BRPI0707202B1 - Variant, dna sequence, expression vector, trangenic microorganism, and, method of producing a variant of lipase - Google Patents

Description

“VARIANTE, SEQÜÊNCIA DE DNA, VETOR DE EXPRESSÃO, MICRORGANISMO TRANSGÊNICO, E, MÉTODO DE PRODUZIR UMA VARIANTE DE LIPASE” CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a variantes de lipase. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Lipases são úteis, por exemplo, como enzimas detergentes para remover lipídeos ou manchas de gordura de roupas e outros têxteis, como aditivos para a massa de pão e outros produtos assados. Desta maneira, a lipase derivada de Thermomyces lanuginosus (sinônimo Humicola lanuginosa, EP 258 068 e EP 305 216) é vendida para o uso detergente sob o nome comercial Lipolase (produto da Novo Nordisk A/S), WO 0060063 descreve variantes da lipase T. lanuginosus com uma primeira boa lavagem particularmente desempenhada em uma solução detergente. WO 9704079, WO 9707202 e WO 0032758 também divulgam variantes da lipase T. lanuginosus.

Em algumas aplicações, é de interesse minimizar a formação da geração de odor por ácidos graxos de cadeia curta. Desta maneira, é conhecido que detergentes de lavagem de roupas com lipases podem algumas vezes deixar odores residuais ligados às roupas manchadas com leite (EP 430315). O WO 02062973 divulga variantes de lipase onde a geração de odor foi reduzida pela ligação de uma extensão de terminal C.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores observaram que pela introdução de mutações em certas regiões/posições de uma lipase é possível melhorar as propriedades ou características da lipase.

Em uma forma de realização preferida, a presente invenção diz respeito a lipases fornecendo propriedades melhoradas para o uso em detergentes. Por exemplo, a invenção fornece variantes com tendência reduzida por gerai· odor obtida pela introdução mutações e uma ou mais regiões identificadas na origem de lipase. Em outra forma de realização preferida, a presente invenção fornece variantes de lipase que, como comparadas à origem de lipase, tiveram o potencial reduzido para a degradação sem a ligação de uma extensão de terminal C.

Em um outro aspecto a invenção diz respeito a uma seqüência de DNA que codifica a variante de lipase da invenção, um vetor de expressão abriga a dita seqüência de DNA e uma célula hospedeira transformada contendo uma seqüência de DNA ou o vetor de expressão.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de produzir as variantes de lipase da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra o alinhamento das lipases.

LISTAGENS DE SEQÜÊNCIA A SEQ ID N°: 1 mostra a lipase que codifica a seqüência de DNA de Thermomyces lanoginosus. A SEQ ID N°: 2 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Thermomyces lanoginosus. A SEQ ID N°: 3 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Absidia reflexa. A SEQ ID N°: 4 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Absidia corvmbifera. A SEQ ID N°: 5 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Rhizomucor miehei. A SEQ ID N°: 6 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Rhizopus oiyzae. A SEQ ID N°: 7 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Aspergilius niger. A SEQ ID N0: S mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Aspergillus tubingeusis. A SEQ ID N°: 9 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Fiisarium o.xysporrum. A SEQ ID N°: 10 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Fusarium heterosporum. A SEQ ID N°: 11 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Aspergillus oiyzae. A SEQ ID N°: 12 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Penicillium camemberti. A SEQ ID N°: 13 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Aspergillus foeiidus. A SEQ ID NO; 14 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Aspergillus niger. A SEQ ID N°: 15 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Aspergillus oryzae. A SEQ ID Nc‘: 16 mostra uma seqüência de aminoácido de uma lipase de Landerina penisapora. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Origem de lipases Qualquer origem de lipase adequada pode ser usada. Em uma fomia de realização preferida, a origem de lipase pode ser uma lipase fungica. Em outra forma de realização preferida, a origem de lipase pode ser a lipase com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou ainda 100% de homologia como definido na seção “Homologia e a]inhamento,, à seqüência de lipase T. lanuginosus mostrada na SEQ ID N°: 2. A origem de lipase pode ser um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia; ou mais preferivelmente um polipeptídeo íungico filamentoso tal como um polipeptídeo Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidíum, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophtbora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichodenna.

Em um aspecto preferido, a origem de lipase é um polipeptídeo Saccharomyces carisbergensis, Saceharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis tendo atividade de lipase.

Em um outro aspecto preferido, a origem de lipase é um polipeptídeo Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmomm, Fusariiun graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterospoiiun, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambueinum, Fusarium sarcocluOum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Thennomyces lanoginosus (sinônimo: Humicola lanuginose), Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichodemia harzianum, Trichodenna koningii, Trichodenna longibrachiatum, Trichodenna reesei ou Trichoderma viride.

Em um outro aspecto preferido, a origem de lipase é uma lipase Thennomyces.

Em um aspecto mais preferido, a origem de lipase é uma lipase Thennomyces lanuginosus. Em uma forma de realização ainda mais preferida a origem de lipase é a lipase da SEQID Νύ: 2.

Variantes de lipases As variantes de lipase da presente invenção compreendem, em comparação com a origem de lipase, pelo menos três substituições selecionadas do grupo que consiste de: a) pelo menos duas substituições na região I, e b) pelo menos uma substituição na região II, e c) pelo menos uma substituição na região III, e d) pelo menos uma substituição na região IV; e em que as variantes tem atividade de lipase.

Em uma fonna de realização preferida, a variante de lipase é uma variante de uma lipase Themiomyces, mais preferivelmente, uma lipase T. lanuginosus, e ainda mais preferivelmente, a lipase T. lanuginosus mostrada na SEQ ID N°: 2. Em uma forma de realização preferida a variante de lipase tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, S5%, 90%, 95%, 9S%, 97%, 98% ou 99% da identidade da SEQ ID N°:2. A variante de lipase pode ser uma variante de uma origem de lipase codificada por um gene derivado/obtido a partir de um dos organismos de origem seguintes: Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospara, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, ou Triehodenna. Em uma forma de realização preferida, a variante de lipase tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%., 90%, 95':’o, 96%, 97%, 98° o ou 99% da identidade à uma origem de lipase codificada por um gene derivado/obtido a partir de um dos organismos de origem seguintes: Candida, Kluyveromyces. Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humieola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, ou Triehoderma.

Em um aspecto preferido, a variante de lipase é um variante Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, SacchaiOmyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis. Em uma forma de realização preferida, a variante de lipase tem pelo menos 50%, 60%, 70%·, 80%, 85%, 90%, 95%·, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade à uma origem de lipase codificada por um gene derivado/obtido de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis. A variante de lipase pode ser uma variante de uma origem de lipase codificada por um gene derivado/obtido a partir de um dos organismos de origem seguintes: Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium gramineamm, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humieola insolens, Thermomyces lanoginosus (sinônimo: Humieola lanuginose), Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Triehoderma harzianum, Trichodemia koningii, Triehoderma longibrachiatum, Triehoderma reesei, ou Triehoderma viride. Em uma forma de realização preferida, a variante de lipase tem pelo menos 50%, 60%j, 70* o, 80%, 85%, 90/ο, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade á uma origem de lipase codificada por um gene derivado/obtido a partir de um dos organismos de origem seguintes: Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus íumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium gramineamm, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarimn negundi, Fusarimn oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sareocliroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium tomlosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatmn, Humicola insolens, Thermomyces lanoginosus (sinônimo: Humicola lanuginose), Mucor miehei, Myceliophthora thennophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichodemia harzianum, Trichoderma koningii, Trichodemia longibrachiatum, Trichodemia reesei ou Trichodemia viride.

Em um outro aspecto preferido, a variante é uma variante de uma lipase Theraiomyces.

Em um aspecto mais preferido, a origem de lipase é uma lipase de Thermomyces lanuginosus. Em uma forma de realização ainda mais preferida a origem de lipase é a lipase da SEQ ID N°: 2.

Identificação de regiões e substituições As posições referidas em uma Região I através da Região IV abaixo são as posições dos resíduos de aminoácido na SEQ ID N°:2. Para observar as posições correspondentes (ou homólogas) em uma lipase diferente, o procedimento descrito em “Homologia e alinhamento” é usado. Substituições na Região I A Região I consiste de resíduos de aminoácidos adjacentes ao resíduo El do terminal N. Nesta região, é preferido substituir um aminoácido de uma origem de lipase com um aminoácido mais positivo. A variante de lipase pode compreender pelo menos duas substituições na Região I, tal como três, quatro, cinco ou seis substituições na Região I.

Os resíduos de aminoácidos correspondentes às posições seguintes são compreendidos pela Região I: 1, 2 a 11 e 223 a 239. As posições seguintes são de interesse particular: 1, 4, 8, 11, 223, 227, 229, 231, 233, 234, 23(5.

Em particular as substituições seguintes foram identificadas: X1N/* X4V, X227G, X231R e X233R.

Em uma forma de realização preferida a variante de lipase tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% da identidade da SEQ1D N°:2 Em uma fonna de realização mais preferida a variante de lipase é uma variante de lipase tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID N*: 2.

Substituições na Região II A Região II consiste de resíduos de aminoácidos em contato com substrato em uma cadeia de acila secundária e uma parte de álcool secundário. Nesta região é preferido substituir um aminoácido de uma origem de lipase com um aminoácido mais positivo ou com um aminoácido menos hidrofóbico. A variante de lipase pode compreender pelo menos uma substituição na região tal como duas, três, quatro, cinco ou seis substituições na Região II.

Os resíduos de aminoácidos correspondentes às posições seguintes são compreendidos pela Região II: 202 a 211 e 249 a 269. As posições seguintes são de interesse particular: 202, 210, 211, 253, 254, 255, 256.

Em particular as substituições seguintes foram identificadas: X202G, X210K/W/A, X255Y/V/A e X256K/R e X259G/M/Q/V.

Em uma forma de realização preferida a variante de lipase tem pelo menos 80" o, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%. ou 99% da identidade da SEQID N°:2 Em uma forma de realização mais preferida a variante de lipase é uma variante de lipase tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 2.

Substituições na Região III A Região III consiste de resíduos de aminoácidos que formam uma estrutura flexível e deste modo permitem o substrato conseguir um local ativo. Nesta região é preferido substituir um aminoácido de uma origem de lipase com um aminoácido mais positivo ou um aminoácido menos hidrofóbico. A variante de lipase pode compreender pelo menos uma substituição na região III, tal como duas, três, quatro, cinco ou seis substituições na Região III.

Os resíduos de aminoácidos correspondentes às posições seguintes são compreendidos pela Região III: 82 a 102. As posições seguintes são de interesse particular: 83, 86, 87, 90, 91, 95, 96,99.

Em particular as substituições seguintes foram identificadas: X83T, X86V e X90A/R.

Em uma forma de realização preferida a variante de lipase tem pelo menos 80® ó, 85%, 90%, 95%, 96° o, 97%, 98'% ou 99% da identidade da SEQ IDN:':2 Em uma forma de realização mais preferida a variante de lipase é uma variante de lipase tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID Nc': 2.

Substituições na Região IV A Região IV consiste de resíduos de aminoácido que ligam-se eletrostaticamente à superfície. Nesta região é preferido substituir um aminoácido cie uma origem de lipase com um aminoácido mais positivo. A variante de lipase pode compreender pelo menos uma substituição na região IV, tal como duas, três, quatro, cinco ou seis substituições na Região IV.

Os resíduos de aminoácidos correspondentes às posições seguintes são compreendidos pela Região IV: 27 e 54 a 62. As posições seguintes são de interesse particular: 27, 56, 57, 58, 60.

Em particular as substituições seguintes foram identificadas: X27R, X5SN/AG/T/P e X60V/S/G/N/R/K/A/L.

Em uma forma de realização preferida a variante de lipase tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade da SEQ 1D NQ:2 Em uma forma de realização mais preferida a variante de lipase é uma variante de lipase tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 2.

Aminoácidos em outras posições A origem de lipase pocle opcionalmente compreender alterações adicionais, por exemplo, substituição de outro aminoácido, particularmente menos do que 10, menos do que 9, menos do que 8, menos do que 7, menos do que 6, menos do que 5 alterações como comparados à uma origem de lipase. Os exemplos são substituições correspondentes de uma ou mais posições 24, 37, 38, 46, 74, 81, 83, 115, 127, 131, 137, 143, 147, 150, 199, 200, 203, 206, 211, 263, 264, 265, 267 e 269 da origem de lipase. Em uma forma de realização particular aqui é uma substituição de pelo menos uma da posição correspondente à posição 81, 147, 150, 227 e 249. Em uma forma de realização preferida pelo menos uma substituição é selecionada do grupo que consiste de X38R, XS1Q/E, X143S/C/N/D/A, X147M/Y, X150G/K, X227G e X249R/I/L. A variante pode compreender substituições fora da Região I a IV definida; o número de substituições fora da Região I a IV definida é preferivelmente menos do que seis, tal como cinco, quatro, três, duas ou uma substituição.

As substituições adicionais podem, por exemplo, ser feitas de acordo com o princípio conhecido na técnica, por exemplo, substituições descritas em WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

Origem de variantes de lipase As variantes de lipases incluem origem de lipases tendo as substituições listadas na tabela 1 abaixo (usando SEQ ID N°: 2 para numeração).

Tabela 1 Em uma outra forma de realização particular, a origem de lipase é idêntica à SEQ ID N°:2, e as variantes da Tabela 1 serão deste modo: Tabela 2: Algumas das variantes particulares da SEQID N°:2 Nomenclatura para modificações de aminoácido Em descrição as variantes de lipase de acordo com a invenção, a nomenclatura seguinte é usada para facilitar a referência: Aminoácido original (s): posição (s): aminoácido substituído (s) De acordo com esta nomenclatura, por exemplo a substituição de ácido glutâmico para glicina na posição 195 é mostrada como G195E. A anulação da glicina na mesma posição é mostrada como G195*, e a inserção de um resíduo de aminoácido adicional tal como lisina é mostrada como G195GK.

Onde uma lipase específica contém uma “anulação” em comparação com outras lipases e uma inserção é feita em uma tal posição esta é indicada como *36D para inserção de um ácido aspártico na posição 36.

As mutações múltiplas são separadas por sinais de adição, isto é: R170Y-Í-G195E, representando mutações nas posições 170 e 195 de substituição de tirosina e ácido glutâmico para arginina e glicina, respectivamente.

Ο X231 indica que o aminoácido em uma origem de polipeptídeo correspondente à posição 231, quando aplica o procedimento de alinhamento descrito. O X231R indica que o aminoácido é substituído com R. Para a SEQ ID N°; 2 X é T, e X231R deste modo indica uma substituição de T na posição 231 com R. Onde o aminoácido em uma posição (por exemplo, 231) pode ser substituído pc»r um outro aminoácido selecionado a partir de um grupo de aminoácidos, por exemplo, o gmpo que consiste de R e P e Y, e será indicado por X231R/P/Y

Em todos os casos, a letra simples IUPAC aceitável ou letra tripla de abreviação de aminoácido é utilizado.

Disposição de aminoácido Nesta especificação, os aminoácidos são classificados como carga negativa, carga positiva ou eletricamente neutra de acordo com sua carga elétrica em pH 10. Desta maneira, os aminoácidos negativos são E, D, C (cisterna) e Y, particularmente E e D. Os aminoácidos positivos são R, K e H, particularmente R e K. Os aminoácidos neutros são G, A, V, L, I, P, F, W, S, T, Μ, N, Q e C quando parte de formação de uma ponte de bissulfeto. Uma substituição com um outro aminoácido no mesmo grupo (negativo, positivo ou neutro) é denominado uma substituição conservativa.

Os aminoácidos neutros podem ser divididos em hidrofóbicos ou não polares (G, A, V, L, I, P, F, W e C como partes de uma ponte de bissulfeto ) e hidrofílicos ou polares (S, T, Μ, N, Q).

Identidade de aminoácido A relação entre duas seqüências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro de “identidade”.

Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento de duas seqüências de aminoácidos é determinada pelo uso do programa de Needle a partir da embalagem EMBOSS (http://embass.org) versão 2,8,0. Os implementos do programa de Needle, o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman, S. B. e Wunseh, C. D. (1970) .T. Mal, Biel, 48, 443-453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, a penalidade de abertura da fenda é 10, a penalidade da extensão da fenda é 0,5. O grau de identidade entre uma sequência de aminoácido da presente invenção (“seqüência da invenção”; por exemplo, aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID N°:2) e uma seqüência de aminoácido diferente (“seqüência estranha”) é calculada com o número de equiparações exatas em um alinhamento de duas seqüências, dividido pelo comprimento da “seqüência da invenção” ou comprimento da “seqüência estranha”, quaisquer que sejam mais curtas. O resultado é expressado em identidade percentual.

Em equiparações exatas ocorre quando a “seqüência da invenção” e a “seqüência estranha” tem resíduos de aminoácidos idênticos nas mesmas posições do sobreposto. O comprimento de uma seqüência é o número de resíduos de aminoácidos na seqüência (por exemplo, o comprimento da SEQ ID N°:2 é 269). O procedimento acima pode ser usado pelo cálculo da identidade bem como homologia e por alinhamento. No contexto da presente invenção homologia e alinhamento foram calculados como descrito abaixo. Homologia e alinhamento Para os propósitos da presente invenção, o grau de homologia pode ser determinado adequadamente pelo meios de programas de computador conhecidos na técnica, tal como GAP fornecido na embalagem do programa GCG (Program Manual for the Wiseonsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wiseonsin, USA 53711) (Needleman, S.B. e Wunseh, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45), usando GAP com os seguintes ajustes para comparação de seqüência de polipeptídeo: A penalidade de criação de GAP de 3,9 e penalidade de extensão de GAP de 0,1.

Em uma presente invenção, posições correspondentes (ou homólogas) nas sequências de lipase de Absidia reflexa, Absidia corymhefera, Rhizinueor miehei, Rhtopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus tubigensis, Rusariwn oyysporurn, Rusarium heierospormn, Aspergillus oiyzea, Penicilitm eamembertii, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Thermoniyces lanoginosus (sinônimo: Humicola lanuginose) e Landerina penisapora são definidos pelo alinhamento mostrado na Figura 1.

Para observar as posições homólogas nas sequências de lipase não mostradas no alinhamento, a seqüência de interesse é alinhado à seqüência mostrada na Figura 1. A nova seqüência é alinhada ao alinhamento presente na Figura 1 pelo uso do alinhamento GAP às seqüências mais homólogas obseivadas pelo programa GAP. O GAP é fornecido na embalagem do programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version S, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. e Wiinsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 4S, 443-45). Os seguintes ajustes são usados por comparação de seqüência de polipeptídeo: A penalidade de criação de GAP de 3,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,1.

Hibridização A presente invenção também diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de lipase que são codificados por polinucleotídeos que hibridizam-se sob condições de estringência muito baixas, preferivelmente condições de estringência baixas, mais preferivelmente condições de estringência médias, mais preferivelmente condições de estringência média altas, ainda mais preferivelmente condições de estringência altas e mais preferivelmente condições de estringência muito altas (i) nucleotídeos de 17S a 660 da SEQ ID N°: 1, (ii) a seqüência de cDNA contida nos nucleotídeos de 17S a 660 da SEQ ID N°: 1, (iii) uma subseqüência de (i) ou (ii) ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii) ou (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 19S9, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2° edição, Cold Spring Harbor, New York). Uma subseqüência de SEQ 1D N*: 1 contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Além disso, a subseqüência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que tem atividade de lipase.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, as condições de estringência de muito baixa a muito alta são definidas como a pré-hibridização e a hibridização a 42° C em 5X de SSPE, 0,3% de SDS, 200 ug/ml dividido em DNA de esperma de salmão desnaturado e 25% de formamida para estringências muito altas e muito baixas, 35"o de formamida para estringências médias e médias-altas ou 50% de formamida para estringências altas e muito altas, seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão por 12 a 24 horas otimamente.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, o material carregador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando-se 2X de SSC, 0,2% de SDS preferivelmente pelo menos a 45° C (estríngência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50° C (estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55° C (estríngência média), mais preferivelmente pelo menos a 60° C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65° C (estringência alta) e mais preferivelmente pelo menos em 70° C (estringência muito alta).

Seqüência de DNA, Vetor de expressão, Célula hospedeira, Produção de lipase A invenção fornece uma seqüência de DNA que codifica a lipase da invenção, um vetor de expressão que abriga a seqüência de DNA e uma célula hospedeira transformada contendo a seqüência de DNA ou o vetor de expressão. Estes podem ser obtidos pelos métodos conhecidos na técnica. A invenção também fornece um método de produzir a lipase pelo cultivo da célula hospedeira transfomiada sob condições condutoras pai a a produção da lipase e recuperação da lipase a partir do caldo resultante. O método pode ser praticado de acordo com os princípios conhecidos na técnica. Atividade de lipase Atividade de lipase em tributirina em pH neutro ( LU) Um substrato para lipase é preparado pela emulsificação da tributirina (tributirato de glicerina) usando-se goma Arábica como o emulsifícador. A hidrólise de tributirina a 30° C em pH 7 ou 9 é seguida em um experimento de titulação de pH-stat. Uma unidade de atividade de lipase (1 LU) iguala a quantidade de enzima capaz de liberar 1 micro mol de ácido butírico/minuto em pH 7.

Risco Benefício O fator Risco Benefício que descreve o desempenho comparado com o risco reduzido quanto ao cheiro do odor é definido como: BR = RPavg/R, como descrito abaixo.

Usos As enzimas da presente invenção podem encontrar uso industrial, por exemplo, serem incluídas nas composições de detergente para a remoção de qualquer matéria graxa.

EXEMPLOS

Os produtos químicos usados como tampões e substratos foram os produtos comerciais pelo menos de grau de reagente.

Meios e Soluções Produto Nome Comercial LAS: Surfac P

Zeólito A Wessalith P

Outros ingredientes usados são regentes de laboratório padrão.

Materiais Produto Fornecedor EMPA22I EMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse 5, CEI-9014 St. Gallen, Suíça Exemplo 1 Produção de enzima Um plasmídeo contendo o gene que codifica a lipase é construído e transformado em uma célula hospedeira adequada usando-se métodos padrão da técnica. A fermentação é realizada como uma fermentação por batelada alimentada usando-se uma temperatura média constante de 34° C em um volume inicial de 1,2 litro. O pH inicial do meio é ajustado a 6,5. Uma vez que o pH aumentou a 7,0 este valor é mantido através da adição de 10% de H3P04. O nível de oxigênio dissolvido no meio é controlado variando-se a taxa de agitação e usando-se uma taxa de aeração fixa de 1,0 litro de ar por litro de meio por minuto. A taxa de adição de alimentação é mantida em um nível constante durante a fase de batelada de alimentação total. O meio de batelada contém xarope de maltose como a fonte de carbono, uréia e extrato de levedura como a fonte de nitrogênio e uma mistura de metais e sais traço. A alimentação adicionada de maneira contínua durante a fase de batelada de alimentação contém xarope de maltose visto que o extrato de levedura e uréia é adicionado a fim de garantir um fornecimento suficiente de nitrogênio. A purificação da lipase pode sei* realizada pelo uso de métodos padrão conhecidos na técnica, por exemplo, pela filtração do sobrenadante de fermentação e cromatografia hidrofóbica e cromatografia trocadora de íon, por exemplo, como descrito no EP 0 851 913 EP, Exemplo 3.

Exemplo 2 AMSA - Ensaio de Tensão Mecânica Automatizada - para o cálculo de Desempenho Relativo (RP) As enzimas variantes do presente pedido são testados usando-se o Ensaio de Tensão Mecânica Automatizado (AMSA). com o teste AMSA o desempenho de lavagem de uma grande quantidade de soluções de enzima-detergente de volume pequeno pode ser examinado. A placa AMSA têm diversas fendas para as soluções de teste e uma tampa que comprime firmemente a amostra de tecido a ser lavada contra todas as aberturas de fenda. Durante o período de lavagem, a placa, as soluções de teste, os têxteis e a tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste em contato com o têxtil e aplicar tensão mecânica. Para a descrição adicional ver, WO 02/42740 especialmente o parágrafo “Formas de realização de método especiais” nas páginas 23-24. Os recipientes que contém a solução de teste de detergente, consistem de orifícios cilíndricos (6 mm de diâmetro, 10 mm de profundidade) em uma placa metálica. O tecido tingido imaterial de teste) está na parte superior das placas metálicas e é usado como uma tampa e sela os recipientes. Uma outra placa metálica está no topo do tecido tingido para evitai* qualquer derramamento de cada recipiente. As duas placas metálicas juntas com o tecido tingido são submetidos à vibração para cima e para baixo em uma frequência de 30 Hz com uma amplitude de 2 mm. O ensaio é conduzido sob as condições experimentais especificadas abaixo: Tabela 3 As amostras turméricas creme foram preparadas misturando-se 5 g de turmérico (Santa Maria, Denmark) com 100 g de creme (38% de gordura, Aria, Denmark} a 50° C, a mistura foi deixada nesta temperatura por cerca de 20 minutos e filtrada (50° C) para remover quaisquer partículas não dissolvidas. A mistura é esfriada a 20 0 C e amostras de algodão tecidas, EMPA221, foram imersas na mistura creme-tumiérica e posteriormente deixadas secar em temperatura ambiente durante a noite e congeladas até o uso. A preparação de amostras creme-tunnéricas é divulgada na patente WO 2006/125437. O desempenho da amostra variante é medido como a claridade da cor das amostras têxteis lavadas com aquela enzima variante específica. A claridade também pode ser expressada como a intensidade da luz refletida a partir da amostra têxtil quando iluminada com luz branca. Quando o têxtil é tingido, a intensidade da luz refletida é menor, do que aquela de um têxtil limpo.

Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem de uma enzima variante.

As medições de cor são feitas com um scanner de leito plano profissional (PFU DL2400pro), que é usado para capturar uma imagem das amostras de tecido lavadas. As varreduras são feitas com uma resolução de 200 dpi e com uma profundidade de cor de saída de 24 bits. A fim de conseguir resultados precisos, o scanner é freqüentemente calibrado com uma alvo IT8 refletivo Kodak.

Para extrair um valor quanto à intensidade de luz a partir das imagens escaneadas, uma aplicação de software projetado especial é usada (Novozymes Color Vector Analyzer). O programa recupera os valores de pixel de 24 bits a partir da imagem e os converte em valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) é calculado pela adição dos valores RGB junto como vetores e então tomando-se o comprimento do vetor resultante: O desempenho de lavagem (P) das variantes é calculado de acordo com a fórmula abaixo: P = Int(v) - Int(r) onde Int(v) é o valor de intensidade de luz da superfície têxtil lavada com enzima e Int(r) é o valor de intensidade de luz da superfície têxtil lavada sem a enzima.

Um registro de desempenho relativo é dado como o resultado da lavagem AMSA de acordo com a definição: Os registros de desempenho relativo (RP) são somados aos desempenhos (P) das variantes de enzima testadas contra a enzima de referência: RP = Ptenzima de teste)/P( enzima de referência). RPavg indica o desempenho médio relativo em comparação com a enzima de referência em todas as três concentrações de enzima (0,125, 0,25, 0,5, 1,0 mg ep/1) RPavg = avg(RP(0,125), RP(0,25) RP(0,5), RP(1,0)) Uma variante é considerada apresentar desempenho de lavagem melhorado, se esta tiver desempenho melhor do que a referência.

No contexto da presente invenção, a enzima de referência é a parte madura da SEQ ID N°:2 com as substituições T23 IR + N233R. Exemplo 3 GC - Cromatografia a Gás - para o cálculo do fator de risco A liberação de ácido butírico das amostras lavadas com lipase foram medidas pela Cromatografia Gasosa de Micro Extração de Fase Sólida (SPME-GC) usando-se o seguinte método. Quatro pedaços têxteis (5 mm de diâmetro), lavados na solução especificada na Tabela 1 contendo 1 mg/1 de lipase, foram transferidos a um fiasco de Cromatografia Gasosa (GC). As amostras foram analisadas em um Varian 3SOO GC equipado com uma coluna Stabilwax- DA w/integra-Guard (30 m, 0,32 mm de ID e 0,25 micro-m df) e uma fibra Carboxen PDMS SPME (75 micro-m). Cada amostra foi pré-incubada por 10 minutos a 40° C seguido por 20 minutos de amostragem com a fibra de SPME no espaço superior sobre os pedaços têxteis. A amostra foi subseqüentemente injetada na coluna (temperatura do injetor = 250° C). Fluxo da coluna = 2 ml de Hélio/min. Gradiente de temperatura do forno de coluna: 0 min = 40° C, 2 min = 40° C, 22 min - 240° C, 32 min = 240° C. O ácido butírico foi detectado pela detecção FID e a quantidade de ácido butírico foi calculada com base em uma curva padrão de ácido butírico. O Odor do Desempenho de Risco, R, de uma variante de lipase está entre a quantidade de ácido butírico da amostra de tecido lavada com a variante de lipase e a quantidade de ácido butírico de uma amostra lavada com a parte madura da lipase da SEQ ID N°: 2, após ambos os valores serem corrigidos para a quantidade de ácido butírico liberado a partir de uma amostra de tecido não lavada com lip»ase. O risco (R) das variantes é calculado de acordo com a fórmula abaixo: Odor = medido em micro g de ácido butírico desenvolvido em 1 mg de proteína de enzima /1 corrigido para o branco Alfa;nzirna deteste Od 01 enzima de iecíe BrailCO

Alfaenzirna de referência Odoi enzima de referência — BrailCO B Al faen=ima de tectí/Alfaen;;ima de referência Uma variante é considerada apresentar odor reduzido em comparação com a referência, se o fator R for menor do que 1.

Exemplo 4 Atividade (LU) com relação à absorbância em 280 nm A atividade de uma lipase com relação à absorbância em 280 nm é determinada pelo seguinte ensaio: LU/A280: A atividade da lipase é determinada como descrito acima na seção Atividade de lipase. A absorbância da lipase em 280 nm é medida (A2S0) e a razão LU/A2S0 é calculada. O LU/A280 relativo é calculado como o LU/A2S0 da variante dividida pelo LU/A280 de uma enzima de referência. No contexto da presente invenção a enzima de referência é a lipase da SEQ ID N°:2 com as substituições T23 IR + N233R.

Exemplo 5 BR - Risco Benefício O fator de Risco Benefício que descreve o desempenho em comparação com o risco reduzido para o cheiro do odor é definido desta maneira como: BR = RPAvg/R

Uma variante é considerada apresentar desempenho de lavagem melhorado e odor reduzido, se o fator BR for maior do que 1.

Aplicando-se os método acima, os seguintes resultados foram obtidos: Tabela 4 A lipase de referência e as variantes 7 e S na Tabela 4 são descritas no WO 2000/060063.

Exemplo 6 BR - Risco Benefício O Risco Benefício foi medido pelas para as variantes listadas na Tabela 5. O fator de Risco Benefício foi medido da mesma maneira como descrito no Exemplo 5 e foi observado estar acima de 1 para todas as variantes listadas.

Tabela 5 A lipase de referência é descrita no WO 2000/060063.

REIVINDICAÇÕES

Claims (5)

1. Variante de uma lipase precursora mostrada na SEQ ID NO: 2, caracterizada pelo fato de que a variante compreende um conjunto de substituições selecionadas do seguinte grupo: a) T23IR + N233R + 1255 Y b) I202G + T231R + N233R c) I86V + L227G + T231R + N233R + P256K d) Q4V + S58N + V60S + T231R + N233R e) S58N + VóOS + I9ÜR + T23 IR + N233R f) I90A + T231R + N233R + 1255V g) S58N + VÓOS + I86V + A150G + L227G + T231R + N233R + P256K h) S58N + VÓOS + L147M + F211L + T231R + N233R i) Q4V + S58A + VÓOS + S83T + 186V + A150G + E2I0K + L227G + T231R + N233R + P256K j) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T231R + N233R + P256K e em que a variante tem atividade de lipase.

2. Sequência de DNA, caracterizada pelo fato de que codifica a variante de lipase como definida na reivindicação 1.

3. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que abriga a sequência de DNA como definida na reivindicação 2.

4. Microrganismo transgênico, caracterizada pelo fato de que é transformado com, a sequência de DNA como definida na reivindicação 2.

5. Método de produzir urna variante dc lipase, caracterizado pelo tato de que o método compreende cultivar o microrganismo transgênico transformado como definido na reivindicação 4 sob condições condutoras para a produção da variante de lipase e recuperação da variante de lipase a partir do caldo resultante.