JP3309985B2 - アルカリプロテアーゼおよびその製造方法 - Google Patents
アルカリプロテアーゼおよびその製造方法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、バシラス（Bacillus）sp.の菌株から由来
するプロテアーゼに関する。更に詳しくは、本発明はバ
シラス（Bacillus）sp.PD498の菌株由来の新規アルカリ
プロテアーゼ並びにバシラス（Bacillus）sp.PD498の単
離された生物学的に純粋な培養物に関する。
するプロテアーゼに関する。更に詳しくは、本発明はバ
シラス（Bacillus）sp.PD498の菌株由来の新規アルカリ
プロテアーゼ並びにバシラス（Bacillus）sp.PD498の単
離された生物学的に純粋な培養物に関する。
更に、本発明はプロテアーゼの製造方法、洗剤用添加
剤および本発明のプロテアーゼを含んでなる洗剤組成物
並びに洗浄プロセスにおけるこのプロテアーゼの使用に
関する。
剤および本発明のプロテアーゼを含んでなる洗剤組成物
並びに洗浄プロセスにおけるこのプロテアーゼの使用に
関する。
背景技術 洗剤用酵素は、20年以上市場で取引されてきておりそ
して今や世界中において粉末および液体中に普通の洗剤
用成分として確立されている。洗剤温度がより低下する
傾向があり、洗剤用酵素の消費は近年において増大して
きた。洗浄用製剤において用いられる酵素は、プロテア
ーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ並びに他の酵
素、又はそれらの混合物を含んでなる。商業的に最も重
要なものは、プロテアーゼである。
して今や世界中において粉末および液体中に普通の洗剤
用成分として確立されている。洗剤温度がより低下する
傾向があり、洗剤用酵素の消費は近年において増大して
きた。洗浄用製剤において用いられる酵素は、プロテア
ーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ並びに他の酵
素、又はそれらの混合物を含んでなる。商業的に最も重
要なものは、プロテアーゼである。
洗剤用プロテアーゼは、天然に見出されたプロテアー
ゼの単離によって開発され引き続き洗剤用製剤中で試験
された。大抵の洗剤用プロテアーゼは、バシラス（Baci
llus）属の構成員から得られる。今日新しいタイプのプ
ロテアーゼが、市場に参入しており、種々の規定された
条件下でより良い費用対性能を与える可能性を提供す
る。
ゼの単離によって開発され引き続き洗剤用製剤中で試験
された。大抵の洗剤用プロテアーゼは、バシラス（Baci
llus）属の構成員から得られる。今日新しいタイプのプ
ロテアーゼが、市場に参入しており、種々の規定された
条件下でより良い費用対性能を与える可能性を提供す
る。
商業上のプロテアーゼ製品の例は、アルカラーゼ（AL
CALASE）（商標）、エスペラーゼ（商標）およびサビナ
ーゼ（商標）であり、全てノボノルディスク社（デンマ
ーク）より供給されている。他の商業的起源からのこれ
らのおよび類似の酵素製品は、洗剤溶液中、すなわち８
〜11の範囲内のpH値で並びに金属イオン封鎖剤、界面活
性剤および漂白剤例えばホウ酸ナトリウムの存在下で活
性である。アルカラーゼ（ALCALASE）（商標）プロテア
ーゼは、バシラスリケニホルミス（Bacillus lichenifo
rmis）種の菌株によって産生される。
CALASE）（商標）、エスペラーゼ（商標）およびサビナ
ーゼ（商標）であり、全てノボノルディスク社（デンマ
ーク）より供給されている。他の商業的起源からのこれ
らのおよび類似の酵素製品は、洗剤溶液中、すなわち８
〜11の範囲内のpH値で並びに金属イオン封鎖剤、界面活
性剤および漂白剤例えばホウ酸ナトリウムの存在下で活
性である。アルカラーゼ（ALCALASE）（商標）プロテア
ーゼは、バシラスリケニホルミス（Bacillus lichenifo
rmis）種の菌株によって産生される。
エスペラーゼ（EXPERASE）およびサビナーゼ（SAVINA
SE）プロテアーゼは、好アルカリ性バシラス（桿菌）の
培養によって得られる。
SE）プロテアーゼは、好アルカリ性バシラス（桿菌）の
培養によって得られる。
発明の要約 本発明によれば、新規な洗剤用プロテアーゼが提供さ
れる。
れる。
第一の面において、本発明はSDS−PAGEによって測定
した場合の34kDの見掛け分子量；約9.3のpI,25℃で測定
してpH9〜11の範囲内に最適温度（基質としてカゼイン
を用い）、pH9.5で測定して40〜55℃の範囲内に最適温
度（基質としてカゼインを用い）および菌株バシラスs
p.PD498,NCIMB No.40484（ナショナル・コレクション・
オブ・インダストリアル・アンド・マリーン・バクテリ
ア（NCIMB）に1992年３月９日に寄託）由来のプロテア
ーゼの免疫化学的性質と同一または部分的の免疫化学的
性質を有するプロテアーゼを提供する。
した場合の34kDの見掛け分子量；約9.3のpI,25℃で測定
してpH9〜11の範囲内に最適温度（基質としてカゼイン
を用い）、pH9.5で測定して40〜55℃の範囲内に最適温
度（基質としてカゼインを用い）および菌株バシラスs
p.PD498,NCIMB No.40484（ナショナル・コレクション・
オブ・インダストリアル・アンド・マリーン・バクテリ
ア（NCIMB）に1992年３月９日に寄託）由来のプロテア
ーゼの免疫化学的性質と同一または部分的の免疫化学的
性質を有するプロテアーゼを提供する。
他の面によれば、本発明はSDS−PAGEにより測定した
場合の34kDの見掛け分子量；約9.3のpI,25℃で測定して
pH9〜11の範囲内に最適温度（基質としてカゼインを用
い）、pH9.5で測定して40〜55℃の範囲内に最適温度
（基質としてカゼインを用い）を有しそしてバシラス
（Bacillus）sp.PD498の菌株から、また菌株バシラス
（Bacillus）sp.PD498から由来するプロテアーゼの免疫
化学的性質と同一または部分的の免疫化学的性質を有す
るプロテアーゼをコードする遺伝子を有する他の宿主生
物から得ることのできるプロテアーゼを提供する。
場合の34kDの見掛け分子量；約9.3のpI,25℃で測定して
pH9〜11の範囲内に最適温度（基質としてカゼインを用
い）、pH9.5で測定して40〜55℃の範囲内に最適温度
（基質としてカゼインを用い）を有しそしてバシラス
（Bacillus）sp.PD498の菌株から、また菌株バシラス
（Bacillus）sp.PD498から由来するプロテアーゼの免疫
化学的性質と同一または部分的の免疫化学的性質を有す
るプロテアーゼをコードする遺伝子を有する他の宿主生
物から得ることのできるプロテアーゼを提供する。
第三の面において、本発明はバシラス（Bacillus）s
p.PD498の菌株の単離された生物学的に純粋な培養物を
提供する。より詳しくは、より明確な面において、バシ
ラス（Bacillus）sp.PD498,NCIB No.40484の菌株または
その突然変異株もしくは変異株が提供される。
p.PD498の菌株の単離された生物学的に純粋な培養物を
提供する。より詳しくは、より明確な面において、バシ
ラス（Bacillus）sp.PD498,NCIB No.40484の菌株または
その突然変異株もしくは変異株が提供される。
第四の面において、本発明はバシラス（Bacillus）s
p.PD498の菌株のプロテアーゼ生産菌株を炭素および窒
素源を含有する適当な普通培地内で培養し、引き続き所
望の酵素を回収することを含んでなる。
p.PD498の菌株のプロテアーゼ生産菌株を炭素および窒
素源を含有する適当な普通培地内で培養し、引き続き所
望の酵素を回収することを含んでなる。
更に詳しい面において、バシラス（Bacillus）sp.PD4
98、またはその突然変異株もしくは変異株、またはバシ
ラス（Bacillus）sp.PD498から由来するプロテアーゼの
免疫化学的性質と同一または部分的の免疫化学的性質を
有するプロテアーゼをコードする遺伝子を有する他の宿
主生物を培養することによって得られる。
98、またはその突然変異株もしくは変異株、またはバシ
ラス（Bacillus）sp.PD498から由来するプロテアーゼの
免疫化学的性質と同一または部分的の免疫化学的性質を
有するプロテアーゼをコードする遺伝子を有する他の宿
主生物を培養することによって得られる。
第五の面において、洗剤用酵素としての酵素が権利要
求される。更に具体的な面において、本発明は本発明の
プロテアーゼを含んでなる洗剤用添加剤および洗剤組成
物を提供する。最後に、本発明は洗浄方法における本発
明の酵素の使用に関する。
求される。更に具体的な面において、本発明は本発明の
プロテアーゼを含んでなる洗剤用添加剤および洗剤組成
物を提供する。最後に、本発明は洗浄方法における本発
明の酵素の使用に関する。
図面の簡単な説明 本発明を以下の添付の図面に従って更に説明する。図
面において、第１図は本発明に係る酵素の温度とタンパ
ク分解活性の関係を示し（例１に従って得られる酵素調
製品、基質として２％カゼインを用いる、pH9.5で測
定；■緩衝剤、□緩衝剤＋0.1％STPP）； 第２図は本発明に係る酵素のpHとタンパク分解活性の
関係を示し（例１に従って得られる酵素調製品、基質と
して１％カゼインを用いる、25℃で測定）；および 第３図は商業上の洗浄用洗剤に比較した本発明に係る
酵素の洗浄性能の関係を示し（□例１に従って得られる
酵素調製品；○サビナーゼ（Savinase）（商標、ノボノ
ルディスクA/S、デンマーク国）を示す。
面において、第１図は本発明に係る酵素の温度とタンパ
ク分解活性の関係を示し（例１に従って得られる酵素調
製品、基質として２％カゼインを用いる、pH9.5で測
定；■緩衝剤、□緩衝剤＋0.1％STPP）； 第２図は本発明に係る酵素のpHとタンパク分解活性の
関係を示し（例１に従って得られる酵素調製品、基質と
して１％カゼインを用いる、25℃で測定）；および 第３図は商業上の洗浄用洗剤に比較した本発明に係る
酵素の洗浄性能の関係を示し（□例１に従って得られる
酵素調製品；○サビナーゼ（Savinase）（商標、ノボノ
ルディスクA/S、デンマーク国）を示す。
発明の詳細な開示 微生物 本発明の酵素を産生できる、本発明の新規微生物は、
土壌微生物から単離された。バシラス（Bacillus）sp.P
D498は、No.40484のもとで、NCIMBにブタペスト条約に
従って寄託されている。
土壌微生物から単離された。バシラス（Bacillus）sp.P
D498は、No.40484のもとで、NCIMBにブタペスト条約に
従って寄託されている。
本発明の微生物は、バシラス（Bacillus）属に属する
好気性、胞子形成細菌である。形態学的には、この細菌
は直径0.7〜0.9ミクロンおよび長さ２〜３ミクロンを有
する自動性棒体として述べることができる。胞子は球形
から楕円形であり、中心から終り近くまで胞子のうをわ
ずかに膨張させる。増殖のための至適温度は25〜37℃内
にあり、そして増殖のための至適pHは７〜９内であり、
pH9.7では増殖せずそして50℃で増殖しない。微生物
は、栄養源寒天斜面上で帯黄色から黄色コロニー（丸形
でかつ円滑）を形成し、そして寒天内への色素の拡散は
認められない。
好気性、胞子形成細菌である。形態学的には、この細菌
は直径0.7〜0.9ミクロンおよび長さ２〜３ミクロンを有
する自動性棒体として述べることができる。胞子は球形
から楕円形であり、中心から終り近くまで胞子のうをわ
ずかに膨張させる。増殖のための至適温度は25〜37℃内
にあり、そして増殖のための至適pHは７〜９内であり、
pH9.7では増殖せずそして50℃で増殖しない。微生物
は、栄養源寒天斜面上で帯黄色から黄色コロニー（丸形
でかつ円滑）を形成し、そして寒天内への色素の拡散は
認められない。
PD498の細胞特性 本発明の菌株バシラス（Bacillus）sp.PD498の細胞特
性を、ドイツチェ ザンムルク フォン マイクロオル
ガニズメン ウントツュルクルツレエンGmbH（マッシェ
ルオーダー ベーク1B,D−3300ブラウシュヴァイク、ド
イツ国）に寄託された公知のバシラス（Bacillus）sp.
タイプ菌株の細胞特性と比較した。
性を、ドイツチェ ザンムルク フォン マイクロオル
ガニズメン ウントツュルクルツレエンGmbH（マッシェ
ルオーダー ベーク1B,D−3300ブラウシュヴァイク、ド
イツ国）に寄託された公知のバシラス（Bacillus）sp.
タイプ菌株の細胞特性と比較した。
本発明のPD198のDNAの高Ｇ＋Ｃ％は、研究された他の
全ての好アルカリバシラス（Bacillus）菌株と大いに異
なる。
全ての好アルカリバシラス（Bacillus）菌株と大いに異
なる。
微生物の培養 本発明の微生物は、同化性炭素および窒素並びに他の
必須栄養源を含有する普通培地中、好気性条件下で培養
することができ、培地は公知の技術に従って構成され
る。
必須栄養源を含有する普通培地中、好気性条件下で培養
することができ、培地は公知の技術に従って構成され
る。
適当な炭素源は炭化水素、例えばスクロース、グルコ
ースおよびデン粉、又は穀物、麦芽、米およびモロコシ
類の如き物質を含有する炭水化物である。培地中に導入
される炭水化物の濃度は、広く変化でき、例えば25％ま
でかつ１〜５％以下までであるが、通常８〜10％が適当
であろうし（パーセントはグルコースの当量として計算
される）。
ースおよびデン粉、又は穀物、麦芽、米およびモロコシ
類の如き物質を含有する炭水化物である。培地中に導入
される炭水化物の濃度は、広く変化でき、例えば25％ま
でかつ１〜５％以下までであるが、通常８〜10％が適当
であろうし（パーセントはグルコースの当量として計算
される）。
普通培地中の窒素源は無機および／又は有機性のもの
であってよい。適当な無機窒素源は、ニトレートおよび
アンモニア塩である。有機窒素源の内、全く多数のもの
が細菌の培養を含む発酵プロセスにおいて通常用いられ
る。説明的例示は、大豆粉、綿実粉、ピーナッツ粉、カ
ゼイン、トウモロコシ、コーンスティープリカー（corn
steep liquor）、酵母エキス、尿素およびアルブミンで
ある。加えて、培地は又有用な微量物質を含有すべきで
ある。
であってよい。適当な無機窒素源は、ニトレートおよび
アンモニア塩である。有機窒素源の内、全く多数のもの
が細菌の培養を含む発酵プロセスにおいて通常用いられ
る。説明的例示は、大豆粉、綿実粉、ピーナッツ粉、カ
ゼイン、トウモロコシ、コーンスティープリカー（corn
steep liquor）、酵母エキス、尿素およびアルブミンで
ある。加えて、培地は又有用な微量物質を含有すべきで
ある。
本発明の新規バシラス種はわずかに好アルカリ性であ
る。従って培養は増殖培地の滅菌後、炭酸水素ナトリウ
ムの如き適当な緩衝剤を添加することによって得ること
のできる、わずかにアルカリ性pH値、pH9.0で好ましく
行うことができる。タンク発酵槽内の培養に対し、人工
通気を用いる必要がある。通気の速度は通常のタンク発
酵内で用いる速度に類似する。
る。従って培養は増殖培地の滅菌後、炭酸水素ナトリウ
ムの如き適当な緩衝剤を添加することによって得ること
のできる、わずかにアルカリ性pH値、pH9.0で好ましく
行うことができる。タンク発酵槽内の培養に対し、人工
通気を用いる必要がある。通気の速度は通常のタンク発
酵内で用いる速度に類似する。
発酵後、液体酵素濃縮物がブロスから粗い物質を除き
次いで所望により低温度で蒸発により又は限外濾過によ
り濃縮することにより製造できる。
次いで所望により低温度で蒸発により又は限外濾過によ
り濃縮することにより製造できる。
固体酵素調製品は、塩、例えばNa2SO4、又は水混和性
溶剤、例えばエタノール又はアセトンを用いて沈殿させ
ることにより精製されたおよび／又は濃縮されたプロセ
スから製造できる。適当な乾燥方法、例えば噴霧乾燥に
よるブロス中の水の除去も又用いることができる。
溶剤、例えばエタノール又はアセトンを用いて沈殿させ
ることにより精製されたおよび／又は濃縮されたプロセ
スから製造できる。適当な乾燥方法、例えば噴霧乾燥に
よるブロス中の水の除去も又用いることができる。
タンパク質分解活性に対する分析 蛋白質分解活性は、基質としてカゼインを用いて測定
される。１カゼインプロテアーゼ単位（CPU）は、標準
条件下、すなわち25℃およびpH9.5で30分間インキュベ
ーション下、（セリン標準と比較して測定された）１級
アミノ基の1mMを放出する酵素の量として定義される。
される。１カゼインプロテアーゼ単位（CPU）は、標準
条件下、すなわち25℃およびpH9.5で30分間インキュベ
ーション下、（セリン標準と比較して測定された）１級
アミノ基の1mMを放出する酵素の量として定義される。
分析方法を記載した小冊子AF228は、ノボノルディス
クA/Sに要求により入手可能であり、この小冊子をその
番号を引用して本明細書に加入される。
クA/Sに要求により入手可能であり、この小冊子をその
番号を引用して本明細書に加入される。
酵素 本発明の酵素は新規洗剤用プロテアーゼである。この
酵素は、炭素および窒素源並びに無機塩を含有する、適
当な普通培地中、本発明の微生物、好ましくはバシラス
（Bacillus）sp.PD498,NCIMB 40484、又はそれらの突然
変異体又は変異体を培養することによって得ることので
きるアルカリプロテアーゼである。酵素は又組換DNA工
学によっても得ることができる。
酵素は、炭素および窒素源並びに無機塩を含有する、適
当な普通培地中、本発明の微生物、好ましくはバシラス
（Bacillus）sp.PD498,NCIMB 40484、又はそれらの突然
変異体又は変異体を培養することによって得ることので
きるアルカリプロテアーゼである。酵素は又組換DNA工
学によっても得ることができる。
本発明のプロテアーゼは次の特徴により記載すること
ができる。
ができる。
物理化学的性質 SDS−PAGEにより測定された34kDの分子量を有する。
約9.3のpIがLKBアムフォリン（Ampholine）（商標）PAG
プレート上で等電点電気泳動によって測定された。プロ
テアーゼ活性は、PMSF、セリンプロテアーゼ阻害剤によ
り阻害される。EDTAおよび大豆蛋白質阻害剤はプロテア
ーゼ活性に影響しない。
約9.3のpIがLKBアムフォリン（Ampholine）（商標）PAG
プレート上で等電点電気泳動によって測定された。プロ
テアーゼ活性は、PMSF、セリンプロテアーゼ阻害剤によ
り阻害される。EDTAおよび大豆蛋白質阻害剤はプロテア
ーゼ活性に影響しない。
温度活性関係を、図１に示す。活性は、0.1％のトリ
ポリリン酸ナトリウム（STPP、多くの商業的洗剤中で、
普通の成分）の存在下（白い四角形）および非存在下
（黒い四角形）、pH9.5でそして基質として２％のカゼ
インを用いて測定した。先に述べた蛋白質分解活性の分
析は、インキュベーション温度を15℃から70℃の間隔内
で変化させるという変形でもって用いられた。図１から
明らかなように、酵素は15℃から70℃までに蛋白質分解
活性を有し、そして45〜55℃の範囲内、50℃付近に至適
温度を有する。
ポリリン酸ナトリウム（STPP、多くの商業的洗剤中で、
普通の成分）の存在下（白い四角形）および非存在下
（黒い四角形）、pH9.5でそして基質として２％のカゼ
インを用いて測定した。先に述べた蛋白質分解活性の分
析は、インキュベーション温度を15℃から70℃の間隔内
で変化させるという変形でもって用いられた。図１から
明らかなように、酵素は15℃から70℃までに蛋白質分解
活性を有し、そして45〜55℃の範囲内、50℃付近に至適
温度を有する。
pHに対する活性の依存性を、pH6〜11の範囲内の予じ
め定められたpH値に調節された緩衝液を用いる同じ手順
によって測定した。
め定められたpH値に調節された緩衝液を用いる同じ手順
によって測定した。
結果を図２に示す。図２から以下の内容が明らかであ
る；すなわち、酵素は６未満ないし11を超えるpH値で蛋
白質分解を有し、pH9〜11の範囲内に、pH10付近に至適p
Hを有する。
る；すなわち、酵素は６未満ないし11を超えるpH値で蛋
白質分解を有し、pH9〜11の範囲内に、pH10付近に至適p
Hを有する。
更に、本発明のプロテアーゼはヨーロッパタイプおよ
びアメリカタイプの洗剤中、洗浄条件下25℃で60分間安
定である。
びアメリカタイプの洗剤中、洗浄条件下25℃で60分間安
定である。
免疫化学的性質 本発明のプロテアーゼは、菌株バシラス（Bacillus）
sp.PD498,NCIMB40484から由来するプロテアーゼの免疫
化学的性質と同一又は部分的同一（すなわち、すくなく
とも部分的同一）を有する。
sp.PD498,NCIMB40484から由来するプロテアーゼの免疫
化学的性質と同一又は部分的同一（すなわち、すくなく
とも部分的同一）を有する。
免疫化学的性質は、交差反応同一性試験により免疫学
的に測定できる。同一性試験は、周知のオクテルロニー
二重免疫拡散法又はN.H.アケルセン;Handbook of immun
o−precipitation−in−Gel Techniquess;ブラックウェ
ルサイエンティフィック社（1983）、５章および14章に
従い、双頭交差免疫電気泳動により行うことができる。
的に測定できる。同一性試験は、周知のオクテルロニー
二重免疫拡散法又はN.H.アケルセン;Handbook of immun
o−precipitation−in−Gel Techniquess;ブラックウェ
ルサイエンティフィック社（1983）、５章および14章に
従い、双頭交差免疫電気泳動により行うことができる。
単一特異性抗血清が、本発明の精製プロテアーゼを用
い家兎を免疫することにより前記方法に従って発生し
た。免疫源をフロイドアジュバントと混合しそして二週
毎に家兎に皮下注入した。８週の総免疫化期間後、抗血
清を得、次いで免疫グロブリンを上記のN.H.アケルセン
により記載した如くそこから調製した。
い家兎を免疫することにより前記方法に従って発生し
た。免疫源をフロイドアジュバントと混合しそして二週
毎に家兎に皮下注入した。８週の総免疫化期間後、抗血
清を得、次いで免疫グロブリンを上記のN.H.アケルセン
により記載した如くそこから調製した。
オクテルロニー二重免疫試験は、本発明のプロテアー
ゼと公知のアルカリセリンプロテアーゼ、アルカラーゼ
（ALCALASE）（商標）、サビナーゼ（SAVINASE）（商
標）、エスペラーゼ（ESPERASE）（商標）、ズブチリン
NOVO（ノボノルディスクA/Sより入手可能）、およびKAZ
USASE（商標）（昭和電工より入手可能）．間で交差反
応を示さなかった。
ゼと公知のアルカリセリンプロテアーゼ、アルカラーゼ
（ALCALASE）（商標）、サビナーゼ（SAVINASE）（商
標）、エスペラーゼ（ESPERASE）（商標）、ズブチリン
NOVO（ノボノルディスクA/Sより入手可能）、およびKAZ
USASE（商標）（昭和電工より入手可能）．間で交差反
応を示さなかった。
洗剤組成物 洗剤組成物は、１種またはそれ以上の界面活性剤を含
むことができ、これはアニオン、非イオン、カチオン、
両性又はこれらのタイプの混合物であってよい。アニオ
ン界面活性剤の典型的例は、直鎖アルキル ベンゼン
スルホネート（LAS）、アルキル スルフェート（A
S）、α−オレフィン スルホネート（AOS）、アルコキ
シ エトキシ スルフェート（AES）又は天然脂肪酸の
アルカリ金属塩である。
むことができ、これはアニオン、非イオン、カチオン、
両性又はこれらのタイプの混合物であってよい。アニオ
ン界面活性剤の典型的例は、直鎖アルキル ベンゼン
スルホネート（LAS）、アルキル スルフェート（A
S）、α−オレフィン スルホネート（AOS）、アルコキ
シ エトキシ スルフェート（AES）又は天然脂肪酸の
アルカリ金属塩である。
非イオン界面活性剤の例は、アルキル ポリエチレン
グリコールエーテル、ノニルフェノール ポリエチレ
ン グリコールエーテル、スクロースおよびグルコース
の脂肪酸エステル、およびポリエトキシル化 アルキル
グリコシドのエステルである。
グリコールエーテル、ノニルフェノール ポリエチレ
ン グリコールエーテル、スクロースおよびグルコース
の脂肪酸エステル、およびポリエトキシル化 アルキル
グリコシドのエステルである。
本発明の洗剤組成物は、当業者に公知の他の洗剤成
分、例えばビールダー、漂白剤、漂白活性剤、土壌−沈
殿防止剤、金属イオン封鎖剤、抗土壌−再付着剤、香
料、酵素および漂白剤用安定化剤、配合助剤、螢光増白
剤、発泡ブースター、キレート化剤、充填剤、布帛柔軟
剤等を含んでいてもよい。本発明の洗剤組成物は、フォ
ルベ、Ｊ〔Falbe,J.;Surfactant in Consumer Product
s.Theory,Technology and Application;Spring Verlag
1987、特に「Frameformulations for liquid/powder he
avy−dudy−detergents」において、特に「Frame Formu
lations for liquid/powder heavy−duty detergents」
と表題付けられた節において記載された如く実質的に製
剤化することができる。
分、例えばビールダー、漂白剤、漂白活性剤、土壌−沈
殿防止剤、金属イオン封鎖剤、抗土壌−再付着剤、香
料、酵素および漂白剤用安定化剤、配合助剤、螢光増白
剤、発泡ブースター、キレート化剤、充填剤、布帛柔軟
剤等を含んでいてもよい。本発明の洗剤組成物は、フォ
ルベ、Ｊ〔Falbe,J.;Surfactant in Consumer Product
s.Theory,Technology and Application;Spring Verlag
1987、特に「Frameformulations for liquid/powder he
avy−dudy−detergents」において、特に「Frame Formu
lations for liquid/powder heavy−duty detergents」
と表題付けられた節において記載された如く実質的に製
剤化することができる。
今日次のように考えられている；すなわち、本発明の
洗剤組成物は洗浄後１に対しタンパク質分解酵素の0.
0005〜0.5CPUに相当する量で酵素調製品を含有してもよ
い。
洗剤組成物は洗浄後１に対しタンパク質分解酵素の0.
0005〜0.5CPUに相当する量で酵素調製品を含有してもよ
い。
本発明の洗剤組成物は、如何なる好都合な形態、例え
ば粉末、液体スラリーの形態で配合され得る。
ば粉末、液体スラリーの形態で配合され得る。
本発明の洗剤組成物は、好都合には１種またはそれ以
上の他の酵素、例えばリパーゼ、アミラーゼ、セルラー
ゼ、オキシダーゼ、および／又はペルオキシダーゼを、
好都合には洗剤組成物に含ましめられて含有してもよ
い。
上の他の酵素、例えばリパーゼ、アミラーゼ、セルラー
ゼ、オキシダーゼ、および／又はペルオキシダーゼを、
好都合には洗剤組成物に含ましめられて含有してもよ
い。
本発明のプロテアーゼは、洗剤用プロテアーゼを含有
する別個の添加剤を添加することにより、または異なる
洗剤用酵素を含んでなる組合せられた添加剤を添加する
ことにより洗剤組成物中に含ましめてもよい。
する別個の添加剤を添加することにより、または異なる
洗剤用酵素を含んでなる組合せられた添加剤を添加する
ことにより洗剤組成物中に含ましめてもよい。
本発明の添加剤は、例えば粒質物、液体、スラリー等
として製剤化され得る。好ましい洗剤用添加洗剤は、無
粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー、また
は保護された酵素である。ダストフリー粒質物は、英国
特許公報第1,362,365号または米国特許第4,106,991号に
従って調製することができ、そして所望により公知の方
法によりコートされ得る。洗剤用酵素は、造粒前または
造粒後に混合してもよい。液体酵素調製品は、確立され
た方法に従い例えばプロピレングリコールの如きポリオ
ール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加
することにより、例えば安定化され得る。他の酵素安定
化剤は、業界において周知である保護された酵素は、ヨ
ーロッパ特許公報第238,216号において開示された方法
に従って調製できる。
として製剤化され得る。好ましい洗剤用添加洗剤は、無
粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー、また
は保護された酵素である。ダストフリー粒質物は、英国
特許公報第1,362,365号または米国特許第4,106,991号に
従って調製することができ、そして所望により公知の方
法によりコートされ得る。洗剤用酵素は、造粒前または
造粒後に混合してもよい。液体酵素調製品は、確立され
た方法に従い例えばプロピレングリコールの如きポリオ
ール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加
することにより、例えば安定化され得る。他の酵素安定
化剤は、業界において周知である保護された酵素は、ヨ
ーロッパ特許公報第238,216号において開示された方法
に従って調製できる。
本発明を次の実施例（いかなる場合も請求の範囲で記
載される本発明の範囲を制限するものではない）により
更に説明する。
載される本発明の範囲を制限するものではない）により
更に説明する。
例１ バシラス（Bacillus）sp.PD498を次の組成（１当た
り）の培地100mlを含有する500mlのバッフル付エルレレ
イカーフラスコ内で回転、振動テーブル（300r.p.m.）
上で25℃で培養した： ジャガイモデンプン 100 ｇ 粉砕大麦 50 ｇ 大豆粉 20 ｇ Na2HPO4×12H2O ９ ｇ プルロニック（Pluronic）（登録商標） 0.1g ナトリウムカゼイネート 10 ｇ 培地内のデンプンをα−アミラーゼで液化し、次いで
培地を120℃で45分間滅菌する。
り）の培地100mlを含有する500mlのバッフル付エルレレ
イカーフラスコ内で回転、振動テーブル（300r.p.m.）
上で25℃で培養した： ジャガイモデンプン 100 ｇ 粉砕大麦 50 ｇ 大豆粉 20 ｇ Na2HPO4×12H2O ９ ｇ プルロニック（Pluronic）（登録商標） 0.1g ナトリウムカゼイネート 10 ｇ 培地内のデンプンをα−アミラーゼで液化し、次いで
培地を120℃で45分間滅菌する。
滅菌後、培地のpHを炭酸水素ナトリウムの1M溶液10ml
を添加して9.0に調節する。
を添加して9.0に調節する。
４日間インキュベーション後、培養物の蛋白質分解活
性を前記方法を用いて測定した。
性を前記方法を用いて測定した。
培養後、プロセスの酵素活性は5CPU/であった。
固体物質を分離後、プロテアーゼを通常のクロマトグ
ラフィー法により精製した。
ラフィー法により精製した。
培養ブロスからの収率は、31mlでありそして120CPU/m
lであった。純度はSDS−PAGEにより判断する如く、90％
超であった。
lであった。純度はSDS−PAGEにより判断する如く、90％
超であった。
この実施例に従って調製した調製品の特性は、この明
細書中の先の部分に記載されておりそして該部分を参照
される。
細書中の先の部分に記載されておりそして該部分を参照
される。
例２ 洗浄性能 洗浄性能試験を、20℃で等温的に10分間、草で汚れた
綿について行った。
綿について行った。
試験は、１当たり酵素蛋白質0.02および0.5mgの酵
素濃度で行った。
素濃度で行った。
2.0g/の商業上の米国粉末洗剤を用いた。洗剤を約
６゜dH（ドイツ硬度）水に溶解し、次いでpHを9.5に調
節した。繊維／洗液比は洗液１当たり6gの繊維であっ
た。
６゜dH（ドイツ硬度）水に溶解し、次いでpHを9.5に調
節した。繊維／洗液比は洗液１当たり6gの繊維であっ
た。
洗浄に続き、布を水道水でフラッシュし次いで風乾し
た。460nmでの規約反射率（％Ｒ）を測定した。洗浄性
能の尺度として示差規約反射率ΔＲを用いたが、これは
添加された酵素で洗浄後の規約反射率引く酵素を添加し
ないで洗浄後の規約反射率に等しい。
た。460nmでの規約反射率（％Ｒ）を測定した。洗浄性
能の尺度として示差規約反射率ΔＲを用いたが、これは
添加された酵素で洗浄後の規約反射率引く酵素を添加し
ないで洗浄後の規約反射率に等しい。
これらの試験結果を図３に示す。図３から明らかなよ
うに本発明のプロテアーゼは良好な洗浄能力を有する。
うに本発明のプロテアーゼは良好な洗浄能力を有する。
フロントページの続き (72)発明者 アースリュンク，ドリット アニタ デンマーク国，デーコー―4000 ロスキ ルゼ，スボゲルスレウ，フュレン ８ (56)参考文献 特開 昭58−134990（ＪＰ，Ａ) 米国特許4764470（ＵＳ，Ａ) 米国特許4771003（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/50 - 9/86 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】次の特性（ａ）〜（ｄ）： （ａ）34kDの見掛け分子量（SDS−PAGEにより測定）； （ｂ）pH9〜11の範囲内に至適pH（25℃でおよび基質と
してカゼインを用い）； （ｃ）40〜55℃の範囲内に至適温度（pH9.5でおよび基
質としてカゼインを用い）；および （ｄ）菌株バシラス（Bacillus）sp.PD498,NCIB No.404
84、またはその突然変異株もしくは変異株から得ること
のできる、 ことを特徴とする、プロテアーゼ。 - 【請求項２】請求の範囲第１項に記載のプロテアーゼを
生産することができる、バシラス（Bacillus）sp.PD49
8,NCIB No.40484、またはその突然変異株もしくは変異
株。 - 【請求項３】バシラス（Bacillus）sp.PD498,NCIB No.4
0484である、請求の範囲第２項に記載の菌株。 - 【請求項４】請求の範囲１項に記載のプロテアーゼの製
造方法であって、菌株バシラス（Bacillus）sp.PD498,N
CIB No.40484、またはそれらの突然変異株もしくは変異
株を培養する、ことを特徴とする方法。 - 【請求項５】無粉塵性粒質物、液体、スラリー、または
保護された酵素の形態で提供される、請求の範囲第１項
に記載のプロテアーゼを含んでなる洗剤用添加剤。 - 【請求項６】前記液体が安定化された液体である、請求
の範囲第５項に記載の洗剤用添加剤。 - 【請求項７】請求の範囲第１項に記載のプロテアーゼを
含んでなる洗剤組成物。 - 【請求項８】１種また複数種の他の酵素を更に含んでな
る、請求の範囲第７項記載の洗剤組成物。 - 【請求項９】前記他の酵素が、アミラーゼ、リパーゼ、
セルラーゼ、オキシダーゼ、および／またはペルオキシ
ダーゼである請求の範囲第８項に記載の洗剤組成物。 - 【請求項１０】請求の範囲第１項に記載のプロテアーゼ
を添加することを含んでなる洗浄方法。 - 【請求項１１】請求の範囲第５項又は６項記載の洗剤用
添加剤を添加することを含んでなる、請求の範囲第10項
記載の洗浄方法。 - 【請求項１２】請求の範囲第７項、８項又は９項記載の
洗剤組成物を添加することを含んでなる、請求の範囲第
10項記載の洗浄方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK702/92 | 1992-05-27 | ||
| DK92702A DK70292D0 (da) | 1992-05-27 | 1992-05-27 | Nyt enzym |
| PCT/DK1993/000183 WO1993024623A1 (en) | 1992-05-27 | 1993-05-26 | Alkaline protease and process for its production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07506972A JPH07506972A (ja) | 1995-08-03 |
| JP3309985B2 true JP3309985B2 (ja) | 2002-07-29 |
Family
ID=8096553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50009894A Expired - Lifetime JP3309985B2 (ja) | 1992-05-27 | 1993-05-26 | アルカリプロテアーゼおよびその製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0652947B1 (ja) |
| JP (1) | JP3309985B2 (ja) |
| KR (1) | KR100284246B1 (ja) |
| AT (1) | ATE192190T1 (ja) |
| DE (1) | DE69328487T2 (ja) |
| DK (2) | DK70292D0 (ja) |
| ES (1) | ES2148230T3 (ja) |
| FI (1) | FI117759B (ja) |
| WO (1) | WO1993024623A1 (ja) |
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| CN1093174C (zh) * | 1995-02-10 | 2002-10-23 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 芽孢杆菌属蛋白酶 |
| WO1996024666A1 (en) * | 1995-02-10 | 1996-08-15 | Novo Nordisk A/S | Bacillus proteases |
| DE19535082A1 (de) | 1995-09-21 | 1997-03-27 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| DE19636035A1 (de) | 1996-09-05 | 1998-03-12 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| US6416756B1 (en) * | 1997-01-10 | 2002-07-09 | Novozymes A/S | Modified protease having 5 to 13 covalently coupled polymeric molecules for skin care |
| DE19703364A1 (de) | 1997-01-30 | 1998-08-06 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| DE19857687A1 (de) | 1998-12-15 | 2000-06-21 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Waschmittel |
| US6855548B2 (en) * | 2000-02-08 | 2005-02-15 | F. Hoffman-La Roche Ag | Use of acid-stable proteases in animal feed |
| US6960462B2 (en) * | 2000-02-08 | 2005-11-01 | Dsm Ip Assets B.V | Use of acid-stable subtilisin proteases in animal feed |
| KR100465852B1 (ko) * | 2002-06-29 | 2005-01-13 | 인하대학교 산학협력단 | 고활성의 알카리성 단백질 분해효소를 대량 생산하는 바실러스 속 ｉ-５２ |
| WO2023110639A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Novozymes A/S | Protease animal feed formulation |
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|---|---|---|---|---|
| DE2026092C3 (de) * | 1969-05-31 | 1979-04-12 | Rikagaku Kenkyusho, Saitama (Japan) | Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease |
| JPS6055118B2 (ja) * | 1982-02-08 | 1985-12-03 | 昭和電工株式会社 | 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法 |
| BE897479A (fr) * | 1983-08-08 | 1983-12-01 | Showa Denko Kk | Protease alcaline sa preparation et son utilisation |
| US4771003A (en) * | 1985-10-22 | 1988-09-13 | Genex Corporation | Heat stable alkaline proteases produced by a bacillus |
| US4764470A (en) * | 1986-02-05 | 1988-08-16 | Genex Corporation | Alkaline protease produced by a bacillus |
| JPH01101884A (ja) * | 1987-10-14 | 1989-04-19 | Lion Corp | 新規アルカリプロテアーゼｌおよびその製造法 |
| JPH02195878A (ja) * | 1989-01-24 | 1990-08-02 | Toagosei Chem Ind Co Ltd | プロテアーゼ |
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| DK58391D0 (da) * | 1991-04-03 | 1991-04-03 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte proteaser |
| DK58491D0 (da) * | 1991-04-03 | 1991-04-03 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte proteaser |
| JPH06261751A (ja) * | 1992-03-12 | 1994-09-20 | Japan Tobacco Inc | 新規プロテアーゼ及びそれを生産するバチルス バディウス ｊｔ０１２７菌株 |
-
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- 1992-05-27 DK DK92702A patent/DK70292D0/da not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-05-26 US US08/325,386 patent/US5597720A/en not_active Expired - Lifetime
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- 1993-05-26 DE DE69328487T patent/DE69328487T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-26 EP EP93912668A patent/EP0652947B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1993-05-26 AT AT93912668T patent/ATE192190T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-05-26 JP JP50009894A patent/JP3309985B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-26 ES ES93912668T patent/ES2148230T3/es not_active Expired - Lifetime
-
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- 1994-11-25 FI FI945543A patent/FI117759B/fi not_active IP Right Cessation
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