DE60013409T2

DE60013409T2 - Alpha-glykosilierte aminosäure freisetzendes enzym

Info

Publication number: DE60013409T2
Application number: DE60013409T
Authority: DE
Inventors: Kaori Ishimaru; Masayuki Yagi; Satoshi Yonehara
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 2000-02-21
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2020-02-22
Also published as: CN1340099A; CN1214106C; JP3668801B2; CN1510136A; EP1156105A4; US6797503B1; EP1156105A1; WO2000050579A1; DE60013409D1; EP1156105B1; AU2576100A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym.
HINTERGRUND
Proteasen werden in verschiedenen industriellen Bereichen verwendet. Proteasen werden z.B. zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins, z.B. glykosylierten Albumins, im Serum verwendet, das als wichtiger Indikator für die Diagnose, Behandlung, usw. von Diabetes dienen kann.
Eine solche Bestimmung des glykosylierten Proteins unter Verwendung der Protease kann beispielsweise durchgeführt werden, indem man das glykosylierte Protein mit der Protease abbaut, das sich ergebende Abbauprodukt mit einer Fructosylaminosäureoxidase (nachfolgend hier als „FAOD" bezeichnet) umsetzt, und dann den Sauerstoffverbrauch oder die Wasserstoffperoxidbildung bestimmt, um die Menge des glykosylierten Proteins zu ermitteln. Beispiele für die Protease umfassen solche, die in der JP 5(1993)-192193 A und JP 7(1995)-289253 A offenbart sind.
Die vorstehend beschriebene Protease-Vorbehandlung des glykosylierten Proteins wird durchgeführt, weil FAOD und dergleichen leicht auf eine glykosylierte Aminosäure und ein glykosyliertes Peptid einwirken können, wogegen sie kaum auf das glykosylierte Protein selbst einwirken. Da die glykosylierte Stelle von glykosyliertem Hämoglobin (nachfolgend hier als „HbA1c" bezeichnet) der N-terminale Aminosäurerest der β-Kette ist, besteht insbesondere ein Bedarf an einer Protease, die HbA1c zu behandeln vermag, so dass FAOD leicht auf diese Stelle des HbA1c einwirken kann.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines neuen Enzyms, das ein glykosyliertes Protein und ein glykosyliertes Peptid zu behandeln vermag, so dass FAOD leicht darauf einwirken kann.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten zunächst bei verschiedenen FAODs den Wirkungsmechanismus der FAOD, die auf ein glykosyliertes Protein, ein glykosyliertes Peptid, eine glykosylierte Aminosäure usw. einwirkt, in denen ein Zucker an eine α-Aminogruppe gebunden ist. Durch diese Untersuchung fanden die Erfinder heraus, dass eine solche FAOD leicht auf die glykosylierte Aminosäure einwirkt, in der ein Zucker an die α-Aminogruppe gebunden ist, wogegen sie kaum auf das oben erwähnte glykosylierte Protein und glykosylierte Peptid einwirkt. Auf der Grundlage dieses Ergebnisses isolierten die Erfinder verschiedene Bakterien aus der Natur, kultivierten diese und untersuchten die von ihnen produzierten Enzyme. Als Ergebnis gelang es den Erfindern, Bakterien zu isolieren, die ein neuartiges Enzym produzieren, welches eine Aminosäure mit einer glykosylierten α-Aminogruppe (α-glykosylierte Aminosäure: nachfolgend hier als „α-GA" bezeichnet) aus dem glykosylierten Protein oder glykosyliertem Peptid freizusetzen vermag, bei dem der Zucker an eine α-Aminogruppe (eine N-terminale Aminogruppe) gebunden ist, wodurch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wurde. Das neue erfindungsgemäße Enzym (α-glykosylierte Aminosäure-freisetzendes Enzym: nachfolgend hier als „α-GARE" bezeichnet) kann α-GA freisetzen, beispielsweise aus dem vorstehend erwähnten glykosylierten Protein oder glykosyliertem Peptid. Das neuartige erfindungsgemäße Enzym kann nicht nur für die Bestimmung von HbA1c verwendet werden, sondern auch in verschiedenen Anwendungsbereichen, z.B. für die Bestimmung anderer glykosylierter Proteine. Somit kann durch Verwendung dieses neuen Enzyms die Bestimmung von HbA1c unter Verwendung von FAOD, die problemlos auf α-GA einwirkt, in klinischen Tests zur praktischen Anwendung kommen. Darüber hinaus kann α-GARE zusätzlich zu den katalytischen Funktionen der Freisetzung von α-GA weitere katalytische Funktionen aufweisen, z.B. die Funktion der Spaltung anderer Peptidbindungen. Beispiele für neuartige, von den vorliegenden Erfindern isolierte Bakterienstämme sind die Bakterienstämme aus der Gattung Corynebacterium und der Gattung Pseudomonas.
Es gibt keine speziellen Beschränkungen für die glykosylierte Aminosäure, die von α-GARE freigesetzt wird, solange diese eine glykosylierte α-Aminogruppe aufweist. Da jedoch, wie vorstehend beschrieben, der N-terminale Valinrest in HbA1c glykosyliert ist, ist die glykosylierte Aminosäure, die durch α-GARE freigesetzt wird, vorzugsweise ein glykosyliertes Valin (nachfolgend hier als „α-GV" bezeichnet).
Beispiele für erfindungsgemäßes α-GARE umfassen die folgenden zwei Arten.
Das erste α-GARE (nachfolgend hier als „α-GARE-1" bezeichnet) stammt aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002. Corynebacterium ureolyticum KDK1002 wurde durch die vorliegenden Erfinder neu aus dem Boden isoliert. Corynebacterium ureolyticum KDK1002 wurde ab dem 11. Januar 1999 (FERM BP-7040) unter der Zugangsnummer FERM P-17135 beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-0046, JAPAN) hinterlegt. Die bakteriologischen Eigenschaften dieses Stammes sind nachfolgend gezeigt.
(Morphologische Eigenschaften)
Dieser Stamm ist ein unbewegliches, stäbchenförmiges Bakterium (Bazillus) mit Abmessungen von 0,8 × 1,2 μm.
(Kultivierungseigenschaften)

Bei Kultivierung in einem Agarmedium nach der üblichen Methode bildet der Stamm eine in ihrer Form kreisförmige und ihrer Erhebung flach-konvexe Kolonie. Die Kolonie ist cremefarben. (Physiologische Eigenschaften)

Gramfärbung:	positiv
Sauerstoffbedarf:	fakultativ anaerob
Nitratreduzierung:	–
Pyrazinamidase:	+
Pyrrolidonylarylamidase:	–
Alkalische Phosphatase:	–
β-Glukoronidase:	–
β-Galactosidase:	–
α-Glukosidase:	–
N-Acetyl-β-glukoseaminase:	–

Esculin (Glukosidase):	–
Urease:	+
Gelatineabbau:	–
β-Hämolyse:	–
Vergärbarkeit von Kohlenhydraten:	–
Glukose:	–
Ribose:	–
Xylose:	–
Mannitol:	–
Maltose:	–
Lactose:	–
Saccharose:	–
Glycogen:	–

Das zweite α-GARE (nachfolgend hier als „α-GARE-2" bezeichnet) stammt aus Pseudomonas alcaligenes KDK1001. Pseudomonas alcaligenes KDK1001 wurde ebenfalls durch die vorliegenden Erfinder neu aus dem Boden isoliert. Pseudomonas alcaligenes KDK1001 wurde unter der Zugangsnummer FERM P-17133 ab dem 11. Januar 1999 (FERM BP-7039) beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-0046, JAPAN) hinterlegt. Die bakteriologischen Eigenschaften dieses Stammes sind nachfolgend gezeigt.
(Morphologische Eigenschaften)
Dieser Stamm ist ein stäbchenförmiges Bakterium (Bazillus) mit Abmessungen von 0,3 × 1,5 μm, das durch polare Flagellen beweglich ist.
(Kultivierungseigenschaften)

Bei Kultivierung in einem Agarmedium nach der herkömmlichen Methode bildet der Stamm eine Kolonie, die in ihrer Form kreisförmig ist, in der Erhebung flach konvex ist und eine glatte Oberfläche aufweist. Die Kolonie ist anfänglich durchscheinend und wird dann hellgelb. Bei Kultivierung in Mac Conkey's Kulturmedium wächst der Stamm, jedoch schwach. Bei einer Kultivierungstemperatur von 40 °C wächst der Stamm überhaupt nicht. (Physiologische Eigenschaften)

Gramfärbung:	negativ
Sauerstoffbedarf:	aerob
Nitratreduzierung:	+
Indolproduktion:	–
Glukoseversäuerung	–
Argeninhydrolase:	–
Urease:	–
Esculinhydrolyse:	+
Gelantinehydrolyse:	–
β-Galactosidase:	+
Gasfreisetzung aus Glukose:	–
Substratverwertung:
Glukose:	+
L-Arabinose:	+
D-Mannose:	+
D-Mannitol:	+
N-Acetyl-D-glucosamin:	–
Maltose:	+
Kaliumgluconat:	+
Decansäure:	+
Adipinsäure:	–
DL-Äpfelsäure:	+
Natriumcitrat:	–
Phenylacetat:	+

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids umfasst: den Abbau eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids mit einem Enzym; die Durchführung einer Redox-Reaktion zwischen dem sich ergebenden Abbauprodukt und FAOD; und die Bestimmung der Redox-Reaktion zur Bestimmung des glykosylierten Proteins oder des glykosylierten Peptids. Bei diesem Verfahren wird das neue erfindungsgemäße Enzym (α-GARE) als das vorstehend erwähnte Enzym verwendet. Die Art des bei diesem Verfahren verwendeten α-GARE wird in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Art, Konzentration, usw. des zu bestimmenden glykosylierten Proteins oder glykosylierten Peptids gewählt. Das α-GARE kann allein oder in Kombination von zwei oder mehr Arten verwendet werden. Das glykosylierte Protein oder dergleichen kann durch Vorbehandlung mit einem anderen Enzym (z.B. Protease) abgebaut werden, so dass das α-GARE leichter darauf einwirken kann.
Bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren wird die Redox-Reaktion vorzugsweise durch Messen der durch die Redox-Reaktion erzeugten Menge Wasserstoffperoxid oder der durch die Redox-Reaktion verbrauchten Sauerstoffmenge gemessen. Die Menge des Wasserstoffperoxids wird vorzugsweise unter Verwendung einer Peroxidase und eines Substrats gemessen, das sich bei Oxidation färbt (nachfolgend hier als „chromogenes Substrat" bezeichnet). Die Menge des Wasserstoffperoxids kann nicht nur durch das vorstehend erwähnte enzymatische Verfahren unter Verwendung der Peroxidase oder dergleichen bestimmt werden, sondern auch beispielsweise durch ein elektrisches Verfahren.
Beispiele für das chromogene Substrat sind N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)diphenylamin-natrium (beispielsweise unter dem Handelsnamen „DA-64" von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich), Orthophenylendiamin (OPD), und ein Substrat, das durch Vereinigung eines Trinder-Reagenz und von 4-Aminoantipyrin erhalten wird. Beispiele des vorstehend genannten Trinder-Reagenz' sind Phenole, Phenolderivate, Anilinderivate, Naphthole, Naphtholderivate, Naphthylamin und Naphthylaminderivate. Anstelle des vorstehend genannten Aminoantipyrins ist es weiterhin möglich, Aminoantipyrinderivate, Vanillindiaminsulfonsäure, Methylbenzothiazolinonhydrazon (MBTH), sulfoniertes Methylbenzothiazolinonhydrazon (SMBTH) und dergleichen zu verwenden. Von diesen chromogenen Substraten wird N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)diphenylamin-natrium besonders bevorzugt.
Bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren sind Blutzellen eine vorzugsweise zu analysierende Probe, weil die Bestimmung von HbA1c in Blutzellen, wie vorstehend beschrieben, für die Diagnose von Diabetes brauchbar ist. Die Probe ist jedoch nicht auf Blutzellen beschränkt, weil sich von den Blutzellen unterscheidende Blutbestandteile (Gesamtblut, Plasma, Serum, usw.); biologische Proben wie beispielsweise Urin und Rückenmarksflüssigkeit; Getränke, wie beispielsweise Säfte; Nahrungsmittel, wie beispielsweise Sojasoße und Soße, usw., ebenfalls glykosylierte Proteine enthalten. Ebenso ist der zu bestimmende Analyt nicht auf HbA1c beschränkt, sondern kann beispielsweise ein glykosyliertes Protein, wie Gelatine und Kasein oder ein glykosyliertes Peptid sein.
Ein erfindungsgemäßer Kit zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids umfasst eine Protease, FAOD, eine Peroxidase und ein Substrat, das durch eine Umsetzung mit der Peroxidase oxidiert wird. Bei diesem Bestimmungskit umfasst die Protease ein erfindungsgemäßes α-GARE. Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann unter Verwendung dieses Kits schnell und leicht durchgeführt werden. Weiterhin kann in diesem Bestimmungskit das α-GARE allein oder in Kombination von zwei oder mehr Arten verwendet werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungskit werden als zu oxidierendes Substrat vorzugsweise die vorstehend beschriebenen chromogenen Substrate verwendet. Weiterhin sind ein in diesem Kit zu verwendender Analyt und eine zu verwendende Probe ebenfalls wie oben beschrieben.
Ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen α-GARE umfasst den Schritt der Kultivierung eines neuen erfindungsgemäßen Bakterienstammes. Dieses Verfahren ermöglicht die einfache Herstellung eines erfindungsgemäßen α-GARE.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von α-GARE umfasst weiterhin vorzugsweise die nachfolgenden Aufreinigungsschritte (a) bis (c):

(a) den Schritt des Entfernens der Bakterienzellen aus der Kultivierungslösung, wobei ein Überstand hergestellt wird;
(b) den Schritt der Ausfällung des in dem Überstand enthaltenen Proteins mit Ethanol; und
(c) den Schritt des Abtrennens des Proteins über Chromatographie.

Die vorstehend beschriebenen Aufreinigungsschritte sind nicht spezifisch einschränkend und können zusammen mit anderen Aufreinigungsschritten durchgeführt werden. Weiterhin ist es möglich, beispielsweise nur den Schritt (a) durchzuführen; die beiden oder mehr Schritte durchzuführen; oder den selben Schritt wiederholt durchzuführen.
Das durch die vorstehend beschriebene Kultivierung des Bakterienstammes erhaltene erfindungsgemäße α-GARE kann in der Kulturlösung oder in aufgereinigtem Zustand verwendet werden. Das α-GARE kann ungeachtet seines Aufreinigungsgrads verwendet werden, solang es α-GA aus dem glykosylierten Protein oder dergleichen freisetzen kann. In aufgereinigter Form kann die spezifische Aktivität des α-GARE jedoch erhöht sein, weil die vom α-GARE unterschiedlichen Komponenten in der Kulturlösung durch die Aufreinigung entfernt werden. Dementsprechend kann die Menge des zu verwendenden α-GARE verringert werden, wodurch die Handhabung des α-GARE erleichtert wird. Wenn das α-GARE zur Herbeiführung verschiedener Reaktionen verwendet wird, kann zusätzlich ein Einfluss der sich von dem α-GARE unterscheidenden Bestandteile vermieden werden.
Die ein erfindungsgemäßes α-GARE kodierenden Gene werden vorzugsweise durch Bestimmung der Aminosäuresequenz und der Gensequenz des über die vorstehend beschriebenen Aufreinigungsschritte aufgereinigten α-GARE hergestellt. Die erfindungsgemäßen α-GARE kodierenden Gene sind nicht auf jene beschränkt, welche für die Expression des α-GARE erforderlich sind. Beispiele für solche Gene sind ein DNA-Fragment, RNA, usw., die als Sonde oder Primer verwendet werden, und ein auf der Grundlage der Gensequenz des vorstehend genannten α-GARE chemisch synthetisiertes Fragment. Unter Verwendung solcher Gene kann ein rekombinantes Gen oder dergleichen hergestellt werden, um α-GARE zu produzieren. Die erfindungsgemäßen Gene des α-GARE können beispielsweise auf folgende Art erhalten werden.
Zunächst wird ein erfindungsgemäßes α-GARE beispielsweise durch die nachfolgend beschriebenen Aufreinigungsschritte aufgereinigt. Dessen Aminosäuresequenz wird dann über eine übliche Methode wie beispielsweise dem Edman-Abbau bestimmt und daraus die Gensequenz des α-GARE abgeleitet. Auf der Grundlage der dadurch erhaltenen Gensequenz wird dann ein DNA-Fragment, RNA-Fragment oder dergleichen über eine übliche Methode wie beispielsweise chemische Synthese oder dergleichen erhalten. Die Gene des erfindungsgemäßen α-GARE können dann erhalten werden, indem die Gene, die ein α-GARE eines neuen erfindungsgemäßen Bakterienstamms kodieren, unter Verwendung des DNA-Fragments, RNA-Fragments oder dergleichen als Primer, Sonde oder dergleichen kloniert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Chromatogramm der TLC-Analyse von Abbauprodukten, die in einem Beispiel der vorliegenden Erfindung durch Abbau glykosylierter Peptide mit einem Kulturüberstand eines Bakterienstamms der Gattung Corynebacterium erhalten wurden.
2 ist ein weiteres Chromatogramm der TLC-Analyse von Abbauprodukten, die in dem selben Beispiel durch Abbau glykosylierter Peptide mit einem Kulturüberstand eines Bakterienstamms der Gattung Corynebacterium erhalten wurden.
3 ist ein Chromatogramm der TLC-Analyse von Abbauprodukten, die in einem weiteren Beispiel der vorliegenden Erfindung durch Abbau glykosylierter Peptide mit einem Kulturüberstand eines Bakterienstamms der Gattung Pseudomonas erhalten wurden.
4 ist ein Gesamtionenchromatogramm aus einer LC-MS-Analyse des Abbauprodukts, das in einem weiteren Beispiel der vorliegenden Erfindung durch Abbau eines glykosylierten Peptids mit einem Kulturüberstand eines Bakterienstammes der Gattung Corynebacterium erhalten wurde.
5 ist ein MS-Spektrum aus einer CC-MS-Analyse des Abbauprodukts, das in demselben Beispiel durch Abbau eines glykosylierten Peptids mit einem Kulturüberstand eines Bakterienstammes der Gattung Corynebacterium erhalten wurde.
6 ist ein Graph, der in einem weiteren Beispiel der vorliegenden Erfindung die Beziehung zwischen der von einem Bakterienstamm der Gattung Corynebacterium stammenden Menge α-GARE und der Extinktion zeigt.
7 ist ein Graph, der in einem weiteren Beispiel der vorliegenden Erfindung die Beziehung zwischen der von einem Bakterienstamm der Gattung Pseudomonas stammenden Menge α-GARE und der Extinktion zeigt.
8 ist ein Graph, der in einem weiteren Beispiel der vorliegenden Erfindung die thermische Stabilität eines von einem Bakterienstamm der Gattung Corynebacterium stammenden α-GARE zeigt.
9 ist ein Graph, der in einem weiteren Beispiel der vorliegenden Erfindung die thermische Stabilität eines von einem Bakterienstamm der Gattung Pseudomonas stammenden α-GARE zeigt.
10 ist ein Graph, der in einem weiteren Beispiel der vorliegenden Erfindung eine optimale Temperatur für ein von einem Bakterienstamm der Gattung Corynebacterium stammendes α-GARE zeigt.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Das Screening eines Bakterienstamms, der ein erfindungsgemäßes α-GARE produziert, kann beispielsweise durchgeführt werden, indem man den Bakterienstamm aus dem Boden gemäß einer Isolierungskultivierungsmethode kultiviert, mit der sich ergebenden Kulturlösung eine Abbaureaktion eines glykosylierten Peptids induziert und dann das sich ergebende Abbauprodukt über Dünnschichtchromatographie (TLC) analysiert, wie nachfolgend ausführlich beschrieben wird. Die vorliegenden Erfinder führten eine ausführliche Untersuchung darüber durch, wie der das α-GARE produzierende Bakterienstamm isoliert werden kann, und erstellten schließlich das nachfolgend beschriebene Screeningverfahren. Es kann auf Grundlange stichhaltiger Gründe versichert werden, dass der Erfolg bei der Isolierung des erfindungsgemäßen, das α-GARE produzierenden Bakterienstamms der Erstellung dieses Screeningverfahrens zuzuschreiben ist.
(1) Kultivierungsverfahren

Das nachfolgend gezeigte flüssige Nährstoffmedium wird 20 Minuten bei 121 °C in einem Autoklaven sterilisiert. Eine Bodenprobe wird in sterilisiertem Wasser suspendiert, welches dann dem vorstehend erwähnten sterilisierten flüssigen Nährstoffmedium zugegeben wird, das dann in einer Schüttelkultur (111 U/min) 48 Stunden bei 30 °C kultiviert wird. Die auf diese Weise erhaltene Kulturlösung wird zentrifugiert (12.000 g, 15 min, 4 °C) und der Überstand gesammelt. (Flüssiges Nährstoffmedium)

Malzextrakt	2,0 g
(Handelsname „Malt extract", Difco Laboratories)
D-Glukose (Nacalai Tesque, Inc.)	2,0 g
Pepton	0,1 g
(Handelsname „Becto peptone", Difco Laboratories)
destilliertes Wasser	100 ml

(2) Abbaureaktion des glykosylierten Peptids
(Verfahren zur Herstellung von glykosyliertem Peptid und glykosylierter Aminosäure)
Unter Verwendung von Valin, Glukose und jedes der nachfolgend gezeigten Peptide werden ein glykosyliertes Peptid mit einer glykosylierten α-Aminogruppe und der Aminosäuresequenz, die mit der N-terminalen Aminosäuresequenz der β-Kette von HbA1c identisch ist, und α-Fructosylvalin (nachfolgend hier als „FV" bezeichnet) nach dem herkömmlichen Verfahren hergestellt.
(Peptid)

Val-His (Peptide Institute Inc.: Dessen Glykosylierungsprodukt wird nachfolgend hier als "F2P" bezeichnet.)
Val-His-Leu (Peptide Institute Inc.: Dessen Glykosylierungsprodukt wird nachfolgend hier als "F3P" bezeichnet.)
Val-His-Leu-Thr (Biolink Corporation: Dessen Glykosylierungsprodukt wird nachfolgend hier als "F4P" bezeichnet.)
Val-His-Leu-Thr-Pro (Sigma Chemical Co.: Dessen Glykosylierungsprodukt wird nachfolgend hier als "F5P" bezeichnet.)
Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Ser (Biolink Corporation: Dessen Glykosylierungsprodukt wird nachfolgend hier als "F9P" bezeichnet.)

(L-Aminosäure)

Val, Leu und His (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

(Abbauverfahren)
Zur Herstellung wässriger Lösungen glykosylierter Peptide werden die vorstehend genannten glykosylierten Peptide jeweils in einer Konzentration von 0,01 Mol/l in destilliertem Wasser gelöst. Anschließend werden jeweils 50 μl der wässrigen Lösungen der glykosylierten Peptide mit 100 μl des vorstehend genannten Kulturüberstands gemischt und die sich ergebenden Gemische über Nacht bei 37 °C umgesetzt. Die auf diese Weise erhaltenen Reaktionslösungen werden dann lyophilisiert.
(3) TLC-Analyse
Die Abbauprodukte der vorstehend genannten glykosylierten Peptide werden mittels TLC auf das Vorliegen oder Fehlen einer α-GARE-Aktivität analysiert. Das zu verwendende Reagenz und das Verfahren zur Durchführung der Analyse werden nachfolgend beschrieben.
(Dünnschichtplatte)

Handelsname „Pre-Coated TLC plate SILICA GEL 60" (Merck & Co., Inc.)

(Nachweisreagenz)
Ninhydrin (Funakoshi Co., Ltd.) wird in 75 Vol.-% Ethanol gelöst, so dass sich eine Endkonzentration von 0,5 Vol.-% ergibt.
(Entwicklungslösemittel)
Butanol (Nacalai Tesque, Inc.), Essigsäure (Nacalai Tesque, Inc.) und destilliertes Wasser werden miteinander im Volumenverhältnis von 2:1:1 gemischt.
(Verfahren zur Durchführung der Analyse)
Die vorstehend genannte Dünnschichtplatte wird zuvor so vorbereitet, dass sie eine Laufstrecke für das Lösemittel von 8 cm aufweist, und eine Startlinie für die Probenauftragungsstellen wird 1 cm vom unteren Ende der Dünnschichtplatte entfernt gesetzt.
Unmittelbar vor Beginn der TLC-Analyse werden die vorstehend genannten lyophilisierten Reaktionslösungen jeweils in 15 μl 50 Vol.-% Ethanol gelöst, und dann mit einer 25 μl-Spritze auf die Startlinie aufgetragen. Als Kontrollen werden das vorstehend genannte FV und die jeweiligen Aminosäuren ebenfalls in gleicher Weise auf der Startlinie aufgetragen. Die Dünnschichtplatte wird dann solange in eine Entwicklungskammer gestellt, die zuvor mit dem vorstehend genannten Entwicklungslösemittel gesättigt wurde, bis das Entwicklungslösemittel auf eine Entfernung von etwa 8 cm von der Startlinie aufsteigt. Das Entwicklungslösemittel sollte so in die Entwicklungskammer eingefüllt werden, dass das untere Ende der Platte bis auf eine Strecke von etwa 0,5 cm in das Lösungsmittel eingetaucht ist.
Nach der Entwicklung wird die Dünnschichtplatte in einem Abzug vollständig luftgetrocknet und das vorstehend genannte Nachweisreagenz (Ninhydrinlösung) aufgesprüht. Die Platte wird dann mit einem vorgeheizten Umluftofen (100 °C) erhitzt, um einen Färbungstest durchzuführen. In diesem Färbungstest wird eine Probe, welche die gleiche Mobilität wie das Kontroll-FV aufweist, als Probe mit positiver α-GARE-Aktivität bestimmt. Der Bakterienstamm der Kulturlösung, die für die Herstellung der Probe mit positiver α-GARE-Aktivität verwendet wurde, ist ein α-GARE-produzierender Stamm.
Die TLC-Analyse ist nicht auf den vorstehend genannten Ninhydrinnachweis beschränkt und kann beispielsweise ein Fluoreszenznachweis unter Verwendung eines anderen Reagenz wie beispielsweise Fluoreszamin und Ethylendiaminsulfat sein.
Weiterhin wird für die vorstehend genannten Kontrollen bevorzugt beispielsweise α-GA eines glykosylierten Proteins oder glykosylierten Peptids verwendet, das als Substrat dient.
Beispiele neuer, vom vorliegenden Erfinder mit diesem Screeningverfahren isolierter Bakterienstämme umfassen Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) und Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P-17133) (FERM BP-7039).
Das erfindungsgemäß für den Nachweis von α-GARE und für die Bestimmung einer α-GARE-Aktivität verwendbare Substrat ist nicht auf die vorstehend genannten glykosylierten Peptide usw. beschränkt. Beispiele für das Substrat sind ein glykosyliertes Protein, glykosyliertes Peptid und dergleichen, die eine glykosylierte N-terminale α-Aminogruppe aufweisen. Für den Fall, dass ein solches glykosyliertes Protein, glykosyliertes Peptid und dergleichen als Substrat verwendet werden, kann α-GARE beispielsweise nachgewiesen/bestimmt werden, indem man eine Redox-Reaktion (z.B. eine Farbentwicklungsreaktion) unter Verwendung des weiter unten beschriebenen FAOD durchführt.
HbA1c und glykosyliertes Globin sind Beispiele für das vorstehend genannte glykosylierte Protein. Diese glykosylierten Proteine können natürlich vorkommen oder über Amadori-Umlagerung zwischen Zuckern und Proteinen synthetisiert werden. Das glykosylierte Globin kann gemäß der von Teale (Teale, F.W.J, Biochem, Biophys, Acta, 35, 543, 1959) vorgeschlagenen Methode über die Globinisierung des HbA1c hergestellt werden, das über HPLC usw. aufgereinigt wurde. Wenn verschiedene Proteine über Synthese glykosyliert werden, gibt es keine Beschränkungen für die zu verwendenden Zucker. Beispiele für die Zucker sind Aldose, z.B. Glukose, und Ketose.
Das vorstehend genannte glykosylierte Peptid kann beispielsweise durch Abbau des vorstehend genannten glykosylierten Proteins mit einer Protease hergestellt werden. Alternativ kann das vorstehend genannte glykosylierte Peptid über die Amadori-Umlagerung zwischen einem Zucker und einem synthetischen Peptid synthetisiert werden. Es gibt keine spezielle Beschränkung für die Länge der glykosylierten Peptide. Die Zahl der Aminosäurereste liegt jedoch beispielsweise im Bereich von 2 bis 20 und vorzugsweise im Bereich von 2 bis 8.
Ein natürliches Peptid und ein synthetisches Peptid können beispielsweise als das Peptid in der Amadori-Umlagerung mit Zucker verwendet werden. Es gibt keine spezielle Beschränkung für die Aminosäurezusammensetzung dieser Peptide. Jedoch wird vorzugsweise ein Peptid verwendet, das kein Arginin oder Lysin enthält. Wenn das Arginin- oder Lysin-freie Peptid glykosyliert wird, wird nur dessen α-Aminogruppe unter Bildung eines glykosylierten Peptids glykosyliert. Dementsprechend kann unter Verwendung eines solchen glykosylierten Peptids nur eine α-GARE-Aktivität nachgewiesen werden.
In dem speziellen Fall, in dem α-GARE zur Bestimmung von HbA1c verwendet wird, weisen die vorstehend genannten Peptide vorzugsweise die Aminosäuresequenz auf, die mit der N-terminalen Aminosäuresequenz der β-Kette von HbA1c identisch ist. Ein Beispiel für ein solches glykosyliertes Peptid ist das glykosylierte Peptid, bei dem die α-Aminogruppe des N- terminalen Val wie in „Abbaureaktion eines glykosylierten Peptids" oben beschrieben glykosyliert ist. Weiterhin kann beispielsweise durch Abbau von HbA1c mit Trypsin ein glykosyliertes Peptid mit acht Aminosäureresten erhalten werden, bei dem die α-Aminogruppe des N-terminalen Valins glykosyliert ist.
Weiterhin kann für den Fall, in dem das glykosylierte Peptid und dergleichen mit einer glykosylierten N-terminalen α-Aminogruppe als Substrat für α-GARE verwendet werden, das α-GARE nicht nur nachgewiesen/bestimmt werden, indem das freigesetzte α-GA nachgewiesen wird, sondern auch durch Nachweis des zurückbleibenden Peptids nach Freisetzung des α-GA.
Es gibt keine speziellen Beschränkungen für solche glykosylierten Peptide, und diese können beispielsweise die Peptide wie beispielsweise FV-Leu (nachfolgend hier „FVL"), FV-Gln (nachfolgend hier „FVQ"), FV-Ala (nachfolgend hier „FVA") und FV-Asn (nachfolgend „FVN") sein. Aus diesen Dipeptiden wird durch das α-GARE FV freigesetzt, wodurch Leu, Gln, Ala bzw. Asn erzeugt werden. Das α-GARE kann durch Umsetzen von Leu mit Leucindehydrogenase; von Gln mit Glutamatdehydrogenase; von Ala mit Alaninamintransferase, α-Ketoglutarsäure und Lactatdehydrogenase; von Asn mit Asparaginaminotransferase, α-Ketoglutarsäure, Maltdehydrogenase, usw. und dann Bestimmung der Bildung von NADH oder NAD durch Messung der Extinktion (bei einer Wellenlänge von 340 nm) nachgewiesen werden.
Ein Beispiel für ein glykosyliertes Tripeptid ist weiterhin FV-Leu-Ser (nachfolgend hier „FVLS"). FV wird durch α-GARE aus FVLS freigesetzt, wodurch Leu-Ser gebildet wird. Das Leu-Ser wird durch eine Hydrolase, wie beispielsweise Aminopeptidase, Chymotrypsin oder Proteinase K unter Bildung von Leucin abgebaut, und das somit erzeugte Leucin kann auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben bestimmt werden. Es gibt keine speziellen Beschränkungen für die Länge des Peptids.
Es ist weiterhin möglich, als Substrat für α-GARE auch ein Substrat zu verwenden, das eine Aminosäure und eine Nachweisgruppe umfasst, bei dem die Aminosäure eine glykosylierte α-Aminogruppe aufweist; die Nachweisgruppe an eine α-Carboxylgruppe der Aminosäure über eine Amidbindung oder Esterbindung gebunden ist, und die Nachweisgruppe bei Freisetzung, nicht aber in gebundenem Zustand, nachgewiesen werden kann.
Bei Reaktion mit dem vorstehend beschriebenen Substrat spaltet α-GARE die Amidbindung oder Esterbindung zwischen α-GA und der Nachweisgruppe, wodurch das α-GA und die Nachweisgruppe freigesetzt werden. Die auf Grund dieser Spaltung freigesetzte Nachweisgruppe entwickelt beispielsweise eine Farbe/Fluoreszenz, wodurch der Nachweis/die Bestimmung des α-GARE ermöglicht wird.
Es gibt keine speziellen Beschränkungen für die vorstehend beschriebene Nachweisgruppe, und vorzugsweise wird eine Nachweisgruppe verwendet, die, wie vorstehend beschrieben, beispielsweise durch die Farbe oder Fluoreszenz, die sie hervorbringt, nachgewiesen werden kann. Beispiele für eine Nachweisgruppe, die über Farbe nachgewiesen werden kann, sind Paranitroanilid (nachfolgend hier als „p-NA" bezeichnet), para-Nitrophenol, Indol, β-Naphthylamid und 4-Methoxy-β-naphthylamid (4MβNA). Weitere Beispiele für eine Nachweisgruppe, die über Fluoreszenz nachgewiesen werden kann, umfassen 4-Methyl-coumaryl-7-amid. Für den Fall, dass p-NA oder para-Nitrophenol verwendet werden, wird beispielsweise eine Extinktion etwa im Bereich der Wellenlängen von 405 bis 410 nm mit einem Spektrophotometer usw. gemessen. Wenn dagegen 4-Methyl-coumaryl-7-amid verwendet wird, wird beispielsweise eine Extinktion im Bereich der Wellenlänge von 460 nm gemessen, nachdem bei einer Wellenlänge von 380 nm angeregt wurde.
Der Grund dafür, dass das α-GARE das α-GA unabhängig davon freisetzen kann, ob die Nachweisgruppe an die α-Carboxylgruppe über die Amidbindung oder die Esterbindung gebunden ist, wird darin gesehen, dass das α-GARE für die Freisetzung des α-GA die glykosylierte Stelle der α-Aminogruppe erkennt.
Das vorstehend beschriebene Substrat für α-GARE, das die an die α-Carboxylgruppe gebundene Nachweisgruppe umfasst, kann beispielsweise unter Verwendung einer im Handel erhältlichen Aminosäure mit einer daran gebundenen Nachweisgruppe und eines Zuckers nach einer üblichen Methode hergestellt werden.
Erfindungsgemäßes α-GARE kann durch Kultivieren eines α-GARE-herstellenden, erfindungsgemäßen Bakterienstamms hergestellt werden, beispielsweise nach einem dem vorstehend erwähnten Kultivierungsverfahren entsprechenden Verfahren. Wenn Coryne-bacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) verwendet wird, liegen die Kultivierungsbedingungen des Stamms beispielsweise für die Kultivierungstemperatur im Bereich von 20 °C bis 37 °C, für die Kultivierungsdauer im Bereich von 18 bis 72 Stunden und für den pH des Kulturmediums im Bereich von 7,0 bis 8,0. Andererseits liegen bei Verwendung von Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P-17133) (FERM BP-7039) als Kulturbedingungen für den Stamm beispielsweise die Kultivierungstemperatur im Bereich von 20 °C bis 40 °C, die Kultivierungsdauer im Bereich von 18 bis 72 Stunden und der pH des Kultivierungsmediums im Bereich von 5,0 bis 10,0.
Weiterhin kann durch Abtrennung und Aufreinigung des α-GARE in der Kultivierungslösung nach einer herkömmlichen Methode eine Enzymzubereitung des α-GARE erhalten werden. Die Aufreinigung des α-GARE kann durch Kombinieren bekannter Methoden, wie dem Aussalzen mit Amoniumsulfat oder dergleichen, isoelektrischer Fällung, Ethanolfällung, Ionenaustauschchromatographie, Gelchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophober Chromatographie usw. erreicht werden. Nachfolgend wird ein Beispiel für eine Aufreinigungsmethode des von Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) gegeben.
Zunächst zentrifugiert man die vorstehend beschriebene Kulturlösung (12.000 g, 15 min, 4 °C), um die Bakterienzellen zu entfernen, und erhält einen Überstand. Dann gibt man bis auf eine Konzentration von 50 Vol.-% kaltes Ethanol zu dem Überstand. Man rührt die sich ergebende Lösung ausreichend und lässt sie etwa 20 Minuten bei 4 °C stehen. Dann zentrifugiert man die Lösung (12.000 g, 15 min, 4 °C), um einen Überstand zu erhalten. Man gibt dem Überstand erneut kaltes Ethanol bis auf eine Konzentration von 85 Vol.-% zu und rührt die sich ergebende Lösung. Anschließend lässt man die Lösung stehen, zentrifugiert sie auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben und sammelt den Niederschlag. Den Niederschlag löst man dann in reinem Wasser.
Die auf diese Weise erhaltene Lösung trägt man auf eine Säule auf (unter dem Handelsnamen „Poros HQ/M" von PE Biosystem, Inc. erhältlich) und eluiert nichtgebundene Fraktionen mit 10 mM Tris-Salzsäure-(HCl)-Puffer (pH 7,5) und sammelt diese. Die nichtgebundenen Fraktionen trägt man dann auf eine weitere Säule auf (erhältlich unter dem Handelsnamen „Bio-Scale CHT-I" von Bio-Rad Laboratories), eluiert die nichtgebundenen Fraktionen mit 1 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0) und sammelt sie. Auf diese Weise kann eine teilweise aufgereinigte Enzymlösung des erfindungsgemäßen α-GARE erhalten werden. Es muss angemerkt werden, dass von anderen neuen, erfindungsgemäßen Bakterienstämmen stammende α-GAREs auf die gleiche Weise aufgereinigt werden können.
Das für die Kultivierung der neuen, erfindungsgemäßen Bakterienstämme verwendete Kulturmedium ist nicht auf das vorstehend beschriebene flüssige Nährstoffmedium beschränkt. Beispielsweise kann auch Hämoglobin-(Hb)-Kulturmedium, wie nachfolgend gezeigt, verwendet werden. Weiterhin kann die in diesem Hb-Medium enthaltene Hb-Lösung auf die nachfolgend beschriebene Weise hergestellt werden. (Hb-Kultivierungsmedium: pH 6,0)

Hb-Lösung 0,2 Gew.-%

K₂HPO₄ 0,2 Gew.-%

MgSO₄•7H₂O 0,02 Gew.-%

Spurenmetallsalzlösung 1,0 Gew.-%

Spurenvitaminlösung 0,2 Gew.-%
(Hb-Lösung)

Man zentrifugiert frisches Blut (2.000 g, 10 min, Raumtemperatur) und sammelt die roten Blutkörperchen. Zur Induzierung von Hämolyse gibt man den roten Blutkörperchen eine entsprechende Menge (Volumen) destilliertes Wasser zu. Zur Entfernung der Membranen der roten Blutkörperchen usw. zentrifugiert man dann das sich ergebende Hämolysat (2.000 g, 15 min, Raumtemperatur). Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird als die Hb-Lösung verwendet. (Spurenmetallsalzlösung)

CaCl₂•2H₂O	200 mg
H₃BO₃	50 mg
CuSO₄•5H₂O	20 mg
KI	50 mg
FeSO₄•7H₂O	100 mg
MnSO₄•5H₂O	200 mg
ZnSO₄•7H₂O	200 mg
Na₂MoO₄•2H₂O	50 mg
Rest Wasser	(Gesamtvolumen = 500 ml)

(Spurenvitaminlösung)

Ca-Pantothensäure	40 mg
Inositol	20 mg
Niacin	40 mg
p-Aminobenzoat	20 mg
Pyridoxinhydrochlorid	40 mg
Thiaminhydrochlorid	40 mg
Biotin	0,2 mg
Vitamin B₁₂	0,05 mg
Rest	Wasser (Gesamtvolumen = 100 ml)

Im Folgenden wird ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids erklärt, wobei als Beispiel der Fall genommen wird, bei dem die Probe Blutzellen sind und die darin enthaltenen glykosylierten Proteine (z.B. HbA1c) unter Verwendung von α-GARE und FAOD bestimmt werden.
Zunächst trennt man nach der üblichen Methode, wie beispielsweise Abtrennung durch Zentrifugation, die Fraktionen der Blutzellen vom Gesamtblut ab und induziert eine Hämolyse der Blutzellfraktionen. Es gibt keine spezielle Beschränkung für die Methode der Induzierung der Hämolyse. Beispiele für die Methode umfassen eine Methode unter Verwendung eines oberflächenaktiven Mittels, eine Methode unter Verwendung von Ultraschallwellen und eine Methode, bei der ein Unterschied im osmotischen Druck verwendet wird. Auf Grund der leichten Durchführbarkeit wird davon die Methode bevorzugt, bei der ein oberflächenaktives Mittel verwendet wird.
Beispiele für das oberflächenaktive Mittel sind Polyoxyethylen-p-t-octylphenylether, beispielsweise erhältlich unter dem Handelsnamen „Triton X-100"; Polyoxyethylensorbitanalkylester, beispielsweise erhältlich unter dem Handelsnamen „Tween-20"; und Poly(oxyethylen)alkylether, beispielsweise erhältlich unter dem Handelsnamen „Brij 35". Die Behandlung mit den vorstehend genannten oberflächenaktiven Mitteln kann unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen durchgeführt werden: Beispielsweise gibt man für den Fall, bei dem die zu behandelnde Lösung 1 bis 10 Vol.-% Blutzellen enthält, das oberflächenaktive Mittel der Lösung auf eine Konzentration von 0,1 bis 1 Gew.-% zu und rührt das sich ergebende Gemisch ungefähr 5 Sekunden bis 1 Minute bei Raumtemperatur.
Anschließend wird das vorstehend beschriebene Probenhämolysat mit dem erfindungsgemäßen α-GARE enzymbehandelt, wodurch α-GA aus dem glykosylierten Protein in dem Probenhämolysat freigesetzt wird. Die vorstehend erwähnte Enzymbehandlung mit dem α-GARE wird beispielsweise in einem Puffer durchgeführt. Die Behandlungsbedingungen werden in Abhängigkeit von beispielsweise der Art (z.B. Unterschieden bezüglich der Quelle und dergleichen) des zu verwendenden α-GARE und den Arten und Konzentrationen des glykosylierten Proteins oder glykosylierten Peptids geeignet ausgewählt.
Beispielsweise wird für den Fall, bei dem der Analyt HbA1c ist und das aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) stammende α-GARE verwendet wird, die Enzymbehandlung beispielsweise unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Die α-GARE-Konzentration der Reaktionslösung liegt im Bereich von 0,01 U/l bis 1 KU/l, die Temperatur im Bereich von 15 °C bis 60 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 3 Minuten bis 6 Stunden, und der pH im Bereich von 5,0 bis 10,0; vorzugsweise liegt die Temperatur im Bereich von 30 °C bis 37 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 5 bis 60 Minuten und der pH im Bereich von 6 bis 8. In diesem Fall können als der vorstehend beschriebene Puffer Tris-HCl-Puffer, Phosphatpuffer, Good's-Puffer (EPPS-Puffer, PIPES-Puffer, usw.) und dergleichen verwendet werden. Von anderen neuen, erfindungsgemäßen Bakterienstämmen stammendes α-GARE kann ebenso auf die gleiche Weise verwendet werden.
Anschließend wird das durch die vorstehend beschriebene Behandlung mit α-GARE erhaltene Abbauprodukt (α-GA) mit FAOD behandelt. Die durch FAOD katalysierte Abbaureaktion des α-GA wird durch die nachstehend gezeigte Formel (1) dargestellt.
(Formel 1)
Wie in Formel (1) gezeigt, werden ein Zucker (R¹-CO-CHO), eine Aminosäure (NH₂-R²) und Wasserstoffperoxid (H₂O₂) gebildet, wenn das durch die α-GARE-Behandlung erhaltene Abbauprodukt (α-GA: R¹-CO-CH₂-NH-R²) mit FAOD behandelt wird.
In der Formel (1) bezeichnet R¹ einen von einem Zucker stammenden Rest, der noch nicht der Glykosylierungsreaktion unterworfen wurde (d.h. Zuckerrest). Der Zuckerrest (R¹) ist ein Aldoserest, wenn der Zucker vor der Reaktion eine Aldose ist, und ein Ketoserest, wenn der Zucker vor der Reaktion eine Ketose ist. Wenn der Zucker vor der Reaktion beispielsweise Glukose ist, nimmt der Zucker in dem glykosylierten Produkt nach der Glykosylierungsreaktion auf Grund der Amadori-Umlagerung die Fructosestruktur an. In diesem Fall ist der Zuckerrest (R¹) ein Glukoserest (Aldoserest). Dieser Zuckerrest (R¹) kann beispielsweise durch -[CH(OH)]_n-CH₂OH dargestellt werden, wobei n für eine ganze Zahl von 0 bis 6 steht.
Weiterhin steht in Formel (1) R² für einen Aminosäurerest mit einer glykosylierten α-Aminogruppe, und R² kann durch die nachfolgend gezeigte Formel (2) dargestellt werden. In der Formel (2) steht R³ für eine Aminosäureseitenkettengruppe.
(Formel 2)

-CHR³-CO-OH

Es gibt keine Beschränkung für die vorstehend beschriebene FAOD, solange sie die vorstehend beschriebene Abbaureaktion katalysiert, und sie kann beispielsweise weitere katalytische Funktionen aufweisen. Ähnlich wie die Enzymbehandlung mit α-GARE wird die Behandlung mit FAOD vorzugsweise in einem Puffer durchgeführt. Es gibt keine speziellen Beschränkungen für den Puffer, und dieser kann beispielsweise Tris-HCl-Puffer, EPPS-Puffer, PIPES-Puffer usw. sein.
Die FAOD-Behandlung wird beispielsweise unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Die FAOD-Konzentration der Reaktionslösung liegt im Bereich von 0,1 bis 10 KU/l, die Temperatur im Bereich von 15 °C bis 50 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 1 bis 60 Minuten, und der pH im Bereich von 6 bis 9; vorzugsweise liegt die FAOD-Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2 KU/l, die Temperatur im Bereich von 30 °C bis 37 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 5 bis 20 Minuten und der pH im Bereich von 7 bis 8.
Anschließend wird das durch die FAOD-Behandlung gebildete Wasserstoffperoxid durch eine Redox-Reaktion unter Verwendung der Peroxidase (POD) und eines Substrats, das bei Oxidation eine Farbe bildet, bestimmt.
Im Allgemeinen wird die Redox-Reaktion in einem Puffer unter Bedingungen induziert, die abhängig von der Konzentration des Wasserstoffperoxids in der Reaktionslösung usw. geeignet ausgewählt wurden. Die Redox-Reaktion wird beispielsweise unter den folgenden Bedingungen induziert: Die POD-Konzentration in der Reaktionslösung liegt im Bereich von 10 U/l bis 400 KU/l, die Reaktionstemperatur im Bereich von 15 °C bis 40 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 0,1 bis 5 Minuten und der pH im Bereich von 5 bis 10; vorzugsweise liegt die POD-Konzentration im Bereich von 50 U/l bis 20 KU/l, die Reaktionstemperatur im Bereich von 30 °C bis 37 °C, die Reaktionsdauer im Bereich von 0,1 bis 1 Minuten und der pH im Bereich von 5 bis 8. Darüber hinaus gibt es keine speziellen Beschränkungen für den Puffer, und dieser kann beispielsweise der gleiche Puffer sein, der für die oben beschriebene FAOD-Behandlung verwendet wurde.
Für den Fall, in dem das vorstehend beschriebene chromogene Substrat als Substrat verwendet wird, kann die Konzentration des Wasserstoffperoxids durch Messung der Farbentwicklung (d.h. der Extinktion der Reaktionslösung) mit einem Spektrophotometer bestimmt werden. Die Konzentration des glykosylierten Proteins in der Probe kann aus der Konzentration des Wasserstoffperoxids bestimmt werden.
Bei diesem Bestimmungsvorgang können die jeweiligen Behandlungsschritte, wie oben beschrieben, einzeln durchgeführt werden. In einigen Fällen können einige der Schritte oder alle Schritte gleichzeitig durchgeführt werden. Beispielsweise können der α-GARE-Behandlungsschritt und der FAOD-Behandlungsschritt gleichzeitig durchgeführt werden, indem α-GARE und FAOD zur Durchführung der Reaktion der Probe zur gleichen Zeit zugegeben werden. Der FAOD-Behandlungsschritt und der Farbentwicklungsschritt unter Verwendung von POD können ebenfalls gleichzeitig durchgeführt werden, indem FAOD, POD und das chromogene Substrat zur Durchführung der Reaktion zur gleichen Zeit dem Abbauprodukt zugegeben werden, das durch die α-GARE-Behandlung erhalten wird. Weiterhin können der Schritt der Hämolyseinduktion durch das oberflächenaktive Mittel und der α-GARE-Behandlungsschritt ebenfalls gleichzeitig durchgeführt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Im vorliegenden Beispiel wurden glykosylierte Peptide mit α-GA mit einem Kulturüberstand eines neuen, erfindungsgemäßen, α-GARE-produzierenden Bakterienstamms umgesetzt, um das α-GA daraus freizusetzen. Soweit nicht anders beschrieben, wurden die Kultivierung des Bakterienstammes, der Abbau der glykosylierten Peptide und die TLC-Analyse der Abbauprodukte auf die gleiche Weise durchgeführt wie bei dem vorstehend beschriebenen Screeningverfahren.
Zunächst inokulierte man Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) in 200 ml des vorstehend genannten flüssigen Nährstoffmediums und kultivierte dann 48 Stunden in einer Schüttelkultur bei 30 °C. Die auf diese Weise erhaltene Kulturlösung zentrifugierte man, um die Bakterienzellen zu entfernen, und der erhaltene Überstand wurde als Rohenzymlösung verwendet.
Dann mischte man jeweils 50 μl der vorstehend genannten 0,01 M Lösungen der glykosylierten Peptide (F2P, F3P und F5P) mit 100 μl dieser Rohenzymlösung. Man setzte die sich ergebenden Gemische über Nacht bei 37 °C um und analysierte die auf diese Weise erhaltenen Reaktionslösungen über TLC. Die Ergebnisse dieser TLC-Analyse sind in 1 und 2 gezeigt. In 1 zeigt die Spur Nr. 1 eine Kontrolle (FV), die Spur Nr. 2 zeigt andere Kontrollen (Leu, Val, His), die Spur Nr. 3 zeigt das F2P-Abbauprodukt und die Spur Nr. 4 zeigt das F3P-Abbauprodukt. In 2 zeigt Spur Nr. 1 das F2P-Abbauprodukt und Spur Nr. 2 zeigt das F5P-Abbauprodukt. Weiterhin sind die Mobilitäten der in diesen Zeichnungen mit Pfeilen markierten Spots in der untenstehenden Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 2
Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P-17133) (FERM BP-7039) wurde in das Flüssigmedium inokuliert. Dann wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 die Kultivierung des Bakterienstamms, der Abbau der glykosylierten Peptide und die TLC-Analyse der Abbauprodukte durchgeführt. Die Ergebnisse dieser TLC-Analyse sind in 3 gezeigt. In 3 zeigt die Spur Nr. 1 eine Kontrolle (FV), die Spur Nr. 2 zeigt andere Kontrollen (Leu, Val, His), die Spur Nr. 3 zeigt das F2P-Abbauprodukt und die Spur Nr. 4 zeigt das F3P-Abbauprodukt. Die Mobilität der in 3 mit Pfeilen markierten Spots sind weiter auch in der untenstehenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Wie in 1, 2 und 3 sowie vorstehend in Tabelle 1 gezeigt, erschienen die Abbauprodukte der mit der jeweiligen Rohenzymlösung behandelten glykosylierten Peptide als die in den Zeichnungen mit den Pfeilen markierten Spots, welche dieselbe Mobilität aufwiesen wie der Spot des Kontroll-FV. Das F5P-Abbauprodukt in Beispiel 2 war ebenfalls als Spot mit der gleichen Mobilität wie der Spot des Kontroll-FV sichtbar (Mobilität 0,46: in der Zeichnung nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass erfindungsgemäßes α-GARE α-GA aus einem glykosylierten Peptid freisetzt. Da die Spots der vorstehend genannten Abbauprodukte eine von Val unterschiedliche Mobilität aufwiesen, wurde weiterhin ermittelt, dass der Zucker nicht von dem durch das α-GARE freigesetzten FV abgetrennt war. Wie in 1, 2 und 3 gezeigt, zeigte das F2P-Abbauprodukt zusätzlich die Spots von FV und His. Der Grund dafür, dass das F3P-Abbauprodukt und das F5P-Abbauprodukt keine weiteren Spots für Abbauprodukte außer für FV (Dipeptid und Tetrapeptid) zeigten, wird darin gesehen, dass diese mit dieser TLC-Methode kaum nachzuweisen sind.
Beispiel 3
Im vorliegenden Beispiel wurde die Freisetzung von α-GA (FV) für ein glykosyliertes Peptid bestätigt, das mit einem aus einem neuen, erfindungsgemäßen Bakterienstamm stammenden Rohenzym behandelt worden war.
Man kultivierte Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) bei 28 °C 5 Tage in dem vorstehend genannten Hb-Kulturmedium (pH 6,0). Man zentrifugierte dann die sich ergebende Kulturlösung (12.000 g, 15 min, 4 °C) und verwendete den erhaltenen Überstand als Rohenzymlösung.
Man mischte die Rohenzymlösung und 50 μl einer 0,01 M F4P-Lösung miteinander und setzte das sich ergebende Gemisch über Nacht bei 37 °C um. Die auf diese Weise erhaltene Reaktionslösung wurde auf eine Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtausschlussgrenze von 5 kDa: Millipore Corporation) aufgetragen, um hochmolekulare Substanzen, wie beispielsweise Proteine und dergleichen, zu entfernen. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde dann lyophilisiert.

Anschließend löste man das lyophilisierte Produkt in 20 μl des nachstehend gezeigten Eluenten A. Man unterzog die sich ergebende Lösung unter den nachstehend gezeigten Bedingungen einer Reversphasenchromatographie und fraktionierte nach dem Beginn der Analyse die Lösung alle 15 Sekunden (250 μl/l Fraktion). Weiterhin wurde FV unter den selben Bedingungen als Kontrolle eluiert und dessen Elutionszeit gemessen. (Reversphasenchromatographie)

Säule;	Handelsname „Hypercarb" (GL Sciences Inc.)
Größe;	100 mm × 4,6 mm
Schleife;	1000 μl
Eluent A;	Trifluoressigsäure : destilliertes Wasser
	= 0,1 : 100 (Volumenverhältnis)
Eluent B;	Aceton : destilliertes Wasser : Trifluoressigsäure
	= 80 : 20 : 0,1 (Volumenverhältnis)
Gradientenbedingungen;	0 bis 25 Minuten: 0 bis 20 Vol.-% Eluent B
	nach 25 Minuten : 20 Vol.-% Eluent B
Fließgeschwindigkeit;	1 ml/min
Säulentemperatur;	37 °C
Nachweiswellenlänge;	210 nm, 230 nm

Anschließend für jede über die vorstehend beschriebene Reversphasenchromatographie erhaltene Trennungsfraktion der Nachweis von FV in der nachfolgend beschriebenen Weise durchgeführt.
(Nachweisverfahren für FV)

Zunächst gab man 20 μl einer wässrigen Wasserstoffperoxidlösung zu 20 μl der jeweiligen Trennfraktionslösungen. Dann gab man weiter 60 μl der nachstehend gezeigten Redoxlösung A zu und setzte die sich ergebenden Gemische bei 37 °C um. Anschließend wurde die Extinktion dieser Reaktionslösungen bei der Hauptwellenlänge von 694 nm und der Unterwellenlänge von 884 nm über ein automatisiertes biochemisches Analysegerät (erhältlich unter dem Handelsnamen „JCA-BM 8" von Japan Electron Optics Laboratory Co. Ltd., im weiteren Verlauf gleichbleibend) gemessen. (Zusammenlösung der Redoxlösung A)

Handelsname „DA 64"	20 μMol/l
(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., nachfolgend gleichbleibend)
POD	20 KU/l
(Typ III: Toyobo Co., Ltd., nachfolgend gleichbleibend)
FAOD (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)	0,5 KU/l
Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0)	0,1 Mol/l

Im Ergebnis wurde eine Farbentwicklung in den Trennfraktionen beobachtet, die einer Elutionszeit von 5 bis 6 Minuten in der Reversphasenchromatographie entsprachen. Eine solche Elutionszeit entsprach der des Kontroll-FV und wies somit darauf hin, dass FV in dem F4P-Abbauprodukt vorlag.
Anschließend führte man unter den nachfolgend gezeigten Bedingungen eine Flüssigphasen chromatographie-(LC)/Massenspektrum-(MS)-Analyse für die Trennfraktionen durch, bei denen eine Farbentwicklung beobachtet wurde. Die Ergebnisse sind in 4 und 5 gezeigt.

4 ist ein Gesamtionenchromatogramm und 5 ist ein MS-Spektrum des eluierten Produkts mit einer Elutionszeit von 1,84 Minuten. (LC-Bedingungen)

Säule;	Handelsname „Inertsil ODS 3" (GL Sciences Inc.)
Größe;	Länge = 150 mm, Innendurchmesser = 2,1 mm
	Teilchengröße des ODS-Trägers = 5 μm
Eluent;	Acetonitril : 0,1 Vol.-% wässrige Ameisensäurelösung
	= 10 : 90 (Volumenverhältnis)
Fließgeschwindigkeit;	0,2 ml/min
Säulentemperatur;	40 °C
(MS-Bedingungen)
Modell;	Handelsname „LC1100MSD"
	(Agilent Technologies, Inc.)
Massenbereich;	100 bis 500 am
Ionisierung;
Zerstäuber:	N₂
Trocknungsgas:	N₂ (10 l/min, 350 °C)
angelegte Spannung:	60 V

Wie in 4 und 5 gezeigt, wurden als Ergebnis drei Peaks detektiert. Genauer gesagt, wurde bei einer Elutionszeit von 1,84 Minuten ein Peak mit einer Massenzahl von 280, welche der Massenzahl von FV entspricht, und ein Peak mit einer Massenzahl von 261, welcher der quasimolekulare Peak von FV ist, detektiert. Da der größte Peak in dem Massenspektrum der Peak mit einer Massenzahl von 280 war, welcher FV zeigt, wurde bestätigt, dass F4P unter Bildung von FV abgebaut worden war.
Beispiel 4
Im vorliegenden Beispiel wurde eine α-GARE-Aktivität bei verschiedenen α-GARE-Konzentrationen bestätigt.
(1) Herstellung von teilweise aufgereinigtem Enzym

Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) und Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P-17133) (FERM BP-7039) wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 kultiviert. Aus den jeweiligen Kulturlösungen wurden Überstände gesammelt und als Rohenzymlösungen verwendet. Dann wurden 50 ml der jeweiligen Rohenzymlösungen unter Verwendungen der Ultrafiltrationsmembranen mit einer Molekulargewichtsausschlussgrenze von 5 kDa (erhältlich von Millipore Corporation unter dem Handelsnamen „Ultra Free MC Filter") eingeengt und mittels unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen durchgeführte Gelchromatographie teilweise aufgereinigt. (Gel-Säulenchromatographie)

Säule:	Handelsname „HiLoad 26/60 Superdex 200pg"
	(Bio-Rad Laboratories)
Säulengröße:	Innendurchmesser = 260 mm, Länge = 600 mm
Fließgeschwindigkeit:	5,2 ml/min
Detektionswellenlänge:	280 nm, 230 nm
Eluent:	20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5)
1 Fraktion:	7 ml

(2) Bestimmung der α-GARE-Aktivität
Die unten gezeigte Lösung aus dem HbA1c-Verdau wurde als Substrat für das von Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) stammende α-GARE verwendet, und 10 mM F3P (50 mMol/l Kaliumphosphatpuffer: pH 8,0) wurde als Substrat für das von Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P 17133) (FERM BP-7039) stammende α-GARE verwendet. Man gab jeweils vorbestimmte Mengen (25, 50, 75, 100, 125 und 140 μl) der jeweiligen teilweise aufgereinigten α-GAREs zu 50 μl der entsprechenden Substrate. Man setzte die sich ergebenden Gemische über Nacht bei 37 °C um. Anschließend wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 durch Verwendung von FAOD in 20 μl der jeweiligen Reaktionslösungen eine Redox-Reaktion induziert und die Extinktion jeder Lösung gemessen. Dann wurde unter Verwendung des in Abwesenheit jedes α-GARE erhaltenen Werts als Nullwert ein Anstieg der Extinktion innerhalb von 5 Minuten als α-GARE-Aktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind 6 und 7 gezeigt. 6 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Menge des aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) stammenden α-GARE und dem Grad der Farbentwicklung (Extinktion) zeigt, und 7 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Menge des aus Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P-17133) (FERM BP-7039) stammenden α-GARE und dem Grad der Farbentwicklung (Extinktion) zeigt.
(Lösung aus dem HbA1c-Verdau)
Man wusch menschliches Gesamtblut mit einer physiologischen Salzlösung (0,85 Gew.-% NaCl) und sammelte die Blutzellen. Um die Blutzellen vollständig zu hämolysieren, gab man ihnen das 10fache ihres Volumens an reinem Wasser zu. Man zentrifugierte das sich ergebende Gemisch (10.000 g, 30 min), um die Membranen der Blutzellen abzutrennen, und erhielt auf diese Weise ein Hämolysat. Dann wurden auf der Grundlage der von Bisse und Wieland vorgeschlagenen Methode (J. Chromatogr. (1988), Bd. 434, Seiten 95–110, Bisse & Wieland) unter Verwendung einer unter dem Handelsnamen „Poly CAT Column" (PolyLC Inc.) erhältlichen Säule mit Abmessungen von 0,94 × 20 cm 7,5 mg Hb des Hämolysats aufgetrennt, um HbA1c zu sammeln. Anschließend mischte man 20 ml des auf diese Weise gesammelten HbA1c (mit einer Hämoglobinkonzentration von 17 g/l) und 5 ml 0,2 M Natriumacetatpuffer (pH 3,0) miteinander. Nachdem man den pH des Gemisches durch Zugabe von Essigsäure auf 3,0 eingestellt hatte, gab man weiterhin 0,35 mg Pepsin (Sigma Chemical Co.) zu. Man inkubierte die sich ergebende Lösung über Nacht bei 28 °C. Dann entfernte man unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (die unter dem Handelsnamen „Ultra Free MC Filter" von der Millipore Corporation erhältlich ist) hochmolekulare Substanzen wie beispielsweise Pepsin und dergleichen. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde als eine Lösung aus dem HbA1c-Verdau verwendet.
Wie in 6 gezeigt, stieg die Aktivität des aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) stammenden α-GARE in einer mengenabhängigen Weise an, wenn die Menge des α-GARE in einem Bereich von etwa 500 bis 100 μl lag. Wie in 7 gezeigt, stieg andererseits die Aktivität des aus Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P-17133) (FERM BP-7039) stammenden α-GARE linear an, wenn mindestens etwa 70 μl des α-GARE zugegeben wurden.
Beispiel 5
Im vorliegenden Beispiel wurde die thermische Stabilität des erfindungsgemäßen α-GARE bestimmt.
Aus dem aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) und dem aus Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P-17133) (FERM BP-7039) stammenden α-GARE wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 teilweise gereinigte Enzyme hergestellt. Man inkubierte die teilweise aufgereinigten Enzyme 15 Minuten bei den jeweiligen Temperaturen (30 °C, 37 °C, 50 °C, 60 °C , 70 °C und 80 °C). Anschließend mischte man 100 μl der hitzebehandelten, teilweise aufgereinigten Enzyme mit 50 μl der Substrate und setzte die sich ergebenden Gemische über Nacht bei 37 °C um. Als Substrate für die jeweiligen α-GAREs verwendete man die gleichen Substrate wie in Beispiel 4. Anschließend induzierte man durch Verwendung von FAOD auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 eine Redox-Reaktion in 20 μl der sich ergebenden Reaktionslösungen und maß die Extinktion jeder Lösung. Als α-GARE-Aktivität bestimmte man einen Anstieg der Extinktion innerhalb von 5 Minuten und berechnete die Restaktivität (%), wobei die Aktivität des nicht-hitzebehandelten α-GARE mit 100 % angenommen wurde. Die Ergebnisse sind in 8 und 9 gezeigt. 8 ist ein Graph, der die thermische Stabilität des aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) stammenden α-GARE zeigt, und 9 ist ein Graph, der die thermische Stabilität des aus Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P-17133) (FERM BP-7039) stammenden α-GARE zeigt.
Wie in 8 gezeigt, blieb das aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) stammende α-GARE selbst nach einer Hitzebehandlung bei 30 °C bis 60 °C zu 100 % aktiv. Die Restaktivität wurde jedoch durch Hitzebehandlung bei 80 °C auf etwa 50 % verringert. Wie in 9 gezeigt, zeigte andererseits das aus Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P-17133) (FERM BP-7039) stammende α-GARE selbst nach einer Hitzebehandlung bei 30 °C bis 60 °C eine Restaktivität von 100 %. Durch Hitzebehandlung bei 70 °C wurde jedoch die Restaktivität auf etwa 60 % verringert.
Beispiel 6
Im vorliegenden Beispiel wurde eine optimale Temperatur für ein erfindungsgemäßes α-GARE bestimmt.
Aus dem aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) stammenden α-GARE wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 beschrieben ein teilweise aufgereinigtes Enzym hergestellt. Dann gab man 100 μl des teilweise aufgereinigten Enzyms zu einem Gemisch aus 90 μl der gleichen HbA1c-Verdaulösung wie in Beispiel 5 verwendet und 10 μl Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0). Man setzte die sich ergebende Lösung über Nacht bei den jeweiligen Temperaturen (10 °C, 30 °C 37 °C, 50 °C, 60 °C und 70 °C) um. Anschließend induzierte man durch Verwendung von FAOD auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 in 20 μl der sich ergebenden Reaktionslösung eine Redox-Reaktion und maß die Extinktion jeder Lösung. Als α-GARE-Aktivität wurde dann ein Anstieg der Extinktion innerhalb von 5 Minuten bestimmt. Das Ergebnis ist in 10 gezeigt. 10 ist ein Graph, der eine optimale Temperatur für das aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) stammende α-GARE zeigt.
Wie in 10 gezeigt, betrug die optimale Temperatur des aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) stammenden α-GARE etwa 40 °C bis 50 °C.
Beispiel 7
Im vorliegenden Beispiel wurde das Molekulargewicht von erfindungsgemäßem α-GARE bestimmt.
Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) und Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P-17133) (FERM BP-7039) wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 kultiviert und Überstände der jeweiligen Kulturlösungen wurden gesammelt. Die Überstände wurden als Rohenzymlösungen verwendet. Die Rohenzymlösungen wurden über Gelchromatographie aufgetrennt, die unter den selben Bedingungen wie in Beispiel 4 durchgeführt wurde. Dann gab man 150 μl jeder Fraktion zu einem Gemisch aus 50 μl eines Substrats und 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) und setzte das sich ergebende Gemisch über Nacht bei 37 °C um. Als Substrate für die jeweiligen α-GAREs wurden die gleichen Substrate wie in Beispiel 4 verwendet. Anschließend wurde unter Verwendung von FAOD auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 eine Redox-Reaktion in 20 μl der sich ergebenden Reaktionslösungen induziert und die Extinktion jeder Lösung gemessen. Als α-GARE-Aktivität wurde dann ein Anstieg der Extinktion innerhalb von 5 Minuten bestimmt. Der unter dem Handelsnamen „MW Marker (HPLC)" (Oriental Yeast Co., Ltd.) erhältliche Marker wurde als Molekulargewichtsmarker verwendet.
Als Ergebnis wurde in beiden Rohenzymlösungen eine α-GARE-Aktivität in den Fraktionen nachgewiesen, die einem Molekulargewicht von etwa 40.000 bis 50.000 entsprachen. Dementsprechend kann angenommen werden, dass das Molekulargewicht sowohl des aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) als auch des aus Pseudomonas alcaligenes KDK1001 (FERM P-17133) (FERM BP-7039) stammenden α-GARE etwa 40.000 bis 50.000 beträgt.
Beispiel 8 und Vergleichsbeispiel 1
In Beispiel 8 wurden glykosylierte Peptide mit den gleichen α-GARE-Rohenzymlösungen behandelt, die in den Beispielen 1 und 2 verwendet wurden, und die α-GARE-Aktivitäten dieser Rohenzymlösungen wurden durch Herbeiführen einer Redox-Reaktion in den sich ergebenden Produkten unter Verwendung von FAOD usw. gemessen. Das in dem vorliegenden Beispiel verwendete Reagenz, die Zusammensetzung des Reagenz und das Verfahren zur Bestimmung der α-GARE-Aktivitäten werden nachfolgend beschrieben.
(50 mM glykosylierte Peptidlösung)
Das vorstehend erwähnte F2P wurde in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 50 mM gelöst.
(Puffer A)

80 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)

(Zusammensetzung der Redox-Lösung B)

Handelsname „DA 64" 0,1 mMol/l

POD 50 KU/l

FAOD (Kikkoman Corporation) 10 KU/l

Puffer A 80 mMol/l

Zunächst mischte man 490 μl der auf die gleiche Weise wie in den Beispielen 1 bzw. 2 hergestellten Rohenzymlösungen mit 10 μl der Lösung glykosylierter Peptide und setzte die sich ergebenden Gemische über Nacht bei 30 °C um, um das glykosylierte Peptid abzubauen. Man gab 55 μl des Puffers A zu 25 μl der sich ergebenden Abbaulösungen und gab dann weiterhin 20 μl der Reaktionslösung B zu, um eine Reaktion herbeizuführen. Anschließend maß man die Extinktion jeder Reaktionslösung bei der Hauptwellenlänge von 694 nm und der Unterwellenlänge von 884 nm unter Verwendung eines automatischen Biochemie-Analysegeräts (erhältlich unter dem Handelsnamen „JCA-BM 8" von Japan Electron Optics Laboratory Co. Ltd.). Auf der Grundlage der auf diese Weise gemessenen Extinktion und der Eichkurve, die zuvor durch Herbeiführen einer Reaktion von FV als Vergleichsmaterial unter Verwendung von FAOD erstellt worden war, bestimmte man dann die α-GARE-Aktivitäten.
Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 2 gezeigt. Andererseits wurden im Vergleichsbeispiel 1 die α-GARE-Aktivitäten auf dieselbe Weise bestimmt, wobei jedoch anstelle der in Beispiel 8 verwendeten Rohenzymlösungen Enzymlösungen verwendet wurden, die jeweils durch Lösen von Trypsin (Sigma Chemical Co.), Papain (Sigma Chemical Co.) und Aminopeptidase (Sigma Chemical Co.) in reinem Wasser bei einer Konzentration von 1 g/l erhalten worden waren. Tabelle 2

Bakterienstamm α-GARE-Aktivität (U/l)

Corynebacterium ureolyticum KDK1002 1,43

Pseudomonas alcaligenes KDK1001 0,26
Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden α-GARE-Aktivitäten für den Fall detektiert, in dem die aus den vorstehend genannten zwei Arten neuer Bakterienstämmen stammenden Rohenzymlösungen verwendet wurden. Im Vergleichsbeispiel 1, bei dem Enzymlösungen unter Verwendung von Trypsin, Papain bzw. Aminopeptidase verwendet wurden, wurden jedoch keine α-GARE-Aktivitäten detektiert.
Beispiel 9
Im vorliegenden Beispiel wurde ein glykosyliertes Peptid mit einer aus Corynebacterium ureolyticum KDK 1002 stammenden α-GARE-Enzymlösung behandelt, und die α-GARE-Aktivität dieser Enzymlösung wurde durch Herbeiführen einer Redox-Reaktion im sich ergebenden Produkt unter Verwendung von FAOD gemessen. Das im vorliegenden Beispiel verwendete Reagenz, die Zusammensetzung des Reagenz und das Verfahren zur Bestimmung der α-GARE-Aktivität werden nachfolgend beschrieben.
(Verfahren zur Herstellung einer α-GARE-Enzymlösung)
Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) wurde in 200 ml des vorstehend genannten flüssigen Nährstoffmediums inokuliert und dann 48 Stunden bei 30 °C in einer Schüttelkultur kultiviert. Die auf diese Weise erhaltene Kulturlösung wurde zur Entfernung der Bakterienzellen zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Anschließend wurde der Überstand auf eine Säule (erhältlich unter dem Handelsnamen „Poros HQ/M" von PE Biosystem, Inc.) und dann auf eine weitere Säule (erhältlich unter dem Handelsnamen „Bio Scale CHT-I" von Bio-Rad Laboratories) auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben aufgetragen, um das α-GARE teilweise aufzureinigen. Die erhaltenen aktiven Fraktionen wurden als α-GARE-Enzymlösungen verwendet.
(Verfahren zur Herstellung von glykosyliertem Globin)
Nach dem vorstehend beschriebenen, von Teale vorgeschlagenen Verfahren wurde Globin aus menschlichen Blutzellen aufgereinigt. Dann gab man dem Globin Glukose bis auf eine Konzentration von 10 Gew.-% zu. Man ließ das sich ergebende Gemisch eine Woche bei 40 °C stehen, um glykosyliertes Globin herzustellen.
Um eine glykosylierte Globinlösung herzustellen, löste man das glykosylierte Globin bei einer Konzentration von 2 g/l in destilliertem Wasser. Dann mischte man 100 μl der α-GARE-Enzymlösung, 50 μl der glykosylierten Globinlösung und 350 μl eines 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) miteinander und setzte das sich ergebende Gemisch 3 Stunden bei 37 °C um, um das glykosylierte Globin abzubauen. Unter Verwendung dieser Abbaulösung wurde dann auf dieselbe Weise wie in Beispiel 8 die α-GARE-Aktivität bestimmt. Es muss hier angemerkt werden, dass die FAOD (Kikkoman Corporation) spezifisch auf ein α-GA einwirkt und aus diesem Grund nur die α-GARE-Aktivität bestimmen kann, selbst wenn das aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) stammende α-GARE nicht nur α-GA, sondern beispielsweise auch einen Aminosäurerest mit einer glykosylierten ε-Aminogruppe freisetzt. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die α-GARE-Aktivität 2,1 U/l betrug.
Beispiel 10
Im vorliegenden Beispiel wurde die α-GARE-Aktivität unter Verwendung von FV-pNA als Substrat bestimmt.
Eine aus Corynebacterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135) (FERM BP-7040) stammende Rohenzymlösung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. Dann mischte man 400 μl der Rohenzymlösung mit 100 μl des nachstehend gezeigten Reaktionsreagenz C und setzte das sich ergebende Gemisch bei 37 °C um. Die Farbentwicklung des durch das α-GARE freigesetzten pNA wurde als Änderung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 410 nm gemessen. Eine Änderung der Extinktion pro Minute wurde dann als α-GARE-Aktivität ermittelt. Das Ergebnis ist nachfolgend in Tabelle 3 gezeigt.
(Herstellung von FV-pNA)
FV-pNA wurde aus Val-pNA (Sigma Chemical Co.) und Glukose nach dem herkömmlichen Verfahren hergestellt. (Reaktionsreagenz C)

FV-pNA 1 ml

50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) 20 ml

Tabelle 3

Probe α-GARE-Aktivität (Anstieg der Extinktion pro Minute)

Beispiel 1 0,0030

Kontrolle 0,0005
Wie in Tabelle 3 gezeigt, kann die Aktivität des erfindungsgemäßen α-GARE ebenfalls unter Verwendung des Aminosäuresubstrats bestimmt werden, das eine Aminosäure mit einer glykosylierten α-Aminogruppe und eine über eine Amid-Bindung an eine α-Carboxylgruppe gebundene detektierbare Gruppe umfasst.
Wie vorstehend ausführlich beschrieben, ermöglicht ein erfindungsgemäßes α-GARE die genaue Bestimmung eines glykosylierten Proteins und eines glykosylierten Peptids, weil es α-GA aus dem glykosylierten Protein und dem glykosylierten Peptid freisetzen kann, so dass FAOD leicht darauf einwirken kann.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Wie vorstehend ausführlich beschrieben, kann ein erfindungsgemäßes, neues Enzym, α-GARE, einen Aminosäurerest mit einer glykosylierten α-Aminogruppe aus einem glykosylierten Protein usw. freisetzen. Dementsprechend kann HbA1c als ein Indikator für Diabetes präzise und einfach bestimmt werden, wenn α-GARE in einem Verfahren zur Bestimmung des glykosylierten Proteins usw. unter Verwendung von FAOD verwendet wird. Die Bestimmung von HbA1c kann daher in klinischen Tests usw. zur praktischen Anwendung kommen.

Claims

Enzym, welches eine Aminosäure mit einer glykosylierten α-Aminogruppe aus einem glykosylierten Protein oder einem glykosylierten Peptid freisetzt, erhalten aus dem Bakterienstamm Corynebakterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135, FERM BP-7040) oder Pseudomonas alcaligenes KDD1001 (FERM P-17133, FERM BP-7039).
Enzym nach Anspruch 1, wobei die freizusetzende Aminosäure mit der glykosylierten α-Aminogruppe Valin mit einer glykosylierten α-Aminogruppe ist.
Verfahren zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids, umfassend: Abbau eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids mit einem Enzym, wobei man ein Abbauprodukt erhält; Durchführung einer Redox-Reaktion zwischen dem Abbauprodukt und einer Fructosylaminosäureoxidase; und Bestimmung der Redox-Reaktion, indem die Menge des glykosylierten Proteins oder des glykosylierten Peptids bestimmt wird, wobei ein Enzym nach einem der Ansprüche 1 oder 2 als Enzym verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das zu bestimmende glykosylierten Protein glykosyliertes Hämoglobin ist.
Kit zur Bestimmung eines glykosylierten Proteins oder eines glykosylierten Peptids, umfassend: eine Protease; eine Fructosylaminosäureoxidase; eine Peroxidase; und ein Substrat, das über eine Reaktion mit der Peroxidase oxidiert wird, wobei die Protease ein Enzym nach einem der Ansprüche 1 oder 2 umfasst.
Bakterienstamm Corynebakterium ureolyticum KDK1002 (FERM P-17135, FERM BP-7040), der ein Enzym produziert, das eine Aminosäure mit einer glykosylierten α-Aminogruppe aus einem glykosylierten Protein oder einem glykosylierten Peptid freisetzt.
Bakterienstamm Pseudomonas alcaligenes KDD1001 (FERM P-17133, FERM BP-7039), der ein Enzym produziert, das eine Aminosäure mit einer glykosylierten α-Aminogruppe aus einem glykosylierten Protein oder einem glykosylierten Peptid freisetzt.
Substrat zur Detektion eines Enzyms nach Anspruch 1 oder 2 zur Bestimmung einer Aktivität des Enzyms, umfassend: eine Aminosäure; und eine detektierbare Gruppe; worin die Aminosäure eine glykosylierte α-Aminogruppe aufweist, die detektierbare Gruppe an eine α-Carboxylgruppe der Aminosäure über eine Amidbindung oder eine Esterbindung gebunden ist, und die detektierbare Gruppe im gebundenen Zustand nicht detektiert werden kann, dagegen im freigesetzten Zustand detektierbar ist.
Substrat nach Anspruch 8, wobei die detektierbare Gruppe wenigstens eine Gruppe ist, die ausgewählt ist unter para-Nitroanilid, para-Nitrophenol, β-Naphthylamid, 4-Methoxy-β-naphthylamid und 4-Methyl-coumaryl-7-amid.