DE69635514T2

DE69635514T2 - Bacillus-proteasen

Info

Publication number: DE69635514T2
Application number: DE69635514T
Authority: DE
Inventors: Helle Outtrup; Lars Sparre Conrad
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-08
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2016-02-09
Also published as: US5888797A; JP3585928B2; AU4534796A; ATE311440T1; BR9607404A; JPH11500611A; EP0809693B1; AR004166A1; CN1093174C; MX9705967A; WO1996024665A1; DE69635514D1; CA2212577C; CN1173894A; EP0809693A1; CA2212577A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Waschmittelproteasen, die aus Stämmen von Bacillus sp. erhältlich sind. In spezifischerer Weise bezieht sich die Erfindung auf eine neue alkalische Protease aus einem Stamm von Bacillus sp. ZI 315. Außerdem bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der Protease als ein Waschmittelenzym und auf Waschmittelzusammensetzungen, die die erfindungsgemäße Protease umfassen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Waschmittelenzyme werden seit mehr als 20 Jahren vertrieben und sind inzwischen auf der ganzen Welt als normale Waschmittelbestandteile sowohl in Pulver- als auch Flüssigwaschmitteln gut etabliert.
Enzyme, die in Waschformulierungen verwendet werden, umfassen viele verschiedene Enzyme, so wie Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cellulasen, sowie andere Enzyme oder Mischungen davon. In kommerzieller Hinsicht sind die wichtigsten Enzyme die Proteasen.
Waschmittelproteasen wurden entwickelt, indem Proteasen, die in der Natur vorkommen, isoliert wurden, gefolgt von dem Testen in Waschmittelformulierungen. Die meisten Waschmittelproteasen werden aus Mitgliedern der Gattung Bacillus erhalten. WO 88/01293 beschreibt eine neue alkalische-Protease-Zubereitung, die eine erhöhte Oxidationsstabilität aufweist, sowie ihre Verwendung als ein Zusatz für Reinigungsmittel.
Beispiele von kommerziellen Proteaseprodukten sind ALCALASE^TM, ESPERASE^TM und SAVINASE^TM, die alle von Novo Nordisk A/S, Dänemark, geliefert werden. Die Protease ALCALASE^TM wird von Stämmen der Spezies Bacillus licheniformis produziert. Die Proteasen ESPERASE^TM und SAVINASE^TM werden durch Kultivieren von Stämmen von alkalophilen Bacilli gewonnen.
Die Waschgewohnheiten, speziell die verwendete Waschtemperatur, die Härte des verwendeten Wassers und die Bestandteile der Waschmittel unterscheiden sich sehr stark von einem Land zum anderen. Typische Bedingungen werden unten umrissen:

– niedriger pH und niedrige Wasserhärte: Flüssigwaschmittel in den USA und Asien;
– niedriger pH und hohe Wasserhärte: Flüssigwaschmittel in Europa;
– hoher pH und niedrige Wasserhärte: Pulverwaschmittel in den USA und Asien; und
– hoher pH und hohe Wasserhärte: Pulverwaschmittel in Europa.

(Ein niedriger pH in Waschmitteln ist typischerweise ein pH in dem Bereich 8,0–9,5, insbesondere um 9; ein hoher pH in Waschmitteln ist typischerweise ein pH in dem Bereich 10–11,5, insbesondere um 10,5. Eine niedrige Wasserhärte beträgt typischerweise in dem Bereich 3–6°dH; eine hohe Wasserhärte beträgt typischerweise in dem Bereich 15–20°dH, insbesondere um 18°dH.)
Außerdem verändern sich die Zusammensetzungen der Waschmittel in den letzten Jahren, um das Waschverfahren umweltfreundlicher zu machen. Alle diese Unterschiede und Veränderungen innerhalb der Waschmittelindustrie machen das Gebiet extrem kompliziert. Deshalb besteht ein ständiger Bedarf danach, neue Proteasen zu finden, die unter einem bestimmtem, vorgegebenem Satz von Bedingungen eine optimale Leistung zeigen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Waschmittelproteasen mit verbesserter Waschleistung bei mittlerer bis niedriger Waschtemperatur bereitzustellen.
Folglich stellt die Erfindung gemäß ihrem ersten Aspekt eine Protease bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, dass:

– sie immunchemische Eigenschaften aufweist, die identisch mit denjenigen einer Protease von dem Stamm Bacillus sp. ZI 315, DSM 9702, sind.

Gemäß einem zweiten Aspekt wird die Verwendung des Enzyms als ein Waschmittelenzym beansprucht. Gemäß weiteren spezifischeren Aspekten stellt die Erfindung Waschmittelzusammensetzungen und Waschmittelzusätze bereit, die die Protease umfassen.
Gemäß einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein Waschverfahren bereit, das das Zugeben der Protease umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen weiter veranschaulicht, worin
die 1 das Verhältnis zwischen der Temperatur und der proteolytischen Aktivität eines erfindungsgemäßen Enzyms zeigt (der gemäß Bsp. 1 gewonnenen Enzympräparation mit 1% Casein als Substrat und bei pH 9,5);
die 2 das Verhältnis zwischen dem pH und der proteolytischen Aktivität eines erfindungsgemäßen Enzyms zeigt (der gemäß Bsp. 1 gewonnenen Enzympräparation mit 1% Casein als Substrat und bei 25°C).
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Der Mikroorganismus
Der neue erfindungsgemäße Mikroorganismus, der fähig ist, ein erfindungsgemäßes Enzym zu produzieren, wird von dem Stamm repräsentiert, der aus einer Bodenprobe isoliert wurde. Bacillus sp. ZI 315 wurde gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung von Hinterlegungen von Mikroorganismen für den Zweck des Patentverfahrens am 30. Januar 1995 bei der DSM – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH – unter der Zugangs-Nr. DSM 9702 hinterlegt.
Der erfindungsgemäße Mikroorganismus ist ein aerobes, alkaliphiles, sporenbildendes Bakterium, das zu der Gattung Bacillus gehört. Morphologisch kann er als Gram+, bewegliche Stäbchen mit einem Durchmesser von 0,6–0,9 Mikron und einer Länge von 1,5–3 Mikron beschrieben werden. Die Sporen (die selten vorkommen) sind elliptisch, zentral bis subterminal und führen zum Anschwellen des Sporangiums.
Die optimale Temperatur für das Wachstum liegt innerhalb 30–40°C, ohne Wachstum bei 50°C, und der optimale pH für das Wachstum liegt innerhalb 9–10, mit gutem Wachstum bei pH 10,0 und ohne Wachstum bei pH 7,0, was den Stamm strikt alkaliphil macht.
Der Mikroorganismus bildet auf alkalischen Nährmedium-Schrägagars gelbe bis orangefarbene, runde und glatte Kolonien, und es wird keine Diffusion von Pigment in den Agar beobachtet.
Bacillus sp. ZI 315 wurde als eine neue Spezies innerhalb der Gruppe 1 der Gattung Bacillus identifiziert. Die vollständige Sequenzanalyse der 16S rDNA zeigte, dass Bacillus sp. ZI 315 am nächsten mit Bacillus firmus, Bacillus circulans und Bacillus benzoevorans verwandt ist; er zweigt weiter entfernt von anderen alkaliphilen Spezies der Gruppe 1, so wie Bacillus cohnii und Bacillus halmapalus, ab. ZI 315 zweigt von seinen phylogenetischen Verwandten ab und zeigt signifikante physiologische Unterschiede zu diesen und wird aus diesen Gründen als eine neue Spezies innerhalb der Gruppe 1 der Gattung Bacillus angesehen.
Kultivierung des Mikroorganismus
Der erfindungsgemäße Mikroorganismus kann unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert werden, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit anderen essentiellen Nährstoffen enthält, wobei das Medium in Übereinstimmung mit den im Stand der Technik bekannten Prinzipien zusammengestellt wird.
Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, so wie Saccharose, Glucose und Stärke, oder Kohlenhydrate, die Materialien, so wie Getreidekörner, Malz, Reis und Sorghum, enthalten. Die in dem Medium enthaltene Kohlenhydratkonzentration kann in einem weiten Bereich schwanken, z.B. nach oben bis 25% und nach unten bis 1–5%, aber für gewöhnlich werden 8–10% geeignet sein, wobei die Prozentanteile als Äquivalente der Glucose berechnet werden.
Die Stickstoffquelle in dem Nährmedium kann anorganischer und/oder organischer Natur sein. Geeignete anorganische Stickstoffquellen sind Nitrate und Ammoniumsalze. Unter den organischen Stickstoffquellen wird eine beträchtliche Anzahl regelmäßig in Fermentationsverfahren verwendet, die die Kultivierung von Bakterien einschließen. Veranschaulichende Beispiele sind Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Erdnussmehl, Casein, Mais, Mais-Einweichflüssigkeit („corn steep liquor"), Hefeextrakt, Harnstoff und Albumin. Zusätzlich sollte das Nährstoffmedium auch gewöhnliche Spurensubstanzen enthalten.
Die neuen Bacillus-Spezies der vorliegenden Erfindung sind leicht alkaliphil. Deshalb wird die Kultivierung vorzugsweise bei alkalischen pH-Werten durchgeführt, die durch die Zugabe von geeigneten Puffern, so wie Natriumcarbonat, pH 9,0–10,5, nach der Sterilisation des Wachstumsmediums erhalten werden können. Für die Kultivierung in Tankfermentern ist es erforderlich, eine künstliche Belüftung zu verwenden. Die Belüftungsrate ist ähnlich zu derjenigen, die bei der herkömmlichen Tankfermentation verwendet wird.
Nach der Fermentation können flüssige Enzymkonzentrate hergestellt werden, indem grobes Material aus der Brühe entfernt wird, oder, falls gewünscht, die Brühe, z.B. durch Evaporieren bei niedriger Temperatur oder durch Umkehrosmose, konzentriert wird. Schließlich können Konservierungsstoffe zu dem Konzentrat zugegeben werden.
Feste Enzymzubereitungen können aus der gereinigten und/oder konzentrierten Brühe durch Ausfällen mit Salzen, so wie Na₂SO₄, oder mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, so wie Ethanol oder Aceton, hergestellt werden. Das Entfernen des Wassers in der Brühe durch geeignete Trocknungsverfahren, so wie Sprühtrocknung, kann ebenfalls eingesetzt werden.
Test für die proteolytische Aktivität
Die proteolytische Aktivität wird mit Casein als Substrat bestimmt. Eine Casein-Proteaseeinheit (CPU) ist als diejenige Menge an Enzym definiert, die 1 mM primäre Aminogruppen (durch Vergleich mit einem Serinstandard bestimmt) pro Minute unter Standardbedingungen, d.h. Inkubation für 30 Minuten bei 25°C und pH 9,5, freisetzt. Ein Ordner AF 228, der das analytische Verfahren beschreibt, ist auf Anfrage bei Novo Nordisk A/S, Dänemark, erhältlich, wobei der Ordner hiermit mittels Verweis eingeschlossen ist.
Das Enzym
Das erfindungsgemäße Enzym ist eine neue Waschmittelprotease. Es ist durch Kultivieren eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus, vorzugsweise Bacillus sp. ZI 315, DSM 9702, oder einer Mutante oder einer Variante davon in einem geeigneten Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, erhältlich. Das Enzym kann auch mittels rekombinanter DNA-Technologie gewonnen werden.
Die erfindungsgemäße Protease kann durch die unten beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften charakterisiert werden.
Physikalisch-chemische Eigenschaften
Ein Molekulargewicht von 38 kD, bestimmt mittels SDS-PAGE. Ein pI bei über 9,3 konnte mittels isoelektrischer Fokusierung auf LKB-Ampholine^®-PAG-Platten bestimmt werden. Die Proteaseaktivität wird durch PMSF, α-1-Antitrypsin und Truthahn-Eiklar-Proteinaseinhibitor inhibiert. EDTA und Sojabohnen-Proteininhibitor beeinflussen die Proteaseaktivität nicht.
Das Temperatur-Aktivitätsverhältnis wurde mit 1% Casein als Substrat und bei pH 9,5 bestimmt. Der zuvor beschriebene Test für die proteolytische Aktivität wurde mit der Modifikation verwendet, dass die Inkubationstemperatur in dem Interval von 10°C bis 70°C variiert wurde.
Das Ergebnis ist in der 1 gezeigt. Es ist aus der Figur ersichtlich, dass das Enzym eine proteolytische Aktivität von Temperaturen unter 10°C bis in etwa 50°C besitzt und ein Temperaturoptimum bei um 40°C aufweist.
Die Abhängigkeit der Aktivität von dem pH wurde mittels des gleichen Verfahrens bestimmt, wobei Britten-Robinson-Puffer verwendet wurden, die auf vorbestimmte pH-Werte in dem pH-Bereich von 6 bis 11 eingestellt waren.
Das Ergebnis ist in der 2 gezeigt. Es ist aus dieser Figur ersichtlich, dass das Enzym eine proteolytische Aktivität bei pH-Werten unter 6 bis über 11 mit einem pH-Optimum in dem Bereich von pH 9 bis pH 11 besitzt.
Die erfindungsgemäße Protease besitzt besondere Potentiale in Waschmitteln mit niedriger Wasserhärte und mittleren bis niedrigen Waschtemperaturen.
Immunchemische Eigenschaften
Die erfindungsgemäße Protease weist immunchemische Eigenschaften auf, die identisch mit denjenigen einer Protease sind, die von dem Stamm Bacillus sp. ZI 315, DSM 9702, abgeleitet ist.
Die immunchemischen Eigenschaften für verschiedene Bacillus-Proteasen stellen tatsächlich ein sehr unterscheidungskräftiges Merkmal dar: während das, wie oben offenbarte, pH-Optimum, Temperatur-Optimum, pI etc. mehr oder weniger gleich sind, führen unterschiedliche immunchemische Eigenschaften zu einer sehr unterschiedlichen Stabilität in verschiedenen Waschmitteln.
Die immunchemischen Eigenschaften können immunologisch durch Kreuzreaktions-Identitätstests bestimmt werden. Die Identitätstests können mittels des wohlbekannten Ouchterlony-Doppel-Immundiffusiortsverfahrens oder durch die Tandem-Kreuzimmunelektrophorese nach N. H. Axelsen; Handbook of Immuno precipitation-in-Gel Techniques; Blackwell Scientific Publications (1983), Kapitel 5 und 14, durchgeführt werden. Die Ausdrücke „antigene Identität" und „partielle antigene Identität" sind in dem gleichen Buch in den Kapiteln 5, 19 und 20 beschrieben.
Monospezifisches Antiserum wurde nach dem oben erwähnten Verfahren hergestellt, indem Kaninchen mit der gereinigten erfindungsgemäßen Protease immunisiert wurden. Das Immunogen wurde mit Freund'schem Adjuvans gemischt und jede zweite Woche in Kaninchen subkutan injiziert. Das Antiserum wurde nach einer Gesamt-Immunisierungsdauer von 8 Wochen gewonnen, und das Immunglobulin wurde daraus, wie von N. H. Axelsen, supra, beschrieben, hergestellt.
Bei der Verwendung des oben beschriebenen Ouchterlony-Doppel-Immundiffusionstests zeigte die erfindungsgemäße Protease keine Kreuzreaktion mit den bekannten Serinproteasen:

– ALCALASE^TM (erhältlich von Novo Nordisk A/S),
– SAVINASE^TM (erhältlich von Novo Nordisk A/S),
– ESPERASE^TM (erhältlich von Novo Nordisk A/S),
– Subtilisin Novo (erhältlich von Novo Nordisk A/S),
– KAZUSASE^TM (erhältlich von SHOWA DENKO),
– den in WO 92107067 beschriebenen Bacillus-Proteasen,
– den in WO 92/17576 beschriebenen Bacillus-Proteasen,
– den in WO 92/17577 beschriebenen Bacillus-Proteasen,
– den in WO 92/17578 beschriebenen Bacillus-Proteasen,
– den in WO 93/18140 beschriebenen Bacillus-Proteasen,
– den in WO 93/24623 beschriebenen Bacillus-Proteasen,
– den in WO 94/01532 beschriebenen Bacillus-Proteasen, und
– den in WO 95/07350 beschriebenen Bacillus-Proteasen.

Verschiedene Bacillus-Proteasen tolerieren verschiedene Waschmittel mit einer großen Variabilität, und eines der besten derzeitigen Mittel, um zwischen Bacillus-Proteasen zu unterscheiden, ist das Mittel der immunchemischen Identität.
Waschmittelzusammensetzungen
Erfindungsgemäß kann die Protease typischerweise ein Bestandteil einer Waschmittelzusammensetzung, z.B. einer Geschirrspül- oder einer Wäsche-Waschmittelzusammensetzung, sein. Dabei kann sie in die Waschmittelzusammensetzung in Form eines nicht-staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms eingeschlossen sein. Nicht-staubende Granulate können, z.B. wie in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide für Novo Industri A/S) beschrieben, hergestellt werden und können wahlweise durch in der Technik bekannte Verfahren beschichtet werden. Beispiele von wachsartigen Beschichtungsmaterialien sind Polyethylenoxid-Produkte (Polyethylenglykol, PEG) mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 1.000 bis 20.000; ethoxylierte Nonylphenole, die von 16 bis 50 Ethylenoxid-Einheiten aufweisen; ethoxylierte Fettalkohole, in denen der Alkohol von 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und die 15 bis 80 Ethylenoxid-Einheiten aufweisen; Fettalkohole; Fettsäuren; und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende Beschichtungsmaterialien, die für den Auftrag mittels Flüssigbett-Techniken geeignet sind, sind in dem Patent GB 1483591 angegeben. Flüssige Enzymzubereitungen können z.B. durch Zugeben eines Polyols, so wie Propylenglykol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, von Milchsäure oder Borsäure, gemäß etablierten Verfahren stabilisiert werden. Andere Enzymstabilisatoren sind in der Technik wohlbekannt. Geschützte Enzyme können gemäß dem in EP 238,216 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
Die erfindungsgemäße Waschmittelzusammensetzung kann in jeder beliebigen zweckmäßigen Form, z.B. als Pulver, Körner, Paste oder Flüssigkeit vorliegen. Ein flüssiges Waschmittel kann wässrig sein, typischerweise bis zu 70% Wasser und 0–30% organisches Lösungsmittel enthalten, oder nicht-wässrig sein.
Die Waschmittelzusammensetzung umfasst ein oder mehrere Tenside, von denen jedes anionisch, nichtionisch, kationisch oder zwitterionisch sein kann. Das Waschmittel wird normalerweise 0–50% anionisches Tensid, so wie lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), Alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkohol-Ethoxysulfat (AEOS oder AES), sekundäre Alkansulfonate (SAS), Alpha-Sulfofettsäure-Methylester, Alkyl- oder Alkenyl-Bernsteinsäure oder Seife enthalten. Sie kann auch 0–40% nichtionisches Tensid, so wie Alkoholethoxylat (AEO oder AE), karboxylierte Alkoholethoxylate, Nonylphenol-Ethoxylat, Alkylpolyglycosid, Alkyldimethylaminoxid, ethoxyliertes Fettsäure-Monoethanolamid, Fettsäure-Monoethanolamid oder Polyhydroxy-Alkyl-Fettsäureamid (z.B. wie in WO 92/06154 beschrieben) enthalten.
Die Waschmittelzusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere andere Enzyme, so wie Amylase, Lipase, Cutinase, Cellulase, Peroxidase und Oxidase, z.B. Laccase, umfassen.
Das Waschmittel kann 1–65% eines Waschmittel-Builders oder Komplexierungsmittels, so wie Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Citrat, Nitriltriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTMPA), Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, lösliche Silikate oder Schichtsilikate (z.B. SKS-6 von Hoechst), enthalten. Das Waschmittel kann auch „unbuilt" sein, d.h. im Wesentlichen frei von Waschmittel-Builder sein.
Das Waschmittel kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind Carboxymethylzellulose (CMC), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenglykol (PEG), Polyvinylalkohol (PVA), Polycarboxylate, so wie Polyacrylate, Malein-/Acrylsäure-Copolymere und Lauryl-Methacrlyat/Acrylsäure-Copolymere.
Das Waschmittel kann ein Bleichsystem enthalten, das eine H₂O₂-Quelle, so wie Perborat oder Percarbonat, umfassen kann, die mit einem Persäure-bildenden Bleichaktivator, so wie Tetraacetylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzolsulfonat (MOBS), kombiniert sein kann. Alternativ kann das Bleichsystem Peroxysäuren von z.B. dem Amid-, Imid- oder Sulfontyp umfassen.
Die Enzyme der erfindungsgemäßen Waschmittelzusammensetzung können stabilisiert sein, wobei herkömmliche Stabilisierungsmittel, z.B. ein Polyol, so wie Propylenglykol oder Glycerin, ein Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure, Borsäure oder ein Borsäurederivat, so wie z.B. ein aromatischer Boratester, verwendet werden, und die Zusammensetzung kann, z.B. wie in WO 92/19709 und WO 92/19708 beschrieben, formuliert sein.
Das Waschmittel kann auch andere herkömmliche Waschmittelbestandteile, so wie z.B. Textilerzeugnis-Ausrüstungen, einschließlich Tone, Schaumbildungsmittel, Schaumunterdrücker, Korrosionsschutzmittel, Schmutzsuspendiermittel, Anti-Schmutzablagerungsmittel, Farbstoffe, Bakterizide, optische Aufheller oder Parfüm, enthalten.
Der pH (in wässriger Lösung bei Gebrauchskonzentration gemessen) wird normalerweise neutral oder alkalisch, z.B. in dem Bereich von 7–11, sein.
Besondere Formen von Waschmittelzusammensetzungen innerhalb des Umfangs der Erfindung schließen ein:

1) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigsten 600 g/l aufweist, umfassend
2) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
3) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
4) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, die eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
5) Eine wässrige Flüssigwaschmittelzusammensetzung, umfassend
6) Eine wässrige, strukturierte Flüssigwaschmittelzusammensetzung, umfassend
7) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, die eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
8) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, umfassend
9) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, umfassend
10) Eine wässrige Flüssigwaschmittelzusammensetzung, umfassend
11) Eine wässrige Flüssigwaschmittelzusammensetzung, umfassend
12) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
13) Wie in 1)–12) beschriebene Waschmittelformulierungen, worin das gesamte oder ein Teil des linearen Alkylbenzolsulfonats durch (C₁₂-C₁₈)-Alkylsulfat ersetzt ist.
14) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
15) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
16) Wie in 1)–15) beschriebene Waschmittelformulierungen, die eine stabilisierte oder eingekapselte Persäure, entweder als einen zusätzlichen Bestandteil oder als einen Ersatz für bereits angegebene Bleichsysteme, enthalten.
17) Wie in 1), 3), 7), 9) und 12) beschriebene Waschmittelzusammensetzungen, worin Perborat durch Percarbonat ersetzt ist.
18) Wie in 1), 3), 7), 9), 12), 14) und 15) beschriebene Waschmittelzusammensetzungen, die zusätzlich einen Mangankatalysator enthalten. Der Mangankatalysator kann z.B. eine der in „Efficient manganese catalysts for low-termperature bleaching", Nature 369, 1994, S. 637–639 beschriebenen Verbindungen sein.
19) Waschmittelzusammensetzung, die als eine nicht-wässrige Waschmittelflüssigkeit formuliert ist, die ein flüssiges, nichtionisches Tensid, so wie z.B. einen linearen, alkoxylierten, primären Alkohol, ein Buildersystem (z.B. Phosphat), Enzym und Alkali umfasst. Das Waschmittel kann auch anionisches Tensid und/oder ein Bleichsystem umfassen.

Die erfindungsgemäße Protease kann in Konzentrationen enthalten sein, die herkömmlicher Weise in Waschmitteln verwendet werden. Derzeit wird in Betracht gezogen, dass die Protease in der erfindungsgemäßen Waschmittelzusammensetzung in einer Menge zugegeben werden kann, die 0,00001–1 mg (berechnet als reines Enzymprotein) Protease pro Liter Waschflüssigkeit entspricht.
Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen veranschaulicht, die den Umfang der wie beanspruchten Erfindung auf keinerlei Weise beschränken sollen.
BEISPIEL 1
Bacillus sp. ZI 315, DSM 9702, wurde bei 30°C auf einem Rotationsschütteltisch (300 upm) in 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Kerben, die 100 ml Medium der folgenden Zusammensetzung (pro Liter)

Kartoffelstärke 100 g

gemahlene Gerste 50 g

Sojabohnenmehl 20 g

Na₂HPO₄ × 12H₂ 9 g

Pluronic^© 0,1 g

Natriumcaseinat 10 g

enthielten, kultiviert.
Die Stärke in dem Medium wird mit α-Amylase verflüssigt, und das Medium wird durch Erhitzen bei 120°C für 45 Minuten sterilisiert.
Nach der Sterilisation wird der pH des Mediums durch Zugabe von 10 ml einer 1 M Lösung von Natriumsesquicarbonat auf 9,7 eingestellt.
Nach der Kultivierung (3 Tage) und nach der Abtrennung des festen Materials wurde die Protease durch ein herkömmliches chromatographisches Verfahren gereinigt.
Die Ausbeute von 1,5 l Kulturbrühe betrug 50 ml mit 70 CPU/l. Die Reinheit betrug mehr als 90%, wie anhand von SDS-PAGE beurteilt wurde.
Die Merkmale der Zubereitung, die in Übereinstimmung mit diesem Beispiel hergestellt wurde, wurden weiter oben in dieser Beschreibung dargestellt, und es wird darauf Bezug genommen.
BEISPIEL 2
Waschleistung der Bacillus-sp.-ZI-315-Protease bei (20°C)
Die Waschleistungstests wurden an Baumwolle, die mit Grassaft beschmutzt war, in einem Modellwaschsystem bei 20°C bei einer konstanten Temperatur für 10 Minuten durchgeführt.
Die Tests wurden bei Proteasekonzentrationen von 1,6, 3,2, 8, 16, 32, 64 und 160 nM durchgeführt.
2,0 g/l einer Pulverwaschmittel-Zusammensetzung amerikanischen Typs wurden in diesem Test verwendet. Das Waschmittel enthielt vor der Zugabe der erfindungsgemäßen Protease keinerlei Enzyme. Das Waschmittel wurde in Wasser mit in etwa 6°dH (deutsche Härte) gelöst. Der pH der Waschflüssigkeit betrug 10. Das Textilie/Waschflüssigkeit-Verhältnis betrug in etwa 5 g Textilie pro Liter Wachflüssigkeit. Für jede Enzymkonzentration wurden zwei unabhängige Tests durchgeführt.
Nach dem Waschen des Textilerzeugnisses wurden die Stoffe in fließendem Leitungswasser für 20 Minuten gespült und dann luftgetrocknet. Die Leistung der erfindungsgemäßen Protease und der Savinase^TM wurde als die Veränderung (ΔR) der Remission (%R) bei 460 nm auf einem Datacolor Elrephometer 2000 gemessen, wobei ΔR die Remission nach dem Waschen mit zugegebener Protease abzüglich der Remission nach dem Waschen ohne zugegebene Protease war.
Die Ergebnisse dieser Tests sind in der Tabelle 1, unten, gezeigt (Mittelwert von 2 Tests).
Tabelle 1
Aus der Tabelle 1 ist ersichtlich, dass ΔR-(Bacillus sp. ZI 315) bei allen gemessenen Proteasekonzentrationen höher als ΔR-(Savinase^TM) ist, d.h. die erfindungsgemäße Protease weist eine bessere Waschleistung bei allen gemessenen Konzentrationen bei 20°C auf.
BEISPIEL 3
Waschleistung der Bacillus-sp.-ZI-315-Protease (bei 25°C)
Die Waschleistungstests wurden an Baumwolle, die mit Grassaft beschmutzt war, in einem Modellwaschsystem bei 25°C bei einer konstanten Temperatur für 10 Minuten durchgeführt.
Die Tests wurden bei Proteasekonzentrationen von 1, 2, 7,5 und 20 nM durchgeführt.

2,0 g/l eines Waschmittels mit der folgenden Zusammensetzung

Lineares Alkylbenzolsulfonat	0,3 g/l
Alkohlethoxylat	0,04 g/l
Seife	0,1 g/l
Na₂SO₄	0,3 g/l
Na₂CO₃	0,4 g/l
Zeolith	0,6 g/l
Na₃-Citrat	0,08 g/l
Carboxymethylcellulose	0,006 g/l
Polycarboxylat	0,083 g/l

wurden in dem Text verwendet. Das Waschmittel wurde in Wasser mit in etwa 6°dH (deutsche Härte) gelöst. Der pH der Waschflüssigkeit wurde auf pH 10 eingestellt. Das Textilie/Waschflüssigkeit-Verhältnis betrug in etwa 5 g Textilie pro Liter Waschflüssigkeit. Für jede Enzymkonzentration wurden zwei unabhängige Tests durchgeführt.

Nach dem Waschen des Textilerzeugnisses wurden die Stoffe in fließendem Leitungswasser für 20 Minuten gespült und dann luftgetrocknet. Die Leistung der erfindungsgemäßen Protease und der Savinase^TM wurde als die Änderung (ΔR) der Remission (%R) bei 460 nm auf einem Datacolor Elrephometer 2000 gemessen, wobei ΔR die Remission nach dem Waschen mit der zugegebenen Protease abzüglich der Remission nach dem Waschen ohne zugegebene Protease war.
Die Ergebnisse dieser Tests sind in der Tabelle 2 unten gezeigt (Mittelwert von 2 Tests).
Tabelle 2
Aus der Tabelle 2 ist ersichtlich, dass ΔR-(Bacillus sp. ZI 315) bei allen gemessenen Proteasekonzentrationen höher ist als ΔR-(Savinase^TM), d.h. die erfindungsgemäße Protease weist eine bessere Waschleistung bei allen gemessenen Konzentrationen bei 25°C auf.
BEISPIEL 4
Verbesserungsfaktor/Modellwaschmittel
Ein Verbesserungsfaktor (unten definiert) für die erfindungsgemäße Protease wurde bei niedriger und hoher Wasserhärte unter Verwendung eines Modellwaschmittels bei pH 9 mit Savinase als Referenz etabliert.
Der Verbesserungsfaktor wurde auf die folgende Weise bestimmt:
Die Messung der Remission (R) bei einem Testmaterial (Gras auf Baumwolle) wurde bei 460 nm unter Verwendung eines Elrepho 2000 Photometers (ohne UV) durchgeführt. Die gemessenen Werte wurden dem folgenden Ausdruck angepasst: R = (a·ΔRmax·c)/(ΔRmax + a·c) + b.
Der Verbesserungsfaktor (IF) wird dann unter Verwendung der Anfangssteigung der Kurve: IF = a/aref berechnet,
worin

R:: die Waschwirkung des Enzyms in Remissionseinheiten ist,
a:: die Anfangssteigung der angepassten Kurve ist,
a_ref:: die Anfangssteigung für das Referenzenzym ist,
b:: der Schnittpunkt der angepassten Kurve und der y-Achse ist,
c:: die Enzymkonzentration in Nanomol aktives Enzym pro Liter ist, und
ΔR_max:: die theoretische maximale Waschwirkung des Enzyms in Remissionseinheiten ist.

Die folgenden Versuchsbedingungen wurden verwendet:

Waschmittel:	25% STP (Na₅P₃O₁₀) 25% Na₂SO₄ 10% Na₂CO₃ 20% LAS (Nansa 80S) 5% NI (Dobanol 25-7) 5% Na₂Si₂O₅ 0,5% CMC (Carboxymethylcellulose) 9,5% Wasser
Waschmitteldosis:	3 g/l
pH:	9,0
Waschdauer:	15 min
Waschtemperatur:	15°C
Wasserhärte:	6°dH und 18°dH
Enzymkonzentrationen:	0, 3, 6, 9, 15, 30 und 60 nM
Stoffprobe/Volumen	5 Stoffproben (Durchmesser 2,5 cm) je 50 ml Waschlösung
Testmaterial:	Gras auf Baumwolle

Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
IF = 4,8, wenn die Wasserhärte 6°dH betrug, und
IF = 1,4, wenn die Wasserhärte 18°dH betrug.
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäße Protease sehr nützlich in Flüssigwaschmitteln (niedriger pH) für die Verwendung in den USA und Asien wäre (wo die Wasserhärte niedrig ist, um oder weniger als 6°dH).
BEISPIEL 5
Verbesserungsfaktor/Kommerzielle Waschmittel
Verbesserungsfaktoren, die, wie in Beispiel 4 beschrieben, erhalten wurden, wurden auch für die kommerziellen Waschmittel Koso Top und Omo Powder China etabliert, wobei die Savinase wiederum als das Referenzenzym verwendet wurde.

Die folgenden Versuchsbedingungen wurden verwendet:

Waschmitteldosis:	1 g/l
pH:	10,5 (Koso Top) und 10,2 (Omo Powder China)
Waschdauer:	15 min
Waschtemperatur:	15°C
Wasserhärte:	3°dH
Enzymkonzentrationen:	3, 6, 9, 15, 30 und 60 nM
Stoffprobe/Volumen	5 Stoffproben (Durchmesser 2,5 cm) je 50 ml Waschlösung
Testmaterial:	Gras auf Baumwolle

Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
IF = 2,1 (Koso Top), und
IF = 3,1 (Omo Powder China)
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäße Protease sehr nützlich in Waschmitteln mit hohem pH für die Verwendung in Asien wäre (wo die Wasserhärte niedrig ist, um 3°dH).

Claims

Protease, dadurch gekennzeichnet, dass sie immunchemische Eigenschaften aufweist, die identisch zu denjenigen einer Protease aus dem Stamm Bacillus sp. ZI 315, DSM 9702, sind, weiter gekennzeichnet durch: (a) ein apparentes Molekulargewicht von 38 kD; (b) einen pI bei über 9,3; (c) ein pH-Optimum in dem Bereich von pH 9 bis pH 11 (bei 25°C und mit Casein als Substrat); ein Temperaturoptimum bei um 40°C (bei pH 9,5 und mit Casein als Substrat), und eine relative Aktivität von um 60% bei 25°C (bei pH 9,5 und mit Casein als Substrat).
Protease nach Anspruch 1, die aus dem Stamm Bacillus sp. ZI 315, DSM 9702, erhältlich ist.
Verwendung einer Protease nach einem beliebigen der Ansprüche 1–2 als ein Waschmittelenzym.
Waschmittelzusammensetzung, umfassend eine Protease nach einem beliebigen der Ansprüche 1–2.
Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 4, die außerdem ein oder mehrere andere Enzyme, insbesondere eine Amylase, eine Lipase, eine Cellulase, eine Peroxidase oder eine Oxidase, umfasst.
Waschmittelzusatz, umfassend eine Protease nach einem beliebigen der Ansprüche 1–2, die in der Form eines nicht-staubenden Granulats, einer Flüssigkeit, insbesondere einer stabilisierten Flüssigkeit, einer Aufschlämmung oder eines geschützten Enzyms bereitgestellt ist.
Waschverfahren, umfassend das Zugeben einer Protease nach einem beliebigen der Ansprüche 1–2.
Waschverfahren nach Anspruch 7, umfassend das Zugeben einer Waschmittelzusammensetzung nach einem der Ansprüche 4–5.
Waschverfahren nach Anspruch 7, umfassend das Zugeben eines Waschmittelzusatzes nach Anspruch 6.