DE60013428T2

DE60013428T2 - Alpha-glikolisierte aminosäure freisetzendes enzym

Info

Publication number: DE60013428T2
Application number: DE60013428T
Authority: DE
Inventors: Kaori Kyoto-shi ISHIMARU; Masayuki Kyoto-shi YAGI; Satoshi Kyoto-shi YONEHARA
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1999-04-12
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2020-04-12
Also published as: EP1176191A1; EP1176191A4; EP1176191B1; US20040247587A1; JP4613282B2; US6825016B1; AU3677100A; WO2000061732A1; CN1355841A; CN1218040C; DE60013428D1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Enzym. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Enzym, das eine Aminosäure mit einer glykosylierten α-Aminogruppe freisetzt.
HINTERGRUND
Proteasen werden in verschiedenen industriellen Bereichen verwendet. Proteasen werden z.B. zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins, z.B. glykosylierten Albumins, im Serum verwendet, das als wichtiger Indikator für die Diagnose, Behandlung, usw. von Diabetes dienen kann.
Eine solche Bestimmung des glykosylierten Proteins unter Verwendung der Protease kann beispielsweise durchgeführt werden, indem man das glykosylierte Protein mit der Protease abbaut, das sich ergebende Abbauprodukt mit einer Fructosylaminosäureoxidase (nachfolgend hier als „FAOD" bezeichnet) umsetzt, und dann den Sauerstoffverbrauch oder die Wasserstoffperoxidbildung bestimmt, um die Menge des glykosylierten Proteins zu ermitteln. Beispiele für die Protease umfassen solche, die in der JP 5(1993)-192193 A und JP 7(1995)-289253 A offenbart sind.
Die vorstehend beschriebene Protease-Vorbehandlung des glykosylierten Proteins wird durchgeführt, weil FAOD und dergleichen leicht auf eine glykosylierte Aminosäure und ein glykosyliertes Peptid einwirken können, wogegen sie kaum auf das glykosylierte Protein selbst einwirken. Da die glykosylierte Stelle von glykosyliertem Hämoglobin (nachfolgend hier als „HbAlc" bezeichnet) der N-terminale Aminosäurerest der β-Kette ist, besteht insbesondere ein Bedarf an einer Protease, die HbAlc zu behandeln vermag, so dass FAOD leicht auf diese Stelle des HbA1c einwirken kann.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines neuen Enzyms, das ein glykosyliertes Protein und ein glykosyliertes Peptid zu behandeln vermag, so dass FAOD leicht darauf einwirken kann.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten zunächst bei verschiedenen FAODs den Wirkungsmechanismus der FAOD, die auf ein glykosyliertes Protein, ein glykosyliertes Peptid, eine glykosylierte Aminosäure usw. einwirkt, bei denen ein Zucker an eine α-Aminogruppe gebunden ist. Durch diese Untersuchung fanden die Erfinder heraus, dass eine solche FAOD leicht auf die glykosylierte Aminosäure einwirkt, in der ein Zucker an die α-Aminogruppe gebunden ist, wogegen sie kaum auf das oben erwähnte glykosylierte Protein und glykosylierte Peptid einwirkt. Auf der Grundlage dieses Ergebnisses isolierten die Erfinder verschiedene Bakterien aus der Natur, kultivierten diese und untersuchten die von ihnen produzierten Enzyme. Als Ergebnis gelang es den Erfindern, Bakterien zu isolieren, die ein neuartiges Enzym produzieren, welches eine Aminosäure mit einer glykosylierten α-Aminogruppe (α-glykosylierte Aminosäure: nachfolgend hier als „α-GA" bezeichnet) aus dem glykosylierten Protein oder glykosyliertem Peptid freizusetzen vermag, bei dem der Zucker an eine α-Aminogruppe (eine N-terminale Aminogruppe) gebunden ist, wodurch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wurde. Das neue erfindungsgemäße Enzym (α-glykosylierte Aminosäure-freisetzendes Enzym: nachfolgend hier als „α-GARE" bezeichnet) kann α-GA freisetzen, beispielsweise aus dem vorstehend erwähnten glykosylierten Protein oder glykosyliertem Peptid. Somit kann durch Verwendung dieses neuen Enzyms die Bestimmung von HbAlc unter Verwendung von FAOD, die problemlos auf α-GA einwirkt, in klinischen Tests zur praktischen Anwendung kommen. Das neue erfindungsgemäße Enzym kann nicht nur für die Bestimmung von HbA1c verwendet werden, sondern auch in verschiedenen Anwendungsbereichen, z.B. für die Bestimmung anderer glykosylierter Proteine. Darüber hinaus kann α-GARE zusätzlich zu den katalytischen Funktionen der Freisetzung von α-GA weitere katalytische Funktionen aufweisen, z.B. die Funktion der Spaltung anderer Peptidbindungen.
Das α-GARE stammt aus dem Bakterienstamm Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004. Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 wurde ebenfalls von den vorliegenden Erfindern neu aus dem Boden isoliert. Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 wurde unter der Zugangsnummer FERM P-17347 ab dem 29. März 1999 beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-0046, JAPAN) hinterlegt. Die ursprüngliche Hinterlegung wurde unter der Zugangsnummer FERM BP-7041 (Datum der Annahme: 21. Februar 2000) in eine Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag beim National Institute of Bioscience ans Human Technology als internationaler Hinterlegungsbehörde überführt. Die bakteriologischen Eigenschaften dieses Stammes sind nachfolgend beschrieben.
(Morphologische Eigenschaften)
Dieser Stamm ist ein bewegliches, stäbchenförmiges Bakterium (Bazillus) mit Abmessungen von 0,8×2,0 μm.
(Kultivierungseigenschaften)

Bei Kultivierung in einem Agarmedium nach dem üblichen Verfahren bildet der Stamm eine Kolonie, die eine kreisförmige Form hat, in der Erhebung flach konvex ist und einen vollständigen Rand aufweist. Die Kolonie ist am Anfang durchscheinend und anschließend leicht gelb gefärbt. Bei Kultivierung in Mac Conkey's Kulturmedium wächst der Stamm nicht. Weiterhin wächst der Stamm bei einer Kultivierungstemperatur von 42 °C, jedoch nur schwach. (Physiologische Eigenschaften)

Gramfärbung:	negativ
Sauerstoffbedarf:	fakultativ anaerob
Nitratreduzierung:	–
Indolproduktion:	–
Glukoseversäuerung:	–
Argininhydrolase:	–
Urease:	–
Esculinhydrolyse:	+

Gelantinehydrolyse:	–
β-Galactosidase:	+
Gasfreisetzung aus Glukose:	–
Substratverwertung:
Glukose:	+
L-Arabinose:	+
D-Mannose:	–
D-Mannitol:	+
N-Acetyl-D-glucosamin:	+
Maltose:	+
Kaliumgluconat:	–
DL-Äpfelsäure:	–
Natiumcitrat:	–
Phenylacetat:	+

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids umfasst: den Abbau eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids mit einem Enzym; die Durchführung einer Redox-Reaktion zwischen dem sich ergebenden Abbauprodukt und FAOD; und die Bestimmung der Redox-Reaktion zur Bestimmung des glykosylierten Proteins oder des glykosylierten Peptids. Bei diesem Verfahren wird das neue erfindungsgemäße Enzym (α-GARE) als das vorstehend erwähnte Enzym verwendet. Die Art des bei diesem Verfahren verwendeten α-GARE wird in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Art, Konzentration, usw. des zu bestimmenden glykosylierten Proteins oder glykosylierten Peptids gewählt. Das α-GARE kann allein oder in Kombination von zwei oder mehr Arten verwendet werden. Das glykosylierte Protein oder dergleichen kann durch Vorbehandlung mit einem weiteren Enzym (z.B. Protease) abgebaut werden, so dass das α-GARE leichter darauf einwirken kann.
Bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren wird die Redox-Reaktion vorzugsweise durch Messen der durch die Redox-Reaktion erzeugten Menge an Wasserstoffperoxid oder der durch die Redox-Reaktion verbrauchten Sauerstoffmenge gemessen. Die Menge des Wasserstoffperoxids wird vorzugsweise unter Verwendung einer Peroxidase und eines Substrats gemessen, das sich bei Oxidation färbt (nachfolgend hier als „chromogenes Substrat" bezeichnet). Die Menge des Wasserstoffperoxids kann nicht nur durch das vorstehend erwähnte enzymatische Verfahren unter Verwendung der Peroxidase oder dergleichen bestimmt werden, sondern auch beispielsweise durch ein elektrisches Verfahren.
Beispiele für das chromogene Substrat sind N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)diphenylamin-natrium (beispielsweise unter dem Handelsnamen „DA-64" von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich), Orthophenylendiamin (OPD), und ein Substrat, das durch Vereinigung eines Trinder-Reagenz und 4-Aminoantipyrin erhalten wird. Beispiele des vorstehend genannten Trinder-Reagenz' sind Phenole, Phenolderivate, Anilinderivate, Naphthole, Naphtholderivate und Naphthylamin, Naphthylaminderivate. Anstelle des vorstehend genannten Aminoantipyrins ist es weiterhin möglich, Aminoantipyrinderivate, Vanillindiaminsulfonsäure, Methylbenzothiazolinon-hydrazon (MBTH), sulfoniertes Methylbenzothiazolinonhydrazon (SMBTH) und dergleichen zu verwenden. Von diesen chromogenen Substraten wird N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)diphenylamin-natrium besonders bevorzugt.
Bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren stellen Blutzellen eine Probe dar, die vorzugsweise analysiert werden soll, weil die Bestimmung von HbA1c in Blutzellen, wie vorstehend beschrieben, für die Diagnose von Diabetes brauchbar ist. Die Probe ist jedoch nicht auf Blutzellen beschränkt, weil von den Blutzellen unterschiedliche Blutbestandteile (Gesamtblut, Plasma, Serum, usw.); biologische Proben, wie beispielsweise Urin und Rückenmarksflüssigkeit; Getränke, wie beispielsweise Säfte; Nahrungsmittel, wie beispielsweise Sojasoße und Soße, usw. ebenfalls glykosylierte Proteine enthalten. Ebenso ist der zu bestimmende Analyt nicht auf HbAlc beschränkt, sondern kann beispielsweise ein glykosyliertes Protein wie beispielsweise Gelatine und Kasein oder ein glykosyliertes Peptid sein.
Ein erfindungsgemäßer Kit zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids umfasst eine Protease, FAOD, eine Peroxidase und ein Substrat, das durch eine Umsetzung mit der Peroxidase oxidiert wird. Bei diesem Bestimmungskit umfasst die Protease ein erfindungsgemäßes α-GARE. Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann unter Verwendung dieses Kits schnell und leicht durchgeführt werden. Weiterhin kann in diesem Bestimmungskit das α-GARE allein oder in Kombination von zwei oder mehr Arten verwendet werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungskit werden als zu oxidierendes Substrat vorzugsweise die vorstehend beschriebenen chromogenen Substrate verwendet. Ein in diesem Kit zu verwendender Analyt und eine zu verwendende Probe sind weiterhin ebenfalls wie oben beschrieben.
Ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen α-GARE umfasst den Schritt der Kultivierung eines neuen erfindungsgemäßen Bakterienstammes. Dieses Verfahren ermöglicht die einfache Herstellung eines erfindungsgemäßen α-GARE.
Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen α-GARE umfasst vorzugsweise die nachfolgenden Aufreinigungsschritte (a) bis (c):

(a) den Schritt des Entfernens der Bakterienzellen aus der Kultivierungslösung, wobei ein Überstand hergestellt wird;
(b) den Schritt der Ausfällung des in dem Überstand enthaltenen Proteins mit Ethanol; und
(c) den Schritt des Abtrennens des Proteins über Chromatographie.

Die vorstehend beschriebenen Aufreinigungsschritte sind nicht als spezifisch einschränkend aufzufassen und können zusammen mit anderen Aufreinigungsschritten durchgeführt werden. Weiterhin ist es möglich, beispielsweise nur den Schritt (a) durchzuführen; die beiden oder mehr Schritte durchzuführen; oder denselben Schritt wiederholt durchzuführen.
Das durch die vorstehend beschriebene Kultivierung des Bakterienstammes erhaltene erfindungsgemäße α-GARE kann als in der Kulturlösung vorliegend oder in aufgereinigtem Zustand verwendet werden. Das α-GARE kann ungeachtet seines Aufreinigungsgrads verwendet werden, solange es α-GA aus dem glykosylierten Protein oder dergleichen freisetzen kann. In aufgereinigter Form kann die spezifische Aktivität des α-GARE jedoch erhöht sein, weil die vom α-GARE unterschiedlichen Komponenten in der Kulturlösung durch die Aufreinigung entfernt werden. Dementsprechend kann die zu verwendende Menge des α-GARE verringert werden, wodurch die Handhabung des α-GARE erleichtert wird. Wenn das α-GARE zur Durchführung verschiedener Reaktionen verwendet wird, kann zusätzlich ein Einfluss der von dem α-GARE unterschiedlichen Bestandteile vermieden werden.
Die ein erfindungsgemäßes α-GARE kodierenden Gene werden vorzugsweise durch Bestimmung der Aminosäuresequenz und der Gensequenz des über die vorstehend beschriebenen Aufreinigungsschritte aufgereinigten α-GARE hergestellt. Die erfindungsgemäßen α-GARE kodierenden Gene sind nicht auf jene beschränkt, welche für die Expression des α-GARE erforderlich sind. Beispiele für solche Gene sind ein DNA-Fragment, RNA, usw. die als Sonde oder Primer verwendet werden, und ein auf der Grundlage der Gensequenz des vorstehend genannten α-GARE basierendes chemisch synthetisiertes Fragment. Unter Verwendung solcher Gene kann eine Rekombinante oder dergleichen hergestellt werden, um α-GARE zu produzieren. Die erfindungsgemäßen Gene des α-GARE können beispielsweise auf folgende Art erhalten werden.
Zunächst wird ein erfindungsgemäßes α-GARE beispielsweise durch die nachfolgend beschriebenen Aufreinigungsschritte aufgereinigt. Über eine übliche Methode, wie beispielsweise den Edman-Abbau, wird dann dessen Aminosäuresequenz bestimmt, aus der die Gensequenz des α-GARE abgeleitet wird. Auf der Grundlage der dadurch erhaltenen Gensequenz wird dann ein DNA-Fragment, RNA-Fragment oder dergleichen über eine übliche Methode wie beispielsweise chemische Synthese oder dergleichen hergestellt. Die Gene des erfindungsgemäßen α-GARE können dann erhalten werden, indem die Gene, die ein α-GARE eines neuen erfindungsgemäßen Bakterienstamms kodieren, unter Verwendung des DNA-Fragments, RNA-Fragments oder dergleichen als Primer, Sonde oder dergleichen kloniert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Chromatogramm der TLC-Analyse von Abbauprodukten, die durch Abbau glykosylierter Peptide mit einem Kulturüberstand eines Bakterienstamms der Gattung Sphingomonas in dem selben Beispiel erhalten wurden.
2 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Menge des von einem Bakterienstamm der Gattung Sphingomonas stammenden α-GARE und der Extinktion in einem weiteren Beispiel der vorliegenden Erfindung zeigt.
3 ist ein Graph, der die thermische Stabilität eines aus einem Bakterienstamm der Gattung Sphingomonas stammenden α-GARE in einem weiteren Beispiel der vorliegenden Erfindung zeigt.
4 ist ein Graph, der eine optimale Temperatur eines α-GARE zeigt, das gemäß einem weiteren Beispiel der vorliegenden Erfindung von einem Bakterienstamm der Gattung Sphingomonas stammt.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Das Screening eines Bakterienstamms, der ein erfindungsgemäßes α-GARE produziert, kann beispielsweise durchgeführt werden, indem man den Bakterienstamm aus dem Boden gemäß einer Isolierungskultivierungsmethode kultiviert, mit der sich ergebenden Kulturlösung eine Abbaureaktion eines glykosylierten Peptids induziert und dann das sich ergebende Abbauprodukt über Dünnschichtchromatographie (TLC) analysiert, wie nachfolgend ausführlich beschrieben wird. Die vorliegenden Erfinder führten eine ausführliche Untersuchung darüber durch, wie der das α-GARE produzierende Bakterienstamm isoliert werden kann, und erstellten schließlich das nachfolgend beschriebene Screeningverfahren. Es kann auf Grundlange stichhaltiger Gründe versichert werden, dass der Erfolg bei der Isolierung des erfindungsgemäßen, das α-GARE produzierenden Bakterienstamms der Erstellung dieses Screeningverfahrens zuzuschreiben ist.
(1) Kultivierungsverfahren
Das nachfolgend gezeigte flüssige Nährstoffmedium wird 20 Minuten bei 121 °C in einem Autoklaven sterilisiert. Eine Bodenprobe wird in sterilisiertem Wasser suspendiert, welches dann dem vorstehend erwähnten sterilisierten flüssigen Nährstoffmedium zugegeben wird, das dann in einer Schüttelkultur (111 U/min) 48 Stunden bei 30 °C kultiviert wird. Die auf diese Weise erhaltene Kulturlösung wird zentrifugiert (12.000 g, 15 min, 4 °C) und der Überstand gesammelt.

(Flüssiges Nährstoffmedium)

Malzextrakt 2,0 g

(Handelsname „Malt extract", Difco Laboratories)

D-Glukose (Nacalai Tesque, Inc.) 2,0 g

Pepton 0,1 g

(Handelsname „Becto peptone", Difco Laboratories)

destilliertes Wasser 100 ml
(2) Abbaureaktion des glykosylierten Peptids
(Verfahren zur Herstellung von glykosyliertem Peptid und glykosylierter Aminosäure)
Unter Verwendung von Valin, Glukose und jedem der nachfolgend gezeigten Peptide werden ein glykosyliertes Peptid mit einer glykosylierten α-Aminogruppe und der Aminosäuresequenz, die zur N-terminalen Aminosäuresequenz der β-Kette von HbA1c identisch ist, und α-Fructosylvalin (nachfolgend hier als „FV" bezeichnet) nach dem herkömmlichen Verfahren hergestellt.
(Peptid)

Val-His (Peptide Institute Inc.: Dessen Glykosylierungsprodukt wird nachfolgend hier als "F2P" bezeichnet.)
Val-His-Leu (Peptide Institute Inc.: Dessen Glykosylierungsprodukt wird nachfolgend hier als "F3P" bezeichnet.)
Val-His-Leu-Thr (Biolink Corporation: Dessen Glykosylierungsprodukt wird nachfolgend hier als "F4P" bezeichnet.)
Val-His-Leu-Thr-Pro (Sigma Chemical Co.: Dessen Glykosylierungsprodukt wird nachfolgend hier als "F5P" bezeichnet.)
Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Ser (Biolink Corporation: Dessen Glykosylierungsprodukt wird nachfolgend hier als "F9P" bezeichnet.)

(L-Aminosäure)
Val, Leu und His (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
(Abbauverfahren)
Zur Herstellung wässriger Lösungen glykosylierter Peptide werden die vorstehend genannten glykosylierten Peptide jeweils in einer Konzentration von 0,01 Mol/l in destilliertem Wasser gelöst. Anschließend werden 50 μl der wässrigen Lösungen der glykosylierten Peptide mit 100 μl des vorstehend genannten Kulturüberstands gemischt und die sich ergebenden Gemische über Nacht bei 37 °C umgesetzt. Die auf diese Weise erhaltenen Reaktionslösungen werden dann lyophilisiert.
(3) TLC-Analyse
Zur Ermittlung des Vorliegens oder Fehlens einer α-GARE-Aktivität werden die Abbauprodukte der vorstehend genannten glykosylierten Peptide mittels TLC auf das Vorliegen von aus den vorstehend genannten glykosylierten Peptiden freigesetztem α-GA analysiert. Das zu verwendende Reagenz und das Verfahren zur Durchführung der Analyse werden nachfolgend beschrieben.
(Dünnschichtplatte)
Handelsname „Pre-Coated TLC plate SILICA GEL 60" (Merck & Co,. Inc.)
(Nachweisreagenz)
Ninhydrin (Funakoshi Co., Ltd.) wird in 75 Vol.-% Ethanol gelöst, so dass sich eine Endkonzentration von 0,5 Vol.-% ergibt.
(Entwicklungslösemittel)
Butanol (Nacalai Tesque, Inc.), Essigsäure (Nacalai Tesque, Inc.) und destilliertes Wasser werden miteinander im Volumenverhältnis von 2:1:1 gemischt.
(Verfahren zur Durchführung der Analyse)
Die vorstehend genannte Dünnschichtplatte wird zuvor so vorbereitet, dass eine Laufstrecke für das Lösungsmittels von 8 cm vorliegt, und eine Startlinie für die Probenauftragungsstellen wird 1 cm vom unteren Ende der Dünnschichtplatte entfernt gesetzt. Unmittelbar vor Beginn der TLC-Analyse werden die vorstehend genannten lyophilisierten Reaktionslösungen in jeweils 15 μl 50 Vol.-% Ethanol gelöst, und dann mit einer 25 μl-Spritze auf die Startlinie aufgetragen. Als Kontrollen werden das vorstehend genannte FV und die jeweiligen Aminosäuren ebenfalls in gleicher Weise auf der Startlinie aufgetragen. Die Dünnschichtplatte wird dann solange in eine Entwicklungskammer gestellt, die zuvor mit dem vorstehend genannten Entwicklungslösemittel gesättigt wurde, bis das Entwicklungslösemittel auf eine Entfernung von etwa 8 cm von der Startlinie aufsteigt. Das Entwicklungslösemittel sollte so in die Entwicklungskammer eingefüllt werden, dass das untere Ende der Platte auf eine Strecke von etwa 0,5 cm in das Lösungsmittel eingetaucht ist.
Nach der Entwicklung wird die Dünnschichtplatte in einem Abzug vollständig luftgetrocknet und das vorstehend genannte Nachweisreagenz (Ninhydrinlösung) aufgesprüht. Die Platte wird dann in einem vorgeheizten Umluftofen (100 °C) erhitzt, um einen Färbungstest durchzuführen. In diesem Färbungstest wird eine Probe, welche die gleiche Mobilität wie das Kontroll-FV aufweist, als Probe mit positiver α-GARE-Aktivität bestimmt. Der Bakterienstamm der Kulturlösung, die für die Herstellung der Probe mit positiver α-GARE-Aktivität verwendet wurde, ist ein α-GARE-produzierender Stamm.
Die TLC-Analyse ist nicht auf den vorstehend genannten Ninhydrinnachweis beschränkt und kann beispielsweise ein Fluoreszenznachweis unter Verwendung eines anderen Reagenz' wie beispielsweise Fluoreszamin und Ethylendiaminsulfat sein.
Weiterhin wird für die vorstehend genannten Kontrollen bevorzugt beispielsweise α-GA eines glykosylierten Proteins oder glykosylierten Peptids verwendet, das als Substrat dient.
Beispiele neuer Bakterienstämme, die von den vorliegenden Erfindern über dieses Screeningverfahren isoliert wurden, umfassen den vorstehend beschriebenen Stamm Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041).
Das erfindungsgemäß für den Nachweis von α-GARE und für die Bestimmung einer α-GARE-Aktivität verwendbare Substrat ist nicht auf die vorstehend genannten glykosylierten Peptide usw. beschränkt. Beispiele für das Substrat sind ein glykosyliertes Protein, glykosyliertes Peptid und dergleichen, die eine glykosylierte N-terminale α-Aminogruppe aufweisen. Wenn ein solches glykosyliertes Protein, glykosyliertes Peptid und dergleichen als Substrat verwendet werden, kann α-GARE beispielsweise nachgewiesen bestimmt werden, indem man eine Redox-Reaktion (z.B. eine Farbentwicklungsreaktion) unter Verwendung des weiter unten beschriebenen FAOD durchführt.
HbAlc und glykosyliertes Globin sind Beispiele für das vorstehend genannte glykosylierte Protein. Diese glykosylierten Proteine können natürlich vorkommen oder über Amadori-Umlagerung zwischen Zuckern und Proteinen synthetisiert werden. Das glykosylierte Globin kann gemäß der von Teale (Teale, F.W.J, Biochem, Biophys, Acta, 35, 543, 1959) vorgeschlagenen Methode über die Globinisierung des HbA1c hergestellt werden, das über HPLC usw. aufgereinigt wurde. Wenn verschiedene Proteine über Synthese glykosyliert werden, gibt es keine Beschränkungen für die zu verwendenden Zucker. Beispiele für die Zucker sind Aldose, z.B. Glukose, und Ketose.
Das vorstehend genannte glykosylierte Peptid kann beispielsweise durch Abbau des vorstehend genannten glykosylierten Proteins mit einer Protease hergestellt werden.
Alternativ kann das vorstehend genannte glykosylierte Peptid über die Amadori-Umlagerung zwischen einem Zucker und einem synthetischen Peptid synthetisiert werden. Es gibt keine spezielle Beschränkung für die Länge der glykosylierten Peptide. Die Zahl der Aminosäurereste liegt jedoch beispielsweise im Bereich von 2 bis 20 und vorzugsweise im Bereich von 2 bis 8.
Ein natürliches Peptid und ein synthetisches Peptid können beispielsweise als das Peptid in der Amadori-Umlagerung mit Zucker verwendet werden. Es gibt keine spezielle Beschränkung hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung dieser Peptide. Jedoch wird vorzugsweise ein Peptid verwendet, das kein Arginin oder Lysin enthält. Wenn das Arginin- oder Lysin-freie Peptid glykosyliert wird, wird nur dessen α-Aminogruppe unter Bildung eines glykosylierten Peptids glykosyliert. Dementsprechend kann unter Verwendung eines solchen glykosylierten Peptids nur eine α-GARE-Aktivität nachgewiesen werden.
In dem speziellen Fall, in dem α-GARE zur Bestimmung von HbA1c verwendet wird, weisen die vorstehend genannten Peptide vorzugsweise die Aminosäuresequenz auf, die mit der N-terminalen Aminosäuresequenz der β-Kette von HbA1c identisch ist. Ein Beispiel für ein solches glykosyliertes Peptid ist das glykosylierte Peptid, bei dem die α-Aminogruppe des N-terminalen Val wie vorstehend in „Abbaureaktion eines glykosylierten Peptids" beschrieben glykosyliert ist. Weiterhin kann beispielsweise durch Abbau von HbAlc mit Trypsin ein glykosyliertes Peptid mit acht Aminosäureresten erhalten werden, bei dem die α-Aminogruppe des N-terminalen Valins glykosyliert ist.
Weiterhin kann für den Fall, in dem das eine glykosylierte N-terminale α-Aminogruppe aufweisende glykosylierte Peptid und dergleichen als Substrat für α-GARE verwendet werden, das α-GARE nicht nur nachgewiesen/bestimmt werden, indem das freigesetzte α-GA nachgewiesen wird, sondern auch durch Nachweis des verbleibenden Peptids nach Freisetzung des α-GA.
Es gibt keine speziellen Beschränkungen für solche glykosylierten Peptide, und diese können beispielsweise Dipeptide wie beispielsweise FV-Leu (nachfolgend hier „FVL"), FV-Gln (nachfolgend hier „FVQ"), FV-Ala (nachfolgend hier „FVA") und FV-Asn (nachfolgend „FVN") sein. Aus diesen Dipeptiden wird durch das α-GARE FV freigesetzt, wodurch Leu, Gln, Ala bzw. Asn erzeugt werden. Das α-GARE kann durch Umsetzen von Leu mit Leucindehydrogenase; von Gln mit Glutamatdehydrogenase; von Ala mit Alaninamintransferase, α-Ketoglutarsäure und Lactatdehydrogenase; von Asn mit Asparaginaminotransferase, α-Ketoglutarsäure, Maltdehydrogenase, usw. und dann Bestimmung der Bildung von NADH oder NAD durch Messung der Extinktion (bei einer Wellenlänge von 340 nm) nachgewiesen werden.
Ein Beispiel für ein glykosyliertes Tripeptid ist weiterhin FV-Leu-Ser (nachfolgend hier „FVLS"). FV wird durch α-GARE aus FVLS freigesetzt, wodurch Leu-Ser gebildet wird. Das Leu-Ser wird durch eine Hydrolase, wie beispielsweise Aminopeptidase, Chymotrypsin oder Proteinase K unter Bildung von Leucin abgebaut, und das somit erzeugte Leucin kann auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben bestimmt werden. Es gibt keine speziellen Beschränkungen für die Länge des Peptids.
Es ist weiterhin möglich, als Substrat für α-GARE auch ein Substrat zu verwenden, das eine Aminosäure und eine Nachweisgruppe umfasst, wobei die Aminosäure eine glykosylierte α-Aminogruppe aufweist; die Nachweisgruppe über eine Amidbindung oder Esterbindung an eine α-Carboxylgruppe der Aminosäure gebunden ist, und die Nachweisgruppe bei Freisetzung, nicht aber in gebundenem Zustand, nachgewiesen werden kann.
Bei Reaktion mit dem vorstehend beschriebenen Substrat spaltet α-GARE die Amidbindung oder Esterbindung zwischen α-GA und der Nachweisgruppe, wodurch das α-GA und die Nachweisgruppe freigesetzt werden. Die auf Grund dieser Spaltung freigesetzte Nachweisgruppe entwickelt beispielsweise eine Farbe/Fluoreszenz, wodurch der Nachweis/die Bestimmung des α-GARE ermöglicht wird.
Es gibt keine speziellen Beschränkungen für die vorstehend beschriebene Nachweisgruppe, und vorzugsweise wird eine Nachweisgruppe verwendet, die, wie vorstehend beschrieben, beispielsweise durch die Farbe oder Fluoreszenz, die sie hervorbringt, nachgewiesen werden kann. Beispiele für Nachweisgruppen, die über ihre Farbe nachgewiesen werden können, sind Paranitroanilid (nachfolgend hier als „p-NA" bezeichnet), para-Nitrophenol, Indol, β-Naphthylamid und 4-Methoxy-β-naphthylamid (4MβNA). Weitere Beispiele für Nachweisgruppen, die über Fluoreszenz nachgewiesen werden können, umfassen 4-Methyl-coumaryl-7-amid. Für den Fall, dass p-NA oder para-Nitrophenol verwendet werden, wird eine Extinktion etwa im Bereich der Wellenlängen von beispielsweise 405 bis 410 nm mit einem Spektrophotometer usw. gemessen. Wenn dagegen 4-Methyl-coumaryl-7-amid verwendet wird, wird eine Extinktion im Bereich der Wellenlänge von beispielsweise 460 nm gemessen, nachdem bei einer Wellenlänge von 380 nm angeregt wurde.
Der Grund dafür, dass das α-GARE das α-GA unabhängig davon freisetzen kann, ob die Nachweisgruppe an die α-Carboxylgruppe über die Amidbindung oder die Esterbindung gebunden ist, wird darin gesehen, dass das α-GARE für die Freisetzung des α-GA die glykosylierte Stelle der α-Aminogruppe erkennt.
Das vorstehend beschriebene Substrat für α-GARE, das die an die α-Carboxylgruppe gebundene Nachweisgruppe umfasst, kann beispielsweise unter Verwendung einer im Handel erhältlichen Aminosäure mit einer daran gebundenen Nachweisgruppe und eines Zuckers nach einer üblichen Methode hergestellt werden.
Das erfindungsgemäße α-GARE kann durch Kultivierung eines α-GARE-produzierenden, erfindungsgemäßen Bakterienstamms hergestellt werden, beispielsweise über ein Verfahren, das dem vorstehend beschriebenen Kultivierungsverfahren gleichwertig ist.
Die Kultivierungsbedingungen von Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041) liegen beispielsweise für die Kultivierungstemperatur im Bereich von 20 °C bis 37 °C, für die Kultivierungsdauer im Bereich von 12 bis 120 Stunden und für den pH des Kultivierungsmediums im Bereich von 6,0 bis 9,5.
Weiterhin kann durch Abtrennung und Aufreinigung des in der Kultivierungslösung enthaltenen α-GARE nach einer herkömmlichen Methode eine Enzympräparation des α-GARE erhalten werden. Die Aufreinigung des α-GARE kann über Kombinierung bekannter Methoden, wie beispielsweise dem Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder dergleichen, isoelektrischer Fällung, Ethanolfällung, Ionenaustauschchromatographie, Gelchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophober Chromatographie usw. erreicht werden.
Zunächst zentrifugiert man die oben beschriebene Kulturlösung (12.000 g, 15 min, 4 °C) zur Entfernung der Bakterienzellen und erhält einen Überstand. Der Überstand wird dann (bezogen auf das Volumen) unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (mit einer Molekulargewichtsausschlussgrenze von 3 kDa: erhältlich unter dem Handelsnamen „MICROZA" von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) 40fach konzentriert. Zu dieser konzentrierten Lösung gibt man entsprechend einem Drittel ihres Volumens ein Anionenaustauschharz (erhältlich unter dem Handelsnamen „DEAE Sepharose FF" von Pharmacia Corporation), um das α-GARE nach der Batch-Methode zu binden und zu eluieren. Die konzentrierte Lösung wird zunächst mit 10 mMol/l einer wässrigen, 0,05 Mol/l NaCl enthaltenden, dibasischen Lösung von 10 mMol/l Kaliumphosphat gewaschen, um nicht-gebundene Proteine zu entfernen. Danach eluiert man das α-GARE mit 0,15 Mol/l NaCl enthaltender 10 mMol/l wässriger Lösung aus dibasischem Kaliumphosphat, um Fraktionen mit α-GARE-Aktivität zu sammeln.
Danach trägt man zur Bindung des α-GARE die aktiven Fraktionen auf eine Säule mit Anionenaustauschharz (erhältlich von Pharmacia Corporation unter dem Handelsnamen „Q-Sepharose FF") auf, die mit 20 mMol/l Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) äquilibriert wurde, und wäscht diese dann mit dem vorstehend beschriebenen Puffer. Danach eluiert man unter Verwendung eines NaCl enthaltenden 20 mMol/l Kaliumphosphatpuffers (pH 7,5) das α-GARE stufenweise bei einer NaCl-Konzentration im Bereich von 0,2 Mol/l bis 0,26 Mol/l. In diesem Fall wird das α-GARE mit einem 20 mMol/l Kaliumphosphatpuffer eluiert, der 0,26 Mol/l NaCl enthält.
Auf diese Weise kann eine teilweise aufgereinigte Enzymlösung des erfindungsgemäßen α-GARE erhalten werden. Es wird darauf hingewiesen, dass von anderen neuartigen erfindungsgemäßen Bakterienstämmen stammende α-GAREs auf die gleiche Weise aufgereinigt werden können.
Das für die Kultivierung der neuen, erfindungsgemäßen Bakterienstämme verwendete Kultivierungsmedium ist nicht auf das vorstehend beschriebene flüssige Nährstoffmedium beschränkt. Das nachfolgend gezeigte Hämoglobin-(Hb)-Kultivierungsmedium kann beispielsweise ebenfalls verwendet werden. Die in diesem Hb-Medium enthaltene Hb-Lösung kann auf die nachstehend beschriebene Weise erhalten werden. (Hb-Kultivierungsmedium: pH 6,0)

Hb-Lösung 0,2 Gew.-%

K₂HPO₄ 0,2 Gew.-%

MgSO₄·7H₂O 0,02 Gew.-%

Spurenmetallsalzlösung 1,0 Gew.-%

Spurenvitaminlösung 0,2 Gew.-%
(Hb-Lösung)

Man zentrifugiert frisches Blut (2.000 g, 10 min, Raumtemperatur) und sammelt die roten Blutkörperchen. Zur Induzierung von Hämolyse gibt man den roten Blutkörperchen eine entsprechende Menge (Volumen) destilliertes Wasser zu. Zur Entfernung der Membranen der roten Blutkörperchen usw. zentrifugiert man dann das sich ergebende Hämolysat (2.000 g, 15 min, Raumtemperatur). Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird als die Hb-Lösung verwendet. (Spurenmetallsalzlösung)

CaCl₂·2H₂O	200 mg
H₃BO₃	50 mg
CuSO₄·5H₂O	20 mg
KI	50 mg
FeSO₄·7H₂O	100 mg

MnSO₄·5H₂O	200 mg
ZnSO₄·7H₂O	200 mg
Na₂MoO₄·2H₂O	50 mg
Rest	Wasser (Gesamtvolumen = 500 ml)

(Spurenvitaminlösung)

Ca-Pantothensäure	40 mg
Inositol	20 mg
Niacin	40 mg
p-Aminobenzoat	20 mg
Pyridoxinhydrochlorid	40 mg
Thiaminhydrochlorid	40 mg
Biotin	0,2 mg
Vitamin B₁₂	0,05 mg
Rest	Wasser (Gesamtvolumen = 100 ml)

Im Folgenden wird ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids erklärt, wobei als Beispiel der Fall genommen wird, bei dem die Probe Blutzellen sind und die darin enthaltenen glykosylierten Proteine (z.B. HbAlc) unter Verwendung von α-GARE und FAOD bestimmt werden.
Zunächst trennt man nach der üblichen Methode, wie beispielsweise Abtrennung durch Zentrifugation, die Fraktionen der Blutzellen vom Gesamtblut ab und induziert eine Hämolyse der Blutzellfraktionen. Es gibt keine spezielle Beschränkung für die Methode der Induzierung der Hämolyse. Beispiele für die Methode umfassen eine Methode unter Verwendung eines oberflächenaktiven Mittels, eine Methode unter Verwendung von Ultraschallwellen und eine Methode, bei der ein Unterschied im osmotischen Druck verwendet wird. Auf Grund der leichten Durchführbarkeit wird davon die Methode bevorzugt, bei der ein oberflächenaktives Mittel verwendet wird.
Beispiele für das oberflächenaktive Mittel sind Polyoxyethylen-p-t-octylphenylether, beispielsweise erhältlich unter dem Handelsnamen „Triton X-100"; Polyoxyethylensorbitanalkylester, beispielsweise erhältlich unter dem Handelsnamen „Tween-20"; und Poly(oxyethylen)alkylether, beispielsweise erhältlich unter dem Handelsnamen „Brij 35". Die Behandlung mit den vorstehend genannten oberflächenaktiven Mitteln kann unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen durchgeführt werden: Beispielsweise gibt man für den Fall, dass die zu behandelnde Lösung 1 bis 10 Vol.-% Blutzellen enthält, das oberflächenaktive Mittel der Lösung auf eine Konzentration von 0,1 bis 1 Gew.-% zu und rührt das sich ergebende Gemisch ungefähr 5 Sekunden bis 1 Minute bei Raumtemperatur.
Anschließend wird das vorstehend beschriebene Probenhämolysat mit dem erfindungsgemäßen α-GARE enzymbehandelt, wodurch α-GA aus dem glykosylierten Protein in dem Probenhämolysat freigesetzt wird. Die vorstehend erwähnte Enzymbehandlung mit dem α-GARE wird beispielsweise in einem Puffer durchgeführt. Die Behandlungsbedingungen werden in Abhängigkeit von beispielsweise der Art (z.B. Unterschieden bezüglich der Quelle und dgl.) des zu verwendenden α-GARE und den Arten und Konzentrationen des glykosylierten Proteins oder glykosylierten Peptids geeignet ausgewählt.
Beispielsweise wird für den Fall, bei dem der Analyt HbAlc ist und das α-GARE aus Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041) stammt, die Enzymbehandlung beispielsweise unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Die α-GARE-Konzentration der Reaktionslösung liegt im Bereich von 0,01 U/l bis 1 KU/l, die Temperatur im Bereich von 15 °C bis 60 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 3 Minuten bis 6 Stunden, und der pH im Bereich von 5,0 bis 10,0; vorzugsweise liegt die Temperatur im Bereich von 30 °C bis 37 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 5 bis 60 Minuten und der pH im Bereich von 6 bis B. In diesem Fall können als der vorstehend beschriebene Puffer Tris-Salzsäure-(HCl)-Puffer, Phosphatpuffer, Good's-Puffer (EPPS-Puffer, PIPES-Puffer, usw.) und dergleichen verwendet werden. Von anderen neuartigen, erfindungsgemäßen Bakterienstämmen stammendes α-GARE kann ebenso auf die gleiche Weise verwendet werden.
Anschließend wird das durch die vorstehend beschriebene Behandlung mit α-GARE erhaltene Abbauprodukt (α-GA) mit FAOD behandelt. Die durch FAOD katalysierte Abbaureaktion des α-GA wird durch die nachstehend gezeigte Formel (1) gezeigt.
(Formel 1) R¹-CO-CH₂-NH-R2 + H₂O + O₂ →R¹-CO-CHO + NH₂R² + H₂O₂
Wie in Formel (1) gezeigt, werden ein Zucker (R¹-CO-CHO), eine Aminosäure (NH₂-R²) und Wasserstoffperoxid (H₂O₂) gebildet, wenn das durch die α-GARE-Behandlung erhaltene Abbauprodukt (α-GA : R¹-CO-CH₂-NH-R²) mit FAOD behandelt wird.
In der Formel (1) bezeichnet R¹ einen von einem Zucker stammenden Rest, der noch nicht der Glykosylierungsreaktion unterworfen wurde (d.h. Zuckerrest). Der Zuckerrest (R¹) ist ein Aldoserest, wenn der Zucker vor der Reaktion eine Aldose ist, und ein Ketoserest, wenn der Zucker vor der Reaktion eine Ketose ist. Wenn der Zucker vor der Reaktion beispielsweise Glukose ist, nimmt der Zucker in dem glykosylierten Produkt nach der Glykosylierungsreaktion auf Grund der Amadori-Umlagerung die Fructosestruktur an. In diesem Fall ist der Zuckerrest (R¹) ein Glukoserest (Aldoserest). Dieser Zuckerrest (R¹) kann beispielsweise durch -[CH(OH)]_n-CH₂OH dargestellt werden, wobei n für eine ganze Zahl von 0 bis 6 steht.
Weiterhin steht in Formel (1) R² für einen Aminosäurerest mit einer glykosylierten α-Aminogruppe, und R² kann durch die nachfolgend gezeigte Formel (2) dargestellt werden. In der Formel (2) steht R³ für eine Aminosäureseitenkettengruppe.
(Formel 2) -CHR³-CO-OH
Solange sie die vorstehend beschriebene Abbaureaktion katalysiert, gibt es keine Beschränkung für die vorstehend beschriebene FAOD, und sie kann beispielsweise weitere katalytische Funktionen aufweisen. Ähnlich wie die Enzymbehandlung mit α-GARE wird die Behandlung mit FAOD vorzugsweise in einem Puffer durchgeführt. Es gibt keine speziellen Beschränkungen für den Puffer, und dieser kann beispielsweise Tris-HCl-Puffer, EPPS-Puffer, PIPES-Puffer usw. sein.
Die FAOD-Behandlung wird beispielsweise unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Die FAOD-Konzentration der Reaktionslösung liegt im Bereich von 0,1 bis 10 KU/l, die Temperatur im Bereich von 15 °C bis 50 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 1 bis 60 Minuten, und der pH im Bereich von 6 bis 9; vorzugsweise liegt die FAOD-Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2 KU/l, die Temperatur im Bereich von 30 °C bis 37 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 5 bis 20 Minuten und der pH im Bereich von 7 bis 8.
Anschließend wird das durch die FAOD-Behandlung gebildete Wasserstoffperoxid durch eine Redox-Reaktion unter Verwendung der Peroxidase (POD) und eines Substrats, das bei Oxidation eine Farbe bildet, bestimmt.
Im Allgemeinen wird die Redox-Reaktion in einem Puffer unter Bedingungen induziert, die abhängig von der Konzentration des Wasserstoffperoxids in der Reaktionslösung usw. in angemessener Weise ausgewählt wurden. Die Redox-Reaktion wird beispielsweise unter den folgenden Bedingungen induziert: Die POD-Konzentration in der Reaktionslösung liegt im Bereich von 10 U/l bis 400 KU/l, die Reaktionstemperatur im Bereich von 15 °C bis 40 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 0,1 bis 5 Minuten und der pH im Bereich von 5 bis 10; vorzugsweise liegt die POD-Konzentration im Bereich von 50 U/l bis 20 KU/l, die Reaktionstemperatur im Bereich von 30 °C bis 37 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 0,1 bis 1 Minuten und der pH im Bereich von 5 bis 8. Darüber hinaus gibt es keine speziellen Beschränkungen für den Puffer, und dieser kann beispielsweise der gleiche Puffer sein, der für die oben beschriebene FAOD-Behandlung verwendet wurde.
Für den Fall, bei dem das vorstehend beschriebene chromogene Substrat als Substrat verwendet wird, kann die Konzentration des Wasserstoffperoxids durch Messung der Farbentwicklung (d.h. der Extinktion der Reaktionslösung) mit einem Spektrophotometer bestimmt werden. Die Konzentration des glykosylierten Proteins in der Probe kann aus der Konzentration des Wasserstoffperoxids bestimmt werden.
Bei diesem Bestimmungsvorgang können die jeweiligen Behandlungsschritte, wie oben beschrieben, einzeln durchgeführt werden. In einigen Fällen können einige der Schritte oder alle Schritte gleichzeitig durchgeführt werden. Beispielsweise können der α-GARE-Behandlungsschritt und der FAOD-Behandlungsschritt gleichzeitig durchgeführt werden, indem α-GARE und FAOD zur Durchführung der Reaktion der Probe zur gleichen Zeit zugegeben werden. Der FAOD-Behandlungsschritt und der Farbentwicklungsschritt unter Verwendung von POD können ebenfalls gleichzeitig durchgeführt werden, indem FAOD, POD und das chromogene Substrat zur Durchführung der Reaktion zur gleichen Zeit dem Abbauprodukt zugegeben werden, das durch die α-GARE-Behandlung erhalten wird.
Weiterhin können der Schritt der Hämolyseinduktion durch das oberflächenaktive Mittel und der α-GARE-Behandlungsschritt ebenfalls gleichzeitig durchgeführt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Im vorliegenden Beispiel wurden glykosylierte, α-GA enthaltende Peptide mit einem Kulturüberstand eines neuen, erfindungsgemäßen, α-GARE-produzierenden Bakterienstamms umgesetzt, um das α-GA daraus freizusetzen. Soweit nicht anders beschrieben, wurden die Kultivierung des Bakterienstammes, der Abbau der glykosylierten Peptide und die TLC-Analyse der Abbauprodukte auf die gleiche Weise durchgeführt wie bei dem vorstehend beschriebenen Screeningverfahren.
Zunächst wurden 5 ml des flüssigen Nährstoffmediums (pH 8,0) mit dem nachstehend gezeigten, neuen, erfindungsgemäßen Bakterienstamm inokuliert und dann über eine Schüttelkultur 48 Stunden bei 30 °C kultiviert. Die auf diese Weise erhaltene Kulturlösung wurde zur Entfernung der Bakterienzellen zentrifugiert und der erhaltene Überstand als Rohenzymlösung verwendet.
Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041)
Anschließend wurden 100 μl der vorstehend beschriebenen Rohenzymlösung mit jeweils 50 μl der vorstehend beschriebenen 0,01 Mol/l wässrigen Lösungen der glykosylierten Peptide (F2P bzw. F3P) gemischt. Die sich ergebenden Gemische wurden bei 30 °C über Nacht umgesetzt und die auf diese Weise erhaltenen Reaktionslösungen über TLC analysiert. Die Ergebnisse dieser TLC-Analyse sind in 1 gezeigt. 1 ist ein Chromatogramm der TLC-Analyse von Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041).
In 1 zeigt Spur Nr. 3 das F3P-Abbauprodukt.
Weiterhin wird die Mobilität der in diesen Zeichnungen mit Pfeilen markierten Spots nachfolgend in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Wie in 1 und vorstehend in Tabelle 1 gezeigt, erschienen die Abbauprodukte der mit den jeweiligen Rohenzymlösung behandelten glykosylierten Peptide als Spots (die in den Zeichnungen mit Pfeilen markiert sind) mit der gleichen Mobilität wie der des Spots des Kontroll-FV. Diese Ergebnisse zeigen, dass erfindungsgemäßes α-GARE aus einem glykosylierten Peptid α-GA freisetzt. Da die Spots der vorstehend genannten Abbauprodukte eine im Vergleich zu Val unterschiedliche Mobilität aufwiesen, wurde weiterhin ermittelt, dass der Zucker nicht von dem durch α-GARE freigesetzten FV abgetrennt war.
Beispiel 2
Im vorliegenden Beispiel wurde die Freisetzung von α-GA (FV) für ein glykosyliertes Peptid bestätigt, das mit einem aus einem erfindungsgemäßen, neuartigen Bakterienstamm stammenden Rohenzym behandelt worden war.
Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041) wurde in dem vorstehend erwähnten Hb-Kultivierungsmedium (pH 6,0) 5 Tage bei 28 °C in hin- und hergehender Schüttelkultur kultiviert. Die sich ergebende Kulturlösung wurde zentrifugiert (12.000 g, 15 min, 4 °C) und der erhaltene Überstand als Rohenzymlösung verwendet.
Man gab 100 μl der Rohenzymlösung und 50 μl 0,2 Mol/l Kaliumphosphatpuffer (pH 8.0) zu 50 μl wässriger 0,1 Mol/l F4P-Lösung und setzte das sich ergebende Gemisch über Nacht bei 37 °C um. Zur Entfernung von hochmolekularen Substanzen, wie Proteinen und dergleichen, wurde die auf diese Weise erhaltene Reaktionslösung auf eine Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsausschlussgrenze von 5 kDa: erhältlich unter dem Handelsnamen „Ultra Free MC Filter" von der Millipore Corporation, nachfolgend Bezugnahme auf diese Angaben) aufgetragen. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde dann lyophilisiert.

Anschließend wurde das lyophilisierte Produkt in 20 μl des nachfolgend gezeigten Eluenten A gelöst. Die sich ergebende Lösung wurde unter den nachstehend gezeigten Bedingungen einer Reversphasenchromatographie unterzogen und die Lösung alle 15 Sekunden nach dem Start der Analyse fraktioniert (250 μl/l Fraktion). Weiterhin wurde FV als Kontrolle unter den selben Bedingungen eluiert und dessen Elutionszeit gemessen. (Reversphasenchromatographie)

Säule;	Handelsname „Hypercarb" (GL Sciences Inc.)
Größe;	100 mm × 4,6 mm
Schleife;	1000 μl
Eluent A;	Trifluoressigsäure : destilliertes Wasser
Eluent B;	Trifluoressigsäure : destilliertes Wasser : Acetonitril
Gradientenbedingungen;	0 bis 25 Minuten: 0 bis 20 Vol.-% Eluent B
	nach 25 Minuten : 20 Vol.-% Eluent B
Fließgeschwindigkeit;	1 ml/min
Säulentemperatur;	37 °C
Nachweiswellenlänge;	210 nm, 230 nm

Anschließend wurde für jede über die vorstehend beschriebene Reversphasenchromatographie erhaltene Trennungsfraktion der Nachweis von FV in der nachfolgend beschriebenen Weise durchgeführt.
(Nachweisverfahren für FV)
Zunächst gab man 20 μl einer wässrigen 10 μMol/l Wasserstoffperoxidlösung zu 20 μl der jeweiligen Trennfraktionslösungen. Dann gab man weiter 60 μl der nachstehend gezeigten Redoxlösung A zu und setzte die sich ergebenden Gemische 15 Minuten bei 37 °C um.

Anschließend wurde die Extinktion dieser Reaktionslösungen bei der Hauptwellenlänge von 694 nm und der Unterwellenlänge von 884 nm über ein automatisiertes biochemisches Analysegerät (erhältlich unter dem Handelsnamen „JCA-BM 8" von Japan Electron Optics Laboratory Co. Ltd., im weiteren Verlauf gleichbleibend) gemessen. (Zusammenlösung der Redoxlösung A)

Handelsname „DA 64"	33 μMol/l
(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., nachfolgend gleichbleibend)
POD	33 KU/l
(Typ III: Toyobo Co., Ltd., nachfolgend gleichbleibend)
FAOD (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)	3,3 KU/l
Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0)	0,17 Mol/l

Im Ergebnis wurde eine Farbentwicklung in den Trennfraktionen beobachtet, die einer Elutionszeit von 5 bis 6 Minuten in der Reversphasenchromatographie entsprachen. Eine solche Elutionszeit entsprach der des Kontroll-FV und wies somit darauf hin, dass FV in dem F4P-Abbauprodukt vorlag.
Beispiel 3
Im vorliegenden Beispiel wurde eine α-GARE-Aktivität bei verschiedenen α-GARE-Konzentrationen bestätigt.
(1) Herstellung eines teilweise aufgereinigten Enzyms

Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041) wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 kultiviert. Aus der Kulturlösung wurde Überstand gewonnen und als Rohenzymlösung verwendet. Dann wurden unter Verwendung der Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsausschlussgrenze von 5 kDa) 50 ml der Rohenzymlösung auf ein Endvolumen von 5 ml konzentriert und dann durch Gelchromatographie unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen teilweise aufgereinigt. (Gel-Säulenchromatographie)

Säule:	Handelsname „Superdex 200pg"
	(Pharmacia Corporation)
Säulengröße:	Innendurchmesser = 260 mm, Länge = 600 mm
Fließgeschwindigkeit:	5,2 ml/min
Nachweiswellenlänge:	280 nm, 230 nm
Eluent:	20 Mol/l Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5)

1 Fraktion:

7 ml

(2) Bestimmung der α-GARE-Aktivität
(Abbauverfahren)
Man gab jeweils vorbestimmte Mengen (25, 50, 75, 100, 125 und 140 μl) des vorstehend beschriebenen, teilweise aufgereinigten α-GARE und 1 Mol/l Kaliumphosphatpuffers (pH 8,0) zu 50 μl wässriger 10 Mol/l F3P-Lösung und setzte die sich ergebenden Gemische über Nacht bei 37 °C um. Das Gesamtvolumen der Reaktionslösung wurde auf 200 μl eingestellt, so dass der vorstehend genannte Puffer in der Lösung mit einer Endkonzentration von 50 mMol/l enthalten war.
(Nachweisverfahren)
Die Reaktionslösung wurde (nach Volumen) 3fach mit destilliertem Wasser verdünnt. Man gab in dieser Reihenfolge 15 μl 10 Mol/l Wasserstoffperoxidlösung und 70 ml der nachfolgend beschriebenen Redoxlösung B zu 25 μl dieser verdünnten Lösung und setzte das sich ergebende Gemisch 15 Minuten bei 37 °C um. Anschließend wurde die Extinktion des Gemisches auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 gemessen. Dann bestimmte man den Anstieg der Extinktion innerhalb von 5 Minuten als α-GARE-Aktivität, wobei der bei Fehlen jedes α-GARE erhaltene Wert als Nullwert verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in FIG. 6 gezeigt. FIG. 6 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Menge des aus Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041) stammenden α-GARE und dem Ausmaß der Farbentwicklung (Extinktion). (Zusammensetzung der Redoxlösung B)

„DA 64" 31 μMol/l

POD 31 KU/l

FAOD 0,8 KU/l

Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) 0,16 Mol/l
Wie in FIG. 6 gezeigt, stieg die Aktivität des α-GARE in mengenmäßiger Abhängigkeit an, wenn sich die Menge des α-GARE im Bereich von 20 bis 100 μl befand.
Beispiel 4
Im vorliegenden Beispiel wurde die thermische Stabilität des erfindungsgemäßen α-GARE bestimmt.
Das teilweise aufgereinigte Enzym, das in Beispiel 3 aus dem von Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041) stammenden α-GARE hergestellt wurde, wurde bei den jeweiligen Temperaturen (30 °C, 37 °C, 50 °C, 60 °C und 70 °C) 20 Minuten inkubiert. Man gab 100 μl der hitzebehandelten, teilweise aufgereinigten Enzyme und 50 μl 50 Mol/l Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) zu 50 μl der gleichen wässrigen F3P-Lösung, die in Beispiel 3 verwendet wurde, und setzte die sich ergebenden Gemische 18 Stunden bei 37 °C um. Anschließend wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 durch Verwendung von FAOD in 20 μl der sich ergebenden Reaktionslösungen eine Redox-Reaktion induziert, und die Extinktion jeder Lösung gemessen. Ein Anstieg der Extinktion innerhalb von 5 Minuten wurde als α-GARE-Aktivität gemessen und die Restaktivität (%) berechnet, wobei man als 100 % die Aktivität des nicht-hitzebehandelten α-GARE einsetzte. Die Ergebnisse sind in FIG. 7 gezeigt. FIG. 7 ist ein Graph, der die thermische Stabilität des aus Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041) stammenden α-GARE zeigt.
Wie in FIG. 7 gezeigt, wies das α-GARE selbst nach einer Hitzebehandlung bei 30 °C bis 50 °C eine Restaktivität von 100 % auf. Das α-GARE wurde jedoch durch Hitzebehandlung bei 70 °C vollständig inaktiviert.
Beispiel 5
Im vorliegenden Beispiel wurde eine optimale Temperatur für ein erfindungsgemäßes α-GARE bestimmt.
Man gab teilweise aufgereinigtes Enzym, das aus von Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041) stammendem α-GARE hergestellt worden war, und 50 μl 50 Mol/l Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) zu 50 μl der gleichen wässrigen F3P-Lösung wie in Beispiel 3 verwendet. Man setzte das sich ergebende Gemisch bei den jeweiligen Temperaturen (10 °C, 30 °C, 37 °C, 50 °C, 60 °C und 70 °C) 8 Stunden um. Die Reaktionslösungen wurden 3fach mit destilliertem Wasser verdünnt. Eine Redox-Reaktion wurde unter Verwendung von FAOD mit 25 μl der verdünnten Lösungen induziert und die Extinktion jeder Lösung; auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 gemessen. Daraufhin wurde ein Anstieg der Extinktion innerhalb von 5 Minuten als α-GARE-Aktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind in FIG. 8 gezeigt. FIG. 8 ist ein Graph, der eine optimale Temperatur des von Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041) stammenden α-GARE zeigt.
Wie in der Zeichnung gezeigt ist, lag die optimale Temperatur des α-GARE im Bereich von 37 °C.
Beispiel 7
Im vorliegenden Beispiel wurde das Molekulargewicht eines erfindungsgemäßen α-GARE bestimmt.
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 trennte man Kulturüberstand von Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041) über Gelchromatographie ab, die unter den selben Bedingungen durchgeführt wurde. Anschließend wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 in jeder Fraktion unter Verwendung von FAOD zur Bestimmung der α-GARE-Aktivität eine Redox-Reaktion induziert. Andererseits wurde unter den selben Bedingungen ein Molekulargewichtsmarker (erhältlich von Oriental Yeast Co., Ltd. unter dem Handelsnamen „MW Marker (HPLC)" erhältlich) der Gel-Säulenchromatographie unterworfen. Aus der durch die Gel-Säulenchromatographie erhaltenen Kalibrierungskurve und dem Ergebnis der α-GARE-Elution wurde gefolgert, dass das Molekulargewicht des aus Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041) stammenden α-GARE ungefähr 40.000 bis 50.000 betrug.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Wie vorstehend ausführlich beschrieben, kann ein erfindungsgemäßes, neues Enzym, α-GARE, einen Aminosäurerest mit einer glykosylierten α-Aminogruppe aus einem glykosylierten Protein usw. freisetzen. Dementsprechend kann HbA1c als ein Indikator für Diabetes präzise und einfach bestimmt werden, wenn α-GARE in einem Verfahren zur Bestimmung des glykosylierten Proteins usw. unter Verwendung von FAOD verwendet wird. Die Bestimmung von HbA1c kann daher in klinischen Tests usw. zur praktischen Anwendung kommen.

Claims

Enzym, welches eine Aminosäure mit einer glykosylierten α-Aminogruppe aus einem glykosylierten Protein oder einem glykosylierten Peptid freisetzt, erhalten aus dem Bakterienstamm Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041).
Enzym nach Anspruch 1, wobei die freizusetzende Aminosäure mit der glykosylierten α-Aminogruppe Valin mit einer glykosylierten α-Aminogruppe ist.
Verfahren zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids, umfassend: Abbau eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids mit einem Enzym, wobei man ein Abbauprodukt erhält; Durchführung einer Redox-Reaktion zwischen dem Abbauprodukt und einer Fructosylaminosäureoxidase; und Bestimmung der Redox-Reaktion, indem die Menge des glykosylierten Proteins oder des glykosylierten Peptids bestimmt wird, wobei ein Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 2 als Enzym verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das zu bestimmende glykosylierten Protein glykosyliertes Hämoglobin ist.
Kit zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids, umfassend: eine Protease; eine Fructosylaminosäureoxidase; eine Peroxidase; und ein Substrat, das über eine Reaktion mit der Peroxidase oxidiert wird, wobei die Protease ein Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 2 umfasst.
Bakterienstamm Sphingomonas parapaucimobilis KDK1004 (FERM BP-7041).