FI118427B

FI118427B - Hapettumisenkestäviä proteaaseja

Info

Publication number: FI118427B
Application number: FI961097A
Authority: FI
Inventors: Helle Outtrup
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1993-09-09
Filing date: 1996-03-08
Publication date: 2007-11-15
Also published as: GR3029869T3; ES2131209T3; FI961097A0; BR9407393A; FI961097A; CN1082544C; WO1995007350A1; DK0719327T3; DK100893D0; KR100338793B1; JPH09502097A; US5856167A; ATE176925T1; EP0719327B1; JP3474576B2; DE69416681T2; EP0719327A1; DE69416681D1; AU7608994A; CN1130403A

Description

118427

Hapettumisenkestäviä proteaaseja - Oxidationsstabila pro-teaser 5 Tämä keksintö koskee Bacillus sp:n kannoista saatuja proteaaseja. Tarkemmin keksintö koskee uutta, uuden Bacillus sp:n kannasta saatua proteaasia, joka on tunnettu siitä, että se on kestävä liuoksissa, jotka sisältävät hypokloriittia ja/tai muita hapettavia aineita. Lisäksi keksintö koskee prosessia 10 proteaasin valmistamiseksi ja proteaasin käyttöä prosesseissa, joissa käytetään vesipitoista hypokloriittia.

Proteaaseja on ollut kaupan yli 20 vuotta moniin erilaisiin tarkoituksiin, joista tärkein on pesuaineiden ainesosana.

15

Proteaasit on kehitetty eristämällä luonnon proteaaseja. Useimmat kaupallisesti saatavat proteaasit on saatu Bacillus-suvusta. Parhaillaan markkinoille tulee uusia prote-aasityyppejä, jotka mahdollistavat entistä paremman hin-20 ta/suorituskyky-suhteen useissa erilaisissa spesifisissä • « : olosuhteissa.

• · · • * · • · · :***· Esimerkkejä kaupallisista Bacillus-proteaasituotteista ovat • · · ....: Alcalase®, Esperase®, Primase®, Savinase® ja Durazyme® (pro- . ,*25 teiiniteknisesti tuotettu muunnos Savinasesta), jotka kaikki * · · ovat saatavilla Novo Nordisk A/S:ltä, Tanska. Nämä ja muut • t · * niiden kaltaiset muista kaupallisista lähteistä saatavat entsyymituotteet ovat aktiivisia pesuaineliuoksissa, siis pH- * · · *♦*·* arvoissa 8 - 11 ja kun läsnä on metalli-ionikomplekseja muo- 30 dostavia (sequestering) aineita, surfaktantteja ja valkaisu- ♦*.*. aineita, kuten natriumboraattia, mutta niiden aktiivisuus • · .··*. vähenee, jos prosessissa käytettävä vesi sisältää hypoklo- riittiä. Tämä on kasvava ongelma, kun teollisuusmaissa kloo- *.V rataan entistä enemmän vettä.

« · · *...35 118427 2

Keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön uusia proteaase-ja, joilla on entistä parempi kestävyys hypokloriittia sisältävissä liuoksissa.

5 Näin ollen ensimmäiseltä kannalta keksintö antaa käyttöön proteaasin, jonka immunokemialliset ominaisuudet ovat samat kuin Bacillus-kannasta DSM 8473 saadun proteaasin, ja joka on kestävä hypokloriittia sisältävissä liuoksissa.

10

Toiselta kannalta keksintö koskee biologisesti puhdasta uuden Bacillus-kannan viljelmää. Tarkemmin keksintö koskee Bacil-lus-kantaa DSM 8473 tai sen mutanttia tai muunnosta.

15 Kolmannelta kannalta keksintö antaa käyttöön proteaasin valmistusprosessin, joka käsittää uuden, proteaasia tuottavan Bacillus-kannan viljelemisen sopivassa ravintoalustassa, joka sisältää hiilen ja typen lähteitä ja epäorgaanisia suoloja, sekä halutun entsyymin ottamisen sitten talteen. Spesifisem-20 mältä kannalta viljellään Bacillus DSM 8473:a tai sen mutant- : *·* tia tai muunnosta, joka koodaa proteaasia, jonka immunoke- • ··

: mialliset ominaisuudet ovat samoja kuin Bacillus sp. DSM

8473 :sta saadun proteaasin.

····· , .*. 25 Neljänneltä kannalta tehdään patenttivaatimus proteaasin • · · käytöstä prosesseissa, joissa käytetään hypokloriittia si- • ♦ · sältävää vettä.

• · ·

Lyhyt kuvaus piirroksista • · ♦ *·* * 30 Tätä keksintöä havainnollistetaan viittaamalla mukana oleviin piirroksiin, joissa • ·* t : • · · .*. Kuvio 1 esittää lämpötilan ja keksinnön mukaisen uuden pro- • · · '][·' teaasin proteolyyttisen aktiivisuuden suhdetta (prote- • « *···* 35 aasivalmiste on saatu esimerkin 1 mukaisesti, substraattina 2 % kaseiinia, pH:ssa 9,5).

118427 3

Kuvio 2 esittää pH:n ja uuden, keksinnön mukaisen proteaasin proteolyyttisen aktiivisuuden suhdetta (proteaasivalmiste on saatu esimerkin l mukaisesti, substraattina 2 % kaseiinia, lämpötilassa 25 °C, käyttäen Britten-Robinson-puskureita 5 ennalta määrättyihin pH-arvoihin säädettyinä, pH-alueella 6 -11) .

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Mikro-oraanismit 10 Keksinnön mukaista uutta mikro-organismia, joka pystyy tuottamaan keksinnön mukaista entsyymiä, edustaa maanäytteestä eristetty kanta.

Uusi Bacillus sp. on talletettu Budapestin sopimuksen, joka 15 koskee patenttiprosesseja varten tehtyjen mikro-organismi- talletusten kansainvälistä tunnustamista (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposits of Microor-ganismis for the Purpose of Patent Procedures), mukaisesti 23.8.1993 kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen 20 und Zellkulturen GmbH talletusnumerolla DSM 8473.

• · • « • · · « ί#ϊ ' Keksinnön mukainen mikro-organismi on aerobinen, itiöitä muodostava bakteeri, joka kuuluu Bacillus-sukuun. Morfologi- ····· sesti sitä voidaan kuvata liikkuviksi sauvoiksi, joiden hal- j .·. 25 kaisija on 0,6 - 0,8 μτα ja pituus 1-3 μπι. Itiöt ovat pyö- .*··. reitä tai soikeita, eivät sporangiota täyttäviä (not swelling * * * the sporangium), keskellä tai subterminaalisesti sijaitsevia.

. Kasvun optimilämpötila on 30 - 50 °C, kasvun optimi-pH 6-8, * · · *;”* hyvä kasvu 50 °C:ssa. Mikro-organismi muodostaa keltaisia • · · V · 30 pesäkkeitä vain kasvatettaessa 37 °C:ssa - muuten värittömiä, :*·*: limaisia pesäkkeitä ravintoagarvinoviljelmillä, eikä väriai- • * »***; neen diffuusiota agariin ole havaittavissa.

·· » * * · • · * *·];* Mikro-organismin viljeleminen • · 35 Keksinnön mukaista mikro-organismia voidaan viljellä aerobisissa olosuhteissa ravintoalustassa, joka sisältää assimiloitavaa hiiltä ja typpeä yhdessä muiden välttämättömien 118427 4 ravintoaineiden kanssa, siten, että kasvatusalusta on valmistettu alan tunnettujen periaatteiden mukaisesti.

Sopivia hiilen lähteitä ovat hiilihydraatit, kuten sakkaroo-5 si, glukoosi ja tärkkelys, tai hiilihydraatteja sisältävät aineet, kuten vilja, maltaat, riisi ja durra. Kasvatusalustaan sisällytettävä hiilihydraattipitoisuus voi vaihdella suuresti ja olla esim. enintään 25 % ja vähintään 1 - 5 %, mutta yleensä sopiva osuus on 8 - 10 %, kun prosenttiosuudet 10 on laskettu glukoosiekvivalentteina.

Typen lähde kasvatusalustassa voi olla epäorgaanista ja/tai orgaanista laatua. Sopivia epäorgaanisia typen lähteitä ovat nitraatit ja ammoniumsuolat. Monia orgaanisia typen lähteitä 15 käytetään säännöllisesti fermentointiprosesseissa, joihin liittyy bakteerien viljeleminen. Havainnollistavia esimerkkejä ovat soijajauho, puuvillansiemenjauhe, maapähkinäjauhe, kaseiini, maissi, maissiuute (corn steep liquor), hiivauute, urea ja albumiini. Lisäksi ravintoalustan tulee sisältää 20 tavalliset hivenaineet.

* * * · • · · • »· V · Fermenttoritankeissa viljeltäessä on tarpeen käyttää keino- tekoista ilmastusta. Ilmastuksen nopeus vastaa tavanomaisessa »:··· tankkifermentoinnissa käytettävää.

. .*. 25 t » · *··

Fermentoinnin jälkeen voidaan tuottaa nestemäisiä entsyymi- • · · tiivisteitä poistamalla liemestä karkea aines, tai jos niin . halutaan, tiivistämällä liemi haihduttamalla alhaisessa läm- » · · “* pötilassa tai käänteisosmoosilla. Lopuksi tiivisteeseen voi- • · · *·* * 30 daan lisätä säilöntäaineita.

* · · • · · • · • · t*”; Kiinteitä entsyymivalmisteita voidaan valmistaa puhdistetusta »·· .*. ja/tai tiivistetystä liemestä sakkauttamalla suoloilla, kuten • · · *;]** Na2S04:llä tai veteen sekoittuvilla liuottimilla, kuten eta- • i *···’ 35 nolilla tai asetonilla. Vesi voidaan myös poistaa liemestä sopivilla kuivausmenetelmillä, kuten sumutuskuivauksella.

118427 5

Proteolyyttisen aktiivisuuden määritys

Proteolyyttinen aktiivisuus määritetään substraattina kaseiini. Yksi kaseiiniproteaasiyksikkö (CPU) on määritetty ent-syymimääräksi, joka vapauttaa 1 mM primäärisiä aminoryhmiä 5 (määritetään vertaamalla seriinistandardiin) minuuttia kohden standardiolosuhteissa eli inkuboitaessa 30 minuuttia 25 °C:ssa, pH:ssa 9,5.

Entsyymit 10 Keksinnön mukaiset entsyymit ovat uusia proteaaseja. Ne ovat emäksisiä proteaaseja, joita saadaan viljelemällä keksinnön mukaista mikro-organismia, edullisesti Bacillus sp. DSM 8473:a tai sen mutanttia tai muunnosta sopivassa ravinto-alustassa, joka sisältää hiilen ja typen lähteitä ja epäor-15 gaanisia suoloja. Entsyymejä voidaan saada myös yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

Keksinnön mukaisia proteaaseja voidaan kuvata seuraavin piirtein.

20 * · j *·· Fysikaalis-kemialliset ominaisuudet :T: Molekyylipaino 30 kD, määritetty SDS-PAGE:lla. Isoelektri- sellä fokusoinnilla LKB Ampholine® PAG -levyillä määritetty ··« pl noin 8,8.

* 25 f « · * * » ·*·, PMSF ja kalkkunanmunan valkuaisen proteinaasiestäjä estävät

• » I

proteaasiaktiivisuutta. EDTA ja soijapavun proteiinin estäjä . eivät vaikuta proteaasiaktiivisuuteen.

» · * • i »

«M

» · * • · · V * 30 Lämpötilan ja aktiivisuuden suhde määritettiin käyttäen substraattina 2 % kaseiinia, pHrssa 9,5. Käytettiin edellä • · I*··. kuvattua proteolyyttisen aktiivisuuden määritysmenetelmää * · · muunnettuna siten, että inkubointilämpötilaa vaihdeltiin • · · '·];* välillä 15 - 70 °C. Uuden proteaasin tulokset esitetään ku- • m 35 viossa 1. Kuviosta ilmenee, että proteaasilla on proteolyyttinen aktiivisuus lämpötiloissa 15 °C - 70 °C, ja sen lämpö-tilaoptimi on 50 °C - 60 °C, noin 60 °C.

118427 €

Aktiivisuuden riippuvuus pH:sta määritettiin samalla menettelyllä, käyttäen ennalta määrättyihin pH-arvoihin säädettyjä puskureita pH-alueella 6-11. Tulokset esitetään kuviossa 2. Kuviosta ilmenee, että entsyymillä on proteolyyttistä aktii-5 visuutta kaikissa pH:n arvoissa tällä alueella (alle ll:stä yli 6:een).

Keksinnön mukaisilla proteaaseilla on erityisiä kykyjä vesipitoisessa hypokloriitissa. Esimerkki 2 kuvaa tätä hyvin 10 selvästi. Yleensä näiden proteaasien jäännösaktiivisuus on vähintään 45 %, edullisesti yli 60 % ja edullisimmin yli 80 % NaCl-pitoisuudessa 5 ppm (ppm = osaa miljoonasta, mg/1), ja jäännösaktiivisuus vähintään 10 %, edullisesti yli 20 %, 10 ppm:ssä NaOCl:a.

15

Immunokemialliset ominaisuudet

Immunokemialliset ominaisuudet voidaan määrittää immunologi-sesti ristikkäisreaktiotunnistuskokeilla (cross-reaction identity tests). Tunnistuskokeet voidaa tehdä hyvin tunne-20 tulla Ouchterlonyn kaksoisimmunodiffuusiomenettelyllä tai ·· j *·· kaksoisristikkäisellä (tandem crossed) immunoelektroforee- ίΤί silla teosten Roitt, I. M., Immunology, Gower Medical Pub- ·’*’· lishing, 1985 ja Axelsen, N. H., Handbook of Immunoprecipi- ·»* tation-in-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications, , .·, 25 1983, kappaleet 5 ja 14, mukaan. Termit "antigeeninen ident- • * » •m, tisyys" ("antigenic identity") ja "osittainen antigeeninen t » » identtisyys" (partial antigenic identity") on kuvattu samassa kirjassa, kappaleissa 5, 19 ja 20.

: «*· • · · * * * *·* * 30 Tehtiin monospesifistä antiseerumia edellämainitun menetelmän ·’·*. mukaisesti, immunisoimalla kaneja yhdellä keksinnön mukaisis- • · ,···. ta puhdistetuista proteaaseista. Immunogeeniin sekoitettiin • · #

Freundin apuainetta ja sitä injisoitiin kaneihin ihon alle • · » '·'·* joka toinen viikko. Antiseerumia otettiin im- • " * f · 35 munisointiperiodin kestettyä kaikkiaan 8 viikkoa, ja siitä valmistettiin immunoglobuliinia, kuten on kuvannut N. H. Axelsen, edellä.

118427 7

Ouchterlonyn kaksoisimmunodiffuusiokokeet osoittivat, ettei keksinnön mukainen proteaasi ollut identtinen minkään tunnetuista emäksisistä seriiniproteaaseista Savinase, Esperase, Durazyme, Primase (saatavissa Novo Nordisk A/S:ltä) tai Ka-5 zusase™ (saatavilla SHOWA DENKOlta) kanssa. Osoitettiin osittainen immunokemiallinen identtisyys Bacillus licheniformiksen Alcalasen kanssa.

Hap.ett.avat aineet 10 Keksinnön mukaiset proteaasit kestävät hapettavia aineita, kuten hypokloriittia, vetyperoksidia ja peroksidin esiasteita (esim. perkarbonaattia, perboraattia ja peroksikarboksyyli-happoja, kuten perasetaattia).

15 Sovellukset

Keksinnön mukaisia proteaaseja voidaan tyypillisesti lisätä ainesosiksi pesuainekoostumuksiin. Proteaasit voivat myös olla käyttökelpoisia proteiinipitoisen lian poistamisessa.

20 Lisäksi tämän keksinnön kuvaamia uusia proteaaseja voidaan * • *·· käyttää proteiinin käsittelyyn prosessivedessä, joka sisältää ij*: hypokloriittia, erityisesti, kun hypokloriittia on läsnä :"*· pitoisuutena l - 10 ppm.

··« ····« « * . .·. 25 Pesuainekoostumukset * · ® *;·, Keksinnön mukaisesti proteaasi voidaan lisätä ainesosana pesuainekoostumukseen. Se voidaan sisällyttää sellaisenaan . pesuainekoostumukseen pesuaineen apuaineena. Pesuainekoos- ♦ · · *;j·* tumus sekä pesuaineen apuaine voivat lisäksi sisältää yhtä * · * V * 30 tai useampaa muuta entsyymiä, kuten lipaaseja, amylaaseja, kutinaaseja, sellulaaseja ja oksidoreduktaaseja.

• ·

«M

t : ·»·

Erityiseltä kannalta keksintö antaa käyttöön pesuaineen apu- • · * *·|·* aineen. Entsyymit voidaan sisällyttää pesuainekoostumukseen 35 lisäämällä erillisiä apuaineita, jotka sisältävät yhtä tai useampaa entsyymiä tai lisäämällä yhdistetty apuaine, joka sisältää kaikki kyseiset entsyymit. Keksinnön mukainen apu- 118427 8 aine eli erillinen apuaine tai yhdistetty apuaine voidaan formuloida esimerkiksi rakeiksi, nesteiksi, lietteiksi jne. Edullisia pesuaineen apuaineformulaatioita ovat rakeet, erityisesti pulverisoitumattomat (non-dusting) rakeet, nesteet, 5 erityisesti stabiloidut nesteet, lietteet tai suojatut entsyymit .

Pulverisoitumattomia rakeita voidaan valmistaa esim. US 4 106 991:ssä ja 4 661 452:ssa (molemmat Novo Industri A/S:n) kuva-10 tuilla tavoilla, ja ne voidaan haluttaessa päällystää alalla tunnetuilla menetelmillä. Esimerkkejä vahamaisista päällys-tysaineista ovat polyeteenioksidituotteet (polyeteeniglykoli, PEG), joiden keskimääräiset molekyylipainot ovat 1 000 -20 000, etoksyloidut nonyylifenolit, joissa on 16 - 50 etee-15 nioksidiyksikköä, etoksyloidut rasva-alkoholit, joissa alkoholi sisältää 12 - 20 hiiliatomia, ja joissa on 15 - 80 etee-nioksidiyksikköä, rasva-alkoholit, rasvahapot ja rasvahappojen mono-, di- ja triglyseridit. Esimerkkejä kalvoa muodostavista päällystysaineista, joita voidaan käyttää leijukerros-20 tekniikoilla, on annettu Iso-Britannian patentissa (GB) ·· • *·· 1483591. Nestemäiset entsyymivalmisteet voidaan stabiloida :T.* esimerkiksi lisäämällä polyolia, kuten propeeniglykolia, ·*** sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa tai boorihappoa t · * vakiintuneiden menetelmien mukaisesti. Alalla tunnetaan hyvin . ,·, 25 muitakin entsyymistabiloijia. Suojattuja entsyymejä voidaan f · t valmistaa julkaisussa EP 238 216 kuvatun menetelmän mukaises- t · · β ti.

φ « · '•j·* Keksinnön mukaiset pesuainekoostumukset voivat olla missä *.! * 30 tahansa sopivassa muodossa, esim. jauheena, rakeina, tahnana » "·’· tai nesteenä. Nestemäinen pesuaine voi olla vesipitoinen, l*··. sisältäen tyypillisesti enintään noin 70 % vettä ja 0 - 30 %

fM

orgaanista liuotinta, tai vedetön.

* · · * * « • · ·*** *...· 35 Pesuainekoostumus käsittää yhtä tai useampaa surfaktanttia, joista kukin voi olla anioninen, ionisoitumaton, kationinen tai amfoteerinen. Pesuaine sisältää yleensä 0 - 50 % 118427 9 anionista surfaktanttia, kuten lineaarista alkyylibent-seenisulfonaattia (LAS), alfa-olefiinisulfonaattia (AOS), alkyylisulfaattia (rasvahapposulfaattia) (AS), alkoholietok-sisulfaattia (AEOS tai AES), sekundaarisia alkaanisulfonaat-5 teja (SAS), alfa-sulfo-rasvahappometyyliestereitä, alkyyli-tai alkenyylisukkinaattia tai saippuaa. Se voi myös sisältää 0 - 40 % ionisoitumatonta surfaktanttia, kuten alkoholietok-sylaattia (AEO tai AE), karboksyloituja alkoholietoksylaat-teja, nonyylifenolietoksylaattia, alkyylipolyglykosidia, 10 alkyylidimetyyliamiinioksidia, etoksyloitua rasvahappo- monoetanoliamidia, rasvahappomonoetanoliamidia tai polyhyd-roksialkyylirasvahappoamidia (esim. kuten on kuvattu W0 92/06154:ssä).

15 Pesuainekoostumus voi lisäksi sisältää yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, kuten amylaaseja, lipaaseja, kutinaaseja, sellulaaseja ja oksidoreduktaaseja.

Pesuaine voi sisältää 1 - 65 % pesuaineen täyteainetta tai 20 komplekseja muodostavaa ainetta, kuten zeoliittia, difos- ·« j '·· faattia, trifosfaattia, fosfonaattia, sitraattia, nitrilo- »·· S,! ί triasetaattia (NTA) , eteenidiamiinitetra-asetaattia (EDTA) , dieteenitriamiinipenta-asetaattia (DTMPA), alkyyli- tai al-·*··· kenyylisukkinaattia, liukoisia silikaatteja tai kerrokselli- j 25 siä silikaatteja (esim. Hoechstin SKS-6) . Pesuaine voi myös *··, olla olennaisesti täyteaineita sisältämätön.

X · * t . Pesuaine voi sisältää yhtä tai useampaa polymeeriä. Esimerk- • ♦ · kejä ovat karboksimetyyliselluloosa (CMC), polyvinyylipyrro- • · * 30 lidoni (PVP), polyeteeniglykoli (PEG), polyvinyylialkoholi !*·*: (PVA) , polykarboksylaatit, kuten polyakrylaatit, maleiini- 4 · ,**·. /akryylihappokopolymeerit ja lauryylimetakrylaatti/akryyli- *9 · /. happokopolymeerit.

ί * · • ♦ *99 4 » ***** 35 Pesuaine voi sisältää valkaisujärjestelmän, joka voi käsittää H202-lähteen, kuten perboraattia tai perkarbonaattia, joka voi olla yhdistetty perhappoa muodostavaan valkaisuaineen 118427 10 aktivoijaan, kuten tetra-asetyyli-eteenidiamiini (taed) tai nonanoyloksibentseenisulfonaatti (NOBS). Vaihtoehtoisesti valkaisujärjestelmä voi käsittää esim. amidi-, imidi- tai sulfonityyppisiä peroksihappoja.

5

Keksinnön mukaisen pesuainekoostumuksen entsyymit voidaan stabiloida tavanomaisilla stabilointiaineilla, esim. poly-olilla, kuten propeeniglykoli tai glyseroli, sokeri tai so-kerialkoholi, maitohappo, boorihappo tai boorihapon johdan-10 nainen, kuten esim. aromaattinen boorihappoesteri, ja koostumus voidaan formuloida esim. WO 92/19709:ssä ja WO 92/19708:ssa kuvatuilla tavoilla.

Pesuaine voi myös sisältää muita tavanoimaisia pesuaineen 15 ainesosia, kuten esim. kankaan hoitoaineita, mukaan luettuna alumiinioksidit (clays), vaahtoamista lisääviä aineita, vaah-donestoaineita, korroosion estäjiä, likaantumista estäviä aineita, lian uudelleen tarttumista estäviä aineita, väriaineita, bakteereja tappavia aineita, optisia kirkaisteita tai 20 hajustetta.

*· » * • t« t :Τϊ pH (mitattuna vesiliuoksesta käyttöpitoisuudessa) on taval- ·*”· lisesti neutraali tai emäksinen, esim. 7-11.

««•V* • » . 25 Keksinnön piiriin kuuluvia erityisiä pesuainekoostumuksia • · · tl» ·*· ovat: 1« * • · v 1) Rakeiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtopaino on • · i *»··* vähintään 600 g/1, ja joka käsittää • S · • 9 * *· 30 - lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia S V (hapoksi laskettuna) 7 - 12 % • f· i ; - alkoholietoksisulfaattia (esim. C12_18-alko-holi, 1-2 EO) tai alkyylisulfaattia (esim.

*:::· cu.,8) i - * * 35 - alkoholietoksylaattia (esim. C14.15-alkoho- 5 - 9 % li, 7 EO) 1 1 8427 11 - natriumkarbonaattia (Na2C03:na) 14 - 20 % -liukoista silikaattia (Na2C03:na) 2 - 6 % - zeoliittia (NaAlSi04:na) 15 - 22 % - natriumsulfaattia (Na2S04:nä) 0 - 6 % 5 - natriumsitraattia/sitruunahappoa (C6H5Na307/C6H807:nä) 0 - 15 % - natriumperboraattia (NaB03.H20:na) 11 - 18 % - TAEDria 2 - 6 % - karboksimetyyliselluloosaa 0 - 2 % 10 - polymeerejä (esim. maleiini-/akryylihappo- kopolymeeriä, PVP:tä, PEG:tä) 0 - 3 % - entsyymejä 0 - 5 % - vähäisiä ainesosia (esim. vaahdonestoai-neita, hajustetta, optista kirkastetta, va- 15 lovalkaisijaa) 0 - 5 % 2) Rakeiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtopaino on vähintään 600 g/1, ja joka käsittää • ·» : - lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia 6 - 11 % • · · ί,,.ί 20 (hapoksi laskettuna) - alkoholietoksisulfaattia (esim. C12_18-al-koholia, 1-2 EO) tai alkyylisulfaattia : (esim. C16.18) l - 3 % - alkoholietoksylaattia (esim. C14.15)-alkoho- 25 lia, 7 EO) 5 - 9 % * · · * · * « · · - natriumkarbonaattia (Na,CO,:na) 15 - 21 %

• * · c J

* i · • · \.'.m - liukoista silikaattia (Na20, 2Si02) 1 - 4 % • · • * · - zeoliittia (NaAlSiO, :na) 24 - 34 % • « · ** • « * • · .***; - natriumsulfaattia (Na2S04:nä) 4 - 10 % ·#* 118427 12 - na t r iumsi t raa11 ia/s i t ruunahappoa (C6H5Na307/C6H807:nä) 0 - 15 % - karboksimetyyliselluloosaa 0 - 2 % - polymeerejä (esim. maleiini-/akryylihap- 5 pokopolymeeriä, PVP, PEG) 0 - 6 % - entsyymejä 0 - 5 % - vähäisiä ainesosia (esim. vaahdonestoai- neita, hajustetta) 0 - 5 % 10 3) Rakeiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtopaino on vähintään 600 g/1, ja joka käsittää - lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia (hapoksi laskettuna) 5 - 9 % - alkoholietoksylaattia (esim. C1z_15-alko- 15 hoiia, 7 EO) 7 - 14 % - saippuaa rasvahappona (esim. C16_22) 1 - 3 % - natriumkarbonaattia (Na2C03:na) 10 - 17 % .. - liukoista silikaattia (Na2C03,2Si02:na) 3 - 9 % • * · - zeoliittia (NaAlSi04 :na) 23 - 33 % • · · 20 - natriumsulfaattia (Na2S04:nä) 0 - 4 % * - natriumperboraattia (NaB03.H20:na) 8 - 16 % : I" - TAED:ia 2 - 8 % • · · t » « - fosfonaattia (esim. EDTMPA:ta) 0 - 1 % * ·.:.*· - karboksimetyyliselluloosaa 0 - 2 % * · * * * * *. 25 - polymeerejä (esim. maleiini-/akryylihap- • pokopolymeeri, PVP, PEG) 0 - 3 % · · i : ·;* - entsyymejä 0 - 5 % • * • * · *·*·* - vähäisiä ainesosia (esim. likaantumisen • · · :...* estäjiä, hajustetta, optista kirkastetta) 0 - 5 % 30 118427 13 4) Rakeiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtopaino on vähintään 600 g/1, ja joka käsittää - lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia (hapoksi laskettuna) 8 - 12 % 5 - alkoholietoksylaattia (esim. C1Z.^-alkoholia, 7 EO) 10 - 25 % - natriumkarbonaattia (Na2C03:na) 14 - 22 % - liukoista silikaattia (Na20, 2Si02:na) 1 - 5 % - zeoliittia (NaAlSi04:na) 25 - 35 % 10 - natriumsulfaattia (Na2S04:nä) 0 - 10 % - karboksimetyyliselluloosaa 0 - 2 % - polymeerejä (esim. maleiini/akryylihappo- kopolymeeria, PVP:tä, PEG:tä) 1 - 3 % - entsyymejä 0 - 5 % 15 - vähäisiä ainesosia (esim. likaantumista estäviä aineita, hajustetta) 0 - 5 % .. 5) Nestemäinen pesuainekoostumus, joka käsittää * · · » .*·*; - lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia ,·*·. 20 (hapoksi laskettuna) 15 - 21 % * · · *:*” - alkoholietoksylaattia (esim. C12.15-alko- i holia, 7 EO tai C12_15-alkoholia, 5 EO) 12 - 18 % • · * ; - saippuaa rasvahappona (esim. oleaattia) 3 - 13 % . - alkenyylisukkinaattia (C12_14) 0 - 13 % • · · * · * 25 - aminoetanolia 8 - 18 % • · · » - sitruunahappoa 2 - 8 % • · • · !***: - fosfonaattia 0 - 3 % • · · :V: - polymeerejä (esim. PVPrtä, PEG:tä) 0 - 3 % • · · - boraattia (B407:nä) 0 - 2 % 118427 14 - etanolia 0 - 3 % - propyleeniglykolia 8 - 14 % - entsyymejä 0 - 5 % - vähäisiä ainesosia (esim. dispergoivia 5 aineita, likaantumista estäviä aineita, hajustetta, optista kirkastetta) 0 - 5 % 6) Nestemäinen pesuainekoostumus, joka käsittää - lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia 10 (hapoksi laskettuna) 15 - 21 % - alkoholietoksylaattia (esim. C12.^-alkoholi, 7 EO tai C12_15-alkoholi, 5 EO) 3 - 9 % - saippuaa rasvahappona (esim. oleaattia) 3 - 10 % - zeoliittia (NaAlSi04:na) 14 - 22 % 15 - kaliumsitraattia 9 - 18 % - boraattia (B407:na) 0 - 2 % - karboksyylimetyyliselluloosaa 0 - 2 % • » ' ** - polymeerejä (esim. PVP:tä, PEG:tä) 0 - 3 % • ·· • · • · · - ankkuroivia polymeerejä, kuten esim. lau- *’. 20 ryylimetakrylaatti/akryylihappokopolymeeri, moolisuhde 25:1, molekyylipaino 3 800) 0 - 3 % ,···. - glyserolia 0 - 5 % S · * - entsyymejä 0 - 5 % - vähäisiä ainesosia (esim. dispergoivia »»« ».· : 25 aineita, likaantumista estäviä aineita, ha- justetta, optisia kirkasteita) 0 - 5 % • · • · • · · t "* 7) Rakeiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtopaino on • · V.·* vähintään 600 g/1, ja joka käsittää ··· • * **** 30 - rasvahapposulfaattia 5 - 10 % 118427 15 - etoksyloitua rasvahappomonoetanoliamidia 3 - 9 % - saippuaa rasvahappona 0 - 3 % - natriumkarbonaattia (Na2C03:na) 5 - 10 % -liukoista silikaattia (Na20, 2Si02:na) l - 4 % 5 - zeoliittia (NaAlSi04:na) 20 - 40 % - natriumsulfaattia (Na2S04:na) 2 - 8 % - natriumperboraattia (NaB03.H20:na) 12 - 18 % - TAED:ia 2 - 7 % - polymeerejä (esim. maleiini-/akryylihappo- 10 kopolymeeriä, PEG:tä) 1 - 5 % - entsyymejä 0 - 5 % - vähäisiä ainesosia (esim. optista kirkastetta, vaahdonestoaineita, hajustetta) 0 - 5 % 15 8) Rakeiksi formuloitu pesuainekoostumus, joka käsittää .. - lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia • · (hapoksi laskettuna) 8 - 14 % * · · • · * ,··· - etoksyloitua rasvahappomonoetanoliamidia 5 - li % • * • · · *:*·· - saippuaa rasvahappona 0 - 3 % 20 - natriumkarbonaattia (Na2C03:na) 4 - 10 % • ·· | | t * - liukoista silikaattia (NazO, 2Si02:na) 1 - 4 % . .*, - zeoliittia (NaAlSiO. :na) 30 - 50 % t · · ··· : - natriumsulfaattia (Na2S04:na) 3 - il % Γ*': - natriumsitraattia (C6H5Na307:na) 5 - 12 % IM | * ···* 25 - polymeerejä (esim. PVP, maleiini-/akryy- lihappokopolymeeri, PEG) l - 5 % • · *·· V.: - entsyymejä 0 - 5 % 118427 16 - vähäisiä ainesosia (esim. vaahdonestoai- neita, hajustetta) 0 - 5 % 9) Rakeiksi formuloitu pesuainekoostumus, joka käsittää 5 - lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia (hapoksi laskettuna) 6 - 12 % - ionisoitumatonta surfaktanttia 1 - 4 % - saippuaa rasvahappona 2 - 6 % - natriumkarbonaattia (Na2C03:na) 14 - 22 % 10 - zeoliittia (NaAlSi04:na) 18 - 32 % - natriumsulfaattia (Na2S04:nä) 5 - 20 % - natriumsitraattia (C^HgNajC^rna) 3 - 8 % - natriumperboraattia (NaB03.Hz0:na) 4 - 9 % - valkaisuaineen aktivoijaa (esim. NOBS tai 15 TAED) 1 - 5 % - karboksimetyyliselluloosaa 0 - 2 % ,, - polymeerejä (esim. polykarboksylaatti tai • *" PEG) 1 - 5 % • ·* k * · l · · t..# - entsyymejä 0 - 5 % * * ····· 20 - vähäisiä ainesosia (esim. optista kirkas- , .*. tetta, hajustetta) 0 - 5 % • · · • ·· : 10) Vesipitoinen nestemäinen pesuainekoostumus, joka käsittää • ;’· - lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia

Mk 25 (hapoksi laskettuna) 15 - 23 % • * * *· * - alkoholietoksisulfaattia (esim. C12_15-al- *···. koholia, 2 - 3 EO) 8 - 15 % S · • · .·]·, - alkoholietoksylaattia (esim. C12.15-alko- * · * holia, 7 EO tai C12_15-alkoholia, 2-3 EO) 3 - 9 % « · «*# 30 - saippuaa rasvahappona (esim. lauraattina) 0 - 3 % 118427 17 - aminoetanolia 1 - 5 % - natriumsitraattia 5 - 10 % - hydrotrooppia (esim. natriumtolueenisul- fonaattia) 2 - 6 % 5 - boraattia (B407:na) 0 - 2 % - karboksimetyyliselluloosaa 0 - 1 % - etanolia l - 3 % - propyleeniglykolia 2 - 5 % - entsyymejä 0 - 5 % 10 - vähäisiä ainesosia (esim. polymeerejä, dispergoivia aineita, hajustetta, optisia kirkasteita) 0 - 5 % 11) Vesipitoinen nestemäinen pesuainekoostumus, joka käsittää 15 - lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia (hapoksi laskettuna) 20 - 32 % - alkoholietoksylaattia (esim. C12_15-alko- holia, 7 EO tai C12_15-alkoholia, 5 EO) 6 - 12 % * • · · ί...: 20 - aminoetanolia 2 - 6 % - sitruunahappoa 8 - 14 % • j't - boraattia (B,07:nä) 1 - 3 % t * * » ~ polymeerejä (esim. maleiini-/akryylihap- . .*. pokopolymeeriä, ankkuroivia polymeerejä, ··· 25 kuten esim. lauryylimetakrylaatti/akryyli- happokopolymeeriä ja CMC:tä) 0 - 3 % • · · • * *··, - glyserolia 3 - 8 % $ * « * · t.’.# - entsyymejä 0 - 5 % • · 4 • · ·»* • · • · • · t 118427 18 - vähäisiä ainesosia (esim. hydrotrooppeja, dispergoivia aineita, hajustetta, optisia 0 - 5 % kirkasteita)# 5 12) Rakeiseksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja joka käsittää - anionista surfaktanttia (lineaarista al-kyylibent seenisulfonaatt ia, alkyylisulfaat-tia, alfa-olefiinisulfonaattia, alfa-sulfo- 10 rasvahappometyyliestereitä, alkaanisul- fonaatteja, saippuaa) 25 - 40 % - ionisoitumatonta surfaktanttia (esim. l - 10 % alkoholietoksylaattia) - natriumkarbonaattia (Na2C03:na) 8 - 25 % 15 - liukoisia silikaatteja (NazO, 2Si02:na) 5 - 15 % - natriumsulfaattia (Na2S04:na) 0 - 5 % - zeoliittia (NaAlSi04:na) 15 - 28 % - natriumperboraattia (NaB03.4H20:na) 0 - 20 % ·· : *·· - valkaisuaineen aktivoijaa (TAED tai NOBS) 0 - 5 % • ·· * * * *·].* 20 - entsyymejä 0 - 5 % • · • · - vähäisiä ainesosia (esim. hajustetta, • · optisia kirkasteita) 0 - 3 % Ιίϊ ··

I * I

* * 13) Kohdissa 1-12 kuvattujen laisia pesuainekoostumuksia, 25 joissa lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti - tai osa :.i.: siitä - on korvattu alkyylisulfaatilla (C12-C18) * · · • · · • · · * !·.·. 14) Kohdissa 1-13 kuvattujen laisia pesuainekoostumuksia, *···. jotka sisältävät stabiloitua tai kapseloitua perhappoa joko *·* 30 lisäainesosana tai korvaamassa jo spesifioituja valkaisujär- • « V.* jestelmiä.

·*· • · • · ··· 118427 19 15) Kohdissa 1, 3, 7, 9 ja 12 kuvattujen laisia pesu-ainekoostumuksia, joissa perboraattisisältö on korvattu per-karbonaatilla.

5 16) Kohdissa l, 3, 7, 9 ja 12 kuvattujen laisia pesu- ainekoostumuksia, jotka lisäksi siältävät mangaanikatalyyt-tiä. Mangaanikatalyytti voi olla esim. yksi artikkelissa "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, s. 637 - 639 kuvatuista yhdis-10 teistä.

17) Vedettömiksi pesuainenesteiksi formuloituja pesu-ainekoostumuksia, jotka käsittävät nestemäistä ionisoituma-tonta surfaktanttia, kuten esim. lineaarista alkoksyloitua 15 primaarialkoholia, täyteainejärjestelmän (esim. fosfaattia), entsyymiä ja emästä. Pesuaine voi käsittää myös anionista surfaktanttia ja/tai valkaisujärjestelmän.

Tätä keksintöä kuvataan edelleen seuraavissa esimerkeissä, 20 joita ei ole tarkoitettu mitenkään rajoittamaan patenttivaa timuksien esittämää keksinnön piiriä.

• · • · : " Esimerkki 1 i »· V! Bacillus sp. DSM 8473:a viljeltiin 37 °C:ssa pyörittävällä • · · ί,,,ί 25 ravistelupöydällä (300 rpm) 500 ml:n kavennetuissa (baffled) *:**: Erlenmeyer-pulloissa, jotka sisälsivät 100 ml kasvatusalus- i ·*; taa, jonka koostumus oli seuraava (per litra) : «» «1* * · · • · ·

Perunatärkkelystä 100 g i 30 Jauhettua ohraa 50 g :‘:’i Soijajauhoa 20 g

Na2HP04 x 12 H20 9 g

Pluronic® 0,1 g f · ·;·* Natriumkaseinaattia 10 g 35 • * ··· • · * · ·*· 118427 20

Kasvatusalustan tärkkelys tehtiin nestemäiseksi alfa-amylaa-silla ja kasvatusalusta steriloitiin kuumentamalla 120 °C:ssa 45 minuuttia.

5 Kolmen inkubointivuorokauden jälkeen viljelmän proteolyytti- nen aktiivisuus määritettiin käyttäen yllä kuvattua menetel mää.

Viljelemisen jälkeen liemen entsyymiaktiivisuus oli 120 10 CPU/1.

Sen jälkeen, kun kiinteä aine oli erotettu, proteaasi puhdistettiin tavanomaisella kromatografisella menetelmällä ja sitten pakastuskuivattiin. Pakastuskuivatun valmisteen ak-15 tiivisuus oli 7,4 CPU/g.

Tämän esimerkin mukaisesti valmistetun valmisteen piirteisiin on viitattu aikaisemmin tässä selityksessä, ja tähän kohtaan viitattiin.

20

Esimerkki 2 säilyvyys • · · Säilyvyyskokeet tehtiin 1,1 g/l:ssa kaupallista amerikka-*;].* laista pesujauhetta, joka oli liuotettu noin 6° dH (saksalai- • 9 *··*" 25 set kovuusasteet, German Hardness) veteen eri natriumhypo- kloriittikonsentraatioiden kanssa 25 °C:ssa, isotermisesti 60 *«:/ minuutissa, proteaasipitoisuudessa 0,3 CPU litraa kohden.

• M

♦ * * • · » Näiden kokeiden tulokset esitetään seuraavassa taulukossa l.

j 30 ···

Taulukko 1 • a · .......................... 1 • ---- - o ppm NaOCl 5 ppm NaOCl 10 ppm NaOCl • ·____ „_ _ ···

Alcalase 100 % 10 % 0 % * __________ _______... _ • · V.** Primase 100 % 5 % 0 % *··** 35 Esperase 55 % 0 % 0 % 1 1 8427 21

Savinase 100 % 0 % 0 %

Durazyme 100 % 40 % 0 %

Uusi proteaasi 100 % 100 % 30 % 5 Taulukko 1 osoittaa, että uusi proteaasi on paljon tunnettuja proteaaseja kestävämpi liuoksissa, jotka sisältävät natriumhypokloriittia. Uuden proteaasin jäännösaktiivisuus on 30 % pesuaineliuoksessa, joka sisältää 10 ppm NaOCl:a, kun tunnetuilla proteaaseilla ei ole ollenkaan aktiivisuutta näissä 10 olosuhteissa.

Esimerkki 3

Kestävyyskokeet (stability performance tests) tehtiin myös I, 1 g/l:ssa kaupallista amerikkalaista pesujauhetta, joka oli 15 liuotettu noin 6° dH (saksalaiset kovuusasteet) veteen, jossa

Oli 1 % Proxania (39,5 % CH3C000H, 4,5 % H202, 44 % CH3COOH, II, 3 % H20, 0,7 % H2S04) , 25 °C:ssa, isotermisesti 60 minuutin ajan, proteaasipitoisuudessa 0,3 CPU litraa kohden.

20 Näiden kokeiden tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 2: ·« • » • ··

Taulukko ,2 :,..J Entsyymi Jäännösaktiivisuus . Alcalase 25 % i ::__ ··· 25 Primase 20 % • · 4 « _________ _ _

Esperase 20 % • - - - -.

» · · *”;* Savinase 25 % « · · • * « —

Durazyme 85 % ^ · i 4 · — ' « · j··*. Uusi proteaasi 100 % • ·· _t , _M _ -I . ...............

.·. 30 • ft » V.* Taulukko 2 osoittaa, että uusi proteaasi on tunnettuja pro- ··· *...· teaaseja kestävämpi liuoksissa, jotka sisältävät Proxania.

118427 22

Esimerkki 4 Pesukykv

Pesukykykokeet suoritettiin ruoholla liatulle puuvillalle 20 °C:ssa, isotermisesti 10 minuutin ajan.

5

Kokeet suoritettiin entsyymipitoisuuksissa 0,0025/ 0,005, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2 ja 0,5 CPU litraa kohden.

Käytettiin 2,0 g/1 kaupallista amerikkalaista pesujauhetta.

10 Pesujauhe liuotettiin noin 6° dH:n (saksalaiset kovuusasteet) veteen ja pH säädettiin 9,5:ksi. Tekstiili/pesuneste-suhde oli 6 g tekstiiliä pesunestelitraa kohden.

Pesun jälkeen kankaat huuhdottiin juoksevalla vesijohtove-15 dellä ja ilmakuivattiin. Remissio (% R) 460 nm:ssä määritettiin.

Pesukyvyn mittana käytettiin remissioerotusta delta R, joka on yhtä suuri kuin pesun jälkeinen remissio, kun entsyymiä 20 oli lisätty, miinus pesun jälkeinen remissio, kun entsyymiä ei ollut lisätty lainkaan.

• * • · · Näiden kokeiden tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 3 | j t (kahden testin keskiarvot).

9 * '···* 25 « 1 : Taulukko 3 |^;·. --

Uuden proteaasin pitoisuus ’ CPU/1 deltaR

. .*. 0,0025 3,8 • * · ' 1 • 94 _ _ . _ .

V· 30 0,005 6,6 9 _ ............

ί V 0,010 6,4 9*9 * Ϊ-- 0,050 11,8 . . --- ο,ι i2,9 __ 0,2 13,6 118427 23 0,5 13,1

Taulukko 3 osoittaa, että uusi proteaasi on hyvin sopiva käytettäväksi pesuaine-entsyyminä.

• i • 1· * ·»« » · · * » · f ««« • · * · • · * *· · • · 999 • 99 Ϊ9 9 • · tit 999 • 9· t: : 9 99 9 9 9 9 I « • 1 t : 99 f 9 • 9 • 99 • 99 9 9 99 « · * · 999 24 1 1 8427 lntt(iMtl«n«l Application No: RCT/ /

MICROORGANISMS

2 7-8

OpoO )M < IMWtm «Ok Ik· »kWHflMi kkllp I· M Ilf ** ., ·»' ° - af Ik· mmum·1» · ICUTVICAtlM W tlN«T·

FwtMr «IMIW tn IMihMM m m PWml ikal (**[· «fmilwiiiari iimnmi« DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELL-KULTUREN GmbH__

Attn·* ·> »—i> kumu·»· pncIMkii mo mi Ml «min)«

Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany

Or· M <imR> · Α«·μΙμι Number · 23 August 1993 DSM 8473

. ADDITIONAL IHOICATIOM· · (Im·· kUnk H Ml MPfkaM·). TM· Infm···· I· c*MMM M · UM4II MMCkM IkM Q

In respect of those designations in which a European and/or Australian patent is sought, during the pendency of the patent application a sample of the deposited microorganism is only to be provided to an independent expert nominated by the person requesting the sample (Rule 28(4) EPC / Regulation 3.25 of Australia Statutory Rules 1991 No 71).

C. D(*l«MAT(0 «TATU ΙΟΙ WHICH INDICATIONS AM MAD· <* IM klM«ll·»» ItuUt» «M|MW SIMM) ·* • e • ·· e • ·· e * · e · # _ _ .., ft. WAftATf Of MMCATtON··tU**ebUafcMset i»ktll>) * * e * — - --------------j— -- - — — - - _ ------- *·· TA· ImRcMMI IN|«i M·· ft SuimRUR M Ifu tUMaUMl Imu RU * (9»*C«fr IN RMUfSi MUKI «I ft UflCUISM «.Iw

• “Acwmn Rumr M DiUiQ

• e • · · see • ·· ··· • · · see e . · QT«| iml .11 fMfiM wlk Ik* ΜΙΜΜΙΙ·ιι·Ι MOkullM ·Μ· MM It· M CMCkM I» Ik· MW «HIM OOktl * · · (MmmW OSm) 'y * * t φ Q Th* 4*1* *1 r*c*iRt (l««i IM b? IM lAUinstUAd iutm '* * * * a e · ·

* * * * (AvtlwM OflksO

o ::1 rim PCTinen»· iJMnwt nw e · ··· e · * e • Φ ·

Claims

118427

1. Proteaasi, tunnettu siitä, että se on tuotettavissa kannalla Bacillus sp. DSM 8473 ja sen immunokemialliset 5 ominaisuudet ovat samat kuin kannasta Bacillus sp. DSM 8473 johdetun proteaasin, ja että sen piirteitä ovat myös (a) ilmeinen molekyylipaino noin 30 kD, SDS-PAGE:lla määritettynä, 10 (b) pi noin 8,8, määritettynä isoelektrisellä fokusoinnilla LKB Ampholine PAG -levyillä, (c) aktiivisuusoptimi lämpötila-alueella 50 °C-60 °C, noin 60 15 °C, määritettynä pH:ssa 9,5, substraattina kaseiini, (d) yli 80 % aktiivisuudesta alueella pH 6-11, mitattuna 25 °C:ssa substraattina kaseiini, ja 20 (e) että se säilyttää vähintään 80 % aktiivisuudestaan 60 minuutin jälkeen 25 °C:ssa 5 ppirussä hypokloriittia.

• · : *·· 2. Biologisesti puhdas Bacillus sp. DSM 8473 -kannan viljel- • · • · · ·,· · ma. ··« : : 25

* · · ·;··· 3. Prosessi patenttivaatimuksen 1 mukaisen proteaasin val- . mistamiseksi, tunnettu siitä, että prosessi käsittää, • · · että viljellään proteaasia tuottavaa, patenttivaatimuksen 2 • · · mukaista, Bacillus sp. -kantaa sopivassa ravitsemusalustässä, .. 30 joka sisältää hiilen ja typen lähteitä ja epäorgaanisia suo- • * · · loja, minkä jälkeen kerätään haluttu entsyymi talteen.

• · • · ·»· : 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen prosessi, tunnettu · · · :***· siitä, että kanta on Bacillus sp. DSM 8473. *·· 35 • · · "**.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen proteaasin käyttö proteii- • · · tia. *· nin käsittelyyn prosessivedessä, joka sisältää hypokloriit 118427

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen proteaasin käyttö, tunnettu siitä, että hypokloriittia on läsnä pitoisuutena 1- 10 ppm.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen proteaasin käyttö prote iinipa toisen lian poistamiseen.

8. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaista proteaasia ja surfaktant- 10 tia.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, erityisesti amylaasia, lipaasia, kutinaasia, 15 sellulaasia ja/tai oksidoreduktaasia.

10. Pesuaineen apuaine, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaista proteaasia pulve-risoitumattomien rakeiden, stabiloidun nesteen, lietteen tai 20 suojatun entsyymin muodossa.

·*·.. 11. Pesuprosessi, tunnettu siitä, että se käsittää likaisen kankaan käsittelyn patenttivaatimuksen 1 mukaisella .···. proteaasilla. • · ·*· _ 25 • · .

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen pesuprosessi, t u n - • · · • · · "* n e t t u siitä, että käsittää patenttivaatimuksen 10 mu- • · · kaista pesuaineen apuainetta. ·· • *** 30 Patentkrav • · · • · ···