WO1992020789A1 - Verfahren zur gewinnung von dimethylamin- bzw. trimethylamin-dehydrogenase, danach erhaltene dehydrogenasen und ihre verwendung - Google Patents

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Susanne Sting
Georg Krix
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    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

Definitions

  • the invention relates to the production of analytically useful dimethylamine or trimethylamine dehydrogenase (DMA or TMA dehydrogenase) and it encompasses the enzymes obtained thereafter and their use.
  • DMA or TMA dehydrogenase analytically useful dimethylamine or trimethylamine dehydrogenase
  • Trimethylaminuria is a disorder of the choline metabolism.
  • the defective enzyme is trimethylamine N-oxidase, which catalyzes the formation of trimethylamine N-oxide.
  • a specific trimethylamine detection is required for the diagnosis.
  • mass spectrometry King GS et al. Biomed. Mass Spectrom.
  • Paracoccus strains isolated from soil samples can be used to obtain two dehydrogenases that are similar per se and which either - grown on DMA-containing medium - for selective DMA conversion or - grown on TMA-containing medium - are capable of selective TMA implementation.
  • the medium was inoculated with 300 ml of a 24-hour-old preculture after the brood temperature had reached 30 ° C.
  • the course of the enzyme activity over time could be determined by taking samples at different times and the activity of the TMA dehydrogenase after cell disruption in the cell-free Supernatant was determined.
  • FIG. 1 shows that maximum enzyme activity can only be obtained within a short period of time towards the end of the growth phase.
  • the 8 1 fermenter was after 21 hours at an OD 660 of 4 - 35 cropped by a centrifuge, to obtain 160 g of wet biomass.
  • the biomass can be stored frozen at -20 ° C, whereby no loss of activity can be seen over several months.
  • the solution was again applied in 2 ml portions to the Mono-Q column and eluted with a NaCl gradient (0-1 M); the enzyme was detached at a NaCl concentration of 400 mM.
  • a specific activity of 4 U / mg was measured in fractions with high enzyme activity.
  • An SDS gel prepared with these fractions showed on the basis of the protein staining that the TMA dehydrogenase was here at least 90% purified.
  • the enzyme can be released from the cells as in Example 2B.
  • the cells are suspended in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0) with the addition of a protease inhibitor (Pefabloc; Pentapharm, Basel, Switzerland) and disrupted by wet grinding with glass beads. After centrifugation (15 minutes at 16000 rpm), the supernatant was filtered (0.45 ⁇ m pores) and then subjected to a further chromatographic separation.
  • C Purification using ion exchange chromatography
  • the supernatant was subjected to ion exchange chromatography on a Q-Sepharose (Pharmacia, Freiburg FRG).
  • the column was equilibrated with 50 mM Na 4 P 2 0 7 buffer pH 9.
  • elution was carried out first with two bed volumes of the same buffer, to which 200 mM NaCl had been added, and then with a linear gradient from 200 to 500 mM NaCl (dissolved in the above sodium phosphate buffer).
  • the active fractions are combined and concentrated with an ultrafiltration membrane (cut-off 30 kDalton; Amicon).
  • the activity of the DMA dehydrogenase was determined analogously to the TMA dehydrogenase with a test approach as for the TMA dehydrogenase, except that 50 ⁇ l of a 100 M dimethylamine solution (in buffer) were provided instead of the TMA solution.
  • the substrate spectrum was determined as indicated in Example 3F.
  • the results showed that the enzyme shows a high specificity for DMA with regard to the amine component, trimethylamine is still reacted with 6% side activity and was inactive: methylamine, 2-dimethylaminoethylamine, dimethylformamide, formaldehyde and methanol.
  • the enzyme is also apparently highly specific with regard to the electron acceptor, TMA is not converted if PES / DCPIP is caused by - -
  • the reaction of DMA in the presence of PES / DCPIP is independent of ⁇ ; If a test is carried out under anaerobic conditions (buffer and test components gassed with argon for 15 min), an identical conversion rate is obtained as in the test with 0 2 gassed buffer. This distinguishes the enzyme from those in the group of oxidases in which 0 2 is the co-substrate of the reaction. Biochemically, the enzyme belongs to the group of dehydrogenases.

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Abstract

Paracoccus Stämme aus Bodenproben liefern nach Züchtung auf dimethylamin- bzw. trimethylaminhaltigem Nährmedium eine hoch selektive Dimethylamin-Dehydrogenase bzw. Trimethylamin-Dehydrogenase, zwei Enzyme, die für die Bewertung der Fischfrische von frischen bzw. gefrorenem Fisch hervorragend geeignet sind. Die Umsetzung erfolgt in Gegenwart von Phenazinetho- oder -methosulfat als Elektronenakzeptor und kann in Gegenwart von Dichlorphenolindophenol durchgeführt und photometrisch verfolgt werden. Die selektive DMA bzw. TMA Bestimmung ist für die Analytik im Lebensmittel- und Diagnosebereich geeignet. Ein besonders effektiver Paracoccus-Stamm wurde unter der Nummer DSM 6512 hinterlegt.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur Gewinnung von Dimethylamin- bzw. Trime- thyla in-Dehydrogenase , danach erhaltene Dehydrogena- sen und ihre Verwendung
Die Erfindung bezieht sich auf die Gewinnung von ana¬ lytisch nützlicher Dimethylamin- bzw. Trimethylamin- Dehydrogenase (DMA- bzw. TMA-Dehydrogenase) und sie umfaßt die danach erhaltenen Enzyme und deren Verwen¬ dung .
DMA- bzw. TMA-Dehydrogenase sind für den selektiven Nachweis von Dimethylamin bzw. Trimethylamin geeignete Enzyme .
Der selektive Nachweis von Dimethylamin bzw. Trime¬ thylamin ist von Bedeutung im Lebensmittelbereich (z.B. Fischverderb) und in der klinischen Diagnostik (Trimethylaminurie , Betain-Analytik) .
Im Lebensmittelbereich hat der Trimethylamin-Nachweis vor allem für die Bestimmung der Fisch-Frische bei fri¬ schem Fisch Bedeutung. Der Fischmuskel enthält hohe Gehalte an Trimethylamin-N-Oxid , das postmortal durch bakterielle Zersetzung zu Trimethylamin (TMA) abgebaut wird. Der auffallend stechende Geruch von verderben¬ dem Meeresfisch wird in der Hauptsache durch TMA ver¬ ursacht . Zur Bestimmung der Fischfrische sind in der analyti¬ schen Literatur bereits eine Reihe verschiedener, eher unspezifischer Parameter vorgeschlagen worden, z.B. der Nucleotid-Gehalt, die Ammoniak-Konzentra¬ tion, flüchtige Säuren, Katalase-Aktivität oder der pH-Wert. Als primäres Abbauprodukt ist aber TMA von besonderem diagnostischem Wert. In die Praxis Eingang gefunden hat eine chemische TMA-Bestimmungsmethode mittels Pikrinsäure (Dyer, W. . , J. Fish Res. Bd. Can. 6. (1945) 351; überarbeitet von: Tozawa, H. et al., In: Fish Inspection and Ouality Control (1971) p. 187, Fishing News (Books) Ltd., London). Diese Methode hat aber den Nachteil, daß viele primäre, sekundäre und tertiäre Amine auch reagieren; zudem ist Pikrinsäure eine hochexplosive Verbindung. Bei der Trimethylaminurie handelt es sich um eine Störung des Cholin-Stoffwechseis. Das defekte Enzym ist die Trimethylamin-N-Oxidase, das die Bildung von Trimethylamin-N-oxid katalysiert. Für die Diagnostik ist ein spezifischer Trimethylamin-Nachweis erforder¬ lich. In aktuellen Veröffentlichungen zur Trimethyl- amin-Analytik werden im Klinik-Bereich Massenspektro- metrie (King G.S. et al. Biomed. Mass Spectrom. 11 (1984) 1), Gas-Chromatographie (Dorland, L. et al. J. Inher. Metab. Dis. 10 (1987) 401) oder auch Head- space Gas-Liquid-Chromatographie (Al-Waiz, M. et al. J. Inher. Metab. Dis. 12 (1989) 80) eingesetzt. Die gaschromatographische Methode (Dorland et al.) wird von den strukturanalogen Verbindungen Betain, Carnitin und Cholin gestört- Insgesamt sind diese Methoden nicht für die Routineanalytik geeignet. Eine Betain-Analytik wird bei der Behandlung der ver¬ schiedenen Formen der Homocystinurie (Störung im Metabolismus von L-Methionin) benötigt. Betain ist z. Zt. mit den üblichen Methoden der Laboranalytik nicht erfaßbar. In Verbindung mit einem Betain-spaltenden Enzym, das Betain in Trimethylamin und Essigsäure spaltet, kann diese Verbindung aber in einem gekoppel¬ ten Enzymtest über Trimethylamin quantifiziert werden.
Die selektive Bestimmung von Dimethylamin ist insbe¬ sondere für die Erfassung des Frische-Zustandes von gefrorenem Fisch geeignet, bei dem andere Abbau-Wege vorherrschen, weshalb hier der DMA-Gehalt Auskunft über ein Verzehr-Limit liefern kann.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein für den spezifischen DMA- bzw. TMA-Nachweis geeigne¬ tes Enzym bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß im wesentlichen dadurch gelöst, daß man einen Paracoccus-Stamm auf einem Dimethylamin bzw. Trimethylamin enthaltenden Kulturmedium vermehrt, erntet und die geernteten Zellen zur Enzymfreisetzung mechanisch aufschließt, die erhaltene Flüssigkeit von Zellfragmenten befreit und das im Rohextrakt enthaltene Enzym ggf. aufreinigt
Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß aus von Bodenproben isolierten Paracoccus Stämmen abhängig von der NährstoffZusammensetzung zwei an sich ähnliche Dehydrogenasen gewonnen werden können, die entweder - gezüchtet auf DMA-haltigem Medium - zur selektiven DMA-Umsetzung oder - gezüchtet auf TMA-haltigem Medium - zur selektiven TMA-Umsetzung befähigt sind.
Die neuen Enzyme sind zusammen mit dem künstlichen Elektronenakzeptor Phenazin ethosulfat (PMS) oder Phenazinethosulfat (PES) zur analytisch-brauchbar selektiven Umsetzung von Dimethylamin (DMA-DH) bzw. Trimethylamin (TMA-DH) befähigt. Die enzymatische Umsetzung von DMA bzw. TMA erfolgt nach den Gleichungen
TMA-Dehydrogenase
TMA + PES ox . > Dimethylamin + HCHO + PES red..
DMA-Dehydrogenase
DMA + PESox. — > Methy J lamin + HCHO + PESred ..
Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung der TMA- bzw. DMA-Dehydrogenase bildenden Mikroorganismen sind Boden¬ proben geeignet, aus denen insbesondere Mikroorganis¬ men der Gattung Paracoccus isoliert werden, die bei Wachstum auf DMA- bzw. TMA-haltigem Nährmedium eine geeignete DMA- bzw. TMA-Dehydrogenase bilden und spe¬ ziell der Paracoccus-Stamm DSM 6512.
Die aus diesem Paracoccus-Stamm isolierte TMA-Dehydro¬ genase zeigt in gereinigter Form die folgenden wesent¬ lichen Parameter:
- Reaktivität mit Trimethylamin in Gegenwart von Phenazinmetho- oder -ethosulfat ;
- Substratspezifität ausschließlich für TMA;
- ein KM-Wert für TMA von 6,6**10-7 M;
- spezifische Aktivität (hoσhgereinigt) von 4 ü/mg;
- Molekulargewicht von 140.000 Dalton (bestimmt mittels Gelfiltration) ;
- Molekulargewicht in der SDS-Elektrophorese: 70.000 Dalton ± 5.000 ;
- pH-Optimum für die Reduktionsreaktion bei pH 9,0;
- Temperatur-Optimum der Aktivität bei 45°C;
- pH-Stabilität: kein Aktivitätsverlust nach 24 h bei 4°C und pH 9,0; Temperatur-Stabilität: 65% Restaktivität nach
30 min bei 30°C (pH 9,0);
Lagerfähigkeit der Enzymlösung: nach einer Woche bei 4°C mit einer Restaktivität von 80 %; nach vier
Wochen bei - 20°C in 50 % Glycerin mit einer
Restaktivität von 70 %; starke Inhibierung durch MnCl2 in 1 mM
Konzentration, Erhöhung der Aktivität durch PMSF
(auf 187 %) ; keine Hemmung der TMA-Umsatzrate durch die strukturanalogen Verbindungen Betain, Cholin,
Carnitin, Trimethylaminoxid und Dimethylamin
(jeweils 1 mM Konzentration).
Die aus diesem Paracoccus-Stamm isolierte DMA- Dehydrogenase zeigt in gereinigter Form die folgenden wesentlichen Parameter:
- Reaktivität mit Dimethylamin in Gegenwart von Phenazinmetho- oder -ethosulfat ;
- hohe Substratspezifität für DMA;
- ein KM-Wert für DMA von 2,6-10-5 M;
- spezifische Aktivität (hochgereinigt) von 2,3 U/mg;
- Molekulargewicht von 140.000 Dalton (bestimmt mittels Gelfiltration);
- aus zwei Untereinheiten mit jeweils 77.000 besteht (bestimmt mittels SDS-Elektrophorese) ;
- pH-Optimum für die Reduktionsreaktion bei pH 8,6;
- Temperatur-Optimum der Aktivität bei 40-45°C;
- ein Optimum der pH-Stabilität bei pH 8,6;
- Temperatur-Stabilität: 65% Restaktivität nach 30 min bei 30°C (pH 9.0);
- starke Inhibierung der photometrischen Reaktion durch MnCl2 in 1 mM Konzentration; - G-
- kein Umsatz mit Methylamin, 2-Dimethylaminoethylamin, Dimethylformamid, Formaldehyd und Methanol, schwache Reaktivität mit Trimethylamin (ca. 6% bezogen auf den Dimethylamin-Umsatz) .
Die erfindungsgemäßen Dehydrogenasen zeigen eine hohe Spezifität bezüglich der Umsetzung von DMA bzw. TMA in Gegenwart anderer Alkylamine, so daß sie für die analytische Bestimmung von Dimethylamin (DMA-Dehydro¬ genase) bzw. Trimethylamin (TMA-Dehydrogenase) in Ge¬ mischen mit anderen Alkylaminen insbesondere im Lebens¬ mittel und diagnostischen Bereich geeignet sind.
Sie können speziell dort eingesetzt werden, wo Di¬ methylamin oder Trimethylamin als Abbauprodukte einer chemischen oder enzymatischen Reaktion entstehen, wie insbesondere zur Ermittlung des Frischezustandes von frischen (mit TMA-DH) bzw. gefrorenem (mit DMA-DH) Fisch.
Von weiterem Interesse ist die Bestimmung von Betain in klinischen Proben nach dessen Umsetzung mit Lyase unter Abspaltung von Trimethylamin, das mit TMA-DH in Gegenwart von Phenazinethosulfat oder Phenazinmetho- sulfat sowie Dichlorphenolindophenol umgesetzt und photometrisch ausgewertet wird.
Weitere Eigenschaften der Enzyme werden u. a. anhand der beigefügten Zeichnungen erläutert. Es zeigen:
Fig. 1: Wachstum und TMA-DH Bildung von Paracoccus DSM 6512 in Abhängigkeit von der Zeit;
Fig. 2 Abhängigkeit der TMA-DH Aktivität vom pH-Wert; Fig.. 3 Eichkurve für TMA im enzymatischen Test; und Flg. 4 Abhängigkeit der DMA-DH Aktivität vo pH-Wert.
Die Erfindung wird in nachfolgenden Beispielen näher erläutert. -?-
Beispiel 1: Isolierung von Mikroorganismen, die das Enzvm TMA-Dehydrogenase enthalten
A. Isolierung aus Bodenproben:
Ein Bioreaktor enthält 1 L Medium A mit folgender
Zusammensetzung:
Trimethylamin 5,0 g/L
Hefeextrakt 0,2 g/L
Ammoniumsulfat 0,5 g/L
Spurensalz-Lösung 20 ml/L
KH2Pθ4 1,5 g/L
K2HP04 4,0 g/L
Der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt, die Lösung wird 30 min bei 121°C sterilisiert. Der Bioreaktor wird mit ca. 5 g einer Bodenprobe (Kompost) beimpft. Im geschlossenen Gefäß wachsen geeignete Mikroorganismen der Bodenprobe heran, die Temperatur wird dabei auf 22°C gehalten. Durch Zufuhr sterilfiltrierter Luft wachsen die Organismen weitgehend unter SauerstoffSättigungs-Bedingungen heran. Nach 1 Tag Wachstum im geschlossenen Gefäß wird aus einer Vorratsflasche sterilisiertes Medium A zugepumpt (0,1 L/Std. ) , gleichzeitig mit derselben Flußrate Reaktor¬ inhalt abgeführt. Täglich wird eine Probe entnommen und auf TMA-Dehydrogenase Aktivität getestet. In den ersten 5 Tagen war keine Aktivität nachweisbar, ab dem 6. Tag konnte ein von Tag zu Tag regelmäßig zu¬ nehmender Aktivitäts-Anstieg gemessen werden. An¬ scheinend hat sich unter den Bedingungen des kontinu¬ ierlichen Wachstums ein geeigneter Mikroorganismus durchgesetzt. Ab dem 10. Tag hatte die Aktivität einen maximalen Wert erreicht, nach 12 Tagen wurde die Kultivierung abgebrochen. Mikroorganismen aus Reaktorproben ab dem 6. Tag, die auf durch Agar (18 g/L) verfestigtes Medium A ausgestrichen wurden, wur¬ den als Reinkultur auf TMA-Dehydrogenase Aktivität getestet. Hieraus konnte ein Stamm mit der gewünsch¬ ten Enzymaktivität isoliert werden (Isolat TMA-1). - «-
B. Taxonomische Bestimmung des Isolats TMA-1: Die mikrobiologische Charakterisierung ergab, daß der Stamm TMA-1 der Gattung Paracoccus zuzuordnen ist. Im einzelnen wurden folgende Eigenschaften festgestellt: Gram-negative Kokken, unbeweglich, strikt aerob, keine Säurebildung, nicht chemolithoautotroph. Gute Verwertung von Methylamin, Dimethylamin, Trimethyl¬ amin, Trimethylamin-N-Oxid, N-Methylformamid, N,N-Dimethylformamid; schwaches Wachstum auf Form- amid. Von den beiden Paracoccus-Arten denitrificans und halodenitrificans unterscheidet sich der Stamm TMA-1 dadurch, daß er nicht chemolithoautotroph ist. Der Stamm wurde am 2.5.1991 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, unter der Nummer DSM 6512 hinterlegt.
Beispiel 2: Gewinnung der TMA-Dehydrogenase
A. Vermehrung von Paracoccus sp. TMA-1
Zur Enzymgewinnung wurde der Stamm TMA-1 in folgendem Medium B angezogen (pro 1 1):
Figure imgf000010_0001
Im 8 1-Maßstab wurde das Medium nach Erreichen der Bruttemperatur von 30 °C mit 300 ml einer 24 Stunden alten Vorkultur beimpft. In einem solchen 8 1-Ansatz konnte gut der Verlauf der Enzymaktivität über die Zeit bestimmt werden, indem Proben zu verschiedenen Zeiten entnommen wurden und die Aktivität der TMA- Dehydrogenase nach Aufschluß der Zellen im zellfreien Überstand bestimmt wurde. In Fig. 1 ist ein solcher Verlauf dargestellt; er verdeutlicht, daß man eine maximale Enzymaktivität nur innerhalb eines enges Zeitraums gegen Ende der Wachstumsphase erhält. Der 8 1-Fermenter wurde nach 21 Stunden bei einer OD 660 von 4-35 mittels einer Zentrifuge geerntet, man erhielt 160 g Biofeuchtmasse. Die Biomasse kann bei -20°C eingefroren gelagert werden, wobei über mehrere Monate kein Aktivitätsverlust erkennbar ist.
B. Zellaufschluß
Die Enzymfreisetzung aus den Zellen kann durch an sich bekannte Methoden (Ultraschall, Hochdruck- Homogenisation, Naßvermahlung u. a.) geschehen. Hier wurden die Zellen durch Naßvermahlung mit Glasperlen aufgeschlossen. Dazu wurde die Biomasse in 0.1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7.0) suspendiert, so daß die Konzentration der Zellfeuchtmasse 40 %ig war. Die Zellinhaltsstoffe wurden aus der Suspension durch einen mechanischen Aufschluß mittels einer Schwing¬ mühle (Typ MM2; Fa. Retsch, Haan, FRG) gewonnen. Der Aufschluß erfolgte in 1.5 ml Eppendorfgefäßen. Die Eppendorfgefäße wurden mit 1.2 g Glasperlen (0,5 mm Durchmesser) und 0.6 ml 40 %iger Zellsuspension gefüllt und für 15 min bei einer Frequenz von 1800/sec geschüttelt. Nach Zentrifugation (3 min bei 12000 Upm) in einer Tischzentrifuge erhielt man einen viskosen Überstand, der für die weitere Enzymgewin¬ nung verwendet wurde.
C. Grobreinigung
Zur Grobreinigung wurden 0.5 ml des Rohextraktes in 1.5 ml Eppendorfgefäße gegeben und dort mit 0.025 ml einer 5 %igen Polyethylenimin-Lösung (PEI) versetzt. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurden die Proben 5 min in einer Tischzentrifuge bei 12000 Upm zentrifu- giert und der fast klare Überstand für die weitere Enzymreinigung eingesetzt.
D. Feinreinigung
Zur Feinreinigung des Enzyms wurde der Überstand nach PEI-Fällung einer Ionenaustauschchromatographie an einer Mono-Q Säule (Fast Protein Liquid Chromato- graphy (FPLC) ; Fa. Pharmacia, Freiburg FRG) unterzo¬ gen. 10 ml des mit einem 0,2 μm-Filter filtrierten Rohextraktes wurden in 2 ml Portionen auf die Säule aufgegeben und mit einem Konzentrationsgradienten von 0.05 M - 0.2 M Natriumpyrophosphat-Puffer pH 9,0 eluiert. Das Enzym wurde bei einer Pufferkonzentra¬ tion von ca. 0,09 M von der Säule abgelöst. Anschlie¬ ßend wurden die das Enzym enthaltenden Fraktionen zusammengegeben und 1:2 mit 0.05 M Natriumpyrophos¬ phat-Puffer verdünnt. Für den letzten Reinigungs¬ schritt wurde nun wiederum die Lösung in 2 ml Portio¬ nen auf die Mono-Q Säule aufgegeben und mit einem NaCl-Gradienten (0-1 M) eluiert; das Enzym wurde bei einer NaCl-Konzentration von 400 mM abgelöst. In Fraktionen mit hoher Enzymaktivität wurde eine spezifische Aktivität von 4 U/mg gemessen. Ein mit diesen Fraktionen angefertigtes SDS-Gel ergab auf Grund der Proteinfärbung, daß die TMA-Dehydrogenase hier zu mindestens 90 % au gereinigt vorlag.
Die Anreicherung des Enzyms im Verlauf der Reinigung ist in Tab. 1 zusammengestellt. - M-
Tab. 1: Reinigung der TMA-Dehydrogenase
Figure imgf000013_0001
Die Aktivität der TMA-Dehydrogenase wurde dabei mit folgenden Testansatz (C) bestimmt:
780 μl Puffer (0,1 M Natriumpyrophosphat plus 0,05 M NH4C1; pH 9,0) 20 μl einer 150 mM Trimethylamin-Lösung (in Puffer)
(Endkonz. im Test: 3 mM) 50 μl Dichlorphenolindophenol (DCPIP; Endkonz. im
Test: 0,08 mM) , 50 μl Phenanzinethosulfat (PES; Endkonz. im Test 2mM) 100 μl Enzymlösung
Die Anfangs-Reaktionsgeschwindigkeit wurde bei 595 nm an einem Spektralphotometer bei 30°C gemessen. Eine Enzymeinheit entspricht dem Umsatz von 1 μMol TMA pro 1 min, gemessen über den Umsatz von 1 μMol Dichlor¬ phenolindophenol pro 1 min (e=7,0 mM~1-cm~1).
Beispiel 3: Charakterisierung der TMA-Dehvdrogenase
A. pH-Abhängigkeit der Umsetzung
Die Abhängigkeit der Aktivität vom pH-Wert wurde be¬ stimmt, indem der pH-Wert des in Beispiel 2.D. aufge¬ führten Pyrophosphat-Puffers auf verschiedene Werte zwischen 7,0 und 11,0 eingestellt wurde und damit die - AI-
Aktivität der TMA-Dehydrogenase wie unter 2.D. be¬ schrieben gemessen wurde. Fig. 2 zeigt das pH-Profil dieser Umsetzung, man erhält eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert von 9.
B. Einfluß des pH-Wertes auf die Lagerstabilität Der Einfluß des pH-Wertes auf die Lagerung wurde getestet, indem 100 μl der Enzymlösung in 780 μl 0.1 M Puffer des entsprechenden pH-Wertes für 24 Stunden bei 4 "C inkubiert wurden.
Die TMA-Dehydrogenase hat ihr Stabilitätsmaximum bei pH 9,0. Die reine Enzymlösung hat nach 6 Tagen bei 4°C eine Restaktivität von 80 %. Unter Zusatz von 50 % Glycerin ließ sich nach 4 Wochen bei - 20 °C noch eine Restaktivität von 70 % messen.
C. Temperatur-Abhängigkeit der Aktivität
Zur Bestimmung des Temperaturoptimums wurde die Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Temperatu¬ ren gemessen. Nach ausreichender Vortemperierung der Testkomponenten ohne Enzym wurde die Reaktion durch Zugabe von Enzymlösung gestartet.
Die TMA-Dehydrogenase zeigt maximale Aktivität bei 45°C, bei 60°C ist keine Aktivität mehr meßbar.
D. Temperatur-Stabilität
Zur Bestimmung der Temperaturstabilität der TMA- Dehydrogenase wurden 100 μl Enzymlösung für 30 min in einem Wasserbad bei der gewünschten Temperatur inku¬ biert. Anschließend wurde die Enzymlösung kurz abge¬ kühlt, mit den restlichen Testkomponenten versetzt und die verbleibende Aktivität durch Messung bei 30°C bestimmt. Man erhält nach Vorinkubation bei 30°C noch 65% Restaktivität, bei 37°C noch 50%. E. Einfluß verschiedener Metallkationen und Inhibitoren
Um das Verhalten der TMA-Dehydrogenase-Aktivität in Gegenwart von Metallkationen und Hemmstoffen zu bestimmen, wurden die entsprechenden Substanzen in einer Konzentration von 1 mM dem Test zugesetzt und nach einer Inkubationszeit von 10 min bei 30 °C die Aktivität bestimmt. Tabelle 2 faßt die Ergebnisse zusammen.
Tabelle 2: Einfluß verschiedener Metallkationen und Inhibitoren. Zur Kontrolle wurden die Verbindungen in parallelen Tests ohne TMA eingesetzt, um einen mögli¬ chen Einfluß der Verbindungen auf den Enzymtest auf¬ zuzeigen.
Figure imgf000015_0001
Auffällig ist die starke Inhibierung des Enzyms durch MnCl2 und die Erhöhung der Aktivität durch PMSF. Beide Komponenten zeigten keine Aktivität im Enzym¬ test ohne TMA.
Figure imgf000016_0001
F. Substratspektrum der TMA-Dehydrogenase
Zur Erstellung eines Substrat-Spektrums wurde im Test (siehe Beispiel 2.D.) einerseits TMA durch eine Reihe anderer Methylamin-Verbindungen (1 mM) , andererseits der Elektronenakzeptor Phenazinethosulfat (einschl. des Redoxfarbstof es Dichlorphenolindophenol) durch andere Elektronenakzeptoren ersetzt und anschließend die Enzymaktivität bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß bezüglich der Aminkomponente anscheinend nur TMA umgesetzt wird, inaktiv waren: Dimethylamin, Methyl¬ amin, Dimethylethylamin, Trimethylamin-N-oxid, Cholinchlorid, Betain, Carnitin und D,L-Carnitinamid. Auch bezüglich des Elektronenakzeptors ist das Enzym anscheinend hochspezifisch, TMA wird nicht umgesetzt, wenn PES/DCPIP durch folgende Verbindungen ersetzt wird: Methylenblau, K3(Fe(CN)6), Wurster's Blau, PES, DCPIP, NAD+ oder NADP+; lediglich mit der struktur¬ analogen Verbindung Phenazinmethosulfat findet eine Reaktion statt (98%iger Umsatz im Vergleich zu PES). Daneben wurden einige der oben erwähnten Amin-Verbin- dungen getestet, ob sie den Umsatz von TMA inhibie¬ ren. Folgende Verbindungen wurden in jeweils äqui- molarer Konzentration zu TMA dem kompletten Enzymtest zugesetzt (in Klammern sind als Ergebnis die jeweili¬ gen Enzymaktivitäten angegeben): Dimethylamin (96%), Cholin (102%), Betain (90%) oder Carnitin (110%). Werden dem kompletten Testansatz mit PES,DCPIP und TMA noch das Coenzym NAD+ oder NADP+ zugesetzt, ist keine Steigerung des Umsatzes nachweisbar. Die Reaktion von TMA in Gegenwart von PES/DCPIP ist θ2-unabhängig; wird ein Test unter. anaeroben Bedin¬ gungen (Puffer und Testkomponenten für 15 min mit Argon begast) durchgeführt, erhält man eine identi¬ sche Umsatzrate wie im Test mit 0 -begasten Puffer. Damit unterscheidet sich das Enzym von solchen der Gruppe der Oxidasen, bei denen 02 Co-Substrat der Reaktion ist. Biochemisch gehört das Enzym damit zu der Gruppe der Dehydrogenasen.
G. Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substrat¬ konzentration (Bestimmung des K^-Wertes1
Zur Bestimmung des KM-Wertes wurde die Aktivität der TMA-Dehydrogenase in Abhängigkeit von der Substrat¬ konzentration gemessen. Die Auswertung nach Lineweaver-Burke ergibt einen KM-Wert von 6,6-10-7 M. Substratsättigung tritt oberhalb von 0.03 mM auf.
H. Bestimmung des Molekulargewichtes In der SDS-Elektrophorese wurde eine Molmasse von 70.000 ±5.000 bestimmt (Vergleich mit Proteinstandards im Molmassenbereich von 20000 bis 97000) .
Beispiel 4: Verwendung des Enzyms für die Bestimmung der TMA-Konzentration
Im Bereich von 2,0 bis 8,0-10~7 M an TMA ist die Reaktionsgeschwindigkeit proportional zur Konzentra¬ tion an TMA (siehe Fig. 3). Man kann somit diese photometrsiehe Reaktion verwenden, um TMA unbekannter Konzentration in Proben zu bestimmen. Mit dieser Nachweismethode sind auch andere TMA- haltige Verbindungen nachweisbar, sofern in einer chemischen oder enzymatischen Vorbehandlung diese Verbindungen derart abgebaut werden, daß TMA freige¬ setzt und dieses dann enzymatisch mittels TMA- Dehydrogenase bestimmt wird. -Ab-
Beispiel 5: Gewinnung der Dimethylamin(DMA-*)-Dehydro¬ genase
A. Vermehrung von Paracoccus DSM 6512 zur Gewinnung von DMA-Dehydrogenase
Zur Enzymgewinnung wurde der Stamm DSM 6512 in fol¬ gendem Medium B angezogen (pro 1 1):
Figure imgf000018_0001
Im 8 1-Maßstab wurde das Medium nach Erreichen der Bruttemperatur von 30 °C mit 300 ml einer 24 Stunden alten Vorkultur beimpft und nach ca. 21 Stunden bei einer OD660 von >4 mittels einer Zentrifuge geerntet. Die Biomasse kann bei -20°C eingefroren gelagert wer¬ den, wobei über mehrere Monate kein Aktivitätsverlust erkennbar ist.
B. Zellaufschluß
Die Enzymfreisetzung aus den Zellen kann wie in Beispiel 2 B erfolgen. Hier wirden die Zellen in 0,1 M Tris-HCl- Puffer (pH 7,0) unter Zusatz eines Proteaseinhibitors (Pefabloc; Fa. Pentapharm, Basel, Schweiz) suspendiert und durch Naßvermahlung mit Glasperlen aufgeschlossen. Nach Zentrifugation (15 Min. bei 16000 UpM) wurde der Überstand filtriert (0,45 μm Poren) und dann einer weiteren chromato¬ graphischen Auftrennung unterzogen.' C. Reinigung mittels Ionenaustausch-Chromatographie
Zur Reinigung des Enzyms wurde der Überstand einer Ionenaustauschchromatographie an einer Q-Sepharose (Fa. Pharmacia, Freiburg FRG) unterzogen. Die Säule wurde mit 50 mM Na4P207-Puffer pH 9 equilibriert. Nach Auftragen des filtrierten Rohextraktes wurde erst mit zwei Bettvolumina des gleichen Puffers eluiert, dem 200 mM NaCl zugesetzt wurden und anschließend mit einem linearen Gradienten von 200 bis 500 mM NaCl (gelöst in obigem Natriumphosphat¬ puffer) . Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und mit einer Ultrafiltationsmembran (Ausschlußgrenze 30 kDalton; Fa. Amicon) eingeengt.
D. Reinigung mittels Gelfiltration
Die eingeengten aktiven Fraktionen nach der Ionenaus¬ tausch-Chromatographie wurden einer Gelfiltration unterworfen. Die Trennung erfolgt über ein Sephadex G-200 Gel (Pharmacia), das mit 50 mM KPi Puffer, pH 8 mit 150 mM NaCl equilibriert wurde. Mit dem gleichen Puffer wird auch eluiert. Die aktiven Fraktionen können bei -20°C mit 50% Glycerin versetzt aufbewahrt werden.
Die Anreicherung des Enzyms im Verlauf der Reinigung ist in Tab. 3 zusammengestellt. - 4g-
Tab. 3: Reinigung der DMA-Dehydrogenase
Reinigungs- schritt
Figure imgf000020_0002
Rohextrakt
Q-Sepharose
Gelfiltration
Figure imgf000020_0001
Die Aktivität der DMA-Dehydrogenase wurde analog zur TMA-Dehydrogenase mit einem Testansatz wie für die TMA-Dehydrogenase bestimmt, nur daß hier an Stelle der TMA-Lösung 50 μl einer 100 M Dimethylamin-Lösung (in Puffer) vorgesehen wurden.
Beispiel 6: Charakterisierung der DMA-Dehydrogenase
A. pH-Abhängigkeit der Umsetzung
Die Abhängigkeit der Aktivität vom pH-Wert wurde ana¬ log zu Beispiel 3 A bestimmt. Fig. 4 zeigt das pH- Profil dieser Umsetzung, man erhält eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert von 8,6.
B. Einfluß des pH-Wertes auf die LagerStabilität Der Einfluß des pH-Wertes auf die Lagerung wurde getestet, indem 100 μl der Enzymlösung in 780 μl 0.1 M Puffer des entsprechenden pH-Wertes (zwischen 7,1 und 10,0) für 24 Stunden bei 4 °C inkubiert wurden. Nach Zugabe der restlichen Testkomponenten wurde dann die Restaktivität bei 30°C gemessen. Die DMA-Dehydro¬ genase hat ihr Stabilitätsmaximum bei pH 8,6 (gemes¬ sene Aktivität: 0,31 U/ml). Bei pH 9,9 wurden noch 0,13 und bei pH 7,6 noch 0,2 U/ml gemessen. ft
C. Temperatur-Abhängigkeit der Aktivität
Zur Bestimmung des Temperaturoptimums wurde die Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Temperatu¬ ren (25 - 60°C) gemessen. Nach ausreichender Vortem¬ perierung der Testkomponenten ohne Enzym wurde die Reaktion durch Zugabe von Enzymlösung gestartet. Die DMA-Dehydrogenase zeigt maximale Aktivität bei 40-45°C, bei 60°C ist keine Aktivität mehr meßbar.
D. Temperatur-Stabilität
Zur Bestimmung der Temperaturstabilität der TMA- Dehydrogenase wurden 100 μl Enzymlösung für 30 min in einem Wasserbad bei der gewünschten Temperatur inku¬ biert. Anschließend wurde die Enzymlösung kurz abge¬ kühlt, mit den restlichen Testkomponenten versetzt und die verbleibende Aktivität durch Messung bei 30°C bestimmt. Man erhält nach Vorinkubation bei 30°C noch 63% Restaktivität, bei 37°C noch 45%, bei 56°C war keine Aktivität mehr feststellbar.
E. Einfluß verschiedener Metallkationen und Inhibitoren
Um das Verhalten der DMA-Dehydrogenase-Aktivität in Gegenwart von Metallkationen und Hemmstoffen zu bestimmen, wurden die entsprechenden Substanzen in einer Konzentration von 1 mM dem Test zugesetzt und nach einer Inkubationszeit von 10 min bei 30'°C die Aktivität bestimmt. Tabelle 4 faßt die Ergebnisse zusammen. -2.0-
Tabelle 4: Einfluß verschiedener Metallkationen und Inhibitoren. Zur Kontrolle wurden die Verbindungen in parallelen Tests ohne TMA eingesetzt, um einen mögli¬ chen Einfluß der Verbindungen auf den Enzymtest auf¬ zuzeigen.
Verbindung Restaktivität (%)
Metallionen:
MgCl2 120
MnCl2 0
ZnS04 60
CuS04 85
CθCl2 115
NiCl2 80
Inhibitoren:
EDTA 115
1,10-Phenantrolin 95
Jodacetamid 90 p-Hydroxymercuribenzoat 95
N-Ethylmaleimid 100
Auffällig ist die starke Inhibierung des Enzyms durch MnCl2.
F. Substratspektrum der TMA-Dehydrogenase
Das Substrat-Spektrum wurde wie in Beispiel 3 F angegeben ermittelt. Die Ergebnisse zeigten, daß bezüglich der Aminkomponente das Enzym eine hohe Spezifität für DMA zeigt, Trimethylamin wird noch mit 6% Nebenaktivität umgesetzt, inaktiv waren: Methyl¬ amin, 2-Dimethylaminoethylamin, Dimethylformamid, Formaldehyd und Methanol. Auch bezüglich des Elektro¬ nenakzeptors ist das Enzym anscheinend hochspezi¬ fisch, TMA wird nicht umgesetzt, wenn PES/DCPIP durch - -
folgende Verbindungen ersetzt wird: Methylenblau, K3(Fe(CN)6), DCPIP, NAD+ oder NADP+, Cytochrom C (Pferd), Brillant Blue R; lediglich mit der struktur¬ analogen Verbindung Phenazinmethosulfat findet eine vergleichbar hohe Reaktion statt (98%iger Umsatz im Vergleich zu PES). Meldolablau wird mit einer Aktivi¬ tät von 15% und die Kombination PES/Cytochrom C (Pferd) mit 30% umgesetzt.
Die Reaktion von DMA in Gegenwart von PES/DCPIP ist θ -unabhängig; wird ein Test unter anaeroben Bedin¬ gungen (Puffer und Testkomponenten für 15 min mit Argon begast) durchgeführt, erhält man eine identi¬ sche Umsatzrate wie im Test mit 02-begasten Puffer. Damit unterscheidet sich das Enzym von solchen der Gruppe der Oxidasen, bei denen 02 Co-Substrat der Reaktion ist. Biochemisch gehört das Enzym damit zu der Gruppe der Dehydrogenasen.
G. Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substrat- konzentration (Bestimmung des K^-Wertes1
Zur Bestimmung des KM-Wertes wurde die Aktivität der DMA-Dehydrogenase in Abhängigkeit von der Substrat¬ konzentration gemessen. Die Auswertung nach Lineweaver-Burke ergibt einen KM-Wert von 2,6-10-5 M.
H. Bestimmung des Molekulargewichtes Mittels Gelfiltration konnte gezeigt werden, daß das Enzym eine Masse von ca. 140.000 Dalton besitzt. In der SDS-Elektrophorese wurde eine Molmasse von 77.000 ±5.000 bestimmt (Vergleich mit Proteinstandards im Molmassenbereich von 20000 bis 97000). Diese Daten zeigen, daß die DMA-Dehydrogenase aus zwei anschei¬ nend identischen Untereinheiten aufgebaut ist. 1-
I. Bestimmung des isoelektrischen Punktes Der isoelektrische Punkt der DMA-Dehydrogenase liegt bei 4,7 (gemessen mittels isoelektrischer Fokussie- rung (Pharmacia, Freiburg)).
K. Bestimmung der N-terminalen Proteinsequenz
Die Sequenz der ersten Aminosäuren des N-Terminus wurden mit einem Proteinsequenator (Fa. Applied
Biosystems) bestimmt:
(Val)-Lys-(Pro)-Xaa-Tyr-(Ile)-Ile-Leu-Phe-Thr-(Pro)-
Ile-Gln-Ile-Xaa-Xaa-Lys-Thr-Leu
Dabei sind Aminosäuren, die in Klammern gesetzt sind, unsicher, Xaa bezeichnet eine unbekannte Aminosäure.
Die Dimethylamin-Dehydrogenase kann analog zur Trimethylamin-Dehydrogenase speziell dort eingesetzt werden, wo Dimethylamin Produkt einer chemischen oder enzymatischen Reaktion ist. So kann für die DMA-Be¬ stimmung die in Beispiel 4 beschriebene Bestimmungs¬ methode für TMA in einfacher Weise abgeändert werden, indem die Trimethylamin-Dehydrogenase durch Dimethyl¬ amin-Dehydrogenase ersetzt wird. Ein solcher Test ist beispielsweise nützlich zur Bestimmung des Frischezu¬ stands von Gefrierfisch, da hier mit zunehmender Lagerung der DMA-Gehalt ansteigt.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Gewinnung von analytisch nützlicher Di¬ methylamin- bzw. Trimethylamin-Dehydrogenase, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man einen Paracoccus Stamm auf einem Dimethylamin bzw. Trimethylamin enthaltenden Kulturmedium vermehrt, erntet und die geernteten Zellen zur Enzymfreisetzung mechanisch aufschließt, die erhaltene Flüssigkeit von Zellfragmenten befreit und das im Rohextrakt enthalte¬ ne Enzym ggf. aufreinigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Aufreinigung eine lonenaustauschchromatographie, sowie eine Gelfiltration und ggf. beiden voran eine Polyethylenimin-Fällung umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß als Paracoccus-Stamm der Stamm mit der Hinterle- gungs-Nr. DSM 6512 bzw. eine seiner Mutanten verwendet wird.
4. Dimethylamin-Dehydrogenase , erhalten nach einem der vorangehenden Ansprüche.
5. Trimethylamin-Dehydrogenase, erhalten nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung von DMA-Dehydrogenase bzw. TMA-Dehydrogenase nach einem der Ansprüche 4 oder 5 zur selektiven analy¬ tischen Bestimmung von Dimethylamin bzw. Trimethylamin in wäßrigen Flüssigkeiten durch enzymatische Umsetzung.
7. Verwendung nach Anspruch 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Umsetzung bei gleichzeitiger Anwesenheit von Phenazinethosulfat oder Phenazin ethosulfat sowie Di- chlorphenolindophenol durchgeführt und photometrisch verfolgt wird.
8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß als wäßrige Flüssigkeit Flüssigkeiten oder Extrakte von Proteinproben aus dem Lebensmittelbereich oder von Diagnostikproben dienen.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8 für den DMA- bzw. TMA-Nachweis in Flüssigkeiten, in denen das Trimethylamin oder Dimethylamin als Abbauprodukt einer chemischen oder enzymatischen Vorbehandlung enthalten ist.
10. Verwendung nach Anspruch 9 für die Bestimmung des Be¬ taingehalts klinischer Proben nach dessen Umsetzung mit Lyase durch photometrische Bestimmung des abgespal¬ teten Tri ethyla ins.
11. Verwendung nach Anspruch 6 von DMA-Dehydrogenase zur Bewertung der Fischfrische von gefrorenem Fisch.
12. Verwendung nach Anspruch 6 von TMA-Dehydrogenase zur Bewertung der Fischfrische von frischem Fisch.
13. Paracoccus-Stamm der Hinterlegungs-Nr. DSM 6512 für die Gewinnung von DMA- bzw. TMA-Dehydrogenase nach Anspruch 1.
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