BRPI0706730A2 - composições detergentes - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES DETERGENTES A presente invenção refere-se a composições detergentes compreendendo um ingrediente detergente e uma variante de lipase com potencial reduzido para geração de odores, obtida mediante a introdução de mutações em uma ou mais regiões identificadas em uma lipase original.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÕES DETERGENTES".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições detergentes,particularmente detergentes para lavagem de roupas, compreendendoenzimas lipolíticas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A remoção otimizada de sujeiras gordurosas é um objetivo cons-tante para os fabricantes de detergente, especialmente no contexto de lava-gem de roupas. Apesar do uso de muitos tensoativos eficazes e suas com-binações, especialmente quando usados com água a baixa temperatura,muitos produtos baseados em tensoativo ainda não conseguem removercompletamente as sujeiras gordurosas ou oleosas. As enzimas Iipase têmsido usadas em detergentes desde os fins dos anos 80 para a remoção desujeiras gordurosas através da decomposição das mesmas em triglicerídeos.

Até recentemente, as principais enzimas lipase disponíveis co-mercialmente, como a Lipolase (nome comercial, Novozymes) funcionavamde maneira particularmente eficaz nos níveis mais baixos de umidade dafase de secagem do processo de lavagem. Essas enzimas tendiam a produ-zir uma limpeza significativa somente na segunda etapa de lavagem, comuma decomposição significativa da gordura somente nas sujeiras restantesnas roupas lavadas durante a fase de secagem, sendo as gorduras decom-postas removidas, então, na próxima etapa de lavagem. Entretanto, maisrecentemente, foram desenvolvidas lipases de maior eficiência que funcio-nam eficientemente também durante a fase de lavagem do processo de lim-peza, de modo que, do ponto de vista da limpeza na segunda etapa de lava-gem, uma melhora significativa no efeito de limpeza devido à enzima Iipasepoder ser encontrada no primeiro ciclo de lavagem. Exemplos dessas enzi-mas são conforme descrito em US 6.939.702 B1, em WO 00/60063 e naDescrição de Pesquisa IP6553D. Essas enzimas são referidas abaixo comolipase de primeira lavagem.

Além do mais, os consumidores preferem que os artigos, comopeças de vestuário, estejam tão limpos quanto possível. Esses consumido-res tipicamente associam o odor de um artigo limpo ou tratado com o graude limpeza desse artigo. Portanto, a efetividade de uma composição de lim-peza e/ou tratamento, do ponto de vista de um consumidor, tipicamente estádiretamente ligada ao odor que essa composição confere a um artigo que élimpo ou tratado com a mesma. As Requerentes reconheceram que determi-nados materiais, como esterases e lipases, podem gerar odores desagradá-veis de ácidos graxos, particularmente odores de ácidos graxos de cadeiacurta, como o odor de ácido butírico. No entanto, esses materiais podem seragentes de limpeza particularmente eficazes. Infelizmente, os consumidorestipicamente associam os odores resultantes do uso desses agentes a umafalta de limpeza. Exemplos de variantes com odor reduzido com uma exten-são carbóxi-terminal são compartilhados em W002/062973, mas essas vari-antes de lipase não demonstram o forte desempenho de lavagem das Iipa-ses de primeira lavagem, como aquelas apresentadas em WO00/60063, in-clusive a variante disponível comercialmente sob o nome Lipex®.

Portanto, permanece uma necessidade por composições deter-gentes compreendendo enzimas Iipotfticas para excelente remoção de sujei-ras gordurosas/oleosas que, ao mesmo tempo, não gera quaisquer odoresdesagradáveis de ácidos graxos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições detergentes com-preendendo um ingrediente detergente e uma variante de Iipase com poten-cial reduzido para geração de odores, sem a ligação de uma extensão car-bóxi-terminal. A variante de Iipase é obtida mediante a introdução de muta-ções em uma ou mais regiões identificadas na Iipase original.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Listagem de Seqüência mostra o alinhamento das lipases.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

SEQ. ID Ne 1 mostra a seqüência de DNA codificando Iipase apartir de Thermomyces lanoginosus.

SEQ. ID Ne 2 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipaseobtida de Thermomyces lanoginosus.

SEQ. ID Ns 3 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipaseobtida de Absidia reflexa.

SEQ. ID Ns 4 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipaseobtida de Absidia corymbifera.

SEQ. ID Ns 5 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipaseobtida de Rhizomucor miehei.

SEQ. ID Ns 6 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipaseobtida de Rhizopus oryzae.

SEQ. ID N2 7 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipaseobtida de Aspergillus niger.

SEQ. ID Nq 8 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipaseobtida de Aspergillus tubingensis.

SEQ. ID N2 9 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipaseobtida de Fusarium oxysporrum.

SEQ. ID N9 10 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Fusarium heterosporum.

SEQ. ID Ns 11 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Aspergillus oryzae.

SEQ. ID Ns 12 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Penicillium camemberti.

SEQ. ID N9 13 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Aspergillus foetidus.

SEQljID N9 14 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Aspergillus niger.

SEQ. ID N915 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Aspergillus oryzae.

SEQ. ID N916 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Iipa-se obtida de Landerina penisapora.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Variantes de Lipase

Lipase OriginalA lipase original pode ser uma Iipase fúngica com uma seqüên-cia de aminoácidos tendo pelo menos 50% de homologia, conforme definidona seção "Homologia e alinhamento", com a seqüência da lipase de T. Ianu-ginosus mostrada na SEQ. ID Ne 2.

A lipase original pode ser um polipeptídeo de levedura como umpolipeptídeo de Candida1 Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizo-saccharomyces ou Yarrowia ou, com mais preferência, um polipeptídeo defungo filamentoso, como um polipeptídeo de Acremonium, Aspergillus, Aure-obasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe,Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicilli-um, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Toly-pocladium ou Trichoderma.

Em um aspecto preferencial, a lipase original é um polipeptídeocom atividade de lipase, proveniente de Saccharomyces carlsbergensis,Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomycesdouglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccha-romyces oviformis.

Em um outro aspecto preferencial, a lipase original é um polipep-tídeo de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides,Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusariumgraminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium ne-gundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusa-rium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusa-rium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusariumvenenatum, Humicola insolens, Thermomyces Ianoginosus (sinônimo: Humi-cola lanuginosa), Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurosporacrassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichodermakoningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichodermaviride.

Em um outro aspecto preferencial, a lipase original é uma lipasede Thermomyces.

Em um aspecto mais preferencial, a Iipase original é uma Iipasede Thermomyces lanuginosus. Em uma modalidade ainda mais preferencial,a Iipase original é a Iipase de SEQ. ID N5 2.

Identificação de Regiões e Substituições

As posições mencionadas nas Regiões de I a IV, abaixo, sãoposições dos resíduos de aminoácido na SEQ. ID N9 2. Para encontrar asposições correspondentes (ou homólogas) em uma Iipase diferente, é usadoo procedimento descrito em "Homologia e alinhamento".

Substituições na Região I

A Região I consiste em resíduos de aminoácido circundando oresíduo N-terminal E1. Nessa região, é preferencial substituir um aminoácidoda Iipase original com um aminoácido mais positivo. Os resíduos de aminoá-cido correspondentes às seguintes posições são compreendidos pela Regi-ão I: de 2 a 11 e de 223 a 239. As seguintes posições são de particular inte-resse: 4, 8, 11, 223, 227, 229, 231, 233, 234, 236. Em particular, foram iden-tificadas as seguintes substituições: X4V, X227G, X231R e X233R.

Em uma modalidade preferencial, a Iipase original tem pelo me-nos 80%, como 85% ou 90%, como pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou99% de identidade com SEQ. ID N5 2. Em uma modalidade da máxima pre-ferência, a Iipase original é idêntica a SEQ. ID Nq 2.Substituições na Região Il

A Região Il consiste em resíduos de aminoácido em contato como substrato em um lado da cadeia de acila e um lado da parte de álcool.Nessa região, é preferencial substituir um aminoácido da Iipase original comum aminoácido mais positivo ou com um aminoácido menos hidrofóbico. Osresíduos de aminoácido correspondentes às seguintes posições são com-preendidos pela Região II: de 202 a 211 e de 249 a 269. As seguintes posi-ções são de particular interesse: 202, 210, 211, 253, 254, 255 e 256. Emparticular, foram identificadas as seguintes substituições: X202G, X210K,X255Y/V e X256K/R.

Em uma modalidade preferencial, a lipase original tem pelo me-nos 80%, como 85% ou 90%, como pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou99% de identidade com SEQ. ID NQ2. Em uma modalidade da máxima prefe-rência, a Iipase original é idêntica a SEQ. ID Nq 2.Substituições na Região Ill

A Região Ill consiste em resíduos de aminoácido que formamuma estrutura flexível permitindo, assim, que o substrato entre no sítio ativo.Nessa região, é preferencial substituir um aminoácido da Iipase original comum aminoácido mais positivo ou com um aminoácido menos hidrofóbico. Osresíduos de aminoácido correspondentes às seguintes posições são com-preendidos pela Região III: de 82 a 102. As seguintes posições são de parti-cular interesse: 83, 86, 87, 90, 91, 95, 96 e 99. Em particular, foram identifi-cadas as seguintes substituições: X83T, X86V e X90A/R.

Em uma modalidade preferencial, a Iipase original tem pelo me-nos 80%, como 85% ou 90%, como pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou99% de identidade com SEQ. ID Ns 2. Em uma modalidade da máxima pre-ferência, a Iipase original é idêntica a SEQ. ID N9 2.

Substituições na Região IV

A Região IV consiste em resíduos de aminoácido que se ligameletrostaticamente a uma superfície. Nessa região, é preferencial substituirum aminoácido da Iipase original com um aminoácido mais positivo. Os resí-duos de aminoácido correspondentes às seguintes posições são compreen-didos pela Região IV: 27 e 54 a 62. As seguintes posições são de particularinteresse: 27, 56, 57, 58 e 60. Em particular, foram identificadas as seguintessubstituições: X27R, X58N/AG/T/P e X60V/S/G/N/R/K/A/L.

Em uma modalidade preferencial, a Iipase original tem pelo me-nos 80%, como 85% ou 90%, como pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou99% de identidade com SEQ. ID Nq 2. Em uma modalidade da máxima pre-ferência, a Iipase original é idêntica a SEQ. ID Nq 2.

Aminoácidos em outras Posições

A Iipase original pode, opcionalmente, compreender substitui-ções de outros aminoácidos, especificamente menos que 10 ou menos quedessas substituições. Os exemplos são substituições correspondentes auma ou mais das posições 24, 46, 74, 81, 83, 127, 131, 137, 147, 150, 203,206, 211, 263, 264, 265, 267 e 269 da Iipase original. Em uma modalidadeespecífica, há uma substituição em pelo menos uma das posições corres-pondentes a 81, 147, 150 e 249. Em uma modalidade preferencial, pelo me-nos uma substituição é selecionada do grupo consistindo em X81Q/E,Χ147M/Y, X150G e X249R/I/L.

Além disso as substituições podem, por exemplo, ser feitas deacordo com os princípios conhecidos na técnica, por exemplo substituiçõesdescritas em WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

Variantes da Lipase Original

Em um aspecto a dita variante, quando comparada à dita Iipaseoriginal, compreende um total de pelo menos três substituições, as quais sãoselecionadas de um ou mais dos seguintes grupos de substituições:a) pelo menos duas substituições na Região I,

b) pelo menos uma substituição na Região II,

c) pelo menos uma substituição na Região III, e/ou

d) pelo menos uma substituição na Região IV.

A variante pode compreender substituições, em comparação àIipase original da variante, correspondentes àquelas listadas abaixo na Ta-bela 1.

<table>table see original document page 8</column></row><table><table>table see original document page 9</column></row><table>

Tabela 1: algumas variantes específicas.

Em uma outra modalidade específica, a Iipase original é idênticaà SEQ. ID N9 2, e as variantes da Tabela 1 serão, portanto:

<table>table see original document page 9</column></row><table>

Tabela 2: algumas variantes específicas de SEQ. ID Nq 2Nomenclatura para modificações de aminoácido

Na descrição das variantes de Iipase de acordo com a presenteinvenção, é usada a seguinte nomenclatura, para facilidade de referência:aminoácido(s) original(is):posição(ões):aminoácido(s) substituído(s).

De acordo com essa nomenclatura, por exemplo, a substituiçãodo ácido glutâmico por glicina na posição 195 é mostrada como G195E. Adeleção da glicina na mesma posição é mostrada como G195*, e a inserçãode um resíduo de aminoácido adicional, como lisina, é mostrada comoG195GK. Nos casos em que uma Iipase específica contém uma "deleção"em comparação com outras Iipases e uma inserção é feita nessa posição,isso é indicado como *36D para a inserção de um ácido aspártico na posição36. Mutações múltiplas são separadas por sinais de soma, isto é,R170Y+G195E, representando mutações nas posições 170 e 195, substitu-indo tirosina e ácido glutâmico por arginina e glicina, respectivamente.

X231 indica o aminoácido em um polipeptídeo original corres-pondente à posição 231, quando se aplica o procedimento de alinhamentodescrito. X231R indica que o aminoácido é substituído por R. Para SEQ. IDNe 2, X é T, e X231R indica, portanto, uma substituição de T na posição 231por R. Nos casos em que o aminoácido em uma posição (por exemplo 231)pode ser substituído por outro aminoácido selecionado de um grupo de ami-noácidos, por exemplo o grupo consistindo em R, P e Y, isso será indicadopor X231 R/P/Y.

Em todos os casos, é empregada a abreviação IUPAC para ami-noácidos, de letra única ou tripla, comumente aceita.

Agrupamento de Aminoácidos

Neste relatório descritivo, os aminoácidos são classificados co-mo negativamente carregados, positivamente carregados ou eletricamenteneutros, de acordo com sua carga elétrica em pH 10. Portanto, os aminoáci-dos negativos são E, D, C (cisteína) e Y, particularmente E e D. Os aminoá-cidos positivos são R, K e H, particularmente R e K. Os aminoácidos neutrossão G, A, V, L, P, F, W, S, T Μ, N, Q e C, quando formando parte de umaponte dissulfeto. A substituição por outro aminoácido no mesmo grupo (ne-gativo, positivo ou neutro) é chamada de substituição conservativa.

Os aminoácidos neutros podem ser divididos em hidrofóbicos ounão-polares (G, A, V, L, I, P, F, W e C como parte de uma ponte de dissulfeto)e hidrofílicos ou polares (S, T Μ, N, Q).

Identidade de Aminoácidos

O nível de relacionamento entre duas seqüências de aminoácidoou entre duas seqüências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro "identidade".

Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento de duasseqüências de aminoácido é determinado mediante o uso do programa Nee-dle, do pacote de software EMBOSS (http://emboss.org), Versão 2.8.0. Oprograma Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito emNeedleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matrizde substituição usada é BLOSUM62, a penalidade por abertura de buraco éde 10, e a penalidade por ampliação de buraco é de 0,5.

O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácidos dapresente invenção ("seqüência da invenção", por exemplo aminoácidos de 1a 269 da SEQ. ID Nq 2) e uma seqüência de aminoácidos diferente ("se-qüência estranha") é calculado como o número de igualdades exatas em umalinhamento das duas seqüências, dividido pelo comprimento da "seqüênciada invenção" ou o comprimento da "seqüência estranha", aquela que formais curta. O resultado é expresso em porcentagem de identidade.

Uma igualdade exata ocorre quando a "seqüência da invenção"e a "seqüência estranha" têm resíduos de aminoácido idênticos nas mesmasposições da sobreposição. O comprimento de uma seqüência é o número deresíduos de aminoácido presentes na mesma (por exemplo, o comprimentoda SEQ. ID N2 2 é 269).

A lipase original tem uma identidade de aminoácidos de pelomenos 50% com a lipase de T. lanuginosus (SEQ. ID Ns 2), particularmentepelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelomenos 90%, mais de 95% ou mais de 98%. Em uma modalidade específica,a lipase original é idêntica à lipase de T. lanuginosus (SEQ. ID Ns 2).

O procedimento acima pode ser usado para cálculo de identida-de, bem como para homologia e alinhamento. No contexto da presente in-venção, a homologia e o alinhamento foram calculados conforme descritomais adiante neste documento.Homologia e Alinhamento

Para os propósitos da presente invenção, o grau de homologiapode ser adequadamente determinado por meio de programas de computa-dor conhecidos na técnica, como o GAP, fornecido no pacote de programasGCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, agosto de1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,EUA 53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of MolecularBiology, 48, 443-45), usando-se o dito GAP com as seguintes configuraçõespara comparação de seqüências de polipeptídeos: penalidade de 3,0 paraabertura de buraco e penalidade de 0,1 para ampliação de buraco.

Na presente invenção, as posições correspondentes (ou homó-logas) nas seqüências de Iipase de Absidia reflexa, Absidia corymbefera,Rhizmucor miehei, Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus tubigen-sis, Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Aspergillus oryzea, Peni-cilium camembertii, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Thermomyces Ia-noginosus (sinônimo: Humicola lanuginosa) e Landerina penisapora são de-finidas pelo alinhamento mostrado na Listagem de Seqüência.

Para encontrar as posições homólogas nas seqüências de Iipasenão mostradas no alinhamento, a seqüência de interesse é alinhada às se-qüências mostradas na Listagem de Seqüência. A nova seqüência é alinha-da ao presente alinhamento na Listagem de Seqüência, mediante o uso dealinhamento GAP com a seqüência mais homóloga encontrada pelo progra-ma GAP. O programa GAP é fornecido no pacote de programas GCG (Pro-gram Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, agosto 1994, GeneticsComputer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711) (Ne-edleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biològy, 48,443-45). São usadas as seguintes configurações para a comparação de se-qüências de polipeptídeos: penalidade de 3,0 para abertura de buraco e pe-nalidade de 0,1 para ampliação de buraco.

A Iipase original tem uma homologia de pelo menos 50% com alipase de Τ. lanuginõsus (SEQ. ID N9 2), particularmente pelo menos 55%,pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, maisde 95% ou mais de 98%. Em uma modalidade específica, a lipase original éidêntica à lipase de T. lanuginõsus (SEQ. ID Ne 2).

Hibridizacão

A presente invenção refere-se, também, a polipeptídeos isoladoscom atividade de lipase, os quais são codificados por polinucleotídeos quese hibridizam sob condições de muito baixa estringência, de preferência sobcondições de baixa estringência, com mais preferência sob condições demédia estringência, com mais preferência sob condições de média-alta es-tringência, com mais preferência ainda sob condições de alta estringência e,com a máxima preferência, sob condições de muito alta estringência com (i)nucleotídeos de 178 a 660 da SEQ. ID N9 1, (ii) a seqüência de cDNA conti-da em nucleotídeos de 178 a 660 da SEQ. ID Ns 1, (iii) uma subseqüênciade (i) ou (ii), ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii) ou (iii) (J. Sambro-ok, E.F. Fritsch, e T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Ma-nual, 2a. Edição, Cold Spring Harbor, New York, EUA). Uma subseqüênciada SEQ. ID N9 1 contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou, de pre-ferência, pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Além disso, a subseqüên-cia pode codificar um fragmento de polipeptídeo que tem atividade de lipase.

Para pontas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em com-primento, as condições de estringência de muito baixas a muito altas sãodefinidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3%SDS1 200 pg/mL de DNA de esperma de salmão submetido a cisalhamentoe desnaturado, e ou 25% de formamida para estringências muito baixas ebaixas, 35% de formamida para estringências médias e médias-altas, ou50% de formamida para estringências altas e muito altas, seguindo os pa-drões de procedimentos para manchamento Southern para 12 a 24 horas,otimamente.

Para pontas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de compri-mento, o material veículo é finalmente lavado três vezes cada um durante 15minutos, mediante o uso de 2X SSC1 0,2% SDS, de preferência pelo menosa 45°C (muito baixa estringência), com mais preferência pelo menos a 50°C(baixa estringência), com mais preferência pelo menos a 55°C (média estrin-gência), com mais preferência pelo menos a 60°C (média-alta estringência),com mais preferência ainda pelo menos a 65°C (alta estringência) e, com amáxima preferência, pelo menos a 70°C (muito alta estringência).

Seqüência de DNA. vetor de expressão, célula hospedeira, produção de Ii-pase

A invenção apresenta uma seqüência de DNA que codifica a Ii-pase da invenção, um vetor de expressão que abriga a seqüência de DNA, euma célula hospedeira transformada que contém a seqüência de DNA ou ovetor de expressão. Esses itens podem ser obtidos por métodos conhecidosna técnica.

A invenção apresenta, também, um método para produção deIipase mediante a cultura da célula hospedeira transformada sob condiçõesapropriadas à produção da lipase, seguida da recuperação da dita Iipase apartir do caldo resultante. O método pode ser praticado de acordo com osprincípios conhecidos na técnica.Atividade de Lipase

-Atividade de lipase em tributirina sob pH neutro (LU)

Um substrato para a lipase é preparado mediante a emulsifica-ção de tributirina (tributirato de glicerina), usando-se goma arábica comoemulsificante. A hidrólise de tributirina a 30°C e a um pH de 7 ou 9 é seguidaem um experimento de titulação pH-stat. Uma unidade de atividade de lipase(1 LU) é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 micromol de ácidobutírico/min sob pH 7.

-Relação risco/benefício

O fator risco/benefício descrevendo o desempenho em compa-ração ao risco reduzido para ocorrência de odores é definido como: RB =DRmédio/R- As variantes de lipase aqui descritas podem ter RBs maiores que1, maiores que 1,1, ou mesmo maiores que 1 até cerca de 1.000.

Desempenho Relativo Médio

O procedimento para cálculo do desempenho relativo médio(DRmédio) é encontrado no Exemplo 5 do presente relatório descritivo. Asvariantes de Iipase aqui descritas podem ter um (DRmédio) de pelo menos0,8, pelo menos 1,1, pelo menos 1,5, ou mesmo de pelo menos 2 a cerca de1.000.

Ingredientes Detergentes

Para uso na presente invenção, composições detergentes inclu-em artigos e composições de limpeza e tratamento. Para uso na presenteinvenção, o termo "composição de limpeza e/ou tratamento" inclui, excetoonde indicado em contrário, agentes de lavagem para múltiplas finalidadesou para "tarefas pesadas" sob a forma de comprimidos, grânulos ou pó, es-pecialmente detergentes para lavagem de roupas, agentes de lavagem paramúltiplas finalidades sob a forma de líquido, gel ou pasta, especialmente oschamados tipos líquidos para tarefas pesadas, detergentes líquidos paratecidos delicados, agentes para lavagem manual de pratos ou agentes paralavagem de pratos para tarefas leves, especialmente aqueles do tipo comalta formação de espuma, agentes para lavagem de pratos à máquina, inclu-sive os vários tipos em comprimido, granulares, líquidos e de auxílio ao en-xágüe para uso doméstico e institucional. As composições podem, também,estar em embalagens de dose unitária, inclusive aquelas conhecidas na téc-nica e aquelas que são solúveis em água, insolúveis em água e/ou permeá-veis à água.

A composição detergente da presente invenção pode compre-ender uma ou mais variantes de Iipase da presente invenção. Em adição àvariante(s) de lipase, a composição detergente compreenderá, ainda, umingrediente detergente. Os ingredientes detergentes na lista não-limitadorailustrada mais adiante neste documento são adequados ao uso nas compo-sições da presente invenção e podem ser desejavelmente incorporados adeterminadas modalidades da invenção, por exemplo para auxiliar ou inten-sificar o desempenho de limpeza, para tratamento do substrato a ser limpo,ou para modificar a estética da composição para limpeza tal como é o casocom colorantes, corantes ou similares. A natureza exata desses componen-tes adicionais, bem como seus níveis de incorporação, dependerá da formafísica da composição e da natureza da operação de limpeza em que seráutilizada. Os ingredientes detergentes adequados incluem, mas não se limi-tam a, tensoativos, builders, agentes quelantes, agentes inibidores de trans-ferência de pigmentos, dispersantes, enzimas e estabilizantes de enzimas,ativadores de alvejamento, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido dehidrogênio, perácidos pré-formados, agentes poliméricos dispersantes, cla-readores, supressores de espuma, corantes, agentes anticorrosão, inibido-res de deslustre, perfumes, amaciantes de tecido, veículos, hidrótropos, e-lementos auxiliares ao processamento, solventes e/ou pigmentos.

Os detergentes típicos compreenderiam, em peso, qualquercombinação dos seguintes ingredientes: de 5% a 30% de tensoativo, de pre-ferência tensoativos aniônicos como alquil benzeno sulfonato linear e etóxisulfato de álcool, de 0,005% a 0,1% de proteína ativa de protease, em que aprotease é, de preferência, selecionada dentre Coronase®, FN4 FNA', ou Sa-vinase®, de 0,001% a 0,1% de proteína ativa de amilase, em que a amilaseé, de preferência, selecionada dentre Termamyl®, Natalase®, Stainzyme® ePurastar® e de 0,1% a 3% de quelantes, de preferência ácido dietileno tria-mina pentacético. Para produtos sob forma de grânulos e comprimidos, es-ses detergentes típicos seriam adicionalmente compreendidos, em peso,por: de 5% a 20% de alvejante, de preferência percarbonato de sódio, de 1%a 4% de ativador de alvejamento, de preferência TAED, e/ou de 0% a 30%de builder, de preferência de 5% a 30%, com mais preferência menos que10% de builder, como o zeólito de aluminossilicato A e/ou o tripolifosfato.

Agentes de Alvejamento - as composições detergentes da pre-sente invenção podem compreender um ou mais agentes de alvejamento.

Em geral, quando é usado um agente de alvejamento, as com-posições da presente invenção podem compreender de cerca de 0,1% acerca de 50%, ou mesmo de cerca de 0,1% a cerca de 25% de agente dealvejamento, em peso da presente composição para limpeza. Exemplos deagentes de alvejamento adequados incluem:

(1) fontes de peróxido de hidrogênio, por exemplo, sais de peri-drato inorgânicos, inclusive sais de metais alcalinos como sais sódicos deperborato (geralmente mono ou tetraidrato), sais de percarbonato, persulfa-to, perfosfato e persilicato, e combinações dos mesmos. Em um aspecto dainvenção, os sais de peridrato inorgânicos são selecionados a partir do gru-po consistindo em sais sódicos de perborato, de percarbonato, e combina-ções dos mesmos, sabões; e

(2) ativadores de alvejamento tendo R-(C=O)-L em que R é umgrupo alquila, opcionalmente ramificado tendo, quando o ativador de alveja-mento é hidrofóbico, de 6 a 14 átomos de carbono, ou de 8 a 12 átomos decarbono e, quando o ativador de alvejamento é hidrofílico, menos de 6 áto-

mos de carbono ou mesmo menos de 4 átomos de carbono, sendo que L éum grupo de saída. Exemplos de grupos de saída adequados são ácidobenzóico e derivados do mesmo, especialmente benzeno sulfonato. Os ati-vadores de alvejamento adequados incluem oxibenzeno sulfonato de dode-canoila, oxibenzeno sulfonato decanoil de, ácido decanoil oxibenzóico ouseus sais, hexanoil oxibenzeno sulfonato de 3,5,5-trimetila, tetraacetil etilenodiamina (TAED) e nonanoil oxibenzeno sulfonato (NOBS). Os ativadores dealvejamento adequados são, também, descritos em WO 98/17767. Emboraqualquer ativador de alvejamento adequado possa ser utilizado, em um as-pecto da invenção a presente composição para limpeza pode compreenderNOBS, TAED ou misturas dos mesmos,

(3) perácidos pré-formados.Quando presente, o perácido e/ou ativador de alvejamento estágeralmente presente na composição em uma quantidade de cerca de 0,1% acerca de 60%, de cerca de 0,5% a cerca de 40%, ou mesmo de cerca de0,6% a cerca de 10%, em peso, com base na composição. Um ou mais pre-cursores hidrofóbicos dos mesmos podem ser usados em combinação comum ou mais perácidos hidrofílicos ou precursores dos mesmos.

As quantidades de fonte de peróxido de hidrogênio e perácidoou ativador de alvejamento podem ser selecionadas de modo que a razãomolar entre oxigênio disponível (da fonte de peróxido) e perácido seja de 1:1a 35:1, ou mesmo de 2:1 a 10:1.

Tensoativos - As composições detergentes de acordo com apresente invenção podem compreender um tensoativo ou um sistema tenso-ativo no qual o tensoativo pode ser selecionado de tensoativos não-iônicos,tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfolíticos, tensoa-tivos zwiteriônicos, tensoativos não-iônicos semipolares e combinações dosmesmos. Quando presente, o tensoativo está, tipicamente, presente em umteor de cerca de 0,1 % a cerca de 60%, de cerca de 0,1 % a cerca de 40%, decerca de 0,1% a cerca de 12%, de cerca de 1% a cerca de 50%, ou mesmode cerca de 5% a cerca de 40%, em peso da presente composição.

Quando incluído, o detergente geralmente conterá de cerca de1 % a cerca de 40% de um tensoativo aniônico, como alquil benzeno sulfona-to linear, alfa-olefina-sulfonato, sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo),etóxi sulfato de álcool, alcano sulfonato secundário, metil éster de alfa-sulfoácido graxo, ácido alquil ou alquenil succínico ou sabão.

O detergente pode, opcionalmente, conter de cerca de 0,2% acerca de 40% de um tensoativo não-iônico, como álcool etoxilato, nonila fe-nol etoxilato, alquil poliglicosídeo, óxido de alquil dimetil amina, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanol amida de ácido graxo, amida deácido poliidróxi alquila graxo, ou derivados N-acil N-alquila de glicosamina("glucamidas").

Builders - as composições detergentes da presente invençãopodem compreender um ou mais builders ou sistemas de builder detergen-tes. Quando um builder é usado, a presente composição compreenderá, tipi-camente, ao menos cerca de 1%, de cerca de 5% a cerca de 60%, ou mes-mo de cerca de 10% a cerca de 40% de builder, em peso da presente com-posição. Os builders incluem, mas não se limitam a, sais de metal alcalino,amônio e alcanol amônio de polifosfatos, silicatos de metal alcalino ou silica-tos lamelares, carbonatos de metais alcalinos e alcalino-terrosos, builders àbase de aluminossilicato e os diversos sais de metal alcalino, amônio e a-mônio substituído de ácidos poliacéticos como ácido etilenodiamino tetraacé-tico e ácido nitrilotriacético, bem como policarboxilatos como ácido melítico,ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidissuccínico, ácido polimaléico, ácidobenzeno 1,3,5-tricarboxílico, ácido carbóxi metil oxi succínico e seus saissolúveis.

Agentes quelantes - as composições detergentes da presenteinvenção podem conter um agente quelante. Os agentes quelantes adequa-dos incluem agentes quelantes de cobre, ferro e/ou manganês, e combina-ções dos mesmos. Quando um agente quelante é usado, a presente compo-sição pode compreender de cerca de 0,005% a cerca de 15%, ou mesmo decerca de 3,0% a cerca de 10% de agente quelante, em peso da presentecomposição.

Clareadores - as composições detergentes da presente invençãopodem, também, conter componentes adicionais que podem alterar a apa-rência dos artigos sendo limpos, como clareadores fluorescentes. Esses cla-readores absorvem luz no espectro de UV e a emitem no espectro visível.Os teores adequados de clareador fluorescente incluem desde teores maisbaixos, de cerca de 0,01, de cerca de 0,05, de cerca de 0,1 ou mesmo decerca de 0,2%, em peso, até teores mais altos de 0,5 ou mesmo 0,75%, empeso.

Dispersantes - As composições da presente invenção podem,também, conter dispersantes. Os materiais orgânicos solúveis em água ade-quados incluem os ácidos homo ou copoliméricos, ou seus sais, em que oácido policarboxílico contenha ao menos dois radicais carboxila separadosum do outro por não mais de dois átomos de carbono.

Enzimas - em adição às variantes de Iipase da presente inven-ção, a composição detergente pode compreender uma ou mais outras enzi-mas que ofereçam benefícios de desempenho de limpeza e/ou de tratamen-to de tecidos, como uma protease, outra lipase, uma cutinase, uma amilase,uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabi-nase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma Iaca-se e/ou uma peroxidase.

Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) escolhida(s) precisa-riam ser compatíveis com os detergentes selecionados (isto é, ótimas quantoa pH, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não-enzimáticos, etc.), e a(s) enzima(s) precisariam estar presentes em quanti-dades eficazes.

As proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou mi-crobiana. É preferencial a origem microbiana. Estão incluídos os mutantesquimicamente modificados ou obtidos mediante engenharia de proteínas. Aprotease pode ser uma protease de serina ou uma metaloprotease, de prefe-rência uma protease microbiana alcalina, ou uma protease semelhante àtripsina. Exemplos de proteases alcalinas são as subtilisinas, especialmenteaquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Car-Isberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (descrita em WO89/06279), SEQ. ID Ns 4 e SEQ. ID Ne 7 em WO 05/103244. Outras protea-ses de serina adequadas incluem aquelas de Micrococcineae spp, especial-mente Cellulonas spp e variantes da mesma, conforme descrito emW02005052146. Exemplos de proteases semelhantes à tripsina são a tripsi-na (por exemplo de origem porcina ou bovina) e a protease de Fusariumdescrita em WO 89/06270 e WO 94/25583.

Exemplos de proteases úteis são as variantes descritas em WO92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 e WO 98/34946, especialmente asvariantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 27, 36,57, 68, 76, 87, 97, 101, 104, 106, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222,224, 235, 245, 252 e 274, e dentre outras variantes com as seguintes muta-ções: (K27R, V104Y, N123S, T124A), (N76D, S103A, V104I), ou (S101G,S103A, V104I, G159D, A232V, Q236H, Q245R, N248D, N252K). Outros e-xemplos de proteases úteis são as variantes descritas em WO 05/052146,especialmente aquelas com substituições em uma ou mais das seguintesposições: 14, 16, 35, 65, 75, 76, 79, 123, 127, 159 e 179.

As enzimas protease preferenciais disponíveis comercialmenteincluem Alcalase®, Savinase®, Primase®, Duralase®, Esperase®, Coronase®,Polarzyme® e Kannase® (Novozymes A/S), Maxatase®, Maxacal®, Maxa-pem®, Properase®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect OxP®, FN2, FN3 eFN4 (Genencor International Inc.).

As Iipases incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica.Estão incluídos os mutantes quimicamente modificados ou obtidos medianteengenharia de proteínas. Exemplos de Iipases úteis incluem aquelas obtidasde Humicola (sinônimo: Thermomyces), por exemplo de H. Ianuginosa (sinô-nimo: T. lanuginosus) conforme descrito em EP 258 Ò68 e EP 305 216, oude H. insolens conforme descrito em WO 96/13580, uma Iipase de Pseudo-monas, por exemplo de P. alcaligenes ou de P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens,Pseudomonas sp., cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wiscon-sinensis (WO 96/12012), uma Iipase de Bacillus, por exemplo de B. subtilis(Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B.stearothermophilus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422).

Outros exemplos são as variantes de Iipase como aquelas des-critas em WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

Outras enzimas Iipase disponíveis comercialmente incluem Lipo-lase®, Lipolase Ultra® e Lipex® (Novozymes A/S).

As amilases (a e/ou β) adequadas incluem aquelas de origembacteriana ou fúngica. Estão incluídos os mutantes quimicamente modifica-dos ou obtidos mediante engenharia de proteínas. As amilases incluem, porexemplo, α-amilases obtidas a partir de Bacillus, por exemplo uma cepa es-pecial de B. licheniformis, descrita com mais detalhes em GB 1.296.839.

Exemplos de amilases úteis são as variantes descritas em WO94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 e WO 97/43424, especialmente asvariantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23,105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243,264, 304, 305, 391, 408 e 444.

As amilases disponíveis comercialmente são Duramyl®, Ter-mamyl®, Stainzyme®, Stainzyme Ultra®, Fungamyl® e ΒΑΝ® (NovozymesA/S), bem como Rapidase® e Purastar® (Genencor International Inc.).

As celulases adequadas incluem aquelais de origem bacterianaou fúngica. Estão incluídos os mutantes quimicamente modificados ou obti-dos mediante engenharia de proteínas. As celulases adequadas incluemcelulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium1 Thiela-via, Acremonium, por exemplo as celulases fúrigicas produzidas a partir deHumicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum, des-critas em US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 e WO89/09259.

As celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neu-tras oferecendo benefícios de cuidado das cores. Exemplos dessas celula-ses são aquelas descritas em EP O 495 257, EP O 531 372, WO 96/11262,WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulasecomo aquelas descritas em WO 94/07998, EP O 531 315, US 5,457,046, US5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.As celulases disponíveis comercialmente incluem Renozyme®, Celluclean®,Endolase®, Celluzyme® e Carezyme® (Novozymes A/S), Clazinase® e Pura-dax HA® (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)® (Kao Corporation).

Peroxidases/Oxidases:

As peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origemvegetal, bacteriana ou fúngica. Estão incluídos os mutantes quimicamentemodificados ou obtidos mediante engenharia de proteínas. Exemplos de pe-roxidases úteis incluem aquelas de Coprinus, por exemplo de C. cinereus, evariantes das mesmas, como aquelas descritas em WO 93/24618, WO95/10602 e WO 98/15257.

As peroxidases disponíveis comercialmente incluem Guardzy-me® (Novozymes A/S).

Quando presentes em uma composição para limpeza, as enzi-mas anteriormente mencionadas podem estar em teores na faixa de cercade 0,00001 % a cerca de 2%, de cerca de 0,0001 % a cerca de 1 % ou mesmode cerca de 0,001% a cerca de 0,5% de proteína de enzima, em peso dacomposição.

Estabilizantes de Enzimas - As enzimas para uso em detergen-tes podem ser estabilizadas por meio de várias técnicas. As enzimas empre-gadas neste caso podem ser estabilizadas pela presença de fontes solúveisde água de íons de cálcio e/ou magnésio nas composições finais que forne-cem tais íons às enzimas. Outros agentes estabilizantes convencionais, porexemplo um poliol como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool deaçúcar, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, por e-xemplo um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenilborônicocomo ácido 4-formilfenil borônico, também podem ser usados, e a composi-ção pode ser formulada conforme descrito, por exemplo, em WO 92/19709 eWO 92/19708.

Solventes - Os solventes adequados incluem água é outros sol-ventes como fluidos lipofílicos. Exemplos de fluidos lipofílicos adequadosincluem siloxanos, outros silicones, hidrocarbonetos, éteres de glicol, deriva-dos de glicerina como éteres de glicerina, aminas perfluoradas, solventesperfluorados e à base de éter hidrofluorado, solventes orgânicos não-fluorados de baixa volatilidade, solventes à base de diol, outros solventesambientalmente amigáveis e misturas desses itens.Método de Lavagem

A presente invenção inclui um método para limpeza e/ou trata-mento de um local entre outros uma superfície ou um tecido. Esse métodoinclui as etapas de colocar uma modalidade da composição de limpeza dasRequerentes, em sua forma pura ou diluída em um líquido de lavagem, emcontato com pelo menos uma porção de uma superfície ou tecido e então,opcionalmente, enxaguar essa superfície ou esse tecido. Pode-se submetera superfície ou o tecido a uma etapa de lavagem antes da etapa de enxágüemencionada acima. Para as finalidades da presente invenção, a lavageminclui, porém não se limita a, esfregamento e agitação mecânica. Como seráapreciado por um versado na técnica, as composições de limpeza da pre-sente invenção são idealmente adequadas para uso em aplicações de lava-gem de roupas. Conseqüentemente, a presente invenção inclui um métodode lavagem de um tecido. O método inclui as etapas de colocar um tecido aser lavado em contato com a dita solução de limpeza para lavanderia con-tendo ao menos uma modalidade das Requerentes para composição de lim-peza, aditivo de limpeza ou uma mistura desses itens. O tecido pode conterpraticamente qualquer tecido que possa ser lavado em condições de usonormais pelo consumidor. A solução tem, de preferência um pH na faixa decerca de 8 a cerca de 10,5. As composições podem ser usadas em concen-trações de cerca de 100 ppm, de preferência de 500 ppm a cerca de 15.000ppm em solução. As temperaturas da água situam-se, tipicamente, na faixade cerca de 5°C a cerca de 90°C. A invenção pode ser particularmente be-néfica sob condições de baixa temperatura da água, por exemplo, abaixo de30°C ou abaixo de 25 ou 20°C. A razão entre água e tecido situa-se, tipica-mente, na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.

Exemplos de Variantes de Lipase

Os produtos químicos usados como tampões e substratos sãoprodutos comercialmente disponíveis pelo menos com grau de reagente.

- Meios e soluções: LAS (Surfac PS®) e Zeolite A (Wessalith P®). Outros in-gredientes usados são reagentes para laboratório convencionais.

- Materiais: EMPA221 disponível junto à EMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse5, CH-9014St. Gallen, Suíça.

Exemplo 1: Produção de Enzima

Um plasmídio contendo o gene que codifica a Iipase é construí-do e transformado em uma célula hospedeira adequada, mediante o uso demétodos-padrão da técnica.

A fermentação é realizada sob a forma de fermentação por lotealimentado, mediante o uso de um meio com temperatura constante de34°C, e um volume inicial de 1,2 litros. O pH inicial do meio é ajustado para6,5. Uma vez que o pH tenha aumentado para 7,0, esse valor é mantido me-diante a adição de H3P04 a 10%. O teor de oxigênio dissolvido no meio écontrolado mediante a variação da taxa de agitação, usando-se uma taxa deaeração fixa de 1,0 litro de ar por litro de meio, por minuto. A taxa de adiçãode alimento é mantida a um teor constante durante toda a fase de lote ali-mentado. O meio do lote continha xarope de maltose como fonte de carbo-no, uréia e extrato de levedura como fonte de nitrogênio, e uma mistura deoligoelementos metálicos e sais. O alimento adicionado de maneira contínuadurante a fase de lote alimentado contém xarope de maltose como fonte decarbono, enquanto extrato de levedura e uréia são adicionados para assegu-rar um suprimento suficiente de nitrogênio.

A purificação da Iipase pode ser feita mediante o uso de méto-dos-padrão conhecidos na técnica, por exemplo mediante a filtração do so-brenadante da fermentação, e a subseqüente cromatografia hidrofóbica etroca de ânions, por exemplo conforme descrito em EP 0 851 913, Exemplo3.

Exemplo 2: TEMA (Teste de Esforço Mecânico Automatizado) para cálculodo Desempenho Relativo (DR).

As variantes de enzima do presente pedido são testadas medi-ante o uso de Teste de Esforço Mecânico Automatizado (TEMA). Com o tes-te TEMA, pode-se examinar o desempenho de lavagem de uma grandequantidade de soluções enzimáticas detergentes em pequenos volumes. Aplaca de TEMA tem um certo número de fendas para soluções de teste, euma tampa que comprime firmemente a amostra de produto têxtil a ser Iava-da contra as aberturas em fenda. Durante o tempo de lavagem, a placa, assoluções de teste, o produto têxtil e a tampa são vigorosamente agitadospara colocar a solução de teste em contato com o produto têxtil, e para apli-car esforço mecânico. Para uma descrição mais detalhada, vide WO02/42740, especialmente o parágrafo "Special method embodiments", naspáginas 23 a 24. Os recipientes, que contêm a solução de teste do detergen-te, consistem em orifícios cilíndricos (6 mm de diâmetro, 10 mm de profundi-dade) em uma placa de metal. O tecido manchado (material de teste) fica notopo da placa de metal e é usado como tampa e lacre nos recipientes. Umaoutra placa de metal fica no topo do tecido manchado para evitar qualquerderramamento de cada um dos recipientes. As duas placas de metal, juntascom o tecido manchado, são vibradas para cima e para baixo a uma fre-qüência de 30 Hz, com uma amplitude de 2 mm.

O ensaio é conduzido sob as condições experimentais abaixoespecificadas:

0,5 g/L de LAS

Solução de Teste 0,52 g/L de Na2C03 1,07 g/L de zeólito A 0,52 g/L de citrato trissódico<table>table see original document page 26</column></row><table>

Tabela 3

Amostras com creme e turmérico foram preparadas mediante amisturação de 5 g de turmérico (Santa Maria, Dinamarca) com 100 g decreme (38% de gordura, Arla, Dinamarca) a 50°C, sendo que a mistura foideixada a essa temperatura durante cerca de 20 minutos e filtrada (50°C)para remover quaisquer partículas não dissolvidas. A mistura é resfriada até20°C, e amostras de tecido de algodão, EMPA221, são imersas na misturade creme e turmérico, sendo então deixadas secar à temperatura ambientede um dia para outro e congeladas até o uso. A preparação das amostras decreme-turmérico é descrita na patente PA 2005 00775, depositada em 27 demaio de 2005.

O desempenho da variante de enzima é medido como o brilhoda cor das amostras de produto têxtil lavadas com aquela variante de enzi-ma específica. O brilho pode, também, ser expresso como a intensidade daluz refletida a partir da amostra de produto têxtil quando iluminada com luzbranca. Quando o produto têxtil está manchado, a intensidade da luz refleti-da é mais baixa que aquela de um produto têxtil limpo. Portanto, a intensida-de da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem deuma variante de enzima.

As medições de cor são feitas em uma scanner de base planade uso profissional (PFU DL2400pro), a qual é usada para capturar uma i-magem das amostras de produto têxtil lavadas. As digitalizações são feitascom uma resolução de 200 dpi e com uma profundidade de cor na saída de24 bits. Para a obtenção de resultados acurados, a scanner é calibrada fre-qüentemente com um alvo reflexivo Kodak IT8.

Para extrair um valor da intensidade de luz das imagens digitali-zadas, é usado um aplicativo de software especialmente projetado (No-vozymes Color Vector Analyzer). O programa recupera os valores de pixelem 24 bits da imagem, e os converte em valores para vermelho, verde e azul(RGB, ou Red, Green, Blue). O valor da intensidade (Int) é calculado medi-ante a adição dos valores RGB como vetores e, então, tomando-se o com-primento do vetor resultante:

<formula>formula see original document page 27</formula>

O desempenho de lavagem (D) das variantes é calculado deacordo com a seguinte fórmula:

D = lnt(v) - lnt(r)

em que

lnt(v) é o valor de intensidade de luz da superfície do produto têxtil lavadacom a enzima testada, enquanto lnt(r) é o valor de intensidade de luz da su-perfície do produto têxtil lavada sem a enzima testada.

É dada uma pontuação de desempenho relativo como resultadoda lavagem TEMA, de acordo com a definição: as pontuações de Desempe-nho Relativo (DR) são a somatória dos desempenhos (D) das variantes deenzima testadas contra a enzima de referência: DR = D(enzima de tes-te)/D(enzima de referência).

O DRmédio indica o desempenho relativo médio em compara-ção ao da enzima de referência em todas as quatro concentrações de enzi-mas (0,125, 0,25, 0,5, 1,0 mg ep/l)

DRmédio = média(DR(0,125), DR(0,25), DR(0,5), DR(1,0))Considera-se que a variante exibe desempenho de lavagem oti-mizado se tiver um desempenho melhor que o da referência. No contexto dapresente invenção, a enzima de referência é a Iipase da SEQ. ID Ns 2, comas substituições T231R + N233R.

Exemplo 3: CG - cromatógrafo gasoso - para cálculo do fator de risco.

A liberação de ácido butírico a partir das amostras lavadas comlipase foi medida por meio de cromatografia a gás por microextração em fa-se sólida (MEFS-CG), utilizando-se o método exposto a seguir. Quatro pe-ças de produto têxtil (com 5 mm de diâmetro), lavadas na solução especifi-cada na Tabela 3, contendo 1 mg/L de lipase, foram transferidas para umfrasco de cromatografia gasosa (CG). As amostras são analisadas em umcromatógrafo gasoso Varian 3800 GC equipado com uma coluna de prote-ção Stabilwax- DA w/Integra (30m, 0,32 mm ID e 0,25 micro-m df) e umafibra Carboxen PDMS para MEFS (75 micro-m). Cada amostra foi pré-incubada durante 10 min a 40°C, seguido de 20 min de amostragem com afibra para MEFS no espaço livre sobre as peças de produto têxtil. A amostrafoi, subseqüentemente, injetada na coluna (temperatura do injetor =250°C).Fluxo da coluna = 2 mL hélio/min. Gradiente de temperatura do forno de co-luna: 0 min = 40°C, 2 min = 40°C, 22 min = 240°C, 32 min = 240°C. O ácidobutírico foi detectado por meio de detecção FID, e a quantidade de ácidobutírico foi calculada com base em uma curva padrão para ácido butírico.

O desempenho de risco para odor, R, de uma variante de lipaseé a razão entre a quantidade de ácido butírico liberado pela amostra lavadacom a variante de lipase e a quantidade de ácido butírico liberado por umaamostra lavada com a lipase da SEQ. ID Ns 2 com as substituições T231R +N233R (enzima de referência), depois de ambos os valores terem sido corri-gidos para a quantidade de ácido butírico liberado por uma amostra lavadasem lipase. O risco (R) das variantes é calculado de acordo com a fórmula abaixo:

Odor = medido em micro g de ácido butírico desenvolvido a 1 mg de proteí-na de enzima/l corrigido para a amostra de controle

Clenzimadeteste = OdorenZimadeteste - arnostra de controleQenzima de referência — OdOfenzima de referência " amOStra d© ΟΟΠίΓΟίβR = Qenzima de teste/Qenzima de referência

Considera-se que a variante exibe odor reduzido, em compara-ção à referência, se o fator R for menor que 1.

Exemplo 4: Atividade (LU) em relação à absorbância a 280nm

A atividade de uma Iipase em relação à absorbância a 280 nm èdeterminada por meio do ensaio LU/A280:

A atividade da Iipase é determinada conforme descrito acima naseção "Atividade da lipase". A absorbância da Iipase a 280 nm é medida(A280), e a razão LU/A280 é calculada. A LU/A280 relativa é calculada comoa LU/A280 da variante dividida pela LU/A280 de uma enzima de referência.No contexto da presente invenção, a enzima de referência é a lipase daSEQ. ID NQ2, com as substituições T231R + N233R.Exemplo 5: RB - Relação risco/benefício

O fator risco/benefício descrevendo o desempenho em compa-ração ao risco reduzido para ocorrência de odores é, portanto, definido co-mo: RB = DRmédio/R.

Considera-se que a variante exibe desempenho de lavagem oti-mizado e odor reduzido, se o fator RB for mais alto que 1.

Mediante a aplicação dos métodos acima descritos, foram obti-dos os seguintes resultados:

<table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>

Tabela 4

A lipase de referência e as variantes 7 e 8 na Tabela 4 são des-critas em WO 2000/060063.

Exemplos de Detergente

As identificações abreviadas de componentes dos exemplossão:

LAS de alquil benzeno sulfonato sódico Cn -13 linear.

CxyAS Alquil sulfato de sódio C1x - C1y.

CxyEzS Alquil sulfato de sódio C1x -C1y, condensado com umamédia de z mols de óxido de etileno.

CxyEy Álcool C1x - C1y com uma média de etoxilação de z

QAS R2.N+(CH3)2(C2H4OH) com R2 = C10-C12

Silicato Silicato de sódio amorfo (razão SiO2:Na2O de 1,6 a 3,2:1)

Zeólito A Aluminossilicato de sódio hidratado, de fórmulaNai2(AIO2SiO2)I2- 27H20 tendo um tamanho de partículaprincipal na faixa de 0,1 a 10 micrômetros (peso expressoem uma base anidra).

(Na-)SKS-6 Silicato cristalino lamelar, de fórmula õ-Na2Si205.

Citrato Citrato diidrato trissódico.

Cítrico Ácido cítrico anidro.

Carbonato Carbonato de sódio anidro.

Sulfato Sulfato de sódio anidroΜΑ/ΑΑ Copolímero aleatório de acrilato/maleato a 4:1, com pesomolecular médio de cerca de 70.000 a 80.000.

Polímero AA Polímero de poliacrilato de sódio, com peso molecularmédio de 4.500.

ΡΒ1/ΡΒ4 Monoidrato/tetraidrato perborato de sódio anidro.

PC3 Percarbonato de sódio anidro [2,74 Na2C03.3H202]

TAED Tetraacetil etileno diamina

NOBS nonanoil oxibenzeno sulfonato, sob a forma do sal sódico.

DTPA Ácido dietileno triamina pentaacético.

HEDP Difosfonato de hidroxietano

EDDS Sal de Na de ácido etilenodiamino-N,N'-dissuccínico, isô-mero (S1S)

STPP Tripolifosfato de sódio

Protease Enzima proteolítica disponível comercialmente sob osnomes Savinase®, Alcalase®, Everlase®, Coronase® ePolarzyme® junto à Novozymes A/S, Properase®, Pura-fect®, Purafect MA® e Purafect Ox® junto à Genencor, eproteases descritas nas patentes WO 91/06637, e/ou WO95/10591, e/ou EP 0 251 446 como FNA, FN3 e/ou FN4.

Amilase Enzima amilolítica disponível comercialmente sob os no-mes Purastar® e Purafect Oxam® junto à Genencor;Termamyl®, Fungamyl®, Duramyl®, Stainzyme® e Nata-lase® junto à Novozymes A/S.

Lipase Qualquer das variantes de Iipase de 1 a 5, descritas noExemplo 5, Tabela 4, e combinações das mesmas.

Mananase Mannaway® disponível comercialmente junto à Novozy-mes

CMC, HEC ou EMC Carbóxi metil ou hidróxi etil celulose, ou celulose modifi-cada com éster.

Aglomerado SS. Aglomerado de supressor de espuma: 12% silicone/sílica,18% álcool estearílico, 70% amido sob forma granular.

TEPAE Etoxilato de tetraetileno pentaamina.

PH Medido sob a forma de uma solução a 1 % em água desti-lada a 20°C

Exemplo A

Composições detergentes alvejantes sob a forma de detergentesgranulados para lavagem de roupas são exemplificados pelas formulaçõesexpostas a seguir.<table>table see original document page 32</column></row><table>

Qualquer das composições no Exemplo A é usada para lavartecidos a uma concentração de 600 a 10.000 ppm em água, com as condi-ções típicas médias de 2.500 ppm, 25°C e uma razão água:pano de 25:1. OpH típico é de cerca de 10, mas pode ser ajustado alterando-se a proporçãode ácido para a forma de sal sódico do alquil benzeno sulfonato.

Exemplo B

Composições detergentes alvejantes sob a forma de detergentesgranulados para lavagem de roupas são exemplificados pelas formulaçõesexpostas a seguir.

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Qualquer das composições acima, no Exemplo B, é usada paralavagem de tecidos a uma concentração de 10.000 ppm em água, a umatemperatura de 20 a 90°C e a uma razão água:tecido de 5:1. O pH típico éde cerca de 10, mas pode ser ajustado alterando-se a proporção de ácidopara a forma de sal sódico do sulfonato de alquil benzeno.

Exemplo C

<table>table see original document page 34</column></row><table>

1 Números dados em mg de enzima/100 gconforme descrito em US 4.597.898.disponível sob o nome comercial LUTENSIT® junto à BASF, e confor-me aqueles descritos em WO 01/05874

Todos os documentos citados na Descrição Detalhada da Inven-ção são, em sua parte relevante, aqui incorporados por referência, e a cita-ção de qualquer documento não deve ser interpretada como admissão deque este represente técnica anterior em relação à presente invenção.

Se houver conflito entre qualquer significado ou definição de umtermo mencionado neste documento e o significado ou definição do mesmotermo em um documento incorporado a título de referência, o significado oudefinição atribuído ao termo mencionado neste documento terá precedência.

Embora modalidades específicas da presente invenção tenhamsido ilustradas e descritas, deve ficar óbvio aos versados na técnica que vá-rias outras alterações e modificações podem ser feitas sem que se desvie docaráter e âmbito da invenção. Portanto, pretende-se cobrir nas reivindica-ções anexas todas essas alterações e modificações que se enquadram noescopo da presente invenção.<table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table><110> The Procter & Gamble Company

<120> Composições Detergentes

<130> CM3051ML

<160> 16

<170> Patentln version 3.3

<210> 1<211> 807<212> DNA<213> Thermomyces Ianuginosus

<220><221> CDS<222> (1)..()

<220><221> mat_peptide<222> (1)..()

<400> 1

gag gtc tcg cag gatGlu Val Ser Gln Asp1 5

ctg ttt aac cag ttc aat ctc ttt gca cag tatLeu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr10 15

48

tct·gca gcc gca tac tgc ggaSer Ala Ala Ala Tyr Cys Gly20

aac att acg tgc acgAsn Ile Thr Cys Thr35

gga aatGiy Asn

gca acg ttt ctc tac tcg tttAla Thr Phe Leu Tyr Ser Phe50 55

ggc ttc ctt gct ctc gac aacGly Phe Leu Ala Leu Asp Asn65 70

cgt ggc tct cgt tcc ata gagArg GIy Ser Arg ser Ile Glu85

ttg aaa gaa ata aat gac attLeu Lys Glu Ile Asn Asp lie100

aaa aac aat gatLys Asn Asη Asρ25

gcc tgc ccc gagAla Cys Pro Glu40

gaa gac tct ggaGlu Asp ser Giy

acg aacThr Asn

aac tggAsn Trp

aaa ttgLys Leu75

ate gagIle Gly90

gcc ccaAla Pro

gta gagVal Glu45

ggcVaJ Gly60

ate gtcIle Val

aat cttAsa Leu

tgc tccCys ser105

g^c tgc

agg ggay Cys Arg Gly

gct ggt acaAla Gly Thr30

aag gcg gatLys Ala Asp

gat gtc accAsp Val Thr

ctc tct ttcLeu ser Phe80

aac ttc gacAsn Phe Asp95

cat gac ggcHis Asp Gly110

96

144

192

240

288

336

ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat acg

Phe Thr ser Ser Trp Arg ser vai Ala Asp Thr115 120

gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat cgc

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg

130 135

tta aggLeu Arg125

gtg gtgvai vai140

cag aagGln Lys Va

ttt acc ggaPhe Thr Gly

384

432cat age ttg ggt ggt gea ttg gea act gtt gcc gga gea gac ctg cgt 480His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr vai Ala Gly Ala Asp Leu Arg145 150 155 160

gga aat ggg tat gat ate gac gtg ttt tca tat gqc gcc ccc cga gtc 528Gly Asn Gly Tyr Asp lie Asp VaT Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val 165 170 175

gga aac agg gct ttt gea gaa ttc ctg acc gta cag acc ggc gga aca 576Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu phe Leu Thr vai Gln Thr Gly Gly Thr 180 185 190

etc tac cgc att acc cac acc aat gat att gtc cct aga ctc ccg ccg 624Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp lie vai Pro Arg.Leu Pro Pro 195 200 205

cgc gaa ttc ggt tac age cat tet age cca gag tac tgg ate aaa tet 672Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys ser 210 215 220

gga acc ctt gtc ccc gtc acc cga aac gat ate gtg aag ata gaa ggc 720

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp lie Val Lys Ile Glu Gly225 230 235 240

ate gat gcc acc gqc gqc aat aac cag" cct aac att ccg gat ate cct 768Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro 245 250 255

gcg cac cta tgg tac ttc gag tta att ggg aca tgt ctt 807Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu 260 265

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 2

Glu vai ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr 20 25 30

Asn Ile Thr cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp 35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr ser Phe Glu Asp ser Gly val Gly Ásp vai Thr 50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu lie Val Leu ser Phe65 70 75 80

Arq Gly Ser Arg ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp 85 90 95Leu Lys Glu Ile Asn Asp lie Cys ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly100 105 110

Phe Thr ser ser Trp Arg ser vai Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys vai115 120 125

Glu Asp Ala vai Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg vai Val Phe Thr Gly130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp xle Val Pro Arg Leu Pro Pro195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Xle Lys Ser210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu lie Gly Thr Cys Leu260 265

<210> 3<211> 265<212> PRT

<213> Absi di a ref1exa<400> 3

Ser ser Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg lie Ala ser Glu Ala Glu Ile1 5 10 15

Lys Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg20 25 30

Thr Val lie Pro Gly Gly Arg Trp Ser Cys Pro His Cys Gly Val Ala35 40 45Ser Asn Leu Gln Ile Thr Lys Thr Phe Ser Thr Leu Ile Thr Asp Thr50 55 60

Asn Val Leu Val Ala Val Gly Glu Lys Glu Lys Thr Ile Tyr vai vai65 70 75 80

Phe Arg Gly Thr Ser ser lie Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile vai Phe85 90 95

Val Pro vai Asn Tyr Pro pro vai Asn Gly Ala Lys vai His Lys Gly100 105 110

Phe Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu vai115 120 125

Lys Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile vai vai Thr Gly130 155 140

His ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr145 150 155 160

His His Gly His Ala Asn Ile Glu lie Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg165 170 175

Ile Gly Thr Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val lie Gly Thr Lys Ile Pro180 185 190

Tyr Gln Arg Leu vai His Glu Arg Asp lie vai Pro His Leu Pro Pro195 200 205

Gly Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys210 215 220

Asp Ser Ser Leu Arg Val Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr ASp Asn Cys225 230 235 240

Ser Asn ser Ile Val Pro Phe Thr ser vai Ile Asp His Leu Ser Tyr245 250 255

Leu Asp Met Asn Thr Gly Leu Cys Leu260 265

<210> 4<211> 264<212> PRT

<213> Absidia corymbifera<400> 4Ser Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu He Lys1 5 10 15

Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg Thr20 25 30

Val Ile Pro Gly Gly Gln Trp ser Cys Pro His Cys Asp Val Ala Pro35 40 45

Asn Leu Asn Ile Thr Lys Thr Phe Thr Thr Leu Ile Thr Asp Thr Asn50 55 60

vai Leu vai Ala vai Gly Glu Asn Glu Lys Thr Ile Tyr vai Val Phe65 70 75 80

Arq Gly Thr ser Ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile vai Phe vai85 90 95

Pro Val Asn Tyr Pro Pro Val Asn Gly Ala Lys vai His Lys Gly'Phe100 105 110

Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu vai Lys115 120 125

Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val vai Thr Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr His145 150 155 160

His Gly His Asp Asn lie Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Ile165 170 175

Gly Thr Pro Glu Phe Ala Asn Tyr vai Ile Gly Thr Lys Ile Pro Tyr180 185 190

Gln Arg Leu vai Asn Glu Arg Asp Ile vai Pro His Leu Pro Pro Gly195 200 205

Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys Asp210 215 220

Ser Ser Leu Arg vai Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys Ser225 230 235 240

Asn Ser lie vai Pro Phe Thr ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr Leu245 250 255Asρ Met Asη Thr Gly Leu Cys Leu260

<210> 5<211> 269<212> PRT

<213> Rhizomucor miehei<400> 5

Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu1 5 10 15

Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr vai20 25 30

Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp35 40 45

Leu Lys lle Ile Lys Thr Trp ser Thr Leu ile Tyr Asp Thr Asn Ala50 55 60

Met Val Ala Arg Gly Asp ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ilé Val Phe Arg65 70 75 80

Gly Ser sér Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro85 90 95

Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu100 105 110

Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp115 120 125

Gln Phe Lys Gln- Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser130 135 140

Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln Arg145 150 155 160

Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln165 170 175

Pro Arg vai Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr vai Val Ser Thr Gly180 185 190

ile Pro Tyr Arg Arg Thr vai Asn Glu Arg Asp Ile vai Pro His Leu195 200 205Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp lie210 215 220

Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu225 230 235 240

Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp245 250 255

His Leu Ser Tyr Phe Gly lie Asn Thr Gly Leu Cys Thr260 265

<210> 6<211> 271<212> PRT

<213> Rhizopus oryzae<400> 6

Ser Ala ser Asp Gly Gly Lys Val vai Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile1 5 10 15

Gln Glu Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg20 25 30

Ser Val Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys vai Gln Cys Gln Lys Trp35 40 45

Val Pro Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp50 55 60

Thr Asn Gly Tyr vai Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu65 70 75 80

Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val85 90 95

Phe Asn Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala100 105 110

Gly Phe Leu ser Ser Tyr Glu Gln vai Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val115 120 125

Val Gln Glu Gln Leu Thr Ala His Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr130 135 140

Gly His ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu145 150 155 160Tyr Gln Arg Glu Pro Arg Leu ser Pro Lys Asn Leu Ser Xle Phe Thr165 170 175

Val Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr vai Glu180 185 190

Ser Thr Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr vai His Lys Arg Asp Ile vai195 200 205

Pro His vai Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu210 215 220

Ser Trp Ile Lys ser Gly Thr Ser Asn vai Gln Ile Cys Thr ser Glu225 230 235 240

Ile Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr ser lie245 250 255

Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly ser Cys Leu260 265 270

<210> 7<211> 267<212> PRT

<213> Aspergillus níger<400> 7

Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp1 5 10 15

Leu Tyr Ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr20 25 30

Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys lie35 40 45

Tyr Asn ser Gln Thr Asp lie Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp Ser50 55 60

ser Lys Glu Ile Ile Thr vai Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro85 90 95

Gln cys Asn Gly Cys Glu Val His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Val100 105 110Ser Val Gln Asp Gln Val Glu ser Leu Val Lys Gln Gln Val Ser Gln115 120 125

Tyr pro Asp Tyr Ala Leu Thr vai Thr Gly His Ser Leu Gly Ala ser130 135 140

Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn lie145 150 155 160

Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg ser Gly Asn Gln Ala Phe Ala165 170 175

Ser Tyr Met Asn Asp Ala Phe Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln180 185 190

Tyr Phe Arg vai Thr His Ala Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro195 200 205

Val Glu Gln Gly Tyr Ala His Gly Gly vai Glu Tyr Trp Ser Val Asp210 215 220

Pro Tyr Ser Ala Gln Asn Thr Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu vai Gln225 230 235 240

Cys cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly vai Asn Asn Ala His Thr Thr245 250 255

Tyr Phe Gly Met Thr Ser Gly Ala Cys Thr Trp260 265

<210> 8<211> 266<212> PRT

<213> Aspergillus tubingensis<400> 8

Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp1 5 10 15

Leu Tyr Ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr xle ser Gln Ala Ala Tyr20 25 30

Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro Ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile35 40 45

Tyr Asn ser Gln Thr Asp Ile Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp ser50 55 60ser Lys Glu Ile lie Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro85 90 95

Gln cys Asn ser Cys Glu Val His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp lie100 105 110

Ser vai Gln Asp Gln Val Glu Ser Leu Val Gln Gln Gln Val Ser Gln115 120 125

Phe Pro Asp Tyr Ala Leu Thr vai Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser130 135 140

Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu ser Ala Thr Tyr Asp Asn Ile145 150 155 160

Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg ser Asn Gln Ala Phe Ala Ser165 170 175

Tyr Met Asn Asp Ala Phe Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln Tyr180 185 190

Phe Arg vál Thr His Ala Asn Asp Gly ile Pro Asn Leu Pro Pro Ala195 200 205

Asp Glu Gly Tyr Ala His Gly vai vai Glu Tyr Trp ser vai Asp Pro210 215 220

Tyr Ser Ala Gln Asn Thr Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu Val Gln Cys225 230 235 240

cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly vai Asn Asn Ala His Thr Thr Tyr245 250 255

Phe Gly Met Thr ser Gly His Cys Thr Trp260 265

<210> 9<211> 276<212> PRT

<213> Fusarium oxysporum<400> 9

Ala vai Gly Val Thr Thr Thr Asp Phe ser Asn Phe Lys Phe Tyr He1 5 10 15Gln His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ser20 25 30

Lys Ile Thr Cys ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Gly Asn Gly35 40 45

Ala Thr Ile Val Thr Ser Phe Val Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly50 55 60

Tyr Val Ala Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu Ile vai Val ser Phe Arg65 70 75 80

Gly Ser lie Asn lie Arg Asn Trp Lea Thr Asn Leu Asp Phe Gly Gln85 90 95

Glu Asp Cys Ser Leu Val ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln100 105 110

Arg Ala Trp Asn Glu Ile Ser Ser Gln Ala Thr Ala Ala Val Ala Ser115 120 125

Ala Arg Lys Ala Asn Pro ser Phe Ash vai Ile Ser Thr Gly His Ser130 135 140

Leu Gly Gly Ala Val Ala vai Leu Ala Ala Ala Asn Leu Arg Val Gly145 150 155 160

Gly Thr Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn165 170 175

Ala Gln Leu ser Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Tyr Arg180 185 190

Val Thr His Ala Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe195 200 205

Gly TVr Arg His Thr Thr Pro Glu Phe Trp Leu Ser Gly Gly Gly Gly210 215 220

Asp Lys vai Asp Tyr Thr Ile Ser Asp Val Lys vai Cys Glu Gly Ala225 230 235 240

Ala Asn Leu Gly Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Ala Ala245 250 255

His Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe260 265 270

Ser Trp Arg Arg

<210> 10

<211> 273

<212> PRT

<213> Fusari um heterosporum

<400> 10

Thr Val Thr Thr Gln Asp Leu Ser Asn Phe Arg Phe Tyr Leu Glrr His1 5 10 15

Ala Asp Ala Ala Tyr Cys Asn Phe Asn Thr Ala vai Gly Lys Pro Val20 25 30

His Cys ser Ala Gly Asn Cys Pro Asp lie Glu Lys Asp Ala Ala Ile35 40 45

vai vai Gly ser vai vai Gly Thr Lys Thr Gly lie Gly Ala Tyr Val50 55 60

Ala Thr Asp Asn Ala Arg Lys Glu Ile Val vai Ser vai Arg Gly Ser65 70 75 80

Ile Asn Val Arg Asn Trp Ile Thr Asn Phe Asn Phe Gly Gln Lys Thr85 90 95

Cys Asp Leu Val Ala Gly Cys Gly vai His Thr Gly Phe Leu Asp Ala100 105 110

Trp Glu Glu Val Ala Ala Asn Val Lys Ala Ala vai Ser Ala Ala Lys115 120 125

Thr Ala Asn Pro Thr Phe Lys Phe vai Val Thr Gly His Ser Leu Gly130 135 140

Gly Ala vai Ala Thr lie Ala Ala Ala Tyr Leu Arg Lys Asp Gly Phe145 150 155 160

Pro Phe Asp Leu Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg vai Gly Asn Asp Phe165 170 175

Phe Ala Asn Phe vai Thr Gln Gln Thr Gly Ala Glu Tyr Arg Val Thr180 185 190

His Gly Asp Asp Pro vai Pro Arg Leu Pro Pro Ile Val Phe Gly Tyr195 200 205

Arg His Thr Ser Pro Glu Tyr Trp Leu Asn Gly Gly Pro Leu Asp Lys210 215 220

Asp Tyr Thr vai Thr Glu Ile Lys vai Cys Glu Gly Ile Ala Asn vai225 230 235 240

Met Cys Asn Glv Gly Thr Ile Gly Leu Asp Ile Leu Ala His Ile Thr245 250 255

Tyr Phe Gln ser Met Ala Thr Cys Ala Pro Ile Ala Ile Pro Trp Lys260 265 270

Arg

<210> 11

<211> 278

<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae

<400> 11

Asp Ile Pro Thr Thr Gln Leu Glu Asp Phe Lys Phe Trp vai Gln Tyr1 5 10 15

Ala Ala Ala Thr Tyr Cys Pro Asn Asn Tyr vai Ala Lys Asp Gly Glu20 25 30

Lys Leu Asn Cys Ser Val Gly Asn Cys Pro Asp vai Glu Ala Ala Gly35 40 45

ser Thr Val Lys Leu Ser Phe Ser Asp Asp Thr Ile Thr Asp Thr Ala50 55 60.

Gly Phe vai Ala vai Asp Asn Thr Asn Lys Ala Ile Val vai Ala Phe65 70 75 80

Arg Gly Ser Tyr ser Ile Arg Asn Trp Val Thr Asp Ala Thr Phe >ro85 90 95

Gln Thr Asp Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Lys Ala Glu Leu Gly Phe100 105 110

Trp Thr Ala Trp Lys Val Val Arg Asp Arg Ile lie Lys Thr Leu Asp115 120 125

Glu Leu Lys Pro Glu His Ser Asp Tyr Lys Ile Val vai Val Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Ala Ala Ile Ala ser Leu Ala Ala Ala Asp Leu Arg Thr145 150 155 160

Lys Asn Tyr Asp Ala Ile Leu Tyr Ala Tyr Ala Ala Pro Arg vai Ala165 170 175

Asn Lys Pro Leu Ala Glu Phe Ile Thr Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Arg180 185 190

Phe Thr His Asn Asp Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Thr Met195 200 205

Gly Tyr Val His Ile ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Thr Ala Pro Asp Asn210 215 220

Thr Thr Val Thr Asp Asn Gln vai Thr vai Leu Asp Gly Tyr Val Asn225 230 235 240

Phe Lys Gly Asn Thr Gly Thr Ser Gly Gly Leu Pro Asp Leu Leu Ala245 250 255

Phe His Ser His Val Trp Tyr Phe Ile His Ala Asp Ala Cys Lys Gly260 265 270

Pro Gly Leu Pro Leu Arg275

<210> 12

<211> 278

<212> PRT

<213> Penicillium camemberti

<400> 12

Asp Val Ser Thr Ser Glu Leu Asp Gln Phe Glu Phe Trp vai Gln Tyr1 5 10 15

Ala Ala Ala Ser Tyr Tyr Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Gln Val Gly Asp20 25 30

Lys Leu ser Cys Ser Lys Gly Asn Cys Pro Glu vai Glu Ala Thr Gly35 40 45

Ala Thr Val ser Tyr Asp Phe ser Asp Ser Thr He Thr Asp Thr Ala50 55 60

Gly Tyr Ile Ala vai Asp His Thr Asn Ser Ala Val Val Leu Ala Phe65 70 75 80

Arg Gly Ser Tyr Ser vai Arg Asn Trp vai Ala Asp Ala Thr Phe vai85 90 95

His Thr Asn Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Leu Ala Glu Leu Gly Phe100 105 110

Trp Ser Ser Trp Lys Leu vai Arg Asp Asp Ile Ile Lys Glu Leu Lys

115 120 125

Glu Val Val Ala Gln Asn Pro Asn Tyr Glu Leu Val Val Val Gly His130 135 140

Ser Leu Gly Ala Ala Val Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp Leu Arq Gly145 150 155 160

Lys Gly Tyr Pro Ser 'Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val165 170 175

Gly Asn Ala Ala Leu Ala Lys Tyr Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Phe180 185 190

Arg Phe Thr His Thr Asn Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser195 200 205

Met Gly Tyr vai His vai Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn210 215 220

Asn Ala Thr Val Ser Thr Ser Asp lie Lys Val lie Asp Gly Asp Val225 230 235 240

Ser Phe Asp Gly Asn Thr Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe245 250 255

Glu Ala His lie Trp Tyr Phe Val Gln vai Asp Ala Gly Lys Gly Pro260 265 270

Gly Leu Pro Phe Lys Arg275

<210> 13<211> 270<212> PRT

<213> Aspergillus foetidus<400> 13

Ser Val Ser Thr Ser Ttir Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ala Gln Trp1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn Ile Asp ser Lys Asp ser Asn20 25 30

Leu Thr Cys Thr Ala Asn Ala Cys Pro Ser VaT Glu Glu Ala ser Thr35 40 45

Thr Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asp Phe Gly Gly Thr Ala50 55 60

Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe65 70 75 80

Arg Gly Ser Ser Thr Ile Glu Asn Trp Ile Ala Asn Leu Asp Phe Ile85 90 95

Leu Glu Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly100 105 110

Phe Trp Lys Ala Trp Glu ser Ala Ala Asp Glu Leu Thr Ser Lys Ile115 120 125

Lys Ser Ala Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg14 5 150 155 160

Asn Asp Gly Tyr Ser vai Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Ile165 170 175

Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His lie Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala180 185 190

Asn Phe Arg vai Thr His Leu Asn Asp Ile vai Pro Arg Val Pro Pro195 200 205

Met Asp Phe Gly Phe ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser210 215 220

Gly Asn Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly225 230 235 240

lie Asn Ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Ser vai Leu245 250 255Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu "Leu260 265 270

<210> 14<211> 270<212> PRT

<213> Aspergi11us niger<400> 14

ser vai ser Thr ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ser Gln Trp1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys ser Asn Asn Ile Asp ser Asp Asp ser Asn20 25 30

vai Thr Cys Thr Ala Asp Ala Cys Pro Ser vai Glu Glu Ala Ser Thr35 40 45

Lys Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala50 55 60

Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe65 70 75 80

Arg Gly Ser Ser Thr Ile Lys As η Trp Xle Ala Asp Leu Asp Phe Ile85 90 95

Leu Gln Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys vai His Thr Gly100 105 110

Phe Trp Lys Ala Trp Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys Ile115 120 125

Lys Ser Ala Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg145 150 155 160

Asn Asp Gly Tyr Ser vai Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val165 170 175

Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala180 185 190

Asn Phe Pro Val Thr His Leu Asn Asp Ile vai Pro Arg Val Pro Pro195 200 205Met Asp Phe Gly Phe Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser210 215 220

Gly Thr Gly Ala Ser vai Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asn ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr vai Asp Val Leu245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile ser Glu Cys Leu Leu260 265 270

<210> 15<211> 269<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae<400> 15

Asp vai Ser Ser Ser Leu Leu Asn Asn Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Asp Glu Asn Leu Asn Ser Thr Gly Thr Lys20 25 30

Leu Thr Cys Ser Val Gly Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Ser Thr35 40 45

Gln Ser Leu Asp Glu Phe Asn Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Pro Ala50 55 60

Gly Tyr Leu Ala Ala Asp Glu Thr Asn Lys Leu Leu Val Leu Ser Phe65 70 75 80

Arg Gly Ser Ala Asp Leu Ala Asn Trp Val Ala Asn Leu Asn Phe Gly85 90 95

Leu Glu Asp Ala ser Asp Leu Cys Ser Gly Cys Glu Val His Ser Gly100 105 110

Phe Trp Lys Ala Trp ser Glu Ile Ala Asp Thr Ile Thr ser Lys Val115 120 125

Glu Ser Ala Leu Ser Asp His Ser Asp Tyr Ser Leu vai Leu Thr Gly130 135 140

His Ser Tyr Gly Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg145 150 155 160Asn Ser Gly His Ser vai Glu Leu Tyr as n'Tyr Gly Gln-Pro Arg Leu165 170 175

Gly Asn Glu Ala Leu Ala ThrTyr lie Thr Asp Gln Asn Lys Gly Gly180 185 190

Asn Tyr Arg Val Thr His Thr Asn Asp Ile vai Pro Lys Leu Pro Pro195 200 205

Thr Leu Leu Gly Tyr His His Phe Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile ser Ser210 215 220

Ala Asp Glu Ala Thr Val Thr Thr Thr Asp Val Thr Glu vai Thr Gly225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asp Gly Thr As ρ Gly Thr Ser Ile Asp245 250 255

Ala His Arq Trp Tyr Phe Ile Tyr Ile Ser Glu Cys ser260 265

<210> 16<211> 251<212> PRT

<213> Landerina penisapora<400> 16

Pro Gln Asp Ala Tyr Thr Ala Ser His Ala Asp Leu vai Lys Tyr Ala1 5 10 15

Thr Tyr Ala Gly Leu Ala Tyr Gln Thr Thr Asp Ala Trp Pro Ala ser20 25 30

Arg Thr vai Pro Lys Asp Thr Thr Leu Ile ser Ser Phe Asp His Thr35 40 45

Leu Lys Gly Ser ser Gly Tyr Ile Ala Phe Asn Glu Pro Cys Lys Glu50 55 60

Ile Ile Val Ala Tyr Arg Gly Thr Asp Ser Leu Ile Asp Trp Leu Thr65 70 75 80

Asn Leu Asn Phe Asp Lys Thr Ala Trp Pro Ala Asn Ile Ser Asn ser85 90 95

Leu Val His Glu Gly Phe Leu Asn Ala Tyr Leu Val Ser Met Gln Gln100 105 110Val Gln Glu Ala Val Asp ser Leu Leu Ala'Lys Cys Pro Asp Ala Thr115 120 125

Ile Ser Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Cys Ile ser130 135 140

Met Val Asp Thr Ala Gln Arg His Arg Gly Ile Lys Met Gln Met Phe145 150 155 160

Thr Tyr Gly Gln Pro Arg Thr Gly Asn Gln Ala Phe Ala Glu Tyr Val165 170 175

Glu Asn Leu Gly His Pro vai Phe Arg Val vai Tyr Arg His Asp Ile180 185 190

Val Pro Arg Met Pro Pro Met Asp Leu Gly Phe Gln His His Gly Gln195 200 205

Glu vai Trp Tyr Glu Gly Asp Glu Asn Ile Lys Phe Cys Lys Gly Glu210 215 220

Gly Glu Asn Leu Thr Cys Glu Leu Gly Val Pro Phe ser Glu Leu Asn225 230 235 240

Ala Lys Asp His Ser Glu Tyr Pro Gly Met His245 250

Claims (37)

1. Composição compreendendo um ingrediente detergente euma variante de uma Iipase original, sendo que a dita variante, quandocomparada à dita Iipase original, compreende um total de pelo menos trêssubstituições, as quais são selecionadas de um ou mais dos seguintesgrupos de substituições:a) pelo menos duas substituições na Região I,b) pelo menos uma substituição na Região II,c) pelo menos uma substituição na Região III, e/oud) pelo menos uma substituição na Região IV.

2. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1, emque as ditas substituições na Região I compreendem substituições nasposições correspondentes a 231 e 233.

3. Composição detergente de acordo com a reivindicação 2, emque as ditas substituições nas posições 231 e 233 são substituídas com umR.

4. Composição detergente de acordo com a reivindicação 2, emque a dita variante compreende uma substituição na posição correspondentea 4 da SEQ. ID Ns 2.

5. Composição detergente de acordo com a reivindicação 4, emque a dita substituição na posição correspondente a 4 da SEQ. ID Ne 2 é V.

6. Composição detergente de acordo com a reivindicação 2, emque a dita variante compreende uma substituição na posição correspondentea 227 da SEQ. ID Ns 2.

7. Composição detergente de acordo com a reivindicação 6, emque a dita substituição na posição correspondente a 227 da SEQ. ID Ns 2 éG.

8. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1, emque a dita pelo menos uma substituição na Região Il compreende umasubstituição selecionada do grupo consistindo em substituições nas posiçõescorrespondentes a 202, 211, 255 e 256.

9. Composição detergente de acordo com a reivindicação 8, emque a dita pelo menos uma substituição na Região Il compreende umasubstituição selecionada do grupo consistindo em X202G, X211L, X255Y/V eX256K.

10. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1, emque a dita pelo menos uma substituição na Região Il compreende umasubstituição na posição correspondente a 210.

11. Composição detergente de acordo com a reivindicação 10,em que a dita substituição correspondente à posição 210 compreendeX210K.

12. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1, emque a dita pelo menos uma substituição na Região Ill compreende umasubstituição selecionada do grupo consistindo em substituições nas posiçõescorrespondentes a 83, 86 e 90.

13. Composição detergente de acordo com a reivindicação 11,em que a dita pelo menos uma substituição na Região Ill compreende umasubstituição selecionada do grupo consistindo em X83T, X86V e X90A/R.

14. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1, emque a dita pelo menos uma substituição na Região Ill compreende umasubstituição da posição correspondente a 83.

15. Composição detergente de acordo com a reivindicação 14,em que a dita substituição correspondente à posição 83 compreende X83T.

16. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1, emque a dita pelo menos uma substituição na Região IV compreende umasubstituição selecionada do grupo consistindo em substituições nas posiçõescorrespondentes a 27, 58 e 60.

17. Composição detergente de acordo com a reivindicação 16,em que a dita pelo menos uma substituição na Região IV compreende umasubstituição selecionada do grupo consistindo em X27R, X58N/A/G/P/T eX60S/V/G/N/R/K/A/L

18. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1,compreendendo pelo menos duas substituições na Região IV,correspondentes às posições 27, 58 e 60.

19. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1,compreendendo pelo menos duas substituições na Região IV, selecionadasdo grupo consistindo em X27R, X58N/A/G/P/T e X60S/V/G/N/R/K/A/L.

20. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1 , emque a dita variante compreende pelo menos uma substituição fora dasRegiões de I a IV definidas.

21. Composição detergente de acordo com a reivindicação 20,em que a dita pelo menos uma substituição fora das Regiões de I a IVdefinidas, é selecionada do grupo consistindo em substituições nas posiçõescorrespondentes a 81,147,150 e 249.

22. Composição detergente de acordo com a reivindicação 20,em que a dita pelo menos uma substituição fora das Regiões de I a IVdefinidas, é selecionada do grupo consistindo em X81 Q/E, X147M/Y, X150Ge X249R/I/L.

23. Composição detergente de acordo com a reivindicação 2, emque a dita lipase original é pelo menos 90% idêntica à SEQ. ID Ne 2.

24. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1, emque a lipase original é idêntica à SEQ. ID N2 2, sendo que a dita variantecompreende um dos seguintes grupos de substituições:a) T231R + N233R + I255Yb) I202G + T231R + N233Rc) I86V + L227G + T231R + N233R + P256Kd) Q4V + S58N + V60S + T231R + N233Re) S58N + V60S + I90R + T231R + N233Rf) I90A + T231R + N231R + I255Vg) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T231R + N233R +P256Kh) S58N + V60S + L147M + F211L + T231R + N233Ri) Q4V + S58A + V60S + S83T + I86V + A150G + E210K +L227G + T231R + N233R + P256Kj) S58N + V60S + 186V + A150G + L227G + T231R + N233R +Ρ256Κ.

25. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1, emque a Iipase original é idêntica à SEQ. ID N9 2, sendo que a dita variantecompreende um dos seguintes grupos de substituições:a) Q4V + S58A + V60S + S83T + I86V + A150G + E210K +L227G + T231R + N233R + P256Kb) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T231R + N233R +P256K.

26. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1, emque a variante de Iipase apresenta uma relação risco/benefício (RB), quandomedida conforme apresentado no relatório descritivo, maior que 1.

27. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1,compreendendo, ainda, de 0,1% a 40%, de preferência de 0,1% a 12%, detensoativo aniônico.

28. Composição detergente de acordo com a reivindicação 27,em que o tensoativo aniônico é um sulfato de alquila alcoxilado.

29. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1,compreendendo, ainda, de 5% a 30% de builder à base de aluminossilicatoe/ou de fosfato.

30. Composição detergente de acordo com a reivindicação 1,compreendendo, ainda, uma fonte de peróxido e um ativador dealvejamento, de preferência tetraacetil etileno diamina.

31. Detergente de acordo com a reivindicação 1, em que o ditodetergente é uma composição detergente líquida ou uma composiçãodetergente sólida.

32. Detergente de acordo com a reivindicação 31, em que o ditodetergente é um detergente granular.

33. Detergente de acordo com a reivindicação 1, em que o ditodetergente é uma composição em dose unitária que consiste em umcomprimido sólido ou um líquido encapsulado em um filme solúvel.

34. Processo de lavagem caracterizado pelo fato decompreendendo a lavagem de artigos têxteis em uma solução aquosa quecompreende a composição detergente como definida na reivindicação 1.

35. Processo de lavagem de acordo com a reivindicação 34, emque o processo é adequado para a remoção de sujeiras e manchas de umasuperfície, compreendendo as etapas de:a) opcionalmente, pré-tratar as sujeiras e as manchas com ascomposições como definidas na reivindicação 1, para formar uma superfícieopcionalmente pré-tratada;b) adicionar à água uma quantidade eficaz das composiçõescomo definidas na reivindicação 1, para formar uma solução aquosa paralavagem compreendendo de cerca de 500 a cerca de 10.000 ppm dacomposição;c) colocar a solução aquosa para lavagem em contato com asuperfície opcionalmente pré-tratada, ed) opcionalmente, aplicar agitação à solução aquosa paralavagem e à superfície opcionalmente pré-tratada.

36. Processo de lavagem de acordo com a reivindicação 34, emque a solução aquosa está a uma temperatura abaixo de 30°C.

37. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a ditavariante de Iipase é uma variante da SEQ. ID Ne 2 compreendendo pelomenos uma das mutações Q4V, S58N/A/G/P/T, I90R ou Q249I/L.