JPH06261751A - 新規プロテアーゼ及びそれを生産するバチルス バディウス ｊｔ０１２７菌株 - Google Patents
新規プロテアーゼ及びそれを生産するバチルス バディウス ｊｔ０１２７菌株Info
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- JPH06261751A JPH06261751A JP8751092A JP8751092A JPH06261751A JP H06261751 A JPH06261751 A JP H06261751A JP 8751092 A JP8751092 A JP 8751092A JP 8751092 A JP8751092 A JP 8751092A JP H06261751 A JPH06261751 A JP H06261751A
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- producing
- phenylalanine
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Abstract
(57)【要約】
【目的】アミノ酸の端を特異的に切断する新規なプロテ
アーゼを提供すること及びそれを生産するバチルス バ
ディウス ＪＴ０１２７菌株を提供すること。 【構成】下記の理化学的性質を有する新規プロテアーゼ （１）ロイシン及びフェニルアラニンのアミノ基側を切
断する （２）カゼインをエンド型に分解し低分子化する （３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ下で分子量約３４０００ （４）紫外線吸収スペクトル λmax＝２８０ｎｍ （５）至適ｐＨ ６〜８ （６）至適温度 ４５〜５５℃及びバチルス バディウ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ） ＪＴ０１２７
（微工研菌寄第１２７２２号）である上記プロテアーゼ
の生産菌。 【効果】Ｎ末端に、ロイシン、フェニルアラニンを配す
るペプチドを効率よく製造できる。
アーゼを提供すること及びそれを生産するバチルス バ
ディウス ＪＴ０１２７菌株を提供すること。 【構成】下記の理化学的性質を有する新規プロテアーゼ （１）ロイシン及びフェニルアラニンのアミノ基側を切
断する （２）カゼインをエンド型に分解し低分子化する （３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ下で分子量約３４０００ （４）紫外線吸収スペクトル λmax＝２８０ｎｍ （５）至適ｐＨ ６〜８ （６）至適温度 ４５〜５５℃及びバチルス バディウ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ） ＪＴ０１２７
（微工研菌寄第１２７２２号）である上記プロテアーゼ
の生産菌。 【効果】Ｎ末端に、ロイシン、フェニルアラニンを配す
るペプチドを効率よく製造できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なプロテアーゼ及
びそれを生産するバチルス バディウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｂａｄｉｕｓ）新菌株に関する。
びそれを生産するバチルス バディウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｂａｄｉｕｓ）新菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術】最近、プロテアーゼ処理した食品蛋白質
から、多くの生理活性ペプチドが見いだされ、機能性食
品への利用が見込まれている。それらペプチドの構造活
性相関の研究から活性発現に必須なアミノ酸配列が明ら
かになっている。このため、末端にある特定のアミノ酸
あるいは特定のアミノ酸配列を有するペプチドを効率よ
く得るためには、そのアミノ酸の端を特異的に切断する
ことが可能なプロテアーゼが望まれる。
から、多くの生理活性ペプチドが見いだされ、機能性食
品への利用が見込まれている。それらペプチドの構造活
性相関の研究から活性発現に必須なアミノ酸配列が明ら
かになっている。このため、末端にある特定のアミノ酸
あるいは特定のアミノ酸配列を有するペプチドを効率よ
く得るためには、そのアミノ酸の端を特異的に切断する
ことが可能なプロテアーゼが望まれる。
【０００３】このような基質特異性を有するプロテアー
ゼのなかで、ロイシンやフェニルアラニンなど疎水性ア
ミノ酸のアミノ基側を良く切断する代表的な酵素とし
て、サーモリシンが生化学工業（株）から市販されてい
る。これは、至適ｐＨ７〜８、適温度７０℃である。ま
た、ロイシン、フエニルアラニン以外に、グリシン、セ
リンのアミノ酸基側をも切断することが知られている。
特定の生理活性ペプチドを効率よく得るためには、より
特異性の高いプロテアーゼが望まれていた。
ゼのなかで、ロイシンやフェニルアラニンなど疎水性ア
ミノ酸のアミノ基側を良く切断する代表的な酵素とし
て、サーモリシンが生化学工業（株）から市販されてい
る。これは、至適ｐＨ７〜８、適温度７０℃である。ま
た、ロイシン、フエニルアラニン以外に、グリシン、セ
リンのアミノ酸基側をも切断することが知られている。
特定の生理活性ペプチドを効率よく得るためには、より
特異性の高いプロテアーゼが望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、アミノ酸の端
を特異的に切断することが可能なプロテアーゼを提供す
ること、特に、ロイシン、フエニルアラニンのアミノ基
側の切断をより厳密に行うプロテアーゼを提供すること
を目的とする。
を特異的に切断することが可能なプロテアーゼを提供す
ること、特に、ロイシン、フエニルアラニンのアミノ基
側の切断をより厳密に行うプロテアーゼを提供すること
を目的とする。
【０００５】本発明者らは、前記目的を達成するべく、
以下に記す方法により微生物を分離した。まず、相模湾
沖合いから得られた海底泥試水を小麦粉を懸濁した寒天
プレート上に塗布、培養し、出現したコロニーのうちコ
ロニー周辺に透明帯を生じた菌を分離し、菌体外酵素生
産菌とした。それらの培養上清とインスリンＢ鎖を反応
させ、生じたペプチドを分析し、疎水性アミノ酸のアミ
ノ基側の切断が最も厳密であった菌としてバチルス バ
ディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）を分離し
た。該菌株が生産するプロテアーゼが前記条件を満足す
るものであることを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。
以下に記す方法により微生物を分離した。まず、相模湾
沖合いから得られた海底泥試水を小麦粉を懸濁した寒天
プレート上に塗布、培養し、出現したコロニーのうちコ
ロニー周辺に透明帯を生じた菌を分離し、菌体外酵素生
産菌とした。それらの培養上清とインスリンＢ鎖を反応
させ、生じたペプチドを分析し、疎水性アミノ酸のアミ
ノ基側の切断が最も厳密であった菌としてバチルス バ
ディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）を分離し
た。該菌株が生産するプロテアーゼが前記条件を満足す
るものであることを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。
【０００６】本発明の菌株は、以下に述べるとおり、菌
学的性質からＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓと同定さ
れるが、いくつかの点においてこれと相違し、また他の
公知菌株とも相違する。従って、本発明者らは、本菌株
を新規な菌株と認定して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉ
ｕｓ ＪＴ０１２７と命名し、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第１２７２２号として寄託した。
学的性質からＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓと同定さ
れるが、いくつかの点においてこれと相違し、また他の
公知菌株とも相違する。従って、本発明者らは、本菌株
を新規な菌株と認定して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉ
ｕｓ ＪＴ０１２７と命名し、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第１２７２２号として寄託した。
【０００７】［菌学的性質］本発明のＢａｃｉｌｌｕｓ
ｂａｄｉｕｓ ＪＴ０１２７は、以下に示すような菌
学的性質を示す。
ｂａｄｉｕｓ ＪＴ０１２７は、以下に示すような菌
学的性質を示す。
【０００８】（Ａ）形態的性質 （ａ）形状とコロニーの色 桿状 淡いピンク系オレンジ色 （ｂ）サイズ 幅 ０．８〜１．０μｍ 長さ １．５〜３．０μｍ （Ｃ）胞子 有（楕円形） （ｄ）鞭毛 有（周毛） （ｅ）グラム染色性 陽性
【０００９】（Ｂ）ペプトンー酵母エキス寒天培地での
生育状況 寒天培地上でピンク系オレンジ色のコロニーを形成す
る。培地中の鉄イオン濃度が低い場合には、若干の色調
変化を起こす。
生育状況 寒天培地上でピンク系オレンジ色のコロニーを形成す
る。培地中の鉄イオン濃度が低い場合には、若干の色調
変化を起こす。
【００１０】（Ｃ）生理的性質 （ａ）硝酸塩の還元：陰性 （ｂ）クエン酸の還元：陰性 （ｃ）０Ｆテスト：ｏｘｉｄａｔｉｖｅ （ｄ）ＶＰテスト：陰性 （ｅ）ＭＲテスト：陰性 （ｆ）オキシダーゼ：陰性 （ｇ）カタラーゼ：陽性 （ｈ）ウレアーゼの生成：陰性 （ｉ）エスクリンの分解：陰性 （ｊ）ＮａＣｌ存在下での生育：ＮａＣｌ ０％ 生育
不良 ＮａＣｌ ３％ 生育良好 ＮａＣｌ ５％ 生育良好
不良 ＮａＣｌ ３％ 生育良好 ＮａＣｌ ５％ 生育良好
【００１１】上記菌株の菌学的性質に基づき、「Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ 第１版」（１９８４年発
行、発行元ＷＩＬＬＩＡＭＳ＆ＷＩＬＫＩＮＳ）の記載
に準じて、本菌株は、バチルス バディウス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）であると同定された。
ｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ 第１版」（１９８４年発
行、発行元ＷＩＬＬＩＡＭＳ＆ＷＩＬＫＩＮＳ）の記載
に準じて、本菌株は、バチルス バディウス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）であると同定された。
【００１２】さらに、公知の同種標準株（ＩＡＭ １１
０５９株）と比較したところ、寒天培地上におけるコロ
ニーの色調が異なること、ＩＡＭ １１０５９株は、Ｂ
ＢＰ様の酵素を生産しない点で相違するので、同菌の新
菌株であり、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ ＪＴ
０１２７」と表示することとした。
０５９株）と比較したところ、寒天培地上におけるコロ
ニーの色調が異なること、ＩＡＭ １１０５９株は、Ｂ
ＢＰ様の酵素を生産しない点で相違するので、同菌の新
菌株であり、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ ＪＴ
０１２７」と表示することとした。
【００１３】［酵素の取得法］上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂａｄｉｕｓ ＪＴ０１２７株の生産するプロテアーゼ
をＢＢＰと称する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ
ＪＴ０１２７株を用いて本発明のプロテアーゼＢＢＰを
得るには、該菌株を適当な培地に接種し、常法にしたが
って培養すればよい。
ｂａｄｉｕｓ ＪＴ０１２７株の生産するプロテアーゼ
をＢＢＰと称する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ
ＪＴ０１２７株を用いて本発明のプロテアーゼＢＢＰを
得るには、該菌株を適当な培地に接種し、常法にしたが
って培養すればよい。
【００１４】本発明で使用される培地は、本発明のＪＴ
０１２７株菌が増殖し、プロテアーゼＢＢＰを生産し得
るものならば任意の培地でよく、例えば、炭素源、窒素
源、ビタミン源としてペプトン、カザミノ酸、酵母エキ
スなどが用いられる。また、この他に鉄、カルシウム、
マグネシウム、リンなどの無機塩類が添加される。
０１２７株菌が増殖し、プロテアーゼＢＢＰを生産し得
るものならば任意の培地でよく、例えば、炭素源、窒素
源、ビタミン源としてペプトン、カザミノ酸、酵母エキ
スなどが用いられる。また、この他に鉄、カルシウム、
マグネシウム、リンなどの無機塩類が添加される。
【００１５】本発明における培養は、好気的条件下で、
例えば通気攪拌法や振とう培養法で行う。培養温度は１
０〜３５℃の範囲なら良いが、菌の生育も良好で酵素生
産量も高い２０〜２５℃が望ましい。初発ｐＨは、培地
中の無機塩の沈澱が少ない中性付近が、培養中のｐＨ
は、中性付近から甚だしくずれないところが、それぞれ
好ましい。培養時間は、１５〜２５時間程度であり、プ
ロテアーゼ活性が最高に達したときに培養を終了すれば
よい。
例えば通気攪拌法や振とう培養法で行う。培養温度は１
０〜３５℃の範囲なら良いが、菌の生育も良好で酵素生
産量も高い２０〜２５℃が望ましい。初発ｐＨは、培地
中の無機塩の沈澱が少ない中性付近が、培養中のｐＨ
は、中性付近から甚だしくずれないところが、それぞれ
好ましい。培養時間は、１５〜２５時間程度であり、プ
ロテアーゼ活性が最高に達したときに培養を終了すれば
よい。
【００１６】このようにして得られた培養液中より目的
とするプロテアーゼの分離精製は、一般の酵素精製法に
準じて行うことができる。すなわち、遠心分離方法また
はろ過法などによって菌体、培地固形物を除去した上清
またはろ液を得る。これらの分離液に可溶性塩類を添加
し蛋白を沈澱させる塩析法、噴霧乾燥法、凍結乾燥法な
どにより本発明のプロテアーゼを得る。さらに、イオン
交換クロマトグラフィー及びゲルフィルトレーションク
ロマトグラフィーなどの精製法を組み合わせ、精製す
る。
とするプロテアーゼの分離精製は、一般の酵素精製法に
準じて行うことができる。すなわち、遠心分離方法また
はろ過法などによって菌体、培地固形物を除去した上清
またはろ液を得る。これらの分離液に可溶性塩類を添加
し蛋白を沈澱させる塩析法、噴霧乾燥法、凍結乾燥法な
どにより本発明のプロテアーゼを得る。さらに、イオン
交換クロマトグラフィー及びゲルフィルトレーションク
ロマトグラフィーなどの精製法を組み合わせ、精製す
る。
【００１７】このようにして得られた本発明のプロテア
ーゼＢＢＰの活性は、以下に示す方法によって測定する
ーゼＢＢＰの活性は、以下に示す方法によって測定する
【００１８】［力価の測定方法］ 基質溶液：０〜２ｍＭの塩化カルシウムを含む５０ｍＭ
トリスー塩酸緩衝液中、ハマルステン氏法カゼイン（和
光純薬社製）を０．６％（ｗ／ｖ）に溶解し、特に記さ
ない限り、ｐＨを８．０に調製した。 酵素液：前記酵素を１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０
ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて適宜に
溶解希釈した。 反応停止液：５％トリクロル酢酸
トリスー塩酸緩衝液中、ハマルステン氏法カゼイン（和
光純薬社製）を０．６％（ｗ／ｖ）に溶解し、特に記さ
ない限り、ｐＨを８．０に調製した。 酵素液：前記酵素を１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０
ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて適宜に
溶解希釈した。 反応停止液：５％トリクロル酢酸
【００１９】４０℃に保温した基質溶液５００μｌに酵
素液１００μｌを加え、正確に２０分間反応させる。反
応は、反応停止液を添加することにより停止させ、室温
下２０分放置する。生じた沈澱を遠心分離により除去し
て、得られたトリクロル酢酸可溶部の２８０ｎｍにおけ
る吸光度（ＯＤT）を測定する。盲験として、酵素液１
００μｌに、４０℃に保温した反応停止液５００μｌを
加え、さらに基質溶液５００μｌを加えて２０分間放置
する。ここで生じた沈澱を同様な操作を行い、得られた
トリクロル酢酸可溶部の２８０ｎｍにおける吸光度（Ｏ
ＤB）を測定する。 １分間あたり吸光度（ΔＯＤ＝Ｏ
ＤT ーＯＤB）を０．００２上昇させる活性を１ヌニッ
トとする。
素液１００μｌを加え、正確に２０分間反応させる。反
応は、反応停止液を添加することにより停止させ、室温
下２０分放置する。生じた沈澱を遠心分離により除去し
て、得られたトリクロル酢酸可溶部の２８０ｎｍにおけ
る吸光度（ＯＤT）を測定する。盲験として、酵素液１
００μｌに、４０℃に保温した反応停止液５００μｌを
加え、さらに基質溶液５００μｌを加えて２０分間放置
する。ここで生じた沈澱を同様な操作を行い、得られた
トリクロル酢酸可溶部の２８０ｎｍにおける吸光度（Ｏ
ＤB）を測定する。 １分間あたり吸光度（ΔＯＤ＝Ｏ
ＤT ーＯＤB）を０．００２上昇させる活性を１ヌニッ
トとする。
【００２０】［酵素の理化学的性質］以下、ＢＢＰの理
化学的性質について詳細に説明する。 （１）作用：カゼイン、インスリンＢ鎖、小麦蛋白など
の蛋白質をエンド型に分解し、低分子化する。 （２）基質特異性：切断箇所がロイシン及びフェニルア
ラニンのアミノ基側である。 （３）至適温度：前述の力価測定方法に基づき、ｐＨを
８．０に調製した反応用液中で種々の温度で測定を行
い、５０℃における活性を１００とし、各温度の相対活
性を求めた結果を図１のグラフに示した。このグラフか
ら、至適温度は、４５〜５５℃である。
化学的性質について詳細に説明する。 （１）作用：カゼイン、インスリンＢ鎖、小麦蛋白など
の蛋白質をエンド型に分解し、低分子化する。 （２）基質特異性：切断箇所がロイシン及びフェニルア
ラニンのアミノ基側である。 （３）至適温度：前述の力価測定方法に基づき、ｐＨを
８．０に調製した反応用液中で種々の温度で測定を行
い、５０℃における活性を１００とし、各温度の相対活
性を求めた結果を図１のグラフに示した。このグラフか
ら、至適温度は、４５〜５５℃である。
【００２１】（４）至適ｐＨ：前述の力価測定方法に基
づき、反応温度を４０℃に設定した反応液中で測定を行
い、ｐＨ７．０における活性を１００とし、各ｐＨにお
ける相対活性を求めた結果を図２のグラフに示した。こ
のグラフから、至適ｐＨは、６．０〜８．０である。 （５）温度安定性：１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０
ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にタンパク濃度
として２０μｇ／ｍｌ濃度に酵素を加え、５０℃で熱処
理し、処理時間後の残存活性を求めた結果を図３に示し
た。１００分後の残存活性は、約５０％である。
づき、反応温度を４０℃に設定した反応液中で測定を行
い、ｐＨ７．０における活性を１００とし、各ｐＨにお
ける相対活性を求めた結果を図２のグラフに示した。こ
のグラフから、至適ｐＨは、６．０〜８．０である。 （５）温度安定性：１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０
ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にタンパク濃度
として２０μｇ／ｍｌ濃度に酵素を加え、５０℃で熱処
理し、処理時間後の残存活性を求めた結果を図３に示し
た。１００分後の残存活性は、約５０％である。
【００２２】（６）金属イオンの影響：前述の力価測定
方法に基づき、反応液中での濃度が２ｍＭになるように
各金属を含む溶液（５０ｍＭトリスー塩酸緩衝液ｐＨ
８．０）を加え、盲験として５０ｍＭトリスー塩酸緩衝
液を加えたときの活性を１００とし、残存活性を求めた
結果を表１に示した。
方法に基づき、反応液中での濃度が２ｍＭになるように
各金属を含む溶液（５０ｍＭトリスー塩酸緩衝液ｐＨ
８．０）を加え、盲験として５０ｍＭトリスー塩酸緩衝
液を加えたときの活性を１００とし、残存活性を求めた
結果を表１に示した。
【００２３】
【表１】 表１から明かな通り、Ｃｕ2+、Ｈｇ2+の存在下で酵素の
活性が著しく阻害される。
活性が著しく阻害される。
【００２４】（７）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動法により測定した結果、分子量は、約３４００
０である。 （８）紫外部吸収スペクトル：λmax＝２８０ｎｍ （９）溶解性：水に可溶
電気泳動法により測定した結果、分子量は、約３４００
０である。 （８）紫外部吸収スペクトル：λmax＝２８０ｎｍ （９）溶解性：水に可溶
【００２５】
［ＪＴ０１２７株の培養法］培地は、ペプトン０．５％
及び酵母エキス０．１と、無機塩類として塩化マグネシ
ウム０．２％、塩化カルシウム０．１％、クエン酸鉄
０．０１％、それに塩化ナトリウム３％を蒸留水１００
ｍｌに溶解し、１規定水酸化ナトリウム水溶液ｐＨ６．
５に調製したものである。この液体培地１００ｍｌを５
００ｍｌのこぶ付きフラスコに入れ、オートクレーブ滅
菌した後、予め培養しておいたＪＴ０１２７株を接種
し、２５℃にて、２４時間、１６０回転／分で振とう培
養した。この培養液を２０分間、８０００回転／分で遠
心分離し、得られた上清の酵素活性は、１５００００ユ
ニットであった。
及び酵母エキス０．１と、無機塩類として塩化マグネシ
ウム０．２％、塩化カルシウム０．１％、クエン酸鉄
０．０１％、それに塩化ナトリウム３％を蒸留水１００
ｍｌに溶解し、１規定水酸化ナトリウム水溶液ｐＨ６．
５に調製したものである。この液体培地１００ｍｌを５
００ｍｌのこぶ付きフラスコに入れ、オートクレーブ滅
菌した後、予め培養しておいたＪＴ０１２７株を接種
し、２５℃にて、２４時間、１６０回転／分で振とう培
養した。この培養液を２０分間、８０００回転／分で遠
心分離し、得られた上清の酵素活性は、１５００００ユ
ニットであった。
【００２６】［ＢＢＰ酵素の精製法］上記によって得ら
れた約８００ｍｌの培養液から硫安沈澱とカラムクロマ
トグラフィー（フェニルトヨパール 東ソー社製）から
なる精製法により電気泳動で１バンドを与える精製酵素
がタンパク量で２．１６ｍｇ得られた。 ［ＢＢＰによるインスリンＢ鎖ジスルフォネート（ウ
シ）の切断］
れた約８００ｍｌの培養液から硫安沈澱とカラムクロマ
トグラフィー（フェニルトヨパール 東ソー社製）から
なる精製法により電気泳動で１バンドを与える精製酵素
がタンパク量で２．１６ｍｇ得られた。 ［ＢＢＰによるインスリンＢ鎖ジスルフォネート（ウ
シ）の切断］
【００２７】１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０ｍＭト
リスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中でインスリンＢ鎖ジ
スルフォネート（生化学工業社製）と１／５００量のＢ
ＢＰを２５℃で反応させ、反応時間毎の生成物を常法に
より、液体クロマトグラフ及びアミノ酸分析計で確認し
た。その結果、主な切断箇所は、ロイシン、フェニルア
ラニンのアミノ基側であった。反応４時間後のクロマト
グラム中のピーク１は、アミノ酸分析の結果、Leu-Cys-
Gly-Ser-His、ピーク２は、Phe-Val-Pro-Lys-Hisであ
る。さらに反応させても、これらがさらに切断されたピ
ークは出現しなかった。その結果を図４のチャートに示
す。
リスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中でインスリンＢ鎖ジ
スルフォネート（生化学工業社製）と１／５００量のＢ
ＢＰを２５℃で反応させ、反応時間毎の生成物を常法に
より、液体クロマトグラフ及びアミノ酸分析計で確認し
た。その結果、主な切断箇所は、ロイシン、フェニルア
ラニンのアミノ基側であった。反応４時間後のクロマト
グラム中のピーク１は、アミノ酸分析の結果、Leu-Cys-
Gly-Ser-His、ピーク２は、Phe-Val-Pro-Lys-Hisであ
る。さらに反応させても、これらがさらに切断されたピ
ークは出現しなかった。その結果を図４のチャートに示
す。
【００２８】
【効果】市販されているサーモリンは、主に基質のロイ
シン、フェニルアラニンのアミノ基側を切断するが、グ
リシン、セリンのアミノ基側も切断することが知られて
いる。これに対し、本発明の酵素ＢＢＰは、基質特異性
がより厳密である。このため、Ｎ末端にこれらのアミノ
酸を配するペプチドを効率よく製造できる。
シン、フェニルアラニンのアミノ基側を切断するが、グ
リシン、セリンのアミノ基側も切断することが知られて
いる。これに対し、本発明の酵素ＢＢＰは、基質特異性
がより厳密である。このため、Ｎ末端にこれらのアミノ
酸を配するペプチドを効率よく製造できる。
【００２９】他の用途として、本発明の酵素ＢＢＰとフ
ェニルアラニンのカルボキシル基側を切断する酵素との
併用で天然蛋白質素材からフェニルアラニンを含まない
ペプチドを得ることができ、フェニルケトン尿症患者用
食品素材製造用酵素として利用可能である。さらに、蛋
白の一次構造を決定するために必要な部分分解ペプチド
を得るための試薬として利用価値がある。
ェニルアラニンのカルボキシル基側を切断する酵素との
併用で天然蛋白質素材からフェニルアラニンを含まない
ペプチドを得ることができ、フェニルケトン尿症患者用
食品素材製造用酵素として利用可能である。さらに、蛋
白の一次構造を決定するために必要な部分分解ペプチド
を得るための試薬として利用価値がある。
【図１】本発明の酵素ＢＢＰの相対活性と温度との関係
を示すグラフである。
を示すグラフである。
【図２】本発明の酵素ＢＢＰの相対活性とｐＨとの関係
を示すグラフである。
を示すグラフである。
【図３】本発明の酵素ＢＢＰの残存活性と５０℃におけ
る処理時間との関係を示すグラフである。
る処理時間との関係を示すグラフである。
【図４】本発明の酵素ＢＢＰとインスリンＢ鎖ジスルフ
ォネートとの反応生成物の液体クロマトグラフのチャー
トである。
ォネートとの反応生成物の液体クロマトグラフのチャー
トである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 水崎 茂暢 東京都品川区東品川４ー12ー62 日本たば こ産業株式会社内 (72)発明者 有田 正俊 神奈川県小田原市酒匂４ー13ー20 日本た ばこ産業株式会社海水総合研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する新規プロテ
アーゼ。 （１）ロイシン及びフェニルアラニンのアミノ基側を切
断する （２）カゼインをエンド型に分解し低分子化する （３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ下で分子量約３４０００ （４）紫外線吸収スペクトル λmax＝２８０ｎｍ （５）至適ｐＨ ６〜８ （６）至適温度 ４５〜５５℃ - 【請求項２】バチルス バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂａｄｉｕｓ）ＪＴ０１２７（微工研菌寄第１２７２
２号）である請求項１記載の生産菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8751092A JPH06261751A (ja) | 1992-03-12 | 1992-03-12 | 新規プロテアーゼ及びそれを生産するバチルス バディウス ｊｔ０１２７菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8751092A JPH06261751A (ja) | 1992-03-12 | 1992-03-12 | 新規プロテアーゼ及びそれを生産するバチルス バディウス ｊｔ０１２７菌株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06261751A true JPH06261751A (ja) | 1994-09-20 |
Family
ID=13916987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8751092A Pending JPH06261751A (ja) | 1992-03-12 | 1992-03-12 | 新規プロテアーゼ及びそれを生産するバチルス バディウス ｊｔ０１２７菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06261751A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5597720A (en) * | 1992-05-27 | 1997-01-28 | Novo Nordisk A/S | Alkaline protease from bacillus sp. PD498, method of making and method of use |
-
1992
- 1992-03-12 JP JP8751092A patent/JPH06261751A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5597720A (en) * | 1992-05-27 | 1997-01-28 | Novo Nordisk A/S | Alkaline protease from bacillus sp. PD498, method of making and method of use |
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