BRPI0707202A2 - variante, seqüência de dna, vetor de expresseão, célula hospedeira transformada, e, método de produzir uma variante de lìpase - Google Patents

Abstract

VARIANTE, SEQUêNCIA DE DNA, VETOR DE EXPRESSãO, CéLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, E, MéTODO DE PRODUZIR UMA VARIANTE DE LìPASE. A invenção fornece variantes de lipase, preferivelmente, variantes com tendência reduzida por gerar odor obtido pela introdução de mutações e uma ou mais regiões identificadas em um origem de lipase.

Description

"VARIANTE, SEQÜÊNCIA DE DNA5 VETOR DE EXPRESSÃO,CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, E, MÉTODO DEPRODUZIR UMA VARIANTE DE LÍPASE"CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a variantes de lipase.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Lipases são úteis, por exemplo, como enzimas detergentespara remover lipídeos ou manchas de gordura de roupas e outros têxteis,como aditivos para a massa de pão e outros produtos assados. Desta maneira,a lipase derivada de Thermomyces lanuginosus (sinônimo Humicolalanuginosa, EP 258 068 e EP 305 216) é vendida para o uso detergente sob onome comercial Lipolase (produto da Novo Nordisk A/S), WO 0060063descreve variantes da lipase T. lanuginosus com uma primeira boa lavagemparticularmente desempenhada em uma solução detergente. WO 9704079,WO 9707202 e WO 0032758 também divulgam variantes da lipase T.lanuginosus.

Em algumas aplicações, é de interesse minimizar a formaçãoda geração de odor por ácidos graxos de cadeia curta. Desta maneira, éconhecido que detergentes de lavagem de roupas com lipases podem algumasvezes deixar odores residuais ligados às roupas manchadas com leite (EP430315). O WO 02062973 divulga variantes de lipase onde a geração de odorfoi reduzida pela ligação de uma extensão de terminal C.SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores observaram que pela introdução de mutações emcertas regiões/posições de uma lipase é possível melhorar as propriedades oucaracterísticas da lipase.

Em uma forma de realização preferida, a presente invenção dizrespeito a lipases fornecendo propriedades melhoradas para o uso emdetergentes. Por exemplo, a invenção fornece variantes com tendênciareduzida por gerar odor obtida pela introdução mutações e uma ou maisregiões identificadas na origem de lipase. Em outra forma de realizaçãopreferida, a presente invenção fornece variantes de lipase que, comocomparadas à origem de lipase, tiveram o potencial reduzido para adegradação sem a ligação de uma extensão de terminal C.

Em um outro aspecto a invenção diz respeito a uma seqüênciade DNA que codifica a variante de lipase da invenção, um vetor de expressãoabriga a dita seqüência de DNA e uma célula hospedeira transformadacontendo uma seqüência de DNA ou o vetor de expressão.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método deproduzir as variantes de lipase da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra o alinhamento das lipases.LISTAGENS DE SEQÜÊNCIA

A SEQ ID N°: 1 mostra a lipase que codifica a seqüência deDNA de Thermomyces lanoginosus.

A SEQ ID N0: 2 mostra uma seqüência de aminoácido de umalipase de Thermomyces lanoginosus.

A SEQ ID N°: 3 mostra uma seqüência de aminoácido de umalipase de Absidia reflexa.

A SEQ ID N°: 4 mostra uma seqüência de aminoácido de umalipase de Absidia corymbifera.

A SEQ ID N°: 5 mostra uma seqüência de aminoácido de umalipase de Rhizomucor miehei.

A SEQ ID N°: 6 mostra uma seqüência de aminoácido de umalipase de Rhizopus oryzae.

A SEQ ID N°: 7 mostra uma seqüência de aminoácido de umalipase de Aspergilius niger.

A SEQ ID N°: 8 mostra uma seqüência de aminoácido de umalipase de Aspergillus tubingensis.

A SEQ ID N°: 9 mostra uma seqüência de aminoácido de umalipase de Fusarium oxysporrum.

A SEQ ID N°: 10 mostra uma seqüência de aminoácido deuma lipase de Fusarium heterosporum.

A SEQ ID N°: 11 mostra uma seqüência de aminoácido deuma lipase de Aspergillus oryzae.

A SEQ ID N0: 12 mostra uma seqüência de aminoácido deuma lipase de Penicillium camemberti.

A SEQ ID N°: 13 mostra uma seqüência de aminoácido deuma lipase de Aspergillus foetidus.

A SEQ ID NO; 14 mostra uma seqüência de aminoácido deuma lipase de Aspergillus niger.

A SEQ ID N°: 15 mostra uma seqüência de aminoácido deuma lipase de Aspergillus oryzae.

A SEQ ID N°: 16 mostra uma seqüência de aminoácido deuma lipase de Landerina penisapora.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Origem de lipases

Qualquer origem de lipase adequada pode ser usada. Em umaforma de realização preferida, a origem de lipase pode ser uma lipase fungica.Em outra forma de realização preferida, a origem de lipase pode ser a lipasecom uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%,85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou ainda 100% de homologia comodefinido na seção "Homologia e alinhamento" à seqüência de lipase T.lanuginosus mostrada na SEQ ID N°: 2.

A origem de lipase pode ser um polipeptídeo de levedura talcomo um polipeptídeo Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces,Schizosaccharomyces, ou Yarrowia; ou mais preferivelmente um polipeptídeofungico filamentoso tal como um polipeptídeo Acremonium, Aspergillus,Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola,Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora,Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces,Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma.

Em um aspecto preferido, a origem de lipase é umpolipeptídeo Saccharomyces carisbergensis, Saccharomyces cerevisiae,Saccharomyees diastaticus, Saccharomyees douglasii, Saccharomyeeskluyveri, Saccharomyees norbensis, ou Saccharomyees oviformis tendoatividade de lipase.

Em um outro aspecto preferido, a origem de lipase é umpolipeptídeo Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillusfumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans,Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusariumculmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusariumheterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusariumreticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusariumsareoehroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusariumtorulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicolainsolens, Thermomyces lanoginosus (sinônimo: Humicola lanuginose), Mucormiehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicilliumpurpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichodermalongibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

Em um outro aspecto preferido, a origem de lipase é umalipase Thermomyces.

Em um aspecto mais preferido, a origem de lipase é uma lipaseThermomyces lanuginosus. Em uma forma de realização ainda mais preferidaa origem de lipase é a lipase da SEQ ID N°: 2.Variantes de lipases

As variantes de lipase da presente invenção compreendem, emcomparação com a origem de lipase, pelo menos três substituiçõesselecionadas do grupo que consiste de:

a) pelo menos duas substituições na região I, e

b) pelo menos uma substituição na região II, e

c) pelo menos uma substituição na região III, e

d) pelo menos uma substituição na região IV;e em que as variantes tem atividade de lipase.

Em uma forma de realização preferida, a variante de lipase éuma variante de uma lipase Thermomyces, mais preferivelmente, uma lipaseT. lanuginosus, e ainda mais preferivelmente, a lipase T. Ianuginosusmostrada na SEQ ID N°: 2. Em uma forma de realização preferida a variantede lipase tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 97%,98% ou 99% da identidade da SEQ ID N°:2.

A variante de lipase pode ser uma variante de uma origem delipase codificada por um gene derivado/obtido a partir de um dos organismosde origem seguintes: Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces,Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, Acremonium, Aspergillus,Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola,Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospara,Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces,Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma. Em uma forma derealização preferida, a variante de lipase tem pelo menos 50%, 60%, 70%,80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade à uma origemde lipase codificada por um gene derivado/obtido a partir de um dosorganismos de origem seguintes: Candida, Kluyveromyces, Pichia,Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, Acremonium,Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium,Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix,Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum,Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma.

Em um aspecto preferido, a variante de lipase é um varianteSaccharomyces carlsbergensis, Saccharomyees cerevisiae, Saccharomyeesdiastaticus, Saccharomyees douglasii, Saceharomyces kluyveri,Saccharomyees norbensis, ou Saccharomyees oviformis. Em uma forma derealização preferida, a variante de lipase tem pelo menos 50%, 60%, 70%,80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade à uma origemde lipase codificada por um gene derivado/obtido de Saccharomycescarlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saecharomyces diastaticus,Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomycesnorbensis, ou Saccharomyces oviformis.

A variante de lipase pode ser uma variante de uma origem delipase codificada por um gene derivado/obtido a partir de um dos organismosde origem seguintes: Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillusfumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans,Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusariumbactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusariumculmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusariumheterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusariumreticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusariumsarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusariumtorulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicolainsolens, Thermomyces lanoginosus (sinônimo: Humicola lanuginose), Mucormiehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicilliumpurpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichodermalongibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride. Em uma formade realização preferida, a variante de lipase tem pelo menos 50%, 60%, 70%,80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade á uma origemde lipase codificada por um gene derivado/obtido a partir de um dosorganismos de origem seguintes: Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori,Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus,Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillusturbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusariumcrookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusariumgraminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum,Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusariumsarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusariumtorulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicolainsolens, Thermomyces lanoginosus (sinônimo: Humicola lanuginose), Mucormiehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicilliumpurpurogenum, Trichoderma harzianum, Triehoderma koningii, Trichodermalongibrachiatum, Triehoderma reesei ou Triehoderma viride.

Em um outro aspecto preferido, a variante é uma variante deuma lipase Thermomyces.

Em um aspecto mais preferido, a origem de lipase é uma lipasede Thermomyces lanuginosus. Em uma forma de realização ainda maispreferida a origem de lipase é a lipase da SEQ ID N°: 2.

Identificação de regiões e substituições

As posições referidas em uma Região I através da Região IVabaixo são as posições dos resíduos de aminoácido na SEQ ID N0:2. Paraobservar as posições correspondentes (ou homólogas) em uma lipasediferente, o procedimento descrito em "Homologia e alinhamento" é usado.Substituições na Região I

A Região I consiste de resíduos de aminoácidos adjacentes aoresíduo El do terminal N. Nesta região, é preferido substituir um aminoácidode uma origem de lipase com um aminoácido mais positivo. A variante delipase pode compreender pelo menos duas substituições na Região I, tal comotrês, quatro, cinco ou seis substituições na Região I.

Os resíduos de aminoácidos correspondentes às posiçõesseguintes são compreendidos pela Região I: 1, 2 a 11 e 223 a 239. Asposições seguintes são de interesse particular: 1, 4, 8, 11, 223, 227, 229, 231,233, 234, 236.

Em particular as substituições seguintes foram identificadas:XlN/* X4V, X227G, X231R e X233R.

Em uma forma de realização preferida a variante de lipase tempelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% da identidade daSEQ ID N0:2

Em uma forma de realização mais preferida a variante delipase é uma variante de lipase tendo a seqüência de aminoácido da SEQ IDN°: 2.

Substituições na Região II

A Região II consiste de resíduos de aminoácidos em contatocom substrato em uma cadeia de acila secundária e uma parte de álcoolsecundário. Nesta região é preferido substituir um aminoácido de uma origemde lipase com um aminoácido mais positivo ou com um aminoácido menoshidrofóbico.

A variante de lipase pode compreender pelo menos umasubstituição na região tal como duas, três, quatro, cinco ou seis substituiçõesna Região II.

Os resíduos de aminoácidos correspondentes às posiçõesseguintes são compreendidos pela Região II: 202 a 211 e 249 a 269. Asposições seguintes são de interesse particular: 202, 210, 211, 253, 254, 255,256.

Em particular as substituições seguintes foram identificadas:X202G, X210K/W/A, X255Y/V/A e X256K/R e X259G/M/Q/V.Em uma forma de realização preferida a variante de lipase tempelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade daSEQ ID N0:2

Em uma forma de realização mais preferida a variante delipase é uma variante de lipase tendo a seqüência de aminoácido da SEQ IDN°: 2.

Substituições na Região III

A Região III consiste de resíduos de aminoácidos que formamuma estrutura flexível e deste modo permitem o substrato conseguir um localativo. Nesta região é preferido substituir um aminoácido de uma origem delipase com um aminoácido mais positivo ou um aminoácido menoshidrofóbico.

A variante de lipase pode compreender pelo menos umasubstituição na região III, tal como duas, três, quatro, cinco ou seissubstituições na Região III.

Os resíduos de aminoácidos correspondentes às posiçõesseguintes são compreendidos pela Região III: 82 a 102. As posições seguintessão de interesse particular: 83, 86, 87, 90, 91, 95, 96, 99.

Em particular as substituições seguintes foram identificadas:X83T, X86V e X90A/R.

Em uma forma de realização preferida a variante de lipase tempelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade daSEQ ID N0:2

Em uma forma de realização mais preferida a variante delipase é uma variante de lipase tendo a seqüência de aminoácido da SEQ IDN°: 2.

Substituições na Região IV

A Região IV consiste de resíduos de aminoácido que ligam-seeletrostaticamente à superfície. Nesta região é preferido substituir umaminoácido de uma origem de lipase com um aminoácido mais positivo.

A variante de lipase pode compreender pelo menos umasubstituição na região IV, tal como duas, três, quatro, cinco ou seissubstituições na Região IV.

Os resíduos de aminoácidos correspondentes às posiçõesseguintes são compreendidos pela Região IV: 27 e 54 a 62. As posiçõesseguintes são de interesse particular: 27, 56, 57, 58, 60.

Em particular as substituições seguintes foram identificadas:X27R, X58N/AG/T/P e X60V/S/G/N/R/K/A/L.

Em uma forma de realização preferida a variante de lipase tempelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade daSEQ ID NQ:2

Em uma forma de realização mais preferida a variante delipase é uma variante de lipase tendo a seqüência de aminoácido da SEQ IDN°: 2.

Aminoácidos em outras posições

A origem de lipase pode opcionalmente compreenderalterações adicionais, por exemplo, substituição de outro aminoácido,particularmente menos do que 10, menos do que 9, menos do que 8, menos doque 7, menos do que 6, menos do que 5 alterações como comparados à umaorigem de lipase. Os exemplos são substituições correspondentes de uma oumais posições 24, 37, 38, 46, 74, 81, 83, 115, 127, 131, 137, 143, 147, 150,199, 200, 203, 206, 211, 263, 264, 265, 267 e 269 da origem de lipase. Emuma forma de realização particular aqui é uma substituição de pelo menosuma da posição correspondente à posição 81, 147, 150, 227 e 249. Em umaforma de realização preferida pelo menos uma substituição é selecionada dogrupo que consiste de X38R, X81Q/E, X143 S/C/N/D/A, X147M/Y,X150G/K, X227G e X249R/I/L.

A variante pode compreender substituições fora da Região I aIV definida; o número de substituições fora da Região I a IV definida épreferivelmente menos do que seis, tal como cinco, quatro, três, duas ou umasubstituição.

As substituições adicionais podem, por exemplo, ser feitas deacordo com o princípio conhecido na técnica, por exemplo, substituiçõesdescritas em WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 eWO 97/07202.

Origem de variantes de lipase

As variantes de lipases incluem origem de lipases tendo assubstituições listadas na tabela 1 abaixo (usando SEQ ID N°: 2 paranumeração).

Tabela 1

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Em uma outra forma de realização particular, a origem delipase é idêntica à SEQ ID N0:2, e as variantes da Tabela 1 serão deste modo:Tabela 2; Algumas das variantes particulares da SEQ ID N°:2

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Nomenclatura para modificações de aminoácido

Em descrição as variantes de lipase de acordo com a invenção,a nomenclatura seguinte é usada para facilitar a referência:

Aminoácido original (s): posição (s): aminoácido substituído(s)

De acordo com esta nomenclatura, por exemplo a substituiçãode ácido glutâmico para glicina na posição 195 é mostrada como G195E. Aanulação da glicina na mesma posição é mostrada como Gl95*, e a inserçãode um resíduo de aminoácido adicional tal como lisina é mostrada comoG195GK.

Onde uma lipase específica contém uma "anulação" emcomparação com outras lipases e uma inserção é feita em uma tal posição estaé indicada como *36D para inserção de um ácido aspártico na posição 36.

As mutações múltiplas são separadas por sinais de adição, istoé: R170Y+G195E, representando mutações nas posições 170 e 195 desubstituição de tirosina e ácido glutâmico para arginina e glicina,respectivamente.

O X231 indica que o aminoácido em uma origem depolipeptídeo correspondente à posição 231, quando aplica o procedimento dealinhamento descrito. O X231R indica que o aminoácido é substituído com R.Para a SEQ ID N°: 2 X é T, e X231R deste modo indica uma substituição deT na posição 231 com R. Onde o aminoácido em uma posição (por exemplo,231) pode ser substituído por um outro aminoácido selecionado a partir de umgrupo de aminoácidos, por exemplo, o grupo que consiste de R e P e Y, e seráindicado por X231 R/P/Y

Em todos os casos, a letra simples IUPAC aceitável ou letratripla de abreviação de aminoácido é utilizado.

Disposição de aminoácido

Nesta especificação, os aminoácidos são classificados comocarga negativa, carga positiva ou eletricamente neutra de acordo com suacarga elétrica em pH 10. Desta maneira, os aminoácidos negativos são E, D,C (cisteína) e Y, particularmente E e D. Os aminoácidos positivos são R, K eH, particularmente R e K. Os aminoácidos neutros são G, A, V, L, I, P, F, W,S, Τ, Μ, N, Q e C quando parte de formação de uma ponte de bissulfeto. Umasubstituição com um outro aminoácido no mesmo grupo (negativo, positivoou neutro) é denominado uma substituição conservativa.

Os aminoácidos neutros podem ser divididos em hidrofóbicosou não polares (G, A, V, L, I, P, F, W e C como partes de uma ponte debissulfeto) e hidrofílicos ou polares (S, Τ, Μ, N, Q).Identidade de aminoácido

A relação entre duas seqüências de aminoácidos ou entre duasseqüências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro de "identidade".

Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento deduas seqüências de aminoácidos é determinada pelo uso do programa deNeedle a partir da embalagem EMBOSS (http://embass.org) versão 2,8,0. Osimplementos do programa de Needle, o algoritmo de alinhamento globaldescrito em Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mal, Biel, 48, 443-453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, a penalidade de aberturada fenda é 10, a penalidade da extensão da fenda é 0,5.

O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácido dapresente invenção ("seqüência da invenção"; por exemplo, aminoácidos 1 a269 da SEQ ID N0:2) e uma seqüência de aminoácido diferente ("seqüênciaestranha") é calculada com o número de equiparações exatas em umalinhamento de duas seqüências, dividido pelo comprimento da "seqüência dainvenção" ou comprimento da "seqüência estranha", quaisquer que sejammais curtas. O resultado é expressado em identidade percentual.

Em equiparações exatas ocorre quando a "seqüência dainvenção" e a "seqüência estranha" tem resíduos de aminoácidos idênticos nasmesmas posições do sobreposto. O comprimento de uma seqüência é onúmero de resíduos de aminoácidos na seqüência (por exemplo, ocomprimento da SEQ ID N0:2 é 269).

O procedimento acima pode ser usado pelo cálculo daidentidade bem como homologia e por alinhamento. No contexto da presenteinvenção homologia e alinhamento foram calculados como descrito abaixo.Homologia e alinhamento

Para os propósitos da presente invenção, o grau de homologiapode ser determinado adequadamente pelo meios de programas decomputador conhecidos na técnica, tal como GAP fornecido na embalagemdo programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8,August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison,Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journalof Molecular Biology, 48, 443-45), usando GAP com os seguintes ajustespara comparação de seqüência de polipeptídeo: A penalidade de criação deGAP de 3,9 e penalidade de extensão de GAP de 0,1.

Em uma presente invenção, posições correspondentes (ouhomólogas) nas seqüências de lipase de Absidia reflexa, Absidia corymbefera,Rhizmucor miehei, Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillustubigensis, Rusarium oxysporurn, Rusarium heterosporum, Aspergillusoryzea, Penicilium eamembertii, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger,Thermomyces lanoginosus (sinônimo: Humicola lanuginose) e Landerinapenisapora são definidos pelo alinhamento mostrado na Figura 1.

Para observar as posições homólogas nas seqüências de lipasenão mostradas no alinhamento, a seqüência de interesse é alinhado àseqüência mostrada na Figura 1. A nova seqüência é alinhada ao alinhamentopresente na Figura 1 pelo uso do alinhamento GAP às seqüências maishomólogas observadas pelo programa GAP. O GAP é fornecido naembalagem do programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package,Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive,Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, CD., (1970),Journal of Molecular Biology, 48, 443-45). Os seguintes ajustes são usadospor comparação de seqüência de polipeptídeo: A penalidade de criação deGAP de 3,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,1.Hibridização

A presente invenção também diz respeito a polipeptídeosisolados tendo atividade de lipase que são codificados por polinucleotídeosque hibridizam-se sob condições de estringência muito baixas,preferivelmente condições de estringência baixas, mais preferivelmentecondições de estringência médias, mais preferivelmente condições deestringência média altas, ainda mais preferivelmente condições deestringência altas e mais preferivelmente condições de estringência muitoaltas (i) nucleotídeos de 178 a 660 da SEQ ID N°: 1, (ii) a seqüência decDNA contida nos nucleotídeos de 178 a 660 da SEQ ID N°: 1, (iii) umasubseqüência de (i) ou (ii) ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii) ou(iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, ALaboratory Manual, 2o edição, Cold Spring Harbor, New York). Umasubseqüência de SEQ ID N°: 1 contém pelo menos 100 nucleotídeoscontíguos ou preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Alémdisso, a subseqüência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que tematividade de lipase.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos decomprimento, as condições de estringência de muito baixa a muito alta sãodefinidas como a pré-hibridização e a hibridização a 42° C em 5X de SSPE,0,3% de SDS, 200 ug/ml dividido em DNA de esperma de salmãodesnaturado e 25% de formamida para estringências muito altas e muitobaixas, 35% de formamida para estringências médias e médias-altas ou 50%de formamida para estringências altas e muito altas, seguindo osprocedimentos de Southern blotting padrão por 12 a 24 horas otimamente.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos decomprimento, o material carregador é finalmente lavado três vezes cada por15 minutos usando-se 2X de SSC, 0,2% de SDS preferivelmente pelo menos a45° C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50° C(estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55° C (estringênciamédia), mais preferivelmente pelo menos a 60° C (estringência média-alta),ainda mais preferivelmente pelo menos a 65° C (estringência alta) e maispreferivelmente pelo menos em 70° C (estringência muito alta).Seqüência de DNA, Vetor de expressão, Célula hospedeira, Produção delipase

A invenção fornece uma seqüência de DNA que codifica alipase da invenção, um vetor de expressão que abriga a seqüência de DNA euma célula hospedeira transformada contendo a seqüência de DNA ou o vetorde expressão. Estes podem ser obtidos pelos métodos conhecidos na técnica.A invenção também fornece um método de produzir a lipasepelo cultivo da célula hospedeira transformada sob condições condutoras paraa produção da lipase e recuperação da lipase a partir do caldo resultante. Ométodo pode ser praticado de acordo com os princípios conhecidos na técnica.

Atividade de lipase

Atividade de lipase em tributirina em pH neutro (LU)

Um substrato para lipase é preparado pela emulsificação datributirina (tributirato de glicerina) usando-se goma Arábica como oemulsificador. A hidrólise de tributirina a 30° C em pH 7 ou 9 é seguida emum experimento de titulação de pH-stat. Uma unidade de atividade de lipase(1 LU) iguala a quantidade de enzima capaz de liberar 1 micro mol de ácidobutírico/minuto em pH 7.

Risco Benefício

O fator Risco Benefício que descreve o desempenhocomparado com o risco reduzido quanto ao cheiro do odor é definido como:

BR — RPavg/R, como descrito abaixo.

Usos

As enzimas da presente invenção podem encontrar usoindustrial, por exemplo, serem incluídas nas composições de detergente para aremoção de qualquer matéria graxa.

EXEMPLOS

Os produtos químicos usados como tampões e substratosforam os produtos comerciais pelo menos de grau de reagente.

Meios e Soluções

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Outros ingredientes usados são regentes de laboratório padrão.Materiais

Produto Fornecedor

EMPA22I EMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St. Gallen,Suíça

Exemplo 1

Produção de enzima

Um plasmídeo contendo o gene que codifica a lipase éconstruído e transformado em uma célula hospedeira adequada usando-semétodos padrão da técnica.

A fermentação é realizada como uma fermentação por bateladaalimentada usando-se uma temperatura média constante de 34° C em umvolume inicial de 1,2 litro. O pH inicial do meio é ajustado a 6,5. Uma vezque o pH aumentou a 7,0 este valor é mantido através da adição de 10% deH3P04. O nível de oxigênio dissolvido no meio é controlado variando-se ataxa de agitação e usando-se uma taxa de aeração fixa de 1,0 litro de ar porlitro de meio por minuto. A taxa de adição de alimentação é mantida em umnível constante durante a fase de batelada de alimentação total.

O meio de batelada contém xarope de maltose como a fonte decarbono, uréia e extrato de levedura como a fonte de nitrogênio e uma misturade metais e sais traço. A alimentação adicionada de maneira contínua durantea fase de batelada de alimentação contém xarope de maltose visto que oextrato de levedura e uréia é adicionado a fim de garantir um fornecimentosuficiente de nitrogênio.

A purificação da lipase pode ser realizada pelo uso de métodospadrão conhecidos na técnica, por exemplo, pela filtração do sobrenadante defermentação e cromatografia hidrofóbica e cromatografia trocadora de íon,por exemplo, como descrito no EP 0 851 913 EP, Exemplo 3.

Exemplo 2

AMSA - Ensaio de Tensão Mecânica Automatizada - para o cálculo deDesempenho Relativo (RP)

As enzimas variantes do presente pedido são testados usando-se o Ensaio de Tensão Mecânica Automatizado (AMSA). com o teste AMSAo desempenho de lavagem de uma grande quantidade de soluções de enzima-detergente de volume pequeno pode ser examinado. A placa AMSA têmdiversas fendas para as soluções de teste e uma tampa que comprimefirmemente a amostra de tecido a ser lavada contra todas as aberturas defenda. Durante o período de lavagem, a placa, as soluções de teste, os têxteis ea tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste emcontato com o têxtil e aplicar tensão mecânica. Para a descrição adicional ver,WO 02/42740 especialmente o parágrafo "Formas de realização de métodoespeciais" nas páginas 23-24. Os recipientes que contém a solução de teste dedetergente, consistem de orifícios cilíndricos (6 mm de diâmetro, 10 mm deprofundidade) em uma placa metálica. O tecido tingido (material de teste) estána parte superior das placas metálicas e é usado como uma tampa e sela osrecipientes. Uma outra placa metálica está no topo do tecido tingido paraevitar qualquer derramamento de cada recipiente. As duas placas metálicasjuntas com o tecido tingido são submetidos à vibração para cima e para baixoem uma freqüência de 30 Hz com uma amplitude de 2 mm.

O ensaio é conduzido sob as condições experimentaisespecificadas abaixo:

Tabela 3

<table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>

As amostras turméricas creme foram preparadas misturando-se5 g de turmérico (Santa Maria, Denmark) com 100 g de creme (38% degordura, Aria, Denmark} a 50° C, a mistura foi deixada nesta temperatura porcerca de 20 minutos e filtrada (50° C) para remover quaisquer partículas nãodissolvidas. A mistura é esfriada a 20 0 C e amostras de algodão tecidas,EMPA221, foram imersas na mistura creme-turmérica e posteriormentedeixadas secar em temperatura ambiente durante a noite e congeladas até ouso. A preparação de amostras creme-turméricas é divulgada na patente WO2006/125437.

O desempenho da amostra variante é medido como a claridadeda cor das amostras têxteis lavadas com aquela enzima variante específica. Aclaridade também pode ser expressada como a intensidade da luz refletida apartir da amostra têxtil quando iluminada com luz branca. Quando o têxtil étingido, a intensidade da luz refletida é menor, do que aquela de um têxtillimpo.

Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada paramedir o desempenho de lavagem de uma enzima variante.

As medições de cor são feitas com um scanner de leito planoprofissional (PFU DL2400pro), que é usado para capturar uma imagem dasamostras de tecido lavadas. As varreduras são feitas com uma resolução de200 dpi e com uma profundidade de cor de saída de 24 bits. A fim deconseguir resultados precisos, o scanner é freqüentemente calibrado com umaalvo IT8 refletivo Kodak.

Para extrair um valor quanto à intensidade de luz a partir dasimagens escaneadas, uma aplicação de software projetado especial é usada(Novozymes Color Vector Analyzer). O programa recupera os valores depixel de 24 bits a partir da imagem e os converte em valores para vermelho,verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) é calculado pela adição dosvalores RGB junto como vetores e então tomando-se o comprimento do vetorresultante:

<formula>formula see original document page 22</formula>

O desempenho de lavagem (P) das variantes é calculado deacordo com a fórmula abaixo:

<formula>formula see original document page 22</formula>

onde

Int(v) é o valor de intensidade de luz da superfície têxtil lavadacom enzima e

Int(r) é o valor de intensidade de luz da superfície têxtil lavadasem a enzima.

Um registro de desempenho relativo é dado como o resultadoda lavagem AMSA de acordo com a definição:

Os registros de desempenho relativo (RP) são somados aosdesempenhos (P) das variantes de enzima testadas contra a enzima dereferência:

RP = P(enzima de teste)/P(enzima de referência).RPavg indica o desempenho médio relativo em comparaçãocom a enzima de referência em todas as três concentrações de enzima (0,125,0,25, 0,5, 1,0 mg ep/1)

RPavg = avg(RP(0,125), RP(0,25) RP(0,5), RP(I5O))Uma variante é considerada apresentar desempenho delavagem melhorado, se esta tiver desempenho melhor do que a referência.

No contexto da presente invenção, a enzima de referência é aparte madura da SEQ ID N0:2 com as substituições T23IR + N233R.

Exemplo 3GC - Cromatografia a Gás - para o cálculo do fator de risco

A liberação de ácido butírico das amostras lavadas com lipaseforam medidas pela Cromatografia Gasosa de Micro Extração de Fase Sólida(SPME-GC) usando-se o seguinte método. Quatro pedaços têxteis (5 mm dediâmetro), lavados na solução especificada na Tabela 1 contendo 1 mg/l delipase, foram transferidos a um frasco de Cromatografia Gasosa (GC). Asamostras foram analisadas em um Varian 3800 GC equipado com uma colunaStabilwax- DA w/integra-Guard (30 m, 0,32 mm de ID e 0,25 micro-m df) euma fibra Carboxen PDMS SPME (75 micro-m). Cada amostra foi pré-incubada por 10 minutos a 40°C seguido por 20 minutos de amostragem coma fibra de SPME no espaço superior sobre os pedaços têxteis. A amostra foisubseqüentemente injetada na coluna (temperatura do injetor = 250°C). Fluxoda coluna = 2 ml de Hélio/min. Gradiente de temperatura do forno de coluna:0 min = 40° C, 2 min = 40° C, 22 min = 240°C, 32 min = 240°C. O ácidobutírico foi detectado pela detecção FID e a quantidade de ácido butírico foicalculada com base em uma curva padrão de ácido butírico.

O Odor do Desempenho de Risco, R, de uma variante de lipaseestá entre a quantidade de ácido butírico da amostra de tecido lavada com avariante de lipase e a quantidade de ácido butírico de uma amostra lavadacom a parte madura da lipase da SEQ ID N0: 2, após ambos os valores seremcorrigidos para a quantidade de ácido butírico liberado a partir de umaamostra de tecido não lavada com lipase. O risco (R) das variantes é calculadode acordo com a fórmula abaixo:

Odor = medido em micro g de ácido butírico desenvolvido em1 mg de proteína de enzima /1 corrigido para o branco

AlfaenzJma Je teste — Odorenzima ^e teste — Branco

AlfaenzJma (ie referência — Odorenzjma de referência — BranCO^ — Alfaenzima (je teste/AlfaenzJma de referência

Uma variante é considerada apresentar odor reduzido emcomparação com a referência, se o fator R for menor do que 1.

Exemplo 4

Atividade (LU) com relação à absorbância em 280 nm

A atividade de uma lipase com relação à absorbância em 280nm é determinada pelo seguinte ensaio:

LU/A280:

A atividade da lipase é determinada como descrito acima naseção Atividade de lipase. A absorbância da lipase em 280 nm é medida(A280) e a razão LU/A280 é calculada. O LU/A280 relativo é calculado comoo LU/A280 da variante dividida pelo LU/A280 de uma enzima de referência.No contexto da presente invenção a enzima de referência é a lipase da SEQID N0:2 com as substituições T23IR + N233R.

Exemplo 5

BR - Risco Benefício

O fator de Risco Benefício que descreve o desempenho emcomparação com o risco reduzido para o cheiro do odor é definido destamaneira como:

BR - RPAvg/R

Uma variante é considerada apresentar desempenho delavagem melhorado e odor reduzido, se o fator BR for maior do que 1.

Aplicando-se os método acima, os seguintes resultados foramobtidos:

Tabela 4

<table>table see original document page 24</column></row><table><table>table see original document page 25</column></row><table>

A lipase de referência e as variantes 7 e 8 na Tabela 4 sãodescritas no WO 2000/060063.

Exemplo 6

BR — Risco Benefício

O Risco Benefício foi medido pelas para as variantes listadasna Tabela 5. O fator de Risco Benefício foi medido da mesma maneira comodescrito no Exemplo 5 e foi observado estar acima de 1 para todas asvariantes listadas.

Tabela 5

<table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table>

A lipase de referência é descrita no WO 2000/060063.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Novozymes A/S

Novozymes North America, Inc.Vind, Jesper

Knotzel, Jurgen Carsten Franz

Borch, Kim

Svendsen, Allan

Callisen, Thomas Honger

Yaver, Debbie

Bjornvad, Mads Eskelund

Hansen, Peter Kamp

Ge, Haiyan

Lamsa, Michael

<120> Variantes de lipase

<130> 10928.204-W0

<160> 18

<170> PatentIn versão 3.4

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> Thermomyces lanuginosus<220>

<221> CDS

<222> (1)..(807)<220>

<221> mat_peptideo

<222> (1)..()

<4 00> 1

gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc aat ctc ttt gca cag tat 48Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr 1 5 10 15 tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat gat gcc cca gct ggt aca 96Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr 20 25 30 aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc CCC gag gta gag aag gcg gat 144Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp 35 40 45 gca acg ttt CtC tac tcg ttt gaa gac tct gga gtg ggc gat gtc acc 192Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr 50 55 60 ggc ttc Ctt gct ctc gac aac acg aac aaa ttg ate gtc ctc tct ttc 240Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe 65 70 75 80 cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg ate ggg aat Ctt aac ttc gac 288Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp 85 90 95 ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc tgc agg gga cat gac ggc 336Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly 100 105 110 ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat acg tta agg cag aag gtg 384Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val 115 120 125 gag gat gct gtg agg gag cat CCC gac tat cgc gtg gtg ttt acc gga 432Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly 130 135 140 cat age ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt gcc gga gca gac ctg cgt 480His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160 gga aat ggg tat gat ate gac gtg ttt tca tat ggc gcc CCC cga gtc 528Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val165 170 175 gga aac agg gct ttt gea gaa ttc ctg acc gta cag acc ggc gga aca 576Gly Asn Arg Ala 180 Phe Ala Glu Phe Leu 185 Thr Val Gln Thr Gly 190 Gly Thr ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att gtc CCt aga ctc ccg ccg 624Leu Tyr Arg 195 Ile Thr His Thr Asn 200 Asp Ile Val Pro Arg 205 Leu Pro Pro cgc gaa ttc ggt tac age cat tet age cca gag tac tgg ate aaa tet 672Arg Glu 210 Phe Gly Tyr Ser His 215 Ser Ser Pro Glu Tyr 220 Trp Ile Lys Ser gga acc Ctt gtc CCC gtc acc cga aac gat ate gtg aag ata gaa ggc 720Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile .Val Lys Ile Glu Gly 225 230 235 240 ate gat gcc acc ggc ggc aat aac cag CCt aac att ccg gat ate CCt 768Ile Asp Ala Thr Gly 245 Gly Asn Asn Gln Pro 250 Asn Ile Pro Asp Ile 255 Pro gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg aca tgt Ctt 807Ala His Leu Trp 260 Tyr Phe Gly Leu Ile 265 Gly Thr Cys Leu

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> Thermomyces Ianuginosus

<4 00> 2 Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala 20 Tyr Cys Gly Lys Asn 25 Asn Asp Ala Pro Ala 30 Gly ThrAsn Ile Thr 35 Cys Thr Gly Asn Ala 40 Cys Pro Glu Val Glu 45 Lys Ala AspAla Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr 50 55 60 Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe65 70 75 80Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp 85 90 95 Leu Lys Glu Ile 100 Asn Asp Ile Cys Ser 105 Gly Cys Arg Gly His 110 Asp GlyPhe Thr Ser 115 Ser Trp Arg Ser Val 120 Ala Asp Thr Leu Arg 125 Gln Lys ValGlu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly 130 135 140 His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg145 150 155 160Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val 165 170 175 Gly Asn Arg Ala 180 Phe Ala Glu Phe Leu 185 Thr Val Gln Thr Gly 190 Gly ThrLeu Tyr Arg 195 Ile Thr His Thr Asn 200 Asp Ile Val Pro Arg 205 Leu Pro ProArg Glu 210 Phe Gly Tyr Ser His 215 Ser Ser Pro Glu Tyr 220 Trp Ile Lys SerGly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly225 230 235 240Ile Asp Ala Thr Gly 245 Gly Asn Asn Gln Pro 250 Asn Ile Pro Asp Ile 255 ProAla His Leu Trp 260 Tyr Phe Gly Leu Ile 265 Gly Thr Cys Leu <210> 3

<211> 265

<212> PRT

<213> Absidia reflexa

<4 00> 3Ser Ser Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu Ile1 5 10 15 Lys Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg 20 25 30 Thr Val Ile Pro Gly Gly Arg Trp Ser Cys Pro His Cys Gly Val Ala 35 40 45 Ser Asn Leu Gln Ile Thr Lys Thr Phe Ser Thr Leu Ile Thr Asp Thr 50 55 60 Asn Val Leu Val Ala Val Gly Glu Lys Glu Lys Thr Ile Tyr Val Val65 70 75 80

Phe Arg Gly Thr Ser Ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile Val Phe 85 90 95 Val Pro Val Asn Tyr Pro Pro Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly 100 105 110 Phe Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val 115 120 125 Lys Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val Val Thr Gly 130 135 140 His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr145 150 155 160His His Gly His Ala Asn Ile Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg 165 170 175 Ile Gly Thr Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro 180 185 190 Tyr Gln Arg Leu Val His Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro 195 200 205 Gly Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys 210 215 220 Asp Ser Ser Leu Arg Val Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys225 230 235 240Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr 245 250 255 Leu Asp Met Asn Thr Gly Leu Cys Leu 260 265 <210> 4 <211> 264 <212> PRT <213> Absidia corymbifera <4 00> 4 Ser Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu Ile Lys1 5 10 15 Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg Thr 20 25 30 Val Ile Pro Gly Gly Gln Trp Ser Cys Pro His Cys Asp Val Ala Pro 35 40 45 Asn Leu Asn Ile Thr Lys Thr Phe Thr Thr Leu Ile Thr Asp Thr Asn 50 55 60 Val Leu Val Ala Val Gly Glu Asn Glu Lys Thr Ile Tyr Val Val Phe65 70 75 80Arg Gly Thr Ser Ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile Val Phe Val 85 90 95 Pro Val Asn Tyr Pro Pro Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly Phe 100 105 110 Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val Lys 115 120 125 Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val Val Thr Gly His 130 135 140 Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr His145 150 155 160His Gly His Asp Asn Ile Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Ile 165 170 175 Gly Thr Pro Glu Phe Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro Tyr 180 185 190Gln Arg Leu Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Gly 195 200 205 Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys Asp210 215 220

Ser Ser Leu Arg Val Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys Ser225 230 235 240Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr Leu 245 250 255 Asp Met Asn Thr Gly Leu Cys Leu 260 <210> 5 <211> 269 <212> PRT <213> Rhizomucor miehei <400> 5 Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu1 5 10 15 Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val 20 25 30 Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp 35 40 45 Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala50 55 60 Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg65 70 75 80Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro 85 90 95 Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu 100 105 110 Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp 115 120 125 Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser130 135 140 Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln Arg145 150 155 160Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln 165 170 175 Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly 180 185 190 Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu 195 200 205 Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr' Trp Ile210 215 220 Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu225 230 235 240Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp 245 250 255 His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr 260 265 <210> 6 <211> 271 <212> PRT <213> Rhiz opus oryzae <4 00> 6 Ser Ala Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile1 5 10 15 Gln Glu Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg 20 25 30 Ser Val Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp 35 40 45 Val Pro Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp50 55 60 Thr Asn Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu65 70 75 80Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val 85 90 95 Phe Asn Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala 100 105 110 Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val 115 120 125 Val Gln Glu Gln Leu Thr Ala His Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr 130 135 140 Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu145 150 155 160Tyr Gln Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr 165 170 175 Val Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu 180 185 190 Ser Thr Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val 195 200 205 Pro His Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu 210 215 220 Ser Trp Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu225 230 235 240Ile Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Ile 245 250 255 Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu 260 265 270 <210> 7 <211> 267 <212> PRT <213> Aspergillus niger <4 00> 7 Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp1 5 10 15 Leu Tyr Ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr 20 25 30 Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro Ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile 35 40 45 Tyr Asn Ser Gln Thr Asp Ile Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp Ser 50 55 60 Ser Lys Glu Ile Ile Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn65 70 75 80Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro 85 90 95 Gln Cys Asn Gly Cys Glu Val His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Val 100 105 110 Ser Val Gln Asp Gln Val Glu Ser Leu Val Lys Gln Gln Val Ser Gln 115 120 125 Tyr Pro Asp Tyr Ala Leu Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser 130 135 140 Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Ile145 150 155 160Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Ser Gly Asn Gln Ala Phe Ala 165 170 175 Ser Tyr Met Asn Asp Ala Phe Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln 180 185 190 Tyr Phe Arg Val Thr His Ala Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro 195 200 205 Val Glu Gln Gly Tyr Ala His Gly Gly Val Glu Tyr Trp Ser Val Asp 210 215 220 Pro Tyr Ser Ala Gln Asn Thr Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu Val Gln225 230 235 240Cys Cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Asn Ala His Thr Thr 245 250 255 Tyr Phe Gly Met Thr Ser Gly Ala Cys Thr Trp260 265

<210> 8<211> 266<212> PRT

<213> Aspergillus tubingensis <4 00> 8 Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp1 5 10 15 Leu Tyr Ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr 20 25 30 Ala Asp Leu 35 Cys Asn Ile Pro Ser 40 Thr Ile Ile Lys Gly 45 Glu Lys IleTyr Asn 50 Ser Gln Thr Asp Ile 55 Asn Gly Trp Ile Leu 60 Arg Asp Asp SerSer Lys Glu Ile Ile Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn65 70 75 80Leu Gln Leu Asp Thr 85 Asn Tyr Thr Leu Thr 90 Pro Phe Asp Thr Leu 95 ProGln Cys Asn Ser 100 Cys Glu Val His Gly 105 Gly Tyr Tyr Ile Gly 110 Trp IleSer Val Gln 115 Asp Gln Val Glu Ser 120 Leu Val Gln Gln Gln 125 Val Ser GlnPhe Pro Asp Tyr Ala Leu Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser 130 135 140 Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Ile145 150 155 160Arg Leu Tyr Thr Phe 165 Gly Glu Pro Arg Ser 170 Asn Gln Ala Phe Ala 175 SerTyr Met Asn Asp Ala Phe Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln Tyr 180 185 190 Phe Arg Val 195 Thr His Ala Asn Asp 200 Gly Ile Pro Asn Leu 205 Pro Pro AlaAsp Glu 210 Gly Tyr Ala His Gly 215 Val Val Glu Tyr Trp 220 Ser Val Asp ProTyr Ser Ala Gln Asn Thr Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu Val Gln Cys225 230 235 240Cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Asn Ala His Thr Thr Tyr 245 250 255 Phe Gly Met Thr 260 Ser Gly His Cys Thr 265 Trp

<210> 9

<211> 276

<212> PRT

<213> Fusarium oxysporum

<4 00> 9

Ala Val Gly Val Thr Thr Thr Asp Phe Ser Asn Phe Lys Phe Tyr Ile1 5 10 15 Gln His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ser 20 25 30 Lys Ile Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Gly Asn Gly 35 40 45 Ala Thr 50 Ile Val Thr Ser Phe 55 Val Gly Ser Lys Thr 60 Gly Ile Gly GlyTyr Val Ala Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Phe Arg65 70 75 80Gly Ser Ile Asn Ile 85 Arg Asn Trp Leu Thr 90 Asn Leu Asp Phe Gly 95 GlnGlu Asp Cys Ser 100 Leu Val Ser Gly Cys 105 Gly Val His Ser Gly 110 Phe GlnArg Ala Trp 115 Asn Glu Ile Ser Ser 120 Gln Ala Thr Ala Ala 125 Val Ala SerAla Arg Lys Ala Asn Pro Ser Phe Asn Val Ile Ser Thr Gly His Ser

130 135 140Leu Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Ala Ala Ala Asn Leu Arg Val Gly145 150 155 160Gly Thr Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn 165 170 175 Ala Gln Leu Ser 180 Ala Phe Val Ser Asn 185 Gln Ala Gly Gly Glu 190 Tyr ArgVal Thr His 195 Ala Asp Asp Pro Val 200 Pro Arg Leu Pro Pro 205 Leu Ile PheGly Tyr 210 Arg His Thr Thr Pro 215 Glu Phe Trp Leu Ser 220 Gly Gly Gly GlyAsp Lys Val Asp Tyr Thr Ile Ser Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala 225 230 235 240Ala Asn Leu Gly Cys 245 Asn Gly Gly Thr Leu 250 Gly Leu Asp Ile Ala 255 AlaHis Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe

260 265 270

Ser Trp Arg Arg

275<210> 10<211> 273<212> PRT

<213> Fusarium heterosporum<4 00> 10

Thr Val Thr Thr Gln Asp Leu Ser Asn Phe Arg Phe Tyr Leu Gln His1 5 10 15 Ala Asp Ala Ala 20 Tyr Cys Asn Phe Asn 25 Thr Ala Val Gly Lys 30 Pro ValHis Cys Ser 35 Ala Gly Asn Cys Pro 40 Asp Ile Glu Lys Asp 45 Ala Ala IleVal Val Gly Ser Val Val Gly Thr Lys Thr Gly Ile Gly Ala Tyr Val 50 55 60 Ala Thr Asp Asn Ala Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Val Arg Gly Ser65 70 75 80Ile Asn Val Arg Asn 85 Trp Ile Thr Asn Phe 90 Asn Phe Gly Gln Lys 95 ThrCys Asp Leu Val 100 Ala Gly Cys Gly Val 105 His Thr Gly Phe Leu 110 Asp AlaTrp Glu Glu 115 Val Ala Ala Asn Val 120 Lys Ala Ala Val Ser 125 Ala Ala LysThr Ala Asn Pro Thr Phe Lys Phe Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly 130 135 14 0 Gly Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Ala Tyr Leu Arg Lys Asp Gly Phe145 150 155 160Pro Phe Asp Leu Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Asp Phe 165 170 175 Phe Ala Asn Phe Val Thr Gln Gln Thr Gly Ala Glu Tyr Arg Val Thr 180 185 190 His Gly Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Ile Val Phe Gly Tyr 195 200 205 Arg His 210 Thr Ser Pro Glu Tyr 215 Trp Leu Asn Gly Gly 220 Pro Leu Asp LysAsp Tyr Thr Val Thr Glu Ile Lys Val Cys Glu Gly Ile Ala Asn Val225 230 235 240Met Cys Asn Gly Gly 245 Thr Ile Gly Leu Asp 250 Ile Leu Ala His Ile 255 ThrTyr Phe Gln Ser 260 Met Ala Thr Cys Ala 265 Pro Ile Ala Ile Pro 270 Trp Lys

Arg

<210> 11

<211> 278

<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae<4 00> 11 Asp Ile Pro Thr Thr Gln Leu Glu Asp Phe Lys Phe Trp Val Gln Tyr1 5 10 15 Ala Ala Ala Thr Tyr Cys Pro Asn Asn Tyr Val Ala Lys Asp Gly Glu 20 25 30 Lys Leu Asn Cys Ser Val Gly Asn Cys Pro Asp Val Glu Ala Ala Gly 35 40 45 Ser Thr Val Lys Leu Ser Phe Ser Asp Asp Thr Ile Thr Asp Thr Ala 50 55 60 Gly Phe Val Ala Val Asp Asn Thr Asn Lys Ala Ile Val Val Ala Phe65 70 75 80Arg Gly Ser Tyr Ser Ile Arg Asn Trp Val Thr Asp Ala Thr Phe Pro 85 90 95 Gln Thr Asp Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Lys Ala Glu Leu Gly Phe 100 105 110 Trp Thr Ala Trp Lys Val Val Arg Asp Arg Ile Ile Lys Thr Leu Asp 115 120 125 Glu Leu Lys Pro Glu His Ser Asp Tyr Lys Ile Val Val Val Gly His 130 135 140 Ser Leu Gly Ala Ala Ile Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asp Leu Arg Thr145 150 155 160Lys Asn Tyr Asp Ala Ile Leu Tyr Ala Tyr Ala Ala Pro Arg Val Ala 165 170 175 Asn Lys Pro Leu Ala Glu Phe Ile Thr Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Arg 180 185 190 Phe Thr His Asn Asp Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Thr Met 195 200 205 Gly Tyr Val His Ile Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Thr Ala Pro Asp Asn 210 215 220 Thr Thr Val Thr Asp Asn Gln Val Thr Val Leu Asp Gly Tyr Val Asn225 230 235 240Phe Lys Gly Asn Thr Gly Thr Ser Gly Gly Leu Pro Asp Leu Leu Ala 245 250 255 Phe His Ser His Val Trp Tyr Phe Ile His Ala Asp Ala Cys Lys Gly 260 265 270 Pro Gly Leu 0 1 R Pro Leu Arg <210> ú. I -J 12 <211> 278 <212> PRT <213> Penicill ium camemberti <400> 12 Asp Val Ser Thr Ser Glu Leu Asp Gln Phe Glu Phe Trp Val Gln Tyr1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Tyr Tyr Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Gln Val Gly Asp 20 25 30 Lys Leu Ser Cys Ser Lys Gly Asn Cys Pro Glu Val Glu Ala Thr Gly 35 40 45 Ala Thr Val Ser Tyr Asp Phe Ser Asp Ser Thr Ile Thr Asp Thr Ala 50 55 60 Gly Tyr Ile Ala Val Asp His Thr Asn Ser Ala Val Val Leu Ala Phe65 70 75 80Arg Gly Ser Tyr Ser Val Arg Asn Trp Val Ala Asp Ala Thr Phe Val 85 90 95 His Thr Asn Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Leu Ala Glu Leu Gly Phe 100 105 110 Trp Ser Ser Trp Lys Leu Val Arg Asp Asp Ile Ile Lys Glu Leu Lys 115 120 125 Glu Val Val Ala Gln Asn Pro Asn Tyr Glu Leu Val Val Val Gly His 130 135 140 Ser Leu Gly Ala Ala Val Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp Leu Arg Gly145 150 155 160Lys Gly Tyr Pro Ser Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val165 170 175 Gly Asn Ala Ala Leu Ala Lys Tyr Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Phe 180 185 190 Arg Phe Thr His Thr Asn Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser 195 200 205 Met Gly Tyr Val His Val Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn 210 215 220 Asn Ala Thr Val Ser Thr Ser Asp Ile Lys Val Ile Asp Gly Asp Val225 230 235 240Ser Phe Asp Gly Asn Thr Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe 245 250 255 Glu Ala His Ile Trp Tyr Phe Val Gln Val Asp Ala Gly Lys Gly Pro 260 265 270 Gly Leu Pro Phe Lys Arg 275 <210> 13 <211> 270 <212> PRT <213> Aspergillus foetidus <400> 13 Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ala Gln Trp1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Lys Asp Ser Asn 20 25 30 Leu Thr Cys Thr Ala Asn Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr 35 40 45 Thr Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asp Phe Gly Gly Thr Ala 50 55 60 Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe65 70 75 80Arg Gly Ser Ser Thr Ile Glu Asn Trp Ile Ala Asn Leu Asp Phe Ile 85 90 95 Leu Glu Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly 100 105 110 Phe Trp Lys Ala Trp Glu Ser Ala Ala Asp Glu Leu Thr Ser Lys Ile 115 120 125 Lys Ser Ala Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly 130 135 140 His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg145 150 155 160Asn Asp Gly Tyr Ser Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Ile 165 170 175 Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala 180 185 190 Asn Phe Arg Val Thr His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro 195 200 205 Met Asp Phe Gly Phe Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser 210 215 220 Gly Asn Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly225 230 235 240Ile Asn Ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Ser Val Leu 245 250 255 Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu 260 265 270 <210> 14 <211> 270 <212> PRT <213> Aspergillus niger <4 00> 14 Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ser Gln Trp1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Asp Asp Ser Asn 20 25 30Val Thr Cys Thr Ala Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr 35 40 45 Lys Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala 50 55 60 Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe65 70 75 80Arg Gly Ser Ser Thr Ile Lys Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ile 85 90 95 Leu Gln Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly 100 105 110 Phe Trp Lys Ala Trp Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys Ile 115 120 125 Lys Ser Ala Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly 130 135 140 His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg145 150 155 160Asn Asp Gly Tyr Ser Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val 165 170 175 Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala 180 185 190 Asn Phe Pro Val Thr His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro 195 200 205 Met Asp Phe Gly Phe Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser 210 215 220 Gly Thr Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly225 230 235 240Ile Asn Ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Asp Val Leu 245 250 255 Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu 260 265 270 <210> 15 <211> 269 <212> PRT <213> Aspergillus oryz ae <4 00> 15 Asp Val Ser Ser Ser Leu Leu Asn Asn Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Asp Glu Asn Leu Asn Ser Thr Gly Thr Lys 20 25 30 Leu Thr Cys Ser Val Gly Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Ser Thr 35 40 45 Gln Ser Leu Asp Glu Phe Asn Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Pro Ala 50 55 60 Gly Tyr Leu Ala Ala Asp Glu Thr Asn Lys Leu Leu Val Leu Ser Phe65 70 75 80Arg Gly Ser Ala Asp Leu Ala Asn Trp Val Ala Asn Leu Asn Phe Gly 85 90 95 Leu Glu Asp Ala Ser Asp Leu Cys Ser Gly Cys Glu Val His Ser Gly 100 105 110 Phe Trp Lys Ala Trp Ser Glu Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val 115 120 125 Glu Ser Ala Leu Ser Asp His Ser Asp Tyr Ser Leu Val Leu Thr Gly 130 135 140 His Ser Tyr Gly Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg145 150 155 160Asn Ser Gly His Ser Val Glu Leu Tyr Asn Tyr Gly Gln Pro Arg Leu 165 170 175 Gly Asn Glu Ala Leu Ala Thr Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Lys Gly Gly 180 185 190 Asn Tyr Arg Val Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro 195 200 205 Thr Leu Leu Gly Tyr His His Phe Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser 210 215 220Ala Asp Glu Ala Thr Val Thr Thr Thr Asp Val Thr Glu Val Thr Gly225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asp Gly Thr Asp Gly Thr Ser Ile Asp

245 250 255

Ala His Arg Trp Tyr Phe Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser260 265

<210> 16<211> 251<212> PRT

<213> Landerina penisapora<4 00> 16

Pro Gln Asp Ala Tyr Thr Ala Ser His Ala Asp Leu Val Lys Tyr Ala1 5 10 15 Thr Tyr Ala Gly 20 Leu Ala Tyr Gln Thr 25 Thr Asp Ala Trp Pro 30 Ala SerArg Thr Val 35 Pro Lys Asp Thr Thr 40 Leu Ile Ser Ser Phe 45 Asp His ThrLeu Lys 50 Gly Ser Ser Gly Tyr 55 Ile Ala Phe Asn Glu 60 Pro Cys Lys GluIle Ile Val Ala Tyr Arg Gly Thr Asp Ser Leu Ile Asp Trp Leu Thr65 70 75 80Asn Leu Asn Phe Asp 85 Lys Thr Ala Trp Pro 90 Ala Asn Ile Ser Asn 95 SerLeu Val His Glu 100 Gly Phe Leu Asn Ala 105 Tyr Leu Val Ser Met 110 Gln GlnVal Gln Glu 115 Ala Val Asp Ser Leu 120 Leu Ala Lys Cys Pro 125 Asp Ala ThrIle Ser Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Cys Ile Ser 130 135 140 Met Val Asp Thr Ala Gln Arg His Arg Gly Ile Lys Met Gln Met Phe145 150 155 160Thr Tyr Gly Gln Pro Arg Thr Gly Asn Gln Ala Phe Ala Glu Tyr Val 165 170 175 Glu Asn Leu Gly 180 His Pro Val Phe Arg 185 Val Val Tyr Arg His 190 Asp IleVal Pro Arg Met Pro Pro Met Asp Leu Gly Phe Gln His His Gly Gln 195 200 205 Glu Val 210 Trp Tyr Glu Gly Asp 215 Glu Asn Ile Lys Phe 220 Cys Lys Gly GluGly Glu Asn Leu Thr Cys Glu Leu Gly Val Pro Phe Ser Glu Leu Asn225 230 235 240Ala Lys Asp His Ser 245 Glu Tyr Pro Gly Met 250 His

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência usada para alinhamento<400> 17

Ala Cys Met Ser His Thr Trp Gly Glu Arg Asn Leu15 10

<210> 18<211> 14<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Seqüência usada para alinhamento<4 00> 18

His Gly Trp Gly Glu Asp Ala Asn Leu Ala Met Asn Pro Ser15 10

Claims (21)

1. Variante de lipase precursora, caracterizada pelo fato decompreender pelo menos três substituições selecionadas do grupo queconsiste de (usando-se a SEQ ID N°: 2 para a numeração):a) pelo menos duas substituições na Região I eb) pelo menos uma substituição na Região II ec) pelo menos uma substituição na Região III epelo menos uma substituição na Região IV e em que a variantetem a atividade de lipase.

2. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que as pelo menos duas substituições na Região Ida lipase precursora compreende as substituições dos aminoácidos nasposições correspondentes às posições 231 e 233 (usando-se a SEQ ID N°:2para a numeração).

3. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que pelo menos duas substituições na Região I dalipase precursora compreende substituições de um R dos aminoácidos nasposições correspondentes às posições 231 e 233 (usando-se SEQ ID N°: 2para a numeração).

4. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a lipase variante é pelo menos 80 %. 85 %, 90%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idêntica à SEQ ID N0:2.

5. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a lipase precursora é a lipase tendo a seqüênciade aminoácido da SEQ ID N0:2.

6. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que a lipase compreende uma substituição adicionalna posição correspondente à posição 4 e/ou posição 227 da SEQ ID N0:2.

7. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que a lipase tem uma substituição correspondente aX4V e X227G (usando-se a SEQ ID N°: 2 para a numeração).

8. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que pelo menos uma substituição na Região II dalipase precursora compreende substituições selecionadas do grupo queconsiste de substituições das posições correspondentes às posições 202, 210,-211, 255 e 256 (usando-se a SEQ ID N°:2 para a numeração).

9. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma lipase precursora éselecionada do grupo que consiste de X202G, X210K, X211L, X255Y/V eX256K (usando-se a SEQ ID N0:2 para a numeração).

10. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que pelo menos uma substituição na Região III dalipase precursora compreende substituições selecionadas do grupo queconsiste de substituições nas posições correspondentes às posições 83, 86 e 90(usando-se a SEQ ID N0:2 para a numeração).

11. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que pelo menos uma substituição na lipaseprecursora é selecionada do grupo que consiste de MT, X86V e X90A/R(usando-se a SEQ ID N0:2 para a numeração).

12. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que pelo menos uma substituição na Região IV dalipase precursora compreende substituições selecionadas do grupo queconsiste de substituições nas posições correspondentes às posições 27, 58 e 60(usando-se a SEQ ID N0:2 para a numeração),

13. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que pelo menos uma substituição na Região IV dalipase precursora compreende substituições selecionadas do grupo queconsiste de X27R, X58N/A/G/P/T e X60S/V/G/N/R/K/A/L, (usando-se aSEQ ID Ν°: 2 para a numeração).

14. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a variante de lipase ainda compreende pelomenos uma substituição na lipase precursora que é selecionada do grupo queconsiste de substituições nas posições correspondentes às posições 81, 147, - 150, 227 e 249 (usando-se a SEQ ID N°:2 para a numeração).

15. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a variante de lipase ainda compreende pelomenos uma substituição selecionada do grupo que consiste de X81Q/E,X147M/Y, XI50G e X249R/I/L (usando-se a SEQ ID N°:2 para anumeração).

16. Variante de lipase de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a lipase compreende uma substituiçãoselecionada do seguinte grupo de substituições:a) T231R + N233R + 1255Yb) 1202G + T23IR + N233Rc) 186V + L227G + T23IR + N233R + P256Kd) Q4V + S58N + V60S + T23IR + N233Re) S58N + V60S+190R + T231 R + N233Rf) 190A + T231R + N233R + I255Vg) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T23IR + N233R + P256Kh) S58N + V60S + L147M + F21IL + T23IR + N233Ri) Q4V + S58A + V60S + S83T + 186V + A150G + E210K + L227G +T23IR + N233R + P256Kj) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T23IR + N233R + P256K

17. Seqüência de DNA, caracterizada pelo fato de que codificaa variante de lipase como definida na reivindicação 1 a 16.

18. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que abriga aseqüência de DNA como definida na reivindicação 17.

19. Célula hospedeira transformada, caracterizada pelo fato deque contém a seqüência de DNA como definida na reivindicação 17.

20. Método de produzir uma variante de lipase, caracterizadopelo fato de que o método compreende cultivar as células hospedeirastransformadas como definidas na reivindicação 19 sob condições condutoraspara a produção da variante de lipase e recuperação da variante de lipase apartir do caldo resultante.

21. Variante da SEQ ID N°: 2, caracterizada pelo fato de quecompreende pelo menos uma das mutações Q4V, S58N/A/G/P/T, I90R ouQ2491/L.