KR102522947B1 - 박테리아 만나나아제를 포함하는 세제 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 박테리아 만나나아제(bacterial mannanase) 효소를 포함하는 신규한 세제 조성물에 관한 것이다. 박테리아 만나나아제를 포함하는 상기 세제 조성물은 만난(mannan)의 분해 또는 변형을 요하는 세탁이나 클리닝에의 적용에 유용하다. 본 발명은 또한 세탁이나 클리닝에 적용하기 위한 상기 세제 조성물의 용도 및 만난을 분해하는 방법에 관한 것이다.

Description

박테리아 만나나아제를 포함하는 세제 조성물
본 발명은 박테리아 만나나아제 (bacterial mannanase) 효소를 포함하는 신규한 세제 조성물에 관한 것이다. 박테리아 만나나아제를 포함하는 상기 세제 조성물은 만난 (mannan)의 분해 또는 변형을 요하는 세탁이나 클리닝에의 적용에 유용하다. 본 발명은 또한 세탁이나 클리닝에 적용하기 위한 상기 세제 조성물의 용도 및 만난을 분해하는 방법에 관한 것이다.
만난은 다양한 식물에서 발견되는 다당류를 포함하는 만노오스 (mannose)이다. 만난은 수성 환경에서 잘 녹지 않으며, 이들의 물리화학적 특성은 점성 분산 (viscous dispersions)을 일으킨다. 또한, 만난은 수-결합력 (water-binding capacity)이 높다. 이러한 모든 특성은 양조, 제빵, 동물 영양, 세탁 및 클리닝을 포함하는 여러 산업에 적용하는데 문제를 야기한다.
식물성 식이요법에는 상이한 β-만난이 존재하고, 이들의 양과 특성에 따라 영양분의 소화, 미생물 군집화 및 성장 성능이 절충될 수 있다. 만난의 효소적 분해는 고-수용성 만난의 소화 점도를 감소시키고 콩과 (leguminoseae)에 존재하는 불용성의 선형 만난을 형성할 수 있는 만노-올리고당 (manno-oligosaccharides)의 생성을 초래할 수 있다. 만나나아제는 모든 단위 동물 (monogastric animals)에서 평균일일증체량 (average daily gain), 사료 효율 (feed efficiency), 체중 균일성 (weight uniformity) 및 생존성 (livability)을 증가시킨다.
단위 동물를 위한 곡물 식이 (cereal diet) 사료 등과 같은, 동물 사료 적용에 있어, 만난은 장 내용물 (gut contents)의 점도에 기여하는 요인으로서, 이는 사료 소화성(feed digestibility)과 동물 성장률에 불리한 영향을 미친다. 반추동물에 있어서, 만난은 섬유질 섭취의 실질적인 성분을 나타내며, 만난의 보다 완전한 소화는 보다 높은 사료 전환 효율 (feed conversion efficiencies)을 촉진할 것이다.
세탁과 클리닝 적용을 위해, 만나나아제를 포함하는 세제 조성물은 만난을 분해하는데 사용될 수 있다. 그러나 우수한 만난 분해 활성을 나타내면서 동시에 다양한 저장 및 사용 조건에서 안정한 만나나아제를 제공하는 데는 어려움이 있다.
WO 99/646169는 다양한 서열을 갖는 만나나아제 효소를 포함하는 직물의 얼룩 제거용 세제 조성물을 개시한다.
Dhawan Samritil et al.은 미생물 만나나아제, 특히 상업 부문에서의 완전한 분해 만나나아제 공급원, 보호 조건 및 응용과 관련된 복합체 만난 구조 및 미생물 효소 복합체에 대한 개요를 제공한다.
본 발명의 목적은 이들 세제 조성물에 적용될 때 만나나아제 활성을 나타내는 신규한 효소를 포함하는 세제 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명은 다른 목적은 만난을 함유하는 얼룩(stain)에 증가된 얼룩 제거 성능을 가지는 세제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 관점에 따르면 서열번호 12(Man 6)의 아미노산 서열과 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나 이상의 효소를 포함하는 세제 조성물로, 상기 적어도 하나 이상의 효소는 만난 분해 활성을 갖는, 세제 조성물을 제공한다.
삭제
본 발명의 일 양태에서, 상기 적어도 하나 이상의 효소는 서열번호 12의 아미노산 서열과 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 세제 조성물에 포함된 만나나아제는 다양한 화학적 환경, 바람직하게는 세제 조성물에서 만난을 함유하는 물질을 분해하고 변형시키는데 적합하다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 세제 조성물은 프로테아제 (protease), 리파아제 (lipase), 큐티나아제 (cutinase), 아밀라아제 (amylase), 카보하이드라아제 (carbohydrase), 셀룰라아제 (cellulase), 펙티나아제 (pectinase), 펙타틀리아제 (pectatlyase), 만나나아제 (mannanase), 아라비나아제 (arabinase), 갈락타나아제 (galactanase), 자일라나아제 (xylanase), 옥시다아제 (oxidase), 잔타나아제 (xanthanase), 락카아제 (laccase), 및/또는 퍼옥시다아제 (peroxidase)로 구성된 군에서 선택되고, 바람직하게는 프로테아제 (protease), 아밀라아제 (amylase), 셀룰라아제 (cellulase) 및 리파아제 (lipase)로 구성된 군에서 선택되는, 하나 이상의 추가적인 효소를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 세제 조성물은 바 (bar), 균질의 정제 (homogenous tablet), 둘 이상의 층을 가지는 정제 (tablet having two or more layers), 둘 이상의 구획을 가지는 파우치 (pouch having one or more compartments), 일반 또는 컴팩트 분말 (regular or compact powder), 과립 (granule), 페이스트 (paste), 겔 (gel), 또는 일반, 컴팩트 또는 농축액 (regular, compact or concentrated liquid)의 형태이다. 일 양태로서, 상기 세제 조성물은 세탁 세제 조성물, 바람직하게는 액체 또는 고체의 세탁 세제 조성물일 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 세제 조성물의 만난 분해 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태로서 본 발명은 본원에 개시된 세제 조성물의 세탁 공정 (laundary process)에서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 세제 조성물을 표면 (surface)에 접촉시키는 단계 (contacting)를 포함하는, 표면으로부터 얼룩 (stain)을 제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본원에 개시된 세제 조성물을 만난에 적용하는 단계 (applying)를 포함하는 만난을 분해하는 방법에 관한 것으로, 바람직하게 상기 만난은 직물(textile)의 표면에 있다.
도 1은 바실러스 (Bacillus)에서 복제를 위한 벡터 pEV1를 도식적으로 보여준다.
도 2는 재조합 만나나아제 단백질 (Man6(발명), Man7(참조) 및 Man14(참조))를 과량 생산하기 위한 Trichoderma reesei 원형질체 (protoplast)의 형질전환에 사용된 발현 카세트를 도식적으로 보여준다. 만나나아제 유전자는 T. reesei cel7A/cbh1 프로모터 (pcbhl)의 조절하에 있으며, 전사의 종결은 T. reesei cel7A/cbh1 종결 서열 (tabh1)에 의해 보장되었다. amdS 유전자는 형질전환 마커로써 포함되었다.
도 3은 아주린-가교된 카롭 갈락토만난(Azurine-crosslinked carob galactomannan)을 기질로 사용하고, pH 7의 40 mM Britton-Robinson 버퍼에서 10분 반응 시간으로 분석된, 재조합 Man6(발명), Man7(참조) 및 Man14(참조) (바실러스 생산된)의 온도 프로파일이다. 모든 측정은 최소한 중복 (duplicates)하여 진행하였다. 데이타 포인트(data points)는 개별 측정의 평균이다.
도 4는 pH 4 내지 pH 11의 40 mM Britton-Robinson 버퍼에서 재조합 Man6(발명), Man7(참조) 및 Man14(참조) (바실러스 생산된)의 활성에 대한 pH의 효과를 나타낸다. 반응 온도는 50℃, 반응 시간은 10분이었다. 아주린-가교된 카롭 갈락토만난을 기질로 사용하였다. 모든 측정은 최소한 중복 (duplicates)하여 진행하였다. 데이타 포인트 (data points)는 개별 측정의 평균이다.
도 5는 박테리아 만나나아제의 SDS-PAGE 분석을 보여준다.
도 6은 상업용 중질 액체 세제 A (Commercial heavy duty liquid detergent A) 4,4 g/l의 존재하에 40℃, 16°dH, 60분, pH 약 8.3 에서 명도 (lightness) (4 개의 얼룩의 ΔL*의 합계)의 증가로서 Man 6(발명) 및 Man7(참조) (Bacillus 및 Trichoderma 에서 생산)의 얼룩 제거 성능을 보여준다. 효소는 활성 단위 (activity units)로 투여되었다. 상업적으로 제조된 Mannaway® 4,0 L를 비교예로 사용하였다.
도 7은 상업용 중질 액체 세제 A 4,4 g/l의 존재하에 40℃, 16°dH, 60분, pH 약 8.3 에서 명도 (4 개의 얼룩의 ΔL*의 합계)의 증가로서 Man 6(발명) 및 Man7(참조) (Bacillus에서 생산)의 얼룩 제거 성능을 보여준다. 효소는 활성 효소 단백질 (active enzyme protein, AEP)로 투여되었다. 상업적으로 제조된 Mannaway® 4,0 L를 비교예로 사용하였다.
도 8은 상업용 컬러 세제 분말 (Commercial color detergent powder) 3.8 g/l의 존재하에 40℃, 16°dH, 60분, pH 약 10에서 명도 (4개의 얼룩의 ΔL*의 합계)의 증가로서 Man 6(발명) 및 Man7(참조) (Bacillus에서 생산)의 얼룩 제거 성능을 보여준다. 효소는 활성 단위(activity units)로 투여되었다. 상업적으로 제조된 Mannaway® 4,0 L를 비교예로 사용하였다.
도 9는 상업용 컬러 세제 분말 3.8 g/l의 존재하에 40℃, 16 °dH, 60분, pH 약 10 에서 명도 (4개의 얼룩의 ΔL*의 합계)의 증가로서 Man 6(발명) 및 Man7(참조) (Bacillus에서 생산)의 얼룩 제거 성능을 보여준다. 효소는 활성 효소 단백질로 투여되었다. 상업적으로 제조된 Mannaway® 4,0 L를 비교예로 사용하였다.
도 10은 상업용 표백 세제 분말 (Commercial bleach detergent powder) 4.2 g/l의 존재하에 40℃, 16 °dH, 60분, pH 약 9.5 에서 명도 (3개의 얼룩의 ΔL*의 합계)의 증가로서 Man 6(발명) 및 Man7(참조) (Bacillus에서 생산)의 얼룩 제거 성능을 보여준다. 효소는 활성 효소 단백질로써 투여되었다. 상업적으로 제조된 Mannaway® 4,0 L를 비교예로 사용하였다.
도 11은 상업용 중질 액체 세제 B (Commercial heavy duty liquid detergent B) 5 g/l의 존재하에 40℃, 16 °dH, 60분, pH 약 8.3 에서 명도 (2개의 얼룩의 ΔL*의 합계)의 증가로서 Man 14(참조) (Bacillus에서 생산)의 얼룩 제거 성능을 보여준다. 효소는 활성 단위로써 투여되었다. 상업적으로 제조된 Mannaway® 4,0 L를 비교예로 사용하였다.
도 12는 상업용 중질 액체 세제 B (Commercial heavy duty liquid detergent B) 5 g/l의 존재하에 40℃, 16 °dH, 60분, pH 약 8.3 에서 명도 (2개의 얼룩의 ΔL*의 합계)의 증가로서 Man 14(참조) (Bacillus에서 생산)의 얼룩 제거 성능을 보여준다. 효소는 활성 효소 단백질로 투여되었다. 상업적으로 제조된 Mannaway® 4,0 L를 비교예로 사용하였다.
도 13은 37℃에서 액체 세제 (OMO Color)에서의 Man 6 및 Man7(참조) (Bacillus에서 생산)의 안정성을 보여준다. 상업적으로 제조된 Mannaway® 4,0 L를 비교예로 사용하였다.
도 14는 상업용 중질 액체 세제 A에서 Man 6 (Bacillus에서 생산)의 안정성을 보여준다. 상업적으로 제조된 Mannaway® 4,0 L를 비교예로 사용하였다.
본원에서 사용되는 "단리된(isolated)"은 천연(자연)에서 발생하지 않는 형태 또는 환경에서의 물질을 의미한다. 단리된 물질의 비제한적인 예는 (1) 임의의 비천연적으로 발생하는 물질 (any non-naturally occurring substance) (2) 임의의 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩타이드 또는 보조인자를 포함하는 임의의 물질로, 천연에서 그것이 연관되어 있는 천연 발생 성분 (constituents)의 하나 이상 또는 전부로부터 최소한 부분적으로 제거된 임의의 물질 (3) 천연에서 발견된 물질과 관련하여 인간의 손에 의해 변형된 임의의 물질, 또는 (4) 천연적으로 연관된 다른 성분 (componets)에 비해 해당 물질의 양을 증가 또는 감소시킴으로써 변형된 임의의 물질 (예를 들어, 숙주 세포에서의 재조합 생산; 물질을 인코딩하는 유전자의 하나 또는 복수의 복제물; 및 물질을 인코딩하는 유전자와 연관된 천연의 프로모터에 대해 대체 프로모터의 사용)을 포함한다. 일 양태 (embodiment)에서 본 발명의 폴리펩타이드, 효소, 폴리뉴클레오티드, 숙주 세포 또는 조성물은 단리된 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는 (comprising)"은 "구성된 (consisting of)" 및 " ~로만 구성된 (consisting only of)"의 좁은 의미의 표현 뿐만 아니라, "포함하는 (including)", "함유하는 (containing)" 및 "종합하는 (comprehending)"의 넓은 의미를 포함한다.
본원에서 사용되는 "단편 (fragment)"은 결실된 (deleted) 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 갖는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. DNA와 관련하여, 단편은 임의의 길이의 단일 가닥 및 이중가닥 DNA를 모두 포함한다. 단편은 효소 활성 또는 조절 활성과 같은, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능을 갖는 활성 단편일 수 있다. 단편은 또한 불활성 단편일 수 있으며, 즉 천연 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 생물학적 효과를 갖지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 "변이체 (varinet)"는 하나 이상의 뉴클레오티드/아미노산이 삽입 또는 결실되거나, 화학적으로 변형된 서열 (뉴클레오티드 또는 아미노산)의 단편을 의미한다.
본원에서 사용되는 "펩타이드 (peptide)" 및 "폴리펩타이드 (polypeptide)"는 복수의 연속적으로 중합된 (consecutive polymerized) 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이다. 본 발명의 목적을 위해, 펩타이드는 최대 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자이고, 폴리펩타이드는 20개 이상의 잔기를 포함한다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 변형된 아미노산 잔기, 코돈에 의해 인코딩되지 않는 천연적으로 발생하는 아미노산 잔기 및 비천연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "단백질 (protein)"은 임의의 크기의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 단백질은 효소, 단백질, 항체, 막 단백질, 펩타이드 호르몬, 조절자 (regulator) 또는 임의의 다른 단백질일 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)"는 5'에서 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 천연 공급원으로부터 단리되거나, 시험관 내에서 합성되거나, 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 "변형(modification)", "변형된(modified)" 및 유사한 용어는 폴리뉴클레오티드의 코딩 또는, 예를 들어, 조절 서열 (regulatory sequence), 5' 비번역 영역 (5' untranslated region), 3' 비번역 영역 (3' untranslated region), 상향 조절 유전자 요소 (up-regulating genetic element), 하향 조절 유전자 요소 (down-regulating genetic element), 인핸서 (enhancer), 억제자 (suppressor), 프로모터, 엑손 또는 인트론 영역과 같은, 비코딩 영역에서의 변형을 지칭한다. 상기 변형은 일부 양태에서 폴리뉴클레오티드의 생물학적 효과, 작용 또는 기능에 영향을 미치지 않는 단지 구조적인 것일 수 있다. 다른 양태에서, 상기 변형은 폴리뉴클레오티드의 생물학적 효과, 작용 또는 기능에 변화를 야기하는 구조적 변형이다. 이러한 변형은 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능을 강화, 억제 또는 변화시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 "동일성(identity)"은 두 서열 모두에 존재하는 잔기가 있는 경우, 다수의 위치에 걸쳐 (over the number of positions) 2개의 정렬된 서열 사이의 아미노산 잔기의 정확한 일치 백분율 (percentage of exact matches)을 의미한다. 하나의 서열이 다른 서열에 상응하는 잔기가 없는 잔기를 갖는 경우, 정렬 프로그램은 정렬에서 갭을 허용하고, 그 위치는 동일성 계산의 분모 (denominator)에서 계수되지 않는다. 동일성은 EMBL-EBI 웹 사이트 (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)의 Pairwise Sequence Alignment tool EMBOSS Needle로 결정되는 값이다.
본원에서 사용되는 "숙주 세포 (host cell)"는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물 (nucleic acid construct) 또는 발현 벡터에 의한 형질전환 (transformation), 형질감염 (transfection), 형질도입 (transduction), 교배 (mating), 교차 (crossin) 등에 민감한 임의의 세포 유형을 의미한다. 용어 "숙주 세포 (host cell)"는 복제 동안 발생하는 돌연변이로 인해 동일하지 않은 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 비제한적인 예는 Ascomycota 문 (Division), Pezizomycotina 아문 (Subdivision)으로부터의; 바람직하게는 Sordariomycetes 강(Class), Hypocreomycetidae 아강(Subclass), Hypocreales 및 Microascales 목(Orders) 및 Aspergillus , Chrysosporium , Myceliophthora 및 Humicola 의 멤버로 구성된 군으로부터의; 보다 바람직하게는 Hypocreacea , Nectriaceae , Clavicipitaceae, Microascaceae 과(Family) 및 Trichoderma (Hypocrea 의 무성생식), Fusarium , Gibberella , Nectria , Stachybotrys , Claviceps , Metarhizium , Villosiclava, Ophiocordyceps , Cephalosporium , 및 Scedosporium 속(Genera)으로 구성된 군으로부터의; 보다 바람직하게는 Trichoderma reesei ( Hypocrea jecorina ), T. citrinoviridae , T. longibrachiatum , T. virens , T. harzianum , T. asperellum , T. atroviridae , T. parareesei , , Fusarium oxysporum , F. gramineanum, F. pseudograminearum , F. venenatum , Gibberella fujikuroi , G. moniliformis, G. zeaea , Nectria ( Haematonectria ) haematococca , Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata , Claviceps purpurea , Metarhizium acridum , M. anisopliae, Villosiclava virens , Ophiocordyceps sinensis , Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum , 및 Scedosporium apiospermum , 및 Aspergillus niger, Aspergillus awamori , Aspergillus oryzae , Chrysosporium lucknowense , Myceliophthora thermophila , Humicola insolens , 및 Humicola grisea로 구성된 군으로부터의; 가장 바람직하게는 Trichoderma reesei 로부터의 진균 세포 (fungal cells), 섬유상 진균 세포 (filamentous fungal cells)이다. 숙주 세포의 비제한적인 예는 박테리아 세포, 바람직하게는 그람 양성 바실루스 (Bacilli) (예: B. subtilis, B. licheniformis , B. megaterium , B. amyloliquefaciens , B. pumilus), 악티노마이세탈레스 (actinomycetales) (예: Streptomyces sp.) 및 효모 (yeasts) (예: Saccharomyces cerevisiae , Pichia pastoris , Yarrowia lipolytica)이다.
일 실시예에서, 숙주 세포의 양태는 진균 세포, 바람직하게는 Trichoderma 또는 Trichoderma reesei 같은 섬유상 진균 세포이다. 일 실시예에서, 숙주 세포의 양태는 박테리아 세포, 바람직하게는 B. subtilis , B. licheniformis , B. megaterium, B. amyloliquefaciens , B. pumilus 같은 그람 양성 바실러스 세포이다.
"재조합 세포 (recombinant cell)" 또는 "재조합 숙주 세포 (recombinant host cell)"는 상기 세포 또는 숙주 세포에 고유하지 (native) 않은 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 변형되거나 (modified) 변경된 (altered) 세포 또는 숙주 세포를 지칭한다. 일 양태에서, 유전적 변형은 숙주 세포의 게놈에 폴리뉴클레오티드가 통합되는 것을 포함한다. 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포와 비교하여 외인성 (exogenous)이다.
본원에서 사용되는 "발현(expression)"은 이에 제한되지는 않으나, 전사, 번역, 번역 후 변형 및 분비를 포함하여, 숙주 세포에서 폴리펩타이드 생산에 관여하는 임의의 단계를 포함한다. 발현 후에는 숙주 세포 또는 발현된 산물을 수확 (harvesting), 즉, 회수 (recoovering)할 수 있다.
용어 "발현 벡터 (expression vector)"는 그 전사를 제공하는 추가의 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 세그먼트를 포함하는 선형 또는 원형의 DNA 분자를 나타낸다. 상기 추가의 세그먼트는 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 복제 원점, 하나 이상의 선택 가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 담체 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 또는 둘 모두의 요소 (elements)를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 재조합 DNA 절차 (recombinant DNA procedures)에 편리하게 적용되는 임의의 발현 벡터일 수 있고, 벡터의 선택은 종종 벡터가 도입되는 숙주 세포에 의존적일 것이다. 따라서, 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉, 염색체 외에 실체 (extrachromosomal entity)로서 존재하는 벡터로, 그 복제가 염색체 복제와 독립적인, 예를 들어, 플라스미드일 수 있다. 대안적으로, 상기 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 때, 숙주 세포 게놈 내로 통합되고, 통합된 게놈과 함께 복제되는 것일 수 있다.
폴리펩타이드 또는 단백질의 발현과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "재조합 발현된 (recombinant expressed)" 또는 "재조합으로 발현된 (recombinantly expressed)"은 당업계의 표준 정의에 따라 정의된다.
특정 미생물 공급원과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "~로부터 수득된 (obtained from)" 및 "수득된 (obtained)"은 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩타이드가 그 특정 공급원 (동종 발현)에 의해 또는 그 공급원으로부터의 유전자가 삽입된 세포 (이종 발현)에 의해 생산되는 것을 의미한다.
용어 "효소 조성물 (enzyme composition)"은, 통상적인 효소 발효 산물로서, 단일 종의 미생물로부터 단리 및 정제될 수 있고, 이러한 제제 (preparations)는 일반적으로 다수의 상이한 효소 활성을 포함하는 통상적인 효소 발효 산물이거나; 단일 성분 효소 (monocomponent enzyme)의 혼합물로서, 상기 효소는 바람직하게는 통상적인 재조합 기술을 사용하여 박테리아 또는 진균 종으로부터 유래한 효소들로, 이들 효소는 다른 종, 바람직하게는 진균 또는 박테리아 종으로부터 유래될 수 있고, 발효되어 별도로 단리 및 정제될 수 있는 단일 성분 효소의 혼합물이거나, 재조합 만나나아제의 발현을 위한 숙주 세포로서 작용하는 미생물의 발효 산물의 혼합물로서, 상기 미생물은 동시에 다른 효소도 생산하는, 미생물의 발효 산물의 혼합물을 의미한다.
용어 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 DNA 세그먼트를 지칭할 때, 세그먼트가 배열되어 이들이 의도된 목적을 위해 함께 작동하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 전사는 프로모터에서 개시되어 코딩 세그먼트를 통해 터미네이터로 진행된다.
용어 "프로모터 (promoter)"는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 위해 제공하는 DNA 서열을 포함하는 유전자의 일부를 나타낸다. 프로모터 서열은 항상 그러한 것은 아니나, 보통 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견된다.
용어 "분비 신호 서열 (secretory signal sequence)"은 그것이 합성된 숙주 세포의 분비 경로를 통하여 더 큰 폴리펩타이드에 방향성을 지시하는 (direct) 그 더 큰 폴리펩타이드의 성분으로서의 폴리펩타이드 ("분비 펩타이드 (secoretory peptide)")를 인코딩하는 DNA 서열을 나타낸다. 상기 분비 신호 서열은 고유하거나 (native) 또는 다른 공급원으로부터의 분비 신호 서열 또는 캐리어 서열로 대체될 수 있다. 숙주 세포에 따라, 상기 더 큰 펩타이드는 분비 경로를 통한 통과 (transit) 과정에서 분비 펩타이드를 제거하기 위해 절단될 수 있다.
용어 "코어 영역 (core region)"은 변형 또는 변경되거나 되지 않을 수 있지만, 그 원래 활성을 유지하는 효소의 도메인을 의미한다; 당업계에 공지된 촉매 도메인은 기능적으로 남아있다.
용어 "링커 (linker)" 또는 "스페이서 (spacer)"는 다중 도메인 단백질의 도메인 사이, 예를 들어 효소 코어와 탄수화물 결합 모듈 (CBM) 또는 임의의 다른 효소 하이브리드와 같은 결합 도메인을 포함하는 효소 사이에, 또는 융합 폴리펩타이드, 예를 들어 2개의 코어 효소를 포함하는 융합 단백질로서 발현된 2개의 단백질 또는 폴리펩타이드 사이에 존재할 수 있는 최소한 두 개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, CBM과 효소 코어의 융합 단백질은 효소 코어를 인코딩하는 DNA 서열, 링커를 인코딩하는 DNA 서열, CBM을 인코딩하는 DNA 서열을 하나의 오픈 리딩 프레임으로 순차적으로 융합시키고 이 구조물을 발현시킴으로써 제공된다.
용어 "세제 조성물 (detergent composition)"은 달리 지시되지 않는 한, 과립 또는 분말 형태의 다목적 (all-purpose) 또는 중질 (heavy duty) 세척제, 특히 클리닝 세제; 액체, 겔 또는 페이스트 형태의 다목적 세척제, 특히 소위 중질 액체 (HDL) 유형; 액체 미세 직물 (fine-fabric) 세제; 손 식기 세척제 또는 경질 (light duty) 식기 세척제, 특히 고-거품 유형 (high-foaming type)의 식기 세척제; 가정용 및 기관용의 다양한 정제, 과립, 액체 및 린스-유형을 포함하는 기계 식기 세척제; 액체 클리닝 및 소독제 (disinfecting agent), 자동차 또는 카페트 샴푸, 욕실 클리너; 금속 클리너; 뿐만 아니라 표백 첨가제 (bleach additives) 및 "얼룩 스틱(stain-stick)" 과 같은 클리닝 보조제 (cleaning auxiliaries) 또는 전처리 유형 (pre-treat type)을 포함한다. 용어 "세제 조성물 (detergent composition)" 및 "세제 제형 (detergent formulation)"이라는 용어는 더러워진 물체의 클리닝을 위해 세척 매체 (washing medium)에 사용하기 위한 혼합물을 나타내는데 사용된다. 일부 양태에서, 상기 용어는 세탁용 직물 (fabric) 및/또는 의복 (garment)과 관련하여 (예를 들어, "세탁 세제 (laundry detergents)") 사용된다. 대안적인 양태에서, 상기 용어는 식기 (dishes), 식기 도구 (cutlery) 등을 세척하는데 사용되는 것과 같은 다른 세제 (예를 들어, "식기 세제 (dishwashing detergents)")를 지칭한다. 본 발명은 임의의 특정 세제 제형 또는 조성물로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 상기 용어는 본 발명에 따른 변이체 이외에, 예를 들어 계면활성제 (surfactants), 빌더 (builders), 킬레이터 (chelators) 또는 킬레이트제 (chelating agents), 표백 시스템 (bleach system) 또는 표백 성분 (bleach components), 중합체 (polymers), 직물 컨디셔너 (fabric conditioners), 폼 부스터 (foam boosters), 비누 거품 억제제 (suds suppressors), 염료 (dyes), 향료 (perfume), 탈지 억제제 (tannish inhibitors), 광학 표백제 (optical brighteners), 살균제 (bactericides), 살진균제 (fungicides), 토양 현탁제 (soil suspending agents), 부식 방지제 (anticorrosion agents), 효소 억제제 또는 안정제 (enzyme inhibitors or stabilizers), 효소 활성화제 (enzyme activators), 트랜스퍼라제 (transferase(s)), 가수 분해 효소 (hydrolytic enzymes), 산화 환원제 (oxido reductases), 블루닝제 및 형광 염료 (bluing agents and fluorescent dyes), 산화 방지제 (antioxidants) 및 가용화제 (solubilizers)를 함유할 수 있는 세제를 포괄하는 것으로 의도된다.
용어 "직물 (textile)"은 얀 (yarns), 얀 중간체 (yarn intermediates), 섬유 (fibers), 부직 직물 (non-woven materials), 천연 직물 (natural materials), 합성 직물 (synthetic materials) 및 임의의 다른 직물, 이들 직물로 만들어진 천 (fabrics), 이들 천으로 만들어진 생성물 (예: 의복 (garments) 및 다른 제품)을 포함하는 임의의 직물을 의미한다. 상기 직물이나 천은, 편직물 (knits), 직포 (wovens), 데님 (denims), 부직포 (non-wovens), 펠트 (felts), 얀 (yarns) 및 타올링 (towelling) 형태일 수 있다. 상기 직물은 목화 (cotton), 아마/린넨 (flax/linen), 황마 (jute), 라미 (ramie), 사이잘 (sisal) 또는 코이어 (coir)를 포함하는 천연 셀룰로오스 또는 비스코스/레이온 (viscose/rayon), 라미 (ramie), 셀룰로오스 아세테이트 섬유 (트리셀)(cellulose acetate fibers (tricell)), 리오 셀 (lyocell) 또는 이들의 블렌드를 포함하는 인공 셀룰로오스 (예를 들어 목재 펄프에서의 유래), 와 같은 셀룰로오스 기반일 수 있다. 상기 직물 또는 천은 울 (wool), 카멜 (camel), 캐시미어 (cashmere), 모헤어 (mohair), 래빗 (rabbit) 및 실크 (silk)를 포함하는 천연 폴리아미드 또는 나일론 (nylon), 아라미드 (aramid), 폴리에스테르 (polyester), 아크릴 (acrylic), 폴리프로필렌 (polypropylen) 및 스판덱스/엘라스틴 (spandex/elastane)와 같은 합성 중합체 (synthetic polymer) 또는 이들의 블렌드 뿐만 아니라 셀룰로오스 기반 및 비-셀룰로오스 기반 천의 블렌드와 같이 비-셀룰로오스 기반일 수 있다. 블렌드의 예는 면 및/또는 레이온/비스코스와 울, 합성 섬유(예: 폴리아미드 섬유, 아크릴 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리비닐 알코올 섬유, 폴리 염화비닐 섬유, 폴리우레탄 섬유, 폴리우레아 섬유, 아라미드 섬유) 및 셀룰루오스-함유 섬유(예: 레이온/비스코스, 라미, 아마/린넨, 황마, 셀룰로오스 아세테이트 섬유, 리오셀)와 같은 하나 이상의 동반 직물 (material)의 블렌드이다. 천(fabric)은 통상적인 세탁 가능한 세탁물, 예를 들어, 얼룩진 (stained) 가정용 세탁물일 수 있다. 천 (fabric) 또는 의복 (garment)이라는 용어가 사용될 때, 더 광범위한 직물 (textile)을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "안정성 (stability)"은 저장 안정성 및 사용 중, 안정성 예를 들어 세척 과정 동안 (세척 안정성에서) 안정성을 포함하며, 시간의 함수로서 본 발명에 따른 프로테아제 변이체의 안정성을 반영하고, 예를 들어, 프로테아제가 용액, 특히 세제 용액에 있을 때, 얼마나 활성이 유지되는가이다. 상기 안정성은 많은 요인, 예를 들어, pH, 온도와 빌더, 계면활성제 등의 양과 같은 세제 조성물에 의해 영향을 받는다. 프로테아제 안정성은 본원 재료 및 방법 섹션에 기재된 '안정성 분석 (stability assay)'을 사용하여 측정될 수 있다. 용어 "개선된 안정성 (improved stability)" 또는 "증가된 안정성 (increased stability)"은 본원에서 모 (parent) 프로테아제의 안정성에 비해 용액에서 증가된 안정성을 나타내는 변이체 프로테아제로 정의된다. 용어 "개선된 안정성" 및 "증가된 안정성"은 "개선된 화학 안정성 (improved chemical stability)", "세제 안정성 (detergent stability)" 또는 "개선된 세제 안정성 (improved detergent stability)"을 포함한다.
세제 조성물 (Detergent Composition)
본 발명은 박테리아 만나나아제 효소를 포함하는 신규한 세제 조성물에 관한 것이다. 박테리아 만나나아제를 포함하는 상기 세제 조성물은 만난의 분해 (degradation) 또는 변형 (modification)을 요하는 세탁 (laundry) 및 클리닝 (cleaning) 적용에 유용하다. 본 발명은 또한 세탁 및 클리닝 적용에서의 상기 세제 조성물의 용도 및 만난 분해 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "만난 (mannan)"은 α-1,6-결합에 의해 골격 (backbone)에 부착된 갈락토오스 (galactose)의 측쇄와 β-1,4-결합에 의해 함께 연결된 만노오스 (mannose) 골격으로 구성된 다당류를 지칭한다. 만난은 구아검 (guar gum) 및 로커스트 빈 검 (locust bean gum)과 같은 식물계 기반 물질을 포함한다. 글루코만난 (glucomannan)은 다소 규칙적으로 교대하는 β-1,4-결합된 만노오스 및 글루코오스의 골격을 갖는 다당류이며, 갈락토만난과 갈락토글루코만난은 알파 -1,6 결합된 갈락토오스 측쇄를 갖는 만난 및 글루코만난이다.
본원에서 사용되는 용어 "만나나아제 (mannanase)" 또는 "갈락토만나나아제 (galactomannanase)"는 당업계에 따라 만난 엔도-1,4-베타-만노시다제 (mannan endo-1,4-beta-mannosidase)로서 정의된 만나나아제 효소를 나타내며, 대안적인 명칭으로는 베타-만나나아제 (beta-mannanase) 및 엔도-1,4-만나나아제 (endo-1,4-mannanase)를 가지며, 만난, 갈락토만난, 글루코만난 및 갈락토글루코만난에서 1,4- 베타-D- 만노시드 결합 (1,4-beta-D-mannosidic linkages)의 가수분해를 촉매한다. 만나나아제는 Enzyme Nomenclature에 따라 EC 3.2.1.78로 분류된다.
본원에서 사용되는 "만나나아제 활성 (mannanase activity)"은 폴리펩타이드의 만난 분해 활성을 지칭한다. 본원에 사용되는 분해 또는 변형은 만노오스 단위 (mannose units) 가 만나나아제에 의해 만난 다당류로부터 가수 분해됨을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 만난 분해 활성은 당업계에 공지된 표준 시험 절차에 따라 시험될 수 있다. 실시예 7은 만나나아제 활성을 측정하기 위한 표준 방법의 예를 제공한다.
제1관점에 따르면, 본 발명의 세제 조성물은 서열번호 12 (Man6)의 아미노산 서열과 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 효소 중 적어도 하나이상의 효소를 포함하고, 상기 적어도 하나 이상의 효소는 만난 분해 활성을 갖는다.
삭제
본 발명의 일 양태에서, 상기 적어도 하나의 효소는 서열번호 12의 아미노산 서열에 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 세제 조성물에 포함된 만나나아제는 다양한 화학적 환경, 바람직하게는 세제 조성물에서 만난 함유 물질을 분해 및 변형하기에 적합하다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 세제 조성물은 프로테아제 (protease), 리파아제 (lipase), 큐티나아제 (cutinase), 아밀라아제 (amylase), 카보하이드라아제 (carbohydrase), 셀룰라아제 (cellulase), 펙티나아제 (pectinase), 펙타리아제 (pectatlyase), 만나나아제 (mannanase), 아라비나아제 (arabinase), 갈락타나아제 (galactanase), 자일라나아제 (xylanase), 옥시다아제 (oxidase), 잔타나아제 (xanthanase), 락카아제 (laccase) 및/또는 퍼옥시다아제 (peroxidase)로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제 및 리파아제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 효소를 더 포함한다.
일반적으로 선택된 효소(들)의 특성은 선택된 세제와 호환 가능 (compatible) 해야 하고, (즉, pH 최적화, 다른 효소 및 비 효소 성분과의 호환성 등), 상기 효소(들)는 유효량으로 존재해야 한다.
셀룰라아제 (Cellulases)
적합한 셀룰라아제는 박테리아 또는 진균 유래의 것들을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 적합한 셀룰라아제는 Bacillus, Pseudomonas , Humicola , Fusarium , Thielavia , Acremonium 속(genera)으로부터의 셀룰라아제를 포함하며, 예를 들어, US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 및 WO 89/09259에 개시된 Humicola insolens , Myceliophthora thermophila 및 Fusarium oxysporum 로부터 생산된 진균 셀룰라아제를 포함한다. 특히 적합한 셀룰라아제는 컬러 관리 이점(color care benefits)을 갖는 알칼리성 또는 중성 셀룰라아제이다. 이러한 셀룰라아제의 예는 EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940에 기재된 셀룰라아제이다. 다른 예는 WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 및 PCT/DK98/00299에 기재된 것과 같은 셀룰라아제 변이체이다. 엔도-베타-1,4-글루카나아제 (endo-beta-1,4-glucanase) 활성을 나타내는 셀룰라아제의 예 (EC 3.2.1.4)는 WO02 / 099091에 기재된 것들이다. 셀룰라아제의 다른 예는 WO96/29397에 기재된 패밀리 45 셀룰라아제를 포함하고, 특히 WO 02/099091의 서열번호 8의 다음 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는 그 변이체를 포함한다: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101, 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141, 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161, 162, 164, 165, 168, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 188, 191, 192, 195, 196, 200, 및/또는 20. 바람직하게는 P19A, G20K, Q44K, N48E, Q119H 또는 Q146 R에서 선택되는 변이를 포함한다. 시판되는 셀룰라아제에는 Celluclean™, Celluzyme™, 및 Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, 및 Puradax HA™ (Genencor International Inc.), 및 KAC-500(B)™ (Kao Corporation)를 포함한다.
프로테아제 (Protease)
적합한 프로테아제는 박테리아, 진균, 식물, 바이러스 또는 동물 유래, 예를 들어 채소 (vegetable) 또는 미생물 유래의 것들을 포함한다. 미생물 유래가 바람직하다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 세린 프로테아제 또는 메탈로프로테아제와 같은 알칼리성 프로테아제 일 수 있다. 세린 프로테아제는 예를 들어 트립신과 같은 S1 패밀리 또는 서브틸리신 (subtilisin)과 같은 S8 패밀리 일 수 있다. 메탈로프로테아제는 예를 들어 M4 패밀리로부터의 서모리신 (thermolysin) 또는 M5, M7 또는 M8 패밀리로부터의 것들과 같은 다른 메탈로프로테아제일 수 있다.
용어 "서브틸라제(subtilases)"는 Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 및 Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523에 따른 세린 프로테아제의 하위 그룹을 지칭한다. 세린 프로테아제는 기질과 공유 부가물 (covalent adduct)을 형성하는, 활성 부위에 세린을 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제의 하위 그룹이다. 서브틸라제는 Subtilisin 패밀리, Thermitase 패밀리, Proteinase K 패밀리, Lantibiotic peptidase 패밀리, Kexin 패밀리 및 Pyrolysin 패밀리의 6개의 하위-분류 (sub-division)로 구분된다. 서브틸라제의 예는 US7262042 및 WO09 /021867에 기재된 Bacillus lentus , B. alkalophilus , B. subtilis , B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus 및 Bacillus gibsonii와 같은 바실러스 유래의 것들, WO89/06279 에 기재된 subtilisin lentus , subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisin BPN ’, subtilisin 309, subtilisin 147 및 subtilisin 168, WO93/18140에 기재된 프로테아제 PD138가 있다. 다른 유용한 프로테아제는 WO92/175177, WO01/016285, WO02/026024 및 WO02/016547에 기재된 것들일 수 있다. 트립신-유사 프로테아제의 예는 트립신 (예를 들어, 돼지 또는 소 유래) 및 WO89/06270, WO94/25583 및 WO05/040372에 기재된 Fusarium 프로테아제, WO05/052161 및 WO05/052146에 기재된 Cellumonas 유래의 키모트립신 프로테아제가 있다. 추가의 바람직한 프로테아제는 WO95/23221에 기재된 것과 같은 Bacillus lentus DSM 5483 유래의 알칼리성 프로테아제 및 WO92/21760, WO95/23221, EP1921147 및 EP1921148에 기재된 이의 변이체가 있다. 메탈로프로테아제의 예는 Bacillus amyloliquefaciens로부터 유래된 것들과 같이 WO07/044993 (Genencor Int.)에 기재된 것과 같은 중성 메탈로프로테아제가 있다.
유용한 프로테아제의 예로는 WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/006305, WO11/036263, WO11/036264에 기재된 변이체이고, BPN’ 넘버링에 따라 특히 다음 위치에 하나 이상의 치환을 갖는 변이체이다: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 및 274. 보다 바람직한 서브틸라제 변이체는 다음 돌연변이를 포함할 수 있다: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (BPN' 넘버링을 사용). 적합한 상업적으로 이용 가능한 프로테아제 효소는 Alcalase®, DuralaseTm, DurazymTm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® 및 Esperase® (Novozymes A/S), Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, PreferenzTm, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, EffectenzTm, FN2®, FN3® , FN4®, Excellase®, , Opticlean® 및 Optimase® (Danisco/DuPont), AxapemTM (Gist-Brocases N.V.), BLAP (US5352604의 도 29에 나타낸 서열) 및 이의 변이체 (Henkel AG) 및 Kao로부터의 KAP (Bacillus alkalophilus subtilisin)라는 상표명으로 판매되는 것들을 포함한다.
리파아제(Lipases) 및 큐티나아제(Cutinases)
적합한 리파아제 및 큐티나아제는 박테리아 또는 진균 유래의 것들을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이 효소가 포함된다. 예로는 Thermomyces, 예를 들어 EP258068 및 EP305216에 기재된 T. lanuginosus (이전 명칭 Humicola lanuginosa)로부터의 리파아제, Humicola, 예를 들어 H. insolens (WO96/13580)로부터의 큐티나아제, Pseudomonas (이들 중 일부는 Burkholderia로 명칭이 변경됨), 예를 들어 P. alcaligenes 또는 P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP331376), P. sp . strain SD705 (WO95/06720 & WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012) 로부터의 리파아제, GDSL-타입 Streptomyces 리파아제 (WO10/065455), Magnaporthe grisea (WO10/107560)로부터의 큐티나아제, Pseudomonas mendocina (US5,389,536) 로부터의 큐티나아제, Thermobifida fusca (WO11/084412) 로부터의 리파아제, Geobacillus stearothermophilus 리파아제 (WO11/084417), Bacillus subtilis 로부터의 리파아제(WO11/084599), Streptomyces griseus (WO11/150157) 및 S. pristinaespiralis (WO12/137147 로부터의 리파아제를 포함한다. 다른 예로는 EP407225, WO92/05249, WO94/01541, WO94/25578, WO95/14783, WO95/30744, WO95/35381, WO95/22615, WO96/00292, WO97/04079, WO97/07202, WO00/34450, WO00/60063, WO01/92502, WO07/87508 및 WO09/109500에 기재된 것들과 같은 리파아제 변이체들이 있다.
바람직한 상업용 리파아제 제품은 LipolaseTM, LipexTM; LipolexTM 및 LipocleanTM (Novozymes A/S), Lumafast (originally from Genencor) 및 Lipomax (originally from Gist-Brocades )를 포함한다.
또 다른 예는 때때로 아실트랜스퍼라아제 (acyltransferase) 또는 퍼하이드로라아제 (perhydrolase) 로 지칭되는 리파아제가 있으며, 예를 들어, Candida antarctica lipase A (WO10/111143)와 상동성을 갖는 아실트랜스퍼라아제, Mycobacterium smegmatis (WO05/56782) 로부터의 아실트랜스퍼라아제, CE 7 family (WO09/67279)로부터의 퍼하이도라아제 및 Huntsman Textile Effects Pte Ltd 로부터 시판 중인 제품 Gentle Power Bleach에 사용되는 M. smegmatis 퍼하이드로라아제 변이체로 특히 S54V 변이체가 있다.
아밀라아제 (Amylases)
본 발명의 서브틸라제 변이체와 함께 사용될 수 있는 적합한 아밀라아제는 알파-아밀라아제 또는 글루코아밀라아제 일 수 있고 박테리아 또는 진균 유래일 수 있다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 아밀라아제는 예를 들어, 바실러스, 예컨대 GB 1,296,839에 상세하게 기재된 Bacillus licheniformis와 같은 특수 균주로부터 수득된 알파 아밀라아제를 포함한다.
적합한 아밀라아제는 WO 95/10603에서 서열번호 3을 갖는 아밀라아제 또는 서열번호 3과 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 바람직한 변이체는 WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 및 WO 99/019467의 서열번호 4에 기재되어 있으며, 예컨대 다음 위치의 하나 이상에서 치환된 변이체이다: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408, 및 444.
다른 적합한 아밀라아제는 WO 02/010355에서 서열번호 6을 갖는 아밀라아제 또는 이에 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 바람직한 변이체는 위치 181 및 182에서 결실 및 위치 193에서 치환을 갖는 것들이다.
적합한 다른 아밀라아제는 WO 2006/066594의 서열번호 6에 나타낸 B. amyloliquefaciens 로부터 유래된 알파-아밀라아제의 잔기 1-33과 WO 2006/066594의 서열번호 4에 나타낸 B. licheniformis 알파-아밀라아제의 잔기 36-483을 포함하는 하이브리드 알파-아밀라아제와 이의 90% 서열 동일성을 갖는 변이체이다. 이 하이브리드 알파-아밀라아제의 바람직한 변이체는 다음 하나 이상의 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것들이다: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 및 Q264. WO2006/066594의 서열 번호 6에 나타낸 B. amyloliquefaciens 유래 된 알파-아밀라아제의 잔기 1-33 및 WO2006/0665의 서열번호 4의 잔기 36-483을 포함하는 하이브리드 알파-아밀라아제의 가장 바람직한 변이체는 다음 치환을 갖는 것들이다:
M197T;
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; 또는
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.
적합한 추가의 아밀라아제는 WO 99/019467에서 서열번호 6을 갖는 아밀라아제 또는 서열번호 6에 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체이다. 서열번호 6의 바람직한 변이체는 다음 하나 이상의 위치에서 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 것들이다: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 및 K269. 특히 바람직한 아밀라아제는 위치 R181 및 G182, 또는 위치 H183 및 G184에서 결실을 갖는 것들이다.
사용될 수 있는 추가적인 아밀라아제는 WO 96/023873의 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 2 또는 서열번호 7을 갖는 것들과 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 7과 90% 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체들이다. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 7의 바람직한 변이체들은 다음 하나 이상의 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것들이다: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 및 476. 보다 바람직한 변이체는 위치 181 및 182 또는 위치 183 및 184에서 결실을 갖는 것들이다. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7의 가장 바람직한 아밀라아제 변이체는 위치 183 및 184에서 결실 및 위치 140, 195, 206, 243, 260, 304 및 476 중 하나 이상에서 치환을 갖는 것들이다.
사용될 수 있는 다른 아밀라아제는 WO 08/153815의 서열번호 2, WO 01/66712의 서열번호 10을 갖는 아밀라아제 또는 WO 08/153815의 서열번호 2에 90% 서열 동일성 또는 WO 01/66712의 서열번호 10에 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체들이다. WO 01/66712의 서열번호 10의 바람직한 변이체는 다음 하나 이상의 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것들이다: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 및 264.
추가로 적합한 아밀라아제는 WO 09/061380의 서열번호 2를 갖는 아밀라아제 또는 서열번호 2와 90 % 서열 동일성을 갖는 이의 변이체들이다. 서열번호 2의 바람직한 변이체는 C-말단의 절단 (truncation) 및/또는 다음 하나 이상의 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것들이다: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 및 G475. 서열번호 2의 보다 바람직한 변이체는 다음 하나 이상의 위치에서 치환: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E 및 G475K, 및/또는 위치 R180 및/또는 S181에서 또는 T182 및/또는 G183의 결실을 갖는 것들이다. 서열번호 2의 가장 바람직한 아밀라아제 변이체는 다음 치환을 갖는 것들이다:
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; 또는
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K 여기서 상기 변이체는 C_말단이 절단되고, 선택적으로 위치 243에서의 치환 및/또는 위치 180 및/또는 위치 181에서 결실을 추가로 포함한다.
다른 적합한 아밀라아제는 WO01/66712에서 서열번호 12를 갖는 알파-아밀라아제 또는 서열번호 12와 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체이다. 바람직한 아밀라아제 변이체는 WO01/66712에서 서열번호 12의 다음 하나 이상의 위치에서 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 것들이다: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. 특히 바람직한 아밀라아제는 D183 및 G184에서 결실을 갖고, R118K, N195F, R320K 및 R458K에서 치환을 갖는 변이체들을 포함하고, M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 및 A339로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에서 추가적으로 치환을 갖는 변이체, 가장 바람직하게는, 이들 모든 위치에서 추가적으로 치환을 갖는 변이체를 포함한다.
다른 예는 WO2011/098531, WO2013/001078 및 WO2013/001087에 기재된 것들과 같은 아밀라아제 변이체이다.
상업적으로 이용가능한 아밀라아제는 DuramylTM, TermamylTM, FungamylTM, StainzymeTM, Stainzyme PlusTM, NatalaseTM, Liquozyme X and BANTM (from Novozymes A/S), 및 RapidaseTM , PurastarTM/EffectenzTM, Powerase 및 Preferenz S100 (from Genencor International Inc./DuPont)이다.
퍼옥시다아제(Peroxidases)/옥시다아제(Oxidases)
적합한 퍼옥시다아제/옥시다아제는 식물, 박테리아 또는 진균 유래의 것들을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 유용한 퍼옥시다아제의 예는 Coprinus, 예를 들어, C. cinereus로부터의 퍼옥시다아제 및 WO 93/24618, WO 95/10602, 및 98/15257에 기재된 이의 변이체들을 포함한다.
상업적으로 이용 가능한 퍼옥시다아제는 GuardzymeTM (Novozymes A/S)을 포함한다.
세제 효소(들)는 하나 이상의 효소를 함유하는 개별 첨가제 (separate additives)를 첨가하거나 이들 효소 모두를 포함하는 조합 첨가제 (combined additive)를 첨가함으로써 세제 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 세제 첨가제, 즉 개별 첨가제 또는 조합 첨가제는 예를 들어 과립제, 액체, 슬러리 (slurry) 등으로 제형화 될 수 있다. 바람직한 세제 첨가제 제형은 과립제, 특히 비분진 과립제, 액체, 특히 안정화된 액체, 또는 슬러리이다.
비-분진 과립제(non-dusting granulates)는 예를 들어 US 4,106,991 및 4,661,452에 개시된 바와 같이 제조될 수 있고 선택적으로 당업계에 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 왁스 코팅 물질의 예는 평균 분자량이 1000 내지 20000 인 폴리 (에틸렌옥사이드) 생성물 (폴리에틸렌 글리콜, PEG); 16 내지 50 개의 에틸렌옥사이드 단위를 갖는 에톡실화된 노닐페놀 (ethoxylated nonylphenol); 알코올이 12 내지 20 개의 탄소 원자를 함유하고 15 내지 80 개의 에틸렌 옥사이드 단위가 있는 에톡실화된 지방 알코올 (ethoxylated fatty alcohols); 지방 알코올; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리-글리세리드가 있다. 유동층 기술(fluid bed techniques)에 의한 적용에 적합한 필름 형성 코팅 물질 (film-forming coating material)의 예는 GB 1483591에 제공되어 있다. 액체 효소 제제는 예를 들어, 확립된 방법에 따라 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산 (lactic acid) 또는 붕산 (boric acid)을 첨가함으로써 안정화될 수 있다. 보호되는 효소는 EP 238,216에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다.
고형 세탁 세제 (solid laundry detergent)에 사용하기 위한 조성물은 예를 들어, 조성물의 중량을 기준으로 예컨대, 0.000005%-2%, 예컨대, 0.00001%-1%, 예컨대, 0.00001%-0,1%와 같이, 0.000001% - 5% 의 효소 단백질을 포함할 수 있다.
세탁액 (laundry liquid)에 사용하기 위한 조성물은 예를 들어, 조성물의 중량을 기준으로 예컨대 0.000005-1 %, 예컨대 0.00001 % -0,01 %와 같이, 0.000001% - 3%의 효소 단백질을 포함할 수 있다.
자동 식기 세척에 사용하기 위한 조성물은 예를 들어, 조성물의 중량을 기준으로 예컨대 0.000005 % -2 %, 예컨대 0.00001 % -1 %, 예컨대 0.00001 % -0,1 %와 같이, 0.000001% - 5%의 효소 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 세제 조성물의 효소(들)는 통상적인 안정화제 (stabilizing agent), 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤과 같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산, 붕산, 예를 들어 방향족 붕산염 에스테르와 같은 붕산 유도체, 또는 4- 포르밀페닐 보론산 (4-formylphenyl boronic acid)과 같은 페닐 보론산 유도체 (phenyl boronic acid derivative)를 사용하여 안정화될 수 있고, 상기 조성물은 예를 들어 WO92/19709 및 WO92/19708에 기재된 바와 같이 제형화 될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 추가의 클리닝 조성물 성분과 조합되어 본 발명의 효소를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다. 추가 성분의 선택은 당업자의 기술 내에 있으며, 아래에 제시된 예시적이고 비제한적인 성분을 포함하는 통상적인 성분을 포함한다.
성분의 선택은 직물 관리를 위해, 클리닝 될 직물의 유형, 오염 (soiling)의 유형 및/또는 정도, 클리닝이 수행되는 온도 및 세제 제품의 제형의 고려를 포함할 수 있다. 이하에 언급된 성분은 특정 기능에 따라 일반적인 머릿말로 분류되지만, 이는 해당 성분이 당업자에 의해 이해될 수 있는 추가 기능을 포함할 수 있으므로, 제한적으로 해석되어서는 안된다.
1. 계면활성제 (Surfactants)
세제 조성물은 하나 이상의 계면 활성제를 포함할 수 있고, 이는 음이온성 및/또는 양이온성 및/또는 비이온성 및/또는 반극성 (semi-polar) 및/또는 양쪽성 이온 (zwitterionic) 또는 이들의 혼합물 일 수 있다. 특정 양태에서, 상기 세제 조성물은 하나 이상의 비이온성 계면 활성제 및 하나 이상의 음이온성 계면 활성제의 혼합물을 포함한다. 계면 활성제(들)는 전형적으로 약 0.1 중량 % 내지 60 중량 %, 예컨대 약 1 중량 % 내지 약 40 중량 %, 또는 약 3 중량 % 내지 약 20 중량 %, 또는 약 3 중량 % 내지 약 10 중량 %의 수준으로 존재한다. 계면활성제(들)는 원하는 클리닝 적용에 기초하여 선택되며, 당업계에 공지된 임의의 통상적인 계면 활성제(들)를 포함한다. 세제에 사용하기 위해 당업계에 공지된 임의의 계면 활성제가 사용될 수 있다.
그 안에 포함될 때, 세제는 일반적으로 약 1 % 내지 약 40 중량 %, 예컨대 약 5 % 내지 약 30 %, 약 5 % 내지 약 15 %, 또는 약 20 % 내지 약 25 %의 음이온성 계면 활성제를 함유할 것이다. 음이온성 계면 활성제의 비제한적 예는 설페이트 및 설포네이트(sulfates and sulfonates), 특히 선형 알킬 벤젠 설포네이트 (LAS), LAS의 이성질체, 분지형 알킬 벤젠 설포네이트 (BABS), 페닐알칸설포네이트, 알파-올레핀 설포네이트 (AOS), 올레핀 설포네이트, 알켄 설포네이트, 알칸 -2,3-디일비스(설페이트), 하이드록시 알칸 설포네이트 및 디설포네이트, 알킬 설페이트 (AS), 예를 들어 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 지방 알코올 설페이트 (FAS), 1차 알코올 설페이트 (PAS), 알코올 에테르 설페이트 (AES 또는 AEOS 또는 FES, 또는 알코올 에톡시 설페이트 또는 지방 알코올 에테르 설페이트로도 알려져 있음), 2차 알칸 설포네이트 (SAS), 파라핀 설포네이트 (PS), 에스테르 설포네이트, 설폰화 지방산 글리세롤 에스테르, 메틸 에스테르 설포네이트 (MES)를 포함하는 알파-설포 지방산 메틸 에스테르 (알파 -SFMe 또는 SES), 알킬-또는 알케닐 숙신산, 도데세닐/테트라데세닐 숙신산 (DTSA), 아미노산의 지방산 유도체, 설포 숙신산의 디 에스테르 및 모노 에스테르 또는 비누 및 이들의 조합을 포함한다.
그 안에 포함될 때, 세제는 보통 약 0 중량 % 내지 약 10 중량 %의 양이온성 계면활성제를 함유할 것이다. 양이온성 계면활성제의 비제한적인 예에는 알킬디메틸에탄올아민 quat (alklydimethylethanolamine quat, ADMEAQ), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (cetyltrimethylammonium bromide, CTAB), 디메틸디스테아릴암모늄 클로라이드 (dimethyldistearylammonium chloride, DSDMAC), 및 알킬벤질디메틸암모늄 (alkylbenzyldimethylammonium), 알킬 4차 암모늄 화합물 (alkyl quaternary ammonium compounds), 알킬 옥실레이티드 4차 암모늄 (alkoxylated quaternary ammonium, AQA) 화합물 및 이들의 조합을 포함한다.
그 안에 포함될 때, 세제는 보통, 예컨대 약 0.5 % 내지 약 30 %, 특히 약 1 % 내지 약 20 %, 약 3 % 내지 약 5 %와 같이 약 3 % 내지 약 10 %, 또는 약 8 % 내지 약 12 %와 같이, 예를 들어, 약 0.2 중량 % 내지 약 40 중량 % 의 비이온성 계면활성제를 함유할 것이다. 비이온성 계면활성제의 비제한적 예는 알코올 에톡시레이트 (alcohol ethoxylates, AE or AEO), 알코올 프로폭시레이트 (alcohol propoxylates), 프로폭시화된 지방 알코올 (propoxylated fatty alcohols, PFA), 알콕시화된 지방산 알킬 에스테르 (alkoxylated fatty acid alkyl esters), 예컨대 에톡시화된 (ethoxylated) 및/또는 프로폭시화된 지방신 알킬 에스테르 (propoxylated fatty acid alkyl esters), 알킬페놀 에톡실레이트 (alkylphenol ethoxylates, APE), 노닐페놀 에톡시레이트 (nonylphenol ethoxylates, NPE), 알킬폴리글리코시드 (alkylpolyglycosides, APG), 알콕시화된 아민 (alkoxylated amines), 지방산 모노에탄올아미드 (fatty acid monoethanolamides, FAM), 지방산 디에탄올아미드 (fatty acid diethanolamides, FADA), 에톡시화된 지방산 모노에탄올아미드 (ethoxylated fatty acid monoethanolamides, EFAM), 프로폭시화된 지방산 모노에탄올아미드 (propoxylated fatty acid monoethanolamides, PFAM), 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드 (polyhydroxy alkyl fatty acid amides), 또는 글루코사민의 N-acyl N-alkyl 유도체 (glucamides, GA, 또는 fatty acid glucamide, FAGA), SPAN 및 TWEEN이라는 상표명으로 입수할 수 있는 제품 및 이들의 조합을 포함한다.
그 안에 포함될 때, 세제는 일반적으로 약 0 중량 % 내지 약 10 중량 % 의 반극성 계면활성제를 함유할 것이다. 반극성 계면활성제의 비제한적 예는 알킬디메틸아민옥사이드 (alkyldimethylamineoxide), N-(코코 알킬)-N,N-디메틸아민 옥사이드 (N-(coco alkyl)-N,N-dimethylamine oxide) 및 N-(탈로우-알킬)-N,N-비스(2-히드록시에틸)아민 옥사이드 (N-(tallow-alkyl)-N,N-bis(2-hydroxyethyl)amine oxide)와 같은 아민 옥사이드 (amine oxides, AO), 지방산 알칸올아미드 (fatty acid alkanolamides) 및 에톡시화된 지방산 알칸올아미드 (ethoxylated fatty acid alkanolamides) 및 이들의 조합을 포함한다.
그 안에 포함될 때, 세제는 보통 약 0 중량 % 내지 약 10 중량 % 의 양쪽성이온 계면활성제를 함유할 것이다. 양쪽성 이온 계면활성제의 비제한적인 예는 베타인(betaine), 알킬디메틸베타인(alkyldimethylbetaine), 설포베타인(sulfobetaine) 및 이들의 조합을 포함한다.
2. 하이드로트로프 (Hydrotropes)
하이드로트로프는 수용액에 소수성 화합물을 (또는 이와 반대로, 비극성 환경에 극성 물질을) 용해시키는 화합물이다. 전형적으로, 하이드로트로프는 친수성 및 소수성 특성 (소위 계면활성제로부터 알려진 양쪽성 (amphiphilic) 특성)을 모두 가지나, 하이드로트로프의 분자 구조는 일반적으로 자발적인 자기-응집 (spontaneous self-aggregation)을 선호하지는 않는다. 하이드로트로프는 마이크로셀러 (miceller), 라멜라 (lamellar) 또는 다른 잘 정의된 중간상 (meso-phases)을 형성하는 계면 활성제 및 지질에서 발견되는 바와 같은 자기 응집이 일어나는 이상 (above)의 임계 농도 (critical concentration)로 표시되지 않는다. 대신, 많은 하이드로트로프는 농도가 증가함에 따라 응집체의 크기가 커지는 연속식 응집 공정 (continuous-type aggregation process)을 보여준다. 그러나 많은 하이드로트로프는 물, 오일, 계면 활성제 및 중합체의 혼합물을 포함하여, 극성 및 비극성 특성의 물질을 함유하는 시스템의 상 거동 (phase behavior), 안정성 및 콜로이드 특성 (colloidal properties)을 변경시킨다. 하이드로트로프는 고전적으로 제약, 개인 관리, 식품으로부터 기술 응용 분야까지 산업 전반에 걸쳐 사용된다. 세제 조성물에 하이드로트로프를 사용하면, 예를 들어 상 분리나 고점도와 같이 바람직하지 않은 현상을 유발하지 않고, 계면 활성제의 보다 농축된 제형이 (물을 제거함으로써 액체 세제를 압축하는 과정에서와 같이) 가능하다.
세제는 0-5 중량 %, 예컨대 약 0.5 내지 약 5 %, 또는 약 3 % 내지 약 5 %의 하이드로트로프를 함유할 수 있다. 세제에 사용하기 위해 당업계에 공지된 임의의 하이드로트로프가 사용될 수 있다. 하이드로트로프의 비제한적인 예는 소듐 벤젠 설포네이트 (sodium benzene sulfonate), 소듐 p-톨루엔 설포네이트 (sodium p-toluene sulfonate, STS), 소듐 자일렌 설포네이트 (sodium xylene sulfonate, SXS), 소듐 쿠멘 설포네이트 (sodium cumene sulfonate, SCS), 소듐 시멘 설포 네이트(sodium cymene sulfonate), 아민 옥사이드(amine oxides), 알코올 및 폴리 글리콜에테르(polyglycolethers), 소듐 하이드록시나프토에이트 (sodium hydroxynaphthoate), 소듐 하이드록시 나프탈렌 설포네이트 (sodium hydroxynaphthalene sulfonate), 나트륨 에틸헥실 설페이트 (sodium ethylhexyl sulfate) 및 이들의 조합을 포함한다.
3. 빌더 및 공동-빌더(Builders and Co-Builders)
세제 조성물은 약 0-65 중량 %, 예컨대 약 5 % 내지 약 45 %의 세제 빌더 또는 공동 빌더, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 식기 세척 세제에서, 빌더의 수준은 전형적으로 40-65 %, 특히 50-65 %이다. 빌더 및/또는 공동 빌더는 Ca 및 Mg와 수용성 복합체를 형성하는 특히 킬레이트제 일 수 있다. 세탁 세제에 사용하기 위해 당업계에 공지된 임의의 빌더 및/또는 공동 빌더가 이용될 수 있다. 빌더의 비제한적 예에는 제올라이트 (zeolites), 디포스페이트 (파이로포스페이트) (diphosphates(pyrophosphates)), 트리포스페이트 (triphosphates) (예 : 소듐 트리포스페이트 (sodium triphosphate (STP 또는 STPP)), 카보네이트 (예 : 탄산나트륨 (sodium carbonate)), 가용성 실리케이트 (예: 소듐 메탄실리케이트 (sodium metasilicate)) 층상 실리케이트 (layered silicates) (예 : Hoechst의 SKS-6), 2- 미노 에-1-올 (2-aminoethan-1-ol, MEA), 디에탄올아민 (diethanolamine, DEA, 이미노디에탄올(iminodiethanol)이라고도 함), 트리에탄올 (trimethanolamine, TEA, 2,2',2''-니트릴로트리에탄올 이라고도 함)과 같은 에탄올 아민 및 카르복시메틸 이눌린 (carboxymethyl inulin, CMI) 및 이들의 조합을 포함한다.
세제 조성물은 또한, 0 내지 20 중량 %, 예를 들어 약 5 % 내지 약 10 %의 세제 공동 빌더, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 세제 조성물은 공동-빌더 단독, 또는 예를 들어, 제올라이트 빌더 같은 빌더와 조합하여 포함할 수 있다. 공동-빌더의 비제한적인 예는 폴리아크릴레이트 (polyacrylates)의 단독 중합체 (homopolymers) 또는 이의 공중합체 (copolymers), 예를 들어 폴리(아크릴산) (poly(acrylic acid) (PAA)) 또는 코폴리(아크릴산/말레산) (acrylic acid/maleic acid)(PAA / PMA))를 포함한다. 추가의 비제한적인 예는 시트레이트 (citrate), 아미노카르복실레이트 (aminocarboxylates), 아미노폴리카르복실레이트 (aminopolycarboxylates) 및 포스포네이트 (phosphonates)와 같은 킬레이터(chelators ) 및 알킬 또는 알케닐 숙신산 (alkyl- or alkenylsuccinic acid)을 포함한다. 추가적인 특정 예는 2,2',2''-니트릴로트리 아세트산 (2,2',2''-nitrilotriacetic acid, NTA), 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA), 이미노디숙신산 (iminodisuccinic acid, IDS), 에틸렌 디아민-N,N'-디숙신산 (ethylenediamine-N,N’-disuccinic acid, EDDS), 메틸글리신디아세트산( methylglycinediacetic acid, MGDA), 글리탐산-N,-N-디아세트산 (glutamic acid-N,N-diacetic acid , GLDA), 1-하이드록시에탄-1,1-디포스폰산(1-hydroxyethane-1,1-diphosphonic acid, HEDP), 에틸렌디아민 테트라-(메틸렌 포스폰산) ((ethylenediaminetetra-(methylenephosphonic acid), EDTMPA), 디에틸렌트리아민펜타키스 (메틸렌포스폰산) (diethylenetriaminepentakis(methylenephosphonic acid, DTPMPA 또는 DTMPA), N-(2-하이드록시에틸)이미노디아세트산 (N-(2-hydroxyethyl)iminodiacetic acid, EDG), 아스파르트산-N-모노아세트산 (aspartic acid-N-monoacetic acid, ASMA), 아스파르트산-N,N-디아세트산 (aspartic acid-N,N-diacetic acid, ASDA), 아스파르트산-N-모노프로피온산(aspartic acid-N-monopropionic acid, ASMP), 이미노디숙신산 (iminodisuccinic acid, IDA), N-(2-설포메틸)-아스파르트산 (N-(2-sulfomethyl)-aspartic acid, SMAS), N-(2-설포에틸)-아스파르트산 (N-(2-sulfoethyl)-aspartic acid, SEAS), N-(2-설포메틸)-글루탐산 (N-(2-sulfomethyl)-glutamic acid, SMGL), N-(2-설포에틸)-글루탐산 (N-(2-sulfoethyl)-glutamic acid, SEGL), N- 메틸이미노디아세트산 (N-methyliminodiacetic acid, MIDA), α-알라닌-N,N-디아세트산 (α-alanine-N,N-diacetic acid, α-ALDA), 세린-N,N-디아세트산 (serine-N,N-diacetic acid, SEDA), 이소세린-N,N-디아세트산 (isoserine-N,N-diacetic acid, ISDA), 페닐알라닌-N, N-디아세트산 (phenylalanine-N,N-diacetic acid, PHDA), 안트라닐산 -N, N-디아세트산 (anthranilic acid-N,N-diacetic acid, ANDA), 설파닐산-N,N-디아세트산 (sulfanilic acid-N, N-diacetic acid, SLDA) , 타우린-N,N- 디아세트산 (taurine-N,N-diacetic acid, TUDA) 및 설포메틸-N,N-디아세트산 (sulfomethyl-N, N-diacetic acid, SMDA), N-(2-하이드록시 에틸)-에틸리덴디아민 -N, N', N'- 트리 아세테이트 (N-(2-hydroxyethyl)-ethylidenediamine-N,N’,N’-triacetate, HEDTA), 디에탄올글리신 (diethanolglycine, DEG), 디에틸렌트리아민 펜타(메틸렌 포스폰산) (diethylenetriamine penta(methylenephosphonic acid), DTPMP), 아미노트리스(메틸렌포스폰산) (aminotris(methylenephosphonic acid) , ATMP), 및 이들의 조합과 염을 포함한다. 추가의 예시적인 빌더 및/또는 공동-빌더는 예를 들어 WO 09/102854, US 5977053에 기재되어 있다.
4. 표백 시스템 (Bleaching Systems)
세제는 0-50 중량 %, 예컨대 약 0.1 % 내지 약 25 %의 표백 시스템을 함유할 수 있다. 세탁 세제에 사용할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 표백 시스템이 사용될 수 있다. 적합한 표백 시스템 성분은 표백 촉매 (bleaching catalysts), 광 표백제 (photobleaches), 표백 활성화제 (bleach activators), 예컨대 과탄산나트륨 (percarbonate) 및 과붕산 나트륨 (sodium perborates)과 같은 과산화수소원 (sources of hydrogen peroxide) , 미리 형성된 과산(preformed peracids) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 적합한 미리 형성된 과산은 이에 한정되는 것은 아니나, 퍼옥시카르복시산 (peroxycarboxylic acids) 및 염, 퍼카르보닉산 (percarbonic acids) 및 염, 퍼이미드산 (perimidic acids) 및 염, 퍼옥시모노황산 (peroxymonosulfuric acids) 및 염, 예를 들어, 옥손 (Oxone, R) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 표백 시스템의 비제한적인 예는 과산화물계 표백 시스템 (peroxide-based bleaching systems)을 포함하며, 이는 과산-형성 표백 활성화제(peracid-forming bleach activator)와 함께, 예를 들어, 퍼보레이트의 나트륨염 (보통 모노- 또는 테트라-하이드레이트) (sodium salts of perborate (usually mono- or tetra-hydrate))과 같은 알칼리 금속염, 퍼카보네이트 (percarbonate), 퍼설페이트 (persulfate), 퍼포스페이트 (perphosphate), 퍼실리케이트 염 (persilicate salts)을 포함하는 무기염을 포함할 수 있다. 용어 표백 활성화제는 본원에서 과산화수소 (hydrogen peroxide)와 같은 과산소 표백제 (peroxygen bleach)와 반응하여 과산 (peracid)을 형성하는 화합물을 의미한다. 이와 같이 형성된 과산은 활성화된 표백제를 구성한다. 본원에서 사용되는 적합한 표백 활성화제는 에스테르 아미드 (esters amides), 이미드 (imides) 또는 무수물 (anhydrides)의 부류에 속하는 것들을 포함한다. 적합한 예는 테트라 아세틸 에틸렌 디아민 (tetracetylethylene diamine, TAED), 소듐 4-[(3,5,5-트리메틸헥사노일)옥시]벤젠 설포네이트 (sodium 4-[(3,5,5-trimethylhexanoyl)oxy]benzene sulfonate, ISONOBS), 디퍼옥시 도데칸산(diperoxy dodecanoic acid), 4-(도데카노일옥시)벤젠설포네이트 (4-(dodecanoyloxy)benzenesulfonate, LOBS), 4-(데카노일옥시)벤젠설포네이트 (4-(decanoyloxy)benzenesulfonate), 4-(데카노일옥시)벤조에이트 (4-(decanoyloxy)benzoate, DOBS), 4-(노나노일옥시)-벤젠설포네이트 (4-(nonanoyloxy)-benzenesulfonate, NOBS) 및/또는 WO98/17767에 개시된 것들이다. 관심있는 표백 활성화제의 특정 패밀리는 EP624154에 개시되어 있으며, 그 패밀리에서 특히 바람직하게는 아세틸 트리에틸 시트레이트 (acetyl triethyl citrate, ATC)이다. ATC 또는 트리아세틴과 같은 단쇄 트리글리세리드 (triglyceride)는 결국 시트르산 및 알코올로 분해되기 때문에 환경 친화적이라는 이점을 갖는다. 또한, 아세틸 트리에틸 시트레이트 (acetyl triethyl citrate) 및 트리아세틴 (triacetin)은 저장시 제품에서 우수한 가수 분해 안정성을 가지며, 효율적인 표백 활성화제이다. 마지막으로 ATC는 세탁 첨가제에 우수한 빌딩 능력 (building capacity)을 제공한다. 대안적으로, 표백 시스템은 예를 들어 아미드 (amide), 이미드 (imide) 또는 설폰 (sulfone) 유형의 퍼옥시산 (peroxyacid)을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한 과산, 예컨대 6-(프탈이미도)퍼옥시헥사노익산 (6-(phthalimido)peroxyhexanoic acid, PAP)을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한 표백 촉매를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 표백 성분은 다음 화학식을 갖는 유기 촉매로 구성된 군으로부터 선택되는 유기 촉매일 수 있다:
Figure 112019103880363-pct00001
(iii) 이들의 혼합물; 여기서 각 R1은 독립적으로 9 내지 24개의 탄소를 함유하는 분지형 알킬기 또는 11 내지 24개 탄소를 함유하는 선형 알킬기이고, 바람직하게는 각 R1은 독립적으로 9 내지 18개의 탄소를 함유하는 분지형 알킬기 또는 11 내지 18개 탄소를 함유하는 선형 알킬기이고, 보다 바람직하게는 각 R1은 독립적으로 2-프로필헵틸 (2-propylheptyl), 2-부틸옥틸 (2-butyloctyl), 2- 펜틸노닐 (2-pentylnonyl), 2-헥실데실 (2-hexyldecyl), n-도데실 (n-dodecyl), n- 테트라데실 (n-tetradecyl), n-헥사데실 (n-hexadecyl), n-옥타데실 (n-octadecyl), 이소-노닐 (iso-nonyl), 이소-데실 (iso-decyl), 이소-트리데실 (iso-tridecyl) 및 이소-펜타데실 (iso-pentadecyl)로 구성된 군에서 선택된다. 다른 예시적인 표백 시스템, 예를 들어 WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259 및 WO2007/087242에 기재되어 있다. 적합한 광표백제는 예를 들어 술폰화 아연 프탈로시아닌 (sulfonated zinc phthalocyanine) 일 수 있다.
5. 중합체 (Polymers)
세제는 0-10 중량 %, 예컨대 0.5-5 %, 2-5 %, 0.5-2 % 또는 0.2-1 %의 중합체를 함유할 수 있다. 세제에 사용하기 위해 당업계에 공지된 임의의 중합체가 사용될 수 있다. 상기 중합체는 상기 언급된 바와 같이, 공동-빌더로 기능할 수 있거나, 재침착 방지 (antiredeposition), 섬유 보호 (fiber protection), 오염 방출 (soil release), 염료 전이 억제 (dye transfer inhibition), 그리스 클리닝 (grease cleaning) 및/또는 거품 방지 특성 (anti-foaming properties)을 제공할 수 있다. 일부 중합체는 상기 언급된 특성 중 하나 이상 및/또는 하기 언급된 모티프 중 하나 이상을 가질 수 있다. 예시적인 중합체는 (카르복시메틸) 셀룰로오스 (carboxymethyl)cellulose, CMC), 폴리(비닐 알콜) (poly(vinyl alcohol), PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (poly(vinylpyrrolidone), PVP), 폴리(에틸렌글리콜) ((poly(ethyleneglycol)) 또는 폴리(에틸렌 옥사이드)(poly(ethylene oxide) (PEG), 에톡시화 폴리(에틸렌이민) (ethoxylated poly(ethyleneimine)), 카르복시 메틸 이눌린 (carboxymethyl inulin, CMI) 및 PAA, PAA/PMA와 같은 폴리카르복실 레이트 (polycarboxylates), 폴리-아스파르트산 (poly-aspartic acid) 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체 (lauryl methacrylate/acrylic acid copolymers), 소수성 개질된 CMC (hydrophobically modified CMC) (HM-CMC) 및 실리콘 (silicones), 테레프탈산 및 올리고머 글리콜의 공중합체 (copolymers of terephthalic acid and oligomeric glycols), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)및 폴리 (옥시에텐 테레프탈레이트)의 공중합체 (copolymers of poly(ethylene terephthalate) and poly(oxyethene terephthalate) (PET-POET), PVP, 폴리(비닐 이미다졸) (poly(vinylimidazole), PVI), 폴리(비닐피리딘-N-옥사이드) (poly(vinylpyridine-N-oxide)) (PVPO 또는 PVPNO) 및 폴리비닐피롤리돈-비닐이미 다졸 (polyvinylpyrrolidone-vinylimidazole, PVPVI)을 포함한다. 추가의 예시적인 중합체는 설폰화된 폴리카르복실레이트 (sulfonated polycarboxylates), 폴리에틸렌 옥사이드 (polyethylene oxide) 및 폴리프로필렌옥사이드 (polypropylene oxide) (PEO-PPO) 및 디쿼터늄 에톡시 설페이트(diquaternium ethoxy sulfate)를 포함한다. 다른 예시적인 중합체는 예를 들어 WO 2006/130575에 개시되어 있다. 상기 언급된 중합체의 염도 또한 고려된다.
6. 직물 착색제 (Fabric hueing agents)
본 발명의 세제 조성물은 또한, 세제 조성물로 제제화되어 직물이 상지 세제조성물을 포함하는 세척액과 접촉될 때 직물에 침착될 수 있고, 따라서 가시광성의 흡수/반사를 통해 상기 직물의 색조 (tint)를 변경시키는 염료 (dye) 또는 안료(pigment)와 같은 직물 착색제를 포함할 수 있다. 형광 미백제 (fluorescent whitening agents)는 최소한 일부 가시광선을 방출한다. 대조적으로, 직물 착색제는 가시광선 스펙트럼의 최소 일부를 흡수함에 따라 표면의 색조 (tint)를 변경시킨다. 적합한 직물 착색제는 염료 및 염료-점토 접합체 (dye-clay conjugates)를 포함하고, 또한 안료를 포함할 수 있다. 적합한 염료는 소분자 염료 및 중합체성 염료를 포함한다. 적합한 소분자 염료는 예를 들어 WO2005/03274, WO2005/03275, WO2005/03276 및 EP1876226에 기재된 바와 같이 (이는 본원에 참조로 포함됨), Direct Blue, Direct Red, Direct Violet, Acid Blue, Acid Red, Acid Violet, Basic Blue, Basic Violet 및 Basic Red의 색상 지수 (C.I.) 분류 (Colour Index classifications)에 해당하는 염료 또는 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 소분자 염료를 포함한다. 세제 조성물은 바람직하게는 약 0.00003 중량 % 내지 약 0.2 중량 %, 약 0.00008 중량 % 내지 약 0.05 중량 %, 또는 심지어 약 0.0001 중량 % 내지 약 0.04 중량 %의 직물 착색제를 포함한다. 상기 조성물은 0.0001 중량 % 내지 0.2 중량 %의 직물 착색제를 포함할 수 있으며, 이는 조성물이 단위 용량 파우치(unit dose pouch) 형태일 때 특히 바람직할 수 있다. 적합한 착색제는 또한 예를 들어 WO 2007/087257 및 WO2007/087243에 개시된다.
7. 보조 재료(Adjunct materials)
세탁 세제에 사용하기 위해 당업계에 공지된 임의의 세제 성분이 또한 사용될 수 있다. 다른 선택적 세제 성분으로는 부식 방지제 (anti-corrosion agents,), 수축 방지제 (anti-shrink agents), 오염 재침착 방지제 (anti-soil redeposition agents), 주름 방지제 (anti-wrinkling agents), 살균제 (bactericides), 바인더 (binders), 부식 저해제 (corrosion inhibitors), 붕해제 (disintegrants/disintegration agents), 염료(dyes), 효소 안정제 (enzyme stabilizers) (붕산, 붕산염, CMC 및/또는 프로필렌 글리콜 같은 폴리올 포함), 점토를 포함하는 직물 컨디셔너 (abric conditioners including clays), 충전제/가공 보조제 (fillers/processing aids), 형광 미백제/광학 증백제 (fluorescent whitening agents/optical brighteners), 폼 부스터 (foam boosters), 폼 (거품) 조절제 (foam (suds) regulators), 향수 (perfumes), 오염-현탁제 (soil-suspending agents), 연화제 (softeners), 비누 거품 억제제 (suds suppressors), 변색 억제제 (tarnish inhibitors), 및 위킹제 (wicking agents)를 단독으로 또는 조합으로 포함한다. 세탁 세제에 사용하기 위해 당업계에 공지된 임의의 성분이 사용될 수 있다. 이러한 성분의 선택은 당업자의 기술 범위 내에 있다.
분산제 (Dispersants): 본 발명의 세제 조성물은 또한 분산제를 함유할 수 있다. 특히 분말 세제는 분산제를 포함할 수 있다. 적합한 수용성 유기 물질은 호모-(homo-) 또는 코-(co) 폴리머 산 (polymeric acid) 또는 이들의 염을 포함하고, 여기서 폴리카르복실산은 2개 이하의 탄소 원자에 의해 서로 분리된 최소 2개의 카르복실 라디칼을 포함한다. 적합한 분산제는 예를 들어 Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.에 기재되어 있다.
염료 전이 억제제 (Dye Transfer Inhibiting Agents): 본 발명의 세제 조성물은 또한 하나 이상의 염료 전이 억제제를 포함할 수 있다. 적합한 중합체성 염료 전이 억제제는 폴리비닐피롤리돈 중합체 (polyvinylpyrrolidone polymers), 폴리아민 N- 옥사이드 중합체 (polyamine N-oxide polymers), N-비닐피롤리돈과 N-비닐이 미다졸의 공중합체 (copolymers of N-vinylpyrrolidone and N-vinylimidazole), 폴리비닐옥사졸리돈 (polyvinyloxazolidones) 및 폴리비닐이미다졸(polyvinylimidazoles) 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 조성물에 존재할 때, 염료 전이 억제제는 조성물의 약 0.0001 중량 % 내지 약 10 중량 %, 약 0.01 중량 % 내지 약 5 중량 % 또는 심지어 약 0.1 중량 % 내지 약 3 중량 %의 수준으로 존재할 수 있다.
형광 미백제 (Fluorescent whitening agent): 본 발명의 세제 조성물은 바람직하게는 형광 미백제 또는 광학 증백제(optical brighteners)와 같이 세정될 물질을 착색 (tint)시킬 수 있는 추가 성분을 함유할 것이다. 증백제가 존재하는 경우, 바람직하게는 약 0.01 % 내지 약 0.5 %의 수준이다. 세탁 세제 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 형광 미백제가 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 가장 일반적으로 사용될 수 있는 형광 미백제는 디아미노스틸벤-설폰산 유도체 (diaminostilbene-sulphonic acid derivatives), 디아릴 피라졸린 유도체 (diarylpyrazoline derivatives) 및 비스페닐-디스티릴 유도체 (bisphenyl-distyryl derivatives)의 분류에 속하는 것들이다. 형광 미백제의 디아미노스틸벤-설폰산 유도체 유형의 예는 다음의 나트륨 염을 포함한다 : 4,4'- 비스-(2-디에탄올아미노-4-아닐리노-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2,2'-디설폰산염 (4,4'-bis-(2-diethanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ylamino)stilbene-2,2'-disulphonate); 4,4'-비스-(2,4-디아닐리노-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2.2'-디설포네이트 (4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ylamino) stilbene-2.2'-disulphonate); 4,4'-비스-(2-아닐리노-4(N-메틸-N-2-하이드록시-에틸아미노)-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2,2'-디설포네이트 (4,4'-bis-(2-anilino-4(N-methyl-N-2-hydroxy-ethylamino)-s-triazin-6-ylamino) stilbene-2,2'-disulphonate), 4,4'-비스-(4-페닐-2,1,3-트리아졸 -2-일)스틸벤-2,2'-디설포네이트 (4,4'-bis-(4-phenyl-2,1,3-triazol-2-yl)stilbene-2,2'-disulphonate); 4,4'-비스-(2-아닐리노-4(1-메틸-2-하이드록시-에틸아미노)-s-트리아진-6-일 아미노)스틸벤-2,2'-디설포네이트 (4,4'-bis-(2-anilino-4(1-methyl-2-hydroxy-ethylamino)-s-triazin-6-ylamino) stilbene-2,2'-disulphonate) 및 2-(스틸빌-4"-나프토-1.,2':4,5)-1,2,3-트리졸 -2"-설포네이트 (2-(stilbyl-4"-naptho-1.,2':4,5)-1,2,3-trizole-2"-sulphonate). 바람직한 형광 미백제는 스위스 바젤의 Ciba-Geigy AG로부터 입수 가능한 Tinopal DMS 및 Tinopal CBS이다. Tinopal DMS는 4,4'-비스-(2-모르폴리노-4 아닐리노-s-트리아진-6-일아미노) 스틸벤 디설포네이트 (4,4'-bis-(2-morpholino-4 anilino-s-triazin-6-ylamino) stilbene disulphonate)의 이나트륨 염 (disodium salt) 이다. Tinopal CBS는 2,2'-비스-(페닐-스티릴) 디설포네이트 (2,2'-bis-(phenyl-styryl) disulphonate)의 이나트륨 염 (disodium salt) 이다. 형광 미백제로는 또한 인도 뭄바이의 Paramount Minerals and Chemicals에 의해 공급되는 시판되는 Parawhite KX가 바람직하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 형광제 (fluorescers)는 1-3-디아릴 피라졸린 (1-3-diaryl pyrazolines) 및 7-알킬아미노쿠마린 (7-alkylaminocoumarins)을 포함한다. 적합한 형광 미백제 수준은 약 0.01, 0.05, 약 0.1 또는 심지어 약 0.2 wt% 의 낮은 수준 내지 0.5 또는 심지어 0.75 wt %의 높은 수준을 포함한다.
오염 방출 중합체 (Soil release polymers) : 본 발명의 세제 조성물은 또한 면 (cotton) 및 폴리에스테르계 직물과 같은 직물로부터 오염의 제거, 특히 폴리 에스테르계 직물로부터 소수성 오염의 제거를 돕는 하나 이상의 토양 방출 중합체를 포함할 수 있다. 오염 방출 중합체는 예를 들어 비이온성 또는 음이온성 테레프탈레이트계 중합체 (terephthalte based polymers), 폴리비닐 카프로락탐 (polyvinyl caprolactam) 및 관련 공중합체, 비닐 그래프트 공중합체 (vinyl graft copolymers), 폴리에스테르 폴리아미드 (polyester polyamides )일 수 있다. Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc의 챕터 7을 참조하라. 다른 유형의 오염 방출 중합체는 코어 구조 및 상기 코어 구조에 부착된 복수의 알콕시레이트기 (alkoxylate groups)를 포함하는 친양쪽성 알콕시화된 그리스 클리닝 중합체 (amphiphilic alkoxylated grease cleaning polymers)이다. 코어 구조는 WO 2009/087523 (본원에 참조로 포함됨)에 상세하게 기술된 바와 같은 폴리알킬렌이민 (polyalkylenimine) 구조 또는 폴리 알칸올아민 (polyalkanolamine) 구조를 포함할 수 있다. 또한, 무작위의(random) 그래프트 공중합체가 오염 방출 중합체로 적합하다. 적합한 그래프트 공중합체는 WO 2007/138054, WO 2006/108856 및 WO 2006/113314 (본원에 참조로 포함됨)에 보다 상세하게 기재되어 있다. 다른 토양 방출 중합체는 치환된 다당류 구조, 특히 치환된 셀룰로오스 구조, 예컨대 EP 1867808 또는 WO 2003/040279 (둘 다 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것과 같은 변형된 셀룰로오스 유도체이다. 적합한 셀룰로오스 중합체는 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르, 셀룰로오스 아미드 및 이들의 혼합물을 포함한다. 적합한 셀룰로오스 중합체는 음이온 변형 셀룰로오스 (anionically modified cellulose), 비이온 변형 셀룰로오스 (nonionically modified cellulose), 양이온 변형 셀룰로오스 (cationically modified cellulose), 양쪽성 이온 변형 셀룰로오스 (zwitterionically modified cellulose) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 적합한 셀룰로오스 중합체는 메틸 셀룰로오스, 카르복시 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 하이드록실 에틸 셀룰로오스, 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로오스, 에스테르 카르복시 메틸 셀룰로오스 및 이들의 혼합물을 포함한다.
재침착 방지제 (Anti-redeposition agents) : 본 발명의 세제 조성물은 또한 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리비닐 피롤리돈 (PVP), 폴리옥시에틸렌 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아크릴산의 단독 중합체, 아크릴산과 말레산의 공중합체 및 에톡실화된 폴리에틸렌이민과 같은 하나 이상의 재침착 방지제를 포함할 수 있다. 상기 오염 방출 중합체로 기재된 셀룰로오스계 중합체는 또한 재침착 방지제로서 기능할 수 있다.
다른 적합한 보조 물질 (adjunct material)은 수축 방지제 (anti-shrink agents), 주름 방지제 (anti-wrinkling agents), 살균제 (bactericides), 결합제 (binder), 담체 (carriers), 염료 (dye), 효소 안정제 (enzyme stabilizers), 섬유 유연제 (fabric softeners), 충전제 (fillers), 거품 조절제 (foam regulators), 하이드로트로프 (hydrotropes), 향수 (perfumes), 안료 (pigments), 거품 억제제 (sod suppressors), 용매 (solvents) 및 액체 세제용 구조화제 (structurants for liquid detergents) 및/또는 구조 탄성화제 (structure elasticizing agents)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 상기 세제 조성물은 바 (bar), 균질 정제(homogenous tablet), 둘 이상의 층을 갖는 정제 (a tablet having two or more layers), 하나 이상의 구획을 갖는 파우치 (a pouch having one or more compartments), 일반 또는 컴팩트 분말 (regular or compact powder), 과립 (granule), 페이스트 (paste), 겔 (gel) 또는 일반, 컴팩트 또는 농축액 (regular, compact or concentrated liquid)의 형태이다. 일 양태에서, 상기 세제 조성물은 세탁 세제 조성물, 바람직하게는 액체 또는 고체 세탁 세제 조성물 일 수 있다. 층 (동일 또는 상이한 상), 파우치, 및 기계 투여 유닛을 위한 형태와 같은 다수의 세제 제형 형태 (detergent formulation forms)가 있다.
파우치는 단일 또는 다중 구획으로 구성될 수 있다. 예를 들어 물에 접촉하기 전에 파우치로부터 조성물의 방출을 허용하지 않고 조성물을 보유 (hold)하기에 적합한 임의의 형태 (form), 형상 (shape) 및 물질 (material)일 수 있다. 파우치는 내부 공간 (inner volume)을 둘러싸는 수용성 필름으로 만들어진다. 상기 내부 공간은 파우치의 구획으로 나누어질 수 있다. 바람직한 필름은 중합물 (polymeric material), 바람직하게는 필름 또는 시트로 형성된 중합체이다. 바람직한 중합체, 공중합체 또는 이의 유도체는 선택된 폴리아크릴레이트 (polyacrylates), 및 수용성 아크릴레이트 공중합체 (water soluble acrylate copolymers), 메틸 셀룰로오스 (methyl cellulose), 카르복시 메틸 셀룰로오스 (carboxy methyl cellulose), 소듐 덱스트린 (sodium dextrin), 에틸 셀룰로오스 (ethyl cellulose), 하이드록시에틸 셀룰로오스 (hydroxyethyl cellulose), 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 (hydroxypropyl methyl cellulose), 말토 덱스트린 (malto dextrin), 폴리 메타크릴레이트 (poly methacrylates)이고, 가장 바람직하게는 폴리비닐 알콜 공중합체 (polyvinyl alcohol copolymers) 및 하이드록시프릴 메틸 셀룰로오스 (hydroxyprpyl methyl cellulose, HPMC)이다. 바람직하게는 필름에서 중합체의 수준은, 예를 들어 PVA는 최소 약 60 % 이다. 바람직한 평균 분자량은 전형적으로 약 20,000 내지 약 150,000 일 것이다. 필름은 또한, 폴리락타이드 (polyactide) 및 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol) (Chris Craft In. Prod. Of Gary, Ind., US에 의해 판매되는 M8630 상표명으로 알려짐) 플러스 글리세롤, 에틸렌 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 및 이들의 혼합물과 같은 가소제(plasticisers)와 같이, 가수 분해성 (hydrolytically degradable) 및 수용성 중합체 블렌드 (water soluble polymer blends)를 포함하는 블렌드 조성물일 수 있다. 파우치는 수용성 필름으로 분리된 고형 세탁 세제 조성물 또는 부속 성분 (part components) 및/또는 액체 세정 조성물 또는 부속 성분 (part components)을 포함할 수 있다. 액체 성분을 위한 구획은 고체를 함유하는 구획과 조성이 상이할 수 있다. 참조:(US2009/0011970 A1).
세제 성분은 물에 녹을 수 있는 파우치 또는 다른 층의 정제에서 구획에 의해 서로 물리적으로 분리될 수 있다. 이에 의해 성분 사이의 저장 중의 부정적 상호작용을 피할 수 있다. 각 구획의 상이한 용해 프로파일은 또한 세척 용액에서 선택된 성분의 용해를 지연시킬 수 있다.
단위로 투여되지 않는, 액체 또는 겔 세제는, 전형적으로 최소 20 중량 % 및 95 % 이하의 물, 예를 들어 약 70 % 이하의 물, 약 65 % 이하의 물, 약 55 % 이하의 물, 약 45 % 이하의 물, 약 35 % 이하의 물을 함유하는 수성일 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 알칸 올, 아민, 디올, 에테르 및 폴리올을 포함하는 다른 유형의 액체가 수성 액체 또는 겔에 포함될 수 있다. 수성 액체 또는 겔 세제는 0-30 % 유기 용매를 함유할 수 있다. 액체 또는 겔 세제는 비수성 (non-aqueous)일 수 있다.
본 발명의 세제 조성물은 세탁 비누 바 형태로 제공될 수 있고, 손세탁용 세탁물, 섬유 (fabrics) 및/또는 직물 (textiles)을 위해 사용될 수 있다. 세탁 비누 바라는 용어는 세탁 바(laundry bar), 비누 바(soap bar), 콤보 바(combo bar), 신디트 바(syndet bar) 및 세제 바(detergent bar)를 포함한다. 바의 유형은 일반적으로 이들이 함유하는 계면 활성제의 유형에서 상이하며, 세탁 비누 바라는 용어는 지방산으로부터 비누를 함유하는 것들 및/또는 합성 비누를 포함한다. 세탁 비누 바는 실온에서 액체, 겔 또는 분말이 아닌 고형물의 물리적 형태를 갖는다. 고형물이라는 용어는 시간이 지남에 따라 물리적 형태가 현저히 변화지 않는 것으로 정의되며, 즉, 만약 고형물 (예: 세탁 비누 바)이 용기 (container) 내부에 비치된 경우, 고형물은 그 고형물이 들어 있는 용기를 채우기 위하여 변형되지 않는다. 상기 바는 전형적으로 바 형태의 고체이지만 원형 또는 타원형과 같은 다른 고체 모양일 수 있다.
세탁 비누 바는 하나 이상의 추가적인 효소, 펩타이드 알데하이드 (eptide aldehydes) (또는 하이드로설파이트 부가물 (hydrosulfite adduct) 또는 헤미아세탈 부가물(hemiacetal adduct))과 같은 프로테아제 억제제, 붕산(boric acid), 붕산염 (borate), 붕사 (borax) 및/또는 4-포밀페닐보론산 (4-formylphenylboronic acid) 과 같은 페닐 보론산 유도체 (phenylboronic acid derivatives), 하나 이상의 비누 또는 합성 계면활성제, 글리세린과 같은 폴리올, 지방산과 같은 pH 조절 화합물, 시트르산, 아세트산 및/또는 포름산 및/또는 1가 양이온의 염(salt of a monovalent cation) 및 유기 음이온(organic anion)을 함유할 수 있고, 상기 1가 양이온의 염은 예를 들어 Na+, K+ 또는 NH4+일 수 있고, 유기 음이온은 예를 들어, 포르메이트(formate), 아세테이트(acetate), 시트레이트(citrate), 락테이트(lactate) 일 수 있으며, 1가 양이온 및 유기 음이온의 염은 예를 들어 소듐 포르메이트 (sodium formate)일 수 있다.
세탁 비누 바는 EDTA와 HEDP 같은 착화제 (complexing agents), 방향제 (perfumes) 및/또는 다른 유형의 충전제 (fillers), 계면활성제(예: 음이온 합성 계면활성제), 빌더 (builders), 중합체성 오염 방출제 (polymeric soil release agents), 세제 킬레이터 (detergent chelators), 안정화제 (stabilizing agents), 충전제 (fillers)), 염료 (dyes), 착색제 (colorants), 염료 전달 억제제 (dye transfer inhibitors), 알콕시화 폴리 카보네이트 (alkoxylated polycarbonates), 비누 거품 억제제(suds suppressers), 구조화제 (structurants), 결합제 (binders), 침출제 (leaching agents), 표백 활성화제(bleaching activators), 점토 오염 제거제(clay soil removal agents), 재침착 방지제 (anti-redeposition agents), 중합체 분산제 (polymeric dispersing agents), 광택제 (brighteners), 섬유 유연제 (fabric softeners), 향료 (perfumes) 및/또는 당업계에 공지된 다른 화합물을 포함할 수 있다.
세탁 비누 바는 이에 한정되는 것은 아니나, 믹서 (mixer), 플로더 (plodder) (예를 들어, 2단 진공 플로더), 압출기 (extruder), 커터 (cutter), 로고 스탬퍼 (logo stamper), 냉각 터널 (cooling tunnerl) 및 랩퍼 (wrapper)와 같은 통상적인 세탁 비누바 제조 장치에서 처리될 수 있다. 본 발명은 임의의 단일 방법에 의해 세탁 비누 바를 제조하는 것으로 제한되지 않는다. 본 발명의 프리믹스는 공정의 상이한 단계에서 비누에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 비누, 효소, 선택적으로 하나 이상의 추가 효소, 프로테아제 억제제 및, 1가 양이온 및 유기 음이온의 염을 함유하는 프리믹스를 제조할 수 있고, 상기 혼합물은 이후 플로드 될 ㅅ수 있다. 효소 및 선택적인 임의의 효소는 예를 들어 액체 형태로 프로테아제 억제제와 동시에 첨가될 수 있다. 혼합 단계 및 플로딩 (plodding) 단계 외에, 밀링 (milling), 압출 (extruding), 절단 (cutting), 스탬핑 (stamping), 냉각 (cooling) 및/또는 랩핑 (wrapping) 단계가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한, 예컨대, 만난을 분해하고 세탁 공정에 사용하기 위한 것과 같이, 본원에 개시된 세제 조성물의 상이한 용도들에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 세제 조성물을 표면에 접촉시키는 단계를 포함하는, 표면으로부터 얼룩을 제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 세제 조성물을 만난에 적용하는 단계를 포함하는 만난 분해 방법에 관한 것으로, 바람직하게 상기 만난은 직물 표면에 있다. 직물 또는 섬유 (fabric)에 부착된 만난을 분해함으로써, 만난에 결합된 먼지 또는 오염이 방출되고 만난 또는 만난 얼룩 (stain)에 다시 결합할 수 없게 된다.
일 양태에서, 본 발명의 세제 조성물에 포함된 만나나아제는 45 ℃ 내지 65 ℃의 온도 범위에서 최소 30 %의 상대 활성을 갖는다. 위와 같은 주위 온도 및 산성 pH에서 활성을 유지하는 만나나아제의 제공은 이와 같은 조건에서 만난 분해가 요구될 때 적용하는 것이 유리하다.
일 양태에서, 본 발명의 세제 조성물에 포함된 만나나아제는 엔도-베타 -1,4- 만노시드 결합(endo-beta-1,4-mannosidic linkages)을 무작위로 가수 분해한다.
일 양태에서, 본 발명의 세제 조성물에 포함된 만나나아제는 박테리아 공급원으로부터 수득 가능하거나 유도 가능하다.
일 양태에서, 본 발명의 세제 조성물에 포함된 만나나아제는 최소 하나의 추가 폴리펩타이드와 융합되어 융합 폴리펩타이드를 형성한다. 상기 융합 폴리펩타이드 또는 추가의 폴리펩타이드는 만나나아제의 것에 추가하여 다른 촉매적 또는 결합 활성을 가질 수 있다. 일 양태에서, 상기 추가의 폴리펩타이드는, 선택적으로 만나나아제와 동일하거나 상이한 유기체로부터 유래된 다른 단백질 또는 효소의 단편인 탄수화물 결합 모듈로 구성되거나 이를 포함한다. 만나나아제는 링커로 추가 폴리펩타이드에 연결될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 다양한 관점을 예시하기 위해 제공된다. 이들은 본 발명을 한정하기 위한 의도가 아니고, 본 발명은 기재된 청구항에 의해 정의된다.
실시예 1: 스크리닝
신규한 베타-1,4-만나나아제 (beta-1,4-mannanases)를 동정하기 위하여 공공의 데이타베이스(NCBI, EBI) 및 선별된 전매 및 공개 게놈 (propriety and public genomes)을 스크리닝하였다. 이 작업에 사용된 모든 전매 및 공개 게놈은 표 1에 나타내었다. 모든 히트(hits)를 그룹화하고 상호 간의 계통 발생 거리에 기초하여 바실러스에 클로닝하기 위하여 최종적으로 15개의 박테리아 유래 유전자를 선별하였다 (표 2).
beta-1,4-mannanases 스크리닝에 사용된 전매 및 공개 게놈 리스트
종 균주 공급원
Bacillus pumilus MS8 ABE
Amphibacillus xylanus NBRC 15112 NCBI
Bacillus hemicellulosilyticus JCM 9152 NCBI
Bacillus clausii KSM-K16 NCBI
Bacillus amyloliquefaciens RH1330 ABE
Virigibacillus soli PL205 NCBI
Bacillus에 클로닝을 위해 선별된 유전자 리스트
서열 lD 종 GH 패밀리 길이
orf2511 Bacillus amyloliquefaciens 26 360 aa
AXY_08250 Amphibacillus xylanus 5 497 aa
Man7 Bacillus hemicellulosilyticus 5 490 aa
T1Z249.2 Bacillus nealsonii 5 369 aa
Man6 Bacillus clausii 5 324 aa
Q9EYQ3 Clostridium cellulolyticum 5 424 aa
YdhT Bacillus cellulosilyticus 26 1183 aa
V5X1N9 Paenibacillus polymyxa 5 588 aa
Q9Z187 Geobacillus stearothermophilus 5 694 aa
Q49HI4 Bacillus circulans 5 327 aa
orf0659 Bacillus pumilus 5 376 aa
JCM9152_1090 Bacillus hemicellulosilyticus 26 489 aa
D3HC62 Streptococcus gallolyticus 5 487 aa
AOLSH9 Acidothermus cellulolyticus 5 763 aa
Man14 Virgibacillus soli 5 482 aa
실시예2 : 바실러스로 박테리아 만나나아제의 클로닝
달리 언급되지 않는 한, DNA 조작 및 형질전환을 포함하는 분자 생물학적 방법은 Sambrook and Russell(2001) 및 Harwood and Cutting(1990)에 기재된 방법에 따라 수행되었다. 유전자 man6, man7 및 man14는 Pfx Accu Prime Polymerase(Invitrogen)을 사용하여 PCR로 증폭되었다. PCR은 제조자의 지침에 따라 수행되었다. 하기 PCR 조건이 발현 플라스미드의 구축에 사용되었다: 94℃에서 120초간 초기 변성, 이어서 35 사이클의 94℃에서 15초, 50/55℃ 중 어느 하나의 온도에서의 30초간 어닐링, 68℃에서의 110/290 초간의 연장, 이후 최종 68℃에서 10분간의 연장. man7의 증폭을 위해 Bacillus hemicellulosilyticus JCM 9152의 게놈 DNA가 사용되었고, man6 및 man14는 코돈 최적화 없이 합성 유전자를 주문하였다 (Eurofins MWG, Germany). 클로닝에 사용된 프라이머 서열은 표 3에 나타내었다. 혼성화를 위한 오버행은 밑줄로 나타내었다.
man6(발명), man7(참조) 및 man14(참조) 증폭을 위해 사용된 프라이머 리스트
주형 프라이머 bp 서열 서열번호
syn. gene man6 Man6_1 39 CAACCGCCTCTGCAGCTTATGCACAAAACGGATTTCACG 1
syn. gene man6 Man6_2 39 CGGTATATCTCTGTCTTAATCACTCTTAAGCCCA TTTTC 2
gDNAB. hemicellulosilyticus Man7_1 37 CAACCGCCTCTGCAGCTTCTGATGGTCATAGCCAAAC 3
gDNAB. hemicellulosilyticus Man7_2 36 CGGTATATCTCTGTCTTATTGGATTGTTACATGATC 4
syn. Gene man14 Man14_1 40 CAACCGCCTCTGCAGCTGCAAGCGGGTTTTATGTAAACGG 5
syn. Gene man14 Man14_2 39 CGGTATATCTCTGTCTTATTTAATGGTAACGTTATCAAC 6
pUB110 derivate Vec_1 17 AGCTGCAGAGGCGGTTG 7
pUB110 derivate Vec_2 21 GACAGAGATATACCGACAGTG 8
유전자들은 표준 벡터 pEV1(도 1), Bacillus licheniformis 유래 PaprE 프로모터와 Bacillus amyloliquefaciens 유래 xylanase 시그널 펩타이드를 포함하는 pUB110 유도체에 NEBuilder®Hifi DNA Assembly Master Mix (NEB, Frankfurt)를 사용하여 클로닝되었다. 클로닝을 위해 사용된 벡터:인서트 비율은 1:3을 적용하였다. 20ul 총 부피에서 단편 (fragments)의 총량은 0.2pmol이었다. 시료는 50℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 구축 목적으로, 발현 플라스미드는 Bacillus subtilis SCK6에 컴피턴스 유도하여 Zhang&Zhang 2011에 기재된 방식에 따라 형질전환하였다. 형질전환된 세포는 10mg/l의 카나마이신이 첨가된 LB(Luria-Bertani) 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 20분간 배양하였다. 콜로니가 발생하면 이를 수집하여 QiaPrep MiniPrep Kit(Qiagen, Hilden)을 사용하여 플라스미드를 분리하였다. 분리 과정은 그람 양성 플라스미드 준비를 위한 제조자가 추천하는 방식에 따라 진행하였다. 인서트는 Sanger sequencing (GATC, Germany)를 이용하여 시퀀싱하였고, 만나나아제 Man6, Man7 및 Man14의 성숙된 형태에 상응하는 DNA 서열임을 확인하였다. 서열 비교는 ClustalW sequence alignment(Thompson et al 1994)를 사용하여 진행되었다. 마지막으로, 발현 플라스미드를 적당한 Bacillus 생산 균주로 전기천공법을 통해 형질전환하였다. Bacillus 생산 균주는 20g/l 트립톤, 10g/l 효모 추출물, 10g NaCl 및 2M 사카로오즈를 포함하는 전기천공 배지에서 생장시키고, OD(600nm)가 0.4일 때 10ml을 수확하였다. 세포를 0.272M 사카로오즈, 1mM MgCl2, 7mM KH2PO4를 함유하는 전기천공 버퍼로 세척하고 250ul 전기천공 버퍼에 재현탁하였다. 전기천공은 하기 조건에서 수행되었다: 1.2 kV, 150Ω, 50uF. 이후 1ml의 전기천공 배지를 첨가하고 세포를 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 세포를 20mg/l 카나마이신으로 보충된 LB 플레이트에 플레이팅하고 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 클론을 상기 방법으로 확인하고 분석 시험을 위한 재료를 제조하는데 사용하였다. 따라서, 균주는 단백질 유도 조건 하의 표준 발현으로 접종하고, 37℃에서 30시간 배양하였다. 상청액을 수득하고 분석 및 적용 시험에 사용하였다. 유전자와 효소의 특성은 표 4 및 표 5에 나타내었다.
Bacillus clausii KSMK16, Bacillus hemicellulosilyticus JCM 9152 및 Virgibacillus soli PL205로부터의 GH5 패밀리 만나나아제 인코딩 유전자에 대한 요약
유전자 SP 포함 길이 (bp) 서열번호
man6 975 9
man7 1473 13
man14 1449 17
Bacillus clausii KSMK16, Bacillus hemicellulosilyticus JCM 9152 및 Virgibacillus soli PL205로부터의 GH5 패밀리 만나나아제 인코딩 유전자로부터 추론된 아미노산 서열에 대한 요약
Man 단백질 아미노산 수 SS 길이 CBM 예상되는 MW(Da)
SS 불포함		 예상되는 pI
SS 불포함		 서열번호
Man6 324 35 31.84 4.56 11
Man7 490 21 Yes 51.36 4.81 15
Man14 482 16 Yes 50.68 4.35 19
실시예 3: Trichoderma reesei에 박테리아 만나나아제 man6(발명) 및 man7(참조)의 PCR-클로닝
표준 분자 생물학적 방법이 DNA 분리 및 효소 처리(예를 들어, 플라스미드 DNA의 분리, DNA 절편을 생산하기 위한 DNA의 절단 (digestion)), E. coli 형질전환, 시퀀싱 등에 사용되었다. 사용된 기초적인 방법은 효소, 시약, 키트 제조자에 의해 기재되어 있거나 표적 분자 생물학 핸드북, 예를 들어, Sambrook and Russell (2001)에 기재되어 있다. 게놈 DNA의 분리는 Raeder and Broda (1985)에 상세히 기재된 방법에 따라 수행하였다.
Bacillus clausii 및 Bacillus hemicellulosilyticus로부터 Man6와 Man7이 각각 Trichoderma reesei에서의 발현을 위해 클로닝되었다. 유전자는 Trichoderma reesei에 코돈 최적화된 합성 유전자를 사용하여 PCR-클로닝하였다. man6 및 man7의 시그널 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열은 PCR을 사용하여 제거하고, 새로운 클로닝 사이트를 만들었다. 프라이머의 서열은 표 6에 나타내었다 (서열번호 21-24).
Bacillus hemicellulosilyticus 및 Bacillus clausii 만나나아제 유전자를 증폭하기 위한 PCR 프로이머로 사용된 올리고뉴클레오티드
주형,
합성 DNA (from)		 올리고뉴클로에오티드 길이
(bp)		 서열a ) 서열번호
Bacillus hemicellulosilyticus BMAN1 60 5'-AGTCAATCGCGACAAGCGCCAGACCCACTCGGGCTTCTAC
A TCGAGGGCTCGACGCTCTA-3' (s)		 21
Bacillus hemicellulosilyticus BMAN2 46 5'-CGCGCCGGATCCTTACTGGATCGTGACGTGGTCCAGGTAGATGGCG-3' (as) 22
Bacillus clausii BMAN3 60 5'-AGTCAATCGCGACAAGCGCCAGAACGGCTTCCACGTCTCC
GGCACGGAGCTCCTGGACAA-3' (s)		 23
Bacillus clausii BMAN4 50 5'CGCGCCGGATCCTTAGTCGCTCTTCAGGCCGTTCTCGCCGTAGACGATGCG-3' (as) 24
a) 괄호 안 "s"는 센스 가닥, "as"는 안티센스 가닥
유전자는 표 6에 기재된 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였고 합성 DNA를 반응에서 주형으로 사용하였다. Bacillus c/ ausii man6 및 Bacillus hemicellulosilyticus man7의 PCR 반응 혼합물은 각각 Phusion HF Polymerase (NEB/BioNordika, 핀란드)를 위한 1x HF 버퍼, 0.2 mM dNTP 믹스 (Thermo Fisher Scientific, 핀란드), 1 uM의 각 프라이머, 3% DMSO (Thermo Fisher Scientific), 1 유닛의 Phusion High-Fidelity Polymerase(NEB/BioNordika, 핀란드) 및 50 ng의 상응하는 플라스미드 DNA를 포함하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 98℃에서 30초간 초기 변성, 이어서 28 사이클의 98℃에서 10초, 45/50/55/60 ℃ 중 어느 하나의 온도에서의 30초간 어닐링, 72℃에서의 45초간의 연장, 이후 최종 72℃에서 7분간의 연장.
표 6에 기재된 프라이머 조합은 예상되는 크기를 갖는 특정 DAN 산물을 생산하였다. PCR 산물은 제조자 방식에 따라 GenJet Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 아가로오즈 겔에서 분리되었고, Nrul 및 BamHI 제한효소 (Thermo Fisher Scientific)로 잘라 Nrul 및 BamHI로 잘린 발현벡터에 클로닝하였다. 라이게이션 반응 혼합액을 Escherichia coli XL 1-Blue (AH Diagnostics)로 형질전환하고, 50-100 ug/ml 암피실린을 포함하는 LB (Luria-Bertani) 플레이트에 플레이팅 하였다. 몇 개의 E. coli 콜로니를 플레이트로부터 수집하고 DNA를 GenJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분리하였다. 양성 클론을 제한 효소로 스크리닝하였다. 그들 자체의 시그널 펩타이드를 인코딩하는 서열이 없는 Bacillus clausii man6 및 Bacillus hemicellulosilyticus man7 GH5 만나나아제를 인코딩하는 유전자가 시퀀싱되었고, 이를 각각 pALK4274 및 pALK4273으로 명명하였다 (상세하게는 실시예 6 참조).
실시예 4: 합성 박테리아 만나나아제 man14(참조)의 클로닝
표준 분자 생물학적 방법이 DNA 분리 및 효소 처리(예를 들어, 플라스미드 DNA의 분리, DNA 절편을 생산하기 위한 DNA의 절단), E. coli 형질전환, 시퀀싱 등에 사용되었다. 사용된 기초적인 방법은 효소, 시약, 키트 제조자에 의해 기재되어 있거나 표적 분자 생물학 핸드북, 예를 들어, Sambrook and Russell (2001)에 기재되어 있다. 게놈 DNA의 분리는 Raeder and Broda (1985)에 상세히 기재된 방법에 따라 수행하였다.
Virgibacillus soli로부터 만나나아제 유전자 man14가 Trichoderma 발현을 위해 클로닝되었다. Virgibacillus soli로부터 GH5 패밀리 만나나아제 Man14를 인코딩하는 유전자는 Trichoderma reesei에 코돈 최적화된 합성 컨스트럭트로 GenScript에 주문하였다.
man14 유전자를 포함하는 GenScript에서 얻은 플라스미드 DNA는 멸균수에 재현탁시키고, 제조자 지침에 따라 Nrul 및 BamHI 제한효소 (Thermo Fisher Scientific)로 절단하고 Nrul 및 BamHI 로 절단된 발현 벡터로 클로닝하였다. 라이게이션 반응 혼합액을 Escherichia coli XL 1-Blue (AH Diagnostics)로 형질전환하고, 50-100 ug/ml 암피실린을 포함하는 LB (Luria-Bertani) 플레이트에 플레이팅 하였다. 몇 개의 E. coli 콜로니를 플레이트로부터 수집하고 DNA를 GenJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분리하였다. 양성 클론을 제한 절단으로 스크리닝하였고, 이들은 예상되는 크기의 인서트를 포함하는 것으로 나타났다. 발현 플라스미드에 융합된 Virgibacillus soli man14의 부위를 시퀀싱하였고 이 플라스미드를 pALK4414로 명명하였다 (상세하게는 실시예 6 참조).
실시예 5: Bacillus 에서 재조합 박테리아 GH5 만나나아제 단백질의 생산
Bacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticus 및 Virgibacillus soli.로부터 재조합 GH5 만나나아제 (Man6(발명), Man7(참조) 및 Man14(참조)) 단백질을 생산하기 위한 발현 플라스미드가 구축되었다. 구축된 발현 플라스미드는 표 7에 나열하였다. 재조합 GH5 유전자 (man6, man7 및 man14)는, 이들 자체의 시그널 서열 없이, Bacillus licheniformis PaprE 프로모터 및 B. amyloliquefaciens xylanase 시그널 펩타이드에 융합되었다. 전사 종결은 강한 터미네이터에 의해 보장하였고, 카나마이신 저항성 마커를 형질전환체 선별에 사용하였다. 형질전환은 실시예 2에 기재된 방법으로 수행되었다.
Bacillus clausii , Bacillus hemicellulosilyticus 및 Virgibacillus soli로부터의 Man6, Man7 및 Man14 재조합 단백질을 적합한 Bacillus 발현 균주에서 생산하기 위해 구축된 발현 플라스미드
만나나아제 (GH5) 단백질 발현 플라스미드
Man6 pEV1 Man6
Man7 pEV1 Man7
Man14 pEV1 Man14
형질전환체의 GH5 생산은 플라스크를 이용한 진탕 배양액의 배양 상청액으로부터 분석되었다. 형질전환체는 LB 플레이트에서 2% glucose, 6% corn steep powder, 1,3 % (NH4)2HP04, 0,05% MgS04 x 7H20 및 0,5% CaCl2 를 함유하는 진탕용 플라스로크 접종하였다. pH는 pH 7.5로 조정하였다. 형질전환체의 GH5 단백질 생산은 37 ℃, 180 rpm에서 30시간 동안 형질전환체를 배양한 후 배양 상청액으로부터 분석하였다. 재조합 단백질의 이종 생산은 SDS-PAGE 및 이후 Coomassie 염색으로 분석하였다. 최상의 생산 형질전환체를 선택하여 실험실 규모의 바이오리액터에서 배양하였다. 형질전환체는 단백질 유도 조건 하의 37℃ 바이오리액터에서 배양하고, 적절한 생산량에 도달할 때까지 추가적으로 양분 공급 (feeding)하였다. 상청액은 적용 시험 (application test)을 위해 원심분리 또는 여과 (filtration)에 의해 회수되었다.
실시예 6: Trichoderma reesei 에서 재조합 박테리아 GH5 만나나아제 단백질의 생산
Bacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticus 및 Virgibacillus soli 유래 재조합 GH5 만나나아제 (Man6(발명), Man7(참조) 및 Man14(참조)) 생산을 위한 Trichoderma reesei에서의 발현 플라스미드가 구축되었다 (실시예 3 및 4 참조). 구축된 발현 플라스미드는 표 8에 나열하였다. 재조합 GH5 유전자 (man6, man7 및 man14)는, 이들 자체의 시그널 서열 없이, T. reesei cel6A/cbh2 CBM carrier 및 Kex2 protease 인식 부위가 뒤따르는 링커와 함께 T. reesei ceI7A/cbh1 프로모터에 융합되었다. 전사 종결은 T. reesei cel7A/cbh1 터미네이터에 의해 보장하였고, Paloheimo et al. (2003)에 기재된 바와 같이 A. nidulans amdS 마커 유전자를 형질전환체 선별에 사용하였다. 선형 발현 카세트 (도 2)를 NotI 절단 후에 벡터 백본으로부터 분리하였고 T. reesei 원형질체 (protoplast)로 형질전환하였다. 사용된 호스트 균주는 T. reesei의 4개의 주요 셀룰라아제 (CBHI, CBHII, EGI, EGII) 중 어느 것도 생산하지 않는다. 형질전환은 단독 질소원 (amdS 마커 유전자)으로 아세트아미다아제(acetamidase)를 선택하는 Karhunen et al. (1993)에 기재된 변형이 적용된 Penttila et al. (1987)에 따라 수행하였다. 형질전환체는 PD 상에서 포자로 번식시키기 (sporulating)에 앞서, 단일 분생자 (single conidia)를 통해 선별 플레이트 상에서 정제하였다.
Trichoderma reesei에서 Bacillus clausii , Bacillus hemicellulosilyticus 및 Virgibacillus soli로부터의 Man6, Man7 및 Man14 재조합 단백질을 생산하기 위하여 구추된 발현 카세트. 발현 카세트의 전체 구조는 도 2에 나타냄.
만나나아제 (GH5) 단백질 발현 플라스미드 발현 카세트 (a
Man6 pALK4274 7.0 kb Notl
Man7 pALK4273 7.5 kb Notl
Man14 pALK4414 7.6 kb Notl
(a T. reesei 형질전환을 위한 발현 카세트는 NotI 절단을 사용하여 벡터 백본으로부터 단리되었다.
형질전환체의 만나나아제 생산은 플라스크 진탕 배양의 배양 상청액으로부터 분석되었다. 형질전환체는 PD slants로부터 5% KH2P04로 완충된 50 ml의 복합 유당-기반 셀룰라아제 유도 배지 (complex lactose-based cellulase inducing medium)를 포함하는 진탕 배양용 플라스크에 접종하였다. 형질전환체의 GH5 단백질 생산은 30℃, 250 rpm에서 7일간 배양한 후 배양 상청액으로부터 분석하였다. 재조합 단백질의 이종 생산 (heterologous production)은 SDS-PAGE 및 이후의 Coomassie 염색으로 분석하였다. 최상의 생산 형질전환체를 선택하여 실험실 규모의 바이오리액터에서 배양하였다. 형질전환체는, 단백질 유도 조건하의 전형적인 중온성 진균 배양 온도 (typical mesophilic fungal cultivation temperature) 및 약산성 조건 (slightly acidic condition)에서 배치 (batch) 또는 추가 공급 유형의 공정 (additional feeding type of process)의 생물 반응기에서 배양되었다. 배양은 배지의 당이 고갈되거나 적당한 생산량에 도달할 때까지 계속되었다. 적용 시험 (application test)을 위해 원심분리 또는 여과에 의해 상청액을 회수하였다.
실시예 7: DNS-방법에 의한 갈락토만나나아제 활성 분석
만나나아제 활성 (MNU)을 pH 7.0, 50℃에서 5분간 갈락토만난(0.3 w/w-%)으로부터 환원당의 방출 (release)로 측정하였다. 방출된 환원 탄수화물의 양은 디니트로살리실산 (dinitrosalicylic acid)을 사용하여 분광광도계로 측정하였다. 분석에 사용된 기질 (0.3 w/w-%)은 다음과 같이 제조되었다 : 0.6g의 locust bean gum (Sigma G-0753)은 50mM 시트르산 나트륨 완충액 (sodium citrate buffer) pH 7 (또는 시트르산 인산염 완충액 (citrate phosphate buffer) pH 7) 에 가열 자석 교반기를 사용하여 약 80 ℃에서 넣어주고, 비등점 (boiling point)까지 가열하였다. 용액을 냉각시키고, 냉장실(2-8℃)에서 연속 교반하며 밤새 용해시키고 비용해성 잔류물은 원심분리로 제거하였다. 이후 완충액으로 용액을 200 ml로 채웠다. 기질은 냉동하여 보관하였고, 약 80 ℃까지 끓인 물의 열로 녹인 후, 실온으로 냉각시키고 사용 전 잘 혼합하였다. 분석에 사용할 DNS 시약은 약 4리터의 물에 50g의 3.5-dinitrosalisylic acid (Sigma D-550)을 용해시켜 제조하였다. 자석 교반하며 80.0 g의 NaOH를 조금씩 첨가하고 용해시켰다. 1500 g의 Rochelle Salt (K-Na-tartrate, Merck 8087)를 자석 교반하며 조금씩 첨가하였다. 최대 45 ℃까지 조심스럽게 데워진 용액을 실온으로 냉각시키고 5000 ml까지 채웠다. 이후 Whatman 1 필터 용지로 여과하고 실온에서 어두운 병에 보관하였다. 반응은 각각 2개의 테스트 튜브에 1.8 ml의 기질 용액을 첨가하여 시작하였고 50 ℃에서 5분간 평형화한 후, 200 ul의 적절히 희석된 효소액을 두 튜브 중 하나에 첨가하고, 볼텍스 믹서로 잘 혼합하고 50 ℃에서 정확히 5분간 반응하였다. 효소가 첨가되지 않은 튜브 (enzyme blank tube)는 평형화 또는 반응할 필요가 없었다. 반응은 두 튜브에 3.0 ml의 DNS 시약을 첨가하고 혼합하여 종결되었다. 200 ul의 시료 용액을 효소가 첨가되지 않은 튜브에 첨가하였다. 두 튜브를 온수조 (boiling water bath)에 넣고, 정확히 5분 가열 후 튜브를 냉각수조에 넣고 실온까지 냉각하였다. 540 nm에서 효소가 첨가되지 않은 튜브에 대한 시료의 흡광도 (absorbance)를 측정하여 활성을 교정 곡선으로부터 판독한 후 희석 계수를 곱하였다. 적절하게 희석된 샘플은 0.15-0.4의 흡광도 차이를 나타내었다. 표준 곡선은 분석 완충액에 360 mg의 만노오스 (SigmaM-6020, 건조기에 보관)를 용해시킨 만노오스 20 mM 농축액 (stock solution)을 제조하고, 3, 6, 10 및 14 umol/ml의 만노오스를 함유하는 용액으로 희석시켜 준비하였다. 표준물 (standards)은 50 ℃에서 반응을 제외하고 시료와 동일하게 핸들링하였다. 흡광도를 540 nm에서 시약 블랭크 (만노오스 표준 희석액 대신 완충액을 포함)에 대조하여 (against) 측정하였다. 보정 곡선을 모든 시리즈 분석에 대해 구축하였다. 1 만노오스 유닛 (MNU)은 반응 조건 하에서 1초 동안 갈락토만난으로부터 1 nmol의 만노오즈에 상응하는 환원력을 갖는 환원성 탄수화물 (reductive carbohydrate)을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다 (1 MNU = 1nkat).
실시예 8: Man6 만나나아제의 정제
세포와 고체를 발효 배양 배지로부터 4 ℃, 4000 g에서 10분간 원심분리하여 제거하였다. 상청액 10 ml을 단백질 정제에 사용하였다. 시료를 0.44 um PVDF membrane (Millex-HV, Merck Millipore Ud,Carrigtwohill, IRL)으로 여과하였다. 여과된 액체 (filtrate)를 pH 7의 20 mM HEPES로 평형화된 HiPrep 26/10 Desalting column (GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴)에 로딩하였다. 염이 제거된 시료를 이후 다시 pH 7의 20 mM HEPES로 미리 평형화시킨 5 ml HiTrap Q HP column (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)에 로딩하였다. 시료를 로딩하고, 컬럼을 동일한 완충액 20 ml로 세척하였다. 단백질을 15 CV의 500 mM NaCl을 포함하는 pH 7의 20 mM HEPES의 선형 염 구배 (linear salt gradient)로 용리하였다. 5 ml의 분획을 수집하고 SDS-PAGE로 분석하였다. 표적 단백질을 함유하는 분획을 합하여 Vivaspin 20, 10 kDa MWCO ultrafiltration devices (GE Healthcare)로 2 ml까지 농축하였다. 농축된 시료를 20 mM MES, 200 mM NaCl pH 6.5로 평형화된 Superdex 75 26/60 겔-여과 컬럼을 사용하여 추가로 분획하였다. 2ml의 분획을 수집하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 순수한 만나나아제를 함유하는 분획을 합하였다. 다른 만나나아제는 탈염 (desalting) 및 이온 교환 단계에서 완충액 조성만 변화시키고 동일한 방법으로 정제하였다. 완충액 조성은 표 9에 나타내었다.
이온 교환 크로마토그래피에 사용된 버퍼
만나나아제 이온 교환 크로마토그래피에 사용된 버퍼
Man6 20 mM HEPES pH 7
Man7 20 mM HEPES pH 7
Man14 20 mM MES pH 6
정제된 시료는 95% 순도 이상이었다.
정제된 시료의 효소 함량을 UV 흡광도 280 nm에서 측정하였다. 각 만나나아제에 대한 여기 계수(Excitation coefficients)는 ExPASy Server http://web.expasy.org/protparam/를 사용하여 효소의 아미노산 서열을 기반으로 계산하였다 (Gasteiger E et al 2005). 정제된 시료의 효소 활성 (MNU)는 실시예7에 기재된 바와 같이 환원당의 방출로 측정하였다. 만나나아제의 특이적 활성 (MNU/mg)은 정제된 시료의 MNU 활성을 정제된 효소의 양으로 나누어 계산하였다. 얻어진 값을 실시예 10 및 11에서 사용된 효소 용량 (enzyme dosages)을 계산하는데 사용하였다.
만나나아제의 pH 프로파일
정제된 만나나아제의 pH 프로파일은 제안된 프로토콜을 약간 수정하여 Megazyme의 beta-mannazyme tablet assay Azurine-crosslinked carob galactomannan (T-MNZ 11/ 14)를 사용하여 측정하였다. 분석의 선형성 (linearity)은 각 정제된 효소로 확인되었다. 분석은 4 내지 11의 pH 값으로 조정된 40 mM Britton-Robinson 완충액에서 수행되었다. 효소 용액을 분석 완충액에 희석하고, 500㎕의 효소 용액을 50℃ 수조에서 5분 동안 평형화한 후, 하나의 기질 정제 (one substrate tablet)를 첨가하였다. 10분 후, 10ml의 2% Tris pH 12를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 반응 튜브를 실온에서 5분간 방치한 후, 교반하고 Whatman No.1 종이 필터를 통해 액체를 여과하였다. 기질로부터 청색 염료의 방출을 595 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량화하였다. 각 pH에서 효소 활성은 최적 pH에서의 활성을 100%로 설정하고 상대적인 활성으로 기록하였다. pH 프로파일은 도 3에 나타내었다.
만나나아제의 상대적 활성(%)은 시료의 만나나아제 활성을 참조 시료 (reference sample)의 만나나아제 활성으로 나눔으로써 계산된다. pH 프로파일의 경우, 참조 시료는 최적 pH (optimal pH)의 시료이다. 온도 프로파일의 경우, 참조 시료는 최적 온도의 시료이다.
만나나아제의 온도 프로파일
정제된 만나나아제의 최적 온도는 제안된 프로토콜을 약간 수정하여 Megazyme의 beta-mannazyme tablet assay Azurine-crosslinked carob galactomannan (T-MNZ 1 1/14)를 사용하여 측정하였다. 분석은 pH 7의 40mM Britton-Robinson 완충액에서 30-90℃ 사이의 변화하는 온도 (varying temperature)에서 10분 동안 수행하였다. 효소 활성은 최적 온도에서의 활성을 100 %로 설정하고 상대적인 활성으로 기록하였다. 온도 프로파일은 도 4에 나타내었다.
만나나아제의 온도 및 pH 특성
Man6는 30-35kDa의 분자량 (molecular mass)을 갖는다. pH 7에서 상기 효소의 최적 온도는 50℃ 내지 70℃이다. 상기 효소는 50℃에서 최소 pH 6 내지 pH 9의 pH 범위에서 최적의 pH를 갖는다. 최적 온도 및 최적 pH는 기질로써 Azurine-crosslinked carob galactomannan을 사용하여 10분의 반응 시간 동안 측정하였다.
Man7은 50-55 kDa의 분자량을 갖는다. pH 7에서 상기 효소의 최적 온도는 50℃ 내지 70℃이다. 상기 효소는 50℃에서 최소 pH 7 내지 pH 10의 pH 범위에서 최적의 pH를 갖는다. 최적 온도 및 최적 pH는 기질로써 Azurine-crosslinked carob galactomannan을 사용하여 10분의 반응 시간 동안 측정하였다.
Man14는 30-40 kDa의 분자량을 갖는다. pH 7에서 상기 효소의 최적 온도는 50℃ 내지 70℃이다. 상기 효소는 50℃에서 적어도 pH 7 내지 pH 8의 pH 범위에서 최적의 pH를 갖는다. 최적 온도 및 최적 pH는 기질로써 Azurine-crosslinked carob galactomannan을 사용하여 10분의 반응 시간 동안 측정하였다.
실시예 9: 표백제 (bleaching agent) 없는 시판 중인 세제와 함께 사용한 Man6(발명) 및 Man7(참조) 만나나아제의 얼룩 제거 성능
Bacillus (실시예 5에 기술된 바와 같이) 및 Trichoderma (실시예 6에 기술된 바와 같이)에서 생산된 Man6 및 Man7 만나나아제는 표백제가 없는 시판 중인 세제로 16°dH의 물 경도 (water hardness) 및 40 ℃에서 만나나아제 민감성 표준 얼룩 (mannanase sensitive standard stains )을 제거하는 성능에 대해 시험하고, 이를 상업적인 만나나아제 제제인 Mannaway® 4,0 L (노보자임)과 비교하였다. Center for Testmaterial B.V. (네덜란드)로부터 인위적으로 오염된 다음 테스트 천 (artificially soiled test cloths)이 사용되었다: 면 위에 만나나아제 민감성 초콜릿 푸딩 (Chocolate pudding mannanase sensitive on cotton) (E-165), 면 (C-S-73)과 폴리에스테르/면 (PC-S-73) 위에 안료와 함께 로커스트 콩 검 (Locust bean gum, with pigment on cotton and on polyester/cotton), 면 위에 카본 블랙과 함께 구아검 (Guar gum with carbon black on cotton) (C-S-43). 직물을 6 cm x 6 cm 견본으로 절단하고 각각 2 조각을 시험에 사용하였다.
만나나아제를 제외한 다른 모든 효소를 함유하는 시판 중인 중질 (heavyduty) 액체 세제 A를 세척액 리터 당 4.4g의 농도로 사용하였고, 효소가 없는 상업용 컬러 세제 분말을 3.8 g/l로 사용하였다. 세제 함유 세척액은 경도 16°dH의 합성 수돗물로 제조되었다. 프로테아제 Savinase® 16 L (0.5 w/w %)와 아밀라아제 Stainzyme® 12 L (0.4 w/w %)가 시판 중인 컬러 세제 분말과 함께 경수에 첨가되었고, 액체 세제는 이미 아밀라아제와 프로테아제를 함유하였다. 컬러 세제 분말의 세척액의 pH는 대략 10이고, 액체 세제를 갖는 세척액은 대략 8.3이었다.
만나나아제 투여량 (dosage)은 세제 중량의 0 - 0.2/0.25 % 범위였지만, 평가를 위해, 투여량은 ml 세척액 당 효소 활성 단위 (MNU) 또는 세척액 l 당 활성 효소 단백질 (AEP)의 mg으로 계산되었다. 활성은 실시예 7에 기재된 바와 같이 측정되었다. 각 제제의 AEP 함량은 실시예 8에 정의된 바와 같이 효소 활성(enzyme activity)을 특정 활성(specific activity)으로 나누어 계산하였다. 대조 시료는 세제 용액을 함유하지만 만나나아제는 포함하지 않았다.
16°dH의 경도를 갖는 합성 수돗물을 위해 다음 농축액 (stock solution)이 탈이온수 (deionized water) (Milli-Q 또는 등가물)에서 제조되었다:
1000°d 칼슘-경도(Calcium-hardness)를 갖는 농축액 : CaCl2 x 2H20 (1.02382.1000, Merck KGaA, 독일) 26,22 g/l
200°d 마그네슘-경도(Magnesium-hardness)를 갖는 농축액 : MgS04 x 7H20 (1.05886.1000, Merck KGaA, 독일) 8,79 g/l H20
NaHC03 농축액 : NaHC03 (1.06329.1000 Merck KGaA, 독일) 29,6 g/l
13,3 ml의 CaCl2 용액, 13,3 ml의 MgSO4 용액 및 10,0 ml의 새로 제조된 NaHCO3 용액을 주어진 순서대로 용적 측정 플라스크 (volumetric flask)에 첨가하고, 탈 이온수로 1 리터까지 만들어 혼합하였다. 물의 경도는 착물 적정 (complexometric titration)에 의해 측정되었고 정확한 것으로 확인되었다.
얼룩 제거 처리는 다음과 같이 Atlas LP-2 Launder-Ometer에서 수행되었다. Launder- Ometer는 우선 40℃로 예열되었다. 이어서, 세제, 경도 16°dH의 250 ml 합성 수돗물 및 희석된 효소 (<1.0 ml)를 1.2 리터 용기에 첨가하였다. 얼룩물 (stains)을 첨가하고 Launder-Ometer를 42rpm의 회전 속도로 40 ℃에서 60 분 동안 작동시켰다. 그 후, 견본 (swatches)을 흐르는 물로 조심스럽게 헹구고 일광으로부터 보호되는 격자판 (grid)에서 밤새 실내 공기에서 건조시켰다. 얼룩 제거 효과는 L*a*b* 컬러 공간 좌표 (color sapce coordinates) (illuminant D65/100, 420 nm cut)를 사용하는 Konica Minolta CM-3610A 분광 광도계를 사용한 반사율 값 (relectance values)으로서 컬러를 측정하여 평가하였다. 만나나아제 성능(얼룩 제거 효율)을 나타내는 얼룩의 퇴색은 ΔL* (delta L*) 로 계산되었으며, 이는 효소 처리 직물의 명도 값 L * 마이너스 만나나아제 없이 세척액으로 처리된 직물의 명도 값 L * (대조군)을 의미한다. 최종 결과 (총 얼룩 제거 효과)는 각 얼룩의 ΔL *의 합으로 나타내었다. 각 얼룩의 컬러 값은 2 견본의 평균이다. 시판 중인 액체 세제로 얻은 결과는 도 6-7에 나타내었다. 본 발명에 따른 만나나아제는 상업적 만나나아제 제제 Mannaway® 4,0 L과 비교할 때, 활성 단위 또는 활성 효소 단백질로서 투여 (dose)될 때 액체 세제와 유사하거나 (Man6) 상당히 우수한 (Man7) 얼룩 제거 성능을 갖는다. 발현 숙주인 Bacillus 또는 Trichoderma와 무관하게 Man6 및 Man7에 대해 유사한 성능이 확인되었다(도 6). 시판 중인 컬러 세제 분말과 함께 확인된 결과는 본 발명에 따른 만나나아제가 상업용 만나나아제 제제 Mannaway® 4,0 L와 비교하여, 활성 단위 또는 활성 효소 단백질로서 투여될 때 컬러 세제 분말과 함께 더 나은 얼룩 제거 성능을 가짐을 보여준다.
실시예 10: 표백제 함유 세제를 사용한 Man 6(발명) 및 Man 7(참조) 만나나아제의 얼룩 제거 성능
(실시예 5에 기술된 바와 같이) Bacillus에서 생산된 Man6 및 Man7 만나나아제는 시판 중인 표백제 세제 분말과 함께 40℃ 및 16°dH의 물 경도에서 만나나아제 민감성 표준 얼룩을 제거하는 성능을 시험하고, 시판 중인 만나나아제 제제 Mannaway® 4,0 L (Novozymes)와 비교하였다. 시험 시스템은 Center for Testmaterial B.V. (네덜란드)로부터 3개의 상이한 인위적으로 오염된 시험용 천이 사용된 것을 제외하고는, 실시예 9와 유사하다: 면 위에 만나나아제 민감성 초콜릿 푸딩 (E-165), 면 위에 안료와 함께 로커스트 콩 검(Locust bean gum) (C-S-73), 면 위에 카본 블랙과 함께 구아검 (C-S-43). 시판 중인 컬러 세제 분말을 세척액 1 리터당 4.2g의 농도로 사용하였고 세척액의 pH는 약 9.5 이었다. 해당 세제는 아무런 효소도 함유하지 않기 때문에 프로테아제 Savinase® 16 L (0.5 w/w % ) 및 아밀라아제 Stainzyme® 12 L (0.4 w/w %)가 시험에 사용된 경수에 첨가되었다. 처리 후 견본의 컬러를 측정하고 실시예 9에 기재된 바와 같이 각각 3개의 얼룩의 ΔL*의 합으로 결과를 계산하였다. 시판 중인 표백제 함유 세제로 얻은 결과 (도 10)는 본 발명에 따른 만나나아제 (Man7)가 활성 효소 단백질로서 투여될 때 시판 중인 만나나아제 Mannaway® 4,0 L 와 비교할 때 상당히 우수한 얼룩 제거 성능을 가짐을 나타낸다. Man6 에서는 상업용 박테리아 만나나아제와 비교하여 최소한 비슷한 성능이 얻어진다.
실시예 11: 시판 중인 액체 세제를 사용한 Man14(참조)의 얼룩 제거 성능
Bacillus에서 생산한 (실시예 5에 기술됨) Man14 만나나아제는 시판 중인 중질 액체 세제 B (heavy duty liquid detergent B)와 함께 40℃ 및 16°dH의 물 경도에서 만나나아제 민감성 표준 얼룩을 제거하는 능력을 시험하고 시판 중인 만나나아제 제제 Mannaway® 4,0 L (Novozymes)와 비교하였다. 시험 시스템은 Center for Testmaterial B.V. (네덜란드)로부터 2 개의 상이한 인위적으로 오염된 시험 천이 사용된 것을 제외하고는, 실시예 9와 유사하다: 면 위에 만나나아제 민감성 초콜릿 푸딩 (E-165), 면 위에 안료와 함께 로커스트 콩 검 (C-S-73). 시판 중인 중질 액체 세제 B를 세척액 1 리터당 5g의 농도로 사용하였고, 세척액의 pH는 약 8.3이었다. 세제는 아무런 효소도 함유하지 않기 때문에 프로테아제 Savinase® 16 L (0,5 w/w %) 및 아밀라아제 Stainzyme® 12 L (0,4 w/w %)가 시험에 사용된 경수에 첨가되었다. 처리 후 견본의 컬러를 측정하고 실시예 9에 기재된 바와 같이 각각 2개의 얼룩의 ΔL*의 합으로 결과를 계산하였다. 시판 중인 액체 함유 세제로 얻은 결과 (도 11-12)는 Man14이 활성 단위 또는 활성 효소 단백질로 투여될 때 시판 중인 제품과 비슷하게 액체 세제에서 우수한 성능을 보였음을 나타낸다.
실시예 12: 시판 중인 액체 세제에서 Man6(발명) 및 Man7(참조) 만나나아제 안정성
Bacillus에서 생산된 Man6 및 Man7 만나나아제 제제의 안정성을 지역 슈퍼 마켓에서 수득한 OMO Color liquid에서 테스트하고 상업적 만나나아제 제제 Mannaway® 4,0 L과 비교하였다. 만나나아제 제제를 세제 중 0.5 % w/w -%로 첨가하고 시료를 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브에서 37 ℃에서 5 주 동안 반응하였다. 30 분 반응 시간을 사용한 것을 제외하고는 실시예 7에 기재된 활성 분석에서의 특정 간격 (certain interval)으로 활성을 측정하였다. 결과는 잔류 활성 (residual activity, %)으로 계산되었으며, 이는 특정 시점에서 취한 시료의 활성을 시료의 초기 활성으로 나눔으로써 수득되었다. Bacillus와 Trichoderma에서 생산된 Man7 및 Trichoderma에서 생산된 Man6의 안정성은 프로테아제를 함유하지만 만나나아제는 함유하지 않는 시판 중인 액체 중질 세제 A에서 Mannaway 4,0 L에 대비하여 시험되었다. 이 시험에서, 1 %-(w/w)의 만나나아제를 사용하고 시료를 12 주 동안 37 ℃에서 인큐베이션 하였다. Omo Color의 결과 (도 13)는 Mannaway® 4,0 L에 비교하여 Man6의 경우 안정성이 상당히 우수하고 Man7는 유사한 안정성을 나타냈다. Man7 및 특히 Man6은 다른 시판 중인 액체 세제 A를 함께 사용할 때에도, 도 14에서와 같이, Mannaway® 4,0 L 보다 더 안정적이었다. 동일한 조건의 또 다른 시험에서 얻은 결과는 Man6이 발현 숙주, Bacillus 또는 Trichoderma에 관계없이 유사한 안정성을 가짐을 보여주었다 (데이터는 나타내지 않음). 안정성 실험의 결과는 본 발명에 따른 만나나아제가 37℃와 같은 고온에서 저장될 때에도 몇 주 동안 세제에서 안정하다는 것을 보여준다. 본 발명에 따른 만나나아제 (Man6 및 Man7)의 안정성은 액체 세제에서 시판 중인 박테리아 만나나아제와 비교하여 개선되었다.
실시예 13: 본 발명에 따른 액체 세제 조성물의 세척 성능
본 발명에 따른 액체 세제 조성물의 세척 성능은 CFT (Center for Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Netherlands ("CFT"), Eidgenossische Material- und Prufanstalt Testmaterialien AG [Federal materials and testing agency, Testmaterials], St. Gallen, Switzerland ("EMPA") 및 Warwick Equest Ltd Unit 55, Consett Business Park, Consett, County Durham ("Equest")로부터 수득된 표준화된 얼룩(standardized stains)을 사용하여 측정되었다.
하기 조성을 갖는 액체 세척제가 기본 제형으로 사용되었다 (모든 값은 중량 %):
케미칼 명 활성 물질 원료 [%] 활성 물질 세제 제형[%]
광물수 (Water demin.) 100 나머지 (Rest)
알킬 벤젠 술폰산 (Alkyl benzene sulfonic acid) 96 2-7
음이온성 계면활성제 (Anionic surfactants) 70 6-10
C12-C18 지방산 나트륨 염 (C12-C18 Fatty acid sodium salt) 30 1-4
비이온성 계면활성제 (Nonionic surfactants) 100 4-7
포스페이트 (Phosphonates) 40 0,1-2
시트르산 (Citric acid) 100 1-3
NaOH 50 1-4
보론산 (Boronic acid) 100 0,1-2
항거품제 (Antifoaming agent) 100 0,01-1
글리세롤 (Glycerol) 100 1-3
효소 (Enzymes) 100 0,1-2
보존제 (Preserving agent) 100 0,05-1
에탄올 (Ethanol) 93 0,5-2
광학 증백제 (Optical brightener) 90 0,01-1
향료 (Perfume) 100 0,1-1
염료 (Dye) 100 0,001-0,1
세제 조성물의 pH는 8,2-8,6 이었다.
이 기본 제형 (base formulation)에 기초하여, 액체 세제 조성물 1과 2가 하기에 나타낸 바와 같이 각각의 효소를 첨가함으로써 제조되었다:
조성물 1 : 서열번호 12에 따른 효소 (Man6) (발명)
조성물 2 : 서열번호 16에 따른 효소 (Man7) (참조)
세척은 AISE 방법에 따라 다음과 같이 수행되었다 : 3,5 kg 클린 밸러스트 천 (Clean ballast cloth), 4 개의 SBL 천 (SBL Cloths), Miele 세탁기, 20 ℃ 및 40 ℃ 단기 프로그램 (Short program).
모든 만나나아제는 총 단백질 함량 기준으로 동일한 양으로 첨가되었다.
액체 세척제의 투여 비율은 세척액 1 리터당 4.0 g이었다. 세척 절차는 경도가 15.5 내지 16.5° (독일 경도 기준)인 물에서 20℃ 내지 40℃의 온도로 60 분 동안 수행되었다.
수득된 결과는 상기 세제를 사용하여 얻은 배출 유닛 (remission unit)과 시판되는 참조 만나나아제 (reference mannanase) (Manoway 4.0L, Novozymes로부터 구입)를 함유한 세제를 사용하여 얻은 배출 유닛 사이의 차이 값이다. 따라서 양의 값은 참조 만나나아제를 포함하는 동일한 세제 조성물과 비교하여 본 발명의 만나나아제를 포함하는 세제 조성물의 개선된 세척 성능을 나타낸다. 세척 시험 내에서 광범위한 얼룩이 시험되었다.
백색도 (whiteness), 즉 얼룩의 증백 (brightening)은 세척 성능의 지표로서 광도계로 측정되었다. 해당 장치 (unit)와 함께 제공된 백색 표준 (white standard)을 사용하여 미리 보정된 미놀타 CM508d 분광계 장치를 사용하였다.
얻어진 결과는 세제로 얻은 방출 단위(remission unit)와 효소 조합을 함유한 세제로 얻은 방출 단위의 차이 값이다. 따라서 양의 값은 세제에 존재하는 효소 조합으로 인한 세척 성능이 개선되었음을 나타낸다. 세제 조성물에서 본 발명의 만나나아제는 다양한 만난 포함 얼룩에서 개선된 성능을 나타낸다.
20°C 40°C
얼룩 Comp.1 Comp.2 Comp.1 Comp.2
초콜릿 아이스크림 (Equest) 1.3 4.2 n.d. n.d.
Carte Dor 초콜릿 아이스크림 (Equest) n.d. 3.3 n.d. 0.7
코코아 [CO] (Equest) n.d. 2.3 n.d. n.d.
마요네즈/카본 블랙 컬러 (CFT CS05S [CO]) 1.3 4.3 1.1 2.2
샐러드 드레싱, 천연 흑색과 함께(CFT CS06 [CO]) 1.2 3.5 1.2 2,6
립스틱, 희석됨, 적색 (CFT CS216 [CO]) n.d. 1.5 n.d. 0.7
실시예 14: 본 발명에 따른 분말 세제 조성물의 세척 성능
본 발명에 따른 분말 세제 조성물의 세척 성능은 CFT (Center for Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Netherlands ("CFT"), Eidgenossische Material- und Prufanstalt Testmaterialien AG [Federal materials and testing agency, Testmaterials], St. Gallen, Switzerland ("EMPA") Warwick Equest Ltd Unit 55, Consett Business Park, Consett, County Durham ("Equest")로부터 수득된 표준화된 얼룩(standardized stains)을 사용하여 측정되었다.
하기 조성을 갖는 고형 세척제가 기본 제형으로 사용되었다 (모든 값은 중량 %):
케미칼 명 활성 물질 원료 [%] 활성 물질 세제 제형 [%]
광물수 (Water demin.) 100 1-4
알킬 벤젠 술폰산 (Alkyl benzene sulfonic acid) 97 9-13
비이온성 계면활성제 (Nonionic surfactants) 100 4-7
퍼카보네이트 (Percarbonates) 88 9-13
TAED 92 1-5
포스페이트 (Phosphonates) 60 0,1-3
폴리아크릴레이트 (Polyacrylates) 45 1-4
소듐 실리케이트 (Soduim silicate) 40 5-10
소듐 카보네이트 (Sodium carbonate) 100 18-22
카르복시메틸셀룰로오스 (Carboxymethylcellulose) 69 1-4
오염 방출 중합체 (Soil release polymer) 100 0,1-1
광학 증백제 (Optical brightener) 70 0,1-1
항거품제 (Antifoaming agent) t.q. 0,01-1
소듐 설페이트 (Sodium sulfate) 100 22-30
효소 (Enzymes) 100 0,1-1
향료 (Perfume) 100 0,1-1
NaOH 100 0,1-1
기타 (Rest) - 1-4
이 기본 제형에 기초하여 하기에 나타낸 바와 같이 각각의 효소를 첨가함으로써 고체 세제 조성물 3 및 4를 제조하였다.
조성물 3 : 서열번호 12에 따른 효소 (Man6) (발명)
조성물 4 : 서열번호 16에 따른 효소 (Man7) (참조)
세척은 AISE 방법에 따라 다음과 같이 수행되었다 : 3,5 kg 클린 밸러스트 천 (Clean ballast cloth), 4 개의 SBL 천 (SBL Cloths), Miele 세탁기, 20 ℃ 및 40 ℃ 단기 프로그램. 모든 만나나아제는 총 단백질 함량 기준으로 동일한 양으로 첨가되었다.
분말 세척제의 투여 비율은 세척액 1 리터당 3.8 그램이었다. 세척 절차는 물의 경도가 15.5 내지 16.5° (독일 경도) 인 20 ℃ 내지 40 ℃의 온도에서 60 분 동안 수행되었다.
백색도, 즉 얼룩의 증백은 세척 성능의 지표로서 광도계로 측정되었다. Minolta CM508d 분광계 장치를 사용하였고, 해당 장치 (unit)와 함께 제공된 백색 표준을 사용하여 미리 보정 하였다.
얻어진 결과는 상기 세제로 얻은 방출 단위와 기준 만나나아제 (Manoway 4.0L, Novozymes에서 수득)를 포함하는 세제로 얻은 방출 단위의 차이 값이다. 따라서 양의 값은 세제의 변형 (variants in the detergent)에서 세척 성능이 개선되었음을 나타낸다. 본 발명의 만나나아제는 몇몇 얼룩에서 개선된 성능을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 만나나아제는 Mannaway와 비교하여 개선된 세척 성능을 나타내는 것이 명백하다.
20℃ 40℃
얼룩 (Stain) Comp.3 Comp.4 Comp.3 Comp.4
Carte Dor 초콜릿 아이스크림 (Equest) 1.4 2.8 2.1 0.5
비에네타 (Vienetta) (Equest) 0.5 0.8 0.5 n.d.
초콜릿 아이스크림 L [CO] (Equest) 0.9 0.9 1.1 n.d.
죽 (Porridge) (EMPA 163 [CO]) n.d. n.d. 1.3 5.1
코코아 (CFT CS02 [CO]) 1.8 3.1 n.d. n.d.
마요네즈/카본 블랙 컬러 (CFT CS05S [CO]) n.d. 1.0 n.d. 2.7
샐러드 드레싱, 천연 흑색과 함께 (CFT CS06 [CO]) 2.0 4.8 1.3 5.1
카본 흑색을 갖는 Sebum BEY (CFT CS32 [CO]) 0.7 1.4 0.5 0.7
초콜릿 드링크, 퓨어 (pure) (CFT CS44 [CO]) n.d. 1.4 n.d. 0.8
특허 청구범위의 범위 및 해석을 제한하지 않으면서, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 관점 (aspects) 또는 양태 (embodiments)의 특정 기술적 효과가 다음에 열거된다 : 하나의 기술적 효과는 만난의 분해 (degradation) 또는 변형 (modification) 이다. 또 다른 기술적 효과는 우수한 저장 안정성을 갖는 만나나아제의 제공이다. 전술한 설명은 본 발명의 특정 실시 (implementations) 및 양태 (embodiments)의 비제한적인 예시들과 본 발명을 수행하기 (carrying out) 위해 본 발명자들에 의해 현재 고려되는 최상의 모드에 대한 완전하고 유익한 설명으로 제공되었다. 그러나 본 발명이 상기 제시된 양태의 세부사항으로 제한되지 않으며, 본 발명의 특성에서 벗어나지 않으며 동등한 수단을 사용하여 다른 양태로서 실시될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
서열번호 1: 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man6_1 서열
서열번호 2: 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man6_2 서열
서열번호 3: 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_1 서열 (참조)
서열번호 4: 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_2 서열 (참조)
서열번호 5: 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man14_1 서열 (참조)
서열번호 6: 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man14_2 서열 (참조)
서열번호 7: 올리고뉴클레오티드 프라이머 Vec_1 서열
서열번호 8: 올리고뉴클레오티드 프라이머 Vec_2 서열
서열번호 9: Bacillus clausii man6 뉴클레오티드 서열
서열번호 10: Trichoderma reesei에 코돈 최적화되고 시그널 펩타이드 코딩 서열이 없는 Bacillus clausii man6 뉴클레오티드 서열
서열번호 11: Bacillus clausii Man6의 추론된 아미노산 서열
서열번호 12: 시그널 펩타이드 없는 Bacillus clausii Man6의 추론된 아미노산 서열
서열번호 13: Bacillus hemicellulosilyticus man7 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 14: Trichoderma reesei에 코돈 최적화되고 시그널 펩타이드 코딩 서열이 없는 Bacillus hemicellulosilyticus man7 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 15: Bacillus hemicellulosilyticus Man7의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 16: 시그널 펩타이드 없는 Bacillus hemicellulosilyticus Man7의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 17: Virgibacillus soli man14 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 18: Trichoderma reesei에 코돈 최적화되고 시그널 펩타이드 코딩 서열이 없는 Virgibacillus soli man14 클레오티드 서열 (참조)
서열번호 19: Virgibacillus soli Man14의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 20: 시그널 펩타이드 없는 Virgibacillus soli Man14의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 21: 올리고뉴클레오티드 프라이머 BMAN1 서열
서열번호 22: 올리고뉴클레오티드 프라이머 BMAN2 서열
서열번호 23: 올리고뉴클레오티드 프라이머 BMAN3 서열
서열번호 24: 올리고뉴클레오티드 프라이머 BMAN4 서열
서열번호 25: Bacillus pumilus man31 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 26: Bacillus pumilus Man31의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 27: Bacillus amyloliquefaciens man32 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 28: Bacillus amyloliquefaciens Man32의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 29: Amphibacillus xylanus man33 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 30: Amphibacillus xylans Man33의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 31: Paenibacillus polymyxa man34 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 32: Paenibacillus polymyxa Man34의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 33: Bacillus hemicellulosilyticus man35 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 34: Bacillus hemicellulosilyticus Man35의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 35: Bacillus alcalophilus man36의 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 36: Bacillus alcalophilus Man36의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 37: Bacillus sp. man37 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 38: Bacillus sp. Man37의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 39: Bacillus circulars man38 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 40: Bacillus circulans Man38의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 41: Paenibacillus sp. man39 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 42: Paenibacillus sp. Man39 의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 43: Bacillus circulans man40 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 44: Bacillus circulans Man40의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 45: Bacillus nealsonii man41 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 46: Bacillus nealsonii Man41의 추론된 아미노산 서열 (참조)
서열번호 47: Bacillus circulans man42 뉴클레오티드 서열 (참조)
서열번호 48: Bacillus circulans Man42 뉴클레오티드 서열 (참조)
<110> Henkel AG & Co. KGaA <120> Detergent compositions comprising Bacterial mannanases <130> Pi19-B226 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 caaccgcctc tgcagcttat gcacaaaacg gatttcacg 39 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cggtatatct ctgtcttaat cactcttaag cccattttc 39 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caaccgcctc tgcagcttct gatggtcata gccaaac 37 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cggtatatct ctgtcttatt ggattgttac atgatc 36 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 caaccgcctc tgcagctgca agcgggtttt atgtaaacgg 40 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cggtatatct ctgtcttatt taatggtaac gttatcaac 39 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 agctgcagag gcggttg 17 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gacagagata taccgacagt g 21 <210> 9 <211> 975 <212> DNA <213> Bacillus clausii <400> 9 atgaagaggg aggacatgga tcaaatgaaa agaaagcggt tacaattgtt tggaacacta 60 gtggtattgg ttttgttcgt gtacggtagc ggttcggcat atgcacaaaa cggatttcac 120 gtatccggta cagagttgtt ggacaaaaat ggcgatcctt atgttatgcg tggcgtcaac 180 catggacact cttggtttaa gcaagatctg gaggaagcaa tccctgccat agcagaaaca 240 ggggcgaaca cggtgagaat ggtcttatcc aatggacagc aatgggaaaa agatgatgcc 300 tctgagcttg cccgtgtgct ggctgccaca gaaacatatg gattgacaac tgtgctggaa 360 gtccatgacg ctacaggaag tgacgatcct gctgatttag agaaagcagt cgattattgg 420 atcgaaatgg ctgatgttct caaggggaca gaagaccgag taatcattaa cgttgccaat 480 gaatggtatg ggtcgtggag gagcgacgtt tgggcagaag catacgcaca agcgatcccg 540 cgcttgcgca gcgctggcct ctcccataca ttaatggttg atgcggcagg ttggggccag 600 taccctgcct ccatccacga gcggggagcc gatgtgtttg cgtccgatcc attaaaaaac 660 acgatgtttt cgatccatat gtacgaatat gcaggagctg atagggcgac aattgcctat 720 aacattgatc gtgtgcttgc tgaaaatctt gctgtggtga tcggtgaatt tggccatagg 780 catcatgatg gcgatgtcga tgaagatgcg attttggcct atacagcaga gcggcaagtg 840 ggctggctgg cctggtcatg gtatggcaac agcgggggtg ttgaatactt ggatttagct 900 gaaggcccat caggcccatt gacgagttgg ggcaaacgaa ttgtttatgg tgaaaatggg 960 cttaagagtg attaa 975 <210> 10 <211> 870 <212> DNA <213> Bacillus clausii <400> 10 cagaacggct tccacgtctc cggcacggag ctcctggaca agaacggcga cccttacgtc 60 atgcgcggcg tcaaccacgg ccacagctgg ttcaagcagg acctcgagga agccatccct 120 gctatcgctg agacgggcgc taacacggtc cgcatggtcc tgagcaacgg ccagcagtgg 180 gagaaggacg acgctagcga gctggctcgc gtcctcgctg ctacggagac gtacggcctc 240 accacggtcc tggaggtcca cgacgctacg ggctcggacg accccgccga cctcgagaag 300 gccgtcgact actggatcga gatggctgac gtcctgaagg gcaccgagga ccgcgtcatc 360 atcaacgtcg ccaacgagtg gtacggctcc tggcgcagcg acgtctgggc cgaggcctac 420 gctcaggcta tccctcgcct ccgctcggcc ggcctctccc acacgctcat ggtcgacgct 480 gccggctggg gccagtaccc tgcttccatc cacgagcgcg gcgctgacgt ctttgcttcg 540 gaccccctga agaacaccat gttctccatc cacatgtacg agtacgctgg cgctgaccgc 600 gctaccatcg cctacaacat cgaccgcgtc ctggctgaga acctggctgt cgtcatcggc 660 gagtttggcc accgccacca cgacggcgac gtcgacgagg acgctatcct ggcttacacc 720 gccgagcgcc aggtcggctg gctggcttgg tcgtggtacg gcaactcggg cggcgtcgag 780 tacctggacc tggctgaggg cccttcgggc cctctcacga gctggggcaa gcgcatcgtc 840 tacggcgaga acggcctgaa gagcgactaa 870 <210> 11 <211> 324 <212> PRT <213> Bacillus clausii <400> 11 Met Lys Arg Glu Asp Met Asp Gln Met Lys Arg Lys Arg Leu Gln Leu 1 5 10 15 Phe Gly Thr Leu Val Val Leu Val Leu Phe Val Tyr Gly Ser Gly Ser 20 25 30 Ala Tyr Ala Gln Asn Gly Phe His Val Ser Gly Thr Glu Leu Leu Asp 35 40 45 Lys Asn Gly Asp Pro Tyr Val Met Arg Gly Val Asn His Gly His Ser 50 55 60 Trp Phe Lys Gln Asp Leu Glu Glu Ala Ile Pro Ala Ile Ala Glu Thr 65 70 75 80 Gly Ala Asn Thr Val Arg Met Val Leu Ser Asn Gly Gln Gln Trp Glu 85 90 95 Lys Asp Asp Ala Ser Glu Leu Ala Arg Val Leu Ala Ala Thr Glu Thr 100 105 110 Tyr Gly Leu Thr Thr Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly 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Bacillus clausii <400> 12 Gln Asn Gly Phe His Val Ser Gly Thr Glu Leu Leu Asp Lys Asn Gly 1 5 10 15 Asp Pro Tyr Val Met Arg Gly Val Asn His Gly His Ser Trp Phe Lys 20 25 30 Gln Asp Leu Glu Glu Ala Ile Pro Ala Ile Ala Glu Thr Gly Ala Asn 35 40 45 Thr Val Arg Met Val Leu Ser Asn Gly Gln Gln Trp Glu Lys Asp Asp 50 55 60 Ala Ser Glu Leu Ala Arg Val Leu Ala Ala Thr Glu Thr Tyr Gly Leu 65 70 75 80 Thr Thr Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Ser Asp Asp Pro Ala 85 90 95 Asp Leu Glu Lys Ala Val Asp Tyr Trp Ile Glu Met Ala Asp Val Leu 100 105 110 Lys Gly Thr Glu Asp Arg Val Ile Ile Asn Val Ala Asn Glu Trp Tyr 115 120 125 Gly Ser Trp Arg Ser Asp Val Trp Ala Glu Ala Tyr Ala Gln Ala Ile 130 135 140 Pro Arg Leu Arg Ser Ala Gly Leu Ser His Thr Leu Met Val Asp Ala 145 150 155 160 Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Ala Ser Ile His Glu Arg Gly Ala Asp 165 170 175 Val Phe Ala Ser Asp Pro Leu Lys Asn Thr Met Phe Ser Ile His Met 180 185 190 Tyr Glu Tyr Ala Gly Ala Asp Arg Ala Thr Ile Ala Tyr Asn Ile Asp 195 200 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aatggtatgg agcatgggac 480 ggacaaggct gggcaaatgg ctataaggag gttattccac gtttacgaaa tgctggcttc 540 actcatacat taatggtaga tgcagctggt tggggacaat accctcaatc gattcatgat 600 tatggtcaag aggtatttaa tgctgatcct ttagcaaata cgatgttttc catccatatg 660 tatgaatatg ctggcggaaa tgcttcaatg gtacaatcta atatcgatgg tgtcgtcgat 720 caagggttag ctcttgtaat aggagaattt gggcatatgc atacggacgg agatgttgat 780 gaagcaacga tattgagcta ctcgcaacaa agaggagtcg gttggctagc ttggtcttgg 840 aaaggcaatg ggactcaatg ggaatatcta gatttatctt atgattggca aggaacaaac 900 ttaacttctt ggggaaatac cattgtccac gggcctaatg gattactcga aacatccatt 960 ccaagctcga ttttccatac cgctccaaac aatggagatc cccctcctca taacggtaat 1020 gaaacgatct tatatgattt cgaacatggc actcaaggct ggtcaggttc ttcacttctt 1080 ggaggacctt ggacgacgaa tgaatggagt acaaatggta accattcatt aaaggccgat 1140 attttcttat cagctaactc caaacatgaa ttagcaaaag ttgaaaatcg aaatttatca 1200 ggctactcta ctttacaagc cactgtccgc catgcacatt ggggaaatgt tggtaattta 1260 acggcgagaa tgtatgtaaa aacgggctca aactatagct ggtttaatgg 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ataatctaat tgctatgtta 300 gaggtccacg atgctactgg aaaagatgat atcagctcat tagatagtgc ggcagattat 360 tggattagta taaaagaagc acttatcggc aaggaagaca aagtcctaat aaacatcgca 420 aatgaatggt acggtacttg ggatggggct agttgggcgg atggctacaa acaagtgatt 480 cccaaattaa gaaatgcagg acttaaccac acactaatag tagactctgc tggctggggg 540 caatttccgg agtccattca caattacgga aaagaagtat tcaatgctga ccccctacaa 600 aatacaatgt tctctattca tatgtatgaa tatgctggtg gggacgcttc tactgtcaaa 660 gcaaatattg acggtgtatt aaatcaaggt ctagccgtaa tcattggaga atttggacat 720 aggcatacag acggagatgt agatgaagca acaattatga attattccca agagaaaaat 780 gttggctggc tcgcatggtc gtggaaaggt aatggcatgg aatgggatta tttagactta 840 tcctatgatt gggccggaaa taacctaacc gactggggaa ataccattgt aaatagtaca 900 aacggcttaa aagctacatc tgaaataagt ccagtatttg gagatggaga tgacggtgta 960 ggcgacggtg gtcctgggga ttctaacgga actgaaacta cgctttataa cttcgaaacc 1020 gggacagaag gatggagcgg cgaaaatata gaaactggac cttggtcagt gaatgagtgg 1080 gcagcaaaag gtaaccactc tttaaaagct gatgttaatt tgggtgataa ctctgaacat 1140 tatctatacc taactcaaaa cctaaatttt agcggaaagt cacaactcac agcgactgta 1200 aagcatgctg attggggaaa cttcggggat gaaataaatg caaagttata tgtaaaaaca 1260 gaatcagatt ggcaatggtt tgatggagga attgaaaaga tcaattcttc aattggaact 1320 attataacct tagatttatc atcgctctca aacccaagtg atattaaaga agttggtgtt 1380 cagtttacgg gttcttcaaa tagttatggc ctaacagctt tatatgttga taacgttacc 1440 attaaataa 1449 <210> 18 <211> 1401 <212> DNA <213> Virgibacillus soli <400> 18 gcctcgggct tctacgtcaa cggcaacact ctctacgacg ccacgggcac cccatttgtc 60 atccgcggca tcaaccacgc tcactcgtgg ttcaaggacg acactgccac cgctatccct 120 gctatcgctg ctacgggcgc caacacgatc cgcatcgtcc tcagcgacgg ctcgcagtac 180 tcccgcgacg acatcgacgg cgtccgcaac ctcatctccc tggccgagga gaacaacctc 240 atcgccatgc tggaggtcca cgacgctacc ggcaaggacg acatcagctc gctggacagc 300 gccgccgact actggatctc gatcaaggaa gccctcatcg gcaaggaaga caaggtcctg 360 atcaacatcg ccaacgagtg gtacggcacc tgggacggcg ctagctgggc tgacggctac 420 aagcaggtca tccctaagct ccgcaacgcc ggcctcaacc acacgctcat cgtcgactcg 480 gctggctggg gccagttccc ggagagcatc cacaactacg gcaaggaagt cttcaacgcc 540 gaccccctgc agaacacgat gttctcgatc cacatgtacg agtacgccgg cggcgacgct 600 tccacggtca aggccaacat cgacggcgtc ctcaaccagg gcctggctgt catcatcggc 660 gagtttggcc accgccacac cgacggcgac gtcgacgagg ccaccatcat gaactacagc 720 caggagaaga acgtcggctg gctggcttgg agctggaagg gcaacggcat ggagtgggac 780 tacctcgacc tgagctacga ctgggccggc aacaacctca ccgactgggg caacacgatc 840 gtcaactcga ccaacggcct gaaggccacc tcggagatca gccctgtctt tggcgacggc 900 gacgacggcg tcggcgacgg tggccccggc gacagcaacg gcaccgagac gacgctgtac 960 aactttgaga cgggcaccga gggctggagc ggcgagaaca tcgagacggg cccttggtcg 1020 gtcaacgagt gggctgccaa gggcaaccac tccctcaagg ccgacgtcaa cctgggcgac 1080 aacagcgagc actacctcta cctgacgcag aacctcaact tctccggcaa gtcgcagctg 1140 acggctaccg tcaagcacgc tgactggggc aacttcggcg acgagatcaa cgccaagctc 1200 tacgtcaaga ccgagagcga ctggcagtgg ttcgacggtg gcatcgagaa gatcaactcc 1260 agcatcggca ccatcatcac gctcgacctg tcgtccctgt cgaacccgtc cgacatcaag 1320 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120 gcgcaaagtg atattatttc tgatgctgtc tacaaaatca cagctcagca ttcaggaaaa 180 agccttgagg ttgaaggcgg ttctaaagat gacggcgcga atgttcaaca atggacagat 240 aacgggaaag aacagcagaa atggagagtt gtggacgtcg gtggcggata ttacaagctc 300 atcagtcaat ctagcggaaa agcactggat gtggcaggtg gtaatacaca tgatggtgcc 360 aatgtgcaac agtggacgga caacggaaat gctcagcaaa agtggaagat catcgatgta 420 ggaggaggct attataagtt gatctcacaa agctctggaa aggcactcga cgtcgttggt 480 ggttatacgc acgacggggc caatgtgcag caatgggcag acaatggatc tgctcaacag 540 cgctggcgtt tcacacaaat tgatacaacc acggatacga cgccgccaac agcaccaacg 600 aatttacaat catcatcgaa aacaagtacc tctgtaacat tgacttggac cacaagcatt 660 gataatgtag gtgtgacagg ctatgtcatt tataatggaa cagatttggt cgggacttct 720 acaactacat cttatattgt tacaggatta acagcgaaca cttcctataa cttcactgtc 780 aaagcgaagg atgccgctgg gaatatttca gaaccatcaa atgtcttgaa agtcacaacg 840 agttcagatt cttctcaaaa cacaggtttt tatgtgaagg gcacaacatt atatgatgga 900 aacggtaatc catttgtgat gagaggaatc aatcatgcat acacatggta taaagggcaa 960 gaatcagtag caattcctgc gattgcgaaa acgggtgcaa acaccatccg gattgtctta 1020 tctgacggac agcagtggac aaaagatgat ttaagcgcgc ttcaaaattt gattacactc 1080 agtgagcaaa acaaacttgt agtgatttta gaggtgcacg acggtactgg caatgacaat 1140 gccgcagttt taaataaaat tgctgattat tggattgaaa tgaagtcagc tttaattggg 1200 aaggaaaata cagttatttt aaacatcgca aatgaatggt ttggtacatg ggatggaaac 1260 ggctgggcgc agggctacaa atcagtcata ccaaagctgc gaaatgcggg catcaaaaac 1320 acgattatgg tggatgcggc tggatgggga caatatccaa aatcgatttt tgattacgga 1380 acgcaagtgt tcgatgcaga tccgctcaag aatacgatgt tttccattca tatgtatgaa 1440 tacgcaggcg gcaacgcaga aacagtgaaa agtaatatcg acaacgtcct gaataaaaat 1500 cttgcactca tcattggaga atttggaatt aaacatacaa acggagatgt tgatgaagca 1560 acgatcatgt catacgcaca gcaaaaaggt gttgggtatc ttggctggtc atggaaagga 1620 aatggttcag gtcttgaata tttagatatg agtaacgatt gggctggcag cagttataca 1680 gagcaaggac atgccattat cgaaggacca aatggcattc gtgcaacatc aaaattatca 1740 accatttaca gcaatgggaa acaataa 1767 <210> 32 <211> 588 <212> PRT <213> Paenibacillus polymyxa <400> 32 Met Lys Lys Leu Leu Ser Cys Leu Ile Ser Leu Ser Met Leu Val Tyr 1 5 10 15 Ile Leu Pro Thr Met Ile Val Ser Ala Asn Asn Asp Gly Val Thr Asn 20 25 30 Leu Ala Leu Asp Ser Thr Pro Ser Ala Gln Ser Asp Ile Ile Ser Asp 35 40 45 Ala Val Tyr Lys Ile Thr Ala Gln His Ser Gly Lys Ser Leu Glu Val 50 55 60 Glu Gly Gly Ser Lys Asp Asp Gly Ala Asn Val Gln Gln Trp Thr Asp 65 70 75 80 Asn Gly Lys Glu Gln Gln Lys Trp Arg Val Val Asp Val Gly Gly Gly 85 90 95 Tyr Tyr Lys Leu Ile Ser Gln Ser Ser Gly Lys Ala Leu Asp Val Ala 100 105 110 Gly Gly Asn Thr His Asp Gly Ala Asn Val Gln Gln Trp Thr Asp Asn 115 120 125 Gly Asn Ala Gln Gln Lys Trp Lys Ile Ile Asp Val Gly Gly Gly Tyr 130 135 140 Tyr Lys Leu Ile Ser Gln Ser Ser Gly Lys Ala Leu Asp Val Val Gly 145 150 155 160 Gly Tyr Thr His Asp Gly Ala Asn Val Gln Gln Trp Ala Asp Asn Gly 165 170 175 Ser Ala Gln Gln Arg Trp Arg Phe Thr Gln Ile Asp Thr Thr Thr Asp 180 185 190 Thr Thr Pro Pro Thr Ala Pro Thr Asn Leu Gln Ser Ser Ser Lys Thr 195 200 205 Ser 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actaatgaga gagtgctaaa tttatctgat 120 ccgaatgcga cacgctatac gaaggaattg tttgcgtttc ttcaagacgt gagtggtgag 180 caagtgttgt tcgggcaaca gcatgcaaca gatgaagggt tgactctgac aggtgaagga 240 aatcgaattg gttcaactga gtcggaggtg aagaatgcag taggtgatta tccagctgtt 300 tttgggtggg atacgaacag cttggatggt cgtgaaaagc caggtacaga tgtggaaagt 360 caagagcaac gaattttaaa tacagcagaa tcgatgaaag tggcacatga attaggaggg 420 atcatcacat taagtatgca tccggataac tttgttaccg gtcattacta tggcgatacg 480 gatggtaacg tcgttcaaga aatattgcca ggtggctcca agcacaatga atttaacgct 540 tggctagata atattgctgc cctagcacat gaattagttg atgataatgg agagcctatt 600 ccggttatct tccgtccatt ccatgagcaa acaggttcgt ggttttggtg gggtgcgagc 660 acaacaactc ctgagcaata caaagcgatt tttcgatata cagtcgaata cttaagagat 720 gcaaagggtg ttcataactt tttatatgga ttctcccctg gtgcgggtcc tgctggcgat 780 ctagatcgat atttagaaac gtacccaggt gataattatg tcgatatctt aggtattgat 840 aattatgata gtaagtcaaa tgcggggtca gacgcttggt tatctggaat ggtaaaagat 900 ttagcgatga tctcgaaatt agcagaggaa agagggaagg 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gttttccatt 780 catatgtatg aatgggcagc gggtaatcct caacaagtaa aagacaatat tgacggtgtt 840 cttgaaaaga atttagctgt agtaattggt gagttcggtc atcatcacta cggaagagat 900 gttgctgttg atacgatctt aagtcattca gagaagtatg atgtaggttg gcttgcctgg 960 tcttggcacg gaaatagtgg tggtgtagag tatcttgact tagcaacaga tttttcaggg 1020 acgcaactaa ctgaatgggg agaaagaatt gtgtacggtc cgaatggttt aaaagaaact 1080 tctgaaatcg ttagtgtata caaaaaataa 1110 <210> 36 <211> 369 <212> PRT <213> Bacillus alcalophilus <400> 36 Met Arg Ser Met Lys Leu Leu Phe Ala Met Phe Ile Leu Val Phe Ser 1 5 10 15 Ser Phe Thr Phe Asn Leu Val Val Ala Gln Ala Ser Gly His Gly Gln 20 25 30 Met His Lys Val Pro Trp Ala Pro Gln Ala Glu Ala Pro Gly Lys Thr 35 40 45 Ala Glu Asn Gly Val Trp Asp Lys Val Arg Asn Asn Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Asn Pro Pro Ala Gly Lys Val Asn Gly Phe Tyr Ile Asp Gly Thr Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Asp Ala Asn Gly Lys Pro Phe Val Met Arg Gly Ile Asn His 85 90 95 Ala His Ser Trp Tyr Lys Pro His Ile Glu Thr Ala Met Glu Ala Ile 100 105 110 Ala Asp Thr 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Tyr Pro Gln Ser Ile His Asp Tyr Gly Gln Asp 195 200 205 Val Phe Asn Ala Asp Pro Leu Lys Asn Thr Ile Phe Ser Ile His Met 210 215 220 Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly Asp Ala Asn Thr Val Arg Ser Asn Ile Asp 225 230 235 240 Arg Val Ile Asp Gln Asp Leu Ala Leu Val Ile Gly Glu Phe Gly His 245 250 255 Arg His Thr Asp Gly Asp Val Asp Glu Asp Thr Ile Leu Ser Tyr Ser 260 265 270 Glu Glu Thr Gly Thr Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Lys Gly Asn Ser 275 280 285 Ala Glu Trp Asp Tyr Leu Asp Leu Ser Glu Asp Trp Ala Gly Asn His 290 295 300 Leu Thr Asp Trp Gly Asn Arg Ile Val His Gly Ala Asn Gly Leu Gln 305 310 315 320 Glu Thr Ser Lys Pro Ser Thr Val Phe Thr Asp Asp Asn Gly Gly Ala 325 330 335 Pro Glu Pro Pro Thr Thr Thr Thr Leu Tyr Asp Phe Glu Gly Ser Thr 340 345 350 Gln Gly Trp His Gly Ser Asn Val Met Gly Gly Pro Trp Ser Val Thr 355 360 365 Glu Trp Gly Ala Ser Gly Asn Tyr Ser Leu Lys Gly Asp Val Asn Leu 370 375 380 Ser Ser Asn Ser Ser His Glu Leu Tyr Ser Glu Gln Ser Arg Asn Leu 385 390 395 400 His Gly Tyr Ser Gln Leu Asn Ala Thr Val Arg His Ala Asn Trp Gly 405 410 415 Asn Pro Gly Asn Gly Met Asn Ala Arg Leu Tyr Val Lys Thr Gly Ser 420 425 430 Asp Tyr Thr Trp Tyr Ser Gly Pro Phe Thr Arg Ile Asn Ser Ser Asn 435 440 445 Ser Gly Thr Thr Leu Ser Phe Asp Leu Asn Asn Ile Glu Asn Ser His 450 455 460 His Val Arg Glu Ile Gly Val Gln Phe Ser Ala Ala Asp Asn Ser Ser 465 470 475 480 Gly Gln Thr Ala Leu Tyr Val Asp Asn Val Thr Leu Arg 485 490 <210> 39 <211> 1551 <212> DNA <213> Bacillus circulans <400> 39 atggggtggt ttttagtgat tttacgcaag tggttgattg cttttgtcgc atttttactg 60 atgttctcgt ggactggaca acttacgaac aaagcacatg ctgcaagcgg attttatgta 120 agcggtacca aattattgga tgctacagga caaccatttg tgatgcgagg agtcaatcat 180 gcgcacacat ggtataaaga tcaactatcc accgcaatac cagccattgc taaaacaggt 240 gccaacacga tacgtattgt actggcgaat ggacacaaat ggacgcttga tgatgtaaac 300 accgtcaaca atattctcac cctctgtgaa caaaacaaac taattgccgt tttggaagta 360 catgacgcta caggaagcga tagtctttcc gatttagaca acgccgttaa ttactggatt 420 ggtattaaaa gcgcgttgat cggcaaggaa gaccgtgtaa tcattaatat agctaacgag 480 tggtacggaa catgggatgg agtcgcctgg gctaatggtt ataagcaagc catacccaaa 540 ctgcgtaatg ctggtctaac tcatacgctg attgttgact ccgctggatg gggacaatat 600 ccagattcgg tcaaaaatta tgggacagaa gtactgaatg cagacccgtt aaaaaacaca 660 gtattctcta tccatatgta tgaatatgct gggggcaatg caagtaccgt caaatccaat 720 attgacggtg tgctgaacaa gaatcttgca ctgattatcg gcgaatttgg tggacaacat 780 acaaacggtg atgtggatga agccaccatt atgagttatt cccaagagaa gggagtcggc 840 tggttggctt ggtcctggaa gggaaatagc agtgatttgg cttatctcga tatgacaaat 900 gattgggctg gtaactccct cacctcgttc ggtaataccg tagtgaatgg cagtaacggc 960 attaaagcaa cttctgtgtt atccggcatt tttggaggtg ttacgccaac ctcaagccct 1020 acttctacac ctacatctac gccaacctca actcctactc ctacgccaag tccgaccccg 1080 agtccaggta ataacgggac gatcttatat gatttcgaaa caggaactca aggctggtcg 1140 ggaaacaata tttcgggagg cccatgggtc accaatgaat ggaaagcaac gggagcgcaa 1200 actctcaaag ccgatgtctc cttacaatcc aattccacgc atagtctata tataacctct 1260 aatcaaaatc tgtctggaaa aagcagtctg aaagcaacgg ttaagcatgc gaactggggc 1320 aatatcggca acgggattta tgcaaaacta tacgtaaaga ccgggtccgg gtggacatgg 1380 tacgattccg gagagaatct gattcagtca aacgacggta ccattttgac actatccctc 1440 agcggcattt cgaatttgtc ctcagtcaaa gaaattgggg tagaattccg cgcctcctca 1500 aacagtagtg gccaatcagc tatttatgta gatagtgtta gtctgcaata a 1551 <210> 40 <211> 516 <212> PRT <213> Bacillus circulans <400> 40 Met Gly Trp Phe Leu Val Ile Leu Arg Lys Trp Leu Ile Ala Phe Val 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Met Phe Ser Trp Thr Gly Gln Leu Thr Asn Lys Ala 20 25 30 His Ala Ala Ser Gly Phe Tyr Val Ser Gly Thr Lys Leu Leu Asp Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Pro Phe Val Met Arg Gly Val Asn His Ala His Thr Trp 50 55 60 Tyr Lys Asp Gln Leu Ser Thr Ala Ile Pro Ala Ile Ala Lys Thr Gly 65 70 75 80 Ala Asn Thr Ile Arg Ile Val Leu Ala Asn Gly His Lys Trp Thr Leu 85 90 95 Asp Asp Val Asn Thr Val Asn Asn Ile Leu Thr Leu Cys Glu Gln Asn 100 105 110 Lys Leu Ile Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Ser Asp Ser 115 120 125 Leu Ser Asp Leu Asp Asn Ala Val Asn Tyr Trp Ile Gly Ile Lys Ser 130 135 140 Ala Leu Ile Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Ile Asn Ile Ala Asn Glu 145 150 155 160 Trp Tyr Gly Thr Trp Asp Gly Val Ala Trp Ala Asn Gly Tyr Lys Gln 165 170 175 Ala Ile Pro Lys Leu Arg Asn Ala Gly Leu Thr His Thr Leu Ile Val 180 185 190 Asp Ser Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Asp Ser Val Lys Asn Tyr Gly 195 200 205 Thr Glu Val Leu Asn Ala Asp Pro Leu Lys Asn Thr Val Phe Ser Ile 210 215 220 His Met Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly Asn Ala Ser Thr Val Lys Ser Asn 225 230 235 240 Ile Asp Gly Val Leu Asn Lys Asn Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe 245 250 255 Gly Gly Gln His Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu Ala Thr Ile Met Ser 260 265 270 Tyr Ser Gln Glu Lys Gly Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Lys Gly 275 280 285 Asn Ser Ser Asp Leu Ala Tyr Leu Asp Met Thr Asn Asp Trp Ala Gly 290 295 300 Asn Ser Leu Thr Ser Phe Gly Asn Thr Val Val Asn Gly Ser Asn Gly 305 310 315 320 Ile Lys Ala Thr Ser Val Leu Ser Gly Ile Phe Gly Gly Val Thr Pro 325 330 335 Thr Ser Ser Pro Thr Ser Thr Pro Thr Ser Thr Pro Thr Ser Thr Pro 340 345 350 Thr Pro Thr Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Gly Asn Asn Gly Thr Ile 355 360 365 Leu Tyr Asp Phe Glu Thr Gly Thr Gln Gly Trp Ser Gly Asn Asn Ile 370 375 380 Ser Gly Gly Pro Trp Val Thr Asn Glu Trp Lys Ala Thr Gly Ala Gln 385 390 395 400 Thr Leu Lys Ala Asp Val Ser Leu Gln Ser Asn Ser Thr His Ser Leu 405 410 415 Tyr Ile Thr Ser Asn Gln Asn Leu Ser Gly Lys Ser Ser Leu Lys Ala 420 425 430 Thr Val Lys His Ala Asn Trp Gly Asn Ile Gly Asn Gly Ile Tyr Ala 435 440 445 Lys Leu Tyr Val Lys Thr Gly Ser Gly Trp Thr Trp Tyr Asp Ser Gly 450 455 460 Glu Asn Leu Ile Gln Ser Asn Asp Gly Thr Ile Leu Thr Leu Ser Leu 465 470 475 480 Ser Gly Ile Ser Asn Leu Ser Ser Val Lys Glu Ile Gly Val Glu Phe 485 490 495 Arg Ala Ser Ser Asn Ser Ser Gly Gln Ser Ala Ile Tyr Val Asp Ser 500 505 510 Val Ser Leu Gln 515 <210> 41 <211> 984 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 41 atgagacaac ttttagcaaa aggtatttta gctgcactgg tcatgatgtt agcgatgtat 60 ggattgggga atctctcttc taaagcttcg gctgcaacag gtttttatgt aagcggtacc 120 actctatatg attctactgg taaacctttt gtaatgcgcg gtgtcaatca ttcgcatacc 180 tggttcaaaa atgatctaaa tgcagccatc cctgctattg ccaaaacagg tgcaaataca 240 gtacgtatcg ttttatctaa tggtgttcag tatactagag atgatgtaaa ctcagtcaaa 300 aatattattt ccctggttaa ccaaaacaaa atgattgctg ttcttgaggt gcatgatgct 360 accggtaaag acgattacgc ttctcttgat gccgctgtaa actactggat cagcatcaaa 420 gatgccttga ttggcaagga agatcgagtc attgttaata ttgccaatga atggtacggt 480 acatggaatg gcagtgcttg ggcagatggt tataagcagg ctattcccaa actaagaaat 540 gcaggcatca aaaacacttt aatcgttgat gccgccggct ggggacaatg tcctcaatcg 600 atcgttgatt acgggcaaag tgtatttgca gcagattcgc ttaaaaatac aattttctct 660 attcacatgt atgaatatgc aggcggtaca gatgcgatcg tcaaaagcaa tatggaaaat 720 gtactgaaca aaggacttcc tttgatcatc ggtgaatttg gcgggcagca tacaaacggc 780 gatgtagatg aacatgcaat tatgcgttat ggtcagcaaa aaggtgtagg ttggctggca 840 tggtcgtggt atggcaacaa tagtgaactc agttatctgg atttggctac aggtcccgcc 900 ggtagtctga caagtatcgg caatacgatt gtaaatgatc catatggtat caaagctacc 960 tcgaaaaaag cgggtatctt ctaa 984 <210> 42 <211> 327 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 42 Met Arg Gln Leu Leu Ala Lys Gly Ile Leu Ala Ala Leu Val Met Met 1 5 10 15 Leu Ala Met Tyr Gly Leu Gly Asn Leu Ser Ser Lys Ala Ser Ala Ala 20 25 30 Thr Gly Phe Tyr Val Ser Gly Thr Thr Leu Tyr Asp Ser Thr Gly Lys 35 40 45 Pro Phe Val Met Arg Gly Val Asn His Ser His Thr Trp Phe Lys Asn 50 55 60 Asp Leu Asn Ala Ala Ile Pro Ala Ile Ala Lys Thr Gly Ala Asn Thr 65 70 75 80 Val Arg Ile Val Leu Ser Asn Gly Val Gln Tyr Thr Arg Asp Asp Val 85 90 95 Asn Ser Val Lys Asn Ile Ile Ser Leu Val Asn Gln Asn Lys Met Ile 100 105 110 Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Lys Asp Asp Tyr Ala Ser 115 120 125 Leu Asp Ala Ala Val Asn Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Asp Ala Leu Ile 130 135 140 Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Val Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Trp Asn Gly Ser Ala Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Gln Ala Ile Pro 165 170 175 Lys Leu Arg Asn Ala Gly Ile Lys Asn Thr Leu Ile Val Asp Ala Ala 180 185 190 Gly Trp Gly Gln Cys Pro Gln Ser Ile Val Asp Tyr Gly Gln Ser Val 195 200 205 Phe Ala Ala Asp Ser Leu Lys Asn Thr Ile Phe Ser Ile His Met Tyr 210 215 220 Glu Tyr Ala Gly Gly Thr Asp Ala Ile Val Lys Ser Asn Met Glu Asn 225 230 235 240 Val Leu Asn Lys Gly Leu Pro Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gly Gln 245 250 255 His Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu His Ala Ile Met Arg Tyr Gly Gln 260 265 270 Gln Lys Gly Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr Gly Asn Asn Ser 275 280 285 Glu Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser Leu Thr 290 295 300 Ser Ile Gly Asn Thr Ile Val Asn Asp Pro Tyr Gly Ile Lys Ala Thr 305 310 315 320 Ser Lys Lys Ala Gly Ile Phe 325 <210> 43 <211> 981 <212> DNA <213> Bacillus circulans <400> 43 atggccaagt tgcaaaaggg tacaatctta acagtcattg cagcactgat gtttgtcatt 60 ttggggagcg cggcgcccaa agccgcagca gctacaggtt tttacgtgaa tggaggcaaa 120 ttgtacgatt ctacgggtaa accattttac atgaggggta tcaatcatgg gcactcctgg 180 tttaaaaatg atttgaacac ggctatccct gcgatcgcaa aaacgggtgc caatacggta 240 cgaattgttt tatcaaacgg tacacaatac accaaggatg atctgaattc cgtaaaaaac 300 atcattaatg tcgtaaatgc aaacaagatg attgctgtgc ttgaagtaca cgatgccact 360 gggaaagatg acttcaactc gttggatgca gcggtcaact actggataag catcaaagaa 420 gcactgatcg ggaaggaaga tcgggttatt gtaaacattg caaacgagtg gtacggaaca 480 tggaacggaa gcgcgtgggc tgacgggtac aaaaaagcta ttccgaaatt aagagatgcg 540 ggtattaaaa ataccttgat tgtagatgca gcaggctggg gtcagtaccc tcaatcgatc 600 gtcgattacg gacaaagcgt attcgccgcg gattcacaga aaaatacggc gttttccatt 660 cacatgtatg agtatgcagg caaggatgcg gccaccgtca aatccaatat ggaaaatgtg 720 ctgaataagg ggctggcctt aatcattggt gagttcggag gatatcacac caatggagat 780 gtcgatgaat atgcaatcat gaaatatggt ctggaaaaag gggtaggatg gcttgcatgg 840 tcttggtacg gtaatagctc tggattaaac tatcttgatt tggcaacagg acctaacggc 900 agtttgacga gctatggtaa tacggttgtc aatgatactt acggaattaa aaatacgtcc 960 caaaaagcgg gaatctttta a 981 <210> 44 <211> 326 <212> PRT <213> Bacillus circulans <400> 44 Met Ala Lys Leu Gln Lys Gly Thr Ile Leu Thr Val Ile Ala Ala Leu 1 5 10 15 Met Phe Val Ile Leu Gly Ser Ala Ala Pro Lys Ala Ala Ala Ala Thr 20 25 30 Gly Phe Tyr Val Asn Gly Gly Lys Leu Tyr Asp Ser Thr Gly Lys Pro 35 40 45 Phe Tyr Met Arg Gly Ile Asn His Gly His Ser Trp Phe Lys Asn Asp 50 55 60 Leu Asn Thr Ala Ile Pro Ala Ile Ala Lys Thr Gly Ala Asn Thr Val 65 70 75 80 Arg Ile Val Leu Ser Asn Gly Thr Gln Tyr Thr Lys Asp Asp Leu Asn 85 90 95 Ser Val Lys Asn Ile Ile Asn Val Val Asn Ala Asn Lys Met Ile Ala 100 105 110 Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Lys Asp Asp Phe Asn Ser Leu 115 120 125 Asp Ala Ala Val Asn Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Glu Ala Leu Ile Gly 130 135 140 Lys Glu Asp Arg Val Ile Val Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly Thr 145 150 155 160 Trp Asn Gly Ser Ala Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Lys Ala Ile Pro Lys 165 170 175 Leu Arg Asp Ala Gly Ile Lys Asn Thr Leu Ile Val Asp Ala Ala Gly 180 185 190 Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser Ile Val Asp Tyr Gly Gln Ser Val Phe 195 200 205 Ala Ala Asp Ser Gln Lys Asn Thr Ala Phe Ser Ile His Met Tyr Glu 210 215 220 Tyr Ala Gly Lys Asp Ala Ala Thr Val Lys Ser Asn Met Glu Asn Val 225 230 235 240 Leu Asn Lys Gly Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gly Tyr His 245 250 255 Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu Tyr Ala Ile Met Lys Tyr Gly Leu Glu 260 265 270 Lys Gly Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr Gly Asn Ser Ser Gly 275 280 285 Leu Asn Tyr Leu Asp Leu Ala Thr Gly Pro Asn Gly Ser Leu Thr Ser 290 295 300 Tyr Gly Asn Thr Val Val Asn Asp Thr Tyr Gly Ile Lys Asn Thr Ser 305 310 315 320 Gln Lys Ala Gly Ile Phe 325 <210> 45 <211> 1110 <212> DNA <213> Bacillus nealsonii <400> 45 atggttgtga aaaaattatc aagttttatt ctaattttac tgttagttac ttctgctttg 60 tttattactg attcaaaagc aagtgctgct tcgggatttt atgtaagcgg taccacttta 120 tatgatgcaa cgggtaaacc gtttactatg agaggtgtaa atcatgctca ttcttggttt 180 aaagaagatt cagcagctgc tattccagca atagcagcaa ctggagcaaa cacagtaaga 240 attgttttat ctgatggtgg acaatacacc aaagatgata ttaatactgt taaaagcctt 300 ttgtcattgg cagaaaaaat aaacttgcat tctggagtca tgacgcacag aaaagacgat 360 gtggaatctt taaatcgtgc agtcgattat tggatcagct taaaagacac attgataggc 420 aaagaagata aagtgataat aaacattgcg aatgaatggt atggtacttg ggatggtgcg 480 gcatgggcag ctggttataa acaagctatt ccaaagttac ggaatgcagg cttaaatcat 540 actctaataa ttgattctgc tggatgggga caatacccag cttccattca taattatgga 600 aaagaggtat ttaatgcgga tccattgaaa aatacaatgt tctccataca tatgtatgag 660 tacgctggtg gggatgcagc aactgttaag tcaaatattg atggtgtctt aaaccaagga 720 ttagctttaa taataggaga gtttggacaa aaacatacaa atggagatgt agatgaagca 780 accatcatga gttattcaca gcaaaaaaat atcggttggc ttgcatggtc ttggaaagga 840 aatagcacag attggagcta tctggattta agcaacgatt ggtctggtaa cagtttaact 900 gattggggta atacggttgt taatggggca aatgggttaa aagccacttc aaaactaagc 960 ggagtattcg gtagctcagc aggaacaaat aatatattgt atgattttga aagcggtaat 1020 caaaactgga ctggatcaaa tatcgcgggt ggaccttgga acgaattcaa gcttgatatc 1080 attcaggacg agcctcagac tccagcgtaa 1110 <210> 46 <211> 369 <212> PRT <213> Bacillus nealsonii <400> 46 Met Val Val Lys Lys Leu Ser Ser Phe Ile Leu Ile Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Thr Ser Ala Leu Phe Ile Thr Asp Ser Lys Ala Ser Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Tyr Val Ser Gly Thr Thr Leu Tyr Asp Ala Thr Gly Lys Pro Phe 35 40 45 Thr Met Arg Gly Val Asn His Ala His Ser Trp Phe Lys Glu Asp Ser 50 55 60 Ala Ala Ala Ile Pro Ala Ile Ala Ala Thr Gly Ala Asn Thr Val Arg 65 70 75 80 Ile Val Leu Ser Asp Gly Gly Gln Tyr Thr Lys Asp Asp Ile Asn Thr 85 90 95 Val Lys Ser Leu Leu Ser Leu Ala Glu Lys Ile Asn Leu His Ser Gly 100 105 110 Val Met Thr His Arg Lys Asp Asp Val Glu Ser Leu Asn Arg Ala Val 115 120 125 Asp Tyr Trp Ile Ser Leu Lys Asp Thr Leu Ile Gly Lys Glu Asp Lys 130 135 140 Val Ile Ile Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly Thr Trp Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Trp Ala Ala Gly Tyr Lys Gln Ala Ile Pro Lys Leu Arg Asn Ala 165 170 175 Gly Leu Asn His Thr Leu Ile Ile Asp Ser Ala Gly Trp Gly Gln Tyr 180 185 190 Pro Ala Ser Ile His Asn Tyr Gly Lys Glu Val Phe Asn Ala Asp Pro 195 200 205 Leu Lys Asn Thr Met Phe Ser Ile His Met Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly 210 215 220 Asp Ala Ala Thr Val Lys Ser Asn Ile Asp Gly Val Leu Asn Gln Gly 225 230 235 240 Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gln Lys His Thr Asn Gly Asp 245 250 255 Val Asp Glu Ala Thr Ile Met Ser Tyr Ser Gln Gln Lys Asn Ile Gly 260 265 270 Trp Leu Ala Trp Ser Trp Lys Gly Asn Ser Thr Asp Trp Ser Tyr Leu 275 280 285 Asp Leu Ser Asn Asp Trp Ser Gly Asn Ser Leu Thr Asp Trp Gly Asn 290 295 300 Thr Val Val Asn Gly Ala Asn Gly Leu Lys Ala Thr Ser Lys Leu Ser 305 310 315 320 Gly Val Phe Gly Ser Ser Ala Gly Thr Asn Asn Ile Leu Tyr Asp Phe 325 330 335 Glu Ser Gly Asn Gln Asn Trp Thr Gly Ser Asn Ile Ala Gly Gly Pro 340 345 350 Trp Asn Glu Phe Lys Leu Asp Ile Ile Gln Asp Glu Pro Gln Thr Pro 355 360 365 Ala <210> 47 <211> 984 <212> DNA <213> Bacillus circulans <400> 47 atgatgttga tatggatgca gggatggaag tctattctag tcgcgatctt ggcgtgtgtg 60 tcagtaggcg gtgggcttcc tagtccagaa gcagccacag gattttatgt aaacggtacc 120 aagctgtatg attcaacggg caaggccttt gtgatgaggg gtgtaaatca tccccacacc 180 tggtacaaga atgatctgaa cgcggctatt ccggctatcg cgcaaacggg agccaatacc 240 gtacgagtcg tcttgtcgaa cgggtcgcaa tggaccaagg atgacctgaa ctccgtcaac 300 agtatcatct cgctggtgtc gcagcatcaa atgatagccg ttctggaggt gcatgatgcg 360 acaggcaaag atgagtatgc ttcccttgaa gcggccgtcg actattggat cagcatcaaa 420 ggggcattga tcggaaaaga agaccgcgtc atcgtcaata ttgctaatga atggtatgga 480 aattggaaca gcagcggatg ggccgatggt tataagcagg ccattcccaa attaagaaac 540 gcgggcatta agaatacgtt gatcgttgat gcagcgggat gggggcaata cccgcaatcc 600 atcgtggatg agggggccgc ggtatttgct tccgatcaac tgaagaatac ggtattctcc 660 atccatatgt atgagtatgc cggtaaggat gccgctacgg tgaaaacgaa tatggacgat 720 gttttaaaca aaggattgcc tttaatcatt ggggagttcg gcggctatca tcaaggtgcc 780 gatgtcgatg agattgctat tatgaagtac ggacagcaga aggaagtggg ctggctggct 840 tggtcctggt acggaaacag cccggagctg aacgatttgg atctggctgc agggccaagc 900 ggaaacctga ccggctgggg aaacacggtg gttcatggaa ccgacgggat tcagcaaacc 960 tccaagaaag cgggcattta ttaa 984 <210> 48 <211> 327 <212> PRT <213> Bacillus circulans <400> 48 Met Met Leu Ile Trp Met Gln Gly Trp Lys Ser Ile Leu Val Ala Ile 1 5 10 15 Leu Ala Cys Val Ser Val Gly Gly Gly Leu Pro Ser Pro Glu Ala Ala 20 25 30 Thr Gly Phe Tyr Val Asn Gly Thr Lys Leu Tyr Asp Ser Thr Gly Lys 35 40 45 Ala Phe Val Met Arg Gly Val Asn His Pro His Thr Trp Tyr Lys Asn 50 55 60 Asp Leu Asn Ala Ala Ile Pro Ala Ile Ala Gln Thr Gly Ala Asn Thr 65 70 75 80 Val Arg Val Val Leu Ser Asn Gly Ser Gln Trp Thr Lys Asp Asp Leu 85 90 95 Asn Ser Val Asn Ser Ile Ile Ser Leu Val Ser Gln His Gln Met Ile 100 105 110 Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Lys Asp Glu Tyr Ala Ser 115 120 125 Leu Glu Ala Ala Val Asp Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Gly Ala Leu Ile 130 135 140 Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Val Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly 145 150 155 160 Asn Trp Asn Ser Ser Gly Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Gln Ala Ile Pro 165 170 175 Lys Leu Arg Asn Ala Gly Ile Lys Asn Thr Leu Ile Val Asp Ala Ala 180 185 190 Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser Ile Val Asp Glu Gly Ala Ala Val 195 200 205 Phe Ala Ser Asp Gln Leu Lys Asn Thr Val Phe Ser Ile His Met Tyr 210 215 220 Glu Tyr Ala Gly Lys Asp Ala Ala Thr Val Lys Thr Asn Met Asp Asp 225 230 235 240 Val Leu Asn Lys Gly Leu Pro Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gly Tyr 245 250 255 His Gln Gly Ala Asp Val Asp Glu Ile Ala Ile Met Lys Tyr Gly Gln 260 265 270 Gln Lys Glu Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr Gly Asn Ser Pro 275 280 285 Glu Leu Asn Asp Leu Asp Leu Ala Ala Gly Pro Ser Gly Asn Leu Thr 290 295 300 Gly Trp Gly Asn Thr Val Val His Gly Thr Asp Gly Ile Gln Gln Thr 305 310 315 320 Ser Lys Lys Ala Gly Ile Tyr 325

Claims (12)

  1. 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 효소를 포함하는 세제 조성물로, 상기 효소는 만난(mannan) 분해 활성을 가지는, 세제 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 프로테아제(protease), 리파아제(lipase), 큐티나아제(cutinase), 아밀라아제(amylase), 카보하이드라아제(carbohydrase), 셀룰라아제(cellulase), 펙티나아제(pectinase), 펙타틀리아제(pectatlyase), 만나나아제(mannanase), 아라비나아제(arabinase), 갈락타나아제(galactanase), 자일라나아제(xylanase), 옥시다아제 (oxidase), 잔타나아제(xanthanase), 락카아제(laccase), 및 퍼옥시다아제(peroxidase)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 추가적인 효소를 더 포함하는 세제 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 바(bar), 균질의 정제(homogenous tablet), 둘 이상의 층을 가지는 정제(tablet having two or more layers), 둘 이상의 구획을 가지는 파우치(pouch having one or more compartments), 일반 또는 컴팩트 분말(regular or compact powder), 과립(granule), 페이스트(paste), 겔(gel), 또는 일반, 컴팩트 또는 농축액(regular, compact or concentrated liquid) 형태인 세제 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세제 조성물은 세탁 세제 조성물인 세제 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세제 조성물은 액체 또는 고체 세탁 세제 조성물인 세제 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항에 따른 세제 조성물을 표면에 접촉시키는 단계를 포함하는, 표면으로부터 얼룩(stain)을 제거하는 방법.
  11. 제1항에 따른 세제 조성물을 만난에 적용하는 단계를 포함하는 만난을 분해하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 만난은 직물(textile) 표면에 있는 것을 특징으로 하는 만난을 분해하는 방법.
KR1020197029962A 2017-04-05 2018-03-01 박테리아 만나나아제를 포함하는 세제 조성물 KR102522947B1 (ko)

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