DE69434817T2

DE69434817T2 - Protease varianten

Info

Publication number: DE69434817T2
Application number: DE69434817T
Authority: DE
Inventors: Grethe Rasmussen; Egon Nielsen; Torben Halkier
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1993-04-01
Filing date: 1994-03-29
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2014-03-30
Also published as: FI954647A0; EP0694065A1; AU6424394A; DK39093D0; FI119026B; KR960701992A; KR100305140B1; US6087315A; FI954647A; WO1994023053A1; ATE335813T1; EP0694065B1; BR9406565A; DE69434817D1; JPH08508643A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteasevarianten, die gegenüber der durch Peroxidasesysteme verursachten Inaktivierung stabilisiert sind, in diesen Proteasevarianten ist ein natürlich vorkommender Tyrosinrest deletiert worden oder mit einem davon unterschiedlichen Aminosäurerest an einer oder mehreren Positionen substituiert worden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Stabilisierung einer Protease gegenüber der durch Peroxidasesysteme verursachten Inaktivierung, und Detergens-Zusammensetzungen umfassend eine Proteasevariante der Erfindung.
STAND DER TECHNIK
Peroxidasen (E.C. 1.11.1.7) sind Enzyme, die die Oxidation eines Substrates (eines Elektron- oder Wasserstoffdonators) mit Wasserstoffperoxid katalysieren. Solche Enyme sind mit mikrobiellem, pflanzlichem und tierischem Ursprung bekannt, z.B. die Peroxidase aus Coprinus cinereus (vgl. z.B. EP Patentanmeldung 179,486). Sie sind typische Hämoproteine, d.h. sie enthalten ein Häm als prostetische Gruppe.
Die Verwendung von Peroxidase zusammen mit Wasserstoffperoxid oder einem Wasserstoffperoxidvorläufer ist vorgeschlagen worden z.B. für das Bleichen von Pulpe für die Papierherstellung, für die Behandlung von Abwasser aus der Pulpeherstellung, für ein verbessertes Bleichen in Wäschedetergenzien, zur Inhibition des Farbstofftransfers während des Waschens, und zur Ligninmodifikation, d.h. in der Spanplattenherstellung.
Peroxidasesysteme (auch als POD-Systeme bezeichnet) umfassend ein Enzym, welches Peroxidaseaktivität zeigt, eine Wasserstoffperoxidquelle und ein peroxidasesteigerndes Mittel werden verwendet, um zu verhindern, dass überschüssige Farbe aus farbigen Geweben, welche aus den Geweben ausgewaschen wird wenn diese gewaschen werden, sich auf anderen Geweben, die in der gleichen Wäsche vorhanden sind, ablagern (dieses Phänomen ist allgemein bekannt als Farbstofftransfer). Detergens-Zusammensetzungen oder Waschflüssigkeiten umfassend solche Peroxidasesysteme sind in WO 92/18687 und WO 92/18683 beschrieben worden.
Ein wichtiger Nachteil bei dem Anwenden solcher Peroxidasesysteme auf Detergens-Zusammensetzungen ist, dass die in solchen Zusammensetzungen vorhandenen Enzyme stark durch das Peroxidasesystem beeinträchtigt sein können, wobei sie die Waschleistung der Detergens-Zusammensetzung behindern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist nun überraschenderweise gefunden worden, dass proteolytische Enzyme gegenüber der durch Peroxidasesysteme verursachten Inaktivierung stabilisiert werden durch Deletion oder Substitution von einem oder mehreren natürlich vorkommenden Tyrosinresten mit einem davon unterschiedlichen Aminosäurerest. Folglich stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit umfassend einen oberflächenaktiven Stoff, eine Pilzperoxidase und eine Variante von Subtilisin 309 Protease, wobei die Variante von Subtilisin 309 Protease gegenüber einer durch ein Peroxidasesystem verursachten Inaktivierung eine im Vergleich zum Elternenzym verbesserte Stabilität besitzt durch Deletieren oder Substituieren von einem oder mehreren natürlich vorkommenden Tyrosinresten in den Positionen 167, 171, 192 (BPN'-Nummerierung) mit einem Phanylalaninrest, einem Leucinrest, einem Isoleucinrest, einem Valinrest, einem Glutaminrest, einem Aparaginrest, einem Serinrest, einem Threoninrest, einem Glutaminsäurerest oder einem Histidinrest.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin illustriert durch Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen, in denen:
1 die Restaktivität (%) – nach 1 min. (schwarz), 5 min. (schraffiert) und 10 min. (weiß) – von Subtilisin 309 und Subtilisin 309/V104Y bei 35 °C in der Anwesenheit des POD-Systems, wie in Beispiel 4 beschrieben, zeigt.
AUSFÜHRLICHE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue Proteasevarianten bereit, welche gegenüber einer durch Peroxidasesysteme verursachten Inaktivierung stabilisiert sind. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung ist eine stabilisierte Protease eine Proteasevariante oder eine mutierte Protease, welche eine verbesserte Stabilität gegenüber einer durch Peroxidasesysteme verursachten Inaktivierung aufweist, wenn sie mit dem Elternenzym verglichen wird. Mit einer Proteasevariante oder einer mutierten Protease ist eine Protease gemeint, die durch Veränderung einer DNA-Nukleotidsequenz des Elterngens oder seiner Derivate erhalten werden kann. Die Proteasevariante oder die mutierte Protease können exprimiert und hergestellt werden, wenn die DNA-Nukleotidsequenz, die das Enzym kodiert, in einen geeigneten Vektor in einem geeigneten Wirtsorganismus insertiert wird. Der Wirtsorganismus ist nicht notwendigerweise identisch mit dem Organismus, aus dem das Elterngen stammt.
Aminosäuren
Als Abkürzungen für Aminosäuren werden die folgenden Symbole benutzt:
Peroxidaseaktivität
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird die enzymatische Aktivität von Peroxidasen in „Peroxidase-Einheiten" (Peroxidase Units, PODU) ausgedrückt. In der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid (E.C. 1.11.1.7) katalysieren die Peroxidasen die Dehydrierung von 2,2'-Azino-bis(3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonat) (ABTS). Die produzierte grünlichblaue Farbe wird photometrisch bei 418 nm überwacht. Eine PODU ist die Menge an Enzym, welche unter Standardbedingungen (d.h. pH 7,0; Wasserstoffperoxid als Substrat; 0,1 M Phosphatpuffer; eine Inkubationstemperatur von 30 °C; eine Inkubationszeit von 3 min. kinetisch gemessen) die Umwandlung von 1 μmol Wasserstoffperoxid pro Minute katalysiert.
Proteaseaktivität
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wurde die enzymatische Aktivität von Subtilisinen gemessen, indem chromogene Substrate verwendet wurden. Die Inkubation von Proteasen mit diesen Substraten führt zu der Spaltung der Substrate und der Freisetzung von p-Nitroanilin, was spektrophotometrisch bei 405 nm detektiert wird.
Subtilisine werden analysiert, indem das Substrat N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid (0,8 mM in 20 mM Natriumphosphatpuffer; pH 8,5 oder 0,8 mM in 20 mM Britton-Robinsonpuffer, pH 8,5) verwendet wird. Die Inkubation wird bei 25 °C durchgeführt und spektrophotometrisch für 4 min. verfolgt. Die Konzentration der Protease ist so gewählt, dass die Freisetzung von p-Nitroanilin während der ganzen Analyse linear ist.
Peroxidasesysteme
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung ist ein Peroxidasesystem ein System umfassend eine Peroxidase oder eine Verbindung, die Peroxidaseaktivität zeigt, eine Wasserstoffperoxidquelle, und ein peroxidaseverstärkendes Mittel. Solche Peroxidasesysteme sind verwendet worden, um eine Farbstofftransfer-Inhibierung zu erreichen und sind z.B. in den internationalen Patentanmeldungen WO 92/18687 und WO 92/18683 beschrieben worden.
In solch einem Peroxidasesystem kann die Peroxidase, oder die Verbindung, die Peroxidaseaktivität zeigt, jede Peroxidase sein, welche durch die Enzymklassifikation EC 1.11.1.7 umfasst ist, oder jedes davon abgeleitete Fragment, welches Peroxidaseaktivität zeigt, oder synthetische oder semisynthetische Derivate davon (z.B. Porphyrin-Ringsysteme oder Mikroperoxidasen, vgl. z.B. US-Patent 4,077,768, EP Patentanmeldung 537,381, internationale Patentanmeldungen WO 91/05858 und WO 92/16634). Solche Peroxidasen sind bekannt mit mikrobiellem, pflanzlichem und tierischem Ursprung.
Die Peroxidase kann durch Pflanzen (z.B. Meerrettich- oder Sojabohnenperoxidase) oder Mikroorganismen wie zum Beispiel Pilzen oder Bakterien produzierbar sein. Einige bevorzugte Pilze schließen Stämme, die zu der Unterabteilung Deuteromycotina, Klasse-Hyphomyceten gehören ein, z.B. Fusarium, Humicola, Tricoderma, Myrothecium, Verticillum, Arthromyces, Caldariomyces, Ulocladium, Embellisia, Cladosporium oder Dreschlera, insbesondere Fusarium oxysporum (DSM 2672), Humicola insolens, Trichoderma resii, Myrothecium verrucana (IFO 6113), Verticillum alboatrum, Verticillum dahlie, Arthromyces ramosus (FERM P-7754), Caldariomyces fumago, Ulocladium chartarum, Embellisia alli oder Dreschlera halodes.
Andere bevorzugte Pilze schließen Stämme ein, die zu der Unterabteilung Basidiomycotina, Klasse-Basidiomyceten gehören, z.B. Coprinus, Phanerochaete, Coriolus oder Trametes, insbesondere Coprinus cinereus f. Microsporus (IFO 8371), Coprinus macrorhizus, Phanerochaete chrysosporium (z.B. NA-12) oder Trametes (früher Polyporus genannt), z.B. T. versicolor (z.B. PR4 28-A).
Weiter bevorzugte Pilze schließen Stämme ein, die zu der Unterabteilung Zygomycotina, Klasse-Mycoraceae gehören, z.B. Rhizopus oder Mucor, insbesondere Mucor hiemalis.
Einige bevorzugte Bakterien schließen Stämme der Gattung Actinomycetales ein, z.B. Streptomyces spheroides (ATTC 23965), Streptomyces thermoviolaceus (IFO 12382) oder Streptoverticillum verticillium ssp. verticillium.
Andere bevorzugte Bakterien schließen Bacillus pumilus (ATCC 12905), Bacillus stearothermophilus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodomonas palustri, Streptococcus lactis, Pseudomonas purrocinia (ATCC 15958) oder Pseudomonas fluorescens (NRRL B-11) ein.
Weiter bevorzugte Bakterien schließen Stämme ein, die zu Myxococcus gehören, z.B. M. virescens.
Andere mögliche Quellen für verwendbare spezielle Peroxidasen sind in Saunders B C et al., Peroxidase, London Butterworth, 1964, S. 41-43 aufgelistet.
Die Peroxidase kann weiterhin eine sein, die durch ein Verfahren herstellbar ist, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, transformiert mit einem rekombinanten DNA-Vektor, welcher eine DNA-Sequenz kodierend für diese Peroxidase, ebenso wie DNA-Sequenzen kodierend für Funktionen, welche die Expression der DNA-Sequenz, die die Peroxidase kodiert, ermöglichen, trägt, in einem Kulturmedium unter Bedingungen umfasst, welche die Expression der Peroxidase und das gewinnen der Peroxidase aus der Kultur ermöglichen.
Insbesondere ist eine rekombinant hergestellte Peroxidase eine Peroxidase abgeleitet von einer Coprinus sp., insbesondere C. macrorhizus oder C. cinereus gemäß WO 92/16634.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung umfassen Verbindungen, die Peroxidaseaktivität zeigen, Peroxidase-aktive Fragmente abgeleitet von Cytochromen, Hämoglobin oder Peroxidaseenzymen und synthetische oder semisynthetische Derivate davon, z.B. Eisenporphine, Eisenporphyrine, und Eisenphthalocyanin und Derivate davon.
In einem Peroxidasesystem kann der Verstärker ein oxidierbares Substrat z.B. Metallionen oder phenolische Verbindungen wie z.B. 7-Hydroxycoumarin (7HCm), Vanillin (VAN) und p-Hydroxybenzensulfonat (pHBS) sein, beschrieben z.B. in den internationalen Patentanmeldungen WO 92/18683 und WO 92/18687 und Kato M und Shimizu S, Plant Cell Physiol. 1985 26 (7), S. 1291-1301 (vgl. insbesondere Tabelle 1), und Saunders B C et al., Peroxidase, London Butterworths, 1964, S. 141 ff. oder 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat) (ABTS), beschrieben in WO 93/00394.
Proteasevarianten
Eine Proteasevariante der Erfindung, stabilisiert gegenüber einer durch Peroxidasesysteme verursachten Inaktivierung, kann eine Variante jedes proteolytischen Enzyms sein, welches geeignet ist für die Beimischung in ein Detergens.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung umfassen solche proteolytischen Enzyme alkalische Proteasen, Subtilisine (z.B. Bacillus lentus Proteasen, Bacillus amyloliguefaciens Proteasen und Bacillus licheniformis Proteasen), Trypsin-artige Proteasen (z.B. Fusarium Proteasen, internationale Patentanmeldung WO 89/06270) und lytische Proteasen (z.B. Nocardiopsis Proteasen, internationale Patentanmeldung WO 88/03947).
Subtilisine
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung ist ein Subtilisin definiert als eine Serin-Protease produziert durch gram-positive Bakterien oder Pilze. Nach einer anderen Definition ist ein Subtilisin eine Serin-Protease, wobei die relative Reihenfolge der Aminosäurereste in der katalytischen Triade Asp-His-Ser ist (Positionen 32, 64 und 221, BPN'-Nummerierung).
Bevorzugte Subtilisine sind Bacillus lentus Proteasen, z.B. Subtilisin 309 und Subtilisin 147, Bacillus amyloliguefaciens Proteasen, z.B. Subtilisin BPN', und Bacillus licheniformis Proteasen, z.B. Subtilisin Carlsberg.
Aminosäurenummerierung
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird eine spezifische Nummerierung von Aminosäurerest-Positionen in Subtilisinen angewandt. Durch Abgleich der Aminosäuresequenzen von verschiedenen Subtilisinen mit Subtilisin BPN' ist es möglich, einer Nummer einer Aminosäurerest-Position in jedem Subtilisin die Nummer der analogen Aminosäure-Position in Subtilisin BPN' zuzuordnen („BPN'-Nummerierung", siehe z.B. internationale Patentanmeldungen WO 89/06279 und WO 91/00345).
Um die zahlreichen Proteasevarianten zu beschreiben, welche erfindungsgemäß produziert oder in Erwägung gezogen wurden, wurden die folgenden Nomenklaturen zur einfacheren Bezugnahme angepasst:
[Ursprüngliche Aminosäure; Position; substituierte Aminosäure]
Entsprechend wird die Substitution von Tyrosin mit Phenylalanin in Position 209 bezeichnet als:
Y209F
Die Deletion einer Asparaginsäure an Position 36 wird angegeben als: D36*, und eine Insertion in solch einer Position wird angegeben als: 36D für eine Insertion einer Asparaginsäure in Position 36.
Mehrfache Mutationen sind durch Pluszeichen getrennt, z.B.:
Y167I+Y209F
was Mutationen in den Positionen 167 und 209 darstellt, wobei Tyrosin mit Isoleucin bzw. Phenylalanin substituiert wird.
Wenn eine Substitution durch Mutation in z.B. Subtilisin 309 durchgeführt wird, wird das Produkt z.B. als „Subtilisin 309/Y209F" bezeichnet.
Alle Positionen, die in diesem Zusammenhang im Hinblick auf Subtilisine genannt werden, beziehen sich auf die BPN'-Nummern, die vorstehend beschrieben wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Proteasevariante der Erfindung ein Subtilisin, welches in einer oder mehreren der folgenden Positionen verändert worden ist: 6, 57, 91, 104, 143, 167, 171, 192, 206, 209, 214, 256, 262, 263, stärker bevorzugt 104, 167, 171, 192 (BPN'-Nummerierung).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Proteasevariante der Erfindung Subtilisin 309, Subtilisin 147, Subtilisin BPN' oder Subtilisin Carlsberg.
Verfahren um Proteasen zu stabilisieren
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Stabilisierung proteolytischer Enzyme gegenüber einer durch Peroxidasesysteme verursachten Inaktivierung bereit, bei diesem Verfahren werden eine oder mehrere natürlich vorkommende Tyrosinreste deletiert oder mit davon unterschiedlichen Aminosäureresten substituiert.
Rekombinant hergestellte Enzyme
In der Vergangenheit sind viele Prozesse für die Herstellung von Polypeptiden oder Proteinen mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie entwickelt worden. Für diesen Zweck werden meistens E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae und unterschiedliche Aspergillus-Stämme, z.B. A. oryzae und A. niger verwendet.
Biosynthetische Expression von Polypeptiden
Bei der Transformation eines Organismus, bei der die Herstellung eines Polypeptids oder eines Proteins beabsichtigt ist, wird eine DNA-Sequenz in den Organismus eingeführt. Die Sequenz enthält die kodierende Region des interessierenden Gens, flankiert durch Transkriptions-/Translations-Startsignale und Transkriptions-/Translations-Terminierungssignale. Die kodierende Region enthält Einheiten von drei Basenpaaren, Kodons genannt, welche bei der Translation der transkribierten Gene in Aminosäuren translatiert werden, welche wiederum zusammengesetzt werden, um das interessierende Polypeptid zu ergeben.
Einführen von Mutationen in Polypeptide
Durch Wechseln eines oder mehrerer spezifischer Kodons in der kodierenden Region und Transformieren des Wirts-Mikroorganismus mit diesen neu kodierenden Regionen können neue Polypeptide hergestellt werden, welche sich von dem Originalpolypeptid durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheiden. Solche Veränderungen können eingeführt werden durch das Mittel einer Technik, die allgemein als „side-directed in vitro mutagenesis" (ortsgerichtete in vitro Mutagenese) bekannt ist. Eine Anzahl von Verfahren ist veröffentlicht worden. Ein frühes Verfahren wird beschrieben durch Zoller & Smith, DNA 1984 3 (6) 479-488, und bezieht die Verwendung des einzelsträngigen M13-Bakteriophagen ein. Ein bevorzugtes Verfahren, bei dem PCR (polymerase chain reaction; Polymerase-Kettenreaktion) verwendet wird, ist durch Nelson & Long, Analytical Biochemistry, 1989 180 147-151 beschrieben. Es bezieht eine 3-Schrittgenerierung eines PCR-Fragmentes ein, welches die gewünschte Mutation enthält, durch Verwenden eines chemisch synthetisierten DNA-Oligonukleotides, als einen der Primer in den PCR-Reaktionen. Aus dem PCR-generierten Fragment kann ein DNA-Fragment, welches die Mutation trägt, durch Spalten mit Restriktionsenzymen und wieder Insertieren in das Expressionsplasmid isoliert werden. Ein drittes Mutageneseverfahren nutzt die Restriktionsschnittstellen in der kodierenden DNA-Region aus. Durch Verdauen der DNA mit Restriktionsenzymen an Stellen, die das Mutageneseziel flankieren, künstliches Synthetisieren eines neuen Fragments, das die gewünschte Mutation enthält und Klonieren dieses neuen Fragments zwischen die Restriktionsschnittstellen, kann eine mutierte kodierenden Region konstruiert werden.
Alle Verfahren sind generell anwendbar auf Untersuchungen in dem Protein-Engineering genannten Gebiet, der sich mit der Entwicklung von Polypeptiden mit neuen oder veränderten Eigenschaften beschäftigt.
Die Transformation und Expression kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren ausgeführt werden, z.B. wie in der europäischen Patentanmeldung 305,216, beschrieben, deren Beschreibung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Die Mikroorganismen, die in der Lage sind, ein stabilisiertes Enzym dieser Erfindung zu produzieren, können durch konventionelle Fermentationsverfahren in einem Nährmedium, das verwertbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit anderen essentiellen Nährstoffen enthält, kultiviert werden, wobei das Medium nach den im Stand der Technik bekannten Prinzipien zusammengesetzt ist. Die Reinigung und Gewinnung des stabilisierten Enzyms kann auch nach per se bekannten Methoden ausgeführt werden.
Klonieren eines Proteasegens
Das Gen, welches für das proteolytische Enzym kodiert, kann aus jedem beliebigen grampositiven Bakterium oder Pilz durch eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren kloniert werden. Erst muss eine genomische und/oder cDNA-Bibliothek von DNA konstruiert werden, in dem chromosomale DNA oder Messenger-RNA des Organismus, welcher die zu studierende Protease produziert, verwendet wird. Dann, falls die Aminosäuresequenz der Protease bekannt ist, können homologe Oligonukleotid-Sonden synthetisiert, markiert und verwendet werden, um die Protease-kodierenden Klone aus einer genomischen Bibliothek bakterieller DNA oder einer Pilz-cDNA-Bibliothek zu identifizieren. Alternativ könnte eine markierte Oligonukleotid-Sonde enthaltend Sequenzen, die homolog zu einer Protease eines anderen Bakterien- oder Pilzstammes sind, als Sonde verwendet werden, um Protease-kodierende Klone zu identifizieren, indem Hybridisierungs- und Waschbedingungen von niedriger Stringenz verwendet werden.
Noch ein anderes Verfahren zur Identifizierung Protease-produzierender Klone würde das Insertieren von Fragmenten genomischer DNA in einen Expressionsvektor wie z.B. einem Plasmid, transformieren der Protease-negativen Bakterien mit der resultierenden genomischen DNA-Bibliothek und dann Ausplattieren der transformierten Bakterien auf Agar, enthaltend ein Protease-Substrat wie Magermilch, einschließen. Diese Bakterien, die das Protease-tragende Plasmid enthalten, werden Kolonien bilden, die, auf Grund des Verdaus der Magermilch durch ausgeschiedene proteolytische Enzyme, von einem Hof klaren Agars umgeben sind.
Generierung- von ortsgerichteter Mutationen in dem Proteasegen
Sobald das Proteasegen kloniert worden ist und wünschenswerte Stellen für die Mutagenese identifiziert wurden, können die Mutationen eingefügt werden, indem synthetische Oligonukleotide verwendet werden. Diese Oligonukleotide enthalten Nukleotidsequenzen, die die gewünschten Mutations-Stellen flankieren, mutierte Nukleotide werden während der Oligonukleotidsynthese eingefügt. In einem bevorzugten Verfahren wird eine einzelsträngige DNA-Lücke, welche das Proteasegen überbrückt, in einem Vektor erstellt, der das Proteasegen trägt. Dann wird das synthetische Nukleotid, das die gewünschte Mutation trägt, an einen homologen Teil der einzelsträngigen DNA angelagert. Die verbleibende Lücke wird dann durch DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) aufgefüllt und das Konstrukt wird, indem T4-Ligase verwendet wird, legiert. Ein spezifisches Beispiel für dieses Verfahren ist beschrieben in [Morinaga et al., Biotechnology, 1984 2 646-639]. Nach Morinaga et al. wird ein Fragment innerhalb des Gens entfernt, indem eine Restriktionsendonuklease verwendet wird. Der Vektor/das Gen, der/das nun eine Lücke enthält, wird dann denaturiert und mit einem Vektor/Gen hybridisiert, welcher/welches an statt eine Lücke zu enthalten mit einer anderen Restriktionsendonuklease an einer Stelle außerhalb des Bereichs, der in die Lücke einbezogen war, geschnitten worden ist. Eine einzelsträngige Region des Gens ist dann für die Hybridisierung mit mutierten Oligonukleotiden verfügbar, die Lücke wird durch das Klenow Fragment der DNA Polymerase I gefüllt, die Insertionen werden mit T4 DNA Ligase ligiert, und, nach einem Replikationszyklus, wird ein doppelsträngiges Plasmid, welches die gewünschte Mutation trägt, hergestellt. Das Morinaga-Verfahren umgeht die zusätzliche Manipulation des Erstellens neuer Restriktionsschnittstellen, und beschleunigt daher die Generierung von Mutationen an vielfachen Stellen. Das US Patent 4,760,025 offenbart die Einführung von Oligonukleotiden, die vielfache Mutationen tragen, durch Ausführen geringfügiger Mutationen an der Kassette. Allerdings kann eine noch größere Vielfalt an Mutationen zu einem bestimmten Zeitpunkt durch das Morinaga-Verfahren eingeführt werden, da eine Menge Oligonukleotide verschiedener Längen eingeführt werden kann.
Expression von Proteasevarianten
Erfindungsgemäß kann ein mutiertes Proteasegen, welches nach den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, oder nach jedem beliebigen Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, in Enzymform exprimiert werden kann, in dem ein Expressionsvektor verwendet wird. Ein Expressionsvektor fällt generell unter die Definition eines Klonierungsvektors, da ein Expressionsvektor üblicherweise die Bestandteile eines typischen Klonierungsvektors einschließt, nämlich ein Element, das die autonome Replikation des Vektors in einem Mikroorganismus unabhängig vom Genom des Mikroorganismus erlaubt, und ein oder mehrere phenotypische Marker für Selektionszwecke. Ein Expressionsvektor schließt Kontrollsequenzen kodierend für einen Promotor, einen Operator, eine Ribosomenbindestelle, ein Translations-Initiationssignal und gegebenenfalls ein Repressorgen oder eine Vielzahl von Aktivatorgenen ein.
Um die Sekretion des exprimierten Proteins zu ermöglichen können Nukleotide, die für eine „Signalsequenz" kodieren vor die kodierende Sequenz des Gens insertiert werden. Für die Expression unter der Führung der Kontrollsequenzen wird ein Zielgen, welches erfindungsgemäß behandelt werden soll, funktionsfähig in dem geeigneten Leserahmen mit den Kontrollsequenzen verknüpft. Promotorsequenzen, die in Plasmidvektoren inkorporiert werden und welche die Transkription des mutierten Proteasegens unterstützen können, schließen den prokaryotischen β-Lactamase-Promotor [Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1978 75 3727-3731] und den tac-Promotor [DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1983 80 21-25] ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Weitere Referenzen können auch in „Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980 242 74-94 gefunden werden.
Nach einer Ausführungsform wird B. subtilis durch einen Expressionsvektor transformiert, der die mutierte DNA trägt. Falls die Expression in einem sekretierenden Mikroorganismus wie zum Beispiel B. subtilis stattfinden, soll, kann eine Signalsequenz dem Translations-Initiations-Signal folgen und der interessierenden DNA-Sequenz vorangehen. Die Signalsequenz wirkt indem das Expressionsprodukt an die Zellwand transportiert wird, wo es nach der Sekretion vom Produkt abgeschnitten wird. Der Begriff „Kontrollsequenzen" wie vorstehend beschrieben soll eine Signalsequenz, falls sie vorhanden ist, einschließen.
Die Mikroorganismen, die in der Lage sind, ein stabilisiertes Enzym dieser Erfindung herzustellen, können durch konventionelle Fermentationsverfahren in einem Nährmedium, das verwertbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit anderen essentiellen Nährstoffen enthält, kultiviert werden, das Medium ist dann in Übereinstimmung mit den im Stand der Technik bekannten Prinzipien zusammengesetzt.
Das Protein der Proteasevariante, welches von der Wirtszelle sekretiert wird, kann in geeigneter Weise durch gut bekannte Arbeitsverfahren aus dem Kulturmedium gewonnen werden, die das Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, und Präzipitieren proteinöser-Bestandteile des Mediums durch ein Salz wie zum Beispiel Ammoniumsulfat, gefolgt durch chromatographische Arbeitsverfahren wie zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, oder ähnliches einschließen.
Nukleotidsequenzen, Expressionsvektoren und Mikroorganismen
Diese Erfindung betrifft auch DNA-Nukleotidsequenzen, die eine stabilisierte Proteasevariante der Erfindung kodieren. Die stabilisierte Enzymvariante kann exprimiert und produziert werden, wenn die DNA-Nukleotidsequenz, die dieses Enzym kodiert, in einen geeigneten Vektor in einen geeigneten Wirtsorganismus insertiert wird. Der Wirtsorganismus ist nicht notwendigerweise identisch mit dem Organismus, aus dem das Elterngen stammte.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Expressionsvektoren und Wirtsorganismen, die ein DNA-Nukleotid enthalten, welches für eine stabilisierte Proteasevariante dieser Erfindung kodiert.
Detergens-Zusammensetzungen
Erfindungsgemäß kann die Proteasevariante typischerweise ein Bestandteil einer Detergens-Zusammensetzung sein. Als solche kann sie in der Detergens-Zusammensetzung in der Form von nicht-staubendem Granulat, einer stabilisierten Flüssigkeit, oder einem geschützten Enzym eingeschlossen sein. Nicht-staubende Granulate können hergestellt werden, z. B. wie offenbart in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide von Novo Industri A/S) und können gegebenenfalls durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, beschichtet sein. Beispiele für wachsartige Beschichtungsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)-Produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit mittleren Molekulargewichten von 1000 bis 20000, ethoxylierte Nonylphenole, die 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten besitzen; ethoxylierte Fettalkohole, in denen der Alkohol 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und in denen 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten gibt; Fettalkohole; Fettsäuren; und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende Beschichtungsmaterialien, welche für eine Anwendung in Flüssigbetttechniken geeignet sind, werden in dem Patent GB 1483591 gegeben. Flüssige Enzymzubereitungen können zum Beispiel durch Hinzufügen eines Polyols, wie zum Beispiel Propylenglycol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, von Milchsäure oder Borsäure nach etablierten Verfahren stabilisiert werden. Andere Enzymstabilisatoren sind im Stand der Technik gut bekannt. Geschützte Enzyme können nach dem in EP 238,216 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
Die Detergens-Zusammensetzung der Erfindung kann in jeder geeigneten Form, z. B. als Pulver, Kügelchen, Paste oder Flüssigkeit vorliegen. Ein flüssiges Detergens kann wässrig sein, typischerweise enthält es bis zu 70 % Wasser und 0-30 % eines organischen Lösungsmittels, oder es ist nicht-wässrig.
Die Detergens-Zusammensetzung umfasst eine oder mehrere oberflächenaktive Substanz(en), jede davon kann anionisch, nicht ionisch, kationisch oder zwitterionisch sein. Das Detergens wird üblicherweise 0-50 % einer anionischen oberflächenaktiven Substanz enthalten, wie zum Beispiel lineares Alkylbenzensulfonat (LAS), Alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkoholethoxysulfat (AEOS oder AES), sekundäre Alkansulfonate (SAS), Alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkyl- oder Alkenyl-Bernsteinsäure oder Seife. Es kann auch 0-40 % von einer nicht-ionischen oberflächenaktiven Substanz, wie zum Beispiel Alkoholethoxylat (AEO oder AE), carboxylierte Alkoholethoxylate, Nonylphenolethoxylat, Alkylpolyglycosid, Alkyldi methylaminoxid, ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid, Fettsäuremonoethanolamid, oder Polyhydroxyalkylfettsäureamid (z. B. wie in WO 92/06154 beschrieben) enthalten.
Die Detergens-Zusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere Enzyme) enthalten, wie zum Beispiel Amylase, Zellulase, Cutinase, Lipase, Peroxidase oder Oxidase.
Das Detergens kann 1-65 % eines Detergens-Builders oder eines Komplex-Bildners wie zum Beispiel Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosponat, Zitrat, Nitrilotriessigsäure (NTE/NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTMPA), Alkyl- oder Alkenyl-Bernsteinsäure, lösliche Silikate oder Phyllosilikate (z. B. SKS-6 von Hoechst) enthalten. Das Detergens kann auch ohne Builder-System sein, d.h. im Wesentlichen frei von Detergens-Builder.
Das Detergens kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind Carboxymethylcellulose (CMC), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenglycol (PEG), Polyvinylalkohol (PVA), Polycarboxylate wie zum Beispiel Polyacrylate, Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymere und Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymere.
Das Detergens kann ein Bleichsystem enthalten, welches eine H₂O₂-Quelle enthalten kann, wie zum Beispiel Perborat oder Percarbonat, welche mit einem Persäure bildenden Bleichaktivator wie zum Beispiel Tetraacetylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzensulfonat (MOBS) kombiniert sein kann. Alternativ kann das Bleichsystem Peroxysäuren vom z. B. Amid-, Imid- oder Sulfontyp umfassen.
Die Enzyme der Detergens-Zusammensetzung der Erfindung können stabilisiert werden, indem konventionelle Stabilisierungsmittel verwendet werden, z. B. ein Polyol, wie zum Beispiel Propylenglycol oder Glycerol, ein Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure, Borsäure, oder ein Borsäurederivat wie z. B. ein aromatischer Boratester, und die Zusammensetzung kann formuliert werden wie z. B. in WO 92/19709 und WO 92/19708 beschrieben.
Das Detergens kann auch andere konventionelle Detergensinhaltsstoffe enthalten wie zum Beispiel Gewebeverbesserer (fabric conditioners) einschließlich Tonerden (clays), Schaumverstärker, Schaumunterdrücker, Anti-Korrosionsmittel, Schmutz-suspendierende Mittel (soil-suspending agents), Mittel gegen Rückverschmutzung (anti-soil redeposition agents), Farbstoffe, Bakteriozide, optische Aufheller oder Parfum.
Der pH (gemessen in einer wässrigen Lösung bei der verwendeten Konzentration) wird üblicherweise neutral oder alkalisch sein, z. B. 7-11.
Spezielle Formen von Detergens-Zusammensetzungen innerhalb des Umfangs der Erfindung schließen ein:

1) Eine Detergens-Zusammensetzung formuliert als ein Granulat, welches eine Raumdichte von mindestens 600 g/l besitzt, umfassend

– lineares Alkylbenzensulfonat (berechnet als Säure)	7-12 %
– Alkoholethoxysulfat (z. B. C_12-18-Alkohol, 1-2 EO) oder Alkylsulfat (z. B. C_16-18)	1-4 %
– Alkoholethoxylat (z. B. C_14-15-Alkohol, 7 EO)	5-9 %
– Natriumcarbonat (als/wie Na₂CO₃)	14-20 %
– lösliches Silikat (als/wie Na₂O, 2SiO₂)	2-6 %
– Zeolith (als/wie NaAlSiO₄)	15-22 %
– Natriumsulfat (als/wie Na₂SO₄)	0-6 %
– Natriumcitrat/Zitronensäure (als/wie C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)	0-15 %
– Natriumperborat (als/wie NaBO₃·H₂O)	11-18 %
– TAED	2-6 %
– Carboxymethylcellulose	0-2 %
– Polymere (z. B. Maleinsäure-/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG)	0-3 %
– Enzyme	0-5 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. Schaumunterdrücker, Parfum, optische Aufheller, Fotobleiche)	0-5 %

2. Eine Detergens-Zusammensetzung formuliert als ein Granulat, welches eine Raumdichte von mindestens 600 g/l aufweist, umfassend

– lineares Alkylbenzensulfonat (berechnet als Säure)	6-11 %
– Alkoholethoxysulfat (z. B. C_12-18-Alkohol, 1-2 EO) oder oder Alkylsulfat (z. B. C_16-18)	1-3 %
– Alkoholethoxylat (z. B. C_14-15-Alkohol, 7 EO)	5-9 %
– Natriumcarbonat (als/wie Na₂CO₃)	15-21 %
– lösliches Silikat (als/wie Na₂O, 2SiO₂)	1-4 %

– Zeolith (als/wie NaAl SiO₄)	24-34 %
– Natriumsulfat (als/wie Na₂SO₄)	4-10 %
– Natriumcitrat/Zitronensäure (als/wie C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)	0-15 %
– Carboxymethylcellulose	0-2 %
– Polymere (z. B. Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG)	1-6 %
– Enzyme	0-5 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. Schaumunterdrücker, Parfum)	0-5 %

3) Eine Detergens-Zusammensetzung, formuliert als ein Granulat, welches eine Raumdichte von mindestens 600 g/l aufweist, umfassend

– lineares Alkylbenzensulfonat (berechnet als Säure)	5-9 %
– Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15-Alkohol, 7 EO)	7-14 %
– Seife als Fettsäure (z. B. C_16-22)	1-3 %
– Natriumcarbonat (als/wie Na₂CO₃)	10-17 %
– lösliches Silikat (als/wie Na₂O, 2SiO₂)	3-9 %
– Zeolith (als/wie NaAl SiO₄)	23-33 %
– Natriumsulfat (als/wie Na₂SO₄)	0-4 %
– Natriumperborat (als/wie NaBO₃·H₂O)	8-16 %
– TAED	2-8 %
– Phosphonat (z. B. EDTMPA)	0-1 %
– Carboxymethylcellulose	0-2 %
– Polymere (z. B. Maleinsäure-/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG)	1-3 %
– Enzyme	0-5 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. Schaumunterdrücker, Parfum, optischer Aufheller)	0-5 %

4) Eine Detergens-Zusammensetzungm, formuliert als ein Granulat, welches eine Raumdichte von mindestens 600 g/l aufweist, umfassend

– lineares Alkylbenzensulfonat (berechnet als Säure)	8-12 %
– Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15-Alkohol, 7 EO)	10-25 %
– Natriumcarbonat (als/wie Na₂CO₃)	14-22 %
– lösliches Silikat (als/wie Na₂O, 2SiO₂)	1-5 %
– Zeolith (als/wie NaAlSiO₄)	25-35 %
– Natriumsulfat (als/wie Na₂SO₄)	0-10 %

– Carboxymethylcellulose	0-2 %
– Polymere (z. B. Maleinsäure-/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG)	1-3 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. Schaumunterdrücker, Parfum)	0-5 %
– Enzyme	0-5 %

5) Eine wässrige, flüssige Detergens-Zusammensetzung umfassend

– lineares Alkylbenzensulfonat (berechnet als Säure)	15-21 %
– Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15-Alkohol, 7 EO oder C_12-15-Alkohol, 5 EO)	12-18 %
– Seife als Fettsäure (z. B. Ölsäure)	3-13 %
– Alkenyl-Bernsteinsäure (C_12-14)	0-13 %
– Aminoethanol	8-18 %
– Zitronensäure	2-8 %
– Phosphonat	0-3 %
– Polymere (z. B. PVP, PEG)	0-3 %
– Borat (als/wie B₄O₇)	0-2 %
– Ethanol	0-3 %
– Propylenglycol	8-14 %
– Enzyme	0-5 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. Dispergiermittel, Schaumunterdrücker, Parfum, optischer Aufheller)	0-5 %

6) Eine wässrige, strukturierte, flüssige Detergens-Zusammensetzung umfassend

– lineares Alkylbenzensulfonat (berechnet als Säure)	15-21 %
– Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15-Alkohol, 7 EO oder C_12-15-Alkohol, 5 EO)	3-9 %
– Seife als Fettsäure (z. B. Ölsäure)	3-10 %
– Zeolith (als/wie NaAlSiO₄)	14-22 %
– Kaliumcitrat	9-18 %
– Borat (als/wie B₄O₇)	0-2 %
– Carboxymethylcellulose	0-2 %
– Polymere (z. B. PEG, PVP)	0-3 %
– Ankerpolymere wie z. B. Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymer; molares Verhältnis 25:1; MW 3800	0-3 %

– Glycerol	0-5 %
– Enzyme	0-5 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. Dispergiermittel, Schaumunterdrücker, Parfum, optischer Aufheller)	0-5 %

7) Eine Detergens-Zusammensetzung, formuliert als ein Granulat, welches eine Raumdichte von mindestens 600 g/l aufweist, umfassend

– Fettalkoholsulfat	5-10 %
– ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid	3-9 %
– Seife als Fettsäure	0-3 %
– Natriumcarbonat (als/wie Na₂CO₃)	5-10 %
– lösliches Silikat (als/wie Na₂O, 2SiO₂)	1-4 %
– Zeolith (als/wie NaAlSiO₄)	20-40 %
– Natriumsulfat (als/wie Na₂SO₄)	2-8 %
– Natriumperborat (als/wie NaBO₃·H₂O)	12-18 %
– TAED	2-7 %
– Polymere (z. B. Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer, PEG)	1-5 %
– Enzyme	0-5 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. optischer Aufheller, Schaumunterdrücker, Parfum)	0-5 %

8) Eine Detergens-Zusammensetzung, formuliert als ein Granulat, umfassend

– lineares Alkylbenzensulfonat (berechnet als Säure)	8-14 %
– ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid	5-11 %
– Seife als Fettsäure	0-3 %
– Natriumcarbonat (als/wie Na₂CO₃)	4-10 %
– lösliches Silikat (als/wie Na₂O, 2SiO₂)	1-4 %
– Zeolith (als/wie NaAlSiO₄)	30-50 %
– Natriumsulfat (als/wie Na₂SO₄)	3-11 %
– Natriumcitrat (als/wie C₆H₅Na₃O₇)	5-12 %
– Polymere (z. B. PVP, Maleinsäure-/Acrylsäure-Copolymer, PEG)	1-5 %
– Enzyme	0-5 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. Schaumunterdrücker, Parfum)	0-5 %

9) Eine Detergens-Zusammensetzung, formuliert als ein Granulat, umfassend

– lineares Alkylbenzensulfonat (berechnet als Säure)	6-12 %
– nicht-ionischer oberflächenaktiver Stoff	1-4 %
– Seife als Fettsäure	2-6 %
– Natriumcarbonat (als/wie Na₂CO₃)	14-22 %
– Zeolith (als/wie NaAlSiO₄)	18-32 %
– Natriumsulfat (als/wie Na₂SO₄)	5-20 %
– Natriumcitrat (als/wie C₆H₅Na₃O₇)	3-8 %
– Natriumperborat (als/wie NaBO₃·H₂O)	4-9 %
– Bleichaktivator (z. B. NOBS oder TAED)	1-5 %
– Carboxymethylcellulose	0-2 %
– Polymere (z. B. Polycarboxylat oder PEG)	1-5 %
– Enzyme	0-5 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. optischer Aufheller, Parfum)	0-5 %

10) Eine wässrige, flüssige Detergens-Zusammensetzung, umfassend

– lineares Alkylbenzensulfonat (berechnet als Säure)	15-23 %
– Alkoholethoxysulfat (z. B. C_12-15-Alkohol, 2-3 EO)	8-15 %
– Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15-Alkohol, 7 EO oder C_12-15-Alkohol, 5 EO)	3-9 %
– Seife als Fettsäure (z. B. Laurinsäure)	0-3 %
– Aminoethanol	1-5 %
– Natriumcitrat	5-10 %
– Hydrotrope Verbindung (z. B. Natriumtoluensulfonat)	2-6 %
– Borat (als/wie B₄O₇)	0-2 %
– Carboxymethylcellulose	0-1 %
– Ethanol	1-3 %
– Propylenglycol	2-5 %
– Enzyme	0-5 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. Polymere, Dispergiermittel, Parfum, optische Aufheller)	0-5 %

11) Eine wässrige, flüssige Detergens-Zusammensetzung, umfassend

– lineares Alkylbenzensulfonat (berechnet als Säure)	20-32 %
– Alkoholethoxylat (z. B. C_12-15-Alkohol, 7 EO oder C_12-15-Alkohol, 5 EO)	6-12 %
– Aminoethanol	2-6 %
– Zitronensäure	8-14 %
– Borat (als/wie B₄O₇)	1-3 %
- Polymer (z. B. Maleinsäure-/Acrylsäure-Copolymer, Ankerpolymere wie z. B. Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymer und CMC)	0-3 %
– Glycerol	3-8 %
– Enzyme	0-5 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. hydrotrophe Verbindungen, Dispergiermittel, Parfum, optische Aufheller)	0-5 %

12) Eine Detergens-Zusammensetzung, formuliert als ein Granulat, welches eine Raumdichte von mindestens 600 g/l aufweist, umfassend

– eine anionische oberflächenaktive Substanz (lineares Alkylbenzensulfonat, Alkylsulfat, Alpha-Oleflnsulfonat, Alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkansulfonat, Seife)	25-40 %
– nicht-ionische oberflächenaktive Substanz (z. B. Alkoholethoxylat)	1-10 %
– Natriumcarbonat (als/wie Na₂CO₃)	8-25 %
– lösliche Silikate (als/wie Na₂O, 2SiO₂)	5-15 %
– Natriumsulfat (als/wie Na₂SO₄)	0-5 %
– Zeolith (als/wie NaAlSiO₄)	15-28 %
– Natriumperborat (als/wie NaBO₃·4H₂O)	0-20 %
– Bleichaktivator (TAED oder NOBS)	0-5 %
– Enzyme	0-5 %
– geringfügige Inhaltsstoffe (z. B. Parfum, optische Aufheller)	0-3 %

13) Detergens-Formulierungen wie beschrieben in 1)-12), wobei der Gehalt an linearem Alkylbenzensulfonat – oder ein Teil davon – durch Alkylsulfat (C₁₂-C₁₈) ersetzt wird.
14) Detergens-Formulierungen wie beschrieben in 1)-13), welche eine stabilisierte oder verkapselte Persäure enthalten, entweder als ein zusätzlicher Bestandteil oder als ein Ersatz für bereits näher beschriebene Bleichsysteme.
15) Detergens-Zusammensetzungen wie beschrieben in 3), 7), 9) und 12), wobei der Gehalt an Perborat ersetzt wird durch Percarbonat.
16) Detergens-Zusammensetzungen formuliert als nicht-wässrige Detergensflüssigkeit umfassend eine flüssige, nicht-ionische oberflächenaktive Substanz, wie z. B. linearer, alkoxylierter, primärer Alkohol, ein Builder-System (z. B. Phosphat), Enzym und Alkali. Das Detergens kann auch eine anionische, oberflächenaktive Substanz und/oder ein Bleichsystem umfassen.

Die Proteasevariante der Erfindung kann in Konzentrationen, die konventionell in Detergenzien angewandt werden, inkorporiert werden. Es wird zurzeit angenommen, dass in der Detergens-Zusammensetzung der Erfindung die Proteasevariante in einer Menge zugefügt werden kann, die 0,001-100 mg Proteasevariante pro Liter Waschflüssigkeit entspricht.
Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung weiter und sind nicht dazu gedacht, in einer irgendeiner Weise den Bereich der Erfindung, wie beansprucht, zu limitieren.
BEISPIEL 1
Das Peroxidasesystem
Ein Peroxidase (POD) System, welches zur Inhibition des Farbstofftransfers (DTI) verwendet wurde, umfassend eine Coprinus cinereus Peroxidase (CiP, erhalten nach der EP-Patentanmeldung 179,486), Wasserstoffperoxid (H₂O₂) und p-Hydroxybenzensulfonat (pHBS) als Peroxidase verstärkendes Mittel, wurde in einem Natriumphosphatpuffer simuliert:
[pHBS]: 50 μM, [H₂O₂]: 200 μM, [CiP]: 2 PODU/ml, 20 mM Natriumphosphat, pH 8,5.
Die Aktivität von Subtilisin 309 (Savinase^®, geliefert durch Novo Nordisk A/S Dänemark) wurde nach Inkubation mit dem Peroxidasesystem für 20 min. bei 35°C untersucht.
Die Restaktivität von Subtilisin 309 wurde gemessen, indem das Substrat N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid wie vorstehend beschrieben verwendet wurde. Die Stabilität der Protease wurde analytisch beurteilt, indem Konzentrationen von 40 nM bzw. 400 nM verwendet wurden.
Für beide Konzentrationen wurde 15 % Restaktivität für Subtilisin 309 relativ zu unbehandeltem Subtilisin 309 gemessen. Das Subtilisin wird daher in Anwesenheit des POD-Systems klar inaktiviert.
BEISPIEL 2
Subtilisin 309 wurde mit dem POD-System in Anwesenheit von [¹⁴C]-pHBS, wie in Beispiel 1 beschrieben, inkubiert. Nach der POD-Behandlung wurde Subtilisin 309 gereinigt und eine weitere Untersuchung, durch Aminosäureanalyse und Gelfiltrationschromatographie unter denaturierenden Bedingungen, unterzogen.
Reinigung von POD behandeltem Subtilisin 309
Zwei Liter Natriumphosphatpuffer enthaltend das POD-System und Subtilisin 309 in einer Konzentration von 400 nM, wurden für 20 min. bei 35°C inkubiert. Nach Inaktivierung wurde die Lösung auf 3 ml in Amicon-Zellen konzentriert, indem YM10-Membranen (Amicon) verwendet wurden. Die weitere Aufreinigung wurde auf einer Gelfiltrationssäule durchgeführt; Superdex 75 (16/60) eluiert mit 0,1 M Ammoniumacetat. Der größte Teil des POD-behandelten Subtilisins 309 eluierte mit einem Molargewicht leicht höher als das des unbehandelten Subtilisin 309. Das POD-behandelte Subtilisin 309 wurde konzentriert und mit 10 Volumen Milli Q Wasser in einer Amicon-Zelle gewaschen.
Aminosäureanal
Die Aminosäureanalyse wurde in dem Applied Biosystems 420A Aminosäureanalysesystem nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse werden unten in Tabelle 1 präsentiert. Wie an der Tabelle gesehen werden kann, ist die einzige detektierbare Aminosäure, die signifikant durch die POD-Inaktivierung beeinflusst ist, Tyrosin (Tyr).
Die POD-Inaktivierung von Subtilisin 309 in Anwesenheit von [¹⁴C]-pHBS führt zur radioaktiven Markierung des Enzyms. Die kovalente Natur dieser Modifikation wurde durch Gelfiltration unter denaturierenden Bedingungen in 2M Harnstoff gezeigt. Tabelle 1 Aminosäureanalyse von Subtilisin 309 und POD inaktiviertem Subtilisin 309.

a Methionin kann im Anschluss an eine saure Hydrolyse nicht quantitativ bestimmt werden
b Tryptophan wird während einer sauren Hydrolyse vollständig zerstört
c (NB, nicht bestimmt).

BEISPIEL 3
Die Stabilisierung von Subtilisin 309 gegenüber dem Peroxidasesystem wurde untersucht, indem eine Vielzahl von Varianten, bei denen einoder mehrere Tyrosin(e) durch andere Aminosäurereste ersetzt waren, verwendet wurden.
Das Peroxidasesystem wurde in einem Britton-Robinson-Puffer simuliert, indem 7-Hydroxycoumarin (7HCm) als peroxidaseverstärkendes Mittel verwendet wurde:
[7HCm): 10 μM, [H₂O₂]: 200 μM, [CiP]: 2 PODU/ml, 20 mM Britton-Robinson-Puffer (20 mM Natriumazetat, 20 mM Natriumborat und 20 mM Natriumphosphat), pH 8,5.
Die unterschiedlichen Varianten wurden mit dem Peroxidasesystem in Konzentrationen, die von 80 bis 120 nM variierten, inkubiert. Nach Inkubation für 10 min. bei 35 °C wurde die Restaktivität der Varianten analysiert, indem als Substrat N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid, wie vorstehend beschrieben, verwendet wurde. Die Restaktivitäten wurden relativ zu unbehandelten Varianten gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten präsentiert. Wie an der Tabelle gesehen werden kann, sind zwei Varianten, die Substitutionen in den Positionen 167, 171 und 192 enthalten, signifikant gegenüber dem Peroxidasesystem, das 7HCm als Verstärker verwendet, stabilisiert. Tabelle 2 Restaktivität von Subtilisin 309 Varianten nach Inkubation mit dem POD-System für 10 min.

a Mittel ± SD, n = 6

BEISPIEL 4
Mehrere der vorstehend erwähnten Subtilisine enthalten einen Tyrosinrest in Position 104. Die Bedeutung eines Tyrosinrests in dieser Position wurde untersucht, indem die Subtilisin 309 Variante V104Y verwendet wurde.
Das Peroxidasessystem wurde in einem Britton-Robinson-Puffer simuliert, indem 7-Hydroxycoumarin (7HCm) als peroxidaseverstärkendes Mittel verwendet wurde:
[7HCm]: 5 μM, [H₂O₂]: 200 μM, [CiP]: 2 PODU/ml, 20 mM Britton-Robinson-Puffer (20 mM Natriumazetat, 20 mM Natriumborat und 20 mM Natriumphosphat), pH 8,5.
Die Proteasen wurden mit dem Peroxidasesystem in einer Konzentration von 80 nM inkubiert. Nach Inkubation für 1, 5, und 10 min. bei 35 °C wurden die Restaktivitäten der Proteasen analysiert, indem N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid als Substrat, wie vorstehend beschrieben verwendet wurde. Die Restaktivitäten wurden relativ zu den unbehandelten Varianten gemessen.
Die Ergebnisse werden in 1 präsentiert. Nach Einfügen eines zusätzlichen Tyrosins in Position 104 wurde die Subtilisin 309 Variante viel empfindlicher gegenüber dem POD-System.

Claims

Zusammensetzung enthaltend einen oberflächenaktiven Stoff, eine Pilz-Peroxidase und eine Variante von Subtilisin 309-Protease, wobei die Variante von Subtilisin 309-Protease gegenüber einer durch ein Peroxidasesystem verursachten Inaktivierung eine im Vergleich mit dem Elternenzym verbesserte Stabilität besitzt durch Deletieren oder Substituieren von einem oder mehreren natürlich vorkommenden Tyrosinresten in den Positionen 167, 171, 192 gemäß der BPN'-Nummerierung mit einem Phenylalaninrest, einem Leucinrest, einem Isoleucinrest, einem Valinrest, einem Glutaminrest, einem Asparaginrest, einem Serinrest, einem Threoninrest, einem Glutaminsäurerest oder einem Histidinrest.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die zusätzlich eines oder mehrere andere Enzyme enthält, insbesondere Lipasen, Amylasen, Cellulasen und Oxidasen, auf übliche Weise in Detergenzien eingebunden.
Zusammensetzung nach einem beliebigen der Ansprüche 1-2, wobei das Peroxidasesystem eine Pilz-Peroxidase, eine Quelle von Wasserstoffperoxid und ein Peroxidase-verstärkendes Mittel enthält.