EP0584104A1 - Verfahren zur gewinnung von dimethylamin- bzw. trimethylamin-dehydrogenase, danach erhaltene dehydrogenasen und ihre verwendung - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von dimethylamin- bzw. trimethylamin-dehydrogenase, danach erhaltene dehydrogenasen und ihre verwendung

Info

Publication number
EP0584104A1
EP0584104A1 EP92909154A EP92909154A EP0584104A1 EP 0584104 A1 EP0584104 A1 EP 0584104A1 EP 92909154 A EP92909154 A EP 92909154A EP 92909154 A EP92909154 A EP 92909154A EP 0584104 A1 EP0584104 A1 EP 0584104A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dehydrogenase
tma
trimethylamine
dma
dimethylamine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP92909154A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Werner Hummel
Udo Wendel
Susanne Sting
Georg Krix
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP0584104A1 publication Critical patent/EP0584104A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
    • A23B2/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general
    • A23B2/70—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals
    • A23B2/725—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23B2/729—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B2/783—Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
    • A23B4/00—Preservation of meat, sausages, fish or fish products
    • A23B4/14—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12
    • A23B4/18—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12 in the form of liquids or solids
    • A23B4/20—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B4/22—Microorganisms; Enzymes; Antibiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

Definitions

  • the invention relates to the production of analytically useful dimethylamine or trimethylamine dehydrogenase (DMA or TMA dehydrogenase) and it encompasses the enzymes obtained thereafter and their use.
  • DMA or TMA dehydrogenase analytically useful dimethylamine or trimethylamine dehydrogenase
  • DMA or TMA dehydrogenase are suitable enzymes for the selective detection of dimethylamine or trimethylamine.
  • dimethylamine or trimethylamine is important in the food sector (e.g. fish spoilage) and in clinical diagnostics (trimethylaminuria, betaine analysis).
  • the trimethylamine detection is particularly important for determining the freshness of fish in fresh fish.
  • the fish muscle contains high levels of trimethylamine N-oxide, which is broken down postmortem by bacterial decomposition to trimethylamine (TMA).
  • TMA trimethylamine
  • the striking pungent smell of spoiling sea fish is mainly caused by TMA.
  • a number of different, rather unspecific parameters have already been proposed in the analytical literature for determining fish freshness, for example the nucleotide content, the ammonia concentration, volatile acids, catalase activity or the pH value. As the primary breakdown product, however, TMA is of particular diagnostic value.
  • a chemical TMA determination method using picric acid has found its way into practice (Dyer, W., J. Fish Res. Vol. Can. 6.
  • Trimethylaminuria is a disorder of the choline metabolism.
  • the defective enzyme is trimethylamine N-oxidase, which catalyzes the formation of trimethylamine N-oxide.
  • a specific trimethylamine detection is required for the diagnosis.
  • mass spectrometry King GS et al. Biomed. Mass Spectrom.
  • the selective determination of dimethylamine is particularly suitable for the detection of the fresh state of frozen fish, in which other degradation routes predominate, which is why the DMA content can provide information about a consumption limit.
  • the object of the invention is therefore to provide an enzyme which is suitable for specific DMA or TMA detection.
  • This object is achieved according to the invention essentially by multiplying and harvesting a Paracoccus strain on a culture medium containing dimethylamine or trimethylamine, mechanically disrupting the harvested cells for enzyme release, removing liquid fragments from the liquid obtained and possibly cleaning up the enzyme contained in the crude extract
  • Paracoccus strains isolated from soil samples can be used to obtain two dehydrogenases that are similar per se and which either - grown on DMA-containing medium - for selective DMA conversion or - grown on TMA-containing medium - are capable of selective TMA implementation.
  • the new enzymes are capable of selectively converting dimethylamine (DMA-DH) or trimethylamine (TMA-DH), which can be used for analytical purposes.
  • DMA-DH dimethylamine
  • TMA-DH trimethylamine
  • Soil samples are suitable as the starting material for the production of the TMA or DMA dehydrogenase-forming microorganisms, from which in particular microorganisms of the genus Paracoccus are isolated which, when grown on a nutrient medium containing DMA or TMA, contain a suitable DMA or Form TMA dehydrogenase and specifically the Paracoccus strain DSM 6512.
  • TMA dehydrogenase isolated from this Paracoccus strain shows the following essential parameters in purified form:
  • the DMA dehydrogenase isolated from this Paracoccus strain shows the following essential parameters in purified form:
  • dehydrogenases according to the invention show a high specificity with regard to the conversion of DMA or TMA in the presence of other alkylamines, so that they are used for the analytical determination of dimethylamine (DMA dehydrogenase) or trimethylamine (TMA dehydrogenase) in a mixture with others Alkylamines are particularly suitable in the food and diagnostic fields.
  • dimethylamine or trimethylamine are formed as degradation products of a chemical or enzymatic reaction, in particular for determining the freshness of fresh (with TMA-DH) or frozen (with DMA-DH) fish.
  • betaine in clinical samples after its reaction with lyase with elimination of trimethylamine, which is reacted with TMA-DH in the presence of phenazineethosulfate or phenazinemethosulfate and dichlorophenolindophenol and evaluated photometrically.
  • Fig. 1 Growth and TMA-DH formation of Paracoccus DSM 6512 as a function of time;
  • Example 1 Isolation of microorganisms which contain the enzyme TMA dehydrogenase
  • a bioreactor contains 1 L of medium A with the following
  • the pH is adjusted to 7.0 and the solution is sterilized at 121 ° C. for 30 minutes.
  • the bioreactor is inoculated with approx. 5 g of a soil sample (compost). Suitable microorganisms of the soil sample grow in the closed vessel, the temperature is kept at 22 ° C. By supplying sterile-filtered air, the organisms grow largely under oxygen saturation conditions.
  • sterilized medium A is pumped in from a storage bottle (0.1 l / h), and reactor contents are removed at the same time with the same flow rate.
  • a sample is taken daily and tested for TMA dehydrogenase activity.
  • TMA-1 Taxonomic determination of the isolate TMA-1: The microbiological characterization showed that the strain TMA-1 belongs to the genus Paracoccus. The following properties were identified: Gram-negative cocci, immobile, strictly aerobic, no acid formation, not chemolithoautotrophic. Good utilization of methylamine, dimethylamine, trimethylamine, trimethylamine-N-oxide, N-methylformamide, N, N-dimethylformamide; weak growth on form amide. The TMA-1 strain differs from the two Paracoccus species denitrificans and halodenitrificans in that it is not chemolithoautotrophic. The strain was deposited on May 2, 1991 with the German Collection of Microorganisms, Braunschweig, under the number DSM 6512.
  • the strain TMA-1 was grown in the following medium B (per 1 1):
  • the medium was inoculated with 300 ml of a 24-hour-old preculture after the brood temperature had reached 30 ° C.
  • the course of the enzyme activity over time could be determined by taking samples at different times and the activity of the TMA dehydrogenase after cell disruption in the cell-free Supernatant was determined.
  • FIG. 1 shows that maximum enzyme activity can only be obtained within a short period of time towards the end of the growth phase.
  • the 8 1 fermenter was after 21 hours at an OD 660 of 4 - 35 cropped by a centrifuge, to obtain 160 g of wet biomass.
  • the biomass can be stored frozen at -20 ° C, whereby no loss of activity can be seen over several months.
  • the enzyme can be released from the cells by methods known per se (ultrasound, high-pressure homogenization, wet grinding, etc.).
  • the cells were disrupted by wet grinding with glass beads.
  • the biomass was suspended in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0) so that the concentration of the cell wet mass was 40%.
  • the cell contents were obtained from the suspension by mechanical disruption using a vibrating mill (type MM2; Retsch, Haan, FRG). The digestion took place in 1.5 ml Eppendorf tubes.
  • the Eppendorf tubes were filled with 1.2 g of glass beads (0.5 mm in diameter) and 0.6 ml of 40% cell suspension and shaken for 15 min at a frequency of 1800 / sec. After centrifugation (3 min at 12000 rpm) in a table centrifuge, a viscous supernatant was obtained which was used for the further enzyme extraction.
  • the supernatant after PEI precipitation was subjected to ion exchange chromatography on a Mono-Q column (Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC); Pharmacia, Freiburg FRG). 10 ml of the with a 0.2 ⁇ m Filters filtered crude extract were applied to the column in 2 ml portions and eluted with a concentration gradient of 0.05 M - 0.2 M sodium pyrophosphate buffer pH 9.0. The enzyme was detached from the column at a buffer concentration of approximately 0.09 M. The fractions containing the enzyme were then combined and diluted 1: 2 with 0.05 M sodium pyrophosphate buffer.
  • FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
  • the solution was again applied in 2 ml portions to the Mono-Q column and eluted with a NaCl gradient (0-1 M); the enzyme was detached at a NaCl concentration of 400 mM.
  • a specific activity of 4 U / mg was measured in fractions with high enzyme activity.
  • An SDS gel prepared with these fractions showed on the basis of the protein staining that the TMA dehydrogenase was here at least 90% purified.
  • TMA dehydrogenase The activity of the TMA dehydrogenase was determined using the following test approach (C):
  • the initial reaction rate was measured at 595 nm on a spectrophotometer at 30 ° C.
  • Fig. 2 shows the pH profile of this reaction, maximum activity is obtained at a pH of 9.
  • the TMA dehydrogenase has its stability maximum at pH 9.0.
  • the pure enzyme solution has a residual activity of 80% after 6 days at 4 ° C. With the addition of 50% glycerol, a residual activity of 70% could be measured after 4 weeks at - 20 ° C.
  • reaction rate was measured at different temperatures. After sufficient preheating of the test components without enzyme, the reaction was started by adding enzyme solution.
  • the TMA dehydrogenase shows maximum activity at 45 ° C, at 60 ° C no activity can be measured.
  • Table 2 Influence of various metal cations and inhibitors. As a control, the compounds were used in parallel tests without TMA, in order to show a possible influence of the compounds on the enzyme test.
  • the test (see Example 2.D.) was replaced by TMA on the one hand with a number of other methylamine compounds (1 mM), and on the other hand the electron acceptor phenazinethosulfate (including the redox dye dichlorophenolindophenol) was replaced by other electron acceptors and then the Enzyme activity determined.
  • the results showed that only TMA is apparently reacted with respect to the amine component, and were inactive: dimethylamine, methylamine, dimethylethylamine, trimethylamine-N-oxide, choline chloride, betaine, carnitine and D, L-carnitine amide.
  • TMA is not converted if PES / DCPIP is replaced by the following compounds: methylene blue, K 3 (Fe (CN) 6 ), Wurster's Blau, PES, DCPIP, NAD + or NADP + ; only with the structurally analogous compound phenazine methosulfate does a reaction take place (98% conversion compared to PES).
  • some of the amine compounds mentioned above were tested as to whether they inhibit the conversion of TMA.
  • the activity of the TMA dehydrogenase was measured as a function of the substrate concentration.
  • the Lineweaver-Burke evaluation shows a K M value of 6.6-10 -7 M. Substrate saturation occurs above 0.03 mM.
  • the reaction rate is proportional to the Konzentra ⁇ tion of TMA (see Fig. 3).
  • This photometric reaction can thus be used to determine TMA of unknown concentration in samples.
  • This detection method can also be used to detect other TMA-containing compounds, provided that these compounds are broken down in a chemical or enzymatic pretreatment in such a way that TMA is released and this is then determined enzymatically by means of TMA dehydrogenase.
  • the strain DSM 6512 was grown in the following medium B (per 1 1):
  • the medium was inoculated with 300 ml of a 24-hour-old preculture after reaching the gross temperature of 30 ° C. and harvested after about 21 hours with an OD 660 of> 4 using a centrifuge.
  • the biomass can be stored frozen at -20 ° C., no loss of activity being discernible over several months.
  • the enzyme can be released from the cells as in Example 2B.
  • the cells are suspended in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0) with the addition of a protease inhibitor (Pefabloc; Pentapharm, Basel, Switzerland) and disrupted by wet grinding with glass beads. After centrifugation (15 minutes at 16000 rpm), the supernatant was filtered (0.45 ⁇ m pores) and then subjected to a further chromatographic separation.
  • C Purification using ion exchange chromatography
  • the supernatant was subjected to ion exchange chromatography on a Q-Sepharose (Pharmacia, Freiburg FRG).
  • the column was equilibrated with 50 mM Na 4 P 2 0 7 buffer pH 9.
  • elution was carried out first with two bed volumes of the same buffer, to which 200 mM NaCl had been added, and then with a linear gradient from 200 to 500 mM NaCl (dissolved in the above sodium phosphate buffer).
  • the active fractions are combined and concentrated with an ultrafiltration membrane (cut-off 30 kDalton; Amicon).
  • the concentrated active fractions after the ion exchange chromatography were subjected to gel filtration.
  • the separation takes place via a Sephadex G-200 gel (Pharmacia), which was equilibrated with 50 mM KPi buffer, pH 8 with 150 mM NaCl. Elution is also carried out with the same buffer.
  • the active fractions can be stored at -20 ° C with 50% glycerol added.
  • the activity of the DMA dehydrogenase was determined analogously to the TMA dehydrogenase with a test approach as for the TMA dehydrogenase, except that 50 ⁇ l of a 100 M dimethylamine solution (in buffer) were provided instead of the TMA solution.
  • Fig. 4 shows the pH profile of this reaction, maximum activity is obtained at a pH of 8.6.
  • reaction rate was measured at various temperatures (25-60 ° C.). After the test components had been adequately tempered without enzyme, the reaction was started by adding enzyme solution. The DMA dehydrogenase shows maximum activity at 40-45 ° C, at 60 ° C no activity can be measured.
  • TMA dehydrogenase 100 ⁇ l enzyme solution were incubated for 30 min in a water bath at the desired temperature. The enzyme solution was then briefly cooled, the remaining test components were added and the remaining activity was determined by measurement at 30 ° C. After preincubation at 63.degree. C., 63% residual activity is obtained, at 37.degree. C. still 45%, at 56.degree. C. no activity was detectable.
  • Table 4 Influence of various metal cations and inhibitors. As a control, the compounds were used in parallel tests without TMA, in order to show a possible influence of the compounds on the enzyme test.
  • the substrate spectrum was determined as indicated in Example 3F.
  • the results showed that the enzyme shows a high specificity for DMA with regard to the amine component, trimethylamine is still reacted with 6% side activity and was inactive: methylamine, 2-dimethylaminoethylamine, dimethylformamide, formaldehyde and methanol.
  • the enzyme is also apparently highly specific with regard to the electron acceptor, TMA is not converted if PES / DCPIP is caused by - -
  • the reaction of DMA in the presence of PES / DCPIP is independent of ⁇ ; If a test is carried out under anaerobic conditions (buffer and test components gassed with argon for 15 min), an identical conversion rate is obtained as in the test with 0 2 gassed buffer. This distinguishes the enzyme from those in the group of oxidases in which 0 2 is the co-substrate of the reaction. Biochemically, the enzyme belongs to the group of dehydrogenases.
  • the activity of the DMA dehydrogenase was measured as a function of the substrate concentration.
  • the Lineweaver-Burke evaluation gives a K M value of 2.6-10 -5 M.
  • the isoelectric point of the DMA dehydrogenase is 4.7 (measured by means of isoelectric focusing (Pharmacia, Freiburg)).
  • the sequence of the first amino acids of the N-terminus was determined using a protein sequencer (from Applied to the first amino acids of the N-terminus).
  • dimethylamine dehydrogenase can be used especially where dimethylamine is the product of a chemical or enzymatic reaction.
  • the determination method for TMA described in Example 4 can be modified in a simple manner by replacing the trimethylamine dehydrogenase with dimethylamine dehydrogenase. Such a test is useful, for example, for determining the freshness of frozen fish, since the DMA content increases with increasing storage.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur Gewinnung von Dimethylamin- bzw. Trime- thyla in-Dehydrogenase , danach erhaltene Dehydrogena- sen und ihre Verwendung
Die Erfindung bezieht sich auf die Gewinnung von ana¬ lytisch nützlicher Dimethylamin- bzw. Trimethylamin- Dehydrogenase (DMA- bzw. TMA-Dehydrogenase) und sie umfaßt die danach erhaltenen Enzyme und deren Verwen¬ dung .
DMA- bzw. TMA-Dehydrogenase sind für den selektiven Nachweis von Dimethylamin bzw. Trimethylamin geeignete Enzyme .
Der selektive Nachweis von Dimethylamin bzw. Trime¬ thylamin ist von Bedeutung im Lebensmittelbereich (z.B. Fischverderb) und in der klinischen Diagnostik (Trimethylaminurie , Betain-Analytik) .
Im Lebensmittelbereich hat der Trimethylamin-Nachweis vor allem für die Bestimmung der Fisch-Frische bei fri¬ schem Fisch Bedeutung. Der Fischmuskel enthält hohe Gehalte an Trimethylamin-N-Oxid , das postmortal durch bakterielle Zersetzung zu Trimethylamin (TMA) abgebaut wird. Der auffallend stechende Geruch von verderben¬ dem Meeresfisch wird in der Hauptsache durch TMA ver¬ ursacht . Zur Bestimmung der Fischfrische sind in der analyti¬ schen Literatur bereits eine Reihe verschiedener, eher unspezifischer Parameter vorgeschlagen worden, z.B. der Nucleotid-Gehalt, die Ammoniak-Konzentra¬ tion, flüchtige Säuren, Katalase-Aktivität oder der pH-Wert. Als primäres Abbauprodukt ist aber TMA von besonderem diagnostischem Wert. In die Praxis Eingang gefunden hat eine chemische TMA-Bestimmungsmethode mittels Pikrinsäure (Dyer, W. . , J. Fish Res. Bd. Can. 6. (1945) 351; überarbeitet von: Tozawa, H. et al., In: Fish Inspection and Ouality Control (1971) p. 187, Fishing News (Books) Ltd., London). Diese Methode hat aber den Nachteil, daß viele primäre, sekundäre und tertiäre Amine auch reagieren; zudem ist Pikrinsäure eine hochexplosive Verbindung. Bei der Trimethylaminurie handelt es sich um eine Störung des Cholin-Stoffwechseis. Das defekte Enzym ist die Trimethylamin-N-Oxidase, das die Bildung von Trimethylamin-N-oxid katalysiert. Für die Diagnostik ist ein spezifischer Trimethylamin-Nachweis erforder¬ lich. In aktuellen Veröffentlichungen zur Trimethyl- amin-Analytik werden im Klinik-Bereich Massenspektro- metrie (King G.S. et al. Biomed. Mass Spectrom. 11 (1984) 1), Gas-Chromatographie (Dorland, L. et al. J. Inher. Metab. Dis. 10 (1987) 401) oder auch Head- space Gas-Liquid-Chromatographie (Al-Waiz, M. et al. J. Inher. Metab. Dis. 12 (1989) 80) eingesetzt. Die gaschromatographische Methode (Dorland et al.) wird von den strukturanalogen Verbindungen Betain, Carnitin und Cholin gestört- Insgesamt sind diese Methoden nicht für die Routineanalytik geeignet. Eine Betain-Analytik wird bei der Behandlung der ver¬ schiedenen Formen der Homocystinurie (Störung im Metabolismus von L-Methionin) benötigt. Betain ist z. Zt. mit den üblichen Methoden der Laboranalytik nicht erfaßbar. In Verbindung mit einem Betain-spaltenden Enzym, das Betain in Trimethylamin und Essigsäure spaltet, kann diese Verbindung aber in einem gekoppel¬ ten Enzymtest über Trimethylamin quantifiziert werden.
Die selektive Bestimmung von Dimethylamin ist insbe¬ sondere für die Erfassung des Frische-Zustandes von gefrorenem Fisch geeignet, bei dem andere Abbau-Wege vorherrschen, weshalb hier der DMA-Gehalt Auskunft über ein Verzehr-Limit liefern kann.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein für den spezifischen DMA- bzw. TMA-Nachweis geeigne¬ tes Enzym bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß im wesentlichen dadurch gelöst, daß man einen Paracoccus-Stamm auf einem Dimethylamin bzw. Trimethylamin enthaltenden Kulturmedium vermehrt, erntet und die geernteten Zellen zur Enzymfreisetzung mechanisch aufschließt, die erhaltene Flüssigkeit von Zellfragmenten befreit und das im Rohextrakt enthaltene Enzym ggf. aufreinigt
Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß aus von Bodenproben isolierten Paracoccus Stämmen abhängig von der NährstoffZusammensetzung zwei an sich ähnliche Dehydrogenasen gewonnen werden können, die entweder - gezüchtet auf DMA-haltigem Medium - zur selektiven DMA-Umsetzung oder - gezüchtet auf TMA-haltigem Medium - zur selektiven TMA-Umsetzung befähigt sind.
Die neuen Enzyme sind zusammen mit dem künstlichen Elektronenakzeptor Phenazin ethosulfat (PMS) oder Phenazinethosulfat (PES) zur analytisch-brauchbar selektiven Umsetzung von Dimethylamin (DMA-DH) bzw. Trimethylamin (TMA-DH) befähigt. Die enzymatische Umsetzung von DMA bzw. TMA erfolgt nach den Gleichungen
TMA-Dehydrogenase
TMA + PES ox . > Dimethylamin + HCHO + PES red..
DMA-Dehydrogenase
DMA + PESox. — > Methy J lamin + HCHO + PESred ..
Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung der TMA- bzw. DMA-Dehydrogenase bildenden Mikroorganismen sind Boden¬ proben geeignet, aus denen insbesondere Mikroorganis¬ men der Gattung Paracoccus isoliert werden, die bei Wachstum auf DMA- bzw. TMA-haltigem Nährmedium eine geeignete DMA- bzw. TMA-Dehydrogenase bilden und spe¬ ziell der Paracoccus-Stamm DSM 6512.
Die aus diesem Paracoccus-Stamm isolierte TMA-Dehydro¬ genase zeigt in gereinigter Form die folgenden wesent¬ lichen Parameter:
- Reaktivität mit Trimethylamin in Gegenwart von Phenazinmetho- oder -ethosulfat ;
- Substratspezifität ausschließlich für TMA;
- ein KM-Wert für TMA von 6,6**10-7 M;
- spezifische Aktivität (hoσhgereinigt) von 4 ü/mg;
- Molekulargewicht von 140.000 Dalton (bestimmt mittels Gelfiltration) ;
- Molekulargewicht in der SDS-Elektrophorese: 70.000 Dalton ± 5.000 ;
- pH-Optimum für die Reduktionsreaktion bei pH 9,0;
- Temperatur-Optimum der Aktivität bei 45°C;
- pH-Stabilität: kein Aktivitätsverlust nach 24 h bei 4°C und pH 9,0; Temperatur-Stabilität: 65% Restaktivität nach
30 min bei 30°C (pH 9,0);
Lagerfähigkeit der Enzymlösung: nach einer Woche bei 4°C mit einer Restaktivität von 80 %; nach vier
Wochen bei - 20°C in 50 % Glycerin mit einer
Restaktivität von 70 %; starke Inhibierung durch MnCl2 in 1 mM
Konzentration, Erhöhung der Aktivität durch PMSF
(auf 187 %) ; keine Hemmung der TMA-Umsatzrate durch die strukturanalogen Verbindungen Betain, Cholin,
Carnitin, Trimethylaminoxid und Dimethylamin
(jeweils 1 mM Konzentration).
Die aus diesem Paracoccus-Stamm isolierte DMA- Dehydrogenase zeigt in gereinigter Form die folgenden wesentlichen Parameter:
- Reaktivität mit Dimethylamin in Gegenwart von Phenazinmetho- oder -ethosulfat ;
- hohe Substratspezifität für DMA;
- ein KM-Wert für DMA von 2,6-10-5 M;
- spezifische Aktivität (hochgereinigt) von 2,3 U/mg;
- Molekulargewicht von 140.000 Dalton (bestimmt mittels Gelfiltration);
- aus zwei Untereinheiten mit jeweils 77.000 besteht (bestimmt mittels SDS-Elektrophorese) ;
- pH-Optimum für die Reduktionsreaktion bei pH 8,6;
- Temperatur-Optimum der Aktivität bei 40-45°C;
- ein Optimum der pH-Stabilität bei pH 8,6;
- Temperatur-Stabilität: 65% Restaktivität nach 30 min bei 30°C (pH 9.0);
- starke Inhibierung der photometrischen Reaktion durch MnCl2 in 1 mM Konzentration; - G-
- kein Umsatz mit Methylamin, 2-Dimethylaminoethylamin, Dimethylformamid, Formaldehyd und Methanol, schwache Reaktivität mit Trimethylamin (ca. 6% bezogen auf den Dimethylamin-Umsatz) .
Die erfindungsgemäßen Dehydrogenasen zeigen eine hohe Spezifität bezüglich der Umsetzung von DMA bzw. TMA in Gegenwart anderer Alkylamine, so daß sie für die analytische Bestimmung von Dimethylamin (DMA-Dehydro¬ genase) bzw. Trimethylamin (TMA-Dehydrogenase) in Ge¬ mischen mit anderen Alkylaminen insbesondere im Lebens¬ mittel und diagnostischen Bereich geeignet sind.
Sie können speziell dort eingesetzt werden, wo Di¬ methylamin oder Trimethylamin als Abbauprodukte einer chemischen oder enzymatischen Reaktion entstehen, wie insbesondere zur Ermittlung des Frischezustandes von frischen (mit TMA-DH) bzw. gefrorenem (mit DMA-DH) Fisch.
Von weiterem Interesse ist die Bestimmung von Betain in klinischen Proben nach dessen Umsetzung mit Lyase unter Abspaltung von Trimethylamin, das mit TMA-DH in Gegenwart von Phenazinethosulfat oder Phenazinmetho- sulfat sowie Dichlorphenolindophenol umgesetzt und photometrisch ausgewertet wird.
Weitere Eigenschaften der Enzyme werden u. a. anhand der beigefügten Zeichnungen erläutert. Es zeigen:
Fig. 1: Wachstum und TMA-DH Bildung von Paracoccus DSM 6512 in Abhängigkeit von der Zeit;
Fig. 2 Abhängigkeit der TMA-DH Aktivität vom pH-Wert; Fig.. 3 Eichkurve für TMA im enzymatischen Test; und Flg. 4 Abhängigkeit der DMA-DH Aktivität vo pH-Wert.
Die Erfindung wird in nachfolgenden Beispielen näher erläutert. -?-
Beispiel 1: Isolierung von Mikroorganismen, die das Enzvm TMA-Dehydrogenase enthalten
A. Isolierung aus Bodenproben:
Ein Bioreaktor enthält 1 L Medium A mit folgender
Zusammensetzung:
Trimethylamin 5,0 g/L
Hefeextrakt 0,2 g/L
Ammoniumsulfat 0,5 g/L
Spurensalz-Lösung 20 ml/L
KH2Pθ4 1,5 g/L
K2HP04 4,0 g/L
Der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt, die Lösung wird 30 min bei 121°C sterilisiert. Der Bioreaktor wird mit ca. 5 g einer Bodenprobe (Kompost) beimpft. Im geschlossenen Gefäß wachsen geeignete Mikroorganismen der Bodenprobe heran, die Temperatur wird dabei auf 22°C gehalten. Durch Zufuhr sterilfiltrierter Luft wachsen die Organismen weitgehend unter SauerstoffSättigungs-Bedingungen heran. Nach 1 Tag Wachstum im geschlossenen Gefäß wird aus einer Vorratsflasche sterilisiertes Medium A zugepumpt (0,1 L/Std. ) , gleichzeitig mit derselben Flußrate Reaktor¬ inhalt abgeführt. Täglich wird eine Probe entnommen und auf TMA-Dehydrogenase Aktivität getestet. In den ersten 5 Tagen war keine Aktivität nachweisbar, ab dem 6. Tag konnte ein von Tag zu Tag regelmäßig zu¬ nehmender Aktivitäts-Anstieg gemessen werden. An¬ scheinend hat sich unter den Bedingungen des kontinu¬ ierlichen Wachstums ein geeigneter Mikroorganismus durchgesetzt. Ab dem 10. Tag hatte die Aktivität einen maximalen Wert erreicht, nach 12 Tagen wurde die Kultivierung abgebrochen. Mikroorganismen aus Reaktorproben ab dem 6. Tag, die auf durch Agar (18 g/L) verfestigtes Medium A ausgestrichen wurden, wur¬ den als Reinkultur auf TMA-Dehydrogenase Aktivität getestet. Hieraus konnte ein Stamm mit der gewünsch¬ ten Enzymaktivität isoliert werden (Isolat TMA-1). - «-
B. Taxonomische Bestimmung des Isolats TMA-1: Die mikrobiologische Charakterisierung ergab, daß der Stamm TMA-1 der Gattung Paracoccus zuzuordnen ist. Im einzelnen wurden folgende Eigenschaften festgestellt: Gram-negative Kokken, unbeweglich, strikt aerob, keine Säurebildung, nicht chemolithoautotroph. Gute Verwertung von Methylamin, Dimethylamin, Trimethyl¬ amin, Trimethylamin-N-Oxid, N-Methylformamid, N,N-Dimethylformamid; schwaches Wachstum auf Form- amid. Von den beiden Paracoccus-Arten denitrificans und halodenitrificans unterscheidet sich der Stamm TMA-1 dadurch, daß er nicht chemolithoautotroph ist. Der Stamm wurde am 2.5.1991 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, unter der Nummer DSM 6512 hinterlegt.
Beispiel 2: Gewinnung der TMA-Dehydrogenase
A. Vermehrung von Paracoccus sp. TMA-1
Zur Enzymgewinnung wurde der Stamm TMA-1 in folgendem Medium B angezogen (pro 1 1):
Im 8 1-Maßstab wurde das Medium nach Erreichen der Bruttemperatur von 30 °C mit 300 ml einer 24 Stunden alten Vorkultur beimpft. In einem solchen 8 1-Ansatz konnte gut der Verlauf der Enzymaktivität über die Zeit bestimmt werden, indem Proben zu verschiedenen Zeiten entnommen wurden und die Aktivität der TMA- Dehydrogenase nach Aufschluß der Zellen im zellfreien Überstand bestimmt wurde. In Fig. 1 ist ein solcher Verlauf dargestellt; er verdeutlicht, daß man eine maximale Enzymaktivität nur innerhalb eines enges Zeitraums gegen Ende der Wachstumsphase erhält. Der 8 1-Fermenter wurde nach 21 Stunden bei einer OD 660 von 4-35 mittels einer Zentrifuge geerntet, man erhielt 160 g Biofeuchtmasse. Die Biomasse kann bei -20°C eingefroren gelagert werden, wobei über mehrere Monate kein Aktivitätsverlust erkennbar ist.
B. Zellaufschluß
Die Enzymfreisetzung aus den Zellen kann durch an sich bekannte Methoden (Ultraschall, Hochdruck- Homogenisation, Naßvermahlung u. a.) geschehen. Hier wurden die Zellen durch Naßvermahlung mit Glasperlen aufgeschlossen. Dazu wurde die Biomasse in 0.1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7.0) suspendiert, so daß die Konzentration der Zellfeuchtmasse 40 %ig war. Die Zellinhaltsstoffe wurden aus der Suspension durch einen mechanischen Aufschluß mittels einer Schwing¬ mühle (Typ MM2; Fa. Retsch, Haan, FRG) gewonnen. Der Aufschluß erfolgte in 1.5 ml Eppendorfgefäßen. Die Eppendorfgefäße wurden mit 1.2 g Glasperlen (0,5 mm Durchmesser) und 0.6 ml 40 %iger Zellsuspension gefüllt und für 15 min bei einer Frequenz von 1800/sec geschüttelt. Nach Zentrifugation (3 min bei 12000 Upm) in einer Tischzentrifuge erhielt man einen viskosen Überstand, der für die weitere Enzymgewin¬ nung verwendet wurde.
C. Grobreinigung
Zur Grobreinigung wurden 0.5 ml des Rohextraktes in 1.5 ml Eppendorfgefäße gegeben und dort mit 0.025 ml einer 5 %igen Polyethylenimin-Lösung (PEI) versetzt. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurden die Proben 5 min in einer Tischzentrifuge bei 12000 Upm zentrifu- giert und der fast klare Überstand für die weitere Enzymreinigung eingesetzt.
D. Feinreinigung
Zur Feinreinigung des Enzyms wurde der Überstand nach PEI-Fällung einer Ionenaustauschchromatographie an einer Mono-Q Säule (Fast Protein Liquid Chromato- graphy (FPLC) ; Fa. Pharmacia, Freiburg FRG) unterzo¬ gen. 10 ml des mit einem 0,2 μm-Filter filtrierten Rohextraktes wurden in 2 ml Portionen auf die Säule aufgegeben und mit einem Konzentrationsgradienten von 0.05 M - 0.2 M Natriumpyrophosphat-Puffer pH 9,0 eluiert. Das Enzym wurde bei einer Pufferkonzentra¬ tion von ca. 0,09 M von der Säule abgelöst. Anschlie¬ ßend wurden die das Enzym enthaltenden Fraktionen zusammengegeben und 1:2 mit 0.05 M Natriumpyrophos¬ phat-Puffer verdünnt. Für den letzten Reinigungs¬ schritt wurde nun wiederum die Lösung in 2 ml Portio¬ nen auf die Mono-Q Säule aufgegeben und mit einem NaCl-Gradienten (0-1 M) eluiert; das Enzym wurde bei einer NaCl-Konzentration von 400 mM abgelöst. In Fraktionen mit hoher Enzymaktivität wurde eine spezifische Aktivität von 4 U/mg gemessen. Ein mit diesen Fraktionen angefertigtes SDS-Gel ergab auf Grund der Proteinfärbung, daß die TMA-Dehydrogenase hier zu mindestens 90 % au gereinigt vorlag.
Die Anreicherung des Enzyms im Verlauf der Reinigung ist in Tab. 1 zusammengestellt. - M-
Tab. 1: Reinigung der TMA-Dehydrogenase
Die Aktivität der TMA-Dehydrogenase wurde dabei mit folgenden Testansatz (C) bestimmt:
780 μl Puffer (0,1 M Natriumpyrophosphat plus 0,05 M NH4C1; pH 9,0) 20 μl einer 150 mM Trimethylamin-Lösung (in Puffer)
(Endkonz. im Test: 3 mM) 50 μl Dichlorphenolindophenol (DCPIP; Endkonz. im
Test: 0,08 mM) , 50 μl Phenanzinethosulfat (PES; Endkonz. im Test 2mM) 100 μl Enzymlösung
Die Anfangs-Reaktionsgeschwindigkeit wurde bei 595 nm an einem Spektralphotometer bei 30°C gemessen. Eine Enzymeinheit entspricht dem Umsatz von 1 μMol TMA pro 1 min, gemessen über den Umsatz von 1 μMol Dichlor¬ phenolindophenol pro 1 min (e=7,0 mM~1-cm~1).
Beispiel 3: Charakterisierung der TMA-Dehvdrogenase
A. pH-Abhängigkeit der Umsetzung
Die Abhängigkeit der Aktivität vom pH-Wert wurde be¬ stimmt, indem der pH-Wert des in Beispiel 2.D. aufge¬ führten Pyrophosphat-Puffers auf verschiedene Werte zwischen 7,0 und 11,0 eingestellt wurde und damit die - AI-
Aktivität der TMA-Dehydrogenase wie unter 2.D. be¬ schrieben gemessen wurde. Fig. 2 zeigt das pH-Profil dieser Umsetzung, man erhält eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert von 9.
B. Einfluß des pH-Wertes auf die Lagerstabilität Der Einfluß des pH-Wertes auf die Lagerung wurde getestet, indem 100 μl der Enzymlösung in 780 μl 0.1 M Puffer des entsprechenden pH-Wertes für 24 Stunden bei 4 "C inkubiert wurden.
Die TMA-Dehydrogenase hat ihr Stabilitätsmaximum bei pH 9,0. Die reine Enzymlösung hat nach 6 Tagen bei 4°C eine Restaktivität von 80 %. Unter Zusatz von 50 % Glycerin ließ sich nach 4 Wochen bei - 20 °C noch eine Restaktivität von 70 % messen.
C. Temperatur-Abhängigkeit der Aktivität
Zur Bestimmung des Temperaturoptimums wurde die Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Temperatu¬ ren gemessen. Nach ausreichender Vortemperierung der Testkomponenten ohne Enzym wurde die Reaktion durch Zugabe von Enzymlösung gestartet.
Die TMA-Dehydrogenase zeigt maximale Aktivität bei 45°C, bei 60°C ist keine Aktivität mehr meßbar.
D. Temperatur-Stabilität
Zur Bestimmung der Temperaturstabilität der TMA- Dehydrogenase wurden 100 μl Enzymlösung für 30 min in einem Wasserbad bei der gewünschten Temperatur inku¬ biert. Anschließend wurde die Enzymlösung kurz abge¬ kühlt, mit den restlichen Testkomponenten versetzt und die verbleibende Aktivität durch Messung bei 30°C bestimmt. Man erhält nach Vorinkubation bei 30°C noch 65% Restaktivität, bei 37°C noch 50%. E. Einfluß verschiedener Metallkationen und Inhibitoren
Um das Verhalten der TMA-Dehydrogenase-Aktivität in Gegenwart von Metallkationen und Hemmstoffen zu bestimmen, wurden die entsprechenden Substanzen in einer Konzentration von 1 mM dem Test zugesetzt und nach einer Inkubationszeit von 10 min bei 30 °C die Aktivität bestimmt. Tabelle 2 faßt die Ergebnisse zusammen.
Tabelle 2: Einfluß verschiedener Metallkationen und Inhibitoren. Zur Kontrolle wurden die Verbindungen in parallelen Tests ohne TMA eingesetzt, um einen mögli¬ chen Einfluß der Verbindungen auf den Enzymtest auf¬ zuzeigen.
Auffällig ist die starke Inhibierung des Enzyms durch MnCl2 und die Erhöhung der Aktivität durch PMSF. Beide Komponenten zeigten keine Aktivität im Enzym¬ test ohne TMA.
F. Substratspektrum der TMA-Dehydrogenase
Zur Erstellung eines Substrat-Spektrums wurde im Test (siehe Beispiel 2.D.) einerseits TMA durch eine Reihe anderer Methylamin-Verbindungen (1 mM) , andererseits der Elektronenakzeptor Phenazinethosulfat (einschl. des Redoxfarbstof es Dichlorphenolindophenol) durch andere Elektronenakzeptoren ersetzt und anschließend die Enzymaktivität bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß bezüglich der Aminkomponente anscheinend nur TMA umgesetzt wird, inaktiv waren: Dimethylamin, Methyl¬ amin, Dimethylethylamin, Trimethylamin-N-oxid, Cholinchlorid, Betain, Carnitin und D,L-Carnitinamid. Auch bezüglich des Elektronenakzeptors ist das Enzym anscheinend hochspezifisch, TMA wird nicht umgesetzt, wenn PES/DCPIP durch folgende Verbindungen ersetzt wird: Methylenblau, K3(Fe(CN)6), Wurster's Blau, PES, DCPIP, NAD+ oder NADP+; lediglich mit der struktur¬ analogen Verbindung Phenazinmethosulfat findet eine Reaktion statt (98%iger Umsatz im Vergleich zu PES). Daneben wurden einige der oben erwähnten Amin-Verbin- dungen getestet, ob sie den Umsatz von TMA inhibie¬ ren. Folgende Verbindungen wurden in jeweils äqui- molarer Konzentration zu TMA dem kompletten Enzymtest zugesetzt (in Klammern sind als Ergebnis die jeweili¬ gen Enzymaktivitäten angegeben): Dimethylamin (96%), Cholin (102%), Betain (90%) oder Carnitin (110%). Werden dem kompletten Testansatz mit PES,DCPIP und TMA noch das Coenzym NAD+ oder NADP+ zugesetzt, ist keine Steigerung des Umsatzes nachweisbar. Die Reaktion von TMA in Gegenwart von PES/DCPIP ist θ2-unabhängig; wird ein Test unter. anaeroben Bedin¬ gungen (Puffer und Testkomponenten für 15 min mit Argon begast) durchgeführt, erhält man eine identi¬ sche Umsatzrate wie im Test mit 0 -begasten Puffer. Damit unterscheidet sich das Enzym von solchen der Gruppe der Oxidasen, bei denen 02 Co-Substrat der Reaktion ist. Biochemisch gehört das Enzym damit zu der Gruppe der Dehydrogenasen.
G. Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substrat¬ konzentration (Bestimmung des K^-Wertes1
Zur Bestimmung des KM-Wertes wurde die Aktivität der TMA-Dehydrogenase in Abhängigkeit von der Substrat¬ konzentration gemessen. Die Auswertung nach Lineweaver-Burke ergibt einen KM-Wert von 6,6-10-7 M. Substratsättigung tritt oberhalb von 0.03 mM auf.
H. Bestimmung des Molekulargewichtes In der SDS-Elektrophorese wurde eine Molmasse von 70.000 ±5.000 bestimmt (Vergleich mit Proteinstandards im Molmassenbereich von 20000 bis 97000) .
Beispiel 4: Verwendung des Enzyms für die Bestimmung der TMA-Konzentration
Im Bereich von 2,0 bis 8,0-10~7 M an TMA ist die Reaktionsgeschwindigkeit proportional zur Konzentra¬ tion an TMA (siehe Fig. 3). Man kann somit diese photometrsiehe Reaktion verwenden, um TMA unbekannter Konzentration in Proben zu bestimmen. Mit dieser Nachweismethode sind auch andere TMA- haltige Verbindungen nachweisbar, sofern in einer chemischen oder enzymatischen Vorbehandlung diese Verbindungen derart abgebaut werden, daß TMA freige¬ setzt und dieses dann enzymatisch mittels TMA- Dehydrogenase bestimmt wird. -Ab-
Beispiel 5: Gewinnung der Dimethylamin(DMA-*)-Dehydro¬ genase
A. Vermehrung von Paracoccus DSM 6512 zur Gewinnung von DMA-Dehydrogenase
Zur Enzymgewinnung wurde der Stamm DSM 6512 in fol¬ gendem Medium B angezogen (pro 1 1):
Im 8 1-Maßstab wurde das Medium nach Erreichen der Bruttemperatur von 30 °C mit 300 ml einer 24 Stunden alten Vorkultur beimpft und nach ca. 21 Stunden bei einer OD660 von >4 mittels einer Zentrifuge geerntet. Die Biomasse kann bei -20°C eingefroren gelagert wer¬ den, wobei über mehrere Monate kein Aktivitätsverlust erkennbar ist.
B. Zellaufschluß
Die Enzymfreisetzung aus den Zellen kann wie in Beispiel 2 B erfolgen. Hier wirden die Zellen in 0,1 M Tris-HCl- Puffer (pH 7,0) unter Zusatz eines Proteaseinhibitors (Pefabloc; Fa. Pentapharm, Basel, Schweiz) suspendiert und durch Naßvermahlung mit Glasperlen aufgeschlossen. Nach Zentrifugation (15 Min. bei 16000 UpM) wurde der Überstand filtriert (0,45 μm Poren) und dann einer weiteren chromato¬ graphischen Auftrennung unterzogen.' C. Reinigung mittels Ionenaustausch-Chromatographie
Zur Reinigung des Enzyms wurde der Überstand einer Ionenaustauschchromatographie an einer Q-Sepharose (Fa. Pharmacia, Freiburg FRG) unterzogen. Die Säule wurde mit 50 mM Na4P207-Puffer pH 9 equilibriert. Nach Auftragen des filtrierten Rohextraktes wurde erst mit zwei Bettvolumina des gleichen Puffers eluiert, dem 200 mM NaCl zugesetzt wurden und anschließend mit einem linearen Gradienten von 200 bis 500 mM NaCl (gelöst in obigem Natriumphosphat¬ puffer) . Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und mit einer Ultrafiltationsmembran (Ausschlußgrenze 30 kDalton; Fa. Amicon) eingeengt.
D. Reinigung mittels Gelfiltration
Die eingeengten aktiven Fraktionen nach der Ionenaus¬ tausch-Chromatographie wurden einer Gelfiltration unterworfen. Die Trennung erfolgt über ein Sephadex G-200 Gel (Pharmacia), das mit 50 mM KPi Puffer, pH 8 mit 150 mM NaCl equilibriert wurde. Mit dem gleichen Puffer wird auch eluiert. Die aktiven Fraktionen können bei -20°C mit 50% Glycerin versetzt aufbewahrt werden.
Die Anreicherung des Enzyms im Verlauf der Reinigung ist in Tab. 3 zusammengestellt. - 4g-
Tab. 3: Reinigung der DMA-Dehydrogenase
Reinigungs- schritt
Rohextrakt
Q-Sepharose
Gelfiltration
Die Aktivität der DMA-Dehydrogenase wurde analog zur TMA-Dehydrogenase mit einem Testansatz wie für die TMA-Dehydrogenase bestimmt, nur daß hier an Stelle der TMA-Lösung 50 μl einer 100 M Dimethylamin-Lösung (in Puffer) vorgesehen wurden.
Beispiel 6: Charakterisierung der DMA-Dehydrogenase
A. pH-Abhängigkeit der Umsetzung
Die Abhängigkeit der Aktivität vom pH-Wert wurde ana¬ log zu Beispiel 3 A bestimmt. Fig. 4 zeigt das pH- Profil dieser Umsetzung, man erhält eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert von 8,6.
B. Einfluß des pH-Wertes auf die LagerStabilität Der Einfluß des pH-Wertes auf die Lagerung wurde getestet, indem 100 μl der Enzymlösung in 780 μl 0.1 M Puffer des entsprechenden pH-Wertes (zwischen 7,1 und 10,0) für 24 Stunden bei 4 °C inkubiert wurden. Nach Zugabe der restlichen Testkomponenten wurde dann die Restaktivität bei 30°C gemessen. Die DMA-Dehydro¬ genase hat ihr Stabilitätsmaximum bei pH 8,6 (gemes¬ sene Aktivität: 0,31 U/ml). Bei pH 9,9 wurden noch 0,13 und bei pH 7,6 noch 0,2 U/ml gemessen. ft
C. Temperatur-Abhängigkeit der Aktivität
Zur Bestimmung des Temperaturoptimums wurde die Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Temperatu¬ ren (25 - 60°C) gemessen. Nach ausreichender Vortem¬ perierung der Testkomponenten ohne Enzym wurde die Reaktion durch Zugabe von Enzymlösung gestartet. Die DMA-Dehydrogenase zeigt maximale Aktivität bei 40-45°C, bei 60°C ist keine Aktivität mehr meßbar.
D. Temperatur-Stabilität
Zur Bestimmung der Temperaturstabilität der TMA- Dehydrogenase wurden 100 μl Enzymlösung für 30 min in einem Wasserbad bei der gewünschten Temperatur inku¬ biert. Anschließend wurde die Enzymlösung kurz abge¬ kühlt, mit den restlichen Testkomponenten versetzt und die verbleibende Aktivität durch Messung bei 30°C bestimmt. Man erhält nach Vorinkubation bei 30°C noch 63% Restaktivität, bei 37°C noch 45%, bei 56°C war keine Aktivität mehr feststellbar.
E. Einfluß verschiedener Metallkationen und Inhibitoren
Um das Verhalten der DMA-Dehydrogenase-Aktivität in Gegenwart von Metallkationen und Hemmstoffen zu bestimmen, wurden die entsprechenden Substanzen in einer Konzentration von 1 mM dem Test zugesetzt und nach einer Inkubationszeit von 10 min bei 30'°C die Aktivität bestimmt. Tabelle 4 faßt die Ergebnisse zusammen. -2.0-
Tabelle 4: Einfluß verschiedener Metallkationen und Inhibitoren. Zur Kontrolle wurden die Verbindungen in parallelen Tests ohne TMA eingesetzt, um einen mögli¬ chen Einfluß der Verbindungen auf den Enzymtest auf¬ zuzeigen.
Verbindung Restaktivität (%)
Metallionen:
MgCl2 120
MnCl2 0
ZnS04 60
CuS04 85
CθCl2 115
NiCl2 80
Inhibitoren:
EDTA 115
1,10-Phenantrolin 95
Jodacetamid 90 p-Hydroxymercuribenzoat 95
N-Ethylmaleimid 100
Auffällig ist die starke Inhibierung des Enzyms durch MnCl2.
F. Substratspektrum der TMA-Dehydrogenase
Das Substrat-Spektrum wurde wie in Beispiel 3 F angegeben ermittelt. Die Ergebnisse zeigten, daß bezüglich der Aminkomponente das Enzym eine hohe Spezifität für DMA zeigt, Trimethylamin wird noch mit 6% Nebenaktivität umgesetzt, inaktiv waren: Methyl¬ amin, 2-Dimethylaminoethylamin, Dimethylformamid, Formaldehyd und Methanol. Auch bezüglich des Elektro¬ nenakzeptors ist das Enzym anscheinend hochspezi¬ fisch, TMA wird nicht umgesetzt, wenn PES/DCPIP durch - -
folgende Verbindungen ersetzt wird: Methylenblau, K3(Fe(CN)6), DCPIP, NAD+ oder NADP+, Cytochrom C (Pferd), Brillant Blue R; lediglich mit der struktur¬ analogen Verbindung Phenazinmethosulfat findet eine vergleichbar hohe Reaktion statt (98%iger Umsatz im Vergleich zu PES). Meldolablau wird mit einer Aktivi¬ tät von 15% und die Kombination PES/Cytochrom C (Pferd) mit 30% umgesetzt.
Die Reaktion von DMA in Gegenwart von PES/DCPIP ist θ -unabhängig; wird ein Test unter anaeroben Bedin¬ gungen (Puffer und Testkomponenten für 15 min mit Argon begast) durchgeführt, erhält man eine identi¬ sche Umsatzrate wie im Test mit 02-begasten Puffer. Damit unterscheidet sich das Enzym von solchen der Gruppe der Oxidasen, bei denen 02 Co-Substrat der Reaktion ist. Biochemisch gehört das Enzym damit zu der Gruppe der Dehydrogenasen.
G. Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substrat- konzentration (Bestimmung des K^-Wertes1
Zur Bestimmung des KM-Wertes wurde die Aktivität der DMA-Dehydrogenase in Abhängigkeit von der Substrat¬ konzentration gemessen. Die Auswertung nach Lineweaver-Burke ergibt einen KM-Wert von 2,6-10-5 M.
H. Bestimmung des Molekulargewichtes Mittels Gelfiltration konnte gezeigt werden, daß das Enzym eine Masse von ca. 140.000 Dalton besitzt. In der SDS-Elektrophorese wurde eine Molmasse von 77.000 ±5.000 bestimmt (Vergleich mit Proteinstandards im Molmassenbereich von 20000 bis 97000). Diese Daten zeigen, daß die DMA-Dehydrogenase aus zwei anschei¬ nend identischen Untereinheiten aufgebaut ist. 1-
I. Bestimmung des isoelektrischen Punktes Der isoelektrische Punkt der DMA-Dehydrogenase liegt bei 4,7 (gemessen mittels isoelektrischer Fokussie- rung (Pharmacia, Freiburg)).
K. Bestimmung der N-terminalen Proteinsequenz
Die Sequenz der ersten Aminosäuren des N-Terminus wurden mit einem Proteinsequenator (Fa. Applied
Biosystems) bestimmt:
(Val)-Lys-(Pro)-Xaa-Tyr-(Ile)-Ile-Leu-Phe-Thr-(Pro)-
Ile-Gln-Ile-Xaa-Xaa-Lys-Thr-Leu
Dabei sind Aminosäuren, die in Klammern gesetzt sind, unsicher, Xaa bezeichnet eine unbekannte Aminosäure.
Die Dimethylamin-Dehydrogenase kann analog zur Trimethylamin-Dehydrogenase speziell dort eingesetzt werden, wo Dimethylamin Produkt einer chemischen oder enzymatischen Reaktion ist. So kann für die DMA-Be¬ stimmung die in Beispiel 4 beschriebene Bestimmungs¬ methode für TMA in einfacher Weise abgeändert werden, indem die Trimethylamin-Dehydrogenase durch Dimethyl¬ amin-Dehydrogenase ersetzt wird. Ein solcher Test ist beispielsweise nützlich zur Bestimmung des Frischezu¬ stands von Gefrierfisch, da hier mit zunehmender Lagerung der DMA-Gehalt ansteigt.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Gewinnung von analytisch nützlicher Di¬ methylamin- bzw. Trimethylamin-Dehydrogenase, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man einen Paracoccus Stamm auf einem Dimethylamin bzw. Trimethylamin enthaltenden Kulturmedium vermehrt, erntet und die geernteten Zellen zur Enzymfreisetzung mechanisch aufschließt, die erhaltene Flüssigkeit von Zellfragmenten befreit und das im Rohextrakt enthalte¬ ne Enzym ggf. aufreinigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Aufreinigung eine lonenaustauschchromatographie, sowie eine Gelfiltration und ggf. beiden voran eine Polyethylenimin-Fällung umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß als Paracoccus-Stamm der Stamm mit der Hinterle- gungs-Nr. DSM 6512 bzw. eine seiner Mutanten verwendet wird.
4. Dimethylamin-Dehydrogenase , erhalten nach einem der vorangehenden Ansprüche.
5. Trimethylamin-Dehydrogenase, erhalten nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung von DMA-Dehydrogenase bzw. TMA-Dehydrogenase nach einem der Ansprüche 4 oder 5 zur selektiven analy¬ tischen Bestimmung von Dimethylamin bzw. Trimethylamin in wäßrigen Flüssigkeiten durch enzymatische Umsetzung.
7. Verwendung nach Anspruch 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Umsetzung bei gleichzeitiger Anwesenheit von Phenazinethosulfat oder Phenazin ethosulfat sowie Di- chlorphenolindophenol durchgeführt und photometrisch verfolgt wird.
8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß als wäßrige Flüssigkeit Flüssigkeiten oder Extrakte von Proteinproben aus dem Lebensmittelbereich oder von Diagnostikproben dienen.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8 für den DMA- bzw. TMA-Nachweis in Flüssigkeiten, in denen das Trimethylamin oder Dimethylamin als Abbauprodukt einer chemischen oder enzymatischen Vorbehandlung enthalten ist.
10. Verwendung nach Anspruch 9 für die Bestimmung des Be¬ taingehalts klinischer Proben nach dessen Umsetzung mit Lyase durch photometrische Bestimmung des abgespal¬ teten Tri ethyla ins.
11. Verwendung nach Anspruch 6 von DMA-Dehydrogenase zur Bewertung der Fischfrische von gefrorenem Fisch.
12. Verwendung nach Anspruch 6 von TMA-Dehydrogenase zur Bewertung der Fischfrische von frischem Fisch.
13. Paracoccus-Stamm der Hinterlegungs-Nr. DSM 6512 für die Gewinnung von DMA- bzw. TMA-Dehydrogenase nach Anspruch 1.
EP92909154A 1991-05-10 1992-05-06 Verfahren zur gewinnung von dimethylamin- bzw. trimethylamin-dehydrogenase, danach erhaltene dehydrogenasen und ihre verwendung Withdrawn EP0584104A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4115340A DE4115340A1 (de) 1991-05-10 1991-05-10 Mikrobiologisch hergestellte trimethylamin-dehydrogenase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung
DE4115340 1991-05-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP0584104A1 true EP0584104A1 (de) 1994-03-02

Family

ID=6431422

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP92909154A Withdrawn EP0584104A1 (de) 1991-05-10 1992-05-06 Verfahren zur gewinnung von dimethylamin- bzw. trimethylamin-dehydrogenase, danach erhaltene dehydrogenasen und ihre verwendung

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0584104A1 (de)
JP (1) JPH06507073A (de)
AU (1) AU1650292A (de)
DE (1) DE4115340A1 (de)
NO (1) NO934055L (de)
WO (1) WO1992020789A1 (de)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2331100A (en) * 1996-08-22 1999-05-12 Univ Leicester Modified forms of trimethylamine dehydrogenase
GB9617709D0 (en) * 1996-08-22 1996-10-02 Univ Leicester Enzyme
JP2006081481A (ja) * 2004-09-17 2006-03-30 Kikkoman Corp 非対称ジメチルアルギニン測定法及び非対称ジメチルアルギニン測定キット
EP2925346A1 (de) 2012-11-30 2015-10-07 Universite d'Auvergne Clermont I Verwendung von mikroorganismen zur verringerung der trimethylaminkonzentration in einer menschlichen körperhöhle, insbesondere zur behandlung von trimethylaminurie oder bakterieller vaginose und prävention von kardiovaskulären erkrankungen
FR3003169B1 (fr) * 2013-03-13 2018-08-31 Universite D'auvergne Clermont I Utilisation de microorganismes pour diminuer le taux de trimethylamine dans une cavite du corps humain, notamment pour le traitement de la trimethylaminurie ou d'une vaginose bacterienne et la prevention des maladies cardiovasculaires
FR3008317B1 (fr) * 2013-07-15 2017-04-28 Univ D'auvergne Clermont I Utilisation de microorganismes pour diminuer le taux de trimethylamine dans une cavite du corps humain, notamment pour le traitement de la trimethylaminurie ou d'une vaginose bacterienne et la prevention des maladies cardiovasculaires
FR2998799B1 (fr) * 2012-11-30 2015-09-04 Univ Dauvergne Clermont I Utilisation de microorganismes pour diminuer le taux de trimethylamine dans l'intestin, traitement de la trimethylaminuremie et prevention de la formation des plaques d'atherome
CN105540869B (zh) * 2015-12-17 2018-04-03 苏州大学 一种负载脱氮副球菌的改性氧化石墨烯复合材料及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9220789A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU1650292A (en) 1992-12-30
DE4115340A1 (de) 1992-11-12
NO934055D0 (no) 1993-11-09
NO934055L (no) 1993-11-09
WO1992020789A1 (de) 1992-11-26
JPH06507073A (ja) 1994-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2122294C3 (de) Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase
DE3855664T2 (de) Antibiotikum-reuterin
Tailor et al. Characterization and optimization of siderophore production from Pseudomonas fluorescens strain isolated from sugarcane rhizosphere
CH638241A5 (de) Enzympraeparat mit l-alpha-aminoacylamidase-aktivitaet.
EP0088656A1 (de) Herstellung von Clostridium Acetobutylicum Mutanten mit hoher Butanol- und Acetonausbeute, erhaltene Mutanten und Verwendung dieser Mutanten zur gemeinsamen Herstellung von Butanol und Aceton
Brabban et al. Isolation of glucosinolate degrading microorganisms and their potential for reducing the glucosinolate content of rapemeal
EP0000560A1 (de) Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven alpha-Hydroxycarbonsäuren
EP0584104A1 (de) Verfahren zur gewinnung von dimethylamin- bzw. trimethylamin-dehydrogenase, danach erhaltene dehydrogenasen und ihre verwendung
EP0120208B1 (de) Mikrobiologisch hergestellte L-Phenylalanin-Dehydrogenase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung
DE3785508T2 (de) Rhodococcus-Bakterie zur Herstellung von Aryl Acylamidase.
DE3600563C2 (de)
DE69534954T2 (de) Methode zur Darstellung von Mikroorganismen welche resistent für organische Lösungsmittel sind, sowie organische Lösungsmittel resistente Mikroorganismen, durch diese Methode erhalten
EP0188712A1 (de) Verfahren zur Gewinnung von Phenylalanin-Dehydrogenase enthaltenden Mikroorganismen und deren Verwendung zur Herstellung von L-alpha-Aminosäuren
EP0218863B1 (de) Mikrobiologisch hergestellte D(-)-Mandelat-Dehydrogenase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung
EP0154269A2 (de) Nucleosidtriphosphat-abhängige 1-Methylhydantoinase und ihre Verwendung
EP0501292A1 (de) Eine L-Carnitin-Amidase produzierender Mikroorganismus, L-Carnitin-Amidase, Verfahren zu deren Gewinnung und deren Verwendung
DE3787520T2 (de) Verfahren zur Bewertung der Mutagenität.
DE2637671A1 (de) Creatinin-desimidase, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur quantitativen bestimmung von creatinin
DE3880290T2 (de) Enzym und verfahren zu seiner herstellung.
DE2659878C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase
Raghuvanshi et al. Iron mediated regulation of growth and siderophore production in a diazotrophic cyanobacterium Anabaena cylindrical
DE68914155T2 (de) Verfahren zur induktion von cytochrom-p-450-enzymen in streptomyces-bakterien und mutagenaktivitätsbestimmung von chemikalien.
DE3903759C2 (de)
AU639372B2 (en) Apparatus for measuring free and total sulfurous acid and method of measurement
DE2954471C2 (de)

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 19931025

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CH DE DK FR GB LI NL

GRAG Despatch of communication of intention to grant

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOS AGRA

17Q First examination report despatched

Effective date: 19980730

18W Application withdrawn

Withdrawal date: 19980807