DE3307607A1 - L-glutaminsaeure-oxidase, verfahren zu deren herstellung und verwendung fuer analysenmethode - Google Patents
L-glutaminsaeure-oxidase, verfahren zu deren herstellung und verwendung fuer analysenmethodeInfo
- Publication number
- DE3307607A1 DE3307607A1 DE19833307607 DE3307607A DE3307607A1 DE 3307607 A1 DE3307607 A1 DE 3307607A1 DE 19833307607 DE19833307607 DE 19833307607 DE 3307607 A DE3307607 A DE 3307607A DE 3307607 A1 DE3307607 A1 DE 3307607A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- glutamic acid
- mole
- enzyme
- acid oxidase
- hydrogen peroxide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
L-Glutaminsäure-Oxidase , Verfahren zu deren Herstellung
und Verwendung für Analysenmethode
Die Erfindung betrifft (H3O bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase,
die eine Substrat-Aktivität für L-Glutaminsäure
oder L-Glutamat (die nachstehend einfach als "L-Glutaminsäure"
oder als "L-Glutamat" bezeichnet sind) hat und eine enzymatisch^ Wirkung aufweist, durch die eine Reaktion
katalysiert wird, bei der ein Mol oC -Ketoglutarsäure
ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid aus ei-
~ G-
nem Mol L-G lut ami η sä ure , einem Mol Sauerstoff und einem
Mol Wasser gebildet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von (H2O2 bildender)
L-Glutaminsäure-Oxidase und umfaßt deren Verwendung für
ein Analysenverfahren.
Bisher kannte man als Substrat-Spezifizität für L-Glutaminsäure
aufweisende Oxidase nur L- (+)-Glutamat-Oxidoreduktase.
Dieses Enzym weist eine enzymatische Wirkung auf, durch die eine Reaktion katalysiert wird, bei der zwei Mole 06 -Ketoglutarsäure,
zwei Mole Ammoniak und ein Mol Wasser aus zwei Molen L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol
Wasser gebildet werden. (Biochim.Biophys. Acta, 368, 158 172 (1974)).
Bekannt ist weiterhin für L-Aminosäure substratspezifische L-Aminosäure-Oxidase, die eine enzymatische Wirkung aufweist,
durch die eine Reaktion katalysiert wird, bei der ein Mol cC-Ke to sä ure , ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid
aus einem Mol Aminosäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden. (Methods in
Enzymology, Vol. II, 204 - 211 (1955) und andere ).
Die zuvor erwähnte bekannte L-(+)-Glutamat-Oxidoreduktase
katalysiert die zuvor beschriebane Reaktion, bei der Wasserstoffperoxid nicht entsteht. Zwar entsteht Wasserstoffperoxid
bei der vorstehend erwähnten Enzym-Reaktion, die durch die bekannten L-Aminosäure-Oxidasan katalysiert
wird; jedoch ist unter den bekannten L-Aminosäure-Oxidase η
bisher nicht von einem Enzym berichtet worden, das auf ein L-Glutaminsäure-Substrat zu wirken vermag. (Methods in
Enzymology, Vol. II, S. 204 - 211 (1955)).
Es wurde nun gefunden, daß Mikroorganismen der Gattung
Streptomyces ein Enzym produzieren, das substratspezifisch auf L-Glutaminsäure wirkt.
So gewinnt man beispielsweise aus Streptomyoes Art A77OO,
der aus einer Bodenprobe eines Feldes in Saku-shi, Naganoken, Japan, isoliert wurde, und aus Streptomyces Art
A8O63, der aus einer Bodenprobe eines Süßkartoffel-Feldes
in Naganohara-cho, Azuma-gun, Gunma-ken, Japan, gewonnen
wurde, das Enzym, das eine Substrat-Spezifizität für L-Glutaminsäure aufweist und eine Reaktion katalysiert,
bei der ein Mol ot-Ketoglutarsäure, ein Mol Ammoniak und
ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden.
Das Enzym wurde gereinigt, und es wurde festgestellt, daß
es sich um ein einzelnes Protein handelt. Dieses erfindungsgemäße Enzym wurde als (ILO bildende) L-Glutamin säure-Oxidase
bezeichnet. Erfindungsgemäß wurde unter Verwandung dieses neuen Enzyms eine neue Bestimmungsmethode
für L-Glutaminsäure, die in einer flüssigen Materialprobe enthalten ist, entwickelt.
Die taxonomischen Eigenschaften der für die Gewinnung des
erfindungsgemäßen Enzyms eingesetzten Mikroorganismen Streptomyces Art A77OO und Λ8Ο63 sind die folgenden:
(A) Streptomyces Art A77OO:
I. Mikroskopische Morphologie:
I. Mikroskopische Morphologie:
Die morphologischen Merkmale waren nach 10 bis 15 ta giger Züchtung bei 30°C auf einem Medium aus Stärkeanorganisches
Salz Agar die folgenden. Praktisch sozusagen die gleichen Merkmale wurden beim Züchten auf einem
Medium aus Hafermehl Agar und beim Züchten auf einem Medium aus Hefeextrakt-Malzextrakt Agar gefunden.
Das Substrat-Myzel ist gekrümmt, es wächst verzweigt
mit einem Durchmesser von 0,5 - 0,6 ,u und hat weder
myceliales Oidium noch Sporenträger.
Das Luftmyzel, das auf dem Substrat-Myzel wächst, ist gekrümmt, wächst mit einfachen Verzweigungen, 0,6 0,8
.u im Durchmesser, und bildet Kettensporen. Die Sporenketten
sind 2- bis 3-gängige Spiralen, die teilweise schleifenförmig oder verhakt angeordnet sind.
Die Sporen haben elliptische Form oder sind kurze Stäbchen; sie sind 0,6 - 0,8 χ 0,8 - 1,0 .u gross und
haben eine glatte Oberfläche.
Es werden weder begeißelte Sporen noch Sporangien gebildet.
II. Komposition von Diaminopimelinsäure:
Bei der vollständigen Zeil-Analyse wurde L-Diaminopimelinsäure gefunden; meso-Formen wurden nicht entdeckt.
III. Makroskopische Merkmale:
Die Merkmale auf verschiedenen Medien, 14 Tage bei 30°C, sind in Tabelle 1 veranschaulicht.
Die FarbbeStimmungen wurden anhand des "Color Harmony
Manual, 4th Edition, 1958 (Container Corp. of America)"
gemacht.
IV. Physiologische Eigenschaften:
(1) Wachstumstemperatur: 20 - 40 C
(2) Sauerstoffbedarf: aerob
(3) Gelatine verflüssigung: positiv (sehr schwach)
(4) Stärkehydrolyse: positiv
(5) Magermilch: Peptonisation: positiv
(schwach)
Koagulation: negativ
(6) Melaninartige Pigment- _ , · ..
bildung: Tvrosin A9ar· negativ
Pepton-IIefeextrakt-Eisen Agar: positiv
(7) Brauchbare Kohlenstoffquellen: positiv?
L-Arabinose, D-Fructose, D-Glucose, Inositol,
D-Mannitol, Raffinose, L-Rhamnose, Saccharose
und D-Xylose.
Tabelle 1
| Medium | Wachstum | gut | Farbton des Substrat-MyzeIs |
Luftmyzel | Lösliches Pigment |
| Saccharose-Nitrat Agar |
gut | mäßig | zimtfarben (3Ie) | gering: perlfarben (3ba) bis rosa (5ba) |
rostbraun (5Ie) |
| Glucose-Asparagin Agar |
mäßig | hell-alfenbein (2 ca) |
keines | ke i ne s | |
| GIy ce rin-Asp aragin Agar |
gut | top asfarbeη (3ne) | mäßig: weiß (a) bis perlfarben (3ba) |
keines | |
| Starke-anorgani- j sehes Salz Agar j g |
topas- (3ne) bis zimtfarben (3Ie) |
mäßig bis gut: ■ perlfarben (3ba) |
keines | ||
| Tyrosin Agar | zimtfarben (3Ie) | mäßig: perlfarber (3ba) |
ι keines | ||
| Hafermehl Agar | bambusfarben (2fb) | mäßig: weiß (a) bis perlfarben (3ba) |
keines |
OO CD -<i CD CD
Tabelle 1 (Forts.)
| Medium | Wachstum | Farbton des Substrat-MyzeIs |
Luftmyzel | Lösliches Pigment |
| Hefextrakt-Malz- axtrakt Agar |
gut | hell-bernstein- (3ic) bis zimtfarbeη (3Ie) |
mäßig bis gut: perlfarben (3ba) |
keines |
| 3ennett's Agar | gut | tonerdebraunfarben (31g) |
mäßig: perlfarben (3ba) |
topas- farben (3ne) |
| Emarson1s Agar | gut | zimtfarben (3Ie) | gering: weiß (a) bis perlfarben (3ba) |
hell-bern steinfarben (3ic) |
| Nutrient Agar | mäßig bis gering |
hell-bernstein farben (3ic) |
einige: weiß (a) |
ke i ne s |
| Pepton-Hefeextrakt- Eisen Agar |
mäßig bis gering |
farblos | ke i ne s | goldbraun (3pi) bis eichenbraun (4pi) |
CO CO CD
Wie zuvor veranschaulicht, kommen der Art A77OO die taxonomischen
Merkmale, Bildung von Luftmyzel mit zahlreichen Sporenketten an einem echten Substrat-Myzel, L-Form von
Diaminopimelinsäure, keine Bildung begeißelter Sporen und
Sporangien, sowie aerobes Wachstum zu, und das bedingt den
Schluß, daß diese Art zu der Gattung Streptomyces gehört. Diese Art wird dementsprechend als Streptomyces sp. A77OO
bezeichnet und wurde hinterlegt beim Fermentation Institut,
Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., Japan, unter der Hinte r le gungsnumme r FERM P-6241.
Diese Art wurde auch hinterlegt beim Agricultural Research Service, unter der Hinte r leg ung s nummer NRRL Number 15267.
(B) Streptomyces Art A8O63:
I. Mikrospkopische Morphologie:
Die morphologischen Merkmale waren nach 10 bis 15 ta giger Züchtung bei 30 C auf einem Medium aus Stärkeanorganisches Salz Agar die folgenden. Praktisch sozusagen
die gleichen Merkmale wurden beim Züchten auf einem Medium aus Glycerin-Asparagin Agar, Tyrosin Agar und
Hefeextrakt-Malzextrakt Agar gefunden.
Das Substrat-Myzel ist gekrümmt, es wächst verzweigt mit einem Durchmesser von 0,5 - 0,6 .u und hat weder
myceliale Oidien noch Sporenträger.
Das Luftmyzel, das auf dem Substrat-Myzel wächst,
ist gekrümmt, wächst mit einfachen Verzweigungen, 0,6 0,8 ,u im Durchmesser groß und bildet viele Kettensporen.
Die Sporenkettan sind reich an Verschlingungen, Verhakungen und Doppelspiralen und weisen einige dreifache
oder mehrfache Spiralen auf.
Die Sporen sind kugelförmig, 0,6 - 0,8 ,u im Durchmesser
groß und haben dornige Oberfläche. Es werden weder begeißelte Sporen noch Sporangien gebildet.
II. Komposition von Diaminopimelinsäure:
Bei der vollständigen Zeil-Analyse wurde L-Diaminopimelinsäure
gefunden; meso-Forman wurden nicht entdeckt.
III. Makroskopische Merkmale:
Die Merkmale auf verschiedenen Medien, 14 Tage bei
3O°C, sind in Tabelle 2 veranschaulicht.
Die FarbbaStimmungen wurden wie für Tabelle 1 angegeben
durchgeführt.
IV. Physiologische Eigenschaften:
(1) Wachstumstemperatur: 15 - 43 C
(2) Sauerstoffbedarf: aerob
(3) Gelatineverflüssigung: positiv (schwach)
(4) StärkehydroIyse: positiv
(5) Magermilch: Koagulation: negativ
PGptonisation:positiv
(6) Melaninartige Pigment- Tyrosin Agar-Medium und
bildung: Pepton-He feextrakt-Eisen-Agar-Medium: positiv
(7) Brauchbare Kohlenstoffquellen: positiv:
D-Fructose, D-Glucose, D-Mannitol, D-Rhamnose
und Saccharose,
schwach positiv:
L-Arabinose, Inositol, Raffinose und D-XyIose
Wie zuvor veranschaulicht, kommen der Art A8O6 3 die taxonomischen
Merkmale, Bildung von Luftmyzel mit zahlreichen Sporenketten an einem echten Substrat-Myzel, L-Form von
DiaminopimelinslurG, keine Bildung begeißelter Sporen und
Sporangien, sowie aerobes Wachstum zu, und das bedingt den Schluß, daß diese Art zu der Gattung Streptomyces gehört.
Diese Art wird dementsprechend als Streptomyces sp. A8O63
bezeichnet und wurde hinterlegt beim Fermentation Institut, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I.,
Japan, unter der HinterlGgungsnummar FERM P-6242.
Diese Art wurde auch hinterlegt beim Agricultural Research Service, unter der Hinterlegungsnummer NRRL Number 1526 8.
| Medium | Wachstum | Farbton des Substrat-Myzels |
Luftmyzel | Lösliches Pigment |
| Saccharose-Nitrat Agar |
gut | schokolade n- braun (5pn) |
gut: silbergrau (3fe) bis beige (3ge) |
kupferbraun (5pi) bis tie fbraun (5pl) |
| Glucose-Asparagin Agar |
gering | dunkelbraun (4pl) |
einige: naturfarben (3dc) |
eichen- braunfarben (4pi) |
| Glyce rin-Asp aragin Agar |
gut | dunkelbraun (4pl) bis schokoladen braun (4pn) |
gut: keks farbe η (3ec) bis beige (3ge) |
e i ehe n- braunfarbeη (4pi) |
| Stärke-anorgani sche s Salz Agar |
gut | dunkelbraun (4pl) |
gut: silbergrau (3fe) bis beige (3ge) |
keines |
| Tyrosin Agar | gut | schokoladen braun (5ρη) |
gut: keksfarben (3ec) bis beige (3ge) |
kupferbraun (5pi) bis tiefbraun (5pl) |
CO O -<i
CD O
Tabelle 2 (Forts.)
| Medium | Wachstum | Farbton des Substrat-Myzels |
Luftmyzel | Lösliches Pigment |
| Hafermehl Agar | mäßig | käme!farben (3ie) bis toner de - braun (31g) |
gut: keksfarben (3ec) bis beige (3ge) |
keines |
| Hefeextrakt-Malz extrakt Agar |
gut | dunkelbraun (4pl) bis schokoladen braun (4pn) |
gut: keksfarben (3ec) bis beige (3ge) |
e i ehe n- braunfarben (4pi) |
| Bennett1s Agar | gut | schokoladen braun (4pn) bis dunkel braun (4pl) |
gut: keksfarben (3ec) bis beige (3ge) |
eichen- braunfarben (4pi) |
| Emarson's Agar | mäßig | eichenbraun- farben (4pi) |
gering: austernweiß (b) |
e i ehe n- braunfarben (4pi) |
| Nutrient Agar | gering | zimtfarbeη (3Ie) | einige: weiß (a) |
zimtfarben (3Ie) |
CO CO CD
Das erfindungsgemäße Enzym, die (H3O3 bildende) L-Glutaminsäure
-Oxidase. ist ein Enzym, das eine Reaktion katalysiert, bei der ein Mol oL -Ketoglutarsäure , ein Mol Ammoniak und
ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol L-Glutaminsäure , einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden.
Die erfindungsgemäße Verwendung des Enzyms führte zu einer
neuen Methode zur Auffindung und/oder quantitativen Erfassung von L-Glutaminsäure in einer L-Glutaminsäure enthaltenden
Materialprobe. Zu diesem Zweck wird erfindungsgemäß eine flüssige Materialprobe, die L-Glutaminsäure enthält,
bzw. darauf analysiert werden soll, mit der erfindungsgemäßen (H3O bildenden) L-Glutaminsäure-Oxidase in
Kontakt gebracht, und es wird in diesem enzymatischen Reaktionssystem
die der Umsetzung des L-Glutamats entsprechende Menge an verbrauchtem Sauerstoff und/oder gebildetem Wasserstoffperoxid,
Ammoniak und/oder ct-Ketoglutarat quantitativ
gemessen.
Das erfindungsgemäße (H»O_ bildende) Enzym L-Glutaminsäure-Oxidase
weist zumindest die folgenden biochemischen Eigenschaften auf:
Substrat-Spezifizität: L-Glutaminsäure
Enzymwirkung: Es wird eine Reaktion katalysiert,
bei der ein Mol Glutaminsäure, ein Mol Sauerstoff und ein Mol Wasser
zu einem Mol ot-Ketoglutarsäure ,
einem Mol Ammoniak und einem Mol Wasserstoffperoxid umgesetzt werden, gemäß der nachstehenden
Forme 1 (I) COOH COOH
+ O2 ■» H2O -» CH2 + Nh3 + H2O2
2 c=o
1 1 ClJ
COOH COOH
_ YG-
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen
(H3O3 bildenden) L-Glutaminsäure-Oxidase ist dadurch
gekennzeichnet, daß man einen (H3O3 bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase
produzierenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces in einem Nährmedium züchtet, und die dabei
gewonnene (H3O9 bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase isoliert.
Für die e rf indungsgenüße Verwendung dieses Enzyms in einem
Prüfverfahren auf L-Glutaminsäure wird zweckmäßig so gearbeitet, daß man eine L-Glutaminsäure enthaltende bzw. auf
L-Glutaminsäure zu prüfende flüssige Materialprobe mit erfindungsgemäßer
(H2°2 frilclender) L-Glutaminsäure-Oxidase,
die substratspezifisch auf L-Glutaminsäure wirkt, in Kontakt
bringt. Dadurch wird eine Reaktion katalysiert, bei der ein Mol cL -Ketoglutarsäure , ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid
aus einem Mol L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden. Man bestimmt
dabei quantitativ die verbrauchte Menge an Sauerstoff und/ oder die gebildete Menge an οι -Ketoglutarsäure, Ammoniak
und/oder Wasserstoffperoxid.
Die erfindungsgemäße (H3O bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase.
(die nachfolgend als L-Glutaminsäure-Oxidase (H_O_) bezeichnet
wird) läßt sich ausreichend charakterisieren als ein
Enzym, das die zuvor beschriebenen Eigenschaf tender Substrat-Spezifizität
und der enzymatischen Wirkung aufweist, und jegliche Enzyme, die diese gleichen Charakteristiken haben, sind
naturgemäß solche erfindungsgemäßen Enzyme, auch wenn sie unterschiedliche isoelektrische Punkte, Km-Werte, pH-Optima,
Hitzebeständigkeits- und pH-Stabilitätswerte haben und durch
Zusätze inhibiert oder aktiviert werden.
Die zuvor im einzelnen beschriebenen Mikroorganismen sind lediglich Beispiele für die erfindungsgamäße L-Glutamin-
- yoT-
säure-Oxidase (II_O ) produzierende Mikroorganismen. Es
können zu diesem Zweck beliebige zur Gattung Streptomyces gehörende L-Glutaminsäure-Oxidase (H3O ) produzierende
Mikroorganismen verwendet werden. Generell treten leicht Mutationen bei Mikroorganismenarten auf, entweder von
Natur aus oder gezielt durch künstliche Züchtung, und solche Mutanten, die L-Glutaminsäure-Oxidase (H^O_) produzierende
Aktivität aufweisen, können für das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls eingesetzt werden. Dies gilt
auch für Arten, die durch rekombinante DNA-Technologie für eine solche Enzym-Produktion verbessert worden sind.
Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung von L-Glutaminsäure-Oxidase (H3O2) aus
solchen dieses Enzym produzierenden Mikroorganismen der
Gattung Streptomyces ist die folgende.
L-Glutaminsäure-Oxidase (H3O3) produzierende Mikroorganismen
der Gattung Streptomyces v/erden in üblicher Weise in einem für Antibiotika-oder Enzymproduktion gebräuchlichen
Nährmedium gezüchtet. Man kann feste oder flüssige Kulturen einsetzen, dabei ist für die Gewinnung des Enzyms im industriellen
Maßstab das Submersverfahren besonders zweckmässig.
Die Nährstoff quellen für die Mikroorganismen sind die üblichen
Madien für Mikroorganismen-Züchtung. Als Stickstoffquallen können Quallen für assimilierbaren Stickstoff, beispielsweise
Getreideweichwasser, Sojabohnenpulver, Pepton,
verschiedene Fleischextrakte, Hefeextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid oder Aminosäuren, wie beispielsweise L-GIutaminsäure,
benutzt werden. Als Kohlenstoff quellen können Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, wie beispielsweise
Saccharose, Glucose, Fructose, Melassen, Malzextrakt oder Stärkehydrolysat eingesetzt werden. Zweckmäßig kann'es wei-
terhin sein, verschiedene anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat
oder Kaliumdihydrogenphosphat, sowie die Schaumbildung
verhindernde Mittel mit zu benutzen.
Die Züchtungstemperaturen können verschieden sein, je nach
dem, wie sie für die Produktion der L-Glutaminsäure-Oxidase
(H„O_) und das Mikroorganismenwachstum erforderlich sind;
sie liegen üblicherweise zwischen 20 und 35 C, vorzugsweise bei etwa 26°C.
Die Züchtungsdauer ist je nach den Arbeitsbedingungen unterschiedlich
und beträgt üblicherweise 50 bis 120 Stunden. Das Züchtungsverfahren sollte möglichst dann beendet werden,
wenn das Maximum an Enzymproduktion erreicht ist.
Die erfindungsgemäße L-Glutaminsäure-Oxidase (H„0_) ist ein
Endo-Enzym und ist in den Zellen eingeschlossen.
Die erfindungsgemäße L-Glutaminsäure-Oxidase (H_0 ) läßt
sich isolieren in der Weise , daß man die bei der Züchtung gebildeten Zellen von der Brühe abtrennt, den feuchten Zellkuchen
in einer Pufferlösung, wie beispielsweise Phosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer oder Dimsthylglutarat-NaOH-Puffer
suspendiert, dann einer Behandlung mit einer französischen Presse, Ultraschallbehandlung, Zerkleinerungsbehandlung in
einer Mahlmühle oder Lysozym-Bahandlung unterwirft und so eine rohe Lösung von L-Glutaminsäure-Oxidase (H2O-) erhält.
Diese Lösung wird in für Proteine und Enzyme bekannter Weise weiter gereinigt, und es wird daraus mit für diesen Zweck
bekannten Methoden die gereinigte L-Glutaminsäure-Oxidase (H0O.,) gewonnen.
Beispielsweise kann man die Enzymlösung einer Ausfällung
mit organischem Lösungsmittel unterwerfen in der Weise, daß man organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise
Aceton, Methanol, Ethanol oder Isopropanol, zusetzt, oder man kann durch Zugabe von Ammoniumsulfat aussalzen; man
kann chromatographisch unter Verwendung von Ionenaustauscher, wie beispielsweise Diethylaminoethylcellulose oder
Diethylaminoethyl-Sepharose reinigen, oder auch für diesen Zweck die Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung
von Dextran-Gel oder Polyacrylamid-Gel einsetzen.
Gereinigtes pulverförmiges Enzym kann man durch Kombination
von zuvor angegebenen Arbeitsweisen und zum Schluß Lyophilisierung
der Enzymlösung gewinnen.
Prüfmethode und biochemische Merkmale der erfindungsgemäßen L-Glutaminsäure-Oxidase (H O) sind folgende:
(1) Prüfmethode:
0,3 % 4-Aminoantipyrin Peroxidase (50 U/ml)
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,0) 0,2 % N,N-Dimethyl-m-toluidin
0,2 M L-Gl ut ami η sä ure (pH'7,O)
Destilliertes Wasser
insgesamt 3,0 ml
Dieses Gemisch (3,0 ml) wurde in eine Quarzzelle bei 37 C
eingefüllt, unmittelbar danach wurde die Enzymlösung (50 ,ul) zugegeben und eingemischt, es wurdebei der konstanten
Temperatur (37 C) in einen Zellenhalter eines Spektrophotometers eingesetzt, dann wurde, nachdem 2 Minuten
lang mit der Enzymlösung vermischt worden war, exakt
5 Minuten lang bebrütet, und die Absorptions-Änderung (optische Dichte /\ A».^) bei 545 nm wurde gemessen.
| 0,3 | ml |
| 0,1 | ml |
| 0,6 | ml |
| 0,3 | ml |
| ) 1,5 | ml |
| 0,2 | ml |
Die Enzym-Aktivität wurde aus der nachstehenden Gleichung
berechnet.
L-Glutaminsäure-Oxidase (H„O_) - Aktivität ( Einheit/ml)
* (ö/ml)
~~ - AA5t<5 ν 1 v 3.05 „ „ ...
~ „ Y 1 " X ~5~ X X Verdünnung
" x 2
(2) Substrat-Spezifizität:
Die relativen Aktivitäten (%) des mittels Streptomyces sp. A77OO produzierten Enzyms L-Glutaminsäure-Oxidase (H2O
(nachstehend als A77OO Enzym bezeichnet) und des mittels Streptomyces sp . A8O63 produzierten Enzyms L-Glutäminsäure
Oxidase (H„O?) (nachstehend als A8O63 Enzym bezeichnet)
wurden auf verschiedenen Substraten im Vergleich mit L-Glutamlnsäure gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 veranschaulicht. Beide Enzyme haben spezifische Aktivität gegenüber L-Glutaminsäure
und keinerlei Aktivität gegenüber den anderen in der Tabelle veranschaulichten Aminosäuren.
(3) Enzymwirkung:
Als Substrat wurde L-Glutamins:iure (0,5 ,umol) verwendet.
Es wurden die Menge an verbrauchtem Sauerstoff und die Mengen an gebildeter d*. -Ketoglutarsäure , gebildetem
Ammoniak und gebildetem Wasserstoffperoxid gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tab-elle 4 veranschaulicht.
| Substrat | Λ77ΟΟ Enzym | Λ8Ο6 3 Enzym |
| L-Glutaminsäure | 100 | 100 |
| L-Tyrosin | 0 | 0 |
| L-Methionin | 0 | 0 |
| L-Phenylalanin | 0 | 0 |
| L-Arginin | O | 0 |
| L-Lysin | 0 | 0 |
| L-Histidin | 0 | 0 |
| L-Alanin | 0 | 0 |
| L- Isoleucin | 0 | 0 |
| L-Valin | 0 | 0 |
| L-Threonin | 0 | 0 |
| L-Sarin | O | 0 |
| D-Glutaminsäure | 0 | O |
| Methylamin | O | 0 |
| Ethylamin | 0 | 0 |
| Butylamin | 0 | 0 |
| Propylamin | O | 0 |
| Benzylamin | O | 0 |
| Hydroxylamin | O | 0 |
| Tyramin | 0 | 0 |
Tabelle 4
| A77OO Enzym | A8O6 3 Enzym | |
| zugegeben L-Glutamins'iure ( ,umol) verbrauchter Sauerstoff ( ,umol) gebildete -Ketoglutar säure ( ,umol) gebildetes Ammoniak ( ,umol) gebildetes Wasserstoff peroxid ( ,umol) |
0,50 0,51 0,48 0,48 0,49 |
0,50 0,50 0,49 0,49 0,48 |
Verbrauchter Sauerstoff wurde mittels Sauerstoff-Elektrode
gemessen. Gebildete -"f- -Ketoglutarsäure wurde mit der
2,4-Dinitrophenylhydrazin-Methode (KAGAKU NO RYOIKI, Supl.
33, S. 99 - 104, "Spectrophotometry on biochemistry", in
japanischer Sprache) bestimmt. Ammoniak wurde mittels der
Indophenol-Methode (J. Diol. Chem., 102, 499 (1933)) gemessen.
Wasserstoffperoxid wurde mittels colorimetry scher Prüfmathode mit Peroxidase-4-Aminoantipyrin-Phenol bestimmt,
Beide Enzyme katalysieren eine Reaktion, bei der ein Mol <-"L -Ketoglutarsäure, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid
aus einem Mol L-Glutaminsäure , einem Mol Sauerstoff
und einem Mol Wasser gebildet werden (Reaktion gemäß Formel (I)).
COOH COOH
' CH2
I I
CH2 + °2 + H2O ->
CH2 + NH3 + H2O2 U)
I I
H-C-NH2 C = O.
I . I
COOH COOH
L-Glutaminsäure a-Ketoglutarsäure
(4) Isoelektrischer Punkt:
Die isoelektrischen Punkte von A77OO Enzym und Λ8Ο6 3 Enzym
wurden unter Verwendung von Trägor-Ainpholyt pH 3,5 - 6,0
(LKB Inc.) mittels der isoelektrischen Ausflockungsmethode
bestimmt. Der isoelektrische Punkt des Enzyms A77OO lag
bei etwa pH 4,3 und der isoelektrische Punkt des Enzyms
A8O63 lag bei etwa pH 4,1.
- Zi-
(5) Km-Wert: i
Der Km-Wert der beiden Enzyme gegen L-Glutaminsäure lag
\ -4
für A77OO bei etwa 5,6 χ 10 M und für das Enzym A8O6 3
bei etwa 1,1 χ 10 ^ M.
(6) pH-Optimum:;
Für die Ermittlung |3es pH-Optimums der Enzyme wurden
Glycin-HCl-Puffer (pH 2,5 - 4,5), Dimethylglutarat-NaOH-Puffer
(pH 4 - 7) , £hosphat-Puffer (pH 6 - 8) , Tris-HCl-Puffer
(pH 7 - 9) uiid Glycin-NaOH-Puf fer (pH 9 - 9,5) eingesetzt.
:
Die Ergebnisse sind:für das Enzym Λ77ΟΟ in Fig. 1 und für
das Enzym A8O6 3 in Fig. 2 veranschaulicht.
In Fig. 1 bedeuten:·
r# : Glycin-HCl-Puffer, pC : Dirne thy lglut ar at-NaOII-Puf fer
A : Phosphat-Puffer ■« : Tris-HCl-Puffer und
♦ : Glycin-NaOH-Puffer.
In Fig. 2 bedeuten: ;
ρ : Glycin-HCl-Puffer
pe : Dimethylglutarat-NaOH-Puffer
;Δ : Phosphat-Puffer
0 : Tris-HCl-Puffer und
O : Glycin-NaOH-Puffer.
In den Figuren 1 und 2 sind auf der Abszisse der pH-Wert und auf der Ordinate- die relative Aktivität in % abgetragen.
Man erkennt, daß das pH-Optimum für beide Enzyme bei pH 5 - 7,5 liegt.
(7) Hitze Stabilität:
Die Enzyme A77OO und!A8O63 wurden in 20 mM Phosphat-Puffer
(pH 7,0) gelöst und bei verschiedenen Temperaturen 10 Minuten lang bebrütet. Dann wurde plötzlich in Eiswasser abge-
kühlt, und danach wurde die verbleibende Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 veranschaulicht.
In Fig. 3 bedeuten:
• : die Werte für das Enzym A77OO und
O : die Werte für das Enzym A8O6 3.
: die Temperatur in C und au:
nate die verbleibende Aktivität in % abgetragen. Beide : riert.
Auf der Abszisse ist die Temperatur in C und auf der Ordi-
rität in % abgetragen. Beide Enzyme sind bis zu 55°C stabil und bei 70 C denatu-
(8) pH-Stabilität:
Es wurde die pH-Stabilität der Enzyme in verschiedenen Pufferlösungen gemessen. Die für das Enzym A77OO ermittelten
Werte sind in Fig. 4 und die für das Enzym A8O63 ermittelten
Werte sind in Fig. 5 veranschaulicht.
Die Enzyme wurden in einer Konzentration von 40 mM in jeder Pufferlösung gelöst, 60 Minuten lang bei 37 C bebrütet und
dann sofort abgekühlt, und es wurden die bei dem jeweiligen pH-Wert verbleibanden Aktivitäten gemessen.
Es wurden die folgenden Pufferlösungen für die jeweiligen
pH-Werte verwendet: .
Glycin-HCl-Puffer (pH 2,5 - 4,5)
als 0 in den Fig. 4 und 5 markiert,
Dime thy lglutarat-NaOII-Puf far (pH 4 - 7,5)
als # in den Fig. 4 und 5 markiert,
Phopshat-Puffsr (pH 6-8)
als Δ in den Fig. 4 und 5 markiert,
Tris-HCl-Puffer (pH 7-9)
als A in den Fig. 4 und 5 markiert, und
Glycin-NaOH-Puffer (pH 9 - 9,5)
als Π in dan Fig. 4 und 5 markiert.
Es sind in den Fig. 4 und 5 jeweils auf der Abszisse der pH-Wert und auf der Ordinate die verbleibende Aktivität
in % abge t rage η.
Man erkennt (Fig. 4), daß das Enzym A77OO bei pH 4,5 - 7,5
und (Fig. 5) das Enzym A8O6 3 bei pH 4 - 7,5 stabil ist.
(9) Wirkung von Metallionen:
Die Wirkung von Metallionen ist in Tabelle 5 veranschaulicht, Die Werte zeigen, daß von Cu verschiedene Ionen keine Wirkung
auf die Enzyme haben.
(10) Wirkung von Tensiden und anderen Substanzen:
Die Wirkung verschiedener Substanzen auf die Enzym-Aktivität
ist in Tabelle 6 veranschaulicht. Daraus, daß EDTA keine Wirkung hat, erkennt man, daß es sich bei beiden
Enzymen nicht um Metalloenzyme handelt. Desgleichen werden beide Enzyme nicht durch NaN3 und KCN inhibiert, und
sie werden nicht durch FAD und FMN in ihrer Wirkung beeinträchtigt.
Wie veranschaulicht, haben die Enzyme A77OO und A8O63
substratspezifische Wirkung auf L-Glutaminsäure und katalysieren eine Reaktion, bei der ein Mol (K-Ketoglutarsäure,
ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol
Wasser gebildet werden. Es handelt sich um ein neues Enzym, (H_02 bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase.
Das neue Enzym,L~Glutaminsäure-0xidas3 (H„O_) , läßt sich
zweckmäßig verwenden für die Analyse von flüssigen Materialprob-en,
die L-Glutaminsäure enthalten, und man kann die darin enthaltene Menge an L-Glutaminsäure quantitativ ermitteln,
wenn man die Menge an verbrauchtem Sauerstoff, oder die Menge an gebildeteri\_-Ketoglutarsäure , gebildetem
Ammoniak und/oder gebildetem Wasserstoffperoxid quantitativ
analysiert.
| Metallsalz | Konzentration (mM) |
Relative | Aktivität (%) |
| Kontroll probe |
- | A77OO Enzym | A8O6 3 Enzym |
| MnCl2 | 1/0 | 100 | 100 |
| MgCl2 | 1,0 | 108,6 | 105,7 |
| CaCl2 | 1,0 | 102,5 | 103,4 |
| BaCl2 | 1,0 | 98,8 | 103,0 |
| NiCl2 | 1,0 | 102,5 | 103,7 |
| CoCl2 | 1,0 | 101,8 | 102,3 |
| ZnCl2 | 1,0 | 99,4 | 98,0 |
| CuCl2 | 1,0 | 106,1 | 110,7 |
| FeCl3 | 1,0 | 50,3 | 62,1 |
| 109,2 | 103,0 |
- vr-
Tabelle 6
| Zusatz | Konze ntration | Relative (% |
Aktivität
) |
| Kontroll probe |
A77OO | A8O6 3 | |
| EDTA | 10 mM | 100 | 100 |
| NaN3 | 10 mM | 93,8 | 100,7 |
| KCN | .10 mM | 101,4 | 102,6 |
| PCMB | 0,002 % | 103,5 | 102,9 |
| FAD | 0,01 mM | 107,6 | 98,2 |
| FMN | 0,01 mM | 100,7 | 100,7 |
| Brij 35 | 0,5 % | 88,9 | 97,1 |
| LBS | 0,1 % | 65,3 | 86,9 |
| SDS | 0,1 % | 131,9 | 110,2 |
| Natrium- cholat |
0#l % | 106,3 | 93,1 |
| Cation FB | 0,5 % | 104,2 | 100,0 |
| CTACl | 0,1 % | 104,2 | 101,8 |
| 98,6 | 94,2 |
Bei einer mit dieser erfindungsgemäßen Methode zu prüfenden flüssigen Materialprobe kann es sich um eine flüssige
Probe handeln, die L-Glutaminsäure enthält. Solche L-Glutaminsäure als Reagens enthaltende Materialproben sind beispielsweise
L-Glutaminsäure aufweisende Fermentationsflüssigkeit,
L-Glutaminsäure enthaltende Getränke sowie Materialproben für die Prüfung der Enzymaktivität oder die Bestimmung
des Substrats in einem enzymatischen Reaktionssystem,
in dem L-Glutaminsäure gebildet oder entwickelt wird, oder einem System, in dem L-Glutaminsäure als Substrat verbraucht
wird.
Beispiele für solche enzy-matischen Reaktionssysteme werden
nachfolgend gegeben; darin bedeuten:
:< -KG öü-Ketoglutarsäure und
L-GA L-Glutaminsäure.
* Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT):
GPT L-Alanin + d-KG * Pyruvat + L-GA
* Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT):
GOT
L-Asparaginsäure + d -KG > Oxalessigsäure + L-GA
L-Asparaginsäure + d -KG > Oxalessigsäure + L-GA
* Cystein-Aminotransferase (CATase):
/-»τι m-3 «ο
L-Cystein + ^-KG ^ ß-Mereaptobrenztraubensäure
+ L-GA
* Tyrosin-Aminotransferase (TATase):
L-Tyrosin + ^-KG ^=—r* p-Hydroxyphenylbrenztrauben-
sä ure + L-GA
* Leucin-Aminotransferase (LATase) :
L-Leucin +(i-KG :—^=—f- 2-Oxoisocaprinsäure + L-GA
* Ky nurenin-Ami no transferase (KATase) :
L-Kynurenin + d- -KG ? o-Aminobenzoy!brenztraubensäure
+ L-GA
* Aminobutylat-Aminotransferase (AATase):
4-Ami nob utter sä ure + A-KG Bernsteinsäuresemi-
aldehyd + L-GA
* ^-Glutamyl-Transpoptidase ( r'-GPT) :
L-Glutamyl-X + L-GA Glycylglycyl-X + L-GA
(X: Transfer-Gruppe, wie beispielsweise Glutamylaminosäure)
-39-
* Glutamat-Racemase (GRase):
D-Glutaminsäure * L-GA.
Diese Enzym-Reaktionssysteine sind lediglich Beispiele für
die Anwendung und den Einsatz der erfindungsgemäßen Enzyme
für eine solche Prüfmethode.
Weiterhin kann man damit die Enzym-Aktivität oder die Menge des Substrats prüfen bzw. quantitativ ermitteln in der Weise
, daß man die Mange an gebildeter bzw. freigesetzter L-Glutaminsäure bestimmt, beispielsweise für folgende Vorgänge
:
* Aminosäure-Acatyltransferase (AAATase) :
Acetyl-CoA + L-GA CoASH + N-Acetyl-L-GA
* Glycin-Aminotransferase (GLATase):
Glyoxalsäuro + L-GA ■ Glycin + oO-KG
* Glutamat-Dacarboxyläse (GDase):
L-GA — 4-Aminobuttersäure + CO2
* j^-Glutamylcystein-Synthetasö ( y-GLCSase) :
ATP + L-GA + L-Cystein ^ -Glutamyl-L-cystein
' + ADP + Pi.
Die zuvor veranschaulichten Enzymreaktionssy-steme sind
nur Beispiele für Systeme, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen
Enzyms untersucht werden können. Bei den dab-ei erfolgenden enzymatischen Reaktionen wird Glutaminsäure
als Substrat verbraucht, und dieser Verbrauch kann zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität quantitativ ermittelt
werden.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung des neuen Enzyms für diese Analysenmethode bringt man die L-Glutaminsäure-Oxidase
(H2O ) mit der L-Glutaminsäure enthaltenden flüssigen Materialprobe
zur Reaktion. Man kann dabei die L-Glutaminsäure-Oxidase
(H2O2) in verschiedenen Formen einsetzen, beispielsweise
als
Enzymlösung, gelöst in einer Pufferlösung, deren pH-Wert der pH-Stabilität des Enzyms entspricht,
mikroverkapseIt in einer solchen Weise, daß das
Enzym vor Denaturierung geschützt ist, oder
in immobilisierter Form, beispielsweise kovalent an Harz, Polysaccharid oder anorganischem Glas
gebunden.
Die Menge an L-Glutamins!ure-Oxidase (H3O2) kann je nach
der Stenge an flüssiger Materialprobe und Reaktionszeit
unterschiedlich gewählt werden; sie liegt vorzugsweise
bei 2-10 Einheiten. Es ist wünschenswert, das Enzym mit möglichst hoher spezifischer Aktivität zu verwenden, jedoch
ist es nicht in jedem Fall erforderlich, das Enzym in höchster Reinheit einzusetzen.
Mengenmäßig ist für die L-Glutaminsäure enthaltende flüssige
Materialprobe keine Grenze gesetzt; die Probe wird in zweckmäßiger Weise hergestellt, verdünnt oder unverdünnt
verwendet.
Bei diesem Analysenverfahren unterwirft man die L-Glutaminsäure-Oxidase
(H0O-) der Reaktion mit der flüssigen Materialprobe . Dazu bebrütet man das Reaktionsgemisch bei konstanter
Temperatur während einer bestimmten Zeit, beispielsweise
5 bis 20 Minuten lang bei 37°C, so daß je Mol L-Glutaminsäure ein Mol Sauerstoff verbraucht und ein Mold-Ketoglutarsäure,
ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid gebildet we r de η.
Dieser Sauerstoff sowie die (A.-Ketoglutarsäure , das Ammoniak
b-zw. das Wasserstoffperoxid lassen sich quantitativ bestimmen. Den Sauerstoff bestimmt man vorteilhafterweise
elektrisch mittels einer Sauerstoff-Elektrode. Die <k-Ketoglutarsäure
wird zweckmäßig colorimetrisch mittels der
Hydrazin-Methode mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin (Absorption
bei 415 nm oder 530 nm) bestimmt. Der Ammoniak läßt sich
elektrisch an einer Ammoniak-Elektrode oder an einer Ionen-Elektrode, nachdem das Ammoniak-Ion gebildet wurde, oder
mittels der Indophenol-Methode bestimmen. Wasserstoffperoxid läßt sich messen an einer Wasserstoffperoxid-Elektrode
oder mit Hilfe eines Indikators, der mit Wasserstoffperoxid
reagiert, wobei eine bestimmbare Verbindung gebildet wird.
Beispiele für einen solchen Indikator sind ein Farbindikator, der sich sichtbar ändert, ein Fluoreszenz-Indikator, der
unter ultravioletter Bestrahlung Leuchte rs ehe inunge η abgibt,
oder eine Lumineszenz-Verbindung. Beispiele für einen Farbindikator
sind Zusammensetzungen, in denen eine Peroxidaseaktive
Substanz und ein Pigment-Precursor enthalten sind. Dafür wird vorzugsweise mit Maerrettich-Peroxidase und die
Kombination von Elektron-Akzeptor, Phenol-Derivat und Anilin-Derivat
eingesetzt. Beispiele für Elektron-Akzeptoren sind 4-Aminoantipyrin, 4-Amino-3-hydrazino-5-marcapto-l,2,4-triazol
2-Hydrazinobenzothiazol, 3-Methyl-2-benzothiazolonhydrazon und 2-Aminobanzothiazol. Beispiele für Phenol-Derivate oder
Anilin-Derivate sind Phenol, Natrium-p-hydroxybenzoesäure, p-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, 4,6-Dichlor-o-cresol,
2,4-Dibromphenol, Ν,Ν-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin,
Ν,Ν-Dimethyl-m-toluidin, Ν,Ν-Diethyl-m-toluidin, N,N-Dimethy1-m-methoxytoluidin,
N,N-Diethanol-m-toluidin, 3-Methyl-N-ethyl-N-hydroxyethylanilin,
N-Ethyl-N-(3-methylphenyl)-N-acetylathylendiamin,
Natrium-N-ethyl-N-hydroxyethyl-m-toluidin,
N-Ethyl-N-sülfopropyl-m-toluidin, Natrium-N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)
-m-toluidin oder m-Acetoamino-N^-diethylanilin.
Farbstoff-Komplexverbindungen von 4-Aminoantipyrin
und einem Phenol-Derivat geben Meßwarte bei 500 - 5 20 nm, und Komplexverbindungen von 4-Aminoantipyrin
und einem Anilin-Derivat geben Maßwerte bei 5 35 - 5 80 nm.
Beispiele für in der Fluorometrie und der Luminomatrie
verwertbare Fluoreszenz-Substrate sind Bis (2 ,4 ,6-trichlorphenoDoxalat,
Pheny!thiohydantoin, Homovanillinsäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure, Vanillylamin, 3-Methoxythirarain,
Phloretin, Hordenin, Luminolmonoanion, Lucigenin oder Waffin.
Diese Substanzen können besonders zweckmäßig zusammen mit
einem Elektronen-Akzeptor und einer Peroxidasa-aktiven Substanz
zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid verwendet werden. Für ein Indikator-Reagens, bei dem die zu ermittelnde
Substanz durch Reaktion mit WaserStoffperoxid umgewandelt wird, verwendet man die Peroxidase in einer Menge von beispielweise
mehr als 0,1 Einheiten je Test, zweckmäßig mit 1 bis 10 Einheiten.
Da der Elektronen-Akzeptor, beispielsweise das 4-Aminoantipyrin
oder die Phenol-Derivate oder die Anil in-Derivate
reagieren und je zwei Mol Wasserstoffperoxid ein Mol dieser dieser Substanzen verbru&cht wird, sollte man sie im Überschuß
gegenüb-er der zu entwickelnden Wasserstoffparoxidmenge
einsetzen, wobei vorteilhaft ein fünfmolarer Überschuß, bezogen auf die Menge an Wasserstoffperoxid, verwendet
wird.
Diese Reagentien werden zweckmäßig miteinander vermischt und zu einer Lösung verarbeitet, oder man mischt sie in eine
Lösung von L-Glutaminsäure-Oxidase (HO) ein, oder man
fertigt daraus ein festphasiges Mischprodukt, zum Beispiel als Schicht auf einer Folie aus synthetischem Harz oder auf
Filterpapier. Man kann weiterhin für die elektrische Bestimmung vorteilhaft eine Enzym-Elektrode einsetzen, die an der
immobilisierten L-Glutaminsäure-Oxidase (H9O-) befestigt ist.
Die Menge an L-Glutaminsäure in einer Materialprobe kann
anhand einer Eichkurve für die in dieser Weise quantitativ ermittelte Menge an Sauerstoff,^-Ketoglutarsäure, Ammoniak
bzw. Wasserstoffperoxid zahlenmäßig festgestellt werden.
Mit den folgenden Beispielen, die jedoch nicht die vorliegende Erfindung begrenzend auszulegen sind, wird diese
noch näher erläutert.
Beispiel 1
Ein Medium (100 ml, pH 7,0) mit 0,5% Pepton, 0,3% Fleischextrakt,
0,1% Hefeextrakt und 0,5% Malzextrakt wurde in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben 20 Minuten lang bei 120 C
sterilisiert. Es wurde mit einer vier Tage alten Kultur von Streptomyces sp. Λ77ΟΟ FERM P-6241 beimpft, und dann
wurde 4 Tage lang bei 26 C bebrütet. Die durch Abzentrifugieren erhaltene Zellkultur wurde in einem Mörser mit
Quarzsand zerkleinert. Durch Zugabe von 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7,0) wurde das Enzym extrahiert, und der Extrakt
wurde gesammelt. Es wurde berechnet, daß in der Kulturbrühe 0,13 u/ml an L-Glutaminsäure-Oxidase (H20_) vorhanden
waren.
Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle von Streptomyces sp. A77OO FERM P-6241 der
Mikroorganismus Streptomyces sp. A8O63 FERM P-6242 verwendet.
Es wurde berechnet, daß in der Kulturbrühe 0,59 u/ml an L-Glutaminsäure-Oxidase (H3O^) vorhanden waren.
Beispiel 3
Es wurden zwei 500 ml Erlenmey-er-Kolben, in denen je 100 ml
eines Mediums mit 0,5% Pepton, 0,3% Fleischextrakt, 0,1%
- 3H-
Ilefeextrakt und 0,5% Malzextrakt enthalten waren, 20 Minuten
lang bei 12O°C sterilisiert. Dieses Medium wurde mit Streptomyces
sp. A8O63 FERM P-6242 beimpft, und es wurde 3 Tage
lang bei 26°C gezüchtet.
Mit diesen Anzucht-Kulturen (200 ml) wurde ein Medium (20 Lit., pH 7,0) mit 0,5% Pep ton, 0,3% Fleischextrakt, 0,1% He feextrakt
und 0,5% Malzextrakt, das sich in einem 30 Liter Fermenter befand, und das zuvor 20 Minuten lang bei 120 C
sterilisiert worden war, beimpft, und dann wurde unter Belüftung mit 20 l/Min, und Rühren mit 300 UpM 96 Stunden
lang bei 26 C gezüchtet. Die Kulturbrühe wurde 5 Minuten
lang mit 5000 UpM zentrifugiert, und so wurden die gezüchteten Zellen erhalten. Die Zellen wurden in 20 mM Phosphat-Puffer
(3 Lit., pH 7,0) suspendiert und mit einem "Dyno-Mill"
genannten Gerät (Handelsbezeichnung, Dyno-Mill, Willy A.
Bachofen Manufact. Engineers, Schweiz) vermählen. Die zermahlenen
Zellen wurden 15 Minuten lang mit 5000 UpM zentrifugiert, und es wurden 2,82 Liter (11200 Einheiten) an
überstehender Lösung erhalten.
Zu der übersäenden Lösung wurde Ammoniumsulfat zugegeben,
und es wurden diejenigen Fraktionen gesammelt, die bei 0,4 - 0,5 3 Sättigung ausfielen. Der Niederschlag wurde in
20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und in ein Celluphan-Tubus
eingegeben und 20 Minuten lang gegen 20 mM Phosphatpuffer
(pH 7,0, 12 Lit.) dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Säule ( 50 χ 400 m/m) , die aus DEAE-Sephaross CL-6B
bestand, aufgegeben, und es wurde mit einem linearen Gradienten von 0 - 0,7 M KCl in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0)
eluiert. Die mit 0,5 M KCl eluierten Fraktionen (130 ml, 6690 Einheiten) wurden mittels Cellophan-Tubus 18 Stunden
lang gegen 6 Lit. 20 mM Phosphatpuffer dialysiert. Das Dialysat wurde im Vakuum konzentriert (auf 15 ml). Das Kon-
zentrat wurde auf eine aus Sepharose CL-6B bestehende Säule
aufgegeben und mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert,
und es wurde das Eluat (80 ml, 5900 Einheiten) erhalten.
Dieses Eluat wurde durch Ultrafiltration auf 8 ml konzentriert
und erneut auf eine aus Sepharose CL-6B bestehende Säule aufgegeben. Dann wurde mit der gleichen, wie zuvor
beschriebenen Pufferlösung eluiert, und es wurde das Eluat (60 ml, 4 890 Einheiten) gewonnen. Dieses Eluat wurde
lyophilisiert, und man erhielt L-Glutaminsäure-Oxidase (H3O2)
(78,9 mg, 58,2 U/mg, 4595 Einheiten) .
Beispiel 4
Ein Medium (pH 7,0, 20 Lit.) mit 0,5% Pepton, 0,3% Fleischextrakt,
0,1% Hefeextrakt und 0,5% Malzextrakt wurde in einem 30 Lit. Rütte 1 fermenter eingefüllt und 20 Minuten lang
b-ei 120°C steriliäart. Dieses Medium wurde mit einer 3 Tage lang bebrüteten Impfkultur (200 ml) von Streptomyces sp.
A77OO FERM P-6241 beimpft, und dann wurde 96 Stunden lang
unter aseptischer Belüftung mit 20 Lit./Min. und Rühren mit 300 UpM submers gezüchtet. Die Kulturbrühe wurde durch 5 Minuten
langes Zentrifugieren mit 5000 UpM abgetrennt, und die
dabei gewonnenen Zellen wurden in 20 mM Phosphatpuffer (pH
7,0, 3 Lit.) suspendiert. Danach wurde mit Hilfe des Dyno-Mill
Gerätes der Zellkuchen zerkleinert. Die zerkleinerten Zellen wurden 15 Minuten lang mit 5000 UpM zentrifugiert, und es
wurde die überstehende Lösung (2,84 Lit., 2950 Einheiten) gewonnen. Dazu wurde Ammoniumsulfat gegeben, und der bei
0,47 - 0,61 Sättigung entstandene Niederschlag wurde gesammelt. Die Ausfällung wurde in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0)
gelöst und in dem Cellophan-Tubus 20 Stunden lang gegen 20 mM
Phosphatpuffer (pH 7,0) dialy-siert. Das Dialysat wurde auf
eine aus DEAE-Sepharose CL-6B bestehende Säule aufgegeben
und durch lineare Gradient-Eluierung mit 0 -0,7 M KCl in
20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Das Eluat bei etwa
0,5 M KCl wurde gesammelt, durch Celluphan-Tubus 18 Stunden
lang gegen 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und konzentriert.
Erneut wurde das Dialysat auf eine aus Sepharose CL-6B bestehende Säule aufgegeben, und das Eluat wurde konzentriert.
Die Reinigung durch Chromatographie an der Sepharose CL-6B - Säule wurde wiederholt, und dann wurde das Eluat
lyophilisiert. Dabei wurde L-Glutaminsäure-Oxidase (H-O ) als
Pulver erhalten (22,0 mg, 49,5 Einheiten/mg, 1080 Einheiten),
Beispiel 5
(Quantitative Bestimmung von L-Glutaminsäure): 40 mM Phosphatpuffer (pH 6,5)
0,03% 4-Aminoantipyrin 0,04% Ν,Ν-Dimethyl-m-toluidin
2 u/ml Peroxidase
2 u/ml L-Glutaminsäure-Oxidase {IIJDA
Dieses zuvor angegebene Reaktionsgemisch (3,0 ml) wurde vermischt mit zu 1/1, bzw. 3/4, bzw. 1/2, bzw. 1/4,bzw. 1/5, bzw
1/10 verdünnter l0 mM L-Glutaminsäure-Lösung (50 ,ul) , und
dann wurde 10 Minuten lang bei 37 C bebrütet. Nach dem Bebrüten wurde das Reaktionsgemisch bei 5 45 nm co Io rime tr i sch
gep rü ft.
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 veranschaulicht. Darin ist auf
der Abszisse die Verdünnung und auf der Ordinate die optische Dichte bsi 5 45 nm abgetragen. Die Markierungen ο beziehen
sich auf die L-Glutaminsäure-Oxidasa (HO) , die gemäß Beispiel
3 erhalten worden war, und die Markierungen. Δ geben die gefundenen Werte für die L-Glutamins'äure-Oxidase (H-O.) ,
die gemäß Beispiel 4 erhalten worden war.
Wie ersichtlich, sind die Ergebnisse für beide Enzyme die gleichen, und es wurde eine gute Linearität zwischen der
Menge an L-Glutaminsaure und dem Ausmaß der Absorption erzielt.
Die folgenden Beispiele wurden unter Verwendung der gemäß Beispiel 3 erhaltenen L-Glutaminsäure-Oxidase (HJD2) durch
ge führt.
Be i sp ie I 6
(Prüfung auf Serum GPT):
Ν,Μ-Diethyl-mtoluidin 3.mM
4-Aminoantipyrin 1/5 mM
Peroxidase 5 Einheiten/ml
L-ΛΙaniη 200 mM
ei. -Ketoglutarsäure 10 mM
Tris-HCl-Puffer (ptl 7,5) 50 mM
L-Glutaminsäure-Oxidase (H2O-) 6 Einheiten/ml
Das zuvor beschriebene Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in
schmale Tc st röhr ehe η eingefüllt und bei 37 C vorbebrütet.
Serum (50 ,ul, in einer Verdünnung von 1/1 bzw. 3/4 bzw.
1/2 bzw. 1/4 bzw. 1/10) wurde zugegeben, und es wurde genau
20 Minuten lang bei 37°C bebrütet. 0,1 M Mcllvain-Puffer
(pH 5,5, 2,0 ml) wurde dazu gegeben, und es wurde colorimetrisch gemessen und die Vierte bei 5 45 nm aufgezeichnet. Als
Kontrollprobe wurde ein Gemisch untersucht, das aus den oben aufgeführten Reaktionsbestandteilen mit Ausnahme von L-Alanin
bestand. Die Ergabnisse sind in Fig. 7 veranschaulicht.
Es ist auf der Abszisse die Verdünnung und auf der Ordinate die optische Dichte bei 545 nm abgetragen. In dieser grafischen
Darstellung läßt sich Serum GPT exakt prüfen.
Beispiel 7
(Prüfung auf Serum GOT):
N,N-Diethyl-m-toluidin 3 mM
4-Aminoantipyrin 1,5 mM
Peroxidase 5 u/ml
L-Asparayinsu ure 200 mM
d. -Ketoglutarsäure 10 mM
Trls-IICl-Puffer (pH 7,5) 50 mM
L-Glutaminsäure-Oxidase (H_02) 6 u/ml
Das aus den zuvor aufgeführten Bestandteilen zusammengesetzte
Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in schmale Teströhrchen eingefüllt
und bei 37 C vorbebrütet. Dazu wurde Serum (in Verdünnungen von 1/1 bzw. 3/4 bzw. 1/2 bzw. 1/4 bzw. 1/10)
(50 ,ul) gegeben, und es wurde genau 20 Minuten lang bei
37°C bebrütet. Dann wurde 0,1 M Mcllvain-Puffer (pH 5,5,
2,0 ml) hinzugefügt und es wurden colorimetrisch die Werte
b-ei 545 nm gemessen. Als Kontrollprobe wurde ein wie oben beschrieben, jedoch ohne L-Asparaginsäure zusammengesetztes
Reaktionsgamisch verwendet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 8 veranschaulicht. Darin ist auf der Abszisse die Verdünnung und auf der Ordinate die optische
Dichte bei 5 45 nm abgetragen. Diese grafische Darstellung ermöglicht es, Serum GOT exakt zu untersuchen.
Beispiel 8
(Serum GPT - Prüfung):
(Reagens I)
N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin 3 mM
Peroxidase 5 u/ml
L-Alanin 200 mM
^-Ketoglutarsäure 10 mM
Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) 50 mM
L-Glutaminsäure-Oxidase (HjO^) 5 u/ml
Ascorbinslure-Oxidase 5 u/ml
(Reagens II)
4-Aminoantipyrin 15 mM
Reagens I (1 ml) wurde in eine Quarzzelle eingefüllt.
Dazu wurde Serum ( 50 ,ul) gegeben, und es wurde 5 Minu-
ten lang bei 37 C bebrütet. Dann wurde Reagens II (0,1 ml) ,
das bei 37 C vorbebrütet worden war, hinzugefügt, und es wurde über verschiedene Zeiten bei 37 C bebrütet und anschließend
colorimetrisch bei 5 45 nm der jeweilige Meßwert ermittelt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 9 veranschaulicht. Darin ist
auf der Abszisse die Reaktionszeit und auf der Ordinate
die optische Dichte bei 5 45 nm abgetragen. Man erkennt, daß keine Zeitverzögerung bei dem Serum GPT - Versuch gefunden
wurde, und daß eine gut lineare Eichkurve, die durch den Nullpunkt geht, erhalten wurde.
Bei dieser Prüfungsmethode sind bei der ersten Reaktionsstufe die nicht-spezifische Reaktion und die Verzögerungszeit getilgt, und demzufolge ist keine Kontrollprüfung erforderlich.
Be i so ie I 9
(Serum GOT - Prüfung)
(Reagens I)
(Reagens I)
N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin · 3 mM
Peroxidase 5 u/ml
L-Asparaginsäure 200 mM
^-Ketoglutarsäure 10 mM
Tris-HCl-Puffar (pH 7,5) 50 mM
L-Glutaminsäure-Oxidase (H2O3) 5 u/ml
Ascorbinsäure-Oxidase 5 u/ml
(Reagens II)
4-Aminoantipyrin 15 mM
Reagens I (1,0 ml) wurde in eine Quarzzelle eingefüllt
und dazu wurde das Serum (50 ,ul) gegeben, und dann wurde
5 Minuten lang bei 37 C bebrütet. Zu dem Reaktionsgemisch
wurde das Reagens II (0,1 ml) , das bei 37 C vorbebrütet worden war, hinzugefügt, und es wurde über unterschiedliche
Zeiten bei 37°C bebrütet und dann colorimetrisch bei
5 45 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 veranschaulicht.
Es ist darin auf dar Abszisse die Reaktionszeit und auf der Ordinate die optische Dichte bei 5 45 nm
abgetragen. Wie man erkennt, liegen die Prüfwerte für GOP auf einer gut linearen Eichkurve, die durch den Nullpunkt
geht.
Be i sp le I 10
Es wurden die in Beispiel 8 beschriebenen Rsagentien I und II verwendet, und es wurde wie dort beschrieben gearbeitet,
jedoch wurden als Serumproben 40 Serum-Portionen (je 50 ,ul)
zur Prüfung auf Serum GPT - Aktivität verwendet.
Weiterhin wurden die gleichen Serum-Portionen mittels der bisher bekannten Methode (UV-Methode, Wako Pure Chem. Co.,
Prüfungs-Set GPT-UV WAKO) geprüft.
Die aus den Ergebnissen berechnete Korrelation beider Methode war die folgende:
γ- = 0,998
y = l,03x + 1,6,
es wurde also eine gute Korrelation erhalten. Eine Korrelationskurve
ist in Fig. 11 veranschaulicht. Auf der Abszisse sind die Werte nach der UV-Methode in IU/1 und auf der
Ordinate die nach der erfindungsgemäßen Methode gewonnenen Werte in IU/1 abgetragen.
Beispiel 11
Die Serum GOT - Aktivität wurde wie in Beispiel 9 beschrieben geprüft, jedoch wurden 40 Serum-Portionen (je 50 ,ul)
als Prob-en verwendet.
Die gleichen Serum-Probeportionen wurden mittels bekannter
GOT-P ruf methode (UV-Methode, Wako Pure Chem. Co., Set GOT-UV
WAKO) untersucht.
Die Korrelation beider Resultate betrugt:
γ- = 0,997
y = Ι,ΟΙχ + 1,1,
wodurch die gute Korrelationskurve erhalten wurde, wie sie
in Fig. 12 veranschaulicht ist. Darin sind auf der Abszisse die Werte nach der UV-Methode in Iü/1 und auf der Ordinate
die Werte nach der erfindungsgemißen Methode in Iü/1 abgetragen.
Leerseite
Claims (14)
1. Neue L-Glutaminsäure-Qxidase, gekennzeichnet durch
die folgenden biochemischen Eigenschaften: .
(i) Substrat-Spezifizität: L-Glutamiηsäure ,
(ii) Enzym-Wirkung: Es wird eine Reaktion katalysiert, bei der ein Mol L-Glutaminsäure , ein Mol Sauerstoff
und ein Mol Wasser zu einem Mol Λ-Ketoglutarsäure ,
einem Mol Ammoniak und einem Mol Wasserstoffperoxid
umgesetzt werden, gemäß nachstehender Formel
COOH
C,00H
CH2 + 02
l
H-C-NIl2
COOH
C=O
C00H
+H2°2
C I 3
2. L-Glutaminsäure-Oxidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet
, daß das Enzym
(i) einen isoelektrischen Punkt bei etwa pH 4,3 (ermittelt mittels Träger-Amp ho Iy t pH 3,5 - 6,0),
-4 (ii) einen Km-Wert für L-Glutamat von etwa 5,6 χ 10 M,
(iii) ein pH-Wirkungsoptimum bei etwa pH 5 - 7,5, (iv) eine Hitzebeständigkeit bis etwa 55°C, und
(ν) eine pH-Stabilität von etwa pH 4,5 - 7,5 aufweist.
3. L-Glutaminsäure-Oxidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Enzym
(i) einen isoelektrischen Punkt bei etwa pH 4,1
(ermittelt mittels Träger-Ampholyt pH 3,5 - 6,0),
(ii) einen Km-Wert für L-Glutamat von etwa 1,1 χ 10 M,
(iii) ein pH-Wirkungsoptimum bei etwa pH 5 - 7,5, (iv) eine Hitzebeständigkeit bis etwa 55 C, und
(v) eine pH-Stabilität von etwa pH 4 - 7,5 aufweist.
4. Verfahren zur Gewinnung von L-Glutaminsäure-Oxidase
nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen (H„O_ entwickelnde) L-Glutaminsäure-Oxidase produzierenden
Mikroorganismus der Gattung Streptomyces in einem N'ihrmedium züchtet und die dabei produzierte (H-O2 bildende)
L-Glutaminsäure-Oxidase isoliert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Mikroorganismus der Gattung Streptomyces Streptomyces sp. A77OO FERM P-6241 einsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Mikroorganismus der Gattung Streptomyces Streptomyces sp. A8O6 3 FERM P-6242 einsetzt.
7. Verwendung der L-Glutaminsäure-Oxidase gemäß Anspruch
1 bis 3 für eine Methode zum Auffinden von L-Glutaminsäure
oder L-Glutamat, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem
wässrigen Medium die eine Substrat-Spezfizität für L-Glutaminsäure
aufweisende, (H-O,, bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase
mit einer auf L-Glutaminsäure zu analysierenden Materialprobe in Kontakt bringt und den bei der dadurch
katalysierten Reaktion, bei der ein Mol Glutaminsäure,
ein Mol Sauerstoff und ein Mol Wasser zu einem Mol
öC-Ketoglutarsäure , einem Mol Ammoniak und einem Mol
Wasserstoffperoxid umgesetzt werden, verbrauchten Sauerstoff und/oder die dabei gebildete oC-Ketoglutarsäure
und/oder Ammoniak und/oder Wasserstoffperoxid quantitativ
bestimmt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid
mittels eines Indikators vornimmt, der bei Reaktion mit Wasserstoffperoxid eine meßbare Veränderung zeigt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Indikator ein Farbreagenz, ein Fluoreszenzreagenz oder ein Lumineszenzreagenz verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet,
daß man als (H2O- bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase
ein aus einem (H3O bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase produzierenden
Mikroorganismus der Gattung Streptomyces gewonnenes Enzym verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß man als zu analysierende Materialprobe eine Flüssigkeit verwendet, die mit dem Enzym ein Reaktionssystem für
das Freisetzen von L-Glutaminsäure bildet.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Flüssigkeit ein Reaktionssystem einsetzt, das
zur Prüfung auf Glutamat-Pyruvat-Transaminase-Aktivität geeignet ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Flüssigkeit ein Reaktionssystem einsetzt, das zur Prüfung auf Glutamat-Öxalacetat-Transaminase-Aktivität
geeignet ist.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Flüssigkeit ein Reaktionssystem einsetzt, das zur Prüfung auf Peptidase-Aktivität geeignet ist.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57033497A JPS58149677A (ja) | 1982-03-02 | 1982-03-02 | Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼ（ｈ↓２ｏ↓２・ジエネレイテイング）およびその製造法、ならびに分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3307607A1 true DE3307607A1 (de) | 1983-09-29 |
| DE3307607C2 DE3307607C2 (de) | 1990-12-20 |
Family
ID=12388181
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19833307607 Granted DE3307607A1 (de) | 1982-03-02 | 1983-03-01 | L-glutaminsaeure-oxidase, verfahren zu deren herstellung und verwendung fuer analysenmethode |
| DE3348379A Expired - Lifetime DE3348379C2 (de) | 1982-03-02 | 1983-03-01 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE3348379A Expired - Lifetime DE3348379C2 (de) | 1982-03-02 | 1983-03-01 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4605615A (de) |
| JP (1) | JPS58149677A (de) |
| KR (1) | KR870000509B1 (de) |
| DE (2) | DE3307607A1 (de) |
| FR (1) | FR2522680B1 (de) |
| IT (1) | IT1161590B (de) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU565635B2 (en) * | 1982-06-29 | 1987-09-24 | Yamasa Shoyu K.K. | L-glutamic acid oxidase |
| JPS5942896A (ja) * | 1982-08-21 | 1984-03-09 | Yamasa Shoyu Co Ltd | Ｌ−グルタミン酸の分析法、分析用試薬および分析用キット |
| JPS6041500A (ja) * | 1983-08-12 | 1985-03-05 | Yamasa Shoyu Co Ltd | アンモニアの定量法 |
| DE3333453A1 (de) * | 1983-09-16 | 1985-04-11 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | L-aminosaeure-oxidase aus hefen der gattung cryptococcus, ihre herstellung und verwendung |
| US5464775A (en) * | 1991-09-16 | 1995-11-07 | Chimera Research And Chemical, Inc. | Method of detecting adulterant in urine |
| CA2406130C (en) * | 2000-04-19 | 2009-07-07 | Yamasa Corporation | L-glutamate oxidase |
| US7297800B2 (en) * | 2001-12-27 | 2007-11-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Process of producing glutamate derivatives |
| CN103525847A (zh) | 2002-08-26 | 2014-01-22 | 味之素株式会社 | 新型醛缩酶和取代α-酮酸的制备方法 |
| KR100723826B1 (ko) | 2002-12-09 | 2007-06-04 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 변이형 ｄ－아미노트랜스퍼라제 및 이를 사용하는 광학활성글루탐산 유도체의 제조방법 |
| US7180370B2 (en) * | 2004-09-01 | 2007-02-20 | Micron Technology, Inc. | CMOS amplifiers with frequency compensating capacitors |
| KR101523754B1 (ko) * | 2007-03-05 | 2015-05-28 | 어드밴스드 리퀴드 로직, 아이엔씨. | 과산화수소 액적에 기초한 분석평가법 |
| CN114657088B (zh) * | 2022-02-17 | 2023-10-13 | 大自然生物集团有限公司 | 用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5926267B2 (ja) * | 1980-08-28 | 1984-06-26 | 萬有製薬株式会社 | Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼ |
| AU565635B2 (en) * | 1982-06-29 | 1987-09-24 | Yamasa Shoyu K.K. | L-glutamic acid oxidase |
-
1982
- 1982-03-02 JP JP57033497A patent/JPS58149677A/ja active Granted
-
1983
- 1983-03-01 DE DE19833307607 patent/DE3307607A1/de active Granted
- 1983-03-01 DE DE3348379A patent/DE3348379C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-02 KR KR1019830000832A patent/KR870000509B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1983-03-02 US US06/472,174 patent/US4605615A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-02 FR FR8303412A patent/FR2522680B1/fr not_active Expired
- 1983-03-02 IT IT19856/83A patent/IT1161590B/it active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NICHTS ERMITTELT * |
| P. Jurtshuk, L. McManus, Biochimica et Biophysica Acta 368 (1974), S. 158-172 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2522680B1 (fr) | 1986-06-27 |
| KR870000509B1 (ko) | 1987-03-13 |
| IT8319856A1 (it) | 1984-09-02 |
| IT8319856A0 (it) | 1983-03-02 |
| US4605615A (en) | 1986-08-12 |
| FR2522680A1 (fr) | 1983-09-09 |
| JPS58149677A (ja) | 1983-09-06 |
| DE3307607C2 (de) | 1990-12-20 |
| DE3348379C2 (de) | 1992-12-17 |
| KR840004161A (ko) | 1984-10-10 |
| IT1161590B (it) | 1987-03-18 |
| JPH0329399B2 (de) | 1991-04-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FR2459287A1 (fr) | Procede pour produire de l'acide l-glutamique par fermentation | |
| DE3307607A1 (de) | L-glutaminsaeure-oxidase, verfahren zu deren herstellung und verwendung fuer analysenmethode | |
| DE69629489T2 (de) | Fructosylaminosäuren oxidase, verfahren zu ihrer herstellung und zum testen von amadori-verbindungen unter zuhilfenahme des enzyms | |
| CH638241A5 (de) | Enzympraeparat mit l-alpha-aminoacylamidase-aktivitaet. | |
| Jensen et al. | Isolation and preparation of pretyrosine, accumulated as a dead-end metabolite by Neurospora crassa | |
| EP0880599B1 (de) | Verfahren zum nachweis der enzymaktivität von mikroorganismen | |
| WO1999009207A1 (fr) | Milieux de culture et d'identification specifique de differentes especes de candida et procedes d'analyse | |
| EP0599159A2 (de) | a-L-Rhamnosidase zur Gewinnung von Rhamnose, ein Verfahren zur Herstellung und ihre Verwendung | |
| DE2716335A1 (de) | Neue cholinoxydase und verfahren zu ihrer herstellung | |
| EP0120208B1 (de) | Mikrobiologisch hergestellte L-Phenylalanin-Dehydrogenase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung | |
| EP0416282B1 (de) | Mikrobiologisch hergestellte N-Acyl-L-prolin-Acylase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung | |
| EP0074095A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Alkylestern von Aspartylphenylalanin | |
| Adachi et al. | Calcium in quinoprotein methanol dehydrogenase can be replaced by strontium | |
| DE4115340A1 (de) | Mikrobiologisch hergestellte trimethylamin-dehydrogenase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung | |
| SU1582993A3 (ru) | Способ определени содержани креатинина, креатина и саркозина в биологической жидкости | |
| DE3878421T2 (de) | Verfahren zur herstellung von carnitin. | |
| DE2637671A1 (de) | Creatinin-desimidase, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur quantitativen bestimmung von creatinin | |
| Wynne et al. | The effect of light and phosphate concentrations on phosphatase activities of the photosynthetic bacterium Chlorobium spp. | |
| DE2751879C2 (de) | ||
| US4587214A (en) | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters | |
| DE2906737C2 (de) | L-Lysin-&alpha;-oxidase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung | |
| Umbarger | Influence of glucose on the growth factor requirement of a mutant of Escherichia coli | |
| FR2484449A1 (fr) | Procede de production de l-tryptophane ou ses derives en utilisant des micro-organismes, et cultures biologiquement pures d'aeromonas sp. ast 108-1, aeromonas sp. ast 111-4, klebsiella sp. ast 148-1 et klebsiella sp. ast 151-7 | |
| DE3123808A1 (de) | Verfahren zur herstellung von l-typtophan oder einem seiner derivate und dafuer verwendbare biologisch reine kultur eines mikroorganismus | |
| SU1263711A1 (ru) | Питательна среда дл выделени и отбора бактерий-продуцентов протеазы |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: MEYER, L., DIPL.-ING. VONNEMANN, G., DIPL.-ING. DR |
|
| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
| 8172 | Supplementary division/partition in: |
Ref country code: DE Ref document number: 3348379 Format of ref document f/p: P |
|
| Q171 | Divided out to: |
Ref country code: DE Ref document number: 3348379 |
|
| AH | Division in |
Ref country code: DE Ref document number: 3348379 Format of ref document f/p: P |
|
| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| AH | Division in |
Ref country code: DE Ref document number: 3348379 Format of ref document f/p: P |
|
| 8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: ASAHI KASEI KOGYO K.K., OSAKA, JP |
|
| 8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Free format text: MEYER, L., DIPL.-ING., PAT.-ANW., 2000 HAMBURG |
|
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |