DE69333672T2 - Rekombinante lipase und alpha-amylase varianten - Google Patents

Rekombinante lipase und alpha-amylase varianten Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Lipase- und α-Amylase-Varianten, die gegen durch Peroxidasesysteme verursachte Inaktivierung stabilisiert sind, wobei bei den Lipase- und α-Amylase-Varianten ein natürlich vorkommender Tyrosinrest deletiert oder mit einem anderen Aminosäurerest an einer oder mehreren Positionen substituiert wurde.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Stabilisieren einer Lipase oder einer α-Amylase gegen die durch Peroxidasesysteme verursachte Inaktivierung und Waschmittelzusammensetzungen, die eine Lipase- und/oder eine α-Amylase-Variante der Erfindung umfassen.
  • STAND DER TECHNIK
  • Peroxidasen (E.C. 1.11.1.7) sind Enzyme, die die Oxidation eines Substrats (eines Elektrons oder Wasserstoffdonors) mit Wasserstoffperoxid katalysieren. Solche Enzyme sind vom mikrobiellen, pflanzlichen und tierischen Ursprung bekannt, z. B. Peroxidase von Coprinus cinereus (vergl. z. B. EP-Patentanmeldung 179,486). Es handelt sich hierbei typischerweise um Hämoproteine, d. h., sie enthalten ein Häm als prosthetische Gruppe.
  • Die Verwendung von Peroxidase zusammen mit Wasserstoffperoxid oder einer Wasserstoffperoxidvorstufe wurde z. B. beim Bleichen von Zellstoff zur Papierherstellung, bei der Behandlung von Abwasser aus der Zellstoffherstellung, zum verbesserten Bleichen in Wäschewaschmitteln, zur Hemmung des Farbübertragung während des Waschens und zur Ligninmodifikation, z. B. bei der Spanplattenherstellung vorgeschlagen.
  • Peroxidasesysteme (auch als POD-Systeme bezeichnet), die eine Peroxidase oder eine Peroxidaseaktivität zeigende Verbindung, eine Wasserstoffperoxidquelle und ein Peroxidase verbesserndes Mittel umfassen, werden zum Verhindern dessen verwendet, dass sich von gefärbten Geweben auslaufende Farbsubstanzen auf anderen sich in der selben Wäsche befindenden Gewebe ablagern (dieses Phänomen wird allgemein als Farbübertragung bezeichnet). Waschmittelzusammensetzungen oder Waschlaugen, die solche Peroxidasesysteme umfassen, wurden z. B. in den Internationalen Patentanmeldungen WO 92/18687 und WO 92/18683 beschrieben.
  • Ein Hauptnachteil beim Anwenden solcher Peroxidasesysteme auf Waschmittelzusammensetzungen ist, dass die in solchen Zusammensetzungen vorliegenden Enzyme stark durch das Peroxidasesystem beeinflusst werden können, wodurch die Waschleistung der Waschmittelzusammensetzung erschwert wird.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es wurde nun überraschend gefunden, dass Lipasen und α-Amylasen gegen durch Peroxidasesysteme verursachte Inaktivierung durch Deletion oder Substitution von einem oder mehreren natürlich vorkommenden Tyrosinresten mit einem anderen Aminosäurerest stabilisiert werden können.
  • Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung einen Lipase- und/oder eine α-Amylase-Variante bereit, in welcher ein oder mehrere natürlich vorkommende Tyrosinreste deletiert oder mit einem anderen Aminosäurerest substituiert wurde.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Stabilisieren einer Lipase- und/oder einer α-Amylase-Variante gegen durch ein Peroxidasesystem verursachte Inaktivierung bereit, wobei in diesem Verfahren ein oder mehrere natürlich vorkommende Tyrosinreste deletiert oder mit einem anderen Aminosäurerest substituiert werden.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Waschmittelzusammensetzungen bereit, die eine Lipase- und/oder eine α-Amylase-Variante der Erfindung umfassen.
  • In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Waschmittelzusätze bereit, die eine Lipase- und/oder eine α-Amylase-Variante der Erfindung umfassen.
  • DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue Lipase- und α-Amylase-Varianten bereit, die gegen durch Peroxidasesysteme verursachte Inaktivierung stabilisiert sind.
  • Im Kontext dieser Erfindung ist eine stabilisierte Lipase- oder α-Amylase-Variante eine Lipase oder eine α-Amylase mit, verglichen mit der Stamm-Lipase oder -α-Amylase, verbesserter Stabilität gegen durch Peroxidasesysteme verursachte Inaktivierung.
  • Aminosäuren
  • Als Abkürzungen für Aminosäuren werden die folgenden Symbole verwendet:
    A = Ala = Alanin
    C = Cys = Cystein
    D = Asp = Aspartamsäure
    E = Glu = Glutaminsäure
    F = Phe = Phenylalanin
    G = Gly = Glycin
    H = His = Histidin
    I = Ile = Isoleucin
    K = Lys = Lysin
    L = Leu = Leucin
    M = Met = Methionin
    N = Asn = Asparagin
    P = Pro = Prolin
    Q = Gln = Glutamin
    R = Arg = Arginin
    S = Ser = Serin
    T = Thr = Threonin
    V = Val = Valin
    W = Trp = Tryptophan
    Y = Tyr = Tyrosin
    B = Asx = Asp (D) oder Asn (N)
    Z = Glx = Glu (E) oder Gln (Q
    X = eine beliebige Aminosäure
    * = Deletion oder abwesende Aminosäure
  • Peroxidase-Aktivität
  • Im Kontext dieser Erfindung wird die enzymatische Aktivität von Peroxidasen in „Peroxidaseeinheiten" (PODU) ausgedrückt. In Gegenwart von Wasserstoffperoxidperoxidasen (E.C. 1.11.1.7) wird die Dehydrierung von 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat) (ABTS) katalysiert. Die erzeugte grünlich-blaue Farbe wird fotometrisch bei 418 nm überwacht. Ein PODU ist die Enzymmenge, die unter Standardbedingungen (d. h., pH 7,0, Wasserstoffperoxid als Substrat; 0,1 M Phosphatpuffer; Inkubationstemperatur 30°C; kinetisch gemessene Inkubationszeit 3 Minuten) die Umwandlung von 1 μmol Wasserstoffperoxid pro Minute katalysiert.
  • Lipase-Aktivität
  • Im Kontext dieser Erfindung wird die enzymatische Lipaseaktivität in Lipaseeinheiten ausgedrückt. Eine Lipaseeinheit (LU) ist die Enzymmenge, die unter Standardbedingungen, d. h. 30°C, pH 7,0, Tributyrinsubstrat, 1 μmol titrierbare Buttersäure pro Minute freisetzt.
  • α-Amylase-Aktivität
  • Die α-Amylase-Aktivität wird als Absorption/ml bei 620 nm unter Verwendung von Phadebas-Tabletten (Phadebasv® Amylase Test; Pharmacia Diagnostics, SW) gemessen. Der Versuch wird bei 60°C durchgeführt.
  • Peroxidaseysteme
  • Im Kontext dieser Erfindung ist ein Peroxidasesystem ein System, das eine Peroxidase oder eine Peroxidase-Aktivität zeigende Verbindung, eine Wasserstoffperoxidquelle und ein Peroxidase verbesserndes Mittel umfasst. Solche Peroxidasesysteme wurden zum Erhalt einer Hemmung der Farbübertragung verwendet und wurden z. B. in den Internationalen Patentanmeldungen WO 92/18687 und WO 92/18683 beschrieben.
  • In einem solchen Peroxidasesystem kann es sich bei der Peroxidase oder der Peroxidase-Aktivität zeigenden Verbindung um eine beliebige in der Enzymklassifizierung EC 1.11.1.7 eingeschlossene Peroxidase oder ein beliebiges davon abgeleitetes Fragment, das Peroxidase-Aktivität zeigt, oder um synthetische oder halbsynthetische Derivate davon (z. B. Porphyrin-Ringsysteme oder Mikroperoxidasen, vgl. z. B. US-Patent 4,077,768, EP-Patentanmeldung 537,381, die Internationalen Patentanmeldungen WO 91/05858 und WO 92/16634) handeln. Solche Peroxidasen sind vom mikrobiellen, pflanzlichen und tierischen Ursprung bekannt.
  • Die Peroxidase kann durch Pflanzen (z. B. Meerrettich- oder Sojabohnenperoxidase) oder durch Mikroorganismen wie Pilze oder Bakterien herstellbar sein. Einige bevorzugte Pilze schließen Stämme, die zur Unterabteilung Deuteromycotina, Klasse Hyphomycetes gehören, z. B. Fusarium Humicola Tricoderma Myrothecium, Verticillum, Arthromyces, Caldariomyces, Ulocladium, Embellisia, Cladosporium, oder Dreschlera, insbesondere Fusarium oxysporum (DSM 2672), Humicola insolens, Trichoderma resii, Myrothecium verrucana (IFO 6113), Verticillum alboatrum, Verticillum dahlie, Arthromyces ramosus (FERM P-7754), Caldariomyces fumago, Ulocladium chartarum, Embellisia alli oder Dreschlera halodes ein.
  • Andere bevorzugte Pilze schießen Stämme ein, die zur Unterabteilung Basidiomycotina, Klasse Basidiomycetes gehören, z. B. Coprinus, Phanerochaete, Coriolus oder Trametes, insbesondere Coprinus cinereus f. microsporus (IFO 8371), Coprinus macrorhizus, Phanerochaete chrysosporium (z. B. NA-12) oder Trametes (früher Polyporus genannt), z. B. T. versicolor (z. B. PR4 28-A) ein.
  • Weitere bevorzugte Pilze schließen Stämme, die zur Unterabteilung Zygomycotina, Klasse Mycoraceae gehören, z. B. Rhizopus oder Mucor, insbesondere Mucor hiemalis ein.
  • Einige bevorzugte Bakterien schließen Stämme der Ordnung Actinomycetales, z. B. Streptomyces spheroides (ATTC 23965), Streptomyces thermoviolaceus (IFO 12382) oder Streptoverticillium verticillium ssp. Verticillium ein.
  • Andere bevorzugte Bakterien schließen Bacillus pumilus (ATCC 12905), Bacillus stearothermophilus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodomonas palustri, Streptococcus lactis, Pseudomonas purrocinia (ATCC 15958) oder Pseudomonas fluorescens (NRRL B-11) ein.
  • Weitere bevorzugte Bakterien schließen Stämme, die zu Myxococcus gehören, z. B. M. virescens ein.
  • Andere mögliche Quellen von nützlichen besonderen Peroxidasen sind in Saunders B. C., vorstehend genannt, S. 41–43, aufgezählt.
  • Bei der Peroxidase kann es sich weiterhin um eine handeln, die durch ein Verfahren herstellbar ist, das das Züchten einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Vektor transformiert ist, der eine die Peroxidase kodierende DNA-Sequenz sowie DNA-Sequenzen, die Funktionen kodieren, die die Expression der die Peroxidase kodierenden DNA-Sequenz gewähren, trägt, in einem Kulturmedium unter die Expression der Peroxidase gewährenden Bedingungen und Gewinnen der Peroxidase aus der Kultur umfasst.
  • Insbesondere ist eine rekombinant hergestellte Peroxidase eine Peroxidase, die von einem Coprinus sp., insbesondere C. macrorhizus oder C. cinereus gemäß WO 92/16634 abgeleitet ist.
  • Im Kontext dieser Erfindung umfassen Peroxidase-Aktivität zeigende Verbindungen Peroxidase-aktive Fragmente, die von Cytochromen, Hämoglobin oder Peroxidase-Enzymen abgeleitet sind und synthetische oder halbsynthetische Derivate davon, z. B. Eisenporphine, Eisenporphyrine und Eisenphthalocyanine und Derivate davon.
  • In einem Peroxidasesystem kann es sich bei dem Verstärker um ein oxidierbares Substrat, z. B. Metallionen oder phenolische Verbindungen wie 7-Hydroxycumarin (7HCm), Vanillin (VAN), und p-Hydroxybenzolsulfonat (pHBS), beschrieben z. B. in den Internationalen Patentanmeldungen WO 92/18683 und WO 92/18687 und Kato M. und Shimizu S., Plant Cell Physiol. 1985 26 (7), S. 1291–1301 (vgl. insbesondere Tabelle 1) und Saunders B. C. et al., Peroxidase, London, 1964, S. 141 ff, oder 2,2'-Azinobis(3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonat) (ABTS), beschrieben in der coabhängigen DK-Patentanmeldung der Anmelder Nr. 9201441, handeln.
  • Lipasen
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Lipase der Erfindung von einem Stamm von Humicola, z. B. H. lanuginosa, H. brevispora, H. brevis var. Thermoidea oder H. insolens erhältlich. Lipasen, die von Humicola erhältlich sind, sind z. B. in US Patent 4,810,414, EP-Anmeldung 305,216 und in der Internationalen Patentanmeldung WO 89/01969 beschrieben, wobei die Veröffentlichungen hiermit unter Bezugnahme eingeschlossen sind.
  • In einer anderen spezifischen Ausführungsform ist die Lipase von einem Stamm von Pseudomonas, z. B. Ps. cepacia, Ps. fragi, Ps. stutzeri oder Ps. fluorescens erhältlich. Lipasen, die von Pseudomonas erhältlich sind, sind z. B. in der Internationalen Patentveröffentlichung 89/04361 beschrieben, wobei die Veröffentlichung hiermit unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • In einer dritten spezifischen Ausführungsform ist die Lipase von einem Stamm von Fusarium, z. B. F. oxysporum erhältlich. Lipasen, die von Fusarium erhältlich sind, sind z. B. in der EP-Veröffentlichung 130,064 und in der EP-Veröffentlichung 395,678 beschrieben, wobei die Veröffentlichungen hiermit unter Bezugnahme eingeschlossen sind.
  • In weiteren spezifischen Ausführungsformen ist die Lipase von einem Stamm von Rhizomucor, z. B. Rhizomucor miehei, oder einem Stamm von Candida, z. B. C antarctica, oder C. cylindracea (auch genannt C. rugosa), oder einem Stamm von Chromobacterium, z. B. C. viscosum, erhältlich.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist eine Lipase-Variante der Erfindung eine Lipase von Humicola lanuginosa mit einer wie in der EP- Veröffentlichung 305,216 beschriebenen Aminosäureseguenz (wobei die Veröffentlichung der Aminosäuresequenz in 5 dargelegt ist), wobei die Sequenz in einer oder mehreren der folgenden Positionen geändert wurde: 16, 21, 53, 138, 164, 171, 194, 213, 220, 261.
  • Amylasen
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die α-Amylase-Variante der Erfindung von einem Stamm von Bacillus oder einem Stamm von Aspergillus erhältlich.
  • In einer stärker spezifischen Ausführungsform ist die α-Amylase-Variante von einem Stamm von B, licheniformis erhältlich. Die Aminosäureseguenz für die 584-α-Amylase von B. licheniformis (Stephens et al.) ist aus J. Bacteriol. 1984, 158, 369–372, und J. Bacteriol. 166, 635–643, 1986, FR 2665178 oder EP 410498 ersichtlich. So lauten die Tyrosinpositionen: 10, 14, 31, 46, 56, 59, 62, 77, 98, 150, 158, 175, 193, 195, 198, 203, 219, 262, 273, 290, 302, 348, 358, 363, 367, 394, 396, 402, 439, 480.
  • In einer anderen spezifischen Ausführungsform ist die α-Amylase-Variante von einem Stamm von B. amyloliquefaciens erhältlich. Die Aminosäureseguenz für die α-Amylase von B. amyloliquefaciens (Takkinen et al.) ist aus J. Biol. Chem. 1983, 258, 1007–1013 ersichtlich.
  • In einer dritten spezifischen Ausführungsform ist die α-Amylase-Variante von einem Stamm von E. stearothermophilus erhältlich. Die Aminosäureseguenz für die α-Amylase von E. stearothermophilus ist aus J. Bacteriol. 166, 635–643, 1986, ersichtlich.
  • In einer vierten spezifischen Ausführungsform ist die α-Amylase-Variante von eurem Stamm von A. niger erhältlich. Die Aminosäureseguenz für die α-Amylase von A. niger ist aus der DK-Patentanmeldung 5126/87 ersichtlich.
  • In weiteren spezifischen Ausführungsformen sind α-Amylase-Varianten der Erfindung chimäre α-Amylasen. Chimäre α-Amylasen sind z. B. in der EP-Patentveröffentlichung 252,666 offenbart.
  • Verfahren zum Stabilisieren von Lipasen und α-Amylasen
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Stabilisieren von Lipasen und α-Amylasen gegen durch Peroxidasesysteme verursachte Inaktivierung bereit, wobei in dem Verfahren ein oder mehrere natürlich vorkommende Tyrosinreste deletiert oder mit einem anderen Aminosäurerest substituiert werden.
  • Rekombinant hergestellte Lipasen und α-Amylasen
  • In der Vergangenheit wurden zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden oder Proteinen mittels rekombinanter DNA-Technologie entwickelt. Hauptsächlich zu diesem Zweck verwendet werden E. coli, Bacillus subtilis. Saccharomyces cerivisiae und andere Aspergillus-Stämme, z. B. A. oryzae und A. niger. Insbesondere sind die Aspergillii attraktive Kandidaten für Wirtsmikroorganismen für rekombinante DNA-Vektoren, indem sie gut charakterisierte und weit verbreitet verwendete Mikroorganismen für die wirtschaftliche Herstellung von Enzymen sind. Bei Aspergillus oryzae wurden Verfahren zur Transformation des Organismus und Herstellung von verschiedenen Enzymen, darunter diese der Lipasen von Humicola lanuginosa und Rhizomucor miehei entwickelt (siehe z. B. die Europäischen Patentanmeldungen 238,023 und 305,216 und die Internationale Patentanmeldung WO 89/01969), wobei die Veröffentlichungen hiermit unter Bezugnahme eingeschlossen sind.
  • Biosynthetische Expression von Polypeptiden
  • Durch Transformation eines Organismus, wobei die Herstellung eines Polypeptids oder eines Proteins beabsichtigt ist, wird eine DNA-Sequenz in den Organismus eingebracht. Die Sequenz enthält die Kodierungsregion des Gens von Interesse, die durch Transkriptions-/Translations-Startsignale und Transkriptions-/Translations-Terminierungssignale eingegrenzt ist. Die Kodierungsregion enthält Einheiten von drei Basenpaaren, genannt Kodone, die durch Translation des transkribierten Gens in Aminosäuren translatiert werden, die wiederum zusammengeschlossen werden, um das Polypeptid von Interesse zu erhalten.
  • Einbringen von Mutationen in Polypeptide
  • Durch Ändern von einem oder mehreren spezifischen Kodonen in der Kodierungsregion und Transformieren des Wirtsorganismus' mit diesen neuen Kodierungsregionen können neue Polypeptide hergestellt werden, die sich von dem ursprunglichen Polypeptid in einer oder mehreren Aminosäuren unterscheiden. Solche Abwandlungen können mittels einer Technik eingebracht werden, die allgemein als „stellengerichtete Mutagenese in vitro" bekannt ist. Eine Anzahl an Verfahren wurde veröffentlicht. Ein frühes Verfahren ist von Zoller & Smith, DNA, 1984, 3 (6), 479–488, beschrieben und beinhaltet die Verwendung des Einzelstrang-M13-Bacteriophagen. Ein bevorzugtes Verfahren unter Verwendung von PCR (Polymerasekettenreaktion) ist von Nelson & Long, Analytical Biochemistry, 1989, 180, 147–151, beschieben. Es beinhaltet eine dreistufige Bildung eines die gewünschte Mutation enthaltenden PCR-Fragments durch Verwendung eines chemisch synthetisierten DNA-Oligonukleotids als einen der Primer in den PCR-Reaktionen. Von dem PCR-gebildeten Fragment kann ein die Mutation tragendes DNA-Fragment durch Spaltung mit Restriktionsenzymen isoliert und wieder in das Expressionsplasmid eingefügt werden. Ein drittes Mutageneseverfahren nutzt Restriktionsstellen in der DNA-Kodierungsregion. Durch Aufschluss der DNA mit Restriktionsenzymen an das Mutageneseziel eingrenzenden Stellen, Synthetisieren eines neuen synthetisch die gewünschte Mutation enthaltenden Fragments und Klonen dieses neuen Fragments zwischen die Restriktionsstellen kann eine Mutantkodierungsregion konstruiert werden.
  • Alle Verfahren sind allgemein auf Untersuchungen auf dem Proteinmanipulation genannten Gebiet anwendbar, bei welchen es sich um die Entwicklung von Polypeptiden mit neuen und abgewandelten Eigenschaften handelt.
  • Die Transformation und Expression können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, z. B. wie in der Europäischen Patentanmeldung 305,216 beschrieben, erzielt werden, wobei die Beschreibung hiermit unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • Die Mikroorganismen, die eine stabilisierte Lipase oder α-Amylase dieser Erfindung herstellen können, können durch herkömmliche Fermentationsverfahren in einem Nährmedium, das einen assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit anderen essentiellen Nährstoffen enthält, gezüchtet werden, wobei das Medium gemäß den Prinzipien des Fachgebiets zusammengesetzt ist. Die Reinigung und Gewinnung der stabilisierten Lipase oder α-Amylase kann auch gemäß an sich bekannten Verfahren durchgeführt werden.
  • Nukleotidsequenzen, Expressionsvektoren und Mikroorganismen
  • Diese Erfindung betrifft DNA-Nukleotidsequenzen, die eine stabilisierte Lipase oder α-Amylase der Erfindung kodieren. Die stabilisierte Lipase oder α-Amylase kann exprimiert und hergestellt werden, wenn die Lipase oder α-Amylase kodierende DNA-Nukleotidsequenz in einen geeigneten Vektor in einem geeigneten Wirtsorganismus eingefügt werden. Der Wirtsorganismus ist nicht unbedingt mit dem Organismus identisch, von welchem das Stamm-Gen stammte. Die Konstruktion der mutierten Gene, Vektoren und Mutanten und der transformierten Mikroorganismen kann durch jede beliebige geeignete rekombinante DNA- Technik, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft auch Expressionsvektoren und Wirtsorganismen, die eine DNA-Nukleotidsequenz enthalten, die eine stabilisierte Lipase oder α-Amylase dieser Erfindung kodiert.
  • Waschmittelzusammensetzungen
  • Erfindungsgemäß können die Lipase- und die α-Amylase-Variante typischerweise ein Bestandteil einer Waschmittelzusammensetzung sein. Als solche kann sie in die Waschmittelzusammensetzung in Form eines nicht stäubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms eingeschlossen sein. Nicht stäubende Granulate können z. B. wie in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide an Novo Industri A/S) hergestellt und gegebenenfalls durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren beschichtet werden. Beispiele für wachsartige Beschichtungsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)-Produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit mittleren Molekulargewichten von 1.000 bis 2.000, ethoxylierte Nonylphenole mit 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten; ethoxylierte Fettalkohole, in welchen der Alkohol 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und in welchen 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten vorliegen; Fettalkohole; Fettsäuren; und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende Beschichtungsmaterialien, die zum Ausbringen durch Wirbelschichttechniken bekannt sind, sind im Patent GB 1483591 angegeben. Flüssige Enzympräparate können z. B. durch Zugabe eines Polyols wie Propylenglycol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols von Milchsäure oder Borsäure gemäß etablierten Verfahren stabilisiert werden. Andere Enzymstabilisatoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Geschützte Enzyme können gemäß dem in EP 238,216 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung kann in jeder beliebigen günstigen Form, z. B. als Pulver, Granulat, Paste oder Flüssigkeit vorliegen. Ein Flüssigwaschmittel kann wässrig, typischerweise enthaltend bis zu 70% Wasser und 0 bis 30% organisches Lösungsmittel, oder nichtwässrig sein.
  • Die Waschmittelzusammensetzung umfasst ein oder mehrere oberflächenaktive Mittel, wobei jedes davon anionisch, nichtionisch, kationisch oder zwitterionisch sein kann. Das Waschmittel enthält gewöhnlich 0 bis 50% anionisches oberflächenaktives Mittel wie lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkoholethoxysulfat (AEOS oder AES), sekundäre Alkansulfonate (SAS), alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure oder Seife. Es kann auch 0 bis 40% nicht ionisches oberflächenaktives Mittel wie Alkoholethoxylat (AEO oder AE), carboxylierte Alkoholethoxylate, Nonylphenolethoxylat, Alkylpolyglycosid, Alkyldimethylaminoxid, ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid, Fettsäuremonoethanolamid, Alkyl(N-methyl)glucoseamid oder Polyhydroxyalkylfettsäureamid (z. B., wie beschrieben in WO 92/06154) enthalten.
  • Die Waschmittelzusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere anderes) Enzyme wie Kutinase, Protease, Cellulase, Peroxidase oder Oxidase umfassen.
  • Das Waschmittel kann 1–65% eines Waschmittelgerüststoffs oder -komplexierungsmittels wie Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Citrat, Nitrilotriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTMPA), Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, lösliche Silicate oder geschichtete Silicate (z. B. SKS-6 von Hoechst) enthalten. Das Waschmittel kann auch ohne Gerüststoff vorliegen, d. h., im Wesentlichen frei von einem Waschmittelgerüststoff sein.
  • Das Waschmittel kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind Carboxymethylcellulose (CMC), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Polyethylenglycol (PEG), Poly(vinylalkohol) (PVA), Polycarboxylate wie Polyacrylate, Malein/Acrylsäure-Copolymere und Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymere umfassen.
  • Das Waschmittel kann ein Bleichsystem enthalten, das eine H2O2-Quelle wie Perborat oder Percarbonat umfassen kann, die mit einem Persäure bildenden Bleichaktivator wie Tetraacetylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzolsulfonat (MOBS) kombiniert werden kann. In einer anderen Ausführungsform kann das Bleichsystem Peroxysäuren z. B. vom Amid-, Imid- oder Sulfontyp umfassen.
  • Die Enzyme der Waschmittelzusammensetzung der Erfindung können unter Verwendung von herkömmlichen Stabilisierungsmitteln, z. B. eines Polyols wie Propylenglycol oder Glycerin, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, Milchsäure, Borsäure oder eines Borsäurederivats, wie z. B. eines aromatischen Boratesters stabilisiert werden, und die Zusammensetzung kann wie z. B. in WO 92/19709 und WO 92/19708 beschrieben formuliert werden.
  • Das Waschmittel kann auch andere herkömmliche Waschmittelzusätze wie z. B. Gewebeweichmacher, einschließlich Tone, Schaumverstärker, Schaumunterdrücker, Antikorrosionsmittel, Schmutzsuspensionsmittel, Mittel gegen die Wiederablagerung von Schmutz, Farbstoffe, Bakterizide, optische Aufheller oder Parfum enthalten.
  • Der pH-Wert (gemessen in wässriger Lösung bei Verwendungskonzentration) ist üblicherweise neutral oder alkalisch, z. B. 7–11.
  • Besondere Formen der Waschmittelzusammensetzungen im Umfang der Erfindung schließen ein:
    • 1) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
      – lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 7–12%
      – Alkoholethoxysulfat (z. B. C12-18-Alkohol, 1–2 EO) oder Alkylsulfat (z. B. C16-18) 1–4%
      – Alkoholethoxylat (z. B. C14-15-Alkohol, 7 EO) 5–9%
      – Natriumcarbonat (wie Na2CO3) 14–20%
      – Lösliches Silicat (wie Na2O, 2SiO2) 2–6%
      – Zeolith (wie NaAlSiO4) 15–22%
      – Natriumsulfat (wie Na2SO4) 0–6%
      – Natriumcitrat/Zitronensäure (wie C6H5Na3O7/C6HgO7) 0–15%
      – Natriumperborat (wie NaBO3·H2O) 11–18%
      – TAED 2–6%
      – Carboxymethylcellulose 0–2%
      – Polymere (z. B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG) 0–3%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. Schaumunterdrücker, Parfum, optische Aufheller, Photobleiche) 0–5%
    • 2) Eine Waschmitteizusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
      – lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 6–11%
      – Alkoholethoxysulfat (z. B. C12-18-Alkohol, 1–2 EO) oder Alkylsulfat (z. B. C16-18) 1–3%
      – Alkoholethoxylat (z. B. C14-15-Alkohol, 7 EO) 5–9%
      – Natriumcarbonat (wie Na2CO3) 15–21%
      – Lösliches Silicat (wie Na2O, 2SiO2) 1–4%
      – Zeolith (wie NaAlSiO4) 24–34%
      – Natriumsulfat (wie Na2SO4) 4–10%
      – Natriumcitrat/Zitronensäure (wie C6H5Na3O7/C6H8O7) 0–15%
      – Carboxymethylcellulose 0–2%
      – Polymere (z. B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG) 1–6%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. Schaumunterdrücker, Parfum) 0–5%
    • 3) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
      – lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 5–9%
      – Alkoholethoxylat (z. B. C12-15-Alkohol, 7 EO) 7–14%
      – Seife als Fettsäure (z. B. C16-22) 1–3%
      – Natriumcarbonat (wie Na2CO3) 10–17%
      – Lösliches Silicat (wie Na2O, 2SiO2) 3–9%
      – Zeolith (wie NaAlSiO4) 23–33%
      – Natriumsulfat (wie Na2SO4) 0–4%
      – Natriumperborat (wie NaBO3·H2O) 8–16%
      – TAED 2–8%
      – Phosphonat (z. B. EDTMPA) 0–1%
      – Carboxymethylcellulose 0–2%
      – Polymere (z. B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG) 1–3%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. Schaumunterdrücker, Parfum, optische Aufheller) 0–5%
    • 4) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
      – lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 8–12%
      – Alkoholethoxylat (z. B. C12-15-Alkohol, 7 EO) 10–25%
      – Natriumcarbonat (wie Na2CO3) 14–22%
      – Lösliches Silicat (wie Na2O, 2SiO2) 1–5%
      – Zeolith (wie NaAlSiO4) 25–35%
      – Natriumsulfat (wie Na2SO4) 0–10%
      – Carboxymethylcellulose 0–2%
      – Polymere (z. B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG) 1–3%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. Schaumunterdrücker, Parfum) 0–5%
    • 5) Eine wässrige Flüssigwaschmittelzusammensetzung, umfassend
      – lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 15–21%
      – Alkoholethoxylat (z. B. C12-15-Alkohol, 7 EO oder C12-15-Alkohol, 5 EO) 12–18%
      – Seife als Fettsäure (z. B. Oleinsäure) 3–13%
      – Alkenylbernsteinsäure (C12-14) 0–13%
      – Aminoethanol 8–18%
      – Zitronensäure 28%–
      – Phosphonat 0–3%
      – Polymere (z. B. PVP, PEG) 0–3%
      – Borat (wie B4O7) 0–2%
      – Ethanol 0–3%
      – Propylenglycol 0–14%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. Dispersionsmittel, Schaumunterdrücker, Parfum, optische Aufheller) 0–5%
    • 6) Eine wässrige strukturierte Flüssigwaschmittelzusammensetzung, umfassend
      – lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 15–21%
      – Alkoholethoxylat (z. B. C12-15-Alkohol, 7 EO oder C12-15-Alkohol, 5 EO) 3–9%
      – Seife als Fettsäure (z. B. Oleinsäure) 3–10%
      – Zeolith (wie NaAlSiO4) 14–22%
      – Kaliumcitrat 9–18%
      – Borat (wie B4O7) 0–2%
      – Carboxymethylcellulose 0–2%
      – Polymere (z. B. PEG, PVP) 0–3%
      – Anker-Polymere wie z. B. Laurylmetharylat/Acrylsäure-Copolymer; Molverhältnis 25 : 1; MW 3800 0–3%
      – Glycerin 0–5%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. Dispersionsmittel, Schaumunterdrücker, Parfum, optische Aufheller) 0–5%
    • 7) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
      – Fettalkoholsulfat 5–10%
      – Ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid 3–9%
      – Seife als Fettsäure 0–3%
      – Natriumcarbonat (wie Na2CO3) 5–10%
      – Lösliches Silicat (wie Na2O, 2SiO2) 1–4%
      – Zeolith (wie NaAlSiO4) 20–40%
      – Natriumsulfat (wie Na2SO4) 2–8%
      – Natriumperborat (wie NaBO3. H2O) 12–18%
      – TAED 2–7%
      – Polymere (z. B. Malein/Acrylsäure-Copolymer, PEG) 1–5%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. optische Aufheller, Schaumunterdrücker, Parfum) 0–5%
    • 8) Eine Waschmittelmittelzusammensetzung, formuliert als Granulat, umfassend
      – lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 8–14%
      – Ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid 5–11%
      – Seife als Fettsäure 0–3%
      – Natriumcarbonat (wie Na2CO3) 4–10%
      – Lösliches Silicat (wie Na2O, 2SiO2) 1–4%
      – Zeolith (wie NaAlSiO4) 30–50%
      – Natriumsulfat (wie Na2SO4) 3–11%
      – Natriumcitrat (wie C6H5Na3O7) 5–12%
      – Polymere (z. B. PVP, Malein/Acrylsäure-Copolymer, PEG) 1–5%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. Schaumunterdrücker, Parfum) 0–5%
    • 9) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als Granulat, umfassend
      – lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 6–12%
      – nichtionisches oberflächenaktives Mittel 1–4%
      – Seife als Fettsäure 2–6%
      – Natriumcarbonat (wie Na2CO3) 14–22%
      – Zeolith (wie NaAlSiO4) 18–32%
      – Natriumsulfat (wie Na2SO4) 5–20%
      – Natriumcitrat (wie C6H5Na3O7) 3–8%
      – Natriumperborat (wie NaBO3·H2O) 4–9%
      – Bleichaktivator (z. B. NOBS oder TAED) 1–5%
      – Carboxymethylcellulose 0–2%
      – Polymere (z. B. Polycarboxylat oder PEG) 1–5%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. optischer Aufheller, Parfum) 0–5%
    • 10) Eine wässrige Flüssigwaschmittelzusammensetzung, umfassend
      – lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 15–23%
      – Alkoholethoxysulfat (z. B. C12-15-Alkohol, 2–3 EO) 8–15%
      – Alkoholethoxylat (z. B. C12-15-Alkohol, 7 EO oder C12-15-Alkohol, 5 EO) 3–9%
      – Seife als Fettsäure (z. B. Laurinsäure) 0–3%
      – Aminoethanol 1–5%
      – Natriumcitrat 5–10%
      – Hydrotrop (z. B. Natriumtoluolsulfonat) 2–6%
      – Borat (wie B4O7) 0–2%
      – Carboxymethylcellulose 0–1%
      – Ethanol 1–3%
      – Propylenglycol 2–5%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. Polymere, Dispersionsmittel, Parfum, optische Aufheller) 0–5%
    • 11) Eine wässrige Flüssigwaschmittelzusammensetzung, umfassend
      – lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 20–32%
      – Alkoholethoxylat (z. B. C12-15-Alkohol, 7 EO oder C12-15-Alkohol, 5 EO) 6–12%
      – Aminoethanol 2–6%
      – Zitronensäure 8–14%
      – Borat (wie B4O7) 1–3%
      – Polymere (z. B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, Anker-Polymere wie z. B. Laurylmethacrylat-/Acrylsäure-Copolymer und CMC) 0–3%
      – Glycerin 3–8%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. Hydrotrope, Dispersionsmittel, Parfum, optische Aufheller) 0–5%
    • 12) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
      – anionisches oberflächenaktives Mittel (lineares Alkylbenzolsulfonat, Alkylsulfat, alpha-Olefinsulfonat, alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkansulfonate, Seife) 25–40%
      – nicht ionische oberflächenaktive Mittel (z. B. Alkoholethoxylat) 1–10%
      – Natriumcarbonat (wie Na2CO3) 8–25%
      – Lösliche Silicate (wie Na2O, 2SiO2) 5–15%
      – Natriumsulfat (wie Na2SO4) 0–5%
      – Zeolith (wie NaAlSiO4) 15–28%
      – Natriumperborat (wie NaBO3·4H2O) 0–20%
      – Bleichaktivator (TAED oder NOBS) 0–5%
      – Enzyme 0–5%
      – Nebenbestandteile (z. B. Parfum, optischer Aufheller) 0–3%
    • 13) Waschmittelformulierungen, wie beschrieben in 1)–12), wobei der Gehalt an linearem Alkylbenzolsulfonat – oder ein Teil davon – durch Alkylsulfat (C12-C18) ersetzt wird.
    • 14) Waschmittelformulierungen, wie beschrieben in 1)–13), die eine stabilisierte oder eingekapselte Peressigsäure entweder als zusätzlicher Bestandteil oder als Ersatz für schon spezifizierte Bleichsysteme enthalten.
    • 15) Waschmittelzusammensetzungen wie beschrieben in 3), 7), 9) und 12), wobei der Gehalt an Perborat durch Percarbonat ersetzt ist.
    • 16) Waschmittelzusammensetzung, formuliert als nicht wässrige Waschmittelflüssigkeit, umfassend ein flüssiges nichtionisches oberflächenaktives Mittel wie z. B. linearen alkoxylierten primären Alkohol, ein Gerüststoffsystem (z. B. Phosphat), Enzym und Alkali. Das Waschmittel kann auch ein anionisches oberflächenaktives Mittel und/oder ein Bleichsystem enthalten.
  • Die Lipase- und α-Amylase-Varianten der Erfindung können in Konzentrationen eingebracht werden, die herkömmlich in Waschmitteln eingesetzt werden. Es wird gegenwärtig erwogen, dass in der Waschmittelzusammensetzung der Erfindung die Lipase- und α-Amylase-Varianten in einer Menge zugesetzt werden können, die 0,001–100 mg Lipase- oder α-Amylase-Variante pro Liter Waschlauge entspricht.

Claims (5)

  1. Alpha-Amylase-Variante von Bacillus licheniformis mit, verglichen mit der Stamm-alpha-Amylase, verbesserter Stabilität gegen Inaktivierung, die durch ein Peroxidasesystem, umfassend eine Peroxidase oder eine Peroxidaseaktivität aufweisende Verbindung, eine Wasserstoffperoxidquelle und ein Peroxidase-verbesserndes Mittel, verursacht wird, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere natürlich vorkommende(r) Tyrosinrest(e) mit einem Phenylalaninrest, einem Leucinrest, einem Isoleucinrest, einem Valinrest, einem Serinrest oder einem Histidinrest in einer oder mehreren der Positionen 10, 14, 31, 46, 56, 59, 62, 77, 98, 150, 158, 175, 193, 195, 198, 203, 219, 262, 273, 290, 302, 348, 358, 363, 367, 394, 396, 402, 439, 480 substituiert wird(werden).
  2. Verfahren zur Stabilisierung einer alpha-Amylase von Bacillus licheniformis mit, verglichen mit der Stamm-alpha-Amylase, verbesserter Stabilität gegen Inaktivierung, die durch ein Peroxidasesystem, umfassend eine Peroxidase oder eine Peroxidaseaktivität aufweisende Verbindung, eine Wasserstoffperoxidquelle und ein Peroxidase-verbesserndes Mittel, verursacht wird, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere natürlich vorkommende(r) Tyrosinrest(e) mit einem Phenylalaninrest, einem Leucinrest, einem Isoleucinrest, einem Valinrest, einem Serinrest oder einem Histidinrest in einer oder mehreren der Positionen 10, 14, 31, 46, 56, 59, 62, 77, 98, 150, 158, 175, 193, 195, 198, 203, 219, 262, 273, 290, 302, 348, 358, 363, 367, 394, 396, 402, 439, 480 substituiert wird(werden).
  3. Waschmittelzusammensetzung, umfassend ein oberflächenaktives Mittel und eine alpha-Amylase-Variante nach Anspruch 1.
  4. Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 3, die ferner ein oder mehrere herkömmlich in Waschmitteln verwendete(s) Enzym(e), insbesondere Proteasen, Zellulasen, Oxidasen und/oder Peroxidasen umfasst.
  5. Waschmittelzusatz, umfassend eine alpha-Amylase-Variante nach Anspruch 1, das in Form eines nicht-stäubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit, einer Aufschlämmung oder eines geschützten Enzyms bereitgestellt ist.
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