的 Asn297。例如參見 Wright 等人， TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露醣、N-乙醯基葡醣胺 (GlcNAc)、半乳醣及唾液酸以及在雙觸角寡醣結構之「莖」中附接至 GlcNAc 的岩藻醣。在一些態樣中，可對本發明之抗體中的寡醣進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變異體。
在一些態樣中，提供了具有非岩藻醣基化寡糖，即缺少 (直接或間接地) 連接至 Fc 區域之岩藻醣的寡糖結構的抗體變異體。此等非岩藻醣基化寡醣 (也稱為「去岩藻醣基化」寡醣) 特定而言在雙天線型寡醣結構的莖中缺少與第一 GlcNAc 連接之岩藻醣殘基的 N-連接寡醣。在一些態樣中，提供了與天然或親本抗體相比在 Fc 區域中具有增加比例的非岩藻醣基化寡糖的抗體變異體。例如，非岩藻醣基化寡醣的比例可以為至少約 20%、至少約 40%、至少約 60%、至少約 80% 或甚至約 100% (即不存在岩藻醣基化寡醣)。非岩藻醣基化寡糖之百分比是缺少岩藻糖殘基之寡糖相對於連接至 Asn 297 (例如復合物、雜合和高甘露糖結構) 的所有寡糖的總和之 (平均) 量，該百分比透過 MALDI-TOF 質譜法測得，例如 WO 2006/082515 中所述。Asn297 係指位於 Fc 區域位置 297 附近之天冬醯胺酸殘基 (Fc 區域殘基的 EU 編號)；但是，Asn297 也可以位於位置 297 上游或下游大約 ±3 個胺基酸處，即由於抗體之微小序列變化而介於位置 294 和 300 之間。此等在 Fc 區域中具有增加的比例的非岩藻醣基化寡糖的抗體可具有改善的 FcγRIIIa 受體結合及/或改善的效應功能，特定而言改善的 ADCC 功能。參見例如 US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠產生具有減少的岩藻醣基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人， Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及 WO 2004/056312，尤其是在實例 11 中)；和敲除細胞株，諸如敲除 α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因 FUT8的 CHO 細胞 (參見例如 Yamane-Ohnuki 等人 Biotech. Bioeng.87:614-622 (2004)；Kanda, Y. 等人 , Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及 WO 2003/085107)；或 GDP-岩藻糖合成或轉運蛋白活性降低或消失的細胞 (參見例如 US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在又一態樣中，抗體變異體被提供有二等分之寡醣，例如，其中連接至抗體之 Fc 區域的雙天線型寡醣被 GlcNAc 平分。此等抗體變異體可具有如上所述之減少的岩藻醣基化及/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變異體之實例描述於例如：Umana 等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)；Ferrara 等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。
亦提供了在寡醣上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變異體。此等抗體變異體可具有改善的 CDC 功能。此等抗體變異體描述於例如 WO 1997/30087、WO 1998/58964 及 WO 1999/22764 中。 c) Fc 區域變異體
在某些態樣中，可在本文所提供之抗體的 Fc 區域中引入一個或多個胺基酸修飾，從而產生 Fc 區變異體。Fc 區域變異體可包含人 Fc 區域序列 (例如，人 IgG 1、IgG 2、IgG 3或 IgG 4Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如，取代)。
在某些態樣中，本發明考慮了一種具有一部分但非全部效應子功能的抗體變異體，使其成為以下應用中所需之候選抗體：其中抗體體內半衰期很重要，但某些效應子功能 (例如補體依賴性細胞毒性 (CDC) 和抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性 (ADCC)) 是不必要或有害的。可實施 活體外及/或 活體內細胞毒性測定，以確認 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。例如，可實施 Fc 受體 (FcR) 結合測定，以確保抗體缺乏 FcγR 結合 (因此可能缺乏 ADCC 活性)，但保留 FcRn 結合能力。媒介 ADCC 之初代細胞 NK 細胞僅表現 FcγRIII，而單核細胞則表現 FcγRI、FcγRII 及 FcγRIII。FcR 在造血細胞上之表現匯總於 Ravetch 和 Kinet 的論文 ( Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991)) 之第 464 頁的表 3 中。用於評估目標分子之 ADCC 活性的體外分析方法的非限制性實例描述於美國專利號 5,500,362 中 (參見例如 Hellstrom, I. 等人， Proc. Nat’l Acad. Sci. USA83: 7059-7063 (1986)) 和 Hellstrom, I 等人， Proc. Nat’l Acad. Sci. USA82: 1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見 Bruggemann, M. 等人， J. Exp. Med.166: 1351-1361 (1987))。可替代地，可採用非放射性分析方法 (參見例如用於流式細胞術之 ACTI™ 非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及 CytoTox 96 ®非放射性細胞毒性分析 (Promega, Madison, WI)。用於此等測定的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在例如 Clynes 等人在 Proc. Natl Acad. Sci. USA95: 652-656 (1998) 中公開的動物模型中在體內評估目標分子之 ADCC 活性。還可實施 C1q 結合測定以確認該抗體無法結合 C1q 並因此缺乏 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro 等人， J. Immunol. Methods202:163 (1996)；Cragg, M.S. 等人， Blood101:1045-1052 (2003)；及 Cragg, M.S. 和 M.J. Glennie， Blood103:2738-2743 (2004))。FcRn 結合和活體內清除率/半衰期測定也可使用此領域中所公知的方法進行 (參見例如 Petkova, S.B. 等人， Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929)。
效應子功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國第 6,737,056 號專利)。此等 Fc 突變體包括具有在胺基酸位置 265、269、270、297 及 327 中的兩者或更多者處的取代之 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 及 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
描述了某些與 FcR 之結合得到改善或減弱的抗體變異體。(參見例如，美國專利號 6,737,056；WO 2004/056312 及 Shields 等人， J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001)。)
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代改善了 ADCC，例如 Fc 區域的位置 298、333 及/或 334 (殘基的 EU 編號) 處之取代。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減弱了 FcγR 結合，例如 Fc 區域的位置 234 和 235 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在一些態樣中，取代為 L234A 和 L235A (LALA)。在某些態樣中，抗體變異體進一步包含 Fc 區中之 D265A 及/或 P329G，其來源於人 IgG 1Fc 區。在一些態樣中，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 和 P329G (LALA-PG)，其來源於人 IgG 1Fc 區域。參見例如 WO 2012/130831。在一些態樣中，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 和 D265A (LALA-DA)，其來源於人 IgG 1Fc 區域。
在某些態樣中，在 Fc 區域中進行修改，得到修改 ( 即改善或減少) 之 C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如美國專利號 6,194,551、WO 99/51642 及 Idusogie 等人 J. Immunol.164: 4178-4184 (2000) 所述。
具有更長半衰期並改善了與新生兒 Fc 受體 (FcRn) (其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，見 Guyer 等人 J. Immunol.117:587 (1976) 和 Kim 等人 J. Immunol.24:249 (1994)) 之結合的抗體描述於 US2005/0014934 (Hinton 等人) 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此類 Fc 變異體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變異體：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如 Fc 區域殘基 434 之取代 (參見例如美國專利號 7,371,826；Dall'Acqua, W.F. 等人，J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524)。
通過定點誘變已經識別出對小鼠 Fc-小鼠 FcRn 相互作用至關重要之 Fc 區域殘基 (參見例如，Dall’Acqua, W.F. 等人 J. Immunol 169 (2002) 5171-5180)。殘基 I253、H310、H433、N434 和 H435 (EU 索引編號) 參與相互作用 (Medesan, C. 等人，Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533；Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542)。已發現殘基 I253、H310 和 H435 對於人 Fc 與小鼠 FcRn 之相互作用至關重要 (Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819)。對人 Fc-人 FcRn 複合物的研究表明，殘基 I253、S254、H435 和 Y436 對於相互作用至關重要 (Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Shields, R.L. 等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。在 Yeung, Y.A. 等人 (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) 中，已經報導並研究了殘基 248 至 259 及 301 至 317 及 376 至 382 及 424 至 437 的各種突變體。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 253、及/或 310、及/或 435 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 253、310 和 435 處之胺基酸取代。在一些態樣中，取代為 Fc 區域中之 I253A、H310A 和 H435A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。參見例如 Grevys, A 等人，J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 310、及/或 433、及/或 436 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 310、433 和 436 處之胺基酸取代。在一些態樣中，取代為 Fc 區域中之 H310A、H433A 和 Y436A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。(參見例如 WO 2014/177460 Al)。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代增加 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 252、及/或 254、及/或 256 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 252、254 和 256 處之胺基酸取代。在一些態樣中，取代為 Fc 區域中之 M252Y、S254T 和 T256E，其來源於人 IgG 1Fc 區域。另參見 Duncan & Winter, Nature322:738-40 (1988)；美國專利號 5,648,260；美國專利號 5,624,821；及 WO 94/29351 涉及 Fc 區變異體的其他實例。
如本文所報導之抗體的重鏈的 C 端可以是以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。於一個優選態樣中，重鏈之 C 端是縮短的 C 端結尾 PG。在本文所報導的所有態樣中之一些態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，胺基酸位置的 EU 索引編號)。在本文所報導的所有態樣中之一些態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，胺基酸位置的 EU 索引編號)。 d) 胱胺酸工程化抗體變異體
在某些態樣中，可能希望創建半胱胺酸工程化抗體，例如 THIOMAB TM抗體，其中抗體之一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，取代殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接子-藥物部分) 結合，以形成免疫結合物，如本文進一步所述。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國專利號 7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130 或 WO 2016040856 所屬的方法產生。 8. 免疫結合物
本發明還提供了包含如本文所述之抗 Notch2 抗體的免疫結合物，其結合 (化學鍵合) 至一種或多種治療劑，例如細胞毒性劑、化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素 (例如來源於細菌、真菌、植物或動物之蛋白毒素、酶活性毒素或其片段) 或放射性同位素。
在一些態樣中，免疫結合物為抗體-藥物結合物 (ADC)，其中抗體與上述一種或多種治療劑結合。通常使用連接子將抗體連接至一種或多種治療劑。ADC 技術概述 (包括治療劑、藥物和連接子之實例) 載於 Pharmacol Review68:3-19 (2016) 中。
在一些態樣中，免疫結合物包括結合至酶活性毒素或其片段的本文所述之抗體，該酶活性毒素或其片段包括但不限於白喉 A 鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素 A 鏈 (來源於銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白 A 鏈、相思子毒素 A 鏈、莫迪素 A 鏈（modeccin A chain）、α-八疊球菌（alpha-sarcin）、油桐蛋白、香石竹毒蛋白（dianthin protein）、美洲商陸蛋白 （Phytolaca americana protein）(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜抑制因子、痲瘋樹毒蛋白（curcin）、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素（gelonin）、米托菌素（mitogellin）、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素和單端孢黴烯族毒素。
在一些態樣中，免疫結合物包含結合至放射性原子以形成放射性結合物的本文所述之抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括 At 211、I 131、I 125、Y 90、Re 186、Re 188、Sm 153、Bi 212、P 32、Pb 212及 Lu 之放射性同位素。當放射性結合物用於偵檢時，它可能包含用於閃爍顯像研究之放射性原子，例如 tc99m 或 I123，或用於核磁共振 (NMR) 成像（亦稱為磁共振成像，mri）之自旋標記物，例如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體和細胞毒性劑之複合體可使用多種雙功能蛋白偶聯劑進行製備，該雙功能蛋白偶聯劑例如 N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯 (SMCC)、亞胺基硫烷 (IT)、亞胺基酸酯的雙功能衍生物 (例如己二酸二甲酯鹽酸鹽 (HCl))、活性酯 (例如雙琥珀醯亞胺辛二酸)、醛 (例如戊二醛)、雙疊氮化合物 (例如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物 (例如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯 (例如甲苯 2,6-二異氰酸酯) 和雙活性氟化合物 (例如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如 Vitetta 等人， Science238:1098 (1987) 中所闡述進行製備。用於將放射性核苷酸結合至抗體的一種例示性螯合劑為碳-14 標記的 1-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)。參見 WO 94/11026。連接子可以為促進細胞中細胞毒性藥物釋放的「可切割連接子」。例如，可使用酸不穩定之連接子、對肽酶敏感之連接子、光不穩定之連接子、二甲基連接子或含雙硫鍵之連接子 (Chari 等人， Cancer Res.52:127-131 (1992)；美國專利第 5,208,020 號)。
本文之免疫複合體或 ADC 明確考慮但不限於此等用交聯劑製得之複合體，該交聯劑包括但不限於可商購獲得 (例如自 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL., U.S.A) 商購獲得) 之 BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC 和磺基-SMPB 以及 SVSB (琥珀醯亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)。 B. 重組方法和組成物
可使用重組方法和組成物來生產抗體，例如 US 4,816,567 中所述。對於這些方法，提供了一個或多個編碼抗體的分離之核酸。
如果是天然抗體或天然抗體片段，則需要兩個核酸，一個用於輕鏈或其片段，且另一個用於重鏈或其片段。此等核酸編碼包含 VL 之胺基酸序列及/或包含抗體的 VH 的胺基酸序列 (例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。這些核酸可以在同一表現載體上，也可以在不同表現載體上。
如果是具有異二聚體重鏈的雙特異性抗體，需要四個核酸，一個用於第一輕鏈，一個用於第一重鏈 (其包含第一異源單體 Fc 區多肽)，一個用於第二輕鏈，且一個用於第二重鏈 (其包含第二異源單體 Fc 區多肽)。這四個核酸可包含在一個或多個核酸分子或表現載體中。此等核酸編碼包含第一 VL 之胺基酸序列、及/或包含第一 VH (包括第一異源 Fc 區域) 之胺基酸序列、及/或包含第二 VL 之胺基酸序列、及/或包含第二 VH (包括抗體之第二異源 Fc 區域) 之胺基酸序列 (例如，抗體之第一及/或第二輕鏈、及/或第一及/或第二重鏈)。這些核酸可以在同一表現載體上，也可以在不同表現載體上，通常這些核酸位於兩個或三個表現載體上，即一個載體可包含一個以上的這些核酸。這些雙特異性抗體的實例是 CrossMabs (參見例如 Schaefer, W. 等人，PNAS，108 (2011) 11187-1191)。例如，異源單體重鏈之一包含所謂「杵突變」 (T366W，視情況地為 S354C 或 Y349C 之一)，且另一個包含所謂「臼突變」 (T366S、L368A 及 Y407V，以及視情況的 Y349C 或 S354C) (參見例如 Carter, P. 等人，Immunotechnol.2 (1996) 73) (根據 EU 索引編號)。
在一些態樣中，提供了編碼抗體的分離核酸，該抗體用於如本文所報導的方法中。
在一些態樣中，提供了一種製備抗 Notch2 抗體之方法，其中該方法包含在適合於表現抗體之條件下培養包含如上所述之編碼抗體的核酸的宿主細胞，並視情況自宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 回收抗體。
在重組產生抗 Notch2 抗體時，將例如上述之編碼抗體之核酸分離並插入一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此等核酸可通過常規方法 (例如，使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並序列化，或通過重組方法或化學合成進行生產。
適用於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可能在細菌中產生，特別是在無需醣基化和 Fc 效應子功能的情況下。有關抗體片段和多肽在細菌中之表現，參見例如 US 5,648,237、US 5,789,199 及 US 5,840,523。(另請參見 Charlton, K.A.，在：Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. (編輯)，Humana Press, Totowa, NJ (2003), 第 245-254 頁，其中描述了抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現後，抗體可與可溶性部分中的細菌細胞糊分離，並可經過進一步純化。
除原核生物以外，真核微生物 (如絲狀真菌或酵母菌) 也為合適的抗體編碼載體的選殖或表現宿主，包括其醣基化途徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而導致具有部分或完全人醣基化模式的抗體的產生。參見 Gerngross, T.U.，Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及 Li, H. 等人，Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215。
用於表現 (醣基化) 抗體的合適的宿主細胞也來源於多細胞生物 (無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特別是用於轉染草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 細胞。
植物細胞培養物亦可以用作宿主。參見例如 US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978 及 US 6,417,429 (描述了在轉基因植物中生產抗體的 PLANTIBODIESTM 技術)。
脊椎動物細胞也可用為宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞株。可用的哺乳動物宿主細胞株的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (如 Graham, F.L. 等人，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 中所述之 293 或 293T 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather, J.P.，Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather, J.P. 等人，Annals N.Y.Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR- CHO 細胞 (Urlaub, G. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，例如 Y0、NS0 和 Sp2/0。有關某些適用於抗體生產的哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如：Yazaki, P. 和 Wu, A.M.，Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. 主編，Humana Press，Totowa，NJ (2004)，第 255-268 頁。
在一些態樣中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。 C. 測定
可採用此領域中所習知的各種測定法對本文所提供之抗 Notch2 抗體的物理/化學性質及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。 1. 結合測定及其他測定
在一些態樣中，例如藉由諸如 ELISA、西方墨點法等已知方法，檢測本發明之抗體的抗原結合活性。
在一些態樣中，競爭測定可用於鑑別與本文提供的一種或多種抗體 rat.1B2 或其人源化型式、rat.3107、rb.2338、rb.2430 及/或 rb.2621 競爭與 Notch2 結合的抗體。在某些態樣中，此類競爭抗體與 rat.1B2 或其人源化型式、rat.3107、 rb.2338、rb.2430 及/或 rb.2621 所結合之同一表位 (例如，線性或構象表位) 結合。用於將抗原決定位映射至抗體結合的詳細例示性方法提供於 Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」 (在 Methods in Molecular Biology第 66 卷 (Humana Press, Totowa, NJ) 中)。
在例示性競爭測定中，將固定化的 Notch2 置於溶液中孵化，該溶液包含與 Notch2 結合的第一標記抗體 (例如 rat.1B2 或其人源化型式、rat.3107、 rb.2338、rb.2430 及/或 rb.2621) 及正在測試其與第一抗體競爭與 Notch2 結合的能力的第二未標記抗體。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，將固定化 Notch2 置於包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體的溶液中進行孵育。在允許第一抗體與 Notch2 結合的條件下孵化後，去除多餘的未結合抗體，並測量與固定化 Notch2 相關聯之標記物的量。如果試驗樣品中與固定化 Notch2 相關的標記物的數量相對於對照樣品而言明顯減少，則表明第二抗體正在與第一抗體競爭與 Notch2 的結合。參見 Harlow 和 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manualch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。
在例示性表位分箱測定中，表面電漿共振用於確定抗體之間的競爭。例如，使用胺偶合將第一抗體 (例如，rat.1B2 或其人源化型式、rat.3107、rb.2338、rb.2430 或 rb.2621) 固定在 SPR sensorprism CMD 200M 晶片上。分析物例如以 50 nM 注射 4 分鐘，然後第二抗體例如以 10 µg/ml 注射 4 分鐘。測定可以在 25℃ 的 HBS-T 緩衝液的電泳緩衝液 (0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.05% 表面活性劑 P20，5 mM CaCl 2) 中進行。可使用 Wasatch 分箱軟體工具 Epitope (Carterra USA) 處理分箱資料。 2. 活性測定
在一些態樣中，提供鑑別具有特定生物活性之抗 Notch2 抗體的測定法。例如，提供鑑別抑制 Jagged1 媒介之傳訊但使 DLL1 媒介之傳訊基本上完整的抗 Notch2 抗體的測定法。亦提供鑑別在活體外及/或活體內減少分泌細胞數量及/或增加纖毛細胞數量之抗 Notch2 抗體的測定法。
實例 5 中描述了鑑別抑制 Jagged1 媒介之傳訊但使 DLL1 媒介之傳訊基本上完整的抗 Notch2 抗體的非限制性例示性測定法。通常，在一些實施例中，將測試抗體添加到表現人類 Notch2 的人類細胞 (諸如細胞株 U87-MG) 的培養物中。然後使培養物與表現 Jagged1 或 DLL1 的細胞接觸。配體依賴性 Notch2 活化導致 Notch2 表現細胞中的 Notch2-ICD 易位。孵化後，對共培養的細胞進行固定並滲透，然後使之與抗 Notch2 ICD 抗體接觸。在移除未結合的抗 Notch2 ICD 抗體後，例如，使用標記的抗 Ig 抗體檢測結合的抗體。如果抗 Notch2 測試抗體抑制 Jagged1 媒介之傳訊但不抑制 DLL1 媒介之傳訊，則與表現 DLL1 的細胞的共培養將產生比與表現 Jagged1 的細胞的共培養更強的信號。
在一些實施例中，測定抗 Notch2 抗體以確定其是否減少分泌細胞數量及/或增加纖毛細胞數量。在實例 8 中描述選擇具有此活性之抗體的非限制性例示性測定法。通常，在一些實施例中，建立初級人支氣管上皮細胞 (HBEC) 的氣-液界面 (ALI) 培養物並培養數週直至它們完全分化，例如當纖毛明顯跳動時所指示。將測試抗 Notch2 抗體添加到 ALI 培養物下室中的培養基中。在約 7 天後，分析 ALI 培養物。從培養物樣品中提取 RNA 並分析指示分泌細胞 (諸如 Muc5b、Muc5ac 和 Scgb1a1) 的基因的表現。亦可通過組織學藉由固定培養物並包埋入石蠟中來分析培養物。用抗體將分泌細胞 (諸如 Muc5b) 和纖毛細胞 (諸如微管蛋白) 切片染色成標記。將用測試抗 Notch2 抗體培養的培養物與沒有用測試抗 Notch2 抗體培養的培養物進行比較，以鑑別減少分泌細胞 (諸如杯狀細胞) 數量及/或增加纖毛細胞數量的抗 Notch2 抗體。 D. 用於診斷和檢測之方法及組成物
在某些態樣中，本文提供的任何抗 Notch2 抗體均可用於檢測生物樣品中是否存在 Notch2。如本文所用的術語「檢測」，涵蓋定量或定性檢測。在某些態樣中，生物樣品包含生物流體、細胞或組織，諸如痰、分泌細胞、氣道上皮細胞、免疫細胞、肺細胞或組織、或支氣管細胞或組織。
在一些態樣中，提供了一種用於診斷或檢測方法中的抗 Notch2 抗體。在又一態樣中，提供了一種檢測生物樣品中是否存在 Notch2 的方法。在某些態樣中，該方法包括在允許抗 Notch2 抗體與 Notch2 結合的條件下使生物樣品與本文所述之抗 Notch2 抗體接觸，以及檢測抗 Notch2 抗體與 Notch2 之間是否形成複合物。此等方法可為 體外或 體內方法。在一些態樣中，使用抗 Notch2 抗體來選擇適合使用抗 Notch2 抗體進行治療的個體，例如，其中 Notch2 為用於選擇患者的生物標記。
在某些態樣中，提供了標記的抗 Notch2 抗體。標記包括但不限於直接檢測的標記或部分 (例如螢光、發色、電子緻密、化學發光和放射性標記)，以及間接檢測 (例如，透過酶促反應或分子相互作用) 的部分，例如酶或配體。例示性標記包括但不限於：放射性同位素 32P、 14C、 125I、 3H 及 131I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；玫瑰紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (美國專利號 4,737,456)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；辣根過氧化物酶 (HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前身 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶結合使用；生物素/抗生物素蛋白；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基等。 E. 醫藥組成物
在又一態樣中，提供了包含本文所提供之任何抗體的醫藥組成物，例如用於以下任何治療方法。在一些態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗體和醫藥上可接受之載劑。在一些態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗體及至少一種另外的治療劑，例如，如下所述。
藉由將具有所需純度的此類抗體與一種或多種視情況選用之醫藥上可接受之載劑 ( Remington's Pharmaceutical Sciences第 16 版，Osol, A. 主編 (1980)) 混合，來製備如本文所述抗 Notch2 抗體的呈凍乾組成物或水溶液形式的醫藥組成物。醫藥上可接受之載劑在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒，其包括但不限於：緩衝劑，例如組胺酸、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑 (例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯化物；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (例如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物 (例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，例如聚乙二醇 (PEG)。本文中例示性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白 (sHASEGP)，例如，人類可溶性 PH-20 透明質酸酶醣蛋白，諸如 rHuPH20 (HYLENEX ®，Halozyme, Inc.)。某些例示性 sHASEGP 及使用方法 (包括 rHuPH20) 描述於美國專利公開號 2005/0260186 和 2006/0104968 中。在一些態樣中，sHASEGP 與一種或多種另外的醣胺聚醣酶諸如軟骨素酶結合在一起。
例示性凍乾抗體組成物如美國專利號 6,267,958 所述。水溶性抗體組成物包括美國專利號 6,171,586 和 WO 2006/044908 中所述的那些，後者所述之組成物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文所述之醫藥組成物還可包含適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。例如，可能需要進一步提供可降低黏液黏彈性的試劑。在一些實施例中，另外的治療劑係選自高張鹽水、甘露醇、α 鏈道酶、N-乙醯基半胱胺酸、半胱胺及支氣管擴張劑。此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。該等技術公開於 Remington's Pharmaceutical Sciences(第 16 版，Osol, A. 主編，1980 年)。
可製備用於緩釋之醫藥組成物。緩釋製劑的適宜的實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式 ,例如膜或微囊。
用於 活體內投予之醫藥組成物通常為無菌的。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。 F. 治療方法及投予途徑
本文所提供之任何抗 Notch2 抗體均可用於治療方法。
在一些態樣中，提供了一種用為藥物的抗 Notch2 抗體。在其他態樣中，提供一種用於治療黏液阻塞性肺病的抗 Notch2 抗體。在某些態樣中，提供了一種用於治療方法中的抗 Notch2 抗體。在某些態樣中，本發明提供一種用於治療罹患黏液阻塞性肺病的個體之方法中的抗 Notch2 抗體，該方法包含對該個體投予有效量之抗 Notch2 抗體。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (如下文所述) (例如，一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外治療劑) 投予該個體。在其他態樣中，本發明提供一種用於減少個體 (individual) (諸如個體的肺中) 之分泌細胞 (諸如杯狀細胞) 數量及/或增加纖毛細胞數量的抗 Notch2 抗體。在某些態樣中，本發明提供一種用於減少個體 (諸如個體的肺中) 之分泌細胞 (諸如杯狀細胞) 數量及/或增加纖毛細胞數量的方法中的抗 Notch2 抗體，該方法包含向該個體投予有效量之抗 Notch2 抗體，以減少個體 (諸如個體的肺中) 之分泌細胞 (諸如杯狀細胞) 數量及/或增加纖毛細胞數量。藉由減少肺中分泌細胞 (諸如杯狀細胞) 的數量，減少肺中黏液的產生且/或增加黏液的清除率，從而減輕例如黏液阻塞性肺病的一種或多種症狀。在一些實施例中，用本文所提供的抗 Notch2 抗體進行治療改善了患有黏液阻塞性肺病的個體的 FEV1 (一秒內用力呼氣量)，減少該個體的呼吸困難，且/或減少該個體的咳嗽。
在又一態樣中，本發明提供了抗 Notch2 抗體在藥物的製造或製備中的用途。在一些態樣中，該藥物用於治療黏液阻塞性肺病。在又一態樣中，藥物用於治療黏液阻塞性肺病的方法中，該方法包含對患有黏液阻塞性肺病的個體投予有效量的藥物。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (例如，如下文所述) 投予個體。在又一態樣中，該藥物用於減少個體 (諸如個體的肺中) 之分泌細胞 (諸如杯狀細胞) 數量及/或增加纖毛細胞數量。在又一態樣中，該藥物用於減少個體 (諸如個體的肺中) 之分泌細胞 (諸如杯狀細胞) 數量及/或增加纖毛細胞數量的方法中，該方法包含向該個體投予有效量之該藥物，以減少個體 (諸如個體的肺中) 之分泌細胞 (諸如杯狀細胞) 數量及/或增加纖毛細胞數量。
在又一態樣中，本發明提供了一種治療黏液阻塞性肺病的方法。在一些態樣中，該方法包含對罹患黏液阻塞性肺病的個體投予有效量之抗 Notch2 抗體。於一個此樣態中，如下所述，該方法進一步包含對該個體投予有效量之至少一種另外的治療劑。
在又一態樣中，本發明提供一種用於減少個體 (諸如個體的肺中) 之分泌細胞 (諸如杯狀細胞) 數量及/或增加纖毛細胞數量的方法。在一些態樣中，該方法包含向個體投予有效量之抗 Notch2 抗體，以減少個體 (諸如個體的肺中) 之分泌細胞 (諸如杯狀細胞) 數量及/或增加纖毛細胞數量。在一些態樣中，「個體」為人。
可用本文提供的抗 Notch2 抗體治療的非限制性例示性黏液阻塞性肺病包括慢性阻塞性肺病 (COPD)、囊腫纖維化、原發性纖毛運動障礙、非囊腫纖維化支氣管擴張症及細支氣管炎。
根據任一上述態樣的「受試者」或「個體」可以是人。
在又一態樣中，本發明提供包含本文所提供的任何抗 Notch2 抗體的醫藥組成物，其例如用於任何上述治療方法。在一些態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗 Notch2 抗體和醫藥上可接受之載劑。在一些態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗 Notch2 抗體及至少一種另外的治療劑，例如，如下所述。
本發明之抗體可單獨投予或用於聯合治療。例如，聯合治療包括投予本發明之抗體並投予至少一種另外的治療劑 (例如，一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外的治療劑)。在某些態樣中，聯合治療包含投予本發明之抗體以及投予至少一種另外的治療劑，諸如降低黏液黏彈性的試劑。在一些實施例中，另外的治療劑係選自高張鹽水、甘露醇、α 鏈道酶、N-乙醯基半胱胺酸、半胱胺及支氣管擴張劑。
上面提到的此等聯合療法涵蓋聯合施用 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的醫藥組成物中)，以及單獨施用，在這種情況下，本發明之抗體的施用可在施用另外的一種或多種治療劑之前、同時和/或之後發生。在一些態樣中，投予抗 Notch2 抗體及投予另外的治療劑彼此發生在約一個月內，或發生在約一週、兩週或三週內，或發生在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內。在一些態樣中，在治療之第 1 天將抗體及另外的治療劑投予患者。
本發明之抗體 (及任何其他治療劑) 可透過任何合適的方式給藥，包括腸胃外、肺內和鼻內給藥，並且如果需要局部治療，則可以採用病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。給藥可透過任何合適的途徑進行，例如透過注射，諸如靜脈內或皮下注射，或透過肺內 (例如吸入) 或鼻內遞送，部分取決於短暫投予還是長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予和脈衝輸注。
本發明之抗體將按照與良好醫學實踐一致的方式進行配製、給藥和施用。在這種情況下，考慮的因素包括待治療的具體障礙、待治療的具體哺乳動物、個別患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、投予方法、投予日程及醫療從業者已知的其他因素。該抗體並非必須、但可以視情況與一種或多種目前用於預防或治療所述疾病之藥劑一起配製。此等其他藥劑的有效量取決於醫藥組成物中存在之抗體的量、疾病或治療的類型以及上文討論的其他因素。這些藥物通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量和透過任意途徑使用。
對於疾病的預防或治療，本發明之抗體的適當劑量 (單獨使用或與一種或多種其他其他治療劑組合使用) 將取決於待治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重度和病程、為了預防或是治療的目的施用該抗體、之前的治療、患者的臨床病史和對該抗體的反應及主治醫師的判斷。在一次或一系列的治療中適宜地對患者投予抗體。此等劑量可以間歇施用，例如每週或每三週施用 (例如，使得患者接受約兩種至約二十種或例如約六種劑量的抗體)。可投予初始較高的負載劑量，隨後投予一個或多個較低劑量。然而，可以使用其他劑量方案。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。 G. 製成品
在本發明的一些態樣中，提供一種包含用於治療、預防及/或診斷上述疾病的製成品。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。容器可以由多種材料例如玻璃或塑膠形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防及/或診斷症狀的另一組成物結合使用，並可能具有無菌入口 (例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或包裝說明書指示該組成物用於治療所選擇的疾病。此外，該製品可以包括 (a) 其中包含有組成物的第一容器，其中，該組成物包含本發明之抗體；及 (b) 其中包含有組成物的第二容器，其中，組成物包含其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此態樣中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的包裝說明書。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。 III. 實例
以下為本發明之方法和組成物的實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他實施例。 實例 1 ：兔和大鼠抗 Notch2 抗體的產生
使用包含 Notch2 之 EGF 重複序列 6 至 10 (huNotch2-EGF6-10 和 muNotch2-EGF6-10) 的人和鼠細胞外域 (ECD)構建體使紐西蘭白兔共免疫，並使用基於 Offner 等人 PLoS ONE 9(2), 2014 之改良方案分離單個 B 細胞。改良的工作流程包括直接 FACS 將 IgG + huNotch2 + B 細胞分選到單個孔中。利用 ELISA 測定 B 細胞培養上清液與人 Notch2 及無關對照蛋白之結合。裂解 Notch2 特異性 B 細胞，立即在 -80°C 下冷凍保存，直至進行分子選殖。如前所述，將來自兔 B 細胞的每個單株抗體之可變區 (VH 及 VL) 選殖到具有含有 N297G 突變之人恆定區的來自所提取之 mRNA的表現載體中 (Offner 等人 PLoS ONE 9(2), 2014)。個別的重組嵌合兔/人抗體在 Expi293 細胞中表現，然後用蛋白 A 純化。然後純化的抗 Notch2 抗體經歷功能活性測定及動力學篩選，如本文所述。
大鼠用 MBP-huNotch2 EGF6-10 + MBP-huNotch2 EGF7-9 的組合進行免疫或用 MBP-huNotch2 EGF6-10 接觸抗原並用 huNotch2-EGF6-10 加強，並且使用改良的融合夥伴產生融合瘤 (Price 等人 J Immunol Methods 2009)。對多種條件進行優化，以使得能夠將個體 IgG+ huNotch2 融合融分選到單個孔內，然後於分選後進行另外培養。藉由 ELISA 分析所得融合瘤上澄液，並使用蛋白 A 純化陽性樣品以進行後續之功能及動力學特徵。將某些大鼠單株抗體測序並選殖到具有 N297G 突變的恆定區。個別的重組嵌合大鼠/人抗體在 Expi293 細胞中表現，然後用蛋白 A 純化。然後純化的抗 Notch2 抗體經歷功能活性測定及動力學篩選，如本文所述。 實例 2 ：使用基於陣列之表面電漿共振的動力學分析和表位分箱
將基於陣列的 SPR 成像系統 (Carterra USA) 用於對實例 1 中產生的一組五種單株抗體 (rat.1B2、rat.3107、rb.2338、rb.2430 和 rb.2621) 以及抗 Notch 2/3 抗體 OMP-59R5 (他瑞妥單抗， 參見美國專利號 8,226,943 B2) 進行表位分箱。將純化的抗體在 pH 4.5 的 10 mM 乙酸鈉緩衝液中稀釋成 10 µg/ml。使用胺偶合，使用 Continuous Flow Microspotter (Carterra，USA) 將抗體直接固定在 SPR sensorprism CMD 200M 晶片 (XanTec Bioanalytics，Germany) 上，以生成六種抗體的陣列。為了進行分析，使用 IBIS MX96 SPRi (Carterra USA) 評估與固定的配體結合的分析物。為了進行動力學分析，將人類 Notch2 以 3 倍稀釋度從 0 到 300 nM 注射 3 分鐘，然後解離 10 分鐘。對於表位分箱，首先將人類 Notch2 以 50 nM 注射 4 分鐘，然後個別單株抗體以 10 µg/ml 注射第二個 4 分鐘。在循環之間用 10 mM 甘胺酸，pH 1.5 再生表面。實驗是在 25℃ 的 HBS-T 緩衝液的電泳緩衝液 (0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.05% 表面活性劑 P20，5 mM CaCl 2) 中進行。使用 Wasatch 分箱軟體工具 Epitope (Carterra USA) 處理分箱資料。
結果顯示於圖 4 中。確定抗體 rat.1B2、rat.3107、rb.2338、rb.2430 和 rb.2621 與抗 Notch 2/3 抗體 OMP-59R5 位於不同的表位分箱中。 實例 3 ：大鼠抗 Notch2 抗體的人源化
如下所述，將大鼠單株抗體 1B2 和 3107 人源化。根據 Kabat 等人，Sequences of proteins of immunological interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1991) 進行殘基編號。
在 1B2 和3107 人源化過程中構建的變異體以人 IgG 的形式進行評估。將每個抗體的高度可變區 (VL 域中的位置 24-34 (L1)、50-56 (L2) 及 89-97 (L3)，以及 VH 域中的位置 26-35 (H1)、50-65 (H2) 及 95-102 (H3)) 移植到各種受體框架中。對於大鼠 1B2，將 VL CDR 移植到 KV1-12*01，並將 VH CDR 移植到 HV3-73*01。此外，CDR-H2 Asn54-Phe55-Ser56 中的醣基化位點突變為 Asp54-Phe55-Ser56。對於大鼠 3107，將 VL CDR 移植到 KV2-30*02，並將 VH CDR 移植到 HV1-2*01。另外，將來自親代抗體之所有 VL 及 VH 游標位置移植到其相應的人種系框架中。於游標位置具有所有大鼠胺基酸的移植物稱為 L1H1 (hu.1B2.L1H1 和 hu.3107.L1H1)。
比較了 hu.1B2.L1H1 抗體與其嵌合親代選殖株的結合親和力。將 L1H1 版抗體的大鼠游標位置轉換回人殘基，以評估每個大鼠游標位置對 huNOTCH2 的結合親和力之貢獻。製備四個另外的輕鏈游標變異體 L2-L5，以及八個另外的重鏈游標變異體 H2-H9。基於上述變異體抗體的結合親和力評估 (資料未顯示)，輕鏈 (L7) 上的 Ser43 和 Tyr71 以及重鏈 (H14) 上的 Val24、Ala49、Ser76 和 Leu78 被確定為關鍵的大鼠游標殘基。如以下實例 6 所述的確定結合親和力。嵌合 1B2 以 5.21E-9 M 的 K D結合，而 hu1B2.L7H14 以 6.13E-9 M 的 K D結合。
比較了 hu.3107.L1H1 抗體與其嵌合親代選殖株的結合親和力。將 L1H1 版抗體的大鼠游標位置轉換回人殘基，以評估每個大鼠游標位置對 huNOTCH2 的結合親和力之貢獻。製備一個另外的輕鏈變異體 (L2)，以及十個另外的重鏈變異體 H2-H11。
為了提高基於 3107 的抗 Notch2 人源化抗體的親和力，基於人源化抗體的結合親和力評估和 HCS 效力 (資料未顯示) 製備 4 個重鏈序列變異體：HV1-2*01 中的 H12 與 P45、T48、A67、V71、S75 和 T76；HV1-2*01 中的 H13 與 P45、T48、A67、V71、T76；H14 以及 H15 位於 HV5-51*01 中，分別具有與 H12 和 H13 相同的游標殘基。對於輕鏈，種系 KV4-1*1 用於 CDR 移植物 (L7)。此外，輕鏈上的 V2 和 F36 被確定為大鼠游標殘基，該等游標殘基在 HCS 測定中保持效力並被移植到種系 KV4-1*01 (L6) 上。基本上如實例 5 中所述的進行 HCS 測定。 實例 4 ：人源化 1B2 抗體的親和力提高
為了提高基於 1B2 的抗 Notch2 人源化抗體的效力，使用 L7H10 作為模板產生 560 個單點突變變異體。利用表面電漿共振對所得之抗體進行篩選，並根據解離速率進行排序。重鏈中有 5 個突變 (A50G、S51Q、I57R、S96H 和 R98F)，輕鏈中有 3 個突變 (S31V、Q55H 和 L96I)，導致解離速率較慢。為了鑑別突變的良好組合，產生 80 個變異體，其兼具單獨和組合之突變集，並通過表面電漿共振表徵進行評估。S51Q 被鑑別為提高了解離速率的突變。
為了進一步提高 1B2 的親和力，將具有 S51Q 和 N54D 突變的 L1H1 用為噬菌體顯示親和力成熟的模板。簡言之，共建構了四個噬菌體文庫，並將其顯示為 M13 噬菌體表面上的單價 Fab。第一組文庫由兩個 CDR NNK 步移 (一個用於 CDR-H1、H2 和 H3，一個用於 CDR-L1、L2 和 L3) 組成，其中三個 CDR 中的每一者中的一個位置同時隨機化。第二組由兩個硬隨機化文庫組成，其中整個 CDR-L3 或 CDR-H3 都發生了突變。
對於親和力提高選擇，噬菌體文庫經歷嚴格性漸增且將冷的人 Notch2 EGF6-10 作為競爭者的四輪溶液分選。觀察到 CDR-H3 硬隨機化文庫的富集。在將親本序列與富集的殖株進行比較後，鑑定出若干 CDR-H3 突變。總共 54 個組合變異體被重新格式化為人 IgG1，以用於抗體生產以及進一步的 BIAcore 結合動力學分析和 HCS 測定。基本上如實例 5 中所述的進行 HCS 測定。hu1B2.v2、hu1B2.v4、hu1B2.v9 和 hu1B2.v8 在 HCS 測定中被鑑別為親和力和效力都得到了最大的提高。將這四個變異體的 CDR-H3 移植到經游標完善的人源化變異體 L7H14 中，以分別產生 hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103 和 hu1B2.v104。如以下實例 6 所述的確定結合親和力。hu1B2.L7H14 對 hu.Notch2 的親和力為 6.13E-9M，而 hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103 及 hu1B2.v014 的親和力分別為 2.84E-09、3.37E-09、3.08E-09 及 3.09E-09。藉由表面電漿共振，沒有一個變異體顯示出與人 Notch1、人 Notch3 或人 Notch4 的結合。使用桿狀病毒顆粒在 ELISA 中量測每個抗 Notch2 變異體的非特異性結合 (Hotzel 等人 MAbs 2012)。使用熱應力和 AAPH 氧化應力測試分析 Hu1B2.v102 和 hu1B2.v104 的分子評估責任 ( 參見Dion 等人 J. Pharm. Sci2018, 107(2), 550)。未鑑別出責任。 實例 5 ：鑑別阻斷 Jagged1 傳訊但不阻斷 DLL1 傳訊之抗體的高通量篩選 (HCS) 測定
收集內源性表現高水平的 huNotch2 (N2) 的人類細胞株 U87-MG，並將每孔 4,000 個細胞接種到 Cell Carrier ultra 384 孔板 (Perkin Elmer, Waltham, MA)上。將板在 37℃ 的 CO 2培養箱中培養 2-5 小時，且在此培養時間內，抗體 (Ab) 測試樣品通過手動初始稀釋製備，然後是由 Bravo 自動液體處理機 (Agilent, Santa Clara, CA) 執行的一組 10 個點的 3 倍或 3.5 倍連續稀釋。將稀釋的 Ab 樣品轉移到含有 U-87-MG 細胞的一組二重複的板中。在添加稀釋的 Ab 後，收集 3T3-Jag1 或 OP9-DLL1 細胞，並將每個配體細胞株以每孔 4,000 個細胞接種在用 Ab 處理的 U-87-MG 細胞頂部並進行孵化以允許配體依賴性 Notch-2 活化和發生在 U-87-MG 細胞中 N2-ICD 易位。
在孵化 16 至 22 小時後，將受體及配體表現細胞的每種共培養物用 4% 多聚甲醛固定 10 分鐘，用 PBS 洗滌板，然後將細胞用 0.05% 皂苷 (Sigma-Aldrich, San Louis, MO) 在 PBS+ 0.05% BSA 緩衝液中滲透 1 小時。在滲透後，洗滌板並用含有 PBS/BSA 緩衝液的 0.05% 皂苷稀釋兔抗 N2-ICD mAb D76A6 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) 並添加到板上並在 4℃下孵化過夜。
第二天，洗滌板並用含有檢測 AF-647 結合的抗兔檢測抗體 (Jackson-Immunoresearch, West Grove, PA) 和 Hoechst-33342 染料 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 的緩衝液染色，然後於輕柔搖動下，在室溫下孵化 2 小時。細胞染色後，用洗滌緩衝液洗滌板，然後將 PBS 添加到每個孔中，然後對板成像。
在 Opera Phenix High Content 成像系統 (Perkin Elmer, Waltham, MA) 上使用 20X 水浸物鏡從每個孔中拍攝六個影像。使用 Columbus 軟體成像分析工具 (Perkin Elmer, Waltham, MA) 進行分析，其中鑑別出核區和核周圍的環區並計算信號強度。獲得閾值以便計算來自最大抑制對照樣品的 N2-ICD 核易位陽性群體。將 Columbus 軟體分析的結果上傳到 Genedata Screener 應用程式 (Lexington, MA)，其中使用從中性對照導出的易位百分比減去最大抑制對照和計算出的 IC50 值來建立標準化過程。
將 3T3-Jag1 及 OP9-DLL1 共培養物組的資料分析結果進行比較，並用於發現阻斷 Jagged1 媒介之活化但不影響 DLL1 媒介之活化的 Notch2 抗體，以及優化抗體的人源化型式。例示性結果顯示於圖 5A 至 5F 中。所有測試的抗體都阻斷 Jagged1 媒介之活化，但不影響 DLL1 媒介之活化。表 2 匯總了每種抗體阻斷 Jagged1 媒介之傳訊的 IC50。 表 2：抗 Notch2 抗體的 Jagged1 IC50
化合物識別號 Jagged1 IC50 [M]
1B2 嵌合 1.253E-8
hu1B2.L1H1.DFS 7.896E-9
hu1B2.v101 3.017E-9
hu1B2.v102 1.591E-9
hu1B2.v103 1.801E-9
hu1B2.v104 2.485E-9
大鼠 3107 2.101E-9
兔 2621 6.671E-10
兔 2338 3.530E-9
兔 2430 1.027E-9
在單獨的實驗中，基本上如上所述在 HCS 測定中測試大鼠抗體 3107 和 3107 的人源化型式。在此實驗中測試的所有抗體都包含具有 N297G 突變的人 IgG1。3107 和人源化變異體全部阻斷 Jagged1 媒介之活化，但不影響 DLL1 媒介之活化 (資料未顯示)。表 3 匯總了每種抗體阻斷 Jagged1 媒介之傳訊的 IC50。 表 3：抗 Notch2 3107 抗體及人源化變異體的 Jagged1 IC50
化合物識別號 Jagged1 IC50 [M]
大鼠 3107 4.88E-09
hu.Notch-3107.L1H15 6.08E-09
hu.Notch-3107.L7H12 1.10E-08
hu.Notch-3107.L7H13 5.94E-09
hu.Notch-3107.L7H14 1.05E-08
hu.Notch-3107.L6H12 4.71E-09
hu.Notch-3107.L6H13 6.42E-09
hu.Notch-3107.L7H15 9.16E-09
hu.Notch-3107.L6H14 6.65E-09
hu.Notch-3107.L1H12 7.85E-09
hu.Notch-3107.L1H13 4.92E-09
hu.Notch-3107.L1H14 6.95E-09
hu.Notch-3107.L6H15 8.03E-09
實例 6 ：使用 BIAcore™ 之動力學分析
抗體之結合親和力通過 BIAcore™ T200 儀器進行測定。兔抗體表現為具有兔可變域和人恆定域的嵌合抗體。大鼠抗體表現為具有大鼠可變域和人恆定區的嵌合抗體。人源化抗體在人 IgG1 框架中表現。為實施動力學測量，在研究級 protein A 芯片 (GE Healthcare) 上捕獲抗體，以達到約 300 RU。huNotch2-EGF6-10 的 連續稀釋液在 37℃ 下以 100 μL/min 的流速注入含另外 3 mM CaCl 2的HBS-P緩衝液中。締合速率 (ka) 和解離率 (kd) 使用 1:1 Langmuir 結合模型 (BIAcore™ T200 評估軟體 2.0 版) 進行計算。平衡解離常數 (KD) 通過比率 kd/ka 計算得出。結果顯示於表 4 中。 表 4. rat.3107、rat.1B2 和某些人源化變異體以及 rb.2338、rb.2430 和 rb.2621 與 huNotch2-EGF6-10 的結合特性 (n=3)
樣品 ka (1/Ms) kd (1/s) K D(M)
Rat-1B2 1.81E+05 9.43E-04 5.21E-09
hu1B2.L1H1.DFS 2.26E+05 1.16E-03 5.15E-09
hu1B2.L7H10 4.18E+05 4.15E-03 9.94E-09
hu1B2.L7H14 2.19E+05 1.34E-03 6.13E-09
hu1B2.v101 2.86E+05 8.13E-04 2.84E-09
hu1B2.v102 3.87E+05 1.31E-03 3.37E-09
hu1B2.v103 2.65E+05 8.17E-04 3.08E-09
hu1B2.v104 3.57E+05 1.10E-03 3.09E-09
Rat-3107 3.63E+05 1.82E-03 5.00E-09
兔 2338 5.33E+05 6.01E-03 11.3E-09
兔 2430 2.19E+06 3.07E-02 14.0E-09
兔 2621 2.48E+06 3.05E-02 12.3E-09
在單獨的實驗中，基本上如上所述測定大鼠 3107 抗體的人源化型式的結合親和力。結果顯示於表 5 中。 表 5. rat.3107 及某些人源化變異體的結合特性
樣品 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
rat.3107 3.42E+05 3.12E-03 9.12E-09
hu.3107.L1H12 3.80E+05 5.42E-03 1.43E-08
hu.3107.L1H13 3.79E+05 5.87E-03 1.55E-08
hu.3107.L1H14 3.60E+05 6.31E-03 1.75E-08
hu.3107.L1H15 3.55E+05 6.34E-03 1.79E-08
hu.3107.L6H12 4.13E+05 4.04E-03 9.79E-09
hu.3107.L6H13 4.48E+05 4.24E-03 9.47E-09
hu.3107.L6H14 3.54E+05 3.54E-03 1.00E-08
hu.3107.L6H15 3.96E+05 3.65E-03 9.23E-09
hu.3107.L7H12 3.84E+05 3.67E-03 9.54E-09
hu.3107.L7H13 3.55E+05 3.53E-03 9.94E-09
hu.3107.L7H14 3.46E+05 3.59E-03 1.04E-08
hu.3107.L7H15 3.50E+05 4.07E-03 1.16E-08
通過 BIAcore™ 評估抗 Notch2 抗體與來自其他物種的 Notch2 和包含不同 EGF 重複區的構造體的結合。對於此實驗，在蛋白 A 芯片上捕獲具有人類恆定區的抗體，以達到約 200 RU。各種抗原的連續稀釋液在 37℃ 下以 100 μL/min 的流速注入含另外 3 mM CaCl 2的HBS-P緩衝液中。實驗結果匯總於表 6 中。 表 6：rat.3107、某些 rat.1B2 人源化型式以及 rb.2338、rb.2430 和 rb.2621 與各種 Notch2構建體、人 Notch1 和人 Notch3 的結合
   hu.1B2.v102 hu1B2.v104 rat.3107 rb.2338 rb.2430 Rb.2621
huNotch2-EGF6-10 + + + + + +
huNotch2-EGF4-7 + + + nt nt nt
huNotch2-EGF5-8 + + + nt nt nt
huNotch2-EGF7-9 + + + nt nt nt
huNotch2-EGF6-12.R268K - - - +/- +/- +/-
muNotch2-EGF6-10 - - - - - -
muNotch2-EGF6-12.K268R + + + + + +
gpNotch2-EGF6-12 + + + + + +
ratNotch2-EGF6-10 - - - nt nt nt
huNotch1 - - - nt nt nt
huNotch3 - - - - - -
nt = 未測試。
1B2 的其他人源化型式 (hu1B2.L1H1.DFS、hu1B2.v4L7、hu1B2.v8L7、hu1B2.v9L7、hu.1B2.DFS.H14L7) 顯示出與上表 4 中的 hu.1B2.v102 和 hu.1B2.v104 類似的結合特徵。基於表 4 中所示的抗 Notch2 抗體的結合特性，rat.3107 以及 rat.1B2、rb.2338、rb.2430 和 rb.2621 的人源化型式結合人類 Notch2 EGF7 中的表位。此外，所有測試的抗體都顯示出與 huNotch2-EGF6-12.R268K 或與 muNotch2-EGF6-10 結合很少或不結合，但與 huNotch2-EGF6-10 和 muNotch2-EGF6-12.K268R 結合，表明抗體接觸人類 Notch2 之位置 268 的精胺酸。 實例 7 ：抗 Notch2 Fab 對 Jagged1 和 DLL1 傳訊的抑制率
某些抗 Notch2 抗體被重新格式化為單價 Fab，並使用實例 5 中所述的 HCS 測定來分析 Jagged1 和 DLL1 傳訊抑制率。
來自 3T3-Jag1 和 OP9-DLL1 共培養物組的資料分析結果用於計算 Jagged1 IC50，並確定 Fab 對 Jagged1 和 DLL1 傳訊的最大抑制百分比。表 7 顯示出對每個 Fab 觀察到的最大 Jagged1 和 DLL1 傳訊抑制率。 表 7：抗 Notch2 Fab 的最大抑制率
Fab 最大 Jagged1 抑制率 最大 DLL1 抑制率
hu1B2.v8 100% 50%
hu1B2.v104 100% 60%
出人意料的是，雖然 hu1B2.v8 和 hu1B2.v104 兩者都以二價抗體形式選擇性抑制 Jagged1 傳訊，但當重新格式化為單價 Fab 時，hu1B2.v8 和 hu1B2.v104 兩者都抑制了 DLL1 傳訊，儘管與 Jagged1 傳訊相比為減小的最大抑制率。相比之下，單價 Fab 格式的 hu1B2.v1.DFS、hu1B2.v101 和 hu1B2.v103 保留了 Jagged1 特異性傳訊抑制活性，並且不抑制 DLL1 (資料未顯示)。不受任何特定理論的束縛，Fab 格式的 hu1B2.v8 和 hu1B2.v104 與 Fab 格式的 hu1B2.v1.DFS、hu1B2.v101 和 hu1B2.v103 之間的選擇性差異可歸因於 CDR-H3 序列的差異。Hu1B2.v8 和 hu1B2.v104 共享 CDR-H3 序列 DGGK LALDA (SEQ ID NO: 11)，而 hu1B2.v1.DFS、hu1B2.v101 和 hu1B2.v103 分別具有 CDR-H3 序列 DSGR WGLDA (SEQ ID NO: 8)、DGGR WGLDA (SEQ ID NO: 9) 和 DGGK WGLDA (SEQ ID NO: 12)。 實例 8 ：抗 Notch2 抗體減少分泌細胞
氣-液界面 (ALI) 培養物：將初級人支氣管上皮細胞 (HBEC) 接種在 0.4μm 孔 PET transwells (Corning #7369) 中，並在浸沒條件下培養，直至在 Pneumacult Ex-Plus 培養基 (StemCell Technologies #05040) 中融合為止。融合後，從上室中移除培養基，將 HBEC 暴露於空氣中，並且用 Pneumacult ALI 基礎培養基 (StemCell Technologies #05001) 代替下室中的培養基。將細胞培養 3-4 週，並在纖毛明顯跳動時完全分化。
抗體處理和樣品分析：將抗體以 50mg/ml 的濃度添加到基礎培養基中。在下室中更換培養基時（每週 3 次），補充抗體。在第 7 天，收集 ALI 培養物用於 RNA 分析和組織學。對於 RNA 分析，使用 Qiagen RNA Extraction 套組 (#74106) 提取 RNA。使用 iScript cDNA 合成 (Biorad #1708891) 進行 cDNA 合成後，對基因 Muc5b、Muc5ac 和 Scgb1a1 (Taqman Assays) 進行基因表現分析。對於組織學分析，對 transwell進行福爾馬林固定和石蠟包埋。對樣品的抗 Muc5b (杯狀細胞)、抗乙醯化 a-微管蛋白 (纖毛細胞) 和 DAPI (核染色) 進行切片和染色。
如圖 6A 至 6D 所示，用抗 Notch2 抗體 1B2 處理降低了 Muc5b、Muc5ac 和 Scgb1a1 在 HBEC 的 ALI 培養物中的 mRNA 表現。用抗 Notch2 抗體 1B2 處理亦減少了杯狀細胞的出現，如使用抗 Muc5b 抗體藉由免疫螢光所檢測。這些結果顯示出 Jagged-Notch2 傳訊的抑制足以顯著減少培養物中的分泌性杯狀細胞。 實例 9 ： Fab 的結合
為了開發一種有效、穩定且可霧化的抗 Notch2 抗體形式，探索了將 Fab 結合成各種多價形式。本實驗中使用的結合試劑如表 8 中所示。 表 8
結合試劑 Fab 數量/結合物 結合試劑之結構
Bis-Mal-PEG6 (BroadPharm) 2
Bis-Mal-PEG11 (BroadPharm) 2
Bis-Mal-PEG19 (BroadPharm) 2
三(Mal-PEG2-醯胺)-胺 (BroadPharm) 3  
4 臂 PEG,-(CH 2) 3NHCO (CH 2) 2-MAL) 4(NOF) (多分散) 4
四(-醯胺基-dPEG®₁₁-MAL) 新戊四醇 (Quanta) 4
6 臂 (DP)-MAL-6000 (JenKem) 6
對於結合，在去封閉之前，將 Fab 經緩衝液交換到 50 mM 磷酸鉀、50 mM 氯化鈉，pH 7.5 緩衝液中。Fab 首先用 50 當量的二硫蘇糖醇 (DTT) 在室溫在含有 2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)，pH 8 (最終濃度) 的 pH 7.5 緩衝液中還原 16 小時。當經由質譜法測得的 Fab 之質量移動 121 m/z 時，還原完成，此係歸因於半胱胺酸之損失。藉由快速蛋白質液相層析 (FPLC) 純化法使用 HiTrap SP HP 陽離子交換管柱 (Cytiva) 去除 DTT。Fab 用 20 mM 琥珀酸鹽緩衝液 (pH 5) 稀釋 20 倍，並裝載到陽離子交換管柱上。用琥珀酸鹽緩衝液洗滌管柱並用 50 mM 磷酸鹽、50 mM 氯化鈉，pH 7.5 溶析。檢查經溶析之 Fab 的 pH 值並在再氧化之前用 0.5 M 磷酸鈉 pH 8 將其調節至 pH 7.5。對於再氧化反應，添加 2 mM EDTA pH 8 (終濃度) 及 15 當量之去氫抗壞血酸 (DHAA)。2 至 3 小時後，檢查再氧化反應，當藉由 LCMS (UV，OD 280nm) 觀察到 ＜1% 的游離輕鏈時，認為再氧化反應完成。藉由 FPLC 純化法使用 SP HP 管柱去除 DHAA。經再氧化之 Fab 用琥珀酸鹽緩衝液稀釋 20 倍並裝載到管柱上。DHAA 用琥珀酸鹽緩衝液洗除，且 Fab 用 20 mM 琥珀酸鹽、300 mM NaCl，pH 5 溶析。藉由粒徑篩析層析法 (SEC) 檢查含有 Fab 的流份，將含有 ＜5% 聚集體的流份合併，並經緩衝液交換到 20 mM 琥珀酸鹽、50 mM NaCl pH 5 中並濃縮至 12 mg/mL。添加 EDTA pH 8 (2 mM 最終濃度)，且等分試樣在 48 小時內使用或經快速冷凍。
對於全部結合反應，使用 0.5 M 磷酸鈉 (pH 8) 將反應的 pH 值增加至 7-7.5 的 pH。Fab 濃度通常為 12 mg/ml，然而，2 至 ＞60 mg/mL 的濃度會導致成功結合。稱重聚乙二醇 (PEG) 連接子 (結合試劑，參見表 8) 並溶解在二甲基甲醯胺 (DMF) 中，濃度介於 0.1 與 0.02 M 之間。PEG 連接子之品質，具體而言所締合之水的量，決定了在結合反應中所使用的當量數。PEG 連接子與 Fab 的比率係針對各連接子經驗地確定，且經優化以最大化結合，使用過量之 Fab 來驅動各反應。
經由 SPHP 離子交換層析將 Fab 結合物與 Fab 單體分離。在純化之前，將各結合混合物在 20 mM 琥珀酸鹽，pH 5 緩衝液中稀釋 20 倍。使用 20 mM 琥珀酸鹽、500 mM NaCl，pH 5 以淺梯度依次溶析 Fab 結合物及 Fab 單體。將含有所需 Fab 結合物的流份合併、濃縮並按需要進行配製。
經純化之結合物經由歷經篩析層析法 (SEC) 使用 TSKgel G3000SWXL 管柱 (7.8 mm ID，30 cm，5 um) 在 Agilent HPLC (運行緩衝液 = 0.2M 磷酸鉀，0.25M KCl，pH 6.2 + 15% IPA，流速 = 0.65 ml/min) 上分析。
如表 9 所示，全部 PEG 二聚體及三聚體結合物以及 4 臂 Mal 3kD 結合物皆具有 ＞ 99% 的所需物質。4 臂 Mal 10kD 結合物具有 97.5% 的所需物質，而 6 臂 Mal-6kD 結合物穩定性較差，具有 91.6% 的所需物質。 表 9
樣品 溶析時間 % 所需物質
1B2.v104.huFab.LC_K149C 14.8 min ＞ 99 %
1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG6_二聚體 13.2 min ＞ 99 %
1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG11_二聚體 13.1 min ＞ 99 %
1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG19_二聚體 13.0 min ＞ 99 %
1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG_三聚體 12.4 min ＞ 99 %
1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG_4-臂-Mal-3kD 11.5 min ＞ 99 %
1B2.v104.huFab.LC_K149C.PEG_4-臂-Mal-10kD 10.5 min 97.5 %
1B2.v104.huFab.LC_K149C.PEG_6-臂-Mal-6kD 10.4 min 91.6 %
亦使用配備 PLRP-S 管柱 (1000A/8um) 的 Agilent 6230 TOF LC/MS 來分析經純化之結合物。使用梯度緩衝液 A (水 + 0.1% 甲酸) 及緩衝液 B (乙腈 + 0.1% 甲酸) 以 0.5 ml/min 的速度溶析該結合物。所觀察到的主要峰之質量與預期質量相一致 (資料未顯示)。此外，與 SEC 結果相一致，4 臂 Mal 10kD 結合物及 6 臂 Mal-6kD 結合物藉由 LC/MS 呈現出在物質方面之異質性。 實例 10 ： Fab 結合活性的表徵
使用 HCS 測定法測量 Fab 結合物的 Jag1 及 DLL 抑制的效力 (IC50)，基本上如上所述。
該實驗之結果顯示於表 10 中。令人驚訝的是，1B2.v104 Fab 與二聚體形式的結合將 Jagged1 抑制提高了約 100 倍。結合成三聚體形式進一步將 Jagged1 抑制增加了 2 至 4 倍。增加價態至四聚體或六聚體僅顯示出效力的增量增加。此外，單價 Fab 令人驚訝地顯示出對 DLL 的顯著抑制，但藉由將 Fab 結合成二聚體、三聚體、四聚體或六聚體形式，其抑制作用顯著降低或消除。 表 10
Fab / Fab 結合物 Jag1 抑制 (IC50) DLL 抑制 (IC50)
1B2.v104.huFab.LC_K149C 120 nM 50 nM
1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG6_二聚體 1-2 nM ＞1 µM
1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG11_二聚體 1-2 nM ＞1 µM
1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG19_二聚體 1-2 nM ＞1 µM
1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG_三聚體 0.5 nM ＞0.7 µM
1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG_4-臂-Mal-3kD 0.35 nM ＞0.5 µM
1B2.v104.huFab.LC_K149C.PEG_4-臂-Mal-10kD 0.27 nM ＞0.5 µM
1B2.v104.huFab.LC_K149C.PEG_6-臂-Mal-6kD 0.21 nM ＞0.4 µM
實例 11 ：使用 KinExA 測定平衡解離常數 (K D) 及結合動力學
為了測定親和力 (K D)，將低濃度及高濃度的某些抗 Notch2 抗體及 Fab 構建體與經滴定的表現 Notch2 的 U-87 細胞在磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (PBS) + 1 mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA) + 0.02% 疊氮化鈉 (NaN 3) 中一起孵育，直至相互作用達到平衡。孵育後，將細胞離心，並將含有抗體或 Fab 構建體之游離部分的上清液在不干擾細胞沉澱的情況下取出，並轉移到帶有自動進樣器的 KinExA 3200 儀器 (Sapidyne Instruments Inc) 上。使各上清液流經由塗有生物素化山羊抗人免疫球蛋白 G (IgG) 重 + 輕 (H+L) (#109-065-003，Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) 的聚苯乙烯珠 (#440176，Sapidyne Instruments Inc) 或生物素化 Notch2 胞外域組成的固相上方，以捕獲游離抗體或 Fab 構建體。使用與 AlexaFluor 647 (#109-605-097，Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) 結合的山羊抗人 IgG F(ab') 2偵測所捕獲的 Fab 及 Fab 結合物。記錄螢光訊號並將其轉化為與平衡樣品中游離抗體或 Fab 構建體之量成正比的電壓訊號。使用內置的平衡全細胞分析方法 KinExA Pro 軟體對所測量之資料進行最小二乘法分析，以將 K D及游離抗體或 Fab 構建體之活性的最優解擬合為代表 1:1 可逆雙分子相互作用的曲線。對於該曲線上的各資料點，x 軸反映受體莫耳濃度，且 y 軸反映平衡時在特定滴定劑濃度下游離抗體的百分比 (Darling 與 Brault，Assay Drug Dev Technol. 2004 Dec;2(6):647-57; Rathanaswami: Anal Biochem. 2008 Feb 1;373(1):52-60)。應用 N 曲線分析來測試兩種濃度的抗體或 Fab 構建體，以測定對表現 Notch2 的 U-87 細胞的 K D。
表 11 顯示本實驗中使用的測試抗體及 Fab 形式以及各形式的低濃度及高濃度。 表 11
抗體 1B2.v104. huIgG1. N297G 1B2.v104. huFab.LC_ K149C.MMTS_ 封端 1B2.v104.FabhuIgG1. N297G 1B2.v104. huFab.LC_ K149C.dPEG_ 三聚體
形式 二價 IgG 抗體 單價 Fab 四價 Fab-IgG 三價 Fab-PEG 結合物
低濃度 100pM 1nM 400pM 50pM
高濃度 10nM 10nM 12nM 500pM
使用與用於平衡分析的測定形式類似的測定形式來測定確定結合動力學，不同之處在於測量值係在「平衡前」收集，並且結合訊號經繪製為時間之函數。對於 KinExA 直接法，抗 Notch2 抗體及 Fab 形式與表現 Notch2 的 U-87 細胞以固定濃度一起孵育 (表 12)，並在不同時間點收集細胞結合溶液之等分試樣以測定游離抗體或 Fab 形式的分數。然後使用 KinExA Pro 軟體測定締合速率常數 (K on)。然後使用以下等式計算解離速率常數 K off：k off= K Dx k on。 表 12
抗體 1B2.v104. huIgG1.N297G 1B2.v104. huFab. LC_ K149C. MMTS_封端 1B2.v104.Fab huIgG1. N297G 1B2.v104. huFab.LC_K149C.dPEG_三聚體
形式 二價 IgG 抗體 單價 Fab 四價 Fab-IgG 三價 Fab-PEG 結合物
濃度 400pM 1nM 400pM 150pM
此等實驗之結果如圖 9 中所示。基於細胞的親和力證實了高度合作的結合且指示緩慢的締合速率以及非常緩慢的解離速率。總體而言，多價形式的基於細胞的結合親和力之提高係歸因於解離速率的顯著降低，這表明多價形式賦予的基於細胞的親合力驅動整體親和力之提高。在 Fab-IgG 的情況下，與二聚體及三聚體相比總體較低的親和力係歸因於較大之形式的空間需求顯著增加，這表現為所測試分子的最慢整體結合速率。 實例 12 ：穩定性測定
活 體外結合物穩定性測定：
具有單個位點半胱胺酸突變的 1B2 Fab 單體在 HEK293 或 CHO 細胞中表現，並使用標準方法進行純化。基本上如實例 9 中所述將所得蛋白質結合以形成三聚體，並將經純化之結合物在 pH 7.4 的 PBS 中稀釋至 1 mg/mL。經稀釋之樣品在 37℃ 孵育 4 週，且在此期間，在不同時間點取等分試樣，並藉由歷經篩析層析法 (SEC) 進行分析，以將完整的三聚體流份定量。參見圖 10。某些結合位點，包括輕鏈 K107C、K149C 及 T209C，在該實驗中在 37℃ 歷經四週顯示出 4% 或更低的解離。全部結合物在 37°C 在 4 週後的解離率皆低於 10%。
霧化穩定性分析：
1B2 K149C 三聚體結合物及 1B2 Fab-IgG 膝使用 Aerogen 振動篩網霧化器從 pH 6.0 組胺酸乙酸鹽 + 150 mM NaCl 中的 40 mg/mL 溶液霧化。將霧化器輸出直接收集到冷卻的 50 mL 錐形管中，且冷凝物藉由離心機旋轉沉降。所收集的材料隨後藉由 SEC 進行分析。透過霧化，1B2 K149C 三聚體結合物及四價 1B2 Fab-IgG 為穩定的。
活 體內三聚體穩定性 ：
透過肺生物轉化分析在活體內分析 1B2 K149C Fab 三聚體穩定性。使用 AssayMAP Bravo 蛋白質樣品製備平台 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 進行親和捕獲 LC-MS。參見，例如，Li 等人，Analytical Chemistry 2020 92 (10), 6839-6843。簡而言之，將人類抗 notch 細胞外域 (ECD) 生物素化並固定到 96 孔板中的鏈球親生物素蛋白筒 (Agilent Technologies) 上，然後使用 ECD 筒系統藉由與約 50 μL 之肺均質物樣品一起孵育並遵循 AssayMAP 之捕獲及溶析工作流程來捕獲抗 notch 分子。使用 30% 乙腈在具有 1% 甲酸的水中之溶液來溶析所捕獲的分子。使用 6230 TOF 質譜儀 (Agilent Technologies) 藉由 LC-MS 來分析 10 μL 體積的溶析液。分子的層析分離係在配備 PLRP-S 管柱 (孔徑 1000Å，粒徑 5µm，50 x 2.1 mm，Agilent，PL1912-1502) 的 Agilent 1260 Infinity II LC 系統上進行。使用 Protein Metrics Intact 軟體對原始資料進行解摺積，並遵循先前描述的方法 (1)，基於不同抗 notch 物質 (三聚體及二聚體) 的相對離子強度計算降解百分比。根據其峰的存在來評估樣品上降解產物的存在。從三聚體中偵測單體及二聚體的測定靈敏度為 1 µg/mL
在該實驗中沒有觀察到降解產物 (二聚體或單體)。
人類囊腫纖維化痰的穩定性：
人類囊腫纖維化痰獲自 BioIVT (目錄 #HMSPUTUM-CF)。將原始黏液在冰上解凍，並在 4℃ 以 800 x g 的速度旋轉沉降。收集上清液並儲存 (-80℃) 用於黏液穩定性測定。
全部構建體 (Fab1B2、Fab-IgG 1B2 及 Trimer 1B2) 皆透過酪胺酸殘基的間接碘化用 125I 進行標記 (Chizzonite 等人， J Immunol1991;147:1548–56)。使用在 PBS 緩衝液中平衡的 NAP-5 管柱實現放射免疫結合物的純化，並藉由歷經篩析層析法確認。藉由將 6 µCi 之放射免疫結合物以 100 µL 總體積 (50:50 黏液與 PBS 緩衝液比率) 在 37℃ 孵育而在不同時間點 (0、3 及 6 小時) 評估活體外黏液穩定性，然後藉由歷經篩析層析法進行測定。
如圖 11 中所示，單價 Fab 及三價 Fab 結合物在人類囊腫纖維化痰中非常穩定，而四價 Fab-IgG 不太穩定，因為可能存在 Fc 切割。 實例 13 ：黏度測定
在不同濃度下測量 1B2.v104 三聚體結合物的黏度 (cP)。將 1B2.v104 三聚體結合物透析到 20 mM pH 6.0 組胺酸氯化物 + 150 mM NaCl 中，並在旋轉濃縮器中經由滲濾濃縮至表 13 中列出的濃度。使用錐板法在 Anton Parr MCR502 上在 25℃ 進行黏度測量。
結果顯示於表 13 中。所測試之最高濃度 (約 180 mg/mL) 的黏度約為 5 cP，並且在霧化所需的濃縮過程中表現出良好的行為 。表 13：
1B2.v104 三聚體結合物的濃度 (mg/mL) 黏度 (cP)
0.0 0.0
93.4 3.0
141.4 4.3
174.3 5.0
實例 14 ：黏液滲透及功效的測定
藉由處理在氣液界面 (ALI 培養物) 生長的 CF 支氣管上皮細胞培養物來評估 1B2 分子對人類氣道上皮細胞的影響。處理 9 天后，藉由 FACS 評估分泌細胞及纖毛細胞的豐度。杯狀細胞用針對 MUC5B (LSBio cat# C402691-200) 及 MUC5AC (殖株 EPR16904 Abcam cat# ab198294) 的抗體染色，而纖毛細胞用針對 FOXJ1 (殖株 2A5 Thermo cat# 14-9965-82) 或乙醯化-α-微管蛋白 (殖株 6-11B-1 Cell Signaling cat# 12152S) 的抗體染色。1B2 分子以劑量依賴性方式減少分泌細胞並增加纖毛細胞。
ALI 培養物
ALI 培養在 37C/5% CO2 的標準加濕組織培養箱中進行。UNCCF3T 細胞 (Fulcher 等人，AJPLCMP. 2009 Jan;296(1):L82-91. doi: 10.1152/ajplung.90314.2008) 購自 Kerafast (cat# ENC016)，並使用 PneumaCult™-Ex Plus 培養基 (StemCell Technologies cat# 05040) 在 T75 組織培養瓶中擴增直至 80% 融合。將細胞解離並以每孔 50,000 個細胞的密度接種在 96 孔轉孔 (transwell) (Corning cat#7369) 上。將細胞保持在浸沉培養物中直至融合，在該階段移除頂端及基底培養基。將基底培養基替換為 PneumaCult™-ALI 培養基 (StemCell Technologies cat# 05001)，同時將頂端表面暴露在空氣中。按照製造商的說明每週補充培養基三次。培養 5 週後，培養物分化為具有功能性分泌細胞及纖毛細胞的假複層上皮細胞。
在 ALI 培養物分化後，1B2 分子以 100-0,0061 µg/ml (基底處理) 或 6000-0.37 µg/ml (頂端處理) 的四倍稀釋範圍進行基底或頂端投予。在 72 小時後洗除基底處理。非靶向對照抗體 (agD) 用作陰性對照，且泛 Notch2 阻斷抗體 (aN2.76) 用作陽性對照。
FACS 分析
對於 FACS 分析，使用冷細胞消化液 (accutase) (StemCell Technologies cat#07920) 從轉孔中分離細胞，根據製造商的方案 (eBioscience FoxP3 染色緩衝液組 #00-5523-00) 進行固定及透化，並與活/死染色劑 (ThermoFisher #L34968) 一起孵育，然後與針對 MUC5B、MUC5AC、FOXJ1 及 Acet-α-微管蛋白的抗體一起孵育。樣品在染色緩衝液中重懸至最終體積為 200 µl，並添加 10 µl Count BrightTM 絕對計數珠 (Invitrogen #C36950)。使用 BD FACSymphony 完成樣品收集，并且收集並記錄了總共 1500 個珠事件。使用 FlowJo 軟體分析流式細胞分析術資料，藉由對活的單態細胞設門控並為述及之抗體繪製個別門控。
黏膜纖毛轉運測定法
為了評估 ALI 培養物頂端側的黏膜纖毛轉運，在處理後第 7 天，使用以下程序從培養物中去除過量之頂端黏液：1) 將培養物與 1mM DTT 在 PBS 溶液中在 37℃ 一起孵育 30 分鐘，從頂端表面吸出過量之黏液及 PBS，2) 然後在添加並抽吸 PBS 的情況下將培養物從頂端洗滌 3 次。在第 9 天，將 10ul 的 2um 直徑 TRITC 螢光珠 (Thermo Fisher Fluorospheres F8826) 以 1:50,000 的比例稀釋於 PBS 中，添加到頂端表面並使其沉澱在黏液上 20 分鐘。使用 4× Plan Fluor 物鏡 (NA：0.13，Nikon) 在配備 Neo scMOS 相機 (Andor) 的 Nikon Ti-E 倒置顯微鏡上在 37℃/5% CO 2環境室 (Okolab) 中隊珠移動進行成像，全部藉由 NIS Elements 軟體 (Nikon) 運行。圖像以 100 毫秒的間隔獲取 250 幀。在 Imaris Spot Tracking (Bitplane) 中跟踪孔中的全部珠。分析了平均軌道位移、速度及長度，並對 6 個用於對照處理的孔 (agD、aN2.76) 及 3 個用於 1B2 分子的孔取平均值。
圖 12A 顯示，當在基底室中投予時，除 1B2.V103 Fab 之外，全部分子皆具有以劑量依賴性方式增加纖毛細胞數量的能力，如藉由 FOXJ1 染色所評估。圖 12B 顯示，當向頂部表面投予時，除 1B2.V104 IgG 之外，全部分子皆具有以劑量依賴性方式增加纖毛細胞數量的能力，如藉由 FOXJ1 染色所評估。圖 12C 至 12F 顯示，如藉由 MUC5B 或 MUC5AC 染色所評估，除兩個 FAB 片段之外，全部分子皆能夠以劑量依賴性方式減少杯狀細胞數量。雖然 1B2.V104 Fab 導致分泌細胞減少，但即使在所測試的最高劑量下，該減少的百分比亦未能達到陽性對照 aN2.76 所達到者。總之，與活性測定中 FAB 片段的顯著較低效力相一致，此等形式未能顯示出穩健的 PD 效應。
此外，圖 13A 顯示當在基底室中投予 1B2 分子時，在黏液纖毛轉運測定中，螢光珠行進的平均軌道長度。除 FAB 片段外的全部格式皆顯示軌道長度的劑量依賴性增加，表明培養物轉運黏液的能力增加。雖然 1B2.V104 Fab 處理導致軌道長度略有增加，但未達到陽性對照 aN2.76 的水平。圖 13B 顯示當在培養物之頂部側上投予 1B2 分子時，在黏液纖毛轉運測定中，螢光珠行進的平均軌道長度。除 FAB 片段外的全部格式皆顯示軌道長度的劑量依賴性增加，表明培養物轉運黏液的能力增加。雖然 1B2.V104 Fab 處理導致軌道長度增加，但它僅在所測試的最高劑量下才有此效應。此外，相較於其他分子，1B2.V104 Fab-IgG 在頂端投予時表現出增加平均軌道長度的能力降低，表明穿透黏液的能力降低。 實例 15 ：表面活性的測定
使用 Attension Theta 懸滴張力計 (Biolin Scientific, Stockholm, Sweden) 測量蛋白質溶液表面張力的時間演化。向玻璃 Hamilton 注射器中填充蛋白質溶液，且 5 μL 液滴從鈍的 24 號不銹鋼針尖處排出。將液滴圖像記錄 120 秒，且將每幅圖像中之液滴形狀擬合至 Young-Laplace 方程以計算隨時間推移的表面張力值。測量在 0.9% 氯化鈉溶液中稀釋的 1 mg/mL 的全部蛋白質樣品的表面張力。個別地分析三滴，並報告三個測量值之平均值。在實驗之間，用超純水沖洗注射器，且超純水的表面張力經證實為 71 至 73 mN/m。全部測量皆在室溫 (21 至 23℃) 進行。如前所述 (可在 pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.molpharmaceut.5b00089 獲得)，藉由比較表面張力的初始變化來評估蛋白質的界面聚集傾向。先前報導的高風險及低風險抗體在同一測試階段進行測量，用於在評估蛋白質樣品的界面聚集傾向時進行比較。
結果顯示於圖 14 中。發現 1B2 三聚體 (1B2.v104.dPEG 三聚體) 顯示出低表面活性。 實例 16 ：氣溶膠表徵
1B2.v104 三聚體及 1B2.v104 Fab-IgG 係以 75 mg/mL 配製在 20 mM HisAc pH 6.0 + 150 mM NaCl + 0.02% PS20 中。此等溶液使用 Pari e-Flow 進行霧化，以能夠進行液滴尺寸分佈 (DSD) 測量。使用 Spraytec (Malvern Instruments Ltd) 進行 DSD。該分析在測定氣溶膠輸出 (AO) 及氣溶膠輸出速率 (AOR) 的同時進行。為此，使用水平地配置的吸入單元。裝有玻璃纖維過濾器的劑量單位取樣裝置 (DUSA) 接附在吸入單元的末端。這與臨界流量控制器 (TPK, Copley Scientific, UK) 及抽吸泵 (Copley Scientific, UK) 耦合。流速設置為 15 L/min，直到霧化器完全排空或被其控制器 (eFlow®) 關閉。將 2 mL 的各抗體裝載到噴霧器安瓿中。對各組合製劑/霧化器一式兩份地進行測試。DSD 根據體積直徑 10、50 及 90 進行分析，該等體積直徑對應於正態分佈的第 10、50 及 90 個百分位數。在一分鐘霧化過程中收集的測量值用於計算平均值。
AO 及 AOR 與 DSD 一起評估。採用相同的設置來收集各組合製劑/霧化器的 AO 及 AOR 值。評估 AOR，激活霧化器、泵及 TPK 60 秒。然後，移除 DUSA 管 (DUSA 管 1) 及過濾器 (過濾器 1)，並對從霧化器發射的抗體量進行定量。該量報告為 AOR。然後更換 DUSA 管及玻璃過濾器以收集發射的劑量直至霧化結束。為了從 DUSA 管及過濾器中回收抗體，使用了鹽水溶液 (150 mM NaCl，pH 6.0)。然後將過濾器置於超聲浴中 1 分鐘。AO 係計算為霧化的前 60 秒內收集的抗體量 (AOR) 與直到安瓿中完全裝載之劑量 (150 mg) 皆經霧化為止收集的抗體量 (過濾器 2、3 及 DUSA 管 2) 的總和。
結果顯示於圖 15 中。總體而言，該分子的氣溶膠性能與能夠經由霧化給藥相一致。粒徑分佈表明氣溶膠中的可吸入顆粒分率較高，且輸出率總體良好。 實例 17 ：評估在天竺鼠中的藥效學效應 (PD)
阻斷氣道中 Notch2 傳訊的藥效學效應 (PD) 包括減少產生 Muc5b 及 Muc5ac 的杯狀細胞數量以及增加表現 FoxJ1 的纖毛細胞數量。為了評估 1B2.v104 形式的 PD 能力，將 6 至 8 週齡的雌性 Hartley 天竺鼠透過僅鼻吸入暴露於經霧化之分子。吸入系統，包括 12-端口僅鼻吸入塔及適當尺寸之約束裝置，係購自從電子醫療測量系統 (EMMS)。使用 AeroNeb 振動網格實驗室霧化器 (小型 VMD「細霧」型式，標靶 VMD 2.5-4µm，Aerogen) 生成各分子的氣溶膠。全部 1B2.v104 形式皆在 20 mM HisAc、150 mM NaCl，pH 5 至 6 中配製，濃度約為 40 mg/ml。藉由改變各劑量組的暴露時間 (例如，約 4 小時 (500 mg)、＜1.5 小時 (150 mg) 或 ＜30 分鐘 (50 mg)) 來實現不同的劑量水平。對照組經腹膜內給藥非阻斷抗體 (抗 gD 抗體，「agD」)、Jag1 阻斷抗體 (抗 Jagged1 抗體，「aJ1」) 或泛 Notch2 阻斷抗體 (抗 Notch2 抗體，「aN2.76」)。參見表 14。 表 14：所給藥的分子
agD = 標準全長 huIgG1
agD.Fab-三聚體 = gD.huFab.LC_K149C.dPEG_三聚體
aJ1 = 全長 huIgG1.S101T.N297G, Jag1 阻斷劑
aN2.76 = 全長 huIgG1，N297G，泛 Notch2 阻斷劑
aN2.1B2.Fab-三聚體 = 1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG_三聚體
aN2.1B2.Fab-IgG FcRnNull = 1B2.v104.huFab-huIgG1.N297G.AAA
aN2.1B2.IgG FcRn 無效 = 1B2.v104.huIgG1.N297G.AAA
aN2.1B2.Fab-二聚體 = 1B2.v104.huFab.LC_K149C.dPEG_二聚體
動物在治療後 7 天執行安樂死。為了進行組織學分析，將左肺取出並用 10% 中性緩衝福爾馬林充氣、繫緊並浸沒在福爾馬林中。24 小時後，將肺轉移到 70% 乙醇中，並透過乙醇到二甲苯的梯度處理，然後包埋到石蠟塊中。將來自此等塊的 4 um 切片封固在玻璃載玻片上，在 70℃ 焙烤 30 分鐘，裝載到 Ventana Discovery Ultra 平台 (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ) 上，脫石蠟，用 Discovery CC1 (Ventana Cat.# 950-500) 在 95℃ 處理 64 分鐘，然後使用雙重或三重順序免疫螢光測定法進行染色。雙重染色從兔抗 CK8/18、殖株 EP17/EP30 (Cat.# M3652，Agilent Dako, Santa Clara, CA) 開始，用 Discovery OmniMap 抗兔 HRP (Ventana Cat.#760-4311) 偵測，並用 TSA-Cy5 (Ventana Cat.# 760-238) 放大訊號。然後用 Ultra CC2 (Ventana Cat# 950-223) 在 100℃ 溶析抗體 8 分鐘，然後用兔抗 FoxJ1 殖株 EPR21874 (Cat.# ab235445，Abcam, Cambridge, UK) 染色，用 Discovery OmniMap 抗兔 HRP 偵測，並用 TSA-FAM (Ventana Cat.# 760-243) 放大訊號。三重染色從兔抗 Muc5B (cat# HPA008246，Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 開始，用 Discovery OmniMap 抗兔 HRP 偵測，並用 TSA-FAM 放大訊號。然後如上所述溶析抗體，然後用小鼠抗 Muc5AC 殖株 45M1 (cat#MA1-38223，Thermo Fisher Scientific) 染色，用 Discovery OmniMap 抗小鼠 HRP (Ventana Cat.#760-4310) 偵測，並用 DISCOVERY Rhodamine6G (Ventana 目錄號 760-244) 放大訊號。類似地溶析抗體，然後用兔抗 CK8/18 殖株 EP17/EP30 染色，用 Discovery OmniMap 抗兔 HRP 偵測，並用 TSA-Cy5 放大訊號。然後，經雙重及三重染色的載玻片用 4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽 (DAPI，Cat# D1306，Invitrogen/Thermo Fisher, Waltham, MA) 複染，并且用 Prolong Gold (Invitrogen/Thermo Fisher Cat. #P36930) 進行蓋玻片封固。在配備 LX-2000 汞光源以及用於 DAPI、FITC、TRITC、Cy5 及 CFP (Hamamatsu, Hamamatsu City, Japan) 的螢光濾光片組的 Nanozoomer XR 上捕獲完整蓋玻片之 20 倍圖像。將圖像輸入定制的圖像查看器進行管理/手動註釋，然後使用 MATLAB (Mathworks, Natick, Massachusetts) 中之定制設計腳本將 Foxj1、Muc5b 及 Muc5ac 的氣道上皮表現定量；分析讀數為 FoxJ1+ 面積佔所分析之氣道上皮 DAPI+ 核心面積的百分比，以及 Muc5b+ 機 Muc5ac+ 面積佔所分析之氣道上皮面積的百分比。圖像資料在 Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) 中繪製，並且使用 ANOVA + Dunnett 檢驗與 a-gD IP 治療組之彼等進行比較。
在不同時間點對天竺鼠進行霧化給藥後，評估 1B2.v104 形式在肺及血液中的濃度。收集肺均質物及血清樣品，並藉由以下免疫吸附測定法分析抗體濃度。
對於 1B2.v104 形式：將 Notch-ECD 蛋白塗覆在 384 孔 Maxisorp 板 (Nunc # 464718) 上。板用 PBS+0.5%BSA 封閉。將天竺鼠血清樣品在樣品緩衝液 (1X PBS、0.5% BSA、0.05% Tween 20、0.35M NaCl、0.25% CHAPS、15PPM Proclin) 中稀釋，並在室溫在板中孵育。將辣根過氧化物酶結合的猴吸附山羊抗人 IgG，(H&L)，(Bethyl，目錄 #A80-319P) 抗體添加到板中。添加 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺 (TMB) 過氧化物酶受質 (KPL，目錄 #5120-0077) 15 分鐘，然後添加等體積的 1M 磷酸以終止反應。以 620nm 作為參考波長，讀取板在 450 nm 的吸光度。
對於 aJ1 及 aN2.76 ：將抗人 Fab (Jackson ImmunoResearch，目錄 #109-006-0) F(ab)2 片段塗覆在 384 孔 Maxisorp 板 (Nunc # 464718) 上。板用 PBS+0.5%BSA 封閉。將天竺鼠血清樣品在樣品緩衝液 (1X PBS + 0.5% BSA + 0.35M NaCl + 0.05% tween 20 + 0.25% CHAPS + 5 mM EDTA + 15PPM Proclin) 中稀釋，並在室溫在板中孵育。將辣根過氧化物酶結合的抗人 IgG Fcγ 片段特異性抗體 (Jackson ImmunoResearch 目錄 #109-036-098 6-098) 添加到板中。添加 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺 (TMB) 過氧化物酶受質 (KPL，目錄 #5120-0077) 15 分鐘，然後添加等體積的 1M 磷酸以終止反應。以 620 nm 作為參考波長，讀取板在 450 nm 的吸光度。
對於 agD.IgG 及 agD.Fab- 三聚體：將 gD 蛋白塗覆在 384 孔 Maxisorp 板 (Nunc # 464718) 上。板用 PBS+0.5%BSA 封閉。將天竺鼠血清樣品在樣品緩衝液 (1X PBS + 0.5% BSA + 0.35M NaCl + 0.05% tween 20 + 0.25% CHAPS + 5 mM EDTA + 15PPM Proclin) 中稀釋，並在室溫在板中孵育。將辣根過氧化物酶結合的猴吸附山羊抗人 IgG (H&L) (Bethyl，目錄 #A80-319P) 抗體添加到板中。添加 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺 (TMB) 過氧化物酶受質 (KPL，目錄 #5120-0077) 15 分鐘，然後添加等體積的 1M 磷酸以終止反應。以 620 nm 作為參考波長，讀取板在 450 nm 的吸光度。
圖 16A 顯示天竺鼠氣道上皮細胞的 FOXJ1 染色的代表性圖像，其中細胞核經 DAPI 複染。
圖 16B 顯示定量的氣道上皮 FOXJ1 陽性面積佔 DAPI 陽性核心面積的百分比 (兩者皆在分段的 CK8/18 陽性氣道上皮面積內)。對於 IP 給藥組，劑量顯示為 mg/Kg，且對於霧化組，劑量顯示為霧化的總 mg。第 7 天的 FOXJ1 訊號如預期地因應於全身 (IP) Notch2-Jag 通路阻斷而增加，其中 a-N2.76 45 mg/kg IP 顯示最大 PD (增加約 32%，p ＜ 0.0001)，且 a- J1 45 mg/kg IP 組顯示部分 PD (增加約 17%，p ＜ 0.05)。在霧化組中，兩個高劑量 a-N2-1B2.Fab-三聚體組皆顯示出顯著的 FoxJ1 升高 (500 mg 時約 18%，p ＜ 0.05；3x 260 mg 時約 37%，p ＜ 0.0001)，而全部其他霧化組皆沒有明顯的 PD 效應。
圖 16C 顯示天竺鼠氣道上皮細胞的 MUC5B 染色的代表性圖像，其中細胞核經 DAPI 複染。
圖 16D 顯示定量的氣道上皮 MUC5B 陽性面積佔分段的 CK8/18 陽性氣道上皮面積的百分比。對於 IP 給藥組，劑量顯示為 mg/Kg，且對於霧化組，劑量顯示為霧化的總 mg。在第 7 天，與 a-gD IP 對照組相比，Muc5b 訊號因應於全身 (IP) Notch2-Jag 通路阻斷而降低，其中 a-N2.76 45 mg/kg IP 對照組顯示最大 PD (降低約 20%，p ＜ 0.0001)，且 a-J1 45 mg/kg IP 對照組顯示降低趨勢，但未達到統計學顯著性。在第 7 天，在霧化組中，150 mg 及更高劑量的 Neb a-N2.1B2.Fab-三聚體組各自顯示降低約 10-12% (p ＜ 0.01)，而陽性對照 150 mg Neb a-N2.76 組顯示 Muc5b 降低約 9% (p ＜0.05)。
圖 16E 顯示定量的氣道上皮 MUC5AC 陽性面積佔分段的 CK8/18 陽性氣道上皮面積的百分比。對於 IP 給藥組，劑量顯示為 mg/Kg，且對於霧化組，劑量顯示為霧化的總 mg。相較於 a-gD IP 對照組，Muc5ac 測量值的方差相對較高，第 7 天的組均值差異無統計學意義，但觀察到 a-N2.76 及 a-J1 45 mg/kg IP 組以及 3x 260 mg Neb a-N2.1B2.Fab-三聚體組的提示性降低趨勢。此等資料在很大程度上對應於在同一肺部的 FoxJ1 IF 圖像分析資料中觀察到的 PD 效應，其中最顯著的例外為 150 mg Neb a-N2-1B2.Fab-三聚體組沒有觀察到顯著的 FoxJ1 PD 效應，此係與針對此等相同組觀察到的顯著 Muc5b PD 效應形成對比的發現。綜上所述，此地發現提出了轉分化在此等組中可能為不完全的，或者更確切而言，僅影響 Muc5b 表現而沒有完全轉分化為纖毛細胞。
使用 Fab-三聚體時觀察到了與 Fab-IgG 相比更好的 PD 效果。圖 16C 至 16E 顯示杯狀細胞減少，且圖 16A 至 16C 顯示在用 Fab-三聚體治療後纖毛細胞增加。MUC5AC 定位於天竺鼠的小氣道中。對照組的 MUC5AC 染色量為可變的，使得統計分析不可行。在 MUC5AC 中缺乏強效可能是由於 MCC 導致到小氣道的輸送低或在小氣道中的停留時間短。如果脫落 (scaling) 為異速生長的，則天竺鼠 PD 劑量反映了臨床上可行的劑量。
圖 17A 及 17B 顯示 1B2.v104 IgG、1B2.v104 Fab-三聚體及 1B2.v104 Fab-IgG 的藥物動力學分析。吸入劑量高達 780 mg 的 1B2.v104 形式後，緩慢的吸收及快速的全身清除將血清 Cmax 限制在低於 1 µg/mL。到給藥後第 7 天，全身暴露量為不可偵測的或在偵測限附近。相較於血清 (圖 17A)，在肺均質物 (圖 17B) 中觀察到顯著更高的暴露量，表明大部分分子在吸入劑量後被限制在肺內。
圖 18A 顯示天竺鼠氣道上皮細胞的 FOXJ1 染色的代表性圖像，其中細胞核經 DAPI 複染。
圖 18B 顯示定量的氣道上皮 FOXJ1 陽性面積佔 DAPI 陽性核心面積的百分比 (兩者皆在分段的 CK8/18 陽性氣道上皮面積內)。對於 IP 給藥組，劑量顯示為 mg/Kg，且對於霧化組，劑量顯示為霧化的總 mg。與經 a-gD.Fab-三聚體治療的陰性對照組相比，所測試的全部治療組皆顯示氣道上皮核心 FoxJ1 訊號增加趨勢或統計學顯著的 (p ＜ 0.05) 增加，反映從分泌細胞到纖毛細胞的轉分化。特定而言，用兩個最高劑量的抗 Notch2.1B2Fab-二聚體治療的組顯示出與抗 Jag1 IP 陽性對照及 a-N2.1B2.Fab-三聚體組相當或更高的統計學顯著的增加。統計學顯著組的效應大小為：17% (a-J1 IP 對照)、20% (a-N2.1B2Fab-二聚體 300 mg) 及 19% (a-N2.1B2Fab-二聚體 780 mg)。相比之下，a-N2.1B2Fab-三聚體組趨向於 9% (150 mg)、9% (300 mg) 及 15% (780 mg) 的更適中的效應大小。
圖 18C 及 18D 顯示定量的氣道上皮 MUC5B 陽性及 MUC5AC 陽性面積作為分段的 CK8/18 陽性氣道上皮面積的百分比。對於 IP 給藥組，劑量顯示為 mg/Kg，且對於霧化組，劑量顯示為霧化的總 mg。雖然 Muc5b 及 Muc5ac 分析資料有噪聲並且未觀察到與 a-gD.Fab-三聚體 neb 150 mg 治療組相比具有統計學意義的治療效應，但趨勢與 FOXJ1 免疫螢光分析觀察到的治療效應大體相一致，即統計學上更穩健。
圖 19A 及 19B 顯示 1B2.v104 Fab-三聚體及 1B2.v104 Fab-二聚體的藥物動力學分析。吸入劑量高達 780 mg 的 1B2 形式後，緩慢的吸收及快速的全身清除將血清 Cmax 限制在低於 10 µg/mL。到給藥後第 7 天，全身暴露量為不可偵測的或在偵測限附近。相較於血清，在肺均質物中觀察到顯著更高的暴露量，表明大部分分子在吸入劑量後被限制在肺內。
儘管為了清楚理解起見，藉由圖示及實例的方式對上述發明進行了詳細描述，但是此等描述及實例不應被解釋是限製本發明之範圍。本文引用的所有專利及科學文獻的揭露內容皆以引用的方式明確納入其所有內容。 IV. 特定序列表
SEQ ID NO 說明 序列
1 rat1B2、hu1B2.L1、hu1B2.L7、hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103、hu1B2.v104 的 CDR-L1 QTSEDIYSGLA
2 rat1B2、hu1B2.L1、hu1B2.L7、hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103、hu1B2.v104 的 CDR-L2 GASRLQD
3 rat1B2、hu1B2.L1、hu1B2.L7、hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103、hu1B2.v104 的 CDR-L3 QQGFKYPLT
4 rat1B2、hu.1B2.v1.DFS.H1、hu.1B2.H10、hu.1B2.DFS.H14、hu.1B2.H1.N54D.S51Q、hu.1B2.v2、hu.1B2.v4、hu.1B2.v8、hu.1B2.v9、hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103、hu1B2.v104 的 CDR-H1 DFYME
5 rat1B2 的 CDR-H2 ASRNKANNFSIVYSASVKD
6 hu.1B2.v1.DFS.H1、hu.1B2.H10、hu.1B2.DFS.H14 的 CDR-H2 ASRNKANDFSIVYSASVKD
7 hu.1B2.H1.N54D.S51Q、hu.1B2.v2, hu.1B2.v4、hu.1B2.v8、hu.1B2.v9、hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103、hu1B2.v104 的 CDR-H2 AQRNKANDFSIVYSASVKD
8 rat1B2、hu.1B2.v1.DFS.H1、hu.1B2.H10、hu.1B2.DFS.H14、hu.1B2.H1.N54D.S51Q 的 CDR-H3 DSGRWGLDA
9 hu.1B2.v2、hu1B2.v101 的 CDR-H3 DGGRWGLDA
10 hu.1B2.v4、hu1B2.v102 的 CDR-H3 DGGRLALDA
11 hu.1B2.v8、hu1B2.v104 的 CDR-H3 DGGKLALDA
12 hu.1B2.v9、hu1B2.v103 的 CDR-H3 DGGKWGLDA
87 hu1B2.L1、hu1B2.L7、hu.1B2.v101、hu.1B2.v102、hu.1B2.v103、hu.1B2.v104 的 LC-FR1 DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITC
88 hu1B2.L1、hu1B2.L7、hu.1B2.v101、hu.1B2.v102、hu.1B2.v103、hu.1B2.v104 的 LC-FR2 WYQQKP GKSPKLLIY
89 hu1B2.L1 的 LC-FR3 GVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYFC
90 hu1B2.L7、hu.1B2.v101、hu.1B2.v102、hu.1B2.v103、hu.1B2.v104 的 LC-FR3 GVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYC
91 hu1B2.L1、hu1B2.L7、hu.1B2.v101、hu.1B2.v102、hu.1B2.v103、hu.1B2.v104 的 LC-FR4 FGG GTKVEIK
92 hu.1B2.v1.DFS.H1、hu.1B2.H10、hu.1B2.DFS.H14、hu.1B2.H1.N54D.S51Q、hu.1B2.v2、hu.1B2.v4、hu.1B2.v8、hu.1B2.v9、hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103、hu1B2.v104 的 HC-FR1 EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS
93 hu.1B2.v1.DFS.H1、hu.1B2.H1.N54D.S51Q、hu.1B2.v2、hu.1B2.v4、hu.1B2.v8、hu.1B2.v9 的 HC-FR2 WIRQA SGKGLEWIA
94 hu.1B2.H10、hu.1B2.DFS.H14、hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103、hu1B2.v104 的 HC-FR2 WVRQA SGKGLEWVA
95 hu.1B2.v1.DFS.H1、hu.1B2.H1.N54D.S51Q、hu.1B2.v2、hu.1B2.v4、hu.1B2.v8、hu.1B2.v9 的 HC-FR3 RF TISRDTSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR
109 hu.1B2.H10 的 HC-FR3 RF TISRDDSKST AYLQMNSLKT EDTAVYYCSR
96 hu.1B2.DFS.H14、hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103、hu1B2.v104 的 HC-FR3 RF TISRDDSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR
97 hu.1B2.v1.DFS.H1、hu.1B2.H10、hu.1B2.DFS.H14、hu.1B2.H1.N54D.S51Q、hu.1B2.v2、hu.1B2.v4、hu.1B2.v8、hu.1B2.v9、hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103、hu1B2.v104 的 HC-FR4 W GQGTLVTVSS
13 rat.1B2 輕鏈可變區 (VL) DIQMTQSPAS LSASLGETVT IQCQTSEDIY SGLAWYHQKP GKSPQLLIYG ASRLQDGVPS RFTGSGSGTQ YSLKISSMQT EDEGVYFCQQ GFKYPLTFGS GTKLEIK
14 rat.1B2 重鏈可變區 (VH) EVKLVDYGGG LVQPGASLRL SCEVSGFTFS DFYMEWIRQA PGKGLEWIAA SRNKANNFSI VYSASVKDRF TISRDTYKSI LYLQMSTLKP EDTAVYYCSR DSGRWGLDAW GQGTSVIVSS
15 hu.1B2.L1 VL DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCQTSEDIY SGLAWYQQKP GKSPKLLIYG ASRLQDGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYFCQQ GFKYPLTFGG GTKVEIK
16 hu.1B2.L7 VL DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCQTSEDIY SGLAWYQQKP GKSPKLLIYG ASRLQDGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GFKYPLTFGG GTKVEIK
17 hu.1B2.v1.DFS.H1 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWIRQA SGKGLEWIAA SRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDTSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DSGRWGLDAW GQGTLVTVSS
18 hu.1B2.H10 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWVRQA SGKGLEWVAA SRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDDSKST AYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DSGRWGLDAW GQGTLVTVSS
19 hu.1B2.DFS.H14 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWVRQA SGKGLEWVAA SRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDDSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DSGRWGLDAW GQGTLVTVSS
20 hu.1B2.H1.N54D.S51Q VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWIRQA SGKGLEWIAA QRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDTSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DSGRWGLDAW GQGTLVTVSS
21 hu.1B2.v2 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWIRQA SGKGLEWIAA QRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDTSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DGGRWGLDAW GQGTLVTVSS
22 hu.1B2.v4 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWIRQA SGKGLEWIAA QRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDTSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DGGRLALDAW GQGTLVTVSS
23 hu.1B2.v8 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWIRQA SGKGLEWIAA QRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDTSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DGGKLALDAW GQGTLVTVSS
24 hu.1B2.v9 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWIRQA SGKGLEWIAA QRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDTSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DGGKWGLDAW GQGTLVTVSS
25 hu.1B2.v101 VL DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCQTSEDIY SGLAWYQQKP GKSPKLLIYG ASRLQDGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GFKYPLTFGG GTKVEIK
26 hu.1B2.v101 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWVRQA SGKGLEWVAA QRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDDSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DGGRWGLDAW GQGTLVTVSS
27 hu.1B2.v102 VL DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCQTSEDIY SGLAWYQQKP GKSPKLLIYG ASRLQDGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GFKYPLTFGG GTKVEIK
28 hu.1B2.v102 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWVRQA SGKGLEWVAA QRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDDSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DGGRLALDAW GQGTLVTVSS
29 hu.1B2.v103 VL DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCQTSEDIY SGLAWYQQKP GKSPKLLIYG ASRLQDGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GFKYPLTFGG GTKVEIK
30 hu.1B2.v103 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWVRQA SGKGLEWVAA QRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDDSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DGGKWGLDAW GQGTLVTVSS
31 hu.1B2.v104 VL DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCQTSEDIY SGLAWYQQKP GKSPKLLIYG ASRLQDGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GFKYPLTFGG GTKVEIK
32 hu.1B2.v104 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWVRQA SGKGLEWVAA QRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDDSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DGGKLALDAW GQGTLVTVSS
107 hu.1B2.v104 Fab 輕鏈 K149C DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCQTSEDIY SGLAWYQQKP GKSPKLLIYG ASRLQDGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GFKYPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWCV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
108 hu.1B2.v104 Fab 重鏈 EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCAVSGFTFS DFYMEWVRQA SGKGLEWVAA QRNKANDFSI VYSASVKDRF TISRDDSKST LYLQMNSLKT EDTAVYYCSR DGGKLALDAW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCD
33 rat.3107、CDR-L1、hu.3107.L1、hu.3107.L6 及 hu.3107.L7 RSSQSLVHSDGNTYLH
34 rat.3107、CDR-L2、hu.3107.L1、hu.3107.L6 及 hu.3107.L7 RISNRFS
35 rat.3107、CDR-L3、hu.3107.L1、hu.3107.L6 及 hu.3107.L7 LQSTHFPDT
36 rat.3107 CDR-H1、hu.3107.V1-2.H1、hu.3107.H12、hu.3107.H13、hu.3107.V5-51.H1、hu.3107.H14 及 hu.3107.H15 NYVIH
37 rat.3107 CDR-H2、hu.3107.V1-2.H1、hu.3107.H12、hu.3107.H13、hu.3107.V5-51.H1、hu.3107.H14 及 hu.3107.H15 YIIPGSGGTKFNEKFKG
38 rat.3107 CDR-H3、hu.3107.V1-2.H1、hu.3107.H12、hu.3107.H13、hu.3107.V5-51.H1、hu.3107.H14 及 hu.3107.H15 DGAGSFTY
39 rat.3107 VL DVLMTQTPVS LPVSLGGQVS ISCRSSQSLV HSDGNTYLHW FLQKPGQSPQ LLIYRISNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEPEDLGV YYCLQSTHFP DTFGGGTKVE IK
40 rat.3107 VH QVQLQQSGAE LAKSGSSVKI SCKASGYTFS NYVIHWIKQT TGQAPEWTGY IIPGSGGTKF NEKFKGKATL TVDKSSTTAY MQLSSLTPVD TAVYYCARDG AGSFTYWGQG TLVTVSS
98 hu.3107.L1 VL DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQSLV HSDGNTYLHW FQQRPGQSPR LLIYRISNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCLQSTHFP DTFGGGTKVE IK
99 hu.3107.L6 VL DVVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRSSQSLV HSDGNTYLHW FQQKPGQPPK LLIYRISNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLTI SSLQAEDVAV YYCLQSTHFP DTFGGGTKVE IK
100 hu.3107.L7 VL DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRSSQSLV HSDGNTYLHW YQQKPGQPPK LLIYRISNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLTI SSLQAEDVAV YYCLQSTHFP DTFGGGTKVE IK
101 hu.3107.V1-2.H1 VH EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFS NYVIHWIRQA PGQGPEWTGY IIPGSGGTKF NEKFKGRATL TVDKSSTTAY MELSRLRSDD TVVYYCARDG AGSFTYWGQG TLVTVSS
102 hu.3107.H12 VH EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFS NYVIHWVRQA PGQGPEWTGY IIPGSGGTKF NEKFKGRATS TVDTSSTTAY MELSRLRSDD TVVYYCARDG AGSFTYWGQG TLVTVSS
103 hu.3107.H13 VH EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFS NYVIHWVRQA PGQGPEWTGY IIPGSGGTKF NEKFKGRATS TVDTSITTAY MELSRLRSDD TVVYYCARDG AGSFTYWGQG TLVTVSS
104 hu.3107.V5-51.H1 VH EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKASGYTFS NYVIHWIRQM PGKGPEWTGY IIPGSGGTKF NEKFKGQATL SVDKSSTTAY LQWSSLKASD TAMYYCARDG AGSFTYWGQG TLVTVSS
105 hu.3107.H14 VH EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYTFS NYVIHWVRQM PGKGPEWTGY IIPGSGGTKF NEKFKGQATI SVDKSSTTAY LQWSSLKASD TAMYYCARDG AGSFTYWGQG TLVTVSS
106 hu.3107.H15 VH EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYTFS NYVIHWVRQM PGKGPEWTGY IIPGSGGTKF NEKFKGQATI SVDKSITTAY LQWSSLKASD TAMYYCARDG AGSFTYWGQG TLVTVSS
41 rb.2338 CDR-L1 QASQSISSYLA
42 rb.2338 CDR-L2 RASKLAS
43 rb.2338 CDR-L3 QSNSYGNNWVGG
44 rb.2338 CDR-H1 SGYDMC
45 rb.2338 CDR-H2 CIYAGSEGFTYYASWAK
46 rb.2338 CDR-H3 WTDSDGSNL
47 rb.2338 VL DVVMTQTPAS VEAAVGGTVT IKCQASQSIS SYLAWYQQKP GQPPKLLIYR ASKLASGVPS RFSGRGSGTQ FTLTISDLEC ADAATYYCQS NSYGNNWVGG FGGGTKVEIK
48 rb.2338 VH QSLEESGGDL VKPGASLTLT CTASGFSFSS GYDMCWVRQA PGKGLEWIAC IYAGSEGFTY YASWAKGRFT ISKSSSTTVT LQMTSLTVAD TATYFCARWT DSDGSNLWGP GTLVTVSS
49 rb.2430、rb.2430.C95dS CDR-L1 QASQSVVNNRLA
50 rb.2430、rb.2430.C95dS CDR-L2 GASTLES
51 rb.2430 CDR-L3 QGEFLCSSGDCVA
52 rb.2430.C95dS CDR-L3 QGEFLCSSGDSVA
53 rb.2430、rb.2430.C95dS CDR-H1 SYDMS
54 rb.2430、rb.2430.C95dS CDR-H2 IIQAGSNTLFYASWA
55 rb.2430、rb.2430.C95dS CDR-H3 GGVIFIIGHFNL
56 rb.2430 VL AQVLTQTASS VSAAVGGTVT INCQASQSVV NNRLAWYQQK PGQPPKLLMY GASTLESGVS SRFKGSGSGT QFTLTISGVQ CDDAATYYCQ GEFLCSSGDC VAFGGGTKVE IK
57 rb.2430.C95dS VL AQVLTQTASS VSAAVGGTVT INCQASQSVV NNRLAWYQQK PGQPPKLLMY GASTLESGVS SRFKGSGSGT QFTLTISGVQ CDDAATYYCQ GEFLCSSGDS VAFGGGTKVE IK
58 rb.2430 VH QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSS YDMSWVRQAP GKGLEWIGII QAGSNTLFYA SWAKGRFTIS KTSTTVDLKI TSPTTEDTAT YFCARGGVIF IIGHFNLWGP GTLVTVSS
59 rb.2621 CDR-L1 QASESIGSYLA
60 rb.2621 CDR-L2 RASTLAS
61 rb.2621 CDR-L3 QQTYSGAGVDNL
62 rb.2621 CDR-H1 SGYDMC
63 rb.2621 CDR-H2 CIVTVSGNTYYASWAK
64 rb.2621 CDR-H3 DGGFTDTWYFHL
65 rb.2621 VL AYDMTQTPAS VEVAVGGTVT IKCQASESIG SYLAWYQQKP GQPPKLLIYR ASTLASGVPS RFKGSGSGTE FTLTISGVQC DDAATYYCQQ TYSGAGVDNL FGGGTKVEIK
66 rb.2621 VH QSLEESGGGL VQPGASLTLT CTASGFSFSS GYDMCWVRQA PGKGLEWIAC IVTVSGNTYY ASWAKGRFTI SKTSSTTVTL QMTSLTAADT ATYFCARDGG FTDTWYFHLW GPGTLVTVSS
67 MBP-huNotch2 EGF6-10 AGSMGKIEEG KLVIWINGDK GYNGLAEVGK KFEKDTGIKV TVEHPDKLEE KFPQVAATGD GPDIIFWAHD RFGGYAQSGL LAEITPDKAF QDKLYPFTWD AVRYNGKLIA YPIAVEALSL IYNKDLLPNP PKTWEEIPAL DKELKAKGKS ALMFNLQEPY FTWPLIAADG GYAFKYENGK YDIKDVGVDN AGAKAGLTFL VDLIKNKHMN ADTDYSIAEA AFNKGETAMT INGPWAWSNI DTSKVNYGVT VLPTFKGQPS KPFVGVLSAG INAASPNKEL AKEFLENYLL TDEGLEAVNK DKPLGAVALK SYEEELAKDP RIAATMENAQ KGEIMPNIPQ MSAFWYAVRT AVINAASGRQ TVDEALKDAQ TNSSSNNNNN NNNNNGENLY FQGSDSLYVP CAPSPCVNGG TCRQTGDFTF ECNCLPGFEG STCERNIDDC PNHRCQNGGV CVDGVNTYNC RCPPQWTGQF CTEDVDECLL QPNACQNGGT CANRNGGYGC VCVNGWSGDD CSENIDDCAF ASCTPGSTCI DRVASFSCMC PEGKAGLLCH LDDACISNPC HKGALCDTNP LNGQYICTCP QGYKGADCTE DVDEGNSHHH HHHHH
68 MBP-huNotch2 EGF7-9 AGSMGKIEEG KLVIWINGDK GYNGLAEVGK KFEKDTGIKV TVEHPDKLEE KFPQVAATGD GPDIIFWAHD RFGGYAQSGL LAEITPDKAF QDKLYPFTWD AVRYNGKLIA YPIAVEALSL IYNKDLLPNP PKTWEEIPAL DKELKAKGKS ALMFNLQEPY FTWPLIAADG GYAFKYENGK YDIKDVGVDN AGAKAGLTFL VDLIKNKHMN ADTDYSIAEA AFNKGETAMT INGPWAWSNI DTSKVNYGVT VLPTFKGQPS KPFVGVLSAG INAASPNKEL AKEFLENYLL TDEGLEAVNK DKPLGAVALK SYEEELAKDP RIAATMENAQ KGEIMPNIPQ MSAFWYAVRT AVINAASGRQ TVDEALKDAQ TNSSSNNNNN NNNNNGENLY FQGSERNIDD CPNHRCQNGG VCVDGVNTYN CRCPPQWTGQ FCTEDVDECL LQPNACQNGG TCANRNGGYG CVCVNGWSGD DCSENIDDCA FASCTPGSTC IDRVASFSCM CPEGKAGLLC HLDDAGNSHH HHHHHH
69 huNotch2 EGF7 (胺基酸 260 至 296)；cynoNotch2 EGF7 (胺基酸 260 至 296) 天竺鼠 Notch2 EGF7 (胺基酸 244 至 280) N IDDCPNHRCQ NGGVCVDGVN TYNCRCPPQW TGQFCT
70 人類 Notch2，有信號序列 (胺基酸 1 至 25) MPALRPALLW ALLALWLCCA APAHALQCRD GYEPCVNEGM CVTYHNGTGY CKCPEGFLGE YCQHRDPCEK NRCQNGGTCV AQAMLGKATC RCASGFTGED CQYSTSHPCF VSRPCLNGGT CHMLSRDTYE CTCQVGFTGK ECQWTDACLS HPCANGSTCT TVANQFSCKC LTGFTGQKCE TDVNECDIPG HCQHGGTCLN LPGSYQCQCP QGFTGQYCDS LYVPCAPSPC VNGGTCRQTG DFTFECNCLP GFEGSTCERN IDDCPNHRCQ NGGVCVDGVN TYNCRCPPQW TGQFCTEDVD ECLLQPNACQ NGGTCANRNG GYGCVCVNGW SGDDCSENID DCAFASCTPG STCIDRVASF SCMCPEGKAG LLCHLDDACI SNPCHKGALC DTNPLNGQYI CTCPQGYKGA DCTEDVDECA MANSNPCEHA GKCVNTDGAF HCECLKGYAG PRCEMDINEC HSDPCQNDAT CLDKIGGFTC LCMPGFKGVH CELEINECQS NPCVNNGQCV DKVNRFQCLC PPGFTGPVCQ IDIDDCSSTP CLNGAKCIDH PNGYECQCAT GFTGVLCEEN IDNCDPDPCH HGQCQDGIDS YTCICNPGYM GAICSDQIDE CYSSPCLNDG RCIDLVNGYQ CNCQPGTSGV NCEINFDDCA SNPCIHGICM DGINRYSCVC SPGFTGQRCN IDIDECASNP CRKGATCING VNGFRCICPE GPHHPSCYSQ VNECLSNPCI HGNCTGGLSG YKCLCDAGWV GINCEVDKNE CLSNPCQNGG TCDNLVNGYR CTCKKGFKGY NCQVNIDECA SNPCLNQGTC FDDISGYTCH CVLPYTGKNC QTVLAPCSPN PCENAAVCKE SPNFESYTCL CAPGWQGQRC TIDIDECISK PCMNHGLCHN TQGSYMCECP PGFSGMDCEE DIDDCLANPC QNGGSCMDGV NTFSCLCLPG FTGDKCQTDM NECLSEPCKN GGTCSDYVNS YTCKCQAGFD GVHCENNINE CTESSCFNGG TCVDGINSFS CLCPVGFTGS FCLHEINECS SHPCLNEGTC VDGLGTYRCS CPLGYTGKNC QTLVNLCSRS PCKNKGTCVQ KKAESQCLCP SGWAGAYCDV PNVSCDIAAS RRGVLVEHLC QHSGVCINAG NTHYCQCPLG YTGSYCEEQL DECASNPCQH GATCSDFIGG YRCECVPGYQ GVNCEYEVDE CQNQPCQNGG TCIDLVNHFK CSCPPGTRGL LCEENIDDCA RGPHCLNGGQ CMDRIGGYSC RCLPGFAGER CEGDINECLS NPCSSEGSLD CIQLTNDYLC VCRSAFTGRH CETFVDVCPQ MPCLNGGTCA VASNMPDGFI CRCPPGFSGA RCQSSCGQVK CRKGEQCVHT ASGPRCFCPS PRDCESGCAS SPCQHGGSCH PQRQPPYYSC QCAPPFSGSR CELYTAPPST PPATCLSQYC ADKARDGVCD EACNSHACQW DGGDCSLTME NPWANCSSPL PCWDYINNQC DELCNTVECL FDNFECQGNS KTCKYDKYCA DHFKDNHCDQ GCNSEECGWD GLDCAADQPE NLAEGTLVIV VLMPPEQLLQ DARSFLRALG TLLHTNLRIK RDSQGELMVY PYYGEKSAAM KKQRMTRRSL PGEQEQEVAG SKVFLEIDNR QCVQDSDHCF KNTDAAAALL ASHAIQGTLS YPLVSVVSES LTPERTQLLY LLAVAVVIIL FIILLGVIMA KRKRKHGSLW LPEGFTLRRD ASNHKRREPV GQDAVGLKNL SVQVSEANLI GTGTSEHWVD DEGPQPKKVK AEDEALLSEE DDPIDRRPWT QQHLEAADIR RTPSLALTPP QAEQEVDVLD VNVRGPDGCT PLMLASLRGG SSDLSDEDED AEDSSANIIT DLVYQGASLQ AQTDRTGEMA LHLAARYSRA DAAKRLLDAG ADANAQDNMG RCPLHAAVAA DAQGVFQILI RNRVTDLDAR MNDGTTPLIL AARLAVEGMV AELINCQADV NAVDDHGKSA LHWAAAVNNV EATLLLLKNG ANRDMQDNKE ETPLFLAARE GSYEAAKILL DHFANRDITD HMDRLPRDVA RDRMHHDIVR LLDEYNVTPS PPGTVLTSAL SPVICGPNRS FLSLKHTPMG KKSRRPSAKS TMPTSLPNLA KEAKDAKGSR RKKSLSEKVQ LSESSVTLSP VDSLESPHTY VSDTTSSPMI TSPGILQASP NPMLATAAPP APVHAQHALS FSNLHEMQPL AHGASTVLPS VSQLLSHHHI VSPGSGSAGS LSRLHPVPVP ADWMNRMEVN ETQYNEMFGM VLAPAEGTHP GIAPQSRPPE GKHITTPREP LPPIVTFQLI PKGSIAQPAG APQPQSTCPP AVAGPLPTMY QIPEMARLPS VAFPTAMMPQ QDGQVAQTIL PAYHPFPASV GKYPTPPSQH SYASSNAAER TPSHSGHLQG EHPYLTPSPE SPDQWSSSSP HSASDWSDVT TSPTPGGAGG GQRGPGTHMS EPPHNNMQVY A
71 食蟹獼猴 Notch2，有信號序列 (胺基酸 1 至 25 M PALRPALLWA LLALWLCRAA PARALQCRDG YEPCVNEGMC VTYHNGTGYC KCPEGFLGEY CQHRDPCEKN RCQNGGTCVA QAMLGKATCR CASGFTGEDC QYSTSHPCFV SRPCLNGGTC HMLSRDTYEC TCQVGFTGKE CQWTDACLSH PCANGSTCTT VANQFSCKCL TGFTGQKCET DVNECDIPGH CQHGGTCLNL PGSYQCQCPQ GFTGQHCDSL YVPCAPSPCV NGGTCRQTGD FTFECNCLPG FEGSTCERNI DDCPNHRCQN GGVCVDGVNT YNCRCPPQWT GQFCTEDVDE CLLQPNACQN GGTCANRNGG YGCVCVNGWS GDDCSENIDD CAFASCTPGS TCIDRVASFS CMCPEGKAGL LCHLDDACIS NPCHKGALCD TNPLNGQYIC TCPQGYKGAD CTEDVDECAM ANSNPCEHAG KCVNTDGAFH CECLKGYAGP RCEMDINECH SDPCQNDATC LDKIGGFTCL CMPGFKGVHC ELEINECQSN PCVNNGQCVD KVNRFQCLCP PGFTGPVCQI DIDDCSSTPC LNGAKCIDHP NGYECQCATG FTGVLCEENI DNCDPDPCHH GQCQDGIDSY TCICNPGYMG AICSDQIDEC YSSPCLNDGR CIDLVNGYQC NCQPGTSGVN CEINFDDCAS NPCIHGICMD GINRYSCVCS PGFTGQRCNI DIDECASNPC RKGATCINGV NGFRCICPEG PHHPSCYSQV NECLSNPCIH GNCTGGLSGY KCLCDAGWVG INCEVDKNEC LSNPCQNGGT CDNLVNGYRC TCKKGFKGYN CQVNIDECAS NPCLNQGTCF DDISGYTCHC VLPYTGKNCQ TVLAPCSPNP CENAAVCKES PNFESYTCLC APGWQGQRCT IDIDECISKP CMNHGLCHNT QGSYMCECPP GFSGMDCEED IDDCLANPCQ NGGSCVDGVN TFSCLCLPGF TGDKCQTDMN ECLSEPCKNG GTCSDYVNSY TCKCQAGFDG VHCENNIDEC TESSCFNGGT CVDGINSFSC LCPVGFTGLF CLHEINECSS HPCLNEGTCV DGLGTYHCSC PLGYTGKNCQ TLVNLCSRSP CKNKGTCIQD KAESRCRCPS GWAGAYCDVP NVSCDIAASR RGVLVEHLCQ HSGVCINAGN THYCQCPLGY TGSYCEEQLD ECASNPCQHG ATCSDFIGGY RCECVPGYQG VNCEYEVDEC QNQPCQNGGT CIDLVNHFKC SCPPGTRGLL CEENIDDCAR GPHCLNGGQC VDRIGGYSCR CLPGFAGERC EGDINECLSN PCSSEGSLDC IQLTNDYLCV CRSAFTGRHC ETFVDVCPQM PCLNGGTCAV ASNMPDGFIC RCPPGFSGAR CQSSCGQVKC RKGEQCVHTA SGPRCFCPNP RDCESGCASS PCQHGGSCHP QRQPPYYSCQ CAPPFWGSRC ELYTAPPSTP PATCLSQYCA DKARDGVCDE ACNSHACQWD GGDCSLTMEN PWANCSSPLP CWDYINNQCD ELCNTAECLF DNFECQGNSK TCKYDKYCAD HFKDNHCDQG CNSEECGWDG LDCAADQPEN LAEGTLVIVV LMPPEQLLQD ARSFLRALGT LLHTNLRIKR DSQGELMVYP YYGEKSAAMK KQRMTRRSIP GEQEQEVAGS KVFLEIDNRQ CVQDSDHCFK NTDAAAALLA SHAIQGTLSY PLVSVVSESL TPERTQLLYL LAVAVVIILF IILLGVIMAK RKRKHGSLWL PEGFTLRRDA SNHKRREPVG QDAVGLKNLS VQVSEANLIG SGTSEHWVDD EGPQPKKVKA EDEALLSEED DPIDRRPWTQ QHLEAADIRR TPSLALTPPQ AEQEVDVLDV NVRGPDGCTP LMLASLRGGS SDLSDEDEDA EDSSANIITD LVYQGASLQA QTDRTGEMAL HLAARYSRAD AAKRLLDAGA DANAQDNMGR CPLHAAVAAD AQGVFQILIR NRVTDLDARM NDGTTPLILA ARLAVEGMVA ELINCQADVN AVDDHGKSAL HWAAAVNNVE ATLLLLKNGA NRDMQDNKEE TPLFLAAREG SYEAAKILLD HFANRDITDH MDRLPRDVAR DRMHHDIVRL LDEYNVTPSP PGTVLTSALS PVICGPNRSF LSLKHTPMGK KSRRPSAKNT MPTSLPNLAK EAKDAKGSRR KKSLSEKVQL SESSVTLSPV DSLESPHTYV SDTTSSPMIT SPGILQASPN PMLATAAPPA SVHAQHALSF SNLHEMQPLA HGASTVLPSV SQLLSHHHIV PPSSGSAGSL SRLHPVPVPA DWMNRMEVNE TQYNEMFGMV LAPAEGTHPS IAPQSRPPEG KHITTPREPL PPIVTFQLIP KGSIAQPAGA PQPQSTCPPA VTGPLPTMYQ IPEMARLPSV AFPTAMMPQQ DGQVAQTILP AYHPFPASVG KYPTPPSQHS YASSNAAERT PSHSGHLQGE HPYLTPSPES PDQWSSSSPH SASDWSDVTT SPTPGGAGGG QRGPGTHMSE PPHNNMQVYA
72 天竺鼠 Notch2，有信號序列 (胺基酸 1 至 9) MYLFCFVLAL QCRDDYEPCV NEGICVTYHN GTGYCKCPEG FLGEYCQHRD PCEKNRCQNG GTCVAQAMLG RATCRCALGF TGEDCQYSTS HPCFVNPPCQ NGGTCHMLSW DTYECTCQVG FTGKLCQWID ACLSQPCANG STCTTVANQF SCKCLAGFTG QKCETDVNEC DIPGQCQNGG TCLNLPGSYQ CQCSQGFTGQ HCDNPYVPCA PSPCVNGGTC RQTGDFTFEC SCLPGFEGST CERNIDDCPN HRCQNGGVCV DGVNTYNCRC PPQWTGQFCT EDVDECLLQP NACQNGGTCT NRNGGYGCVC VNGWSGDDCS ENIDDCAFAS CTPGSTCIDR VASFSCMCPE GKAGLLCHLD DACISNPCHK GALCDTNPLN GHYICTCPQG YKGADCTEDV DECAMTNSNP CEHAGKCVNT DGAFHCECLK GYAGPRCEMD INECHSDPCQ NDATCLDKIG GFTCLCMPGF KGVHCEIEIN ECQSNPCVNN GQCVDKVNRF QCLCPPGFTG PVCQIDIDDC SSTPCLNGAK CIDHPNGYEC QCATGFTGLL CEENIDNCDP DPCHHGQCQD GIDSYTCICN PGYMGAICSD QIDECYSSPC LNEGRCIDLV NGYQCNCQPG TSGVNCEINF DDCASSPCVN GTCVDGISRY SCVCSPGFTG QRCNVDIDEC ASNPCRKGAT CINDVNGFRC ICPEGPHHPS CYSQVNECLS NPCIHGSCIG GLSGYKCLCD AGWVGINCEV DKNECLSNPC QNGGTCDNLV NGYKCTCKKG FKGYNCQVNI DECASNPCLN QGTCFDDVSG YTCQCALPYT GKNCQTVLAP CSPNPCENAA VCKEAPNFES FTCLCAPGWQ GQRCTVDIDE CVSKPCMNHG LCHNTQGSYM CECPPGFSGM DCEEDINDCL ANPCQNGGSC VDGVNTFSCM CLPGFIGDKC QTDMNECLSE PCKNGGTCSD YVNSYTCKCQ AGFDGVHCEN NIDECTDSSC FNGGTCVDGI NSFSCLCPVG FTGPFCLHEI NECSSHPCLN EGTCVDGLGT YRCTCPLGYT GKNCQTLVNL CSQSPCKNKG TCIQEKAESR CLCPSGWTGA YCDVPNVSCD VAALNKGVLA KNLCKNSGAC INAGNTHHCQ CPLGYTGSYC EQQLDECASN PCKHGATCTD FIGGYRCECV PGYQGVNCEY EVDECQNQPC RNGGTCVDLV NHFKCSCPPG TRGLFCEENI DDCAGGPHCL NGGQCVDRIG GYSCRCLPGF AGERCEGDIN ECLSNPCNSE GSLDCIQLTN NYQCVCRSTF TGRHCETFVD VCPQKPCLNG GTCAVASNMP DGFICRCPPG FSGAKCQSSC GQVKCRKGEQ CVHTAAGPRC FCPSPQDCES GCASSPCQHG GSCYPQRQPP YYSCHCSVPF GGNHCQFYMA PTSIPSDICA SQYCADKARD GVCDEVCNSH ACQWDGGDCS LTMEDPWANC SSPLPCWNYI NNQCDELCNT AECLFDNFEC QGNSKTCKYD KYCADHFKDN HCDQGCNSEE CGWDGLDCAA DQPENLAEGT LVIVVLMPPE QLLQDARSFL RALGTLLHTN LRIKLDSQGL PMVYPYYGEK SAAMKKQKLS RRSLPDEQEQ EVAGSQVFLE IDNRQCVQDS EQCFKNTDAA AALLASHAIQ GTLSYPLVSV VSESLSPKPT PLLYLLAVAV VFILFIILLG VIMAKRKRKH GSLWLPEGFT LRRDSSNHKR REPVGQDAVG LKNLSVQVSE ANLIGSGTSE HWVDDEGPQP KKAKAEDEAL LSEEEDPIDR RPWTQQHLEA ADIRRTPSLA LTPPQAEQEV DVLDVNVRGP DGCTPLMLAS LRGGSSDMSD EDEDGEDSSA NIITDLVYQG ASLQAQTDRT GEMALHLAAR YSRADAAKRL LDAGADANAQ DNMGRCPLHA AVAADAQGVF QILIRNRVTD LDARMNDGTT PLILAARLAV EGMVAELINC QADVNAVDDH GKSALHWAAA VNNVEATLLL LKNGANRDMQ DNKEETPLFL AAREGSYEAA KILLDHFANR DITDHMDRLP RDVARDRMHH DIVRLLDEYN VTPSPPGTVL TSALSPVICG PNRSFLSLKH TPMAKKSRRP NAKSTMPTSL PNLAKEAKDA KGSRRKKSLS EKVQLSESSV TLSPVDSLES PHTYVSDTTS SPMITSPGIL QASPNPMLAA AAPQAPVHAQ HALSFPNPHE MQPLAPGAST VLPSVSQLLS HHHIVPPGSS SAGNLSRLHP VTVPADWMNR MEMSDTQYNE MFGMVLTPAE GTHPGIAPQS RPPEGKHVPT PRETLPPIVT FQLIPKGSIA QPAGASQPQS TCPPAVAGPL PTMYQIPEMA RLPGVAFPTA MMPQQDGQVA QTILPAYHPF PASVGKYPTP PSQHSYASSN AAERTPNHSG HLQGEHPYLT PSPDSPDQWS SSSPHSASDW SDVTTSPTPG SGGGGQRGPG THMSEPPHSN MQVYA
73 小鼠 Notch2，有信號序列 (胺基酸 1 至 25) MPALRPAALR ALLWLWLCGA GPAHALQCRG GQEPCVNEGT CVTYHNGTGF CRCPEGFLGE YCQHRDPCEK NRCQNGGTCV PQGMLGKATC RCAPGFTGED CQYSTSHPCF VSRPCQNGGT CHMLSRDTYE CTCQVGFTGK QCQWTDACLS HPCENGSTCT SVASQFSCKC PAGLTGQKCE ADINECDIPG RCQHGGTCLN LPGSYRCQCP QGFTGQHCDS PYVPCAPSPC VNGGTCRQTG DFTFECNCLP GFEGSTCERN IDDCPNHKCQ NGGVCVDGVN TYNCRCPPQW TGQFCTEDVD ECLLQPNACQ NGGTCTNRNG GYGCVCVNGW SGDDCSENID DCAYASCTPG STCIDRVASF SCLCPEGKAG LLCHLDDACI SNPCHKGALC DTNPLNGQYI CTCPQGYKGA DCTEDVDECA MANSNPCEHA GKCVNTDGAF HCECLKGYAG PRCEMDINEC HSDPCQNDAT CLDKIGGFTC LCMPGFKGVH CELEVNECQS NPCVNNGQCV DKVNRFQCLC PPGFTGPVCQ IDIDDCSSTP CLNGAKCIDH PNGYECQCAT GFTGILCDEN IDNCDPDPCH HGQCQDGIDS YTCICNPGYM GAICSDQIDE CYSSPCLNDG RCIDLVNGYQ CNCQPGTSGL NCEINFDDCA SNPCMHGVCV DGINRYSCVC SPGFTGQRCN IDIDECASNP CRKGATCIND VNGFRCICPE GPHHPSCYSQ VNECLSNPCI HGNCTGGLSG YKCLCDAGWV GVNCEVDKNE CLSNPCQNGG TCNNLVNGYR CTCKKGFKGY NCQVNIDECA SNPCLNQGTC FDDVSGYTCH CMLPYTGKNC QTVLAPCSPN PCENAAVCKE APNFESFSCL CAPGWQGKRC TVDVDECISK PCMNNGVCHN TQGSYVCECP PGFSGMDCEE DINDCLANPC QNGGSCVDHV NTFSCQCHPG FIGDKCQTDM NECLSEPCKN GGTCSDYVNS YTCTCPAGFH GVHCENNIDE CTESSCFNGG TCVDGINSFS CLCPVGFTGP FCLHDINECS SNPCLNAGTC VDGLGTYRCI CPLGYTGKNC QTLVNLCSRS PCKNKGTCVQ EKARPHCLCP PGWDGAYCDV LNVSCKAAAL QKGVPVEHLC QHSGICINAG NTHHCQCPLG YTGSYCEEQL DECASNPCQH GATCNDFIGG YRCECVPGYQ GVNCEYEVDE CQNQPCQNGG TCIDLVNHFK CSCPPGTRGL LCEENIDECA GGPHCLNGGQ CVDRIGGYTC RCLPGFAGER CEGDINECLS NPCSSEGSLD CVQLKNNYNC ICRSAFTGRH CETFLDVCPQ KPCLNGGTCA VASNMPDGFI CRCPPGFSGA RCQSSCGQVK CRRGEQCIHT DSGPRCFCLN PKDCESGCAS NPCQHGGTCY PQRQPPHYSC RCPPSFGGSH CELYTAPTST PPATCQSQYC ADKARDGICD EACNSHACQW DGGDCSLTME DPWANCTSTL RCWEYINNQC DEQCNTAECL FDNFECQRNS KTCKYDKYCA DHFKDNHCDQ GCNSEECGWD GLDCASDQPE NLAEGTLIIV VLLPPEQLLQ DSRSFLRALG TLLHTNLRIK QDSQGALMVY PYFGEKSAAM KKQKMTRRSL PEEQEQEQEV IGSKIFLEID NRQCVQDSDQ CFKNTDAAAA LLASHAIQGT LSYPLVSVFS ELESPRNAQL LYLLAVAVVI ILFFILLGVI MAKRKRKHGF LWLPEGFTLR RDSSNHKRRE PVGQDAVGLK NLSVQVSEAN LIGSGTSEHW VDDEGPQPKK AKAEDEALLS EDDPIDRRPW TQQHLEAADI RHTPSLALTP PQAEQEVDVL DVNVRGPDGC TPLMLASLRG GSSDLSDEDE DAEDSSANII TDLVYQGASL QAQTDRTGEM ALHLAARYSR ADAAKRLLDA GADANAQDNM GRCPLHAAVA ADAQGVFQIL IRNRVTDLDA RMNDGTTPLI LAARLAVEGM VAELINCQAD VNAVDDHGKS ALHWAAAVNN VEATLLLLKN GANRDMQDNK EETPLFLAAR EGSYEAAKIL LDHFANRDIT DHMDRLPRDV ARDRMHHDIV RLLDEYNVTP SPPGTVLTSA LSPVLCGPNR SFLSLKHTPM GKKARRPNTK STMPTSLPNL AKEAKDAKGS RRKKCLNEKV QLSESSVTLS PVDSLESPHT YVSDATSSPM ITSPGILQAS PTPLLAAAAP AAPVHTQHAL SFSNLHDMQP LAPGASTVLP SVSQLLSHHH IAPPGSSSAG SLGRLHPVPV PADWMNRVEM NETQYSEMFG MVLAPAEGAH PGIAAPQSRP PEGKHMSTQR EPLPPIVTFQ LIPKGSIAQA AGAPQTQSSC PPAVAGPLPS MYQIPEMPRL PSVAFPPTMM PQQEGQVAQT IVPTYHPFPA SVGKYPTPPS QHSYASSNAA ERTPSHGGHL QGEHPYLTPS PESPDQWSSS SPHSASDWSD VTTSPTPGGG GGGQRGPGTH MSEPPHSNMQ VYA
74 huNotch2-EGF6-10 AGSDSLYVPC APSPCVNGGT CRQTGDFTFE CNCLPGFEGS TCERNIDDCP NHRCQNGGVC VDGVNTYNCR CPPQWTGQFC TEDVDECLLQ PNACQNGGTC ANRNGGYGCV CVNGWSGDDC SENIDDCAFA SCTPGSTCID RVASFSCMCP EGKAGLLCHL DDACISNPCH KGALCDTNPL NGQYICTCPQ GYKGADCTED VDEGNSHHHH HH
75 muNotch2-EGF6-10 AGSDSPYVPC APSPCVNGGT CRQTGDFTFE CNCLPGFEGS TCERNIDDCP NHKCQNGGVC VDGVNTYNCR CPPQWTGQFC TEDVDECLLQ PNACQNGGTC TNRNGGYGCV CVNGWSGDDC SENIDDCAYA SCTPGSTCID RVASFSCLCP EGKAGLLCHL DDACISNPCH KGALCDTNPL NGQYICTCPQ GYKGADCTED VDEGNSGLND IFEAQKIEWH ENLYFQGHHH HHHHH
76 gpNotch2-EGF6-12 AGSDNPYVPC APSPCVNGGT CRQTGDFTFE CSCLPGFEGS TCERNIDDCP NHRCQNGGVC VDGVNTYNCR CPPQWTGQFC TEDVDECLLQ PNACQNGGTC TNRNGGYGCV CVNGWSGDDC SENIDDCAFA SCTPGSTCID RVASFSCMCP EGKAGLLCHL DDACISNPCH KGALCDTNPL NGHYICTCPQ GYKGADCTED VDECAMTNSN PCEHAGKCVN TDGAFHCECL KGYAGPRCEM DINECHSDPC QNDATCLDKI GGFTCLCMPG FKGVHCEIEI NEGNSGLNDI FEAQKIEWHE NLYFQGHHHH HHHH
77 huNotch2-EGF6-12.R268K AGSDSLYVPC APSPCVNGGT CRQTGDFTFE CNCLPGFEGS TCERNIDDCP NHKCQNGGVC VDGVNTYNCR CPPQWTGQFC TEDVDECLLQ PNACQNGGTC ANRNGGYGCV CVNGWSGDDC SENIDDCAFA SCTPGSTCID RVASFSCMCP EGKAGLLCHL DDACISNPCH KGALCDTNPL NGQYICTCPQ GYKGADCTED VDECAMANSN PCEHAGKCVN TDGAFHCECL KGYAGPRCEM DINECHSDPC QNDATCLDKI GGFTCLCMPG FKGVHCEGNS GLNDIFEAQK IEWHENLYFQ GHHHHHHHH
78 muNotch2-EGF6-12.K268R AGSDSPYVPC APSPCVNGGT CRQTGDFTFE CNCLPGFEGS TCERNIDDCP NHRCQNGGVC VDGVNTYNCR CPPQWTGQFC TEDVDECLLQ PNACQNGGTC TNRNGGYGCV CVNGWSGDDC SENIDDCAYA SCTPGSTCID RVASFSCLCP EGKAGLLCHL DDACISNPCH KGALCDTNPL NGQYICTCPQ GYKGADCTED VDECAMANSN PCEHAGKCVN TDGAFHCECL KGYAGPRCEM DINECHSDPC QNDATCLDKI GGFTCLCMPG FKGVHCELEV NEGNSGLNDI FEAQKIEWHE NLYFQGHHHH HHHH
79 ratNotch2-EGF6-10 AGSDSPYVPC APSPCVNGGT CRQTGDFTSE CHCLPGFEGS NCERNIDDCP NHKCQNGGVC VDGVNTYNCR CPPQWTGQFC TEDVDECLLQ PNACQNGGTC TNRNGGYGCV CVNGWSGDDC SENIDDCAFA SCTPGSTCID RVASFSCLCP EGKAGLLCHL DDACISNPCH KGALCDTNPL NGQYICTCPQ AYKGADCTED VDEGNSGLND IFEAQKIEWH ENLYFQGHHH HHHHH
80 muNotch2 EGF7 (胺基酸 260 至 296) N IDDCPNHKCQ NGGVCVDGVN TYNCRCPPQW TGQFCT
81 大鼠 Notch2，有信號序列 (胺基酸 1 至 25) MPALRPAALR ALLWLWLCGA GPAHALQCRG GQEPCVNEGT CVTYHNGTGY CRCPEGFLGE YCQHRDPCEK NRCQNGGTCV TQAMLGKATC RCAPGFTGED CQYSTSHPCF VSRPCQNGGT CHMLSWDTYE CTCQVGFTGK QCQWTDVCLS HPCENGSTCS SVANQFSCRC PAGITGQKCD ADINECDIPG RCQHGGTCLN LPGSYRCQCP QRFTGQHCDS PYVPCAPSPC VNGGTCRQTG DFTSECHCLP GFEGSNCERN IDDCPNHKCQ NGGVCVDGVN TYNCRCPPQW TGQFCTEDVD ECLLQPNACQ NGGTCTNRNG GYGCVCVNGW SGDDCSENID DCAFASCTPG STCIDRVASF SCLCPEGKAG LLCHLDDACI SNPCHKGALC DTNPLNGQYI CTCPQAYKGA DCTEDVDECA MANSNPCEHA GKCVNTDGAF HCECLKGYAG PRCEMDINEC HSDPCQNDAT CLDKIGGFTC LCMPGFKGVH CELEVNECQS NPCVNNGQCV DKVNRFQCLC PPGFTGPVCQ IDIDDCSSTP CLNGAKCIDH PNGYECQCAT GFTGTLCDEN IDNCDPDPCH HGQCQDGIDS YTCICNPGYM GAICSDQIDE CYSSPCLNDG RCIDLVNGYQ CNCQPGTSGL NCEINFDDCA SNPCLHGACV DGINRYSCVC SPGFTGQRCN IDIDECASNP CRKDATCIND VNGFRCMCPE GPHHPSCYSQ VNECLSSPCI HGNCTGGLSG YKCLCDAGWV GINCEVDKNE CLSNPCQNGG TCNNLVNGYR CTCKKGFKGY NCQVNIDECA SNPCLNQGTC LDDVSGYTCH CMLPYTGKNC QTVLAPCSPN PCENAAVCKE APNFESFTCL CAPGWQGQRC TVDVDECVSK PCMNNGICHN TQGSYMCECP PGFSGMDCEE DINDCLANPC QNGGSCVDKV NTFSCLCLPG FVGDKCQTDM NECLSEPCKN GGTCSDYVNS YTCTCPAGFH GVHCENNIDE CTESSCFNGG TCVDGINSFS CLCPVGFTGP FCLHDINECS SNPCLNSGTC VDGLGTYRCT CPLGYTGKNC QTLVNLCSPS PCKNKGTCAQ EKARPRCLCP PGWDGAYCDV LNVSCKAAAL QKGVPVEHLC QHSGICINAG NTHHCQCPLG YTGSYCEEQL DECASNPCQH GATCSDFIGG YRCECVPGYQ GVNCEYEVDE CQNQPCQNGG TCIDLVNHFK CSCPPGTRGL LCEENIDDCA GAPHCLNGGQ CVDRIGGYSC RCLPGFAGER CEGDINECLS NPCSSEGSLD CIQLKNNYQC VCRSAFTGRH CETFLDVCPQ KPCLNGGTCA VASNVPDGFI CRCPPGFSGA RCQSSCGQVK CRRGEQCVHT ASGPHCFCPN HKDCESGCAS NPCQHGGTCY PQRQPPYYSC RCSPPFWGSH CESYTAPTST PPATCLSQYC ADKARDGICD EACNSHACQW DGGDCSLTME DPWANCTSSL RCWEYINNQC DELCNTAECL FDNFECQRNS KTCKYDKYCA DHFKDNHCDK GCNNEECGWD GLDCAADQPE NLAEGILVIV VLLPPEQLLQ DSRSFLRALG TLLHTNLRIK QDSQGALMVY PYYGEKSAAM KKQKVARRSL PDEQEQEIIG SKVFLEIDNR QCVQDSDQCF KNTDAAAALL ASHAIQGTLS YPLVSVVSES EDPRNTPLLY LLAVAVVIIL FLILLGVIMA KRKRKHGFLW LPEGFTLRRD SSNHKRREPV GQDAVGLKNL SVQVSEANLI GSTTSEHWGD DEGPQPKKAK AEDDEALLSE DDPVDRRPWT QQHLEAADIR RTPSLALTPP QAEQEVDVLD VNVRGPDGCT PLMLASLRGG SSDLSDEDED AEDSSANIIT DLVYQGASLQ AQTDRTGEMA LHLAARYSRA DAAKRLLDAG ADANAQDNMG RCPLHAAVAA DAQGVFQILI RNRVTDLDAR MNDGTTPLIL AARLAVEGMV AELINCQADV NAVDDHGKSA LHWAAAVNNV EATLLLLKNG ANRDMQDNKE ETPLFLAARE GSYEAAKILL DHFANRDITD HMDRLPRDVA RDRMHHDIVR LLDEYNVTPS PPGTVLTSAL SPVLCGPNRS FLSLKHTPMG KKARRPNTKS TMPTSLPNLA KEAKDVKGSR RKKCLNEKVQ LSESSVTLSP VDSLESPHTY VSDATSSPMI TSPGILQASP TPLLAAAPAA PVHAQHALSF SNLHEMQPLR PGASTVLPSV SQLLSHHHIV PPGSGSAGSL GRLHSVPVPS DWMNRVEMSE TQYSEMFGMV LAPAEGTHPG MAAPQSRAPE GKPIPTQREP LPPIVTFQLI PKGSLAQAAG APQTQSGCPP AVAGPLPSMY QIPEMARLPS VAFPPTMMPQ QEGQVAQTIV PTYHPFPASV GKYPTPPSQH SYASSNAAER TPNHGGHLQG EHPYLTPSPE SPDQWSSSSP HSASDWSDVT TSPTPGGGGG GQRGPGTHMS EPPHSNMQVY A   
82 huNotch2-EGF4-7 GSQWTDACLS HPCANGSTCT TVANQFSCKC LTGFTGQKCE TDVNECDIPG HCQHGGTCLN LPGSYQCQCL QGFTGQYCDS LYVPCAPSPC VNGGTCRQTG DFTFECNCLP GFEGSTCERN IDDCPNHRCQ NGGVCVDGVN TYNCRCPPQW TGQFCTEDVD EGNSGLNDIF EAQKIEWHEN LYFQGHHHHH HHH
83 huNotch2-EGF5-8 GSETDVNECD IPGHCQHGGT CLNLPGSYQC QCLQGFTGQY CDSLYVPCAP SPCVNGGTCR QTGDFTFECN CLPGFEGSTC ERNIDDCPNH RCQNGGVCVD GVNTYNCRCP PQWTGQFCTE DVDECLLQPN ACQNGGTCAN RNGGYGCVCV NGWSGDDCSE NIDDGNSGLN DIFEAQKIEW HENLYFQGHH HHHHHH
84 huNotch2-EGF7-9 AHHHHHHGEN LYFQGSERNI DDCPNHRCQN GGVCVDGVNT YNCRCPPQWT GQFCTEDVDE CLLQPNACQN GGTCANRNGG YGCVCVNGWS GDDCSENIDD CAFASCTPGS TCIDRVASFS CMCPEGKAGL LCHLDDAGNS
85 huNotch1 AGSERPYVPC SPSPCQNGGT CRPTGDVTHE CACLPGFTGQ NCEENIDDCP GNNCKNGGAC VDGVNTYNCR CPPEWTGQYC TEDVDECQLM PNACQNGGTC HNTHGGYNCV CVNGWTGEDC SENIDDCASA ACFHGATCHD RVASFYCECP HGRTGLLCHL NDACISNPCN EGSNCDTNPV NGKAICTCPS GYTGPACSQD VDEGNSGLND IFEAQKIEWH ENLYFQGHHH HHHHH
86 huNotch3 GSENPAVPCA PSPCRNGGTC RQSGDLTYDC ACLPGFEGQN CEVNVDDCPG HRCLNGGTCV DGVNTYNCQC PPEWTGQFCT EDVDECQLQP NACHNGGTCF NTLGGHSCVC VNGWTGESCS QNIDDCATAV CFHGATCHDR VASFYCACPM GKTGLLCHLD DACVSNPCHE DAICDTNPVN GRAICTCPPG FTGGACDQDV DECSIGANPC EHLGRCVNTQ GSFLCQCGRG YTGPRCETDV NECLSGPCRN QATCLDRIGQ FTCICMAGFT GTYCEVDIDE GNSGLNDIFE AQKIEWHENL YFQGHHHHHH HH
圖 1A 至 1B 顯示大鼠抗 Notch2 抗體 1B2 及其某些人源化型式之輕鏈可變區 (圖 1A) 與重鏈可變區 (圖 1B) 的比對。 圖 2A 至 2B 顯示大鼠抗 Notch2 抗體 3107 之輕鏈可變區 (圖 2A) 及重鏈可變區 (圖 2B)。 圖 3A 至 3B 顯示兔抗 Notch 2 抗體 2338、2430、輕鏈中具有 C95dS 取代的 2430、及 2621 之輕鏈可變區 (圖 3A) 與重鏈可變區 (圖 3B) 的比對。 圖 4 顯示 rat.1B2、rat.3107、rb.2338、rb.2430、rb.2621 和抗 Notch 2/3 抗體 OMP-59R5 (他瑞妥單抗 (tarextumab)， 參見美國專利號 8,226,943 B2) 的表位分箱。 圖 5A 至 5F 顯示在包含表現 Notch2 受體的細胞及表現 Jagged1 配體 (圖 5A、5C、5E) 或 DLL1 配體 (圖 5B、5D、5F) 的細胞的共培養測定中阻斷 Jagged1 媒介之 Notch2 活性 (圖 5A、5C、5E) 及保持 DLL1 媒介之 Notch2 活性 (圖 5B、5D、5F)。圖 5A 及 5B 分別顯示隨著抗 Notch2 抗體嵌合 1B2 以及人源化型式 hu1B2.v1.DFS、hu1B2.v101、hu1B2.v102、hu1B2.v103 及 hu1B2.v104 的抗體濃度增加，Jagged1 媒介之傳訊及 DLL1 媒介之傳訊的活性百分比變化。圖 5C 及 5D 分別顯示隨著大鼠抗 Notch2 抗體 3107 的抗體濃度增加，Jagged1 媒介之傳訊及 DLL1 媒介之傳訊的活性百分比變化。圖 5E 及 5F 分別顯示隨著兔抗 Notch2 抗體 2338、2621 及 2430 的抗體濃度增加，Jagged1 媒介之傳訊及 DLL1 媒介之傳訊的活性百分比變化。 圖 6A 至 6D 顯示 (圖 6A) Muc5b、(圖 6B) Muc5ac 及 (圖 6C) Scgb1a1 在與抗 gD 對照抗體或大鼠/人嵌合抗 Notch2 抗體 1B2 接觸的初級人類支氣管上皮細胞的氣-液界面 (ALI) 培養物中的 mRNA 表現；以及經抗 gD 對照抗體處理的 ALI 培養物 (左) 及經抗 Notch2 抗體 1B2 處理的 ALI 培養物 (右) 的 (圖 6D) 免疫螢光分析。用抗 Muc5b染色杯狀細胞切片，用抗乙醯化 a-微管蛋白染色纖毛細胞切片，且用 DAPI染色核染色切片。在經抗 Notch2 抗體 1B2 處理的 ALI 培養物中觀察到杯狀細胞的顯著減少。 圖 7A 至 7B 顯示大鼠抗 Notch2 抗體 3107 及其某些人源化型式之輕鏈可變區 (圖 7A) 與重鏈可變區 (圖 7B) 的比對。 圖 8 顯示 1B2.v1 變體，以評估空間與親合力。各變體中使用的 Fab 包括 hu.1B2.v1.DFS.H1 VH 及 hu.1B2.L1 VL。儘管空間位阻在 Notch2 抑制中起一定作用，但親合力似乎為效力的驅動因素。 圖 9 顯示 U-87 細胞上各種 1B2.v104 形式的動力學測量，其 Notch2 複本數為 12,700。基於細胞的親和力證實高度合作的結合并且減緩開啟及關閉速率。 圖 10 顯示 1B2.v104 Fab 三聚體結合位點的活體外穩定性。 圖 11 顯示 1B2.v104 Fab、1B2.v104 Fab-IgG 及 1B2.v104 Fab 三聚體在 0、3 及 6 小時的活體外黏液穩定性。透過酪胺酸殘基之間接碘化，全部抗體皆經 125I 標記。 圖 12A 至 12F 顯示在用各種 1B2 形式進行基底 (basal) 或頂部 (apical) 處理 9 天後，分泌細胞及纖毛細胞百分比的定量。結果表明，當在基底室或透過黏液從頂部側進行處理時，分泌細胞減少且纖毛細胞增加。圖 12A 顯示，當在基底室中投予時，除 1B2.V103 Fab 之外，全部分子皆具有以劑量依賴性方式增加纖毛細胞數量的能力，如藉由 FOXJ1 染色所評估。圖 12B 顯示，當向頂部表面投予時，除 1B2.V104 IgG 之外，全部分子皆具有以劑量依賴性方式增加纖毛細胞數量的能力，如藉由 FOXJ1 染色所評估。圖 12C 至 12F 顯示，如藉由 MUC5B 或 MUC5AC 染色所評估，除兩個 FAB 片段之外，全部分子皆能夠以劑量依賴性方式減少杯狀細胞數量。 圖 13A 至 13B 顯示黏液纖毛轉運測定的結果，該測定證明上皮細胞具有更有效地移動黏液的能力，這證實新纖毛細胞的協調及定向跳動。圖 13A 顯示當在基底室中投予 1B2 分子時，在黏液纖毛轉運測定中，螢光珠行進的平均軌道長度。圖 13B 顯示當在培養物之頂部側上投予 1B2 分子時，在黏液纖毛轉運測定中，螢光珠行進的平均軌道長度。 圖 14 顯示已知為高風險 (抗-IFNγ) 及低風險 (Perjeta) 的兩種抗體以及 1B2.v104.dPEG 三聚體的表面張力 (膨脹模數 (mN/m)) 之時間 (min) 演化。 圖 15 顯示 Fab1B2.v104 三聚體的氣溶膠特性。 圖 16A 至 16E 顯示用不同劑量之 1B2.v104 Fab 三聚體、1B2.v104 Fab-IgG、1B2.v104 IgG 以及各種陽性及陰性對照霧化的天竺鼠的杯狀細胞及纖毛細胞之定量。圖 16B 顯示在用 Fab-三聚體處理後纖毛細胞增加。圖 16D 及 16E 顯示杯狀細胞減少。它們共同顯示，1B2.v104 Fab 三聚體與 1B2.v104 Fab-IgG 及 1B2.v104 IgG 相比具有更好的藥效學 (PD) 效應。 圖 17A 至 17B 顯示 1B2.v104 Fab 三聚體、1B2.v104 Fab-IgG 及 1B2.v104 IgG 在血液 (圖 17A) 及肺 (圖 17B) 中的藥物動力學 (PK) 概況。 圖 18A 至 18B 顯示用不同劑量之 1B2.v104 Fab 二聚體、1B2.v104 Fab 三聚體以及各種陽性及陰性對照霧化的天竺鼠的杯狀細胞及纖毛細胞之定量。圖 18B 顯示在用 Fab-二聚體及 Fab-三聚體處理後纖毛細胞增加。圖 18C 及 18 D 顯示杯狀細胞減少的趨勢。它們共同顯示，1B2.v104 Fab 二聚體與 1B2.v104 Fab 三聚體相比具有更好的藥效學 (PD) 效應。 圖 19A 至 19B 顯示 1B2.v104 Fab 二聚體級 1B2.v104 Fab 三巨頭在血液 (圖 19A) 及肺 (圖 19B) 中的藥物動力學 (PK) 概況。
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Claims (75)

  1. 一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中該結合物抑制 Jagged1 媒介的傳訊 (Jagged1-mediated signaling)，但不抑制 DLL1 媒介的傳訊。
  2. 一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中該結合物抑制 Jagged1 媒介的傳訊相比 DLL1 媒介的傳訊達更大之程度。
  3. 如請求項 2 之結合物，其中該結合物能達到對 Jagged1 媒介的傳訊之最大抑制為 100%，及對 DLL1 媒介的傳訊之最大抑制為小於 80%、或小於 70%、或小於 60%。
  4. 如請求項 1 至 3 中任一項之結合物，其中該結合物不抑制 Jagged1 與 Notch2 之結合。
  5. 如請求項 1 至 4 中任一項之結合物，其中該結合物不抑制 DLL1 與 Notch2 之結合。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之結合物，其中該結合物結合 Notch2 之 EGF7 重複序列 (repeat) 內的表位。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項之結合物，其中該結合物結合在 Notch2 之胺基酸 260 至 296 內的表位。
  8. 如請求項 1 至 6 中任一項之結合物，其中該結合物結合在 Notch2 之胺基酸 260 至 296 內的不連續表位。
  9. 一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中該結合物結合 Notch2 之 EGF7 重複序列內的表位。
  10. 一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中該結合物結合在 Notch2 之胺基酸 260 至 296 內的表位。
  11. 一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中該結合物結合在 Notch2 之胺基酸 260 至 296 內的不連續表位。
  12. 如請求項 1 至 11 中任一項之結合物，其中該結合物接觸人類 Notch2 之精胺酸 268 (R268)。
  13. 如請求項 12 之結合物，其中該結合物不結合包含離胺酸 268 (K268) 的 Notch2。
  14. 如請求項 1 至 13 中任一項之結合物，其中該結合物結合包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列的多肽且不結合包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列的多肽。
  15. 如請求項 1 至 14 中任一項之結合物，其中該結合物與人類 Notch2 及食蟹獼猴 Notch2 結合。
  16. 如請求項 1 至 15 中任一項之結合物，其中該結合物不與小鼠 Notch2 結合。
  17. 如請求項 1 至 16 中任一項之結合物，其中該結合物與天竺鼠 Notch2 結合。
  18. 如請求項 1 至 17 中任一項之結合物，其中該結合物不與人類 Notch1 或人類 Notch3 結合。
  19. 如請求項 1 至 18 中任一項之結合物，其中藉由表面電漿共振所測定，該結合物以小於 10 nM、小於 8 nM、小於 5 nM、小於 3 nM、小於 2 nM 或小於 1 nM 之親和力 (K D) 結合人類 Notch2。
  20. 如請求項 1 至 19 中任一項之結合物，其中該結合物以小於 10 nM、小於 5 nM、小於 3 nM、小於 2 nM 或小於 1 nM 之 IC50 抑制 Jagged1 媒介的傳訊。
  21. 如請求項 20 之結合物，其中對 Jagged1 媒介的傳訊之抑制係使用高通量篩選 (high-content screening，HCS) 測定法測定。
  22. 如請求項 1 至 21 中任一項之結合物，其中各抗原結合域獨立地包含： a)  重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列的 CDR-L3； b)  重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列的 CDR-L3； c)  重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列的 CDR-L3； d)  重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列的 CDR-L3；或 e)  重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列的 CDR-L3。
  23. 一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中各抗原結合域獨立地包含： a)  重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 6 或 7 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 8、9、10、11 或 12 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列的 CDR-L3； b)  重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列的 CDR-L3； c)  重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列的 CDR-L3； d)  重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 51 或 52 之胺基酸序列的 CDR-L3；或 e)  重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列的 CDR-H3，以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列的 CDR-L3。
  24. 如請求項 1 至 23 中任一項之結合物，其中各抗原結合域獨立地包含： a)  VH 序列，其與 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； b)  VL 序列，其與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； c)  如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列； d)  VH 序列，其與選自 SEQ ID NO: 17 至 24、26、28、30 及 32 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； e)  VL 序列，其與選自 SEQ ID NO: 15、16、25、27、29 及 31 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； f)  如 (d) 中所定義之 VH 序列及如 (e) 中所定義之 VL 序列； g)  VH 序列，其與 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； h)  VL 序列，其與 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； i)  如 (g) 中所定義之 VH 序列及如 (h) 中所定義之 VL 序列； j)  VH 序列，其與選自 SEQ ID NO: 102 至 106 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； k)  VL 序列，其與選自 SEQ ID NO: 98 至 100 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； l)  如 (j) 中所定義之 VH 序列及如 (k) 中所定義之 VL 序列； m) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； n)  VL 序列，其與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； o)  如 (m) 中所定義之 VH 序列及如 (n) 中所定義之 VL 序列； p)  VH 序列，其與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； q)  VL 序列，其與 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； r)  如 (p) 中所定義之 VH 序列及如 (q) 中所定義之 VL 序列； s)  VH 序列，其與 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； t)  VL 序列，其與 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性；或 u)  如 (s) 中所定義之 VH 序列及如 (t) 中所定義之 VL 序列。
  25. 如請求項 1 至 24 中任一項之結合物，其中各抗原結合域獨立地包含： a)  VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列； b)  VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列； c)  如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列； d)  VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 17 至 24、26、28、30 及 32 之胺基酸序列； e)  VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 15、16、25、27、29 及 31 之胺基酸序列； f)  如 (d) 中所定義之 VH 序列及如 (e) 中所定義之 VL 序列； g)  VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列； h)  VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列； i)  如 (g) 中所定義之 VH 序列及如 (h) 中所定義之 VL 序列； j)  VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 101 至 106 之胺基酸序列； k)  VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 98 至 100 之胺基酸序列； l)  如 (j) 中所定義之 VH 序列及如 (k) 中所定義之 VL 序列； m) VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列； n)  VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列； o)  如 (m) 中所定義之 VH 序列及如 (n) 中所定義之 VL 序列； p)  VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列； q)  VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列； r)  如 (p) 中所定義之 VH 序列及如 (q) 中所定義之 VL 序列； s)  VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列； t)  VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列；或 u)  如 (s) 中所定義之 VH 序列及如 (t) 中所定義之 VL 序列。
  26. 一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中各抗原結合域獨立地包含： a)  VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列； b)  VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列； c)  如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列； d)  VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 17 至 24、26、28、30 及 32 之胺基酸序列； e)  VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 15、16、25、27、29 及 31 之胺基酸序列； f)  如 (d) 中所定義之 VH 序列及如 (e) 中所定義之 VL 序列； g)  VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列； h)  VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列； i)  如 (g) 中所定義之 VH 序列及如 (h) 中所定義之 VL 序列； j)  VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 101 至 106 之胺基酸序列； k)  VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 98 至 100 之胺基酸序列； l)  如 (j) 中所定義之 VH 序列及如 (k) 中所定義之 VL 序列； m) VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列； n)  VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列； o)  如 (m) 中所定義之 VH 序列及如 (n) 中所定義之 VL 序列； p)  VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列； q)  VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 56 或 57 之胺基酸序列； r)  如 (p) 中所定義之 VH 序列及如 (q) 中所定義之 VL 序列； s)  VH 序列，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列； t)  VL 序列，其包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列；或 u)  如 (s) 中所定義之 VH 序列及如 (t) 中所定義之 VL 序列。
  27. 如請求項 1 至 23 中任一項之結合物，其中各抗原結合域獨立地包含： a)  VH 序列，其與選自 SEQ ID NO: 17 至 24、26、28、30 及 32 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； b)  VL 序列，其與選自 SEQ ID NO: 15、16、25、27、29 及 31 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； c)  如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列； d)  VH 序列，其與選自 SEQ ID NO: 102 至 106 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性； e)  VL 序列，其與選自 SEQ ID NO: 98 至 100 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性；或 f)  如 (d) 中所定義之 VH 序列及如 (e) 中所定義之 VL 序列。
  28. 如請求項 1 至 23 及 27 中任一項之結合物，其中各抗原結合域包含： a)  VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 17 至 24、26、28、30 及 32 之胺基酸序列； b)  VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 15、16、25、27、29 及 31 之胺基酸序列； c)  如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列； d)  VH 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 101 至 106 之胺基酸序列； e)  VL 序列，其包含選自 SEQ ID NO: 98 至 100 之胺基酸序列；或 f)  如 (d) 中所定義之 VH 序列及如 (e) 中所定義之 VL 序列。
  29. 如請求項 1 至 23 中任一項之結合物，其中各抗原結合域獨立地包含： a)  SEQ ID NO: 26 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 25 之 VL 序列； b)  SEQ ID NO: 28 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 27 之 VL 序列； c)  SEQ ID NO: 30 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 29 之 VL 序列；或 d)  SEQ ID NO: 32 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 31 之 VL 序列。
  30. 一種結合物，其包含至少兩個透過非肽連接子共價連接的與人類 Notch2 結合之抗原結合域，其中各抗原結合域獨立地包含： a)  SEQ ID NO: 26 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 25 之 VL 序列； b)  SEQ ID NO: 28 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 27 之 VL 序列； c)  SEQ ID NO: 30 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 29 之 VL 序列；或 d)  SEQ ID NO: 32 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 31 之 VL 序列。
  31. 如請求項 1 至 30 中任一項之結合物，其中各抗原結合域包含相同的 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3 胺基酸序列。
  32. 如請求項 1 至 31 中任一項之結合物，其中各抗原結合域包含相同的 VH 及 VL 胺基酸序列。
  33. 如請求項 1 至 32 中任一項之結合物，其中各抗原結合域為人類或人源化抗原結合域。
  34. 如請求項 1 至 33 中任一項之結合物，其中各抗原結合域係選自 Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH 及 F(ab') 2。
  35. 如請求項 34 之結合物，其中各抗原結合域為 Fab、Fab' 或 Fab'-SH。
  36. 如請求項 1 至 35 中任一項之結合物，其中至少一個抗原結合域係透過半胱胺酸胺基酸之硫醇基 (sulfhydryl) 基團與該非肽連接子共價連接。
  37. 如請求項 36 之結合物，其中各抗原結合域係透過半胱胺酸胺基酸之硫醇基基團與該非肽連接子共價連接。
  38. 如請求項 36 或請求項 37 之結合物，其中該半胱胺酸胺基酸係在該抗原結合域之恆定區或骨架區 (framework region) 中。
  39. 如請求項 39 之結合物，其中該半胱胺酸胺基酸係在該抗原結合域之輕鏈恆定區中。
  40. 如請求項 36 至 39 中任一項之結合物，其中該半胱胺酸胺基酸為工程化半胱胺酸胺基酸。
  41. 如請求項 40 之結合物，其中該半胱胺酸胺基酸為在該抗原結合域之輕鏈恆定區中的 K149C 工程化半胱胺酸胺基酸。
  42. 如請求項 1 至 35 中任一項之結合物，其中至少一個抗原結合域係透過離胺酸胺基酸之胺基團與該非肽連接子共價連接。
  43. 如請求項 42 之結合物，其中各抗原結合域係透過離胺酸胺基酸之胺基團與該非肽連接子共價連接。
  44. 如請求項 42 或請求項 43 之結合物，其中該離胺酸胺基酸係在該抗原結合域之恆定區或骨架區中。
  45. 如請求項 1 至 44 中任一項之結合物，其中該結合物包含兩個、三個、四個、五個或六個抗原結合域。
  46. 如請求項 1 至 45 中任一項之結合物，其中該非肽連接子為多元醇。
  47. 如請求項 1 至 46 中任一項之結合物，其中該非肽連接子為多臂多元醇。
  48. 如請求項 47 中任一項之結合物，其中該多臂多元醇為二聚體、三聚體、四聚體或六聚體。
  49. 如請求項 48 之結合物，其中該多臂多元醇之各臂包含與抗原結合域形成琥珀醯亞胺接附 (succinimide attachment) 的馬來醯亞胺 (maleimide) 部分。
  50. 如請求項 47 至 49 中任一項之結合物，其中該多臂多元醇係選自： ； ； ； ； ； ；或 ； 其中各 n 獨立地選自 1 至 50、1 至 40、1 至 30、1 至 20、1 至 15 或 1 至 10 的整數。
  51. 如請求項 30 至 45 中任一項之結合物，其中各抗原結合域包含 SEQ ID NO: 32 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 31 之 VL 序列，且其中該非肽連接子為多臂多元醇，該多臂多元醇包含與抗原結合域形成琥珀醯亞胺接附的馬來醯亞胺部分，其中該多臂多元醇為 。
  52. 如請求項 30 至 45 中任一項之結合物，其中各抗原結合域包含 SEQ ID NO: 32 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 31 之 VL 序列，且其中該非肽連接子為多臂多元醇，該多臂多元醇包含與抗原結合域形成琥珀醯亞胺接附的馬來醯亞胺部分，其中該多臂多元醇為 。
  53. 如請求項 51 或請求項 52 之結合物，其中各抗原結合域係透過在該抗原結合域之輕鏈恆定區中的 K149C 工程化半胱胺酸胺基酸之硫醇基基團與該非肽連接子共價連接。
  54. 如請求項 1 至 53 中任一項之結合物，其中各抗原結合域為 Fab，其中 Fab 輕鏈包含 SEQ ID NO: 107 之胺基酸序列，且 Fab 重鏈包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
  55. 一種生產如請求項 1 至 54 中任一項之結合物的方法，其包含將至少兩個與人類 Notch2 結合 (bind) 的抗原結合域與非肽連接子結合 (conjugating)。
  56. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 54 中任一項之結合物及醫藥上可接受之載劑。
  57. 如請求項 56 之醫藥組成物，其進一步包含另外的治療劑。
  58. 如請求項 57 之醫藥組成物，其中該另外的治療劑係選自高張鹽水、甘露醇、α 鏈道酶 (dornase alpha)、N-乙醯基半胱胺酸、半胱胺及支氣管擴張劑。
  59. 如請求項 1 至 54 中任一項之結合物或如請求項 56 至 58 中任一項之醫藥組成物，其用為藥物。
  60. 如請求項 1 至 54 中任一項之結合物或如請求項 56 至 58 中任一項之醫藥組成物，其用於治療黏液阻塞性肺病。
  61. 如請求項 60 之結合物，其中該黏液阻塞性肺病係選自慢性阻塞性肺病 (COPD)、囊腫纖維化、原發性纖毛運動障礙、非囊腫纖維化支氣管擴張症及細支氣管炎。
  62. 一種如請求項 1 至 54 中任一項之結合物或如請求項 56 至 58 中任一項之醫藥組成物在製造藥物中之用途，該藥物用於治療黏液阻塞性肺病。
  63. 如請求項 62 之用途，其中該黏液阻塞性肺病係選自慢性阻塞性肺病 (COPD)、囊腫纖維化、原發性纖毛運動障礙、非囊腫纖維化支氣管擴張症及細支氣管炎。
  64. 一種如請求項 1 至 54 中任一項之結合物或如請求項 56 至 58 中任一項之醫藥組成物在製造藥物中之用途，該藥物用於減少個體中的分泌細胞數量及/或增加纖毛細胞數量。
  65. 如請求項 64 之用途，該藥物將分泌細胞轉化成纖毛細胞。
  66. 如請求項 64 或請求項 65 之用途，其中該等分泌細胞及纖毛細胞係在該個體之肺中。
  67. 如請求項 64 至 66 中任一項之用途，其中該等分泌細胞為杯狀細胞。
  68. 一種治療患有黏液阻塞性肺病的個體之方法，其包含向該個體投予有效量之如請求項 1 至 54 中任一項之結合物或如請求項 56 至 58 中任一項之醫藥組成物。
  69. 如請求項 68 之方法，其中該黏液阻塞性肺病係選自慢性阻塞性肺病 (COPD)、囊腫纖維化、原發性纖毛運動障礙、非囊腫纖維化支氣管擴張症及細支氣管炎。
  70. 一種減少個體中的分泌細胞數量之方法，其包含向受試者投予有效量之如請求項 1 至 54 中任一項之結合物或如請求項 56 至 58 中任一項之醫藥組成物，以消耗該個體中的分泌細胞及/或增加纖毛細胞數量。
  71. 如請求項 70 之方法，其中該方法包含將分泌細胞轉化成纖毛細胞。
  72. 如請求項 70 或請求項 71 之方法，其中該等分泌細胞及纖毛細胞係在該個體之肺中。
  73. 如請求項 70 至 72 中任一項之方法，其中該等分泌細胞為杯狀細胞。
  74. 如請求項 70 至 73 中任一項之方法，其進一步包含向該個體投予另外的治療劑。
  75. 如請求項 74 之方法，其中該另外的治療劑係選自高張鹽水、甘露醇、α 鏈道酶、N-乙醯基半胱胺酸、半胱胺及支氣管擴張劑。
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